WO2014033672A1 - UTILISATION D'UN RÉCEPTEUR KINASE À MOTIFS LysM POUR AMÉLIORER LA RÉPONSE DES PLANTES AUX LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES. - Google Patents

UTILISATION D'UN RÉCEPTEUR KINASE À MOTIFS LysM POUR AMÉLIORER LA RÉPONSE DES PLANTES AUX LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES. Download PDF

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kinase
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Jean-Jacques Bono
Judith FLIEGMANN
Christophe Lachaud
Julie CULLIMORE
Marie CUMENER
Virginie GASCIOLLI
Benoit LEFEBVRE
Nikita MALKOV
Charles Rosenberg
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite de Toulouse
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Definitions

  • the invention relates to the improvement of the effects on plants of lipochitooligosaccharide factors Nod and Myc-LCOs.
  • a very large number of terrestrial plants are able to establish, through their root system, a symbiosis with soil microorganisms.
  • Rhizobia soil bacteria
  • Rhizobium the roots of plants of the family of legumes
  • root nodules in which is fixed atmospheric nitrogen.
  • Rhizobia soil bacteria
  • Rhizobium the roots of plants of the family of legumes
  • the symbiosis of this species is relatively specific: a given species of Rhizobium nodulates only certain species of legumes, the number of which varies according to the species of Rhizobium concerned.
  • endomycorrhizal symbiosis with arbuscules, which occurs not only in vegetables, but in most terrestrial plants, and involves fungi belonging to the order Glomales.
  • the fungus provides the plant with mineral compounds, mainly phosphate and nitrogen, and the plant provides carbon compounds from photosynthesis.
  • Rhizobium-legumi symbiosis and endomycorrhizal symbiosis with arbuscules have a number of points in common.
  • Rhizobia Nod Factors
  • Myc-LCOs Factors fungi
  • LCOs lipochitooligosaccharides
  • the oligochitinic skeleton also bears various substituents at the reducing and non-reducing ends (acetylation, sulfation, methylation, fucosylation, etc.), and the length, degree of unsaturation, and position of the unsaturated bonds. of the fatty acid chain may vary (DENARIE et al., Annu Rev Biochem, 65, 503-35, 1996, D'HAEZE & HOLSTERS, Glycobiology, 12, 79R-105R, 2002).
  • the fatty acid of the non-reducing end is a common fatty acid, mainly oleic acid (Cl 8: 1) or palmitic acid (C16 : 0), and the only other substitution has been observed is O-sulfation of the reducing end (MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 201 1).
  • Nod and Myc-LCOs have a beneficial effect on plant growth and development.
  • Nod factors as well as Myc-LCOs factors have been reported to improve root development and structure (OLAH et al., Plant J, 44, 195-207, 2005, MAILLET et al., Nature, 469).
  • N-Acetyl Glucosamine is also a basic component of signaling molecules that are important in parasite-plant interactions, and are particularly powerful elicitors of defense responses in plants to pathogenic bacteria and fungi.
  • COs chitooligosaccharides
  • These are the chitooligosaccharides (COs), which represent fragments of chitin released mainly by fungal wall hydrolysis, and which consist of a linear sequence of ⁇ -linked (1 to 4) N-acetyl glucosamine residues. ) and not involving any substitution with a fatty acid, and bacterial peptidoglycans, the polysaccharide portion of which is a copolymer of N-acetyl glucosamine and N-acetyl-muramic acid.
  • COs chitooligosaccharides
  • LysM lysine-patterned proteins
  • LysM-RLKs proteins belonging to the family of LysM patterned kinase receptors
  • the LysM motif (Pfam PF01476) is present in a very large number of prokaryotic or eukaryotic proteins (BUIST et al., Molecular Microbiology, 68, 838-47, 2008). In prokaryotes, it is for example found in parietal enzymes involved in the degradation of peptidoglycans; in eukaryotes it is present in some chitinases, or in receptors involved in the perception of molecules containing N-acetyl glucosamine.
  • LysM motif kinase receptors comprise an extracellular domain containing 1 to 3 LysM motifs, associated to an intracellular kinase domain via a transmembrane domain. In a number of these receptors, the intracellular kinase domain is inactive, i.e., is not capable of catalyzing a phosphorylation reaction.
  • LysM motif kinase receptors belong to a multigene family whose number of representatives depends on the species concerned.
  • Some of these receptors have been shown to be involved in the perception of COs derived from chitin, and in the induction of the plant's response to fungal infections; mention may be made in particular of Arabidopsis thaliana LYK1 / CERK1 (MIYA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 19613-18, 2007, WAN et al., Plant Cell 20, 471-81, 2008), and RLK4 (WAN et al. al., Plant Physiol., online prepublication, June 28, 2012), and in rice, OsCERKI (SHIMIZU et al., The Plant Journal, 64, 204-14, 2010). In rice and M.
  • LysM motif protein has also been described as implicated in the perception of COs; however, this protein lacks a kinase domain (KA U et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 1086-91, 2006, FLIEGMAN et al., Plant Physiology and Biochemistry 49, 709-720, 2011).
