WO2014005682A2 - Mikroskop und verfahren zur spim mikroskopie - Google Patents

Mikroskop und verfahren zur spim mikroskopie Download PDF

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    • G02B27/0988—Diaphragms, spatial filters, masks for removing or filtering a part of the beam

Definitions

  • the invention relates to a microscope which comprises an imaging objective for imaging a specimen on a detector and means for illuminating the specimen with a light sheet in the focal plane of the imaging objective or in a defined plane in the vicinity of this focal plane.
  • the means for illumination comprise a coherent light
  • a microscope with the illumination beam path and detection beam path in the
  • sample with a light sheet in the focal plane of the imaging lens i. perpendicular to its optical axis
  • SPIM selective plane illumination microscopy
  • LSM confocal laser scanning microscopy
  • SPIM technology is based on wide-field microscopy and allows visualization of the sample based on optical sections through individual planes of the sample.
  • Fig.1 the basic structure of a SPIM microscope is shown first.
  • the light from an illumination source 1 is formed into a light sheet via an illumination optical system 2 and directed onto a sample 3.
  • Sample and light sheet are in the focal plane of an imaging lens 4.
  • the optical axis of the imaging lens 4 is perpendicular to the direction from which the sample 3 is illuminated.
  • the illumination optics 2 usually comprises a plurality of optical elements which collimate the coherent light of the illumination source 1 and form a light sheet therefrom.
  • the prior art includes the
  • Illumination optics 2 usually also a cylindrical lens whose flat side facing the sample and whose curved side points in the direction of the illumination source.
  • illumination optics 2 are to be explained, with which the generation of a light sheet with increased depth of field and reduced shadowing is possible in relation to arrangements known from the prior art.
  • the light sheet that is elongated less than 1 ⁇ m in one direction (the y direction) but as far as possible in the other two directions, with no light above and below in the y direction of the light sheet. This light above and below the sheet of light would disturb the measurement from the observation direction (y-direction).
  • Interference patterns may be thin in the y-direction and in principle theoretically infinitely extended in the x and z directions, but periodically propagate in y so that there is a great deal of light outside the sheet of light
  • Bessel beams (DE 10 2007 063 274 A1) can theoretically be infinitely extended in the z-direction, in y they have the desired diameter, but again very much power is in the y-direction outside the beam; If you scan a Bessel beam in the x-direction, you will get a light sheet, but with a lot of light output above and below the desired plane.
  • Line focus with cylindrical lens With a cylindrical lens, a focus can be generated in the x-direction; If you scan the beam in the z direction by defocusing, you can also create a light sheet.
  • a cylindrical lens forms a line focus in the x direction (at a distance f behind the cylindrical lens) from the incident collimated laser beam. This can be shifted in the z-direction (defocus, realizable for example by changing the focal length f by a
  • the claims are expressly included in the disclosure of the invention.
  • the invention relates both to a microscope for "SPIM" microscopy and a
  • a propagation-invariant or well-defined distribution in the z-direction is obtained by limiting the z-component in the frequency spectrum of the light.
  • Each z-component undergoes a different phase shift due to "propagation”, which is why it is advantageous to restrict the z-components of the frequency spectrum with a filter function
  • a sinc (z) function as a filter function in the z-direction
  • Other functions are also conceivable in principle like a sinc (z) A 2 function, but the sinc function offers the particular advantage of enabling an (idealized) constant profile in z.
  • the Sinc function should be mentioned here as particularly advantageous for functions that allow an approximately constant beam profile on the axis over a larger range in the z direction.
  • a sinc (z) filter in front of the cylinder lens.
  • the sinc (z) filter is transformed into the y direction and implemented as a filter in the y direction.
  • this requires a relatively complex filter because the sinc function has positive and negative values.
  • a pure amplitude filter can only accept positive values for the transmission.
  • a negative value of the transmission of the filter corresponds to one
  • Phase shift by ⁇ / 2 With an additional phase shift of e.g. ⁇ / 2, however, negative values for the transmission can also be realized.
  • the filter function In the x direction, the filter function can be constant.
  • Figure 2 shows such an example of the theoretically ideal transmission curve of a complex filter. Shown schematically is a collimated laser beam LK which passes through a space filter F arranged in the pupil of a used optics and is influenced by this in amplitude and phase. The corresponding spatial light distribution is shown schematically as a modulated laser beam ML.
  • the sinc (v z ) thus projected onto the y-axis provides for expansion in the z-direction.
  • the sinc (v z ) projected into the v y axis does not yet limit the beam profile ideally in the y direction. Superimposed is the in the y-direction projected sinc (v z)
  • this sinc (v y ) ensures that the light leaf is bounded in the y direction
  • the sinc (v z ) projected into the v y axis ensures that the light leaf remains constant over a certain z distance.
  • Both sinc functions influence each other; a small y-extension requires an extended sinc (v y ) which, as shown in the example, should correspond approximately to the projected sinc (v z ).
  • a DOF ⁇ 8pm can be achieved. Further examples are listed on the following pages.
  • the light sheet may also be implemented with a conventional rotationally symmetric optic having, for example, spherical surfaces.
  • the filter function in direction (Sinc (v z )) is then projected as a rotationally symmetric function into the xy plane and multiplied by one or two other filter functions in x and y to obtain the desired bound in y and the desired spread in x and z
  • sinc (v y ) function in the y direction for the thin light sheet in the y direction
  • v x very narrow sinc
  • FIG. 3 in a cross section along a Y / Z sectional area along the Y axis of FIG. 2, an amplitude distribution A superimposed on three filter functions (x, y, z) is shown by way of example.
  • anamorphic optics such as the illustrated cylindrical lens an extended line focus with a focal length of 10pm in the z-direction at a thickness of about 1 ⁇ in y
  • a light sheet even smaller thickness is possible, for example ⁇ x ⁇ ⁇ x 2 ⁇ ⁇ ⁇ (x times z times y).
  • the zero point of the sinc functions in the pupil of the illumination optics can be freely selected.
  • Smaller leaflets with diameter in y of 1 pm are also possible (e.g., 10pm x 100pm x 1pm XxZxY at a wavelength of 0.5pm).
