WO2013180537A2 - 피부 투과성 펩타이드 - Google Patents

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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a skin-penetrating peptide, and more particularly, the present invention provides an isolated peptide capable of penetrating the skin and delivering a drug, an isolated polynucleotide encoding the peptide, and a composition for transdermal delivery comprising the peptide.
  • a peptide-cargo complex comprising a peptide and a cargo.
  • Drug delivery through the skin has been used in various fields and forms, such as pain relief patch, smoking cessation patch or pregnancy control agent because of its ease of use.
  • Drugs that pass through the skin are mainly intended for delivery through the skin to the systemic circulation, but in addition to drugs such as atopy treatments, whitening or anti-wrinkle cosmetics may be used for the purpose of delivery to the organs of the skin itself. .
  • drugs such as atopy treatments, whitening or anti-wrinkle cosmetics may be used for the purpose of delivery to the organs of the skin itself.
  • whitening or anti-wrinkle cosmetics may be used for the purpose of delivery to the organs of the skin itself.
  • stratum corneum consisting of about 10 to 15 stratum corneocytes with a thickness of about 10 ⁇ m to 45 ⁇ m, and the stratum corneum is formed in a form called mortar and brick structure.
  • the stratum corneum has a brick structure consisting of keratin-rich keratinocytes, and a mortar structure filled with lipids such as ceramide, fatty acid, or wax, between the keratinocytes. Consists of By this structure, the outside of the skin has a structure that prevents intrusion from the outside while preventing the loss of moisture inside. However, this structure has a very low material permeability property faithfully to the purpose.
  • Korean Patent No. 1054519 discloses a human growth hormone-derived peptide having excellent stability and skin permeability compared to natural human growth hormones and a composition comprising the same
  • Korean Patent No. 1104223 discloses human IL.
  • IL-10-derived peptides and compositions containing the same have been disclosed which have the same function as that of --10 (interleukin-10) and have superior stability and skin permeability compared to native IL-10, these peptides are functional in themselves. Therefore, there is a disadvantage that it can not be used as a carrier for delivery of other drugs.
  • peptides have been developed that can be used for the treatment of skin diseases and for promoting skin penetration of pharmaceutically active agents (US Pat. No. 7,659,252).
  • the peptide has the advantage that it can be used as a carrier for transdermal delivery of other drugs as well as showing excellent skin permeability, but after penetrating the skin is consumed through the circulatory system of the body, in the case of drugs targeting the skin It has the disadvantage that it does not exert much effect.
  • One object of the present invention is to provide an isolated peptide consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10.
  • Another object of the present invention is to provide an isolated polynucleotide encoding the peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a peptide-cargo complex comprising the isolated peptide and cargo.
  • Another object of the present invention to provide a composition for transdermal delivery comprising the isolated peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for transdermal delivery of cargo using the peptide.
  • the present invention provides an isolated peptide consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10.
  • Amino acid sequences used in the present invention are abbreviated as follows according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • a novel peptide has been developed that can exhibit skin permeability and further exhibit skin persistence, and can be applied to transdermal delivery systems of drugs such as peptides or proteins.
  • Such peptides of the present invention may consist of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10:
  • NQTDHLFSTFIS SEQ ID NO: 1
  • NGSLNTHLAPIL SEQ ID NO: 2
  • GGSIAASELEYY SEQ ID NO: 3
  • ELKQVVISDINH SEQ ID NO: 4
  • MVRDHPGLSGWT SEQ ID NO: 5
  • TSGISINKLPHT SEQ ID NO: 6
  • IFAALDYKENLH DMKWTL 7
  • QIEKHVYFNASQ SEQ ID NO: 9
  • TNIPSLSGILMK SEQ ID NO: 10
  • the isolated peptide is not only composed of the sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10, but also one or more amino acids of the terminal region of the sequence is removed or Peptides substituted or exhibiting at least 80% homology are also within the scope of the present invention.
  • the isolated peptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 of the present invention is characterized by exhibiting skin permeability, and may further exhibit skin persistence.
  • skin permeability refers to the ability of a peptide to penetrate the skin and penetrate into the skin.
  • skin persistence refers to a peptide that has penetrated the skin and passes through the skin tissue to the circulation. Rather, it refers to the ability to remain in the skin by binding to tissue within the skin.
  • the components combined with the peptide have excellent properties of remaining in the skin tissue so as to act on the skin tissue or the skin cells. Therefore, since the peptide of the present invention is excellent in skin permeability as well as skin permeability, it can be usefully used as a carrier for pharmaceutical preparations or cosmetics using the target tissue as skin tissue.
  • Peptides exhibiting such skin permeability can be used for transdermal delivery of various kinds of cargo such as other peptides, proteins, polynucleotides, oligonucleotides, siRNAs or commercially available drugs that bind thereto.
  • the term "cargo" refers to a substance that is intended to penetrate the skin and be delivered into the skin.
  • the cargo is a substance that is connected to the isolated peptide of the present invention and delivered into the skin, but the kind thereof is not particularly limited, and for example, peptide, protein, polynucleotide, oligonucleotide, ribozyme, siRNA, vector Or a substance for gene therapy such as a virus, or a commercially available drug.
  • the phage of the peptide of the present invention can penetrate porcine skin through the phage display method (Examples 1 to 5).
  • the cargo may be delivered into the skin in the form of a complex linked to an isolated peptide of the present invention.
  • the complex is a form in which the cargo is covalently linked to the peptide; And a form in which the cargo and the peptide are combined in a non-covalent interaction.
  • the cargo when it is a peptide or protein, it may be in the form of a fusion protein, but is not limited thereto.
  • the cargo When the cargo is covalently linked to the peptide, it may be linked through a linker or directly linked.
  • linker basically refers to a linker capable of linking two different fusion partners (eg, a biological polymer) using a covalent bond.
  • the linker may be a peptide linker or a non-peptide linker, and in the case of a peptide linker, may be composed of one or more amino acids.