  • LysM motif kinase receptors have been described as involved in the perception of Nod factors; it is NFP and LYK3 of Medicago truncatula and NFR1 and NFR5 of Lotus japonicus (LIMPENS et al., Science, 302, 630-3, 2003; MADSEN et al., Nature, 425, 637-40, 2003; RADUTOIU et al., Nature, 425, 585-92, 2003a, ARRIGHI et al, Plant Physiology, 142, 265-79, 2006, SMIT et al., Plant Physiol, 145, 183-91, 2007).
  • NFP of Medicago truncatula and a related protein of Parasponia andersonii have also been reported to be involved in the perception of Myc factors (MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 2011; OP DEN CAMP et al. Science, 331, 909-12, 2011).
  • NFR1 and NFR5 of Lotus japonicus can bind directly to LCOs with high affinity (BROGHAMMER et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 109, 13859-64, 2012).
  • NFBS Nod Factor Binding Site
  • NodSm-IV (Ac, S, C16: 2A2,9)
  • Sinorhizobium meliloti the symbiote of Medicago
  • NFBS2 which has a high affinity for the NodSm factor is associated with the plasma membrane of Medicago varia cells in culture (GRESSENT et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999), and a site with similar properties has also been described in the membrane fraction of Medicago truncatula cell cultures (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). However, the affine protein associated with NFBS2 has not been identified so far.
  • the inventors have now succeeded in identifying this protein as being the LYR3 protein, previously identified in silico by ARRIGHI et al. (2006, cited above), among the kinase receptors with LysM motifs, and also called MtLYK12 (ZHANG, 2007, cited above), but to which no particular function could be attributed.
  • the inventors have further characterized its binding properties to LCOs.
  • the subject of the present invention is the use of a polynucleotide chosen from:
  • a polynucleotide coding for a LysM motif kinase receptor whose extracellular domain flanked by the signal peptide has at least 45%, and in order of increasing preference, at least 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or 98% sequence identity, and at least 65%, and in order of increasing preference, at least 70, 75, 80, 85, 90,
  • a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the extracellular domain of said LysM motif kinase receptor
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1 and the homologous region of the targeted protein.
  • Nod factor or Myc-LCO factor is here denoted any LCO whose basic generic structure comprises a chain of ⁇ (1-4) -linked N-acetylglucosamine residues, and which is N-acylated on the terminal glucosamine not -reducing by a fatty acid.
  • LCO can be of natural origin (provided by or purified from symbiotic microorganisms), or be produced by chemical synthesis and / or genetic engineering. Very many Nod factors and Myc-LCO factors are known in themselves; for example, the Nod factors described in the review articles of DENARIE et al., (1996, cited above) or D'HAEZE & HOLSTERS (2002, cited above), as well as in the PCT Applications.
  • LysM motif kinase receptors are shown in Table I below. Those whose extracellular domain has at least 45% identity and at least 65% sequence similarity to that of Medicago truncatula's LYR3 protein are indicated in bold with an asterisk.
  • the extracellular domain of a LysM motif kinase receptor that can be used in accordance with the invention is capable of binding to at least one LCO selected from Nod factors and Myc-LCO factors, with a dissociation constant (Kd). less than or equal to 100 nM, preferably less than or equal to 50 nM, and very preferably less than or equal to 20 nM.
  • Kd dissociation constant
  • Said extracellular domain is capable of binding at least one LCO selected from Nod factors and Myc-LCO factors with a binding affinity at least 50 times, preferably at least 100 times, advantageously at least 200 times, and so at least 500 times more than its binding affinity for a corresponding CO (ie a CO having the same oligochitinic backbone as said Nod factor or said Myc-LCO factor).
  • polypeptide comprising the extracellular domain of said LysM motif kinase receptor
  • it may be the isolated extracellular domain, or further comprise one or more other domains, for example a transmembrane domain (or an anchor sequence membrane) and possibly an intracellular kinase domain (which can either have kinase activity or be devoid of it).
  • a transmembrane domain or an anchor sequence membrane
  • intracellular kinase domain which can either have kinase activity or be devoid of it.
  • chimeric polypeptide in which the domain (s) associated with the extracellular domain originates from one or more other protein (s) than the receptor kinase with motifs. LysM from which said extracellular domain is derived.
  • the transmembrane domain and, if appropriate, the intracellular kinase domain may originate from one or possibly two LysM patterned receptor (s) different from that from which said extracellular domain originates.
  • LysM motif kinase receptor may be from a plant of the same species as the extracellular domain, or from one or two plants of different species.
  • the extracellular domain can also be combined with domains derived from proteins other than the LysM motif kinase receptor (s), such as those described by DE LORENZO et al. FEBS Letters 585, 1521-1528, 201 1, involved in defense reactions, pathogen resistance or plant productivity.
  • the present invention relates to a method for improving the response of a plant to at least one LCO selected from the Nod factors and the Myc-LCO factors, characterized in that it comprises the transformation of said plant by a polynucleotide encoding a LysM patterned kinase receptor, or for a polypeptide comprising the extracellular domain of said receptor, as defined above, and the expression of said receptor or said polypeptide in said plant.
  • the improvement of the response of a plant to Nod factors and / or Myc-LCO factors may be reflected in particular by improving the nodulation and / or endomycorhization of said plant; it may also result in a better response to treatment with Nod factors and / or Myc-LCO factors, making it possible to increase one or more of the beneficial effects of these factors, such as the improvement of germination, root development, growth, photosynthetic yield or pathogen resistance.