  • the new filter light sheets with large lateral expansions with a small thickness in the y direction and in the y direction little light outside of the light sheet can be generated, which are significantly better than the known from the prior art light sheets, for example at least one factor have two larger dimensions in x or z than Gaussian beams, or have at least a factor of 10 less light intensity in the y-direction outside the light sheet than a Bessel beam or a two-beam interference pattern.
  • the light sheets can also be in both the z-direction and in the x-direction (depending on the position of the filter in the pupil). This makes the arrangement particularly flexible.
  • the light sheets can be modulated with a phase function to shift them in x, y, and z direction (focus or shift).
  • the light sheets can be used e.g. also be moved (scanned) through the room with an SLM (Spatial Light Modulator).
  • SLM Spatial Light Modulator
  • This SLM would be used alone or in conjunction with an amplitude filter and cause a shift of the light sheet, for example in the y direction.
  • confocal scanning through the sample with the observation beam is e.g. from y-. Direction possible.
  • Sinc A 3 filters are also possible to arrange several Sinc A 3 filters and thus light sheets side by side or one above the other.
  • the light sheet area can be increased or stimulated for STED, for example, an additional excitation at the edge of an excitation region.
  • the light sheets can be modulated (structured) by, for example, two Sinc A 3 filter in the pupil without defocus or phase shift brings. This can be the
  • Modulation frequency freely set.
  • the resulting interference field can be used for SIM (ZEISS Elyra S.1) or similar methods with structured illumination.
  • the light sheet thickness can be further reduced (eg ⁇ . / ⁇ ), wherein the expansion of the light sheet is lower.
  • Off-Axis with off-a
  • FIG. 5 initially shows a Sinc (v z ) filter as the complex filter in the pupil as a sectional image with lateral main maxima as shown in FIG. 4 at the bottom right.
  • FIG. 6 shows, by way of example above, a unilateral off-axis function in the pupil according to the invention in logarithmic or linear scaling (top left and bottom), the illumination situation in focus in the XY direction (top center) and XZ direction (center bottom ) and the y / Z distribution of the light in logarithmic (top right) and linear scaling (bottom right).
  • FIG. 7 shows in section an example of an impressed asymmetric and one-sided sine function FSinc in the pupil
  • Fig. 8 General realization (by way of example):
  • the first filter 1 is designed so that it generates the desired intensity in the pupil, the
  • the filter 1 may e.g. be designed as CGH (Computer Generated Hologram) and easily calculated and manufactured by known methods.
  • the second filter is then (as indicated schematically below) a pure one
  • the filters can be designed for a collimated or any other incident coherent laser beam.
  • a part of the refractive power is displaced from the first filter into the collimator (beam shaping telescope).
  • FIG. 8 shows in a) a schematic section along the Y / Z plane and in b) along an X / Z plane.
  • a beam shaping element Telescope TL
  • a combination of a first filter F1 follows in the direction of illumination
  • Amplitudenfilter can be and a second filter F2 as a phase filter, wherein advantageously the second filter F2 is arranged in the entrance pupil of an optic O.
  • Optics O can be a normal lens.
  • F1 and F2 can also be both phase filters. They create one together
  • This complex filter function produces an extensive light distribution LV extending in the Z direction, with a Y direction (perpendicular to the light surface advantageously very small extension below a range of 5 micrometers (even up to less than 2 micrometers!).
  • Mathieu rays are almost propagationally invariant in the z direction; its beam profile in the xy plane is almost independent of the z position. In the z direction, a line focus with about 1 ⁇ expansion in the y direction is possible. In the y direction, the beam diverges, but this can be suppressed. Therefore, with a Mathieu beam scanning in the x direction surprisingly a SPIM light sheet can be realized because in
  • Observation beam is located.
  • the Mathieu beam consists of two opposite ones
  • Gaussian laser beam LS along an optical illumination axis z shown schematically in a side section in the Z plane.
  • Fig. 9 c shows the lighting conditions in the front focal plane of a
  • Lens arrangement L in which a ring diaphragm RB is arranged.
  • the ring stop must be illuminated with an elliptical Gaussian beam to create a math ray.
  • An advantageous method for producing this light distribution is shown in FIG. 9a).
  • the cylindrical lens arrangement of two suitable cylindrical lenses ZL1, ZL2 in this case generates the necessary elliptical illumination distribution.
  • the annular diaphragm When passing through the annular diaphragm, the annular diaphragm is only partially detected by the illumination distribution and there are two symmetrical semi-circular components R1, R1 in the pupil plane, which subsequently generates a y-limited Mathieu beam after the lens arrangement.
  • a planar light modulator such as a "Spatial Light Modulator” (SLM) is arranged after the Gaussian laser beam, which could only apply light to the required areas of the annular diaphragm in turn, as in FIG. 9a, a Mathieu beam to create.
  • SLM Spatial Light Modulator
  • the SLM could also be arranged in the front focal plane instead of the annular diaphragm and release only the partial annular regions, as shown in FIG. 9c).
  • Cylindrical lens arrangement (10a), an intensity modulator IM (10b) or a combination of cylindrical lens arrangement and intensity modulator (10c) is arranged downstream.
  • the cylindrical lens arrangement in turn, generates an elliptical light distribution, so that no annular light distribution is applied to the axicon and thus no bizze jets are generated, but mathematic rays are generated.
  • FIG. 10 b analogous to FIG. 9 b, again an intensity modulator IM takes over this beam shaping.
  • the advantage is that mixing of Bessel beams and Mathieustrahlen can be avoided by an intensity influence, which generates a radially scaled elliptical Gaussian intensity distribution on the axicon.
  • Gaussian distribution and in b) and c) on the right with a radially scaled elliptical Gaussian distribution generated by the light modulator. It is additionally blocked by IM in each case a central region of the illumination distribution, as shown, and only in the side regions generates a radially scaled elliptical distribution.
  • IM IM
  • SLM SLarky-based laser ranger
  • suitable anamorphic optics can further optimize beamforming.
  • the Mathieustrahl has a high-frequency intensity modulation in the x direction.
  • the beam can be used to increase the axial resolution through structured illumination.
  • 3 fluorescence images of the sample are generated in a static Mathieustrahl, wherein the beam is shifted in each image by a respective phase of 120 ° in the x direction.