  • Peptides comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 10 of the present invention, the N-terminal or / and C-terminal and the like thereof in order to protect from protein cleavage enzymes in vivo and increase stability It may be chemically modified, protected with an organic group, or modified by adding amino acids to peptide ends or the like. In particular, in the case of chemically synthesized peptides, since the N- and C-terminus are charged, acetylation of the N-terminus and / or amidation of the C-terminus are performed to remove such charges. It may be, but is not particularly limited thereto. In addition, the peptide may further be a dansyl group coupled to the C-terminus, but is not limited thereto.
  • the peptides of the present invention can be synthesized by methods well known in the art, for example by automated peptide synthesizers, depending on their length, and can also be produced by genetic engineering techniques. For example, through genetic engineering, a fusion gene encoding a fusion protein, comprising a fusion partner and a peptide of the present invention, is prepared and transformed into a host cell, and then expressed in the form of a fusion protein, a protease or compound The peptide of the present invention may be cleaved and separated from the fusion protein to produce a desired peptide.
  • a protease such as Factor Xa or enterokinase
  • a compound such as CNBr or hydroxylamine
  • the skin-penetrating peptides (SEQ ID NOs: 1 to 10) were selected, and the skin permeability of the phage containing the selected skin-penetrating peptides was confirmed, as compared to the control group. It was confirmed to exhibit excellent skin permeability (Table 1).
  • the peptide derivatives of the form of a single-silyl group bonded to the C-terminal of the peptide were synthesized, and the absorbance thereof was measured to confirm the skin permeability of these peptides. As a result, the peptides also showed excellent skin permeability (Table 2). ).
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the peptide.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention is not particularly limited due to the degeneracy of the codon, but preferably may be composed of any one of the following nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 to 20.
  • the present invention provides a peptide-cargo complex comprising the isolated peptide and cargo.
  • the isolated peptides, cargoes and complexes are as described above.
  • the present invention provides a composition for transdermal delivery comprising the isolated peptide.
  • composition may further comprise a cargo, in which case the peptide and cargo may be in the form of a peptide-cargo complex.
  • the peptide Since the peptide exhibits skin permeability, it can be used for transdermal or percutaneous delivery of various cargoes such as peptides, proteins, polynucleotides, oligonucleotides, ribozymes, siRNAs or commercially available drugs. It can be used as a composition and can function as a carrier for the cargo.
  • the carrier is a substance that delivers a substance to a specific site. Since the peptide of the present invention exhibits skin permeability, a composition including the same may be used as a carrier for delivering cargo into the skin.
  • the carrier or composition may be used to deliver a drug through the body surface, such that: (a) an amount of the peptide of the invention that can result in drug delivery through the body surface without damaging the body; And (b) an effective amount of cargo, but is not limited thereto.
  • composition for transdermal delivery of the present invention comprising the peptide is preferably in the form of an easy to be delivered into the skin, for example, in the form of an external preparation for the skin, and the composition comprises liposomes, micelles, and microspheres. Can be prepared together.
  • skin external preparation refers to an agent provided for external skin use. Examples include formulations such as ointments, creams, gels, lotions, pastes, patches, and the like, but are not particularly limited as long as they have a purpose to deliver a target substance into the skin by applying it externally.
  • composition may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers or additives known in the art.
  • the carrier is preferably a material suitable for transdermal or topical delivery.
  • the carriers or additives useful in the present invention preferably do not interact with other ingredients in a detrimental manner included in the composition without causing toxicity to the skin.
  • composition of the present invention can be used in the delivery of a drug that is not easy to deliver itself into the skin, in addition to the peptide of the present invention may further include a substance capable of promoting skin permeation.
  • the substance that promotes skin penetration is preferably capable of minimizing the possibility of skin damage, irritation and systemic symptoms.
  • compositions of the present invention examples include saturated or unsaturated fatty acids; Aliphatic alcohols; Bile acids; Nonionic surfactants, amines, amides, hydrocarbon solvents, terpins, lower alkyl esters, cyclodextrin enhancers, heterocycles containing nitrogen, sulfoxides and ureas; And derivatives thereof, but is not limited thereto.
  • composition comprising the peptide of the present invention may be in the form of a pharmaceutical composition when the substance to be delivered is a therapeutic substance.
  • the peptide of the present invention when formulated into a pharmaceutical composition, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants. Sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories can be included.
  • non-aqueous solvents and suspending solvents may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the peptides of the present invention may contain carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, etc. to increase stability or absorption. Small molecule proteins or other stabilizers.
  • composition may be in the form of a cosmetic composition.
  • the peptide Since the peptide exhibits excellent skin permeability and may also exhibit skin persistence, it may be included in the cosmetic composition to facilitate the delivery of various ingredients such as the active ingredient included in the cosmetic composition, such as a whitening ingredient, into the skin.
  • Cosmetic compositions of the present invention are conventional auxiliaries in the cosmetic field, such as fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners, gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, interfaces
  • active agents water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants, chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles as well as cosmetics
  • It may be used as a component of general cosmetics or functional cosmetics, together with auxiliary agents commonly used in the cosmetic or dermatology field, such as any other ingredients commonly used.
  • the term "functional cosmetics (cosmedical, cosmeceutical)” refers to a product having a specialized functional function of bio-active efficacy, the effect is emphasized, unlike the general cosmetics is introduced into the cosmetic professional treatment function.
  • the functional cosmetics means a product that helps to whiten the skin, a product that helps to improve skin wrinkles, a cosmetic that helps to burn the skin finely or protect the skin from ultraviolet rays.
  • Cosmetics comprising the cosmetic composition of the present invention can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, interfaces It may be formulated as an active agent-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, and the like. More specifically, flexible lotion, astringent lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, lotion, gel, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, ointment, stick, patch, spray or powder It may be prepared in a dosage form.
  • the present invention provides a method for transdermal delivery of cargo using the peptide.
  • the peptide and cargo are as described above.
  • the method for transdermal delivery of cargo of the present invention may be a method comprising applying to the skin of an individual an effective amount of the peptide-drug conjugate or a composition comprising the same. Since the peptide of the present invention has excellent skin permeability, the above method can effectively deliver cargo linked to the peptide into the skin.