  • the method according to the invention can be implemented by the usual methods, known in themselves, genetic engineering and plant transgenesis. Classically, it includes the following steps:
  • the present invention also relates to recombinant DNA constructs for the expression of a LysM patterned receptor kinase or of a polypeptide comprising the extracellular domain of said receptor, as defined above.
  • These include expression cassettes, comprising a polynucleotide encoding said kinase receptor or said polypeptide, placed under transcriptional control of a suitable promoter.
  • Said promoter may be the endogenous promoter of said LysM patterned kinase receptor; in this case, the expression cassette may advantageously consist of the sequence coding for said kinase receptor, flanked by 0.5 to 2 kb, preferably from 1 to 1.5 kb, of genomic sequence upstream.
  • it may be a heterologous promoter.
  • promoters can be obtained for example from plants, plant viruses, or bacteria such as Agrobacterium. They include constitutive promoters, namely promoters that are active in most tissues and cells and under most environmental conditions, as well as specific tissue-specific or cell-specific promoters, which are active only or mainly in certain tissues or certain tissues. cell types, and inducible promoters that are activated by physical or chemical stimuli.
  • constitutive promoters examples include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) described by KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), or its derivatives, the promoter of the cassava vein mosaic virus (CsVMV) described in the International Application WO 97/48819, the maize ubiquitin promoter (CHRISTENSEN & QUAIL, Transgenic Res, 5, 213-8, 1996), of the trefoil (Ljubql, MAEKAWA et al., Mol Plant Microbe Interact 21, 375-82, 2008) or Arabidopsis (UBQ10, NORRIS et al., Plant Mol Biol 21, 895-906, 1993) or the "actin-intron-actin" promoter of rice (McELROY et al., Mol Gen. Genet. , 231, 150-160, 1991, GenBank accession number S 44221).
  • a promoter conferring specific or preferred expression in the tissues of the root will be used;
  • the present invention also encompasses recombinant vectors resulting from the insertion of an expression cassette according to the invention into a host vector.
  • the expression cassettes and recombinant vectors in accordance with the invention may, of course, also comprise other sequences, usually used in this type of construction.
  • the choice of these sequences will be carried out, in a conventional manner, by those skilled in the art depending in particular on criteria such as the host cells chosen, the transformation protocols envisaged, etc.
  • Nonlimiting examples include transcription terminators, leader sequences (leader sequences) and polyadenylation sites. These sequences do not interfere with the specific properties of the promoter or gene with which they are associated, but can improve overall qualitatively or quantitatively, the transcription and, where appropriate, the translation. Examples of such sequences frequently used in plants include, among the most widespread, the 35S RNA terminator of CaMV, the terminator of the nopaline synthase gene, etc. It is also possible, in order to increase the level of expression, to use enhancer sequences (enhancer sequences for transcription and translation).
  • sequences allowing the monitoring of the transformation, and the identification and / or selection of the transformed cells or organisms include reporter genes, giving these cells or organisms a readily recognizable phenotype, or selection marker genes: only those cells or organisms expressing a specific selection marker gene, are viable under given conditions (selective conditions).
  • reporter genes are for example that of beta-glucuronidase (GUS), that of luciferase, or that of the "green or red fluorescent protein” (GFP / RFP) and their derivatives.
  • Selection marker genes are generally antibiotic resistance genes, or also, in the case of plants or plant cells, a herbicide. There is a very large variety of selection marker genes from which the skilled person can make his choice according to the criteria that he himself determined.
  • the choice of the most appropriate vector depends in particular on the intended host, and the method envisaged for the transformation of the host in question. Many methods for the genetic transformation of plant or plant cells are available in the art for many plant species, dicotyledonous or monocotyledonous. By way of non-limiting examples, mention may be made of virus-mediated transformation, microinjection transformation, electroporation, microprojectile transformation, Agrobacterium transformation, and the like.
  • the present invention also encompasses any host cell transformed with a polynucleotide encoding a LysM motif kinase receptor or for a polypeptide comprising the extracellular domain of said receptor, as defined above, which includes in particular the host cells transformed by a expression cassette or a recombinant vector according to the invention.
  • Cell or organism transformed by a polynucleotide means any cell or organism whose genetic content has been modified by transfer of said polynucleotide into said cell or said organism, whatever the method of transfer that has been used, and that the information genetics provided by said polynucleotide is integrated into the chromosomal DNA or remains extrachromosomal.
  • Said host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • a prokaryotic cell it may in particular be an Agrobacterium cell such as ! Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • a eukaryotic cell it may be in particular a plant cell derived from a dicotyledonous or monocotyledonous plant. The construct may be transiently expressed, it may also be incorporated into a stable extrachromosomal replicon, or integrated into the chromosome.
  • the subject of the present invention is also a transgenic plant comprising in its genome at least one copy of a transgene containing a polynucleotide encoding a LysM patterned receptor kinase or for a polypeptide comprising the extracellular domain of said receptor, as defined above. .
  • a transgenic plant is defined here as a transformed plant in which the exogenous genetic information provided by a transforming polynucleotide is stably integrated into the chromosomal DNA, in the form of a transgene, and can thus be transmitted to the descendants of said plant.
  • This definition therefore encompasses also the descendants of the plants resulting from the initial transgenesis, since they contain in their genome at least one copy of the transgene.
  • the plant material (protoplasts, calli, cuttings, seeds, etc.) obtained from the transformed cells or transgenic plants in accordance with the invention is also part of the subject of the present invention.