  • the three images are calculated to obtain a resulting image with increased sectioning.
  • FIG. 11 shows by way of example the illumination distribution of the generated math ray in the XY plane at a position zO in the optical axis or in the XZ plane in a section along the optical axis z.
  • the X direction would correspond to the scanning direction for generating the planar light distribution.

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Description

Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, welches ein Abbildungsobjektiv zur Abbildung einer Probe auf einen Detektor sowie Mittel zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs bzw. in einer definierten Ebene in der Nähe der dieser Fokusebene umfasst. Die Mittel zur Beleuchtung umfassen eine kohärentes Licht
abstrahlende Beleuchtungsquelle.
Ein Mikroskop, bei dem Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang im
Wesentlichen senkrecht zueinander angeordnet sind, und bei der die Probe mit einem Lichtblatt in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs, d.h. senkrecht zu dessen optischer Achse, beleuchtet wird, ist für die Untersuchung von Proben nach dem Verfahren der Selective-Plane-Illumination-Microscopy (SPIM) ausgelegt. Im Unterschied zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM), bei der eine dreidimensionale Probe in einzelnen, unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für Punkt abgetastet wird und die dabei gewonnenen Bildinformationen nachfolgend zu einer dreidimensionalen Abbildung der Probe
zusammengesetzt werden, beruht die SPIM-Technologie auf der Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die bildliche Darstellung der Probe auf der Grundlage von optischen Schnitten durch einzelne Ebenen der Probe.
Die Vorteile der SPIM-Technologie bestehen unter anderem in der größeren
Geschwindigkeit, mit der die Erfassung der Bildinformationen erfolgt, der geringeren Gefahr des Ausbleichens von biologischen Proben sowie einer erweiterten Eindringtiefe des Fokus in die Probe.
Prinzipiell werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten sind oder in diese eingebracht werden, mit Laserlicht angeregt, welches zu einem sogenannten Lichtblatt geformt ist. Mit dem Lichtblatt wird jeweils eine ausgewählte Ebene in der Tiefe der Probe beleuchtet und mit einer Abbildungsoptik ein Bild dieser Probenebene in Form eines optischen Schnitts gewonnen. Im Wesentlichen äquivalent zu einer solchen Anregung mit einem statischen Lichtblatt ist die schnelle Hin- und Herbewegung eines dünnen,
rotationssymmetrischen Laserstrahls in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs. Effektiv, d.h. im zeitlichen Mittel über den Zeitraum der Beobachtung, ergibt sich somit die Form eines Lichtblatts. Die SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in Stelzer et al., Optics Letters 31 , 1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004), in der DE 102 57 423 A1 und in der WO2004/0530558 A1.
In Fig.1 ist zunächst der grundsätzliche Aufbau eines SPIM-Mikroskops dargestellt. Das Licht einer Beleuchtungsquelle 1 wird über eine Beleuchtungsoptik 2 zu einem Lichtblatt geformt und auf eine Probe 3 gelenkt. Probe und Lichtblatt befinden sich in der Fokusebene eines Abbildungsobjektivs 4. Die optische Achse des Abbildungsobjektivs 4 steht senkrecht zu der Richtung, aus der die Probe 3 beleuchtet wird. Die Beleuchtungsoptik 2 umfasst in der Regel mehrere optische Elemente, die das kohärente Licht der Beleuchtungsquelle 1 kollimieren und daraus ein Lichtblatt formen. Im Stand der Technik umfasst die
Beleuchtungsoptik 2 in der Regel auch eine Zylinderlinse, deren flache Seite zur Probe weist und deren gewölbte Seite in Richtung der Beleuchtungsquelle weist. Im Folgenden sollen mehrere Beispiele für Beleuchtungsoptiken 2 erläutert werden, mit denen die Erzeugung eines Lichtblatts mit erhöhter Schärfentiefe und verringertem Schattenwurf gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten Anordnungen möglich ist.
Problemstellung:
Gewünscht ist eine Lichtverteilung (das Lichtblatt), die in einer Richtung (der y-Richtung) weniger als 1 pm ausgedehnt ist, jedoch in den beiden anderen Richtungen so weit ausgedehnt ist als möglich, wobei sich in y-Richtung kein Licht oberhalb und unterhalb des Lichtblatts befinden soll. Dieses Licht oberhalb und unterhalb des Lichtblatts würde die Messung aus der Beobachtungsrichtung (y-Richtung) stören.
Bisher bekannte Lösungen sind: a) lnterferenzmuster können in y-Richtung dünn sein und im Prinzip theoretisch in x- und z- Richtung unendlich ausgedehnt, jedoch setzen sie sich in y periodisch fort, so dass sich sehr viel Licht außerhalb des Lichtblatts befindet
b) Besselstrahlen (DE 10 2007 063 274 A1 ) können theoretisch in z-Richtung unendlich ausgedehnt sein, in y haben sie den gewünschten Durchmesser, jedoch ist erneut sehr viel Leistung in y-Richtung außerhalb des Strahls; scannt man einen Besselstrahl in x-Richtung, erhält man zwar ein Lichtblatt, jedoch mit sehr viel Lichtleistung oberhalb und unterhalb der gewünschten Ebene. c) Linienfokus mit Zylinderlinse: Mit einer Zylinderlinse kann ein Fokus in x-Richtung erzeugt werden; scannt man durch Defokussierung den Strahl in z-Richtung, so kann man ebenso ein Lichtblatt realisieren.
Eine Zylinderlinse formt aus dem einfallenden kollimierten Laserstrahl einen Linienfokus in x- Richtung (im Abstand f hinter der Zylinderlinse). Dieser kann in z-Richtung verschoben werden (Defokus, realisierbar z.B. durch Änderung der Brennweite f durch eine
verschiebbare Linsen oder einen SLM). Dieser Linienfokus hat allerdings eine sehr geringe Ausdehnung in z-Richtung (DOF ~ λ/ΝΑ2, DOF = Depth of Focus), wobei die Ausdehnung immer geringer wird, je dünner der Linienfokus in y-Richtung wird.
Beispiel: NA = 0.5 -> bei λ = 0.488pm folgt DOF ~ λ/ΝΑ2~ 2 μτη.