  • the subject includes, without limitation, any subject that requires delivery of the cargo into the skin, and examples include, but are not limited to, mammals including cattle, pigs, sheep, chickens, dogs or humans, or birds.
  • the peptide of the present invention exhibits not only an excellent skin penetration effect, but also a skin residual effect, it may be widely used in the development of various transdermal delivery agents to be applied to skin tissue.
  • 1 is a photograph and graph showing the amount of binding of each of the negative control, control and phage expressing S3-2 to pig skin.
  • a dissolution test method for transdermal preparations was applied.
  • Franz glass cell (Standard diameter 9mm, Receiver 5ml, Permgear) was used for this purpose.
  • Pork skin 0.7 mm thick, Medikinetics
  • the phages were treated on the top, and then the phage remaining in the receiver at the bottom was amplified by penetrating the pig skin.
  • round selection was defined as round selection.
  • phages having good skin permeability were selected in a competitive manner, and a total of three rounds were performed.
  • Ph.D-12 Phage Library Kit (New England Biolab) was used. 500 9 TBS (1% BSA) were treated with 10 9 phages. After incubation for 16 hours, phage was amplified using all 5 ml of TBS of the receptacle.
  • E. coli ER2738 (New England Biolab) was used as a host cell for amplifying phage.
  • 25 ml LB medium was inoculated with shake cultured ER2738 and treated with 5 ml of TBS with phage permeated at OD (550 nm) 0.5 and incubated for 4 hours. After centrifugation at 8000G, E. coli and phage were separated from each other. The phage supernatant was then treated with 6 ml of precipitate (20% PEG6000, 2.5 M NaCl) to precipitate the phage. After centrifugation at 8000G, the precipitated phages were treated with TBS solution to separate and store the phages.
  • E. coli ER2738 with phage was screened using the properties of blue in LB / X-gal / IPTG plates. Specifically, 300 ⁇ l of ER2738 culture was diluted with an appropriate amount of phage in TBS, 2 ⁇ l of the phage was mixed, and then mixed with 4 mL of TOP agar, followed by treatment on the top of the LB / X-gal / IPTG plate and further culture for 16 hours. Then blue colonies were selected.
  • the pig skin is mounted between the top and bottom of the Franz glass cell, and 500 ⁇ l and 5 ml of TBS solution are placed on the top and bottom, respectively, to reduce the nonspecific binding that may occur between the skin and the phage coated protein.
  • the number of phages to be treated was uniformly adjusted to 10 10 and treated on top of the Franz glass cell.
  • a phage capable of expressing a peptide having an amino acid sequence of "TDMNKTEIRFVR (SEQ ID NO: 21)" was used. After reacting with pig skin for 16 hours, it was penetrated and the number of phages in the receptacle was measured.
  • each of the peptides was chemically synthesized, and then a derivative was added to the C'-terminus of dansyl (Dansyl) group, respectively, and the control group "TDMNKTEIRFVR ( A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21) was used.
  • pig skin was mounted between the top and bottom of the Franz glass cell, 500 ⁇ l and 5 mL of TBS solution were added to the top and bottom of the cell, respectively, and then each of the derivatives was added to the top of the cell at the same concentration. Incubated for hours. After the incubation was completed, the amount of each derivative present in the receiving portion at the bottom was measured by a victor fluorescence meter (victor fluorescence meter, 340/520) to compare the degree of permeation (Table 2).
  • the synthesized 10 peptide derivatives all showed a very excellent skin permeability compared to the control.
  • the S3-1 peptide, S3-2 peptide, S3-3 peptide, S3-7 peptide, S3-8 peptide, S3-9 peptide and S4-9 peptide show relatively excellent skin permeability among the 10 peptides.
  • S3-2 peptide showed the best skin permeability.
  • the main mechanism by which a substance penetrates the skin is the way in which the substance dissolves in the components of the skin and diffuses from the uppermost layer to the lower layer. Through this, the effective substance can be effectively delivered to the entire skin.
  • the surface of the skin is composed of keratin and keratin gap material, and in order for the selected peptide to effectively penetrate the skin, the solubility of components of the skin surface must be good.
  • the solubility of the substance in the skin component can be analyzed by measuring the amount bound to the substance after reacting it with the skin for a short time (10 minutes).
  • pig skin was first cut to a size of 10 mm ⁇ 10 mm, and phages capable of expressing each peptide selected in Example 1 were added thereto, and then the degree of binding to the pig skin was measured. At this time, a phage expressing a peptide having an amino acid sequence of "TDMNKTEIRFVR (SEQ ID NO: 21)" was used.
  • anti-M13 antibody HRP conjugate was used.
  • a control group without phage was set as a negative control group.
  • the cut pork skin was placed in a 1.5 ml tube and 500 ⁇ l of TBS (1% BSA) was added.
  • TBS 1% BSA
  • no phages were added.
  • 10 10 phages were added for 10 minutes. Incubated. Then, using a TBS solution containing 1% BSA was washed 10 times for 1 minute at 12,000 RPM.
  • TBS solution containing 1% BSA containing an anti-M13 antibody HRP (Horseradish peroxidase) conjugate was added and further incubated for 5 minutes.
  • TBS solution containing 1% BSA was added to the culture, washed 10 times at 12,000 RPM for 1 minute, and then all remaining buffer was removed, and TMB solution (Tetramethylbenzidine solution, Amersham) was further added. At this time, the TMB is degraded by HRP bound to the antibody to give a blue color.
  • the reaction was stopped by treatment with 0.2 N sulfuric acid, the blue color was changed to yellow, and the absorbance (450 nm) was measured to determine the degree of binding between the phage and the skin.
  • FIG. 1 is a photograph and a graph showing the amount of phage expressing a negative control, a control group and S3-2 respectively bound to pig skin.
  • each of the peptides remaining in the skin shows a high skin residual compared to the control.
  • S3-1, S3-2, S3-3, and S3-7 bind to the skin at a relatively high level among the 10 peptides, among which S3-2 binds to the skin at the highest level. It was confirmed.