  • the invention also encompasses the products obtained from the transgenic plants according to the invention, including fodder, wood, leaves, stems, roots, flowers and fruits.
  • MvNFBS2 and PvNFBS2 are enriched in the plasma membrane.
  • the proteins corresponding to these NFBS2 sites had not been identified. More recently, a binding site with comparable properties, namely a high affinity for the Nod factor of S.
  • meliloti NodSm-IV (Ac, S, C16: 2A2, 9), has been demonstrated in the membrane fraction. cells in culture of Medicago truncatula (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006).
  • the cells were homogenized 6 times 5 seconds at 4 ° C. in a propeller mill, in extraction buffer (25 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.47 M sucrose, 10 mM EDTA, 10 mM dithiothreitol). addition of a cocktail of protease inhibitors (0.1 mM (Amino-2-ethyl) -4-benzenesulfonyl fluoride chlorohydrate (AEBSF), antipain, leupeptin, aprotinin, pepstatin, chymostatin), then the homogenate was treated as previously described by GRESSENT et al. (1999, supra).
  • AEBSF protease inhibitors
  • the membrane fraction sedimenting at 45,000 xg was resuspended in binding buffer (25 mM Na-cacodylate buffer pH 6.0, 0.25 M sucrose, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 , cocktail of inhibitors of proteases) adjusted to 50% glycerol and stored at -80 ° C.
  • binding buffer 25 mM Na-cacodylate buffer pH 6.0, 0.25 M sucrose, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 , cocktail of inhibitors of proteases
  • reaction mixtures were incubated for 1 hour at 0 ° C. in 96-well microtiter plates (Nunc), filtered to separate the free radioactive ligand from the bound one, the washed filters and their radioactivity measured as previously described by GRESSENT et al. . (1999, supra).
  • the data was analyzed using the RADLIG software version 4 (Biosoft, Cambridge, UK).
  • the LCOs corresponding to Myc-LCOs factors: LCO-IV (S, C18: 1A9) and its non-sulfated counterpart, as well as LCO-IV (S, Cl 6: 0) are also recognized with a very high affinity (Kj from 6 to 1 (nM).
  • LC0-II (C16: 1A9) and chitotetraosis (CO-IV) have a very low affinity (Kj of 5 ⁇ and Kj> 2 ⁇ , respectively).
  • the binding site present in Medicago truncatula therefore has binding affinity and binding selectivity characteristics similar to those previously observed for the MvNFBS2 site. It will be hereinafter referred to as MtNFBS2.
  • Non-sulfated homologs of these molecules were synthesized and labeled with S to enable the stable ligand / affine protein complex to be detected.
  • a protein of apparent molecular weight close to 100 kDa is detectable in the membrane fraction obtained from the cells of the mutant dmi3. the binding of the radiolabelled ligand to this polypeptide is completely abolished when the incubation is carried out in the presence of an excess of LCO-IV (S, C16: 2A2, 9).
  • the binding is also inhibited in the presence of an excess of sulfated or non-sulfated Myc-LCOs (LCO-IV (S, C18: 1A9 and LC0-IV (C18: 1A9), but not in the presence of an excess of the corresponding chitooligosaccharide (CO-IV)
  • LCO-IV sulfated or non-sulfated Myc-LCOs
  • LC0-IV C18: 1A9
  • CO-IV chitooligosaccharide
  • proteomic and transcriptomic approaches have been performed.
  • LysM motif kinase receptors LYR3,
  • LYK9 As it is known that the proteins of this family are involved in the perception of molecules containing a chitinic skeleton, these receptors have been chosen for the rest of the experiments.
  • the LYR3, LYK9, and LYR6 genes were inserted into a binary vector, C-terminally fused with a fluorescent protein (YFP) and introduced into Nicotiana benthamiana leaves by agroinfiltration using Agrobacterium tumefaciens. .
  • YFP fluorescent protein
  • the NFP and LYK3 genes that code for putative Nod and LYR4 factor receptors were inserted into the same vectors and expressed under the same conditions.
  • GATEWAY technology Invitrogen
  • the complete coding sequence was amplified by PCR using primers specific for this sequence and containing the attB1 and attB2 recombination sites and then introduced by recombination BP into the pDONR 207 input vector (INVITROGEN ).
  • the recombinant pENTR clone thus obtained was then recombined with the vector pBin19-35S-GW-YFP (FROIDURE et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107, 15281-86, 2010; al, Plant Cell, 23, 3498-51 1, 201 1) to generate the binary vector used to transform the plants.
  • This vector was introduced by electroporation into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 which carries the ternary plasmid pBBRv ⁇ GN54D (VAN DER FITS et al, Plant Molecular Biology, 43, 495-502, 2000).
  • the transformed bacteria were cultured overnight at 28 ° C in YEB medium (5 g / l Bacto peptone, 5 g / 1 beef extract, 5 g / 1 sucrose, 1 g / 1 yeast extract, 2 mM MgSO 4 ) supplemented with 10 ⁇ g / ml of rifampicin, 40 ⁇ g / ml of gentamycin, and 50 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • YEB medium 5 g / l Bacto peptone, 5 g / 1 beef extract, 5 g / 1 sucrose, 1 g / 1 yeast extract, 2 mM MgSO 4
  • 10 ⁇ g / ml of rifampicin 40 ⁇ g / ml of gentamycin, and 50 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • chimeric constructs in which the transmembrane domain and the kinase domain are replaced by the transmembrane domain and the inactive NFP kinase domain, were performed for the LYR3, LYR4, LYK9, and LYR6 proteins.