Nachteil der oben genannten Lösungen sind die geringen Ausdehnungen der Einzelstrahlen bzw. die Erfordernis, den Strahl scannen zu müssen. Weiterhin befindet sich beim Bessel- Strahl in y-Richtung und beim x-Linienfokus in z-Richtung sehr viel Licht, welches die Probe bleichen kann. Weiteres Ziel ist es daher, die Ausdehnungen der Lichtfoki zu vergrößern.
Die Erfindung wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche charakterisiert.
Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die Patentansprüche sind ausdrücklich in die Offenbarung der Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung betrifft sowohl ein Mikroskop zur„ SPIM" Mikroskopie als auch ein
zugehöriges mikroskopisches Verfahren sowie ein Betriebsverfahren für ein Mikroskop sowie die in den Patentansprüchen aufgeführten vorteilhaften Verwendungen von
Sine Filtern und Mathieustrahlen für die SPIM Mikroskopie.
Hierzu wird erfindungsgemäß folgendes vorgeschlagen:
Eine in z-Richtung ausbreitungsinvariante bzw. wohldefinierte Verteilung wird dadurch erhalten, dass man die z-Komponente im Frequenzspektrum des Lichts limitiert. Jede z- Komponente erfährt durch„Ausbreitung" eine andere Phasenverschiebung, weshalb es vorteilhaft ist, die z-Komponenten des Frequenzspektrums mit einer Filterfunktion zu beschränken. Es wird insbesondere vorgeschlagen, als Filterfunktion in z-Richtung eine Sinc(z)-Funktion zu verwenden. Andere Funktionen sind prinzipiell auch denkbar wie eine Sinc(z)A2Funktion, jedoch bietet die Sinc-Funktion den besonderen Vorteil, ein (idealisiert) konstantes Profil in z zu ermöglichen.
Eine genaue Filterfunktion kann natürlich weiter optimiert werden, die Sinc-Funktion soll insofern hier als besonders vorteilhaft genannt sein für Funktionen, die in z-Richtung über einen größeren Bereich ein näherungsweise konstantes Strahlprofil auf der Achse ermöglichen.
Die Ausdehnung eines Linienfokus kann also erfindungsgemäß in z-Richtung durch einen Sinc(z)-Filter vor der Zylinderlinse vergrößert werden. Der Sinc(z)-Filter wird hierzu in die y- Richtung umtransformiert und als Filter in y-Richtung realisiert. Hierzu ist allerdings ein relativ komplex aufgebauter Filter erforderlich, da die Sinc-Funktion ja positive und negative Werte hat. Ein reiner Amplitudenfilter kann nur positive Werte für die Transmission annehmen. Ein negativer Wert der Transmission des Filters entspricht einer
Phasenverschiebung um λ/2. Mit einer zusätzlichen Phasenverschiebung von z.B. λ/2 können jedoch auch negative Werte für die Transmission realisiert werden. In x-Richtung kann die Filterfunktion konstant sein.
Die Abbildung 2 zeigt ein solches Beispiel für den theoretisch idealen Transmissionsverlauf eines komplexen Filters. Dargestellt ist schematisch ein kollimierter Laserstrahl LK der durch einen in der Pupille einer verwendeten Optik angeordneten Raumfilter F hindurchtritt und von diesem in Amplitude und Phase beeinflusst wird. Die entsprechende räumliche Lichtverteilung ist als modulierter Laserstrahl ML schematisch dargestellt.
Hier ist zunächst ein Raumfrequenzfilter sinc(vz) aufgeprägt.
Eine Zylinderlinse ZL und das erzeugte Lichtblatt LB folgen in Beleuchtungsrichtung. Der sinc(vz) entspricht vorteilhaft einem über die Ewald'sche Gleichung in die vy -Richtung umskalierten Sine mit Null-Position bei vy=0 (on axis). Der somit auf die y-Achse projizierte Sinc(vz) sorgt für die Ausdehnung in z-Richtung.
Der in die vy -Achse projizierte Sinc(vz) limitiert das Strahlprofil allerdings noch nicht ideal in y-Richtung. Überlagert ist der in die y-Richtung projizierte sinc(vz) daher beispielsweise mit einem sinc(vy) (durch Multiplikation); dieser sinc(vy) sorgt dafür, dass das Lichtblatt in y- Richtung begrenzt ist, während der in die vy -Achse projizierte Sinc(vz) dafür sorgt, dass das Lichtblatt über eine bestimmte z-Entfernung konstant bleibt. Beide Sinc-Funktionen beeinflussen sich; eine kleine y-Ausdehnung erfordert einen ausgedehnten sinc(vy), der - wie im Beispiel gezeigt - etwa dem projizierten sinc(vz) entsprechen sollte.
Im Beispiel kann somit eine DOF ~ 8pm erreicht werden. Weitere Beispiele sind auf den folgenden Seiten aufgeführt.
In einem weiteren Beispiel kann das Lichtblatt statt mit einer zylindrischen Optik, die im Wesentlichen entlang der x-Achse konstant ausgebildet ist, auch mit einer gewöhnlichen rotationssymmetrischen Optik mit beispielsweise sphärischen Flächen ausgeführt werden. Die Filterfunktion in z- ichtung (Sinc(vz )) wird als rotationssymmetrische Funktion dann in die x-y Ebene projiziert und mit einer oder zwei weiteren Filterfunktionen in x und y multipliziert, um die gewünschte Begrenzung in y und die gewünschte Ausdehnung in x und z zu erhalten, also beispielsweise mit einer sehr breiten sinc(vy )-funktion in y-Richtung für das dünne Lichtblatt in y-Richtung und eine sehr schmale sinc(vx )-funktion in x-Richtung für die große Ausdehnung in x-Richtung.
In Figur 3 ist in einem Querschnitt entlang einer Y / Z Schnittfläche entlang der Y Achse von Fig. 2 eine aus drei Filterfunktionen (x,y,z) überlagerte Amplitudenverteilung A beispielhaft dargestellt.
Auf diese Weise ist es überraschend möglich, auch ohne Verwendung einer
anamorphotischen Optik wie der dargestellten Zylinderlinse einen ausgedehnten Linienfokus mit einer Fokuslänge von 10pm in z-Richtung bei einer Dicke von etwa 1μηη in y
(Wellenlänge 0.488pm) zu realisieren (100pm x 10 m x 1 pm X x Z x Y).