  • the pig skin was reacted with the derivative, and the amount of peptide dissolved on the surface was measured. Specifically, cut pig skin was placed in a 1.5 ml tube and 500 ⁇ l of TBS (1% BSA) was added. In addition, the control group and each derivative to be measured were incubated with the skin for 10 minutes. As a control, a peptide consisting of the amino acid sequence of "TDMNKTEIRFVR (SEQ ID NO: 21)" was used.
  • the cells were washed 10 times at 12,000 RPM for 1 minute using TBS (1% BSA), and the pig skin was terminated in a 24-well plate, and the amount of peptide remaining on the surface was measured using a victor fluorescence meter. meter, 340/520) and compared (Table 4).
  • Table 4 Amount of Peptide Derivatives in Pig Skin Type of derivative Fluorescence intensity (340/520) Control 4200 S3-1 Peptide Derivatives 143000 S3-2 Peptide Derivatives 260000 S3-3 Peptide Derivatives 47000 S3-7 Peptide Derivatives 98000 S3-8 Peptide Derivatives 100000 S3-9 Peptide Derivatives 47000 S4-4 Peptide Derivatives 13200 S4-7 Peptide Derivatives 37600 S4-9 Peptide Derivatives 56000 S4-10 Peptide Derivatives 25000
  • the level of each peptide derivative remaining in the skin was confirmed that all peptide derivatives are higher than the control group.
  • the S3-1 peptide, S3-2 peptide, S3-7 peptide and S3-8 peptide remained in the skin at a relatively high level among the 10 peptides, and among them, the S3-2 peptide was the highest.
  • the level was confirmed to remain on the skin.

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Abstract

본 발명은 피부 투과성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부를 투과하여 약물을 전달할 수 있는 분리된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 상기 펩타이드를 포함하는 경피 전달용 조성물 및 상기 펩타이드 및 카고를 포함하는 펩타이드-카고 복합체에 관한 것이다.

Description

피부 투과성 펩타이드
본 발명은 피부 투과성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부를 투과하여 약물을 전달할 수 있는 분리된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 상기 펩타이드를 포함하는 경피 전달용 조성물 및 상기 펩타이드 및 카고를 포함하는 펩타이드-카고 복합체에 관한 것이다.
피부를 통하여 약물을 전달하는 것은 이의 사용 편리성으로 인하여, 진통패치, 금연패치 또는 임신 조절제 등 다양한 분야 및 형태로 사용되고 있다. 이러한 피부를 통과하는 약물은, 주로 피부를 통하여 체순환계(systemic circulation)로 전달시키기 위한 것이나, 이외에도 아토피 치료제, 미백 또는 주름 개선용 화장품 등의 약물은 피부 자체의 기관에 전달시키려는 목적으로 사용되기도 한다. 이런 편리성 및 기능성에도 불구하고, 피부의 구조상 약물을 피부를 통과하여 전달하는 것에는 많은 어려움이 존재하여, 피부를 통과하는 약물을 개발하는 것이 쉽지 않다. 피부 외부에는, 약 10μm 내지 45μm 정도의 두께를 가지는 약 10층에서 15층의 각질세포(corneocyte)로 이루어진 각질층이 존재하며, 이러한 각질층은 모르타르(mortar)와 브릭(brick) 구조라 불리는 형태로 이루어져 있다. 상기 각질층은, 케라틴이 풍부한 각질세포로 이루어져 있는 브릭(brick) 구조와, 이러한 각질세포 사이를 세라마이드(ceramide), 지방산(fatty acid), 또는 왁스(wax) 등과 같은 지질이 채운 모르타르(mortar) 구조로 이루어져 있다. 이러한 구조에 의하여, 피부 외부는 내부의 수분의 손실을 막으면서, 외부로부터의 침입을 막는 구조를 가지게 된다. 그러나, 이러한 구조는 그 목적에 충실하게 물질 투과성이 아주 낮은 특성을 가지게 된다. 500Da 이하의 저분자 구조 성분들만이 확산 방식에 의해서 피부 내로 전달될 수 있며, 주로 모르타르 구조의 세포 내 지질 층이나, 지질층 간의 수용성 구조를 통하여 이루어 진다. 이러한 약물의 피부 내로의 전달은, 약물의 성질에 따라서도 크게 좌우될 수 있다. 또한, 피부 내로의 약물 전달은, 피부 표면을 직접 통과하는 방식 이외에도 피부의 땀샘, 모공, 피지선 등의 구조를 이용하여 전달될 수도 있다.
이러한 배경 하에, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있는 약물 및 약물 전달 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10(interleukin-10)의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 우수한 IL-10 유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타내므로, 다른 약물의 전달용 담체로서는 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 이에, 피부 질환의 치료 및 약학적 활성 제제의 피부투과촉진에 사용될 수 있는 피부 투과성 펩타이드가 개발된 바 있다(미국등록특허 제7,659,252호). 상기 펩타이드는 우수한 피부투과도를 나타낼 뿐만 아니라 다른 약물의 경피전달용 담체로서도 사용될 수 있다는 장점이 있으나, 피부를 투과한 다음에는 체내의 순환시스템을 통해 소모되기 때문에, 피부를 표적으로 하는 약물의 경우에는 별다른 효과를 발휘하지 못한다는 단점을 가진다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도, 피부에 잔류할 수 있는 특성을 가지는 피부 투과성 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 분리된 펩타이드를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 분리된 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리된 펩타이드 및 카고를 포함하는 펩타이드-카고 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리된 펩타이드를 포함하는 경피 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 이용하여 카고를 경피 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된, 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소루신 I
루신 L 라이신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명에서는, 피부 투과성을 나타내며, 추가로 피부 잔류성을 나타낼 수 있어, 펩타이드 또는 단백질 등과 같은 약물의 경피 전달 시스템에 적용할 수 있는 신규한 펩타이드를 개발하였다.
이러한 본 발명의 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
NQTDHLFSTFIS(서열번호 1), NGSLNTHLAPIL(서열번호 2), GGSIAASELEYY(서열번호 3), ELKQVVISDINH(서열번호 4), MVRDHPGLSGWT(서열번호 5), TSGISINKLPHT(서열번호 6), IFAALDYNLGRH(서열번호 7), DMKWTLKEWMTH(서열번호 8), QIEKHVYFNASQ(서열번호 9), TNIPSLSGILMK(서열번호 10).