  • the "Golden Gaste" cloning method was used (ENGLER et al., PLOS One, 3 (11): e3647, 2008) and the constructed chimeric gene was inserted into a binary vector pCAMBIA2200 (http: / /www.cambia.org; GenBank: AF234313.1) modified under the control of the 35S promoter.
  • the chimeric proteins expressed by these constructs contain, in their C-terminal portion, the transmembrane domain and the kinase domain. intracellularly, and in their N-terminal portion, the extracellular domain of LYR3, LYR4, LYK9, or LYR6. Their expression in N. benthamiana leaves did not give rise to a hypersensitive response.
  • Membrane fractions were prepared from the homogenates, using the same protocol as described above for the preparation of the microsomal fractions, except that 0.6% (w / v) polyvinyl-polypyrrolidone was added to the microsomal fractions. extraction buffer. After centrifugation at 3000 x g, the supernatant was collected and centrifuged at 45,000 x g. The resulting pellet (membrane fraction) was resuspended in binding buffer, and stored at -80 ° C in the presence of 10% or 50% glycerol, until used.
  • the membrane proteins were separated by 10% polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS, and transferred to nitrocellulose membrane, and the detection of recombinant proteins carried out using anti-GFP antibodies.
  • the LCO-specific binding properties were assessed by equilibrium binding, as described in Example 1, using 0.8 to 2.4 nM LCO-IV ( 35 S, C16: 2A2, 9) +/- 2 ⁇ LCO-IV (S, C16: 2A2.9) unlabeled, and from 25 ⁇ g to 80 ⁇ g of membrane proteins, depending on the level of expression of the YFP-labeled protein.
  • Figure 5 shows the results of various experiments carried out with the LYR3-YFP protein expressed in N. benthamiana leaves: 5a): Scatchard curve of a saturation binding experiment with LCO-IV ( 35 S, C16: 2A2 9); B) -e): equilibrium binding experiments with 0.9 nM LCO-IV ( 35 S, C16: 2A2.9) as the labeled ligand, and varying concentrations of various competing LCOs and COs; b) Myc-LCOs; c) LCOs with a variable number of GlcNAc residues; d) COs with a variable number of GlcNAc residues; e) LCOs differing in the length of the fatty acid chain, and sulphated or not on the non-reducing terminal sugar.
  • LYR3 does not show any significant selectivity with respect to the structure of the fatty acid chain, since LCOs with C16 chains containing 0, 1 or 2 unsaturations have similar affinities (Table III). and the affinity differences between Myc-LCOs (C16: 0 or C18: 1A9) and Nod factors (C16: 2, A2.9), which have different fatty acid chains, are not very important (less than 2 times). Similarly, sulfation on the non-reducing terminal sugar does not significantly affect the binding properties (Fig. 5 e, Table III).
  • Peptidoglycan which is a ligand for certain LysM domain proteins (WILLMANN et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 19824-9) has also been tested in equilibrium binding experiments; no competition with radioactive LCO for binding to LYR3 was observed (results not shown).
  • the closest homologues of MtLYR3 were investigated on the basis of sequence homologies with the extracellular domain in legumes of agronomic interest (Pisum sativum, pea, Glycine max, soybean, Phaseolus vulgaris, bean), as well as the legume model Lotus japonicus, the trefoil.
  • This homologous research has been extended to non-leguminous plants whose genome is sequenced: Prunus persica (peach), Solanum lycopersicum (tomato) and Arabidopsis thaliana. .
  • MtLYR3 orthologs In legumes, MtLYR3 orthologs have been identified in P. sativum, P. vulgaris and L. japonicus. In G. max, orthologues exist in duplicate due to a duplication of the genome.
  • the corresponding genes have been cloned and sequenced. Some rare sequence differences with respect to the sequences in the databases have been observed which could be explained by the use of different plant varieties or sequencing errors in the databases.
  • the cloned genes were introduced into binary vectors, C-terminal fusion with the YFP fluorescent protein, and introduced into Nicotiana benthamiana leaves by Agrobacterium tumefaciens agroinfiltration, as described in Example 3 below. above.
  • the membrane fractions were isolated, their protein content was analyzed by electrophoresis under denaturing conditions, followed by immunodetection using anti-GFP antibodies as described in Example 3, and their ability to interact with the LCOs. was determined by equilibrium binding, as described in Example 1, in the presence of 1 nM LCO-IV ( 35 S, C16: 2A2.9). The specific binding value is determined by the difference between the value of the total binding and that of the non-specific binding obtained for an incubation in the presence of an excess (2 ⁇ l) of unlabeled ligand.
  • LjNFR5 and LjNFR1 receptor capacity of L japonicus identified to play a role in nodulation by a genetic approach (MADSEN et al., Nature, 425, 637-40, 2003, RADUTOIU et al. , Nature, 425, 585-92, 2003a) and respective orthologues of NFP and LYK3 in M. truncatula, was determined under the same conditions.