Ferner kann man ein Lichtblatt mit 100pm x ΙΟΌμιτη x 4μηη (Breite x mal Tiefe z mal Dicke in y) realisieren.
Auf der Achse (Winkel Null) liegen die Sinc-Funktionen einfach übereinander und„zerstören" sich gegenseitig, d.h. es dominiert immer die jeweilige Sinc-Funktion mit der kleineren Breite (siehe auch Fig. 3).
Um die Sinc-Funktionen voneinander zu trennen, d. h. möglichst viel Frequenzinformation zu übertragen, kann man den Filter außeraxial in einer Objektivpupille anlegen, ideal bei einer möglichst großen Apertur (z.B. bei NA = 0.85 bei einer Objektiv-NA = 1). Somit ist überraschend ein Lichtblatt noch geringerer Dicke möglich, beispielsweise ΙΟΌμιτι x ΙΟ μιη x 2μηι (x mal z mal y). Allgemein kann der Nullpunkt der Sinc-Funktionen in der Pupille der Beleuchtungsoptik frei gewählt werden.
Kleinere Lichtblätter mit Durchmesser in y von 1 pm sind ebenfalls möglich (z.B. 10pm x 100pm x 1 pm XxZxY bei einer Wellenlänge von 0.5pm). Insbesondere können mit dem neuen Filter Lichtblätter mit großen lateralen Ausdehnungen bei gleichzeitiger geringer Dicke in y-Richtung und in y-Richtung wenig Licht außerhalb des Lichtblattes erzeugt werden, die deutlich besser als die aus dem Stand der Technik bekannten Lichtblätter sind, beispielsweise mindestens einen Faktor zwei größere Abmessung in x oder z aufweisen als Gauss-Strahlen, oder mindestens einen Faktor 10 weniger Lichtintensität in y-Richtung außerhalb des Lichtblattes als ein Besselstrahl oder ein Zweistrahl-Interferenzmuster aufweisen.
Die Lichtblätter können auch sowohl in z-Richtung als auch in x-Richtung verlaufen (je nach Position der Filter in der Pupille). Das macht die Anordnung besonders flexibel.
Die Lichtblätter können mit einer Phasenfunktion moduliert werden, um sie in x, y, und z- Richtung zu verschieben (Fokus oder Shift). Damit können die Lichtblätter z.B. auch mit einem SLM (Spatial Light Modulator) durch den Raum bewegt (gescannt) werden. Dieser SLM würde allein oder im Zusammenwirken mit einem Amplitudenfilter eingesetzt werden und eine Verschiebung des Lichtblattes, beispielsweise in y- Richtung, bewirken. Damit ist ein konfokales Scannen durch die Probe mit dem Beobachtungsstrahl z.B. aus y-. Richtung möglich.
Es können weiterhin mehrere SincA3-Filter und somit Lichtblätter nebeneinander oder übereinander angeordnet werden. Somit kann die Lichtblattfläche vergrößert werden oder z.B. für STED eine zusätzliche Abregung am Rand einer Anregungsregion stimuliert werden.
Die Lichtblätter können moduliert (strukturiert) werden, indem man z.B. zwei SincA3-Filter in der Pupille ohne Defokus oder Phasenverschiebung einbringt. Damit kann die
Modulationsfrequenz frei eingestellt werden. Das entstehende Interferenzfeld kann für SIM (ZEISS Elyra S.1 ) oder ähnliche Verfahren mit strukturierter Beleuchtung genutzt werden. Die Lichtblattdicke kann weiter verringert werden (z.B. Ο./μπι), wobei die Ausdehnung des Lichtblatts geringer wird. Mathematische Formeln und Definitionen:
SINC-Function: sinc(arg) = sin(w arg)
° π-arg
Ewald'sche Gleich
Off-Axis: with off-a
Damit argz = π
Spezialfall: on axis
Figure imgf000009_0001
sin(argz)
fV-Ox,vx)
argz
In den nachstehenden Darstellungen gemäß Fig.4 ist rechts oben und links oben jeweils eine erzeugte sinc(vz) Funktion entlang der Z Achse mit unterschiedlich gelegtem Maximum dargestellt.
Es wird deutlich dass sich bei mittiger Anordnung des Maximums ein besseres Z Profil ergibt.
NA
Untern links ist beispielhaft Sinc(vz) mit vx = 0.5— Λ (λ=0.488) (linkes Bild,
vz - Achse nach rechts) dargestellt und derselbe Sinc(vz)-Filter unten rechts projiziert in transversale Koordinaten nach der Ewald'schen Gleichung (rechtes Bild); dieser Verlauf entspricht dem Komplexen Filter in der Pupille, den man einsetzen muss, um den entsprechenden stückweise konstanten Verlauf in z-Richtung zu erhalten.
Diese erfindungsgemäße Umskalierung (Umtransformierung oder Projektion) der sinc(vz) Funktion nach der Ewald'schen Gleichung in y Richtung ist überraschend besonders vorteilhaft.
Die Darstellung in Fig. 5 zeigt jeweils zunächst oben links einen Sinc(vz)-Filter als komplexen Filter in der Pupille als Schnittbild mit seitlichen Hauptmaxima wie in Fig. 4 unten rechts dargestellt Oben Mitte ist einen Schnitt durch die x-y-Ebene an einer idealen Fokusposition (z = 0) einer Linse ( eines Objektives ), in deren Pupille der Sinc(z)-Filter angeordnet ist (Point Spread Function PSF des Systems mit Filter) dargestellt, ( in logarithmischer Skalierung )und oben rechts der y-z-Verlauf (mit z: entlang der
Ausbreitungsrichtung des Lichts).
In der unteren Reihe sind von links nach rechts die obigen Elemente in linearer Skalierung dargestellt, die einer tatsächlichen Lichtverteilung auf der rechten Seite entspricht:
Unten links: Schnitt durch x-y-Ebene (z = 0) - PSF in linearer Skalierung
Unten Mitte: x-z-Verlauf
Unten rechts: y-z-Verlauf, lineare Skalierung, Zoom auf linken Bereich der„Lichtnadel". Deutlich wird dass vorteilhaft über einen ausreichend langen Z- Verlauf ein konstant in Richtung stark begrenzter Strahlverlauf erreicht werden kann.