또한, 본 발명에서 상기 분리된 펩타이드는 상기 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 서열로 구성된 것뿐만 아니라, 피부 투과성 또는/및 피부 잔류성을 나타내는 한, 상기 서열의 말단 부위의 하나 이상의 아미노산이 제거 또는 치환되거나, 80% 이상의 상동성을 보이는 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 분리된 펩타이드는 피부 투과성을 나타내는 것을 특징으로 하며, 나아가 추가로 피부 잔류성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 용어, "피부 투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력을 의미하며, 상기 "피부 잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부 내의 조직에 결합되어 피부 내에 잔류하는 능력을 의미한다. 표적 조직을 피부조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 경우에는, 상기 펩타이드와 결합된 성분이 피부조직 또는 피부세포에 작용할 수 있도록 피부조직에 잔류하는 특성이 우수한 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 피부 투과성뿐만 아니라 피부 잔류성이 우수하므로, 표적조직을 피부조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 담체로서도 유용하게 사용될 수 있다.
이러한 피부 투과성을 나타내는 펩타이드는 이와 결합하는 다른 펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 상업적으로 판매되는 약물 등과 같은 다양한 종류의 카고(cargo)의 경피 전달을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "카고"는 피부를 투과하여 피부 내로 전달되고자 하는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 카고는 본 발명의 분리된 펩타이드에 연결되어 피부 내로 전달되는 물질이라면, 특별히 그 종류는 제한되지 않으나, 그 예로 펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, siRNA, 벡터 또는 바이러스와 같은 유전자 치료를 위한 물질, 또는 상업적으로 판매되는 약물 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 파지 디스플레이 방법을 통하여 본 발명의 펩타이드가 제시된 파지가 돼지 피부를 투과할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 내지 5).
상기 카고는 본 발명의 분리된 펩타이드에 연결된 복합체 형태로 피부 내로 전달될 수 있다. 여기서, 상기 복합체는 카고가 공유결합으로 펩타이드에 연결된 형태; 및 카고와 펩타이드가 비공유적 상호작용으로 결합된 형태를 모두 포함한다. 또한, 카고가 펩타이드 또는 단백질인 경우, 융합 단백질 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 카고가 공유결합으로 펩타이드에 연결된 경우에는 링커를 통하여 연결되거나, 직접 연결될 수 있다.
본 발명에서 용어, "링커"는 기본적으로는 두 개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 공유결합을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미한다. 상기 링커는 펩타이드 링커 또는 비펩타이드 링커일 수 있으며, 펩타이드 링커인 경우에는, 하나 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 또는/및 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다. 특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation) 또는/및 C-말단을 아미드화(amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 펩타이드는 추가로 C-말단에 단실(dansyl)기가 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 펩타이드는 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여, 융합파트너 및 본 발명의 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 이를 숙주 세포에 형질전환시킨 후, 융합 단백질 형태로 발현하고, 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다. 이를 위하여 예를 들어 Factor Xa나 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합파트너와 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 파지 디스플레이 방법을 이용하여 피부 투과성 펩타이드 10종(서열번호 1 내지 10)을 선별하였고, 선별된 피부 투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 피부 투과성을 확인한 결과, 대조군에 비하여 우수한 피부 투과성을 나타냄을 확인하였다(표 1). 또한, 상기 펩타이드의 C 말단에 단실기가 결합된 형태의 펩타이드 유도체를 각각 합성하고, 이의 흡광도를 측정하여 이들 펩타이드의 피부 투과성을 확인한 결과, 상기 펩타이드 역시 우수한 피부 투과성을 나타냄을 확인하였다(표 2). 아울러, 상기 피부 투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 피부 잔류성을 확인한 결과, 대조군에 비하여 현저히 우수한 피부 잔류성을 나타냄을 확인하였다(표 3). 또한, 상기 펩타이드의 C 말단에 단실기가 결합된 유도체를 이용하여, 펩타이드의 피부 잔류성을 확인한 결과, 상기 펩타이드가 우수한 피부 잔류성을 나타냄을 확인하였다(표 4).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴현상으로 인하여 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 하기의 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성될 수 있다.
피부 투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드:
AATCAGACTGATCATCTTTTTTCGACGTTTATTTCT(서열번호 11),
AATGGTTCTCTTAATACTCATCTTGCGCCGATTCTG(서열번호 12),
GGTGGTAGTATTGCTGCTTCGGAGCTGGAGTATTAT(서열번호 13),
GAGCTGAAGCAGGTTGTGATTTCTGATATTAATCAT(서열번호 14),
ATGGTTCGGGATCATCCTGGTCTTTCTGGTTGGACG(서열번호 15),
ACTTCGGGGATTTCTATTAATAAGTTGCCGCATACT(서열번호 16),
ATTTTTGCTGCGTTGGATTATAATCTGGGTCGTCAT(서열번호 17),
GATATGAAGTGGACGCTGAAGGAGTGGATGACTCAT(서열번호 18),
CAGATTGAGAAGCATGTTTATTTTAATGCTAGTCAG(서열번호 19),
ACGAATATTCCTTCGTTGTCGGGGATTCTTATGAAG(서열번호 20)
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분리된 펩타이드 및 카고를 포함하는 펩타이드-카고 복합체를 제공한다.
상기 분리된 펩타이드, 카고 및 복합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분리된 펩타이드를 포함하는 경피 전달용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 추가로 카고를 포함할 수 있으며, 카고를 포함하는 경우, 상기 펩타이드와 카고는 펩타이드-카고 복합체의 형태로 존재할 수 있다.
상기 펩타이드는, 피부 투과성을 나타내므로, 이를 펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, siRNA 또는 상업적으로 판매되는 약물 등과 같은 다양한 카고의 경피(transdermal) 또는 피부를 통한(percutaneous) 전달을 위한 조성물로서 사용할 수 있으며, 상기 카고의 담체로서 기능할 수 있다. 상기 담체란, 물질을 어느 특정 부위에 전달하는 물질로서, 본 발명의 펩타이드는 피부 투과성을 나타내므로 이를 포함하는 조성물을 피부 내로 카고를 전달하는 담체로서 이용될 수 있다.