  • FIG. 6 shows the binding activity of the membrane fractions of Nicotiana benthamiana leaves expressing A) the orthologs of LYR3 from G. max (GmLYR3-1 and GmLYR3-1), P. vulgaris (PvLYR3, P. sativum (PsLYR3) and L japonicus (LjLYS 12); B) LjLYS12, LjNFR5, and LjNFR1.
  • AtLysM-RLK4 In the case of AtLysM-RLK4 (FIG. 8 A), the photolabeling does not appear specific since it is also observed in the presence of an excess of competitors, be it LCOs (Nod and Myc-LCOs factors). or COs (short or long chain). AtLysM-RLK4 therefore seems to lack the ability to interact with LCOs.
  • S1LYR3 Figure 8B
  • the interaction is partially inhibited by an excess of LCOs but not by an excess of COs, suggesting that this protein recognizes lipo-chitooligosaccharides but with a low affinity and a different selectivity of MtLYR3 and its orthologues .
  • LysM-RLK1 or Chitin Elicitor Receptor Kinase 1 is a major player in the perception of chitin in A. thaliana (MIYA et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 19613-19618, WAN et al., Plant Cell 20: 471-481, IIZASA et al., J Biol Chem 285: 2996-3004, PETUTSCHNIG et al., J Biol Chem 285 (37): 28902-2891 1).
  • the "Golden Gâte” cloning method was used (ENGLER et al., PLOS One, 3 (11): e3647, 2008).
  • a construct allowing the reconstitution of the CERK1 gene from the nucleotide sequences encoding its extracellular domain and its transmembrane domain fused to its intracellular kinase domain was carried out according to the same approach.
  • These different constructs were introduced in Agrobacterium tumefaciens GV3101 and in Agrobacterium rhizogenes MSV440 to stably or transiently transform a cerkl mutant of A. thaliana expressing the aequorin calcium probe described by WAN et al. (Plant Physiology 160: 396-406, 2012).
  • the EFR receptor is responsible for the perception of the EF-Tu bacterial elicitor (elongation thermo unstable factor) resulting, at the cellular level for example by the production of ethylene or reactive oxygen species (ZIPFEL et al. Cell 125, 749-760, 2006).
  • constructs allowing the production of chimeric proteins constituted by the extracellular domain of LYR3 (LYR3-ED) fused to a transmembrane domain (TM) and to the intracellular kinase domain (Kin) of the EFR receptor, were generated.
  • the transgenic plants obtained make it possible to follow, following the application of LCOs, the characteristic defense responses of the EFR receptor.

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Description

UTILISATION D'UN RÉCEPTEUR KINASE À MOTIFS LysM POUR AMÉLIORER LA RÉPONSE DES PLANTES AUX LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES.
L'invention est relative à l'amélioration des effets sur les plantes des facteurs lipochitooligosaccharidiques Nod et Myc-LCOs.
Un très grand nombre de plantes terrestres sont capable d'établir, par l'intermédiaire de leur système racinaire, une symbiose avec des microorganismes du sol.
Le plus connu de ces systèmes endosymbiotiques est celui qui intervient entre des bactéries du sol, collectivement dénommées Rhizobia ou Rhizobium et les racines de plantes de la famille des légumineuses, et aboutit à la formation de nodules racinaires dans lesquels est fixé l'azote atmosphérique. La symbiose i?/z zo& wm-légumineuse est relativement spécifique : une espèce donnée de Rhizobium ne nodule que certaines espèces de légumineuses, dont le nombre varie selon l'espèce de Rhizobium concernée.
Un autre type important d'endosymbiose racinaire est la symbiose endomycorhizienne à arbuscules, qui intervient non seulement chez les légumes, mais chez la plupart des plantes terrestres, et qui implique des champignons appartenant à l'ordre des Glomales.
Le champignon fournit à la plante des composés minéraux, principalement du phosphate et de l'azote, et la plante fournit des composés carbonés issus de la photosynthèse.
La symbiose Rhizobium-légumi use et la symbiose endomycorhizienne à arbuscules ont un certain nombre de points communs. L'un d'entre eux est la nature des signaux symbiotiques produits par les Rhizobia (Facteurs Nod) ou par les champignons (Facteurs Myc-LCOs) ; en effet, dans les deux cas, il s'agit de lipochitooligosaccharides (LCOs), composés d'un squelette d' oligochitine comportant trois à cinq résidus de N-acétyl glucosamine liés en β (1-4), acylé sur la glucosamine terminale non-réductrice par un acide gras (GOUGH & CULLIMORE, Molecular Plant-Microbe Interactions, 24, 867-78, 2012).
Chez les facteurs Nod le squelette oligochitinique porte en outre divers substituants au niveau des extrémités réductrices et non-réductrices (acétylation, sulfatation, méthylation, fucosylation...), et la longueur, le degré d'insaturation, et la position des liaisons insaturées de la chaîne d'acide gras peut varier (DENARIE et al., Annu Rev Biochem, 65, 503-35, 1996; D'HAEZE & HOLSTERS, Glycobiology, 12, 79R-105R, 2002). Cette diversité de substituants résulte de la présence chez différentes souches de Rhizobia, de gammes différentes de gènes nod impliqués dans ces substitutions, et aboutit à une grande variété de facteurs Nod différents, qui intervient dans la spécificité de l'interaction Rhizobium-légu im sQ.