Genereller SincA3-Filter
argx = π [vx - rvx]/Ax
Figure imgf000010_0001
Complex Filter:
sin(argx) sin(argy) sin(argz)
F(vx,vx) = fVx(vx,vx) · fVy(vx,vx) · fv_(vx,vx) =
argx argy argz
Die Darstellung in Fig. 6 zeigt beispielhaft oben eine einseitige off Axis Funktion in der Pupille gemäß der Erfindung in logarithmischer bzw. linearer Skalierung ( links oben und unten), die Beleuchtungssituation im Fokus in X-Y Richtung( Mitte oben ) sowie XZ Richtung ( Mitte unten) sowie die y/ Z Verteilung des Lichtes in logarithmischer( rechts oben ) sowie linearer Skalierung ( rechts unten).
In Fig. 7 ist ausschnitthaft ein Beispiel einer aufgeprägten asymmetrischen und einseitigen sine Funktion FSinc in der Pupille erkennbar
Fig. 8 : Allgemeine Realisierung (beispielhaft):
Der oben beschriebene komplexe Filter kann durch einen einfachen komplexen Filter in der Pupille realisiert werden (entsprechend F(vx,vx)); dann erhält man allerdings eine sehr geringe Transmission, da fast überall F(vx,vx) = 0 ist. Alternativ kann man mit zwei Filtern eine sehr hohe Transmission erreichen. Der Erste Filter 1 ist so ausgelegt, dass er in der Pupille die gewünschte Intensität erzeugt, die der
Amplitude des Filters entspricht. Der Filter 1 kann z.B. als CGH (Computer generated hologram) ausgelegt und nach bekannten Methoden einfach berechnet und hergestellt werden. Der zweite Filter ist dann (wie unten schematisch angedeutet) ein reines
Phasenelement, welches die negativen Werte der Transmission des Komplexen Filters durch einfache Phasensprünge um λ/2 erzeugt.
Die Filter können für einen kollimierten oder jeden beliebigen anderen einfallenden kohärenten Laserstrahl ausgelegt werden.
Im Beispiel in Fig.8 ist ein Teil der Brechkraft aus dem ersten Filter in den Kollimator (Beam Shaping Telescope) verlagert.
Die Darstellung in Fig. 8 zeigt in a) einen schematischen Schnitt entlang der Y/Z Ebene und in b) entlang eines X/Z Ebene. Nach einem Element zur Strahlformung (Teleskop TL) folgt in Beleuchtungsrichtung eine Kombination aus einem ersten Filter F1 , der ein
Amplitudenfilter sein kann und einem zweiten Filter F2 als Phasenfilter, wobei vorteilhaft der zweite Filter F2 in der Eintrittspupille einer Optik O angeordnet ist.
Bei der Optik O kann es sich um ein normales Objektiv handeln.
F1 und F2 können auch beides Phasenfilter sein. Sie erzeugen zusammen eine
Lichtverteilung in der Eintrittspupille, die einer dreidimensionalen (X, Y, Z) sine Funktion als Raumfilterfunktion für die nach dem Lichtdurchgang durch die Optik O entstehende
Lichtverteilung entspricht.
Durch diese komplexe Filterfunktion entsteht eine in Z Richtung ausgedehnte flächiger Lichtverteilung LV mit in Y Richtung (senkrecht zur Lichtfläche vorteilhaft sehr geringer Ausdehnung unterhalb eines Bereiches von 5 Mikrometer (sogar bis zu unter 2 Mikrometer!)
Zur Realisierung und Herstellung der obengenannten Filterkombinationen sei ergänzend und beispielhaft auf folgende Literatur verwiesen:
„ Iterative design of a holographic beamformer", Eismann, Tai , Cederquist,
Applied Optics Vol.28, No.13, Uuly 1989. Mathieustrahlen
In WO2004/ 053558 (A1 ) ist neben einer flächigen Beleuchtung durch ein Lichtblatt beschrieben worden, dass ein Lichtblatt durch die scannende Bewegung eines„
linienartigen" Punktlichtstrahls (dort Fig. 7) erzeugt werden kann. Hierbei kann eine
Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtung durch Bewegung der Probe oder des Lichtstrahles zur Erzeugung eines flächigen Beleuchtungsbereiches erfolgen.
An sich ist die Verwendung vom Mathieustrahlen zur Formung von Beleuchtungsstrahlen eines Barcodescanners aus US2003/0189097 A1 bekannt.
Mathieu-Strahlen sind in z-Richtung nahezu propagationsinvariant; ihr Strahlprofil in der xy- Ebene ist nahezu unabhängig von der z-Position. In z- Richtung ist ein Linienfokus mit ca. 1μιτι Ausdehnung in y-Richtung möglich. In y-Richtung divergiert der Strahl zwar, dies kann aber unterdrückt werden. Daher kann mit einem Mathieu-Strahl durch Scannen in x- Richtung überraschend ein SPIM Lichtblatt realisiert werden, da sich in
Beobachtungsrichtung (y-Richtung) kein störendes Licht innerhalb der Apertur des
Beobachtungsstrahls befindet.
Im Frequenzbereich besteht der Mathieu-Strahl aus zwei gegenüberliegenden
Frequenzbeiträgen; dies führt zu einer hochfrequenten Modulation des Strahls in x-Richtung. Diese Modulation kann vorteilhaft unterdrückt werden, indem man einen der beiden
Frequenzbeiträge blockt, z.B. eine Hälfte der Pupille abblendet bzw. nur eine Hälfte des Mathieu-Spektrums erzeugt.
Zu den physikalischen Grundlagen wird auf„ Experimental demonstration of optical Mathieu beams", Optics Communications 195(2001 ), 35-40 verwiesen:
Nachstehend werden vorteilhafte optische Anordnungen zur Erzeugung von in einer Richtung stark begrenzter Mathieustrahlen beschrieben, wie sie bei der o. g. SPIM
Anwendung besonders vorteilhaft Verwendung finden könnten.