특히, 상기 담체 또는 조성물은 신체 표면을 통하여 약물을 전달시키기 위하여, (a) 신체에 손상을 가하지 않으면서, 신체 표면을 통해 약물 전달을 가져올 수 있는 양의 본 발명의 펩타이드; 및 (b) 유효량의 카고를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩타이드를 포함하는 본 발명의 경피 전달용 조성물은 그 목적에 비추어, 피부 내로 전달되기 용이한 형태, 에컨대 피부 외용제의 형태인 것이 바람직하며, 또한, 상기 조성물은 리포좀, 미쉘, 및 마이크로스피어와 함께 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "피부 외용제"란, 피부 외용으로 제공되는 제제를 의미한다. 그 예로, 연고(ointment), 크림, 겔, 로션, 페이스트, 패치와 같은 제형 등이 있으나, 피부 외용으로 적용하여 피부 내로 목적하는 물질을 전달하고자 하는 목적을 지닌다면 특별히 그 종류가 제한되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 당업계에 알려진 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 여기서, 담체는 경피 전달 또는 국부 전달에 적합한 물질인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 유용한 담체 또는 첨가제는 피부에 독성을 나타내지 않으면서도, 조성물에 포함된 해로운 방식으로 다른 성분과 상호작용하는 것이 아닌 것이 바람직하다.
아울러, 본 발명의 조성물은 그 자체로는 피부 내로 전달이 용이하지 않은 약물의 전달에 사용될 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드 외에도 피부 투과를 촉진시킬 수 있는 물질을 추가로 더 포함할 수 있다. 이러한 피부 투과를 촉진시키는 물질은, 피부 손상 가능성, 자극 및 전신증상을 최소화할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물에 추가로 포함될 수 있는 이러한 피부 투과를 촉진시킬 수 있는 물질의 예로는, 포화 또는 불포화 지방산; 지방족 알코올; 담즙산; 비이온성 계면활성제, 아민, 아마이드, 탄화수소 용매, 터핀, 저급 알킬 에스터, 사이클로덱스트린 강화제, 질소를 함유하는 헤테로사이클, 설폭사이드 및 우레아; 및 이들의 유도체가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 전달하고자 하는 물질이 치료적 물질인 경우, 약학적 조성물의 형태일 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 약제학적 조성물로 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 또한, 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 화장료 조성물의 형태일 수 있다.
상기 펩타이드는 우수한 피부 투과성을 나타내며, 피부 잔류성 또한 나타낼 수 있으므로, 이를 화장료 조성물에 포함시켜, 화장료 조성물에 포함되는 유효 성분, 예컨대 미백 성분과 같은 다양한 성분의 피부 내로의 전달을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적인 보조제 예를 들어, 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 뿐만 아니라 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제와 함께 일반 화장품 또는 기능성 화장품의 구성요소로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품을 의미한다. 그 예로, 상기 기능성 화장품은 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름 개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 화장품을 의미한다.
본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 로션, 젤, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 연고, 스틱, 패취, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 카고를 경피 전달하는 방법을 제공한다.
상기 펩타이드 및 카고에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 카고를 경피 전달하는 방법은 상기 펩타이드-약물 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 피부 투과성이 우수하므로, 상기 방법을 이용하면 펩타이드에 연결된 카고를 피부 내로 효과적으로 전달시킬 수 있다. 상기 개체는 카고의 피부 내 전달이 요구되는 개체라면 제한없이 포함하며, 그 예로 소, 돼지, 양, 닭, 개 또는 인간 등을 포함하는 포유 동물, 또는 조류 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 펩타이드는 우수한 피부 침투 효과뿐만 아니라, 피부 잔류 효과를 나타내므로, 피부 조직에 적용하고자 하는 다양한 경피 전달용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 음성 대조군, 대조군 및 S3-2를 발현시키는 파지 각각이 돼지 피부에 결합하는 양을 나타내는 사진 및 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 피부 투과성 펩타이드의 선별
피부 투과성 펩타이드를 선별하기 위해서 경피 제제의 용출 실험 방법을 응용하였다. 이를 위해 프란츠 유리 셀(Franz glass cell, Standard 직경 9mm, Receiver 5㎖, Permgear)을 이용하였다. 유리 셀의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 그 상단에 파지를 처리한 다음, 돼지피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 잔류하는 파지를 증폭하였다. 이 과정을 1회 진행하는 것을 1 라운드(round) 선별한 것으로 정의하였다. 1 라운드에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2 라운드를 진행하는 방식으로, 피부 투과력이 좋은 파지를 경쟁 방식으로 선별하였고, 총 3 라운드를 수행하였다.
또한, 피부와 파지의 코팅 단백질 사이에 생길 수 있는 비특이적인 결합을 감소시키기 위하여, 유리 셀의 상단과 하단 각각에, 500㎕와 5㎖의 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) 용액에 1% BSA(Sigma)를 용해시킨 것을 사용하였다.
아울러, 무작위적인 펩타이드 서열을 가지는 파지를 가지고 시작하기 위해서, Ph.D-12 파지 라이브러리 키트(New England Biolab)를 사용하였다. 500㎕의 TBS(1% BSA)에 109개의 파지를 처리하였다. 이후 16시간동안 배양하였고, 상기 수용부의 TBS 5㎖를 모두 사용하여 파지를 증폭하였다.
파지를 증폭하기 위한 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)를 이용하였다. 25㎖의 LB 배지에 진탕 배양된 ER2738를 접종하고 O.D.(550nm) 0.5에서 투과한 파지가 있는 TBS 5㎖를 모두 처리하고 4시간 배양하였다. 이후 8000G로 원심 분리하여 E.coli와 파지를 서로 분리하였다. 그 다음, 파지가 있는 상층액에 6㎖의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 파지를 침전시켰다. 8000G로 원심 분리후 침전된 파지에 TBS 용액을 처리하여 파지를 분리하여 보관하였다.