Les facteurs Myc-LCOs caractérisés jusqu'à présent ont une variété de substituants beaucoup plus limitée : l'acide gras de l'extrémité non-réductrice est un acide gras courant, principalement un acide oléique (Cl 8: 1) ou palmitique (C16:0), et la seule autre substitution ayant été observée est une O-sulfatation de l'extrémité réductrice (MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 201 1).
A coté de leurs rôles dans les symbioses Rhizobium-légum euse et endomycorhizienne, les facteurs Nod et Myc-LCOs ont un effet bénéfique sur la croissance et le développement des plantes. Par exemple, il a été rapporté que des facteurs Nod ainsi que des facteurs Myc-LCOs amélioraient le développement et la structure racinaire (OLAH et al., Plant J, 44, 195-207, 2005 ; MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 201 1), et qu'ils favorisaient la germination, la croissance de diverses plantes et le rendement de la photosynthèse (MAJ et al., J Chem Ecol, 35, 479-87, 2009 ; KIDAJ et al, Microbiol Res, 167, 144-50, 2012 ; PRITHIVIRAJ et al., Planta, 216, 437-45, 2003 ; SOULEIMANOV et al., J Exp Bot, 53, 1929-34, 2002 ; KHAN et al., J Plant Physiol, 165, 1342-1351, 2008).
La N-acétyl glucosamine constitue également un composant de base de molécules de signalisation qui sont importantes dans les interactions parasite-plante, et constituent notamment de puissants éliciteurs des réactions de défense chez les plantes vis-à- vis des bactéries et des champignons pathogènes. Il s'agit des chitooligosaccharides (COs), qui représentent des fragments de chitine libérés principalement par l'hydrolyse de la paroi fongique, et qui sont constitués d'un enchaînement linéaire de résidus de N-acétyl glucosamine liés en β (1-4) et ne comportant aucune substitution par un acide gras, et des peptidoglycanes bactériens, dont la partie polysaccharidique est un copolymère de N-acétyl glucosamine et d'acide N-acétyl-muramique.
Parmi les protéines connues pour être impliquées dans la perception de fragments de chitine ou de peptidoglycanes bactériens figurent des protéines à motifs lysin (LysM), et notamment des protéines appartenant à la famille des récepteurs kinase à motifs LysM (LysM-RLKs pour « LysM Receptor-Like Kinases »).
Le motif LysM (Pfam PF01476) est présent dans un très grand nombre de protéines procaryotes ou eucaryotes (BUIST et al., Molecular Microbiology, 68, 838-47, 2008). Chez les procaryotes, il est par exemple retrouvé dans des enzymes pariétales impliquées dans la dégradation des peptidoglycanes; chez les eucaryotes il est présent dans certaines chitinases, ou dans des récepteurs intervenant dans la perception de molécules contenant de la N-acétyl glucosamine.
Les récepteurs kinase à motifs LysM, dont l'existence n'a été décrite que chez les plantes (ZHANG et al., Plant Physiology, 144, 623-36, 2007), comprennent un domaine extracellulaire contenant 1 à 3 motifs LysM, associé à un domaine kinase intracellulaire via un domaine transmembranaire. Chez un certain nombre de ces récepteurs, le domaine kinase intracellulaire est inactif, c'est-à-dire n'est pas capable de catalyser une réaction de phosphorylation.
Les analyses effectuées à partir des séquences disponibles sur les bases de données ont montré que les récepteurs kinase à motifs LysM appartiennent à une famille multigénique dont le nombre de représentants dépend de l'espèce concernée. On a ainsi identifié 17 membres de cette famille chez Medicago truncatula (ARRIGHI et al., Plant Physiology, 142, 265-79, 2006) ainsi que chez Lotus japonicus (LOHMANN et al., Mol Plant Microbe Interact, 23, 510-21, 2010), 12 chez le soja, 5 chez Arabidopsis thaliana, et 10 chez le riz (ZHANG, 2007, précité), mais la fonction précise de la plupart d'entre eux n'a pas encore été élucidée.
Il a été montré que certains de ces récepteurs sont impliqués dans la perception des COs dérivés de la chitine, et dans l'induction de la réponse de la plante aux infections fongiques ; on citera notamment chez Arabidopsis thaliana LYK1/CERK1 (MIYA et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 19613-18, 2007; WAN et al., Plant Cell 20, 471-81 , 2008), et RLK4 (WAN et al., Plant Physiol., prépublication en ligne, 28 juin 2012), et chez le riz, OsCERKl (SHIMIZU et al, The Plant Journal, 64, 204-14, 2010). Chez le riz et M. truncatula, une protéine à motif LysM a également été décrite comme impliquée dans la perception des COs ; cette protéine est toutefois dépourvue de domaine kinase (KA U et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 1 1086-91, 2006 ; FLIEGMAN et al., Plant Physiology and Biochemistry 49, 709-720, 2011).
D'autres récepteurs kinase à motifs LysM ont été décrits comme impliqués dans la perception des facteurs Nod ; il s'agit de NFP et LYK3 de Medicago truncatula et de NFRl et NFR5 de Lotus japonicus (LIMPENS et al., Science, 302, 630-3, 2003; MADSEN et al, Nature, 425, 637-40, 2003; RADUTOIU et al., Nature, 425, 585-92, 2003a; ARRIGHI et al, Plant Physiology, 142, 265-79, 2006; SMIT et al., Plant Physiol, 145, 183-91, 2007). Il a aussi été rapporté que NFP de Medicago truncatula et une protéine apparentée de Parasponia andersonii (PaNFP) étaient également impliqués dans la perception des facteurs Myc (MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 2011 ; OP DEN CAMP et al., Science, 331, 909- 12, 201 1).