In Fig. 9 a) und b) ist jeweils die Erzeugung eines Mathieustrahls MS aus einem
gaußförmigen Laserstrahl LS entlang einer optischen Beleuchtungsachse z schematisch in einem Seitenschnitt in der Z Ebene dargestellt.
Fig. 9 c) zeigt die Beleuchtungsverhältnisse in der vorderen Fokalebene einer
Linsenanordnung L, in der eine Ringblende RB angeordnet ist. Die Ringblende muss zur Erzeugung eines Mathieustrahls mit einem elliptischen Gaußstrahl beleuchtet werden. Eine Vorteilhafte Methode, um diese Lichtverteilung zu erzeugen ist in Fig 9a) dargestellt. Die Zylinderlinsenanordnung aus zwei geeigneten Zylinderlinsen ZL1 , ZL2 erzeugt hierbei die notwendige elliptische Beleuchtungsverteilung. Beim Durchtritt durch die Ringblende wird die Ringblende nur teilweise von der Beleuchtungsverteilung erfasst und es entstehen zwei symmetrisch halbkreisförmige Anteile R1 , R1 in der Pupillenebene, die im weiteren Verlauf nach der Linsenanordnung einen y-begrenzten Mathieustrahl erzeugt.
Blendet man einen der beiden Anteile R1 oder R2 aus, z.B. durch teilweises Schließen der Ringblende, so kann ein in y-Richtung begrenzter Strahl erzeugt werden, der im Gegensatz zum Mathieustrahl keine periodische Struktur aufweist.
Prinzipiell ist es natürlich denkbar statt eines elliptischen Strahlquerschnittes die Ringblende oben und unten abgedeckt zu gestalten um die zwei halbkreisförmigen Bereiche gemäß Fig. 9c zu erzeugen.
In Fig. 9 b ist anstelle einer Strahlformung mit Zylinderlinsen ein flächiger Lichtmodulator wie ein„ Spatial Light Modulator" (SLM) nach dem gaußförmigen Laserstrahl angeordnet, der nur die benötigten Bereiche der Ringblende mit Licht beaufschlagen könnte um wiederum wie in Fig. 9a einen Mathieustrahl zu erzeugen.
Prinzipiell könnte aber auch der SLM in der vorderen Brennebene anstelle der Ringblende angeordnet sein und nur die Teilringbereiche, wie in 9c) dargestellt, freigeben.
In Fig. 10 a) - c) wird der Mathieustrahl durch ein Axicon AX erzeugt, das einer
Zylinderlinsenanordnung (10a) , einem Intensitätsmodulator IM (10b) beziehungsweise einer Kombination aus Zylinderlinsenanordnung und Intensitätsmodulator (10c)nachgeordnet ist.
Durch die Zylinderlinsenanordnung wird wiederum eine elliptische Lichtverteilung erzeugt, so dass am Axicon keine ringförmige Lichtverteilung anliegt und damit keine Besseistrahlen sondern Mathieustrahlen erzeugt werden.
In Fig. 10 b übernimmt analog zu Fig. 9 b wiederum ein Intensitätsmodulator IMdiese Strahlformung.
Hier ist der Vorteil, dass durch eine Intensitätsbeeinflussung, die eine radial skalierte elliptische gaußförmige Intensitätsverteilung auf dem Axicon erzeugt ,eine Vermischung aus Besselstrahlen und Mathieustrahlen vermieden werden kann.
In Fig. 10 a - c rechts ist die zu den links nebenstehenden Abbildungen auf dem Axicon ankommende Intensitätsverteilung dargestellt, jeweils links mit einer elliptischen
Gaußverteilung und in b) und c) auf der rechten Seite mit einer durch den Lichtmodulator erzeugten radial skalierten elliptischen Gaußverteilung. Es wird durch IM jeweils ein Mittenbereich der Beleuchtungsverteilung zusätzlich blockiert, wie dargestellt, und nur in den Seitenbereichen eine radial skalierte elliptische Verteilung erzeugt.
Ohne Einschränkung durch die Darstellungen kann durch den IM, SLM oder eine geeignete anamorphotische Optik eine weitere Optimierung der Strahlformung erfolgen.
Weitere Möglichkeiten, einen Mathieustrahl zu erzeugen, bestehen darin, in die vordere Brennebene der Linse L ein Hologramm oder ein diffraktives Element einzubringen und dies mit einem Laser zu beleuchten. Bei Verwendung eines diffraktiven Elements oder eines SLMs kann zusätzlich auch auf die Linse L verzichtet werden.
Der Mathieustrahl weist eine hochfrequente Intensitätsmodulation in x-Richtung auf. Somit kann der Strahl genutzt werden, um die axiale Auflösung durch strukturierte Beleuchtung zu erhöhen. Hierbei werden 3 Fluoreszenzbilder der Probe bei einem statischen Mathieustrahl erzeugt, wobei der Strahl bei jedem Bild um jeweils eine Phase von 120° in x-Richtung verschoben wird. Die drei Bilder werden verrechnet, um so ein resultierendes Bild mit erhöhtem Sectioning zu erhalten. In Fig. 11 ist beispielhaft die Beleuchtungsverteilung des erzeugten Mathieustrahles in der XY Ebene an einer Stelle zO in der optischen Achse bzw. in der XZ Ebene in einem Schnitt entlang der optischen Achse z dargestellt. Deutlich wird eine vorteilhafte Begrenzung des Strahlprofiles in Y Richtung.
Die X Richtung würde der Scanrichtung zur Erzeugung der flächigen Lichtverteilung entsprechen.