최종적으로, 피부 투과성 파지가 가지는 펩타이드를 확인하기 위해서 파지를 단일 콜로니에서 증폭시켰다. 파지를 가지는 E.coli ER2738는 LB/X-gal/IPTG 플레이트에서 파란색을 띄는 성질을 이용하여 선별하였다. 구체적으로, ER2738 배양액300㎕에 파지를 TBS로 적정량 희석하고, 2㎕를 처리한 뒤, 이를 TOP 아가(agar) 4㎖에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG 플레이트 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 청색의 콜로니를 선별하였다. 각각의 콜로니를 5㎖의 ER2738 배양액에 6시간동안 추가로 배양하고, Ph.D-13 파지 스핀 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리한 다음, 이들의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 10종의 피부 투과성 펩타이드(S3-1 파지(서열번호 1), S3-2 파지(서열번호 2), S3-3 파지(서열번호 3), S3-7 파지(서열번호 4), S3-8 파지(서열번호 5), S3-9 파지(서열번호 6), S4-4 파지(서열번호 7), S4-7 파지(서열번호 8), S4-9 파지(서열번호 9) 및 S4-10 파지(서열번호 10))를 선별하였다.
실시예 2: 피부 투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 피부 투과성 확인
상기 실시예 1에서 선별된 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 가지는 각각의 펩타이드를 발현시킬 수 있는 파지들의 피부 투과성을 확인하였다.
구체적으로, 프란츠 유리 셀의 상단과 하단 사이에 돼지 피부를 장착하고, 피부와 파지의 코팅 단백질 사이에 생길 수 있는 비특이적인 결합을 줄여주기 위하여, 상단과 하단 각각에는 500㎕와 5㎖의 TBS용액에 1% BSA를 용해시킨 것을 사용하였다. 처리하는 파지의 수를 1010 개로 일정하게 맞추어서 상기 프란츠 유리 셀의 상단에 처리하였다. 이때, 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR(서열번호 21)"의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 발현할 수 있는 파지를 이용하였다. 이를 돼지 피부와 16시간 동안 반응시킨 후에, 이를 투과하여 수용부에 있는 파지의 수를 측정하였다. 이를 위하여, ER2738 배양액 300㎕ 및 파지를 포함하는 수용부의 TBS 10㎕를 혼합하였고, 이를 TOP 아가 4㎖에 섞은 후, LB/X-gal/IPTG 플레이트 상단에 처리하고, 16시간 동안 추가로 배양한 다음, 청색 콜로니의 수를 계수하였다(표 1).
표 1
돼지피부를 투과한 파지의 수
파지의 종류 투과한 파지의 수
대조군 3
S3-1 3100
S3-2 9000
S3-3 2500
S3-7 1400
S3-8 250
S3-9 360
S4-4 440
S4-7 720
S4-9 450
S4-10 350
상기 표 1에서 보듯이, 상기 선발된 10종의 펩타이드를 가지는 파지는 모두, 대조군에 비하여 우수한 피부 투과성을 나타내었다. 특히, S3-1, S3-2, S3-3 및 S3-7은 상기 10종의 펩타이드를 가지는 파지 중에서도 보다 우수한 피부 투과성을 나타냄을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2가 가장 우수한 피부 투과성을 나타냄을 확인하였다.
이와 같은 결과는, 본 발명의 10종의 분리된 펩타이드가 우수한 피부 투과성을 가짐을 나타내는 결과이다.
실시예 3: 피부 투과성 펩타이드 유도체의 피부 투과성 확인
상기 실시예 1에서 선별된 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 각각의 펩타이드의 C 말단에 단실(Dansyl)기가 결합된 형태의 유도체를 각각 합성하고, 이들 유도체의 피부 투과성을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 각각의 펩타이드들을 화학적으로 합성한 다음, 펩타이드의 C'-말단에 단실(Dansyl)기를 추가한 유도체를 각각 합성하였으며, 대조군으로는 C'-말단에 단실기를 추가한 "TDMNKTEIRFVR (서열번호 21)"의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 사용하였다.
또한, 프란츠 유리 셀의 상단과 하단 사이에 돼지 피부를 장착하고, 상기 셀의 상단과 하단 각각에 500㎕와 5㎖의 TBS 용액을 가한 다음, 셀 상단에 유도체 각각을 동일한 농도로 가하면서, 16시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 하단의 수용부에 존재하는 각 유도체의 양을 빅터 형광 미터(victor fluorescence meter, 340/520)로 측정하여 투과 정도를 비교하였다(표 2).
표 2
돼지피부를 투과한 펩타이드 유도체의 양
유도체의 종류 형광 세기(340/520)
대조군 1500
S3-1 펩타이드 유도체 42000
S3-2 펩타이드 유도체 70000
S3-3 펩타이드 유도체 19000
S3-7 펩타이드 유도체 25000
S3-8 펩타이드 유도체 22000
S3-9 펩타이드 유도체 18000
S4-4 펩타이드 유도체 4400
S4-7 펩타이드 유도체 8600
S4-9 펩타이드 유도체 16000
S4-10 펩타이드 유도체 9000
상기 표 2에서 보듯이, 상기 합성된 10종의 펩타이드 유도체는 모두 대조군에 비하여 매우 우수한 피부 투과성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1 펩타이드, S3-2 펩타이드, S3-3 펩타이드, S3-7 펩타이드, S3-8 펩타이드, S3-9 펩타이드 및 S4-9 펩타이드는 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 우수한 피부 투과성을 나타내었으며, 그 중에서도 S3-2 펩타이드가 가장 우수한 피부 투과성을 나타내었다.
실시예 4: 피부 투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 피부 잔류성 확인
물질이 피부를 투과하게 되는 주요 메커니즘은 피부의 성분에 물질이 용해되어서, 최상층에서 하층으로 확산되는 방식으로 진행되는 것이다. 이를 통하여 피부 전체에 유효물질이 효과적으로 전달될 수 있다. 피부의 표면은 각질과 각질 간극 물질 등으로 이루어져 있고, 선별된 펩타이드가 피부를 효과적으로 투과하기 위해서는 피부 표면을 이루는 성분에 대한 용해성이 좋아야 한다. 이러한 물질의 피부 성분에 대한 용해성은, 짧은 시간(10분)동안, 물질을 피부와 반응시킨 후 이에 결합된 양을 측정하여 분석할 수 있다. 또한 워시-오프(wash-off) 제품에 사용할 경우, 특히 피부와의 결합력이 좋아야 한다. 이 경우, 먼저 피부와의 결합 후 내부로 확산되게 된다. 따라서 선별된 파지의 피부 결합성을 측정하여 상기 펩타이드의 우수성을 확인하고자 하였다.
이를 위해, 먼저 돼지 피부를 10mm X 10mm 크기로 절단하였고, 상기 실시예 1에서 선별한 각각의 펩타이드를 발현시킬 수 있는 파지를 가한 다음, 상기 돼지 피부에 대한 결합정도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR(서열번호 21)"의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 발현시키는 파지를 이용하였다.
상기 돼지 피부에 결합한 파지의 양을 측정하기 위하여, anti-M13 항체 HRP 컨쥬게이트를 이용하였다. 항체 자체와 피부와의 결합에 의한 시그널을 제거하기 위해서 파지가 없는 대조군을 음성대조군으로 설정하였다. 절단한 돼지 피부를 1.5㎖ 튜브에 넣고 500㎕의 TBS(1% BSA)를 가한 다음, 상기 음성대조군의 경우 파지를 넣지 않고, 대조군과 측정하고자 하는 파지의 경우, 1010개의 파지를 가하여 10분간 배양하였다. 그런 다음, 1% BSA를 포함하는 TBS용액을 이용하여 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척하였다. 이어, 항-M13 항체 HRP(Horseradish peroxidase) 컨쥬게이트가 포함된 1% BSA를 포함하는, TBS 용액 500㎕를 가하고, 5분간 추가로 배양하였다. 상기 배양물에 1% BSA를 포함하는 TBS 용액을 가하고, 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척한 다음, 잔류하는 완충액을 모두 제거하였으며, TMB 용액(Tetramethylbenzidine solution, Amersham)을 추가로 가하였다. 이때, 상기 TMB는 항체에 결합된 HRP에 의해서 분해되어 파란색을 발색시킨다. 최종적으로, 0.2N 황산을 처리하여 반응을 정지시키고, 파란색을 노란색으로 변화시킨 다음, 흡광도(450nm)를 측정하여 파지-피부 간 결합정도를 측정하였다. 그 다음, 각각의 흡광도에서 음성 대조군의 흡광도를 삭제하여 산출한 흡광도를 바탕으로, 각각의 활성을 상호 비교하였고, 그 결과를 표 3 및 도 1에 나타내었다. 도 1은 음성 대조군, 대조군 및 S3-2를 발현시키는 파지가 각각 돼지 피부에 결합하는 양을 각각 나타내는 사진 및 그래프이다.
표 3
피부에 잔류하는 파지의 양
파지의 종류 흡광도(450nm)
대조군 0.07
S3-1 0.32
S3-2 0.56
S3-3 0.25
S3-7 0.27
S3-8 0.21
S3-9 0.18
S4-4 0.21
S4-7 0.22
S4-9 0.21
S4-10 0.21
상기 표 3 및 도 1에 나타난 바와 같이, 피부에 잔류하는 각 펩타이드 모두는 대조군에 비하여 높은 피부 잔류성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1, S3-2, S3-3 및 S3-7은 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 높은 수준으로 피부에 결합함을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2가 가장 높은 수준으로 피부에 결합함을 확인하였다.
실시예 5: 피부 투과성 펩타이드 유도체의 피부 잔류성 확인
상기 실시예 3에서 합성된 각 유도체들의 피부 결합성을 확인하기 위해서, 돼지 피부와 상기 유도체를 반응시키고, 표면에 용해된 펩타이드의 양을 측정하였다. 구체적으로, 잘라낸 돼지 피부를 1.5㎖ 튜브에 넣고 500㎕의 TBS(1% BSA)를 넣었다. 여기에 대조군과 측정하고자 하는 각 유도체를 추가하여 피부와 함께 10분간 배양하였다. 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR (서열번호 21)"의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 이용하였다. 배양 이후 TBS(1% BSA)를 이용하여 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척하고, 상기 반응이 종료된 돼지 피부를 24웰 플레이트에 옮긴 다음, 표면에 잔류하는 펩타이드의 양을 빅터 형광 미터(victor fluorescence meter, 340/520)로 측정하여 비교하였다(표 4).
표 4
돼지 피부에 잔류한 펩타이드 유도체의 양
유도체의 종류 형광 세기(340/520)
대조군 4200
S3-1 펩타이드 유도체 143000
S3-2 펩타이드 유도체 260000
S3-3 펩타이드 유도체 47000
S3-7 펩타이드 유도체 98000
S3-8 펩타이드 유도체 100000
S3-9 펩타이드 유도체 47000
S4-4 펩타이드 유도체 13200
S4-7 펩타이드 유도체 37600
S4-9 펩타이드 유도체 56000
S4-10 펩타이드 유도체 25000
상기 표 4에서 보듯이, 피부에 잔류하는 각 펩타이드 유도체의 수준은 모든 펩타이드 유도체가 대조군보다도 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1 펩타이드, S3-2 펩타이드, S3-7 펩타이드 및 S3-8 펩타이드는 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 높은 수준으로 피부에 잔류함을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2 펩타이드가 가장 높은 수준으로 피부에 잔류함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된, 분리된 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 피부 투과성인 것인 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 추가로 피부 잔류성을 나타내는 것인 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 카고(cargo)의 경피 전달을 위한 것인 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 C-말단이 아미드화된 것인 펩타이드.
  6. 제1항의 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 내지 20으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 분리된 펩타이드를 포함하는, 경피 전달용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 카고(cargo)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 카고는 분리된 펩타이드에 공유결합으로 연결된 형태; 또는 분리된 펩타이드와 비공유적 상호작용으로 결합한 형태인 것인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제의 형태를 가지는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 분리된 펩타이드, 및 카고를 포함하는, 펩타이드-카고 복합체.
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