Claims

Patentansprüche
1. Mikroskop, bestehend aus o einer Abbildungsoptik, die von einer Probe (1 ) in einen ersten Aperturwinkel abgestrahltes Licht über ein Abbildungsobjektiv (7) in einer ersten Richtung aufnimmt, o einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung des von der Probe (1) in den ersten Aperturwinkel abgestrahlten Lichts, welches mit der Abbildungsoptik aufgenommen wird, o einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) mit einer Wellenlänge λ und einen Beleuchtungsstrahlengang zur
Beleuchtung der Probe (1 ) mit einer Beleuchtungslichtverteilung in einer zweiten Richtung, wobei die zweite Richtung im Wesentlichen senkrecht zur ersten Richtung ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung Mittel aufweist, so dass o innerhalb eines Abschnitts (LZ) in der zweiten Richtung die
Beleuchtungslichtverteilung im Wesentlichen konstant ist, o innerhalb des vom ersten Aperturwinkel aufgespannten Kegels außerhalb eines Bereich einer Ausdehnung (LY) in der ersten Richtung die Leistung des Beleuchtungslichts weniger als 20% beträgt, wobei gilt:
LY < 2 λ,
LZ > 8 λ.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , wobei
die Mittel einen komplexen Filter umfassen, der die Lichtverteilung in eine Pupille der Beleuchtungseinrichtung in einen im wesentlichen kreisrunden Bereich einschränken.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, wobei
der Filter eine Beleuchtungslichtverteilung erzeugt, die in der Pupille der
Beleuchtungseinrichtung aus einer Überlagerung von mindestens zwei Sinc-Funktionen besteht.
4. Mikroskop nach Anspruch 3, wobei
eine der beiden Sinc-Funktionen einer entsprechend der Ewald'schen Gleichung in eine, vorzugsweise die X- Y-Ebene projizierten Sinc(z)-Funktion entspricht.
5. Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
der Filter eine Beleuchtungslichtverteilung erzeugt, die in der Pupille der
Beleuchtungseinrichtung dem Spektrum eines Mathieu-Strahls entspricht.
6. Mikroskop, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, bestehend aus einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe (1 ) mit einem Lichtblatt, einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe (1 ) abgestrahlt wird, einer Abbildungsoptik, die die Probe (1 ) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht schneidet, wobei ein Amplituden- und/oder Phasenfilter im Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen ist, der als Sine Raumfilter wirkt indem er in mindestens einer Raumrichtung das Beleuchtungslicht durch Filterung der auftretenden Raumfrequenzen mit einer sine Funktion limitiert und/ oder das Beleuchtungslicht bezüglich seiner Phase und Amplitude in mindestens einer Raumrichtung durch eine sine Filterfunktion limitiert wird und/ oder ein kombinierter Amplituden- und Phasenfilter im Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen ist, der eine Formung des Lichtblattes durch Beeinflussung des Transsmissionsverlaufes der Beleuchtungslichtverteilung mit einer sine Filterfunktion vornimmt.
7. Mikroskop nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet dass der Amplituden und/ oder Phasenfilter zumindest teilweise in oder in der Nähe einer Pupillenebene einer Beleuchtungsoptik angeordnet ist und/ oder der Filter durch Hologramm (CGH) und/ oder eine diffraktive Optik realisiert ist und/ oder der Filter zumindest teilweise durch einen räumlichen Modulator für Licht ( Spatial Light Modulator (SLM) gebildet ist und/ oder eine Verschiebung des Lichtblattes senkrecht zur Lichtrichtung mit dem SLM erfolgt und/oder eine Verschiebung der Fokusebene des Abbildungsobjektives bei Verschiebung des Lichtblattes erfolgt und/ oder dass eine asymmetrische Sine Funktion/ off axis Verteilung in der Pupillenebene erzeugt ist und/ oder dass ein zur optischen Achse ausseraxial wirkender sine Filter vorgesehen ist und/ oder eine Überlagerung mehrerer Sine Filter zur Lichtblattstrukturierung vorgesehen ist und/ oder eine durch Ewald'sche Gleichung umskalierte sine Funktion als Filterfunktion vorgesehen ist und/ oder im Beleuchtungsstrahlengang zur Strahlformung eine Kombination des Filters mit einer anamorphotischen Optik erfolgt
8. Mikroskopverfahren oder Verfahren zum Betrieb eines Mikroskops nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche
9. Mikroskop, bestehend aus einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe (1 ) mit einem Lichtblatt, einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe (1 ) abgestrahlt wird, einer Abbildungsoptik, die die Probe (1 ) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht schneidet, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mathieustrahls zur Lichtblatterzeugung bei SPIM
10. Mikroskop nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass
Verwendung eines scannenden Mathieustrahls zur Lichtblatterzeugung bei SPIM
11. Mikroskop, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bestehend aus einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe (1) mit einem Lichtblatt, einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe (1 ) abgestrahlt wird, einer Abbildungsoptik, die die Probe (1 ) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht schneidet, dadurch gekennzeichnet dass
Erzeugung des Mathieustrahls mit einem Intensitäts-und/ oder Phasenmodulator erfolgt, insbesondere durch mindestens eines der nachfolgend genannten optischen Elemente:
1 ) Partielle Ringblende, insbesondere Blende aus zwei gegenüberliegenden Halbkreisen
2) durch einen räumlichen Modulator für Licht ( Spatial Light Modulator (SLM)
3) Axicon
4) Hologramm
5) Diffraktives Element
12. Mikroskop nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Erzeugung einer elliptischen Gaußverteilung vor der Ringblende und/ oder die Erzeugung einer Gaußverteilung vor der Ringblende, wobei ein oberer und unterer Teil der Ringblende nicht beaufschlagt wird und/ oder eine Strahlformung durch eine anamorphotische Optik und/ oder einen
Intensitätsmodulator wie einen SLM
Und/ oder einer Erzeugung einer elliptischen Gaußverteilung auf dem Axicon und/ oder einer Erzeugung einer Gaußverteilung auf dem Axicon, wobei ein oberer und unterer Teil des Axicons nicht beaufschlagt wird und/ oder der Verwendung eines Intensitätsmodulators zur Optimierung der Lichtverteilung und/ oder einer Kombination von anamorphotischer Optik und Intensitätsmodulator zur
Optimierung der Lichtverteilung und/ oder der Unterdrückung von Frequenzanteilen des Mathieustrahls zur Vermeidung der periodischen Intensitätsmodulation des Strahls und/ oder der Erzeugung einer strukturierten Beleuchtung und/ oder der zeilenweisen Detektion auf einem Flächendetektor , insbesondere CCD Empfänger oder EMCCD Empfänger oder CMOS oder sCMOS Kamera und/ oder der flächenhaften Detektion auf einem Flächendetektor, wobei die Fläche der Detektion kleiner als die gesamte Detektionsfläche des Flächendetektors ist.
13. Mikroskopverfahren oder Verfahren zum Betrieb eines Mikroskopes nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche
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