Récemment, il a été rapporté que NFRl et NFR5 de Lotus japonicus pouvaient se lier directement à des LCOs avec une affinité élevée (BROGHAMMER et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 109, 13859-64, 2012).
En revanche, aucune interaction directe de NFP ou LYK3 de Medicago truncatula avec des LCOs n'a été rapportée à l'heure actuelle. Toutefois, des études biochimiques effectuées avec des facteurs Nod radiomarqués ont montré l'existence de 3 sites de liaison des facteurs Nod (dénommés NFBS, pour "Nod Factor Binding Site") dans des fractions obtenues à partir de racines de Medicago truncatula, ou de cellules en culture de Medicago truncatula ou de Medicago varia (BONO et al., Plant J, 7, 253-60, 1995 ; GRESSENT et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999; HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). Ces sites diffèrent entre eux par leur affinité et leur sélectivité vis-à-vis du principal facteur Nod (NodSm-IV(Ac, S, C16:2A2,9)) produit par Sinorhizobium meliloti, le symbiote de Medicago, mais ils reconnaissent tous également les facteurs Nods sulfatés et non-sulfatés, et sont indépendants de NFP. L'un de ces sites, dénommé NFBS2, qui présente une affinité élevée pour le facteur NodSm est associé à la membrane plasmique des cellules de Medicago varia en culture (GRESSENT et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999), et un site ayant des propriétés similaires a également été décrit dans la fraction membranaire de cultures de cellules de Medicago truncatula (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). Cependant, la protéine affine associée à NFBS2 n'avait jusqu'à présent pas pu être identifiée.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à identifier cette protéine comme étant la protéine LYR3, précédemment identifiée in silico par ARRIGHI et al. (2006, précité), parmi les récepteurs kinase à motifs LysM, et également dénommée MtLYK12 (ZHANG, 2007, précité), mais à laquelle aucune fonction particulière n'avait pu être attribuée. Les Inventeurs ont caractérisé en outre ses propriétés de liaison aux LCOs.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide choisi parmi :
- un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM dont le domaine extracellulaire flanqué du peptide signal possède au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 98% d'identité de séquence, et au moins 65%, et par ordre de préférence croissante, au moins 70, 75, 80, 85, 90,
95 ou 98%o de similarité de séquence avec la région 1-274 de la protéine LYR3 de Medicago truncatula de séquence SEQ ID NO: 2 ;
- un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur kinase à motifs LysM ;
pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO.
Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées ici sont calculées en utilisant le programme Needle de la suite EMBOSS avec les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par les acides aminés 1-274 de la séquence
SEQ ID NO : 1 et la région homologue de la protéine ciblée.
On désigne ici par facteur Nod ou facteur Myc-LCO, tout LCO dont la structure générique de base comporte une chaîne de résidus de N-acétyl glucosamine liés en β (1-4), et qui est N-acylé sur la glucosamine terminale non-réductrice par un acide gras. Ledit
LCO peut être d'origine naturelle (fourni par les microorganismes symbiotes ou purifié à partir de ceux-ci), ou être produit par synthèse chimique et/ou par génie génétique. De très nombreux facteurs Nod et facteurs Myc-LCO sont connus en eux-mêmes ; on citera par exemple les facteurs Nod décrits dans les articles de revue de DENARIE et al., (1996, précité) ou de D'HAEZE & HOLSTERS (2002, précité), ainsi que dans les Demandes PCT
WO 91/15496, WO 94/00466, ou WO 2005/063784, ou les facteurs Myc décrits dans la
Demande PCT WO 2010/049817.
L'homme du métier peut aisément identifier des domaines extracellulaires de récepteurs kinase à motifs LysM utilisables dans le cadre de la présente invention, sur la base de leur homologie de séquence avec celui de la protéine LYR3 de Medicago truncatula, et en outre sur la base de leur affinité pour les LCOs et de la sélectivité de leur liaison aux LCOs par rapport aux COs.
Quelques exemples de récepteurs kinase à motifs LysM sont mentionnés dans le Tableau I ci-dessous. Ceux dont le domaine extracellulaire possède au moins 45% d'identité et au moins 65% de similarité de séquence avec celui de la protéine LYR3 de Medicago truncatula sont indiqués en gras et par un astérisque.
Tableau I
Figure imgf000006_0001
Sources des références:
Medicago truncatula - Génome Sequencing Project Release version : Mt3.5.1 (http://medicagohapmap.org/); Lotus japonicus génome assembly build 2.5 (http://www.kazusa.or.jp/lotus/), Lohmann et al (2010, précité) ; Arabidopsis thaliana - The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/);
Solanum lycopersicum - génome version 3.0.1 (http://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome) Prunus persica (peach) - Phytozome v9.1 (http://www.phytozome.org). Typiquement, le domaine extracellulaire d'un récepteur kinase à motifs LysM utilisable conformément à l'invention est capable de se lier à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO, avec une constante de dissociation (Kd), inférieure ou égale à 100 nM, de préférence inférieure ou égale à 50 nM, et de manière tout à fait préférée inférieure ou égale à 20 nM.
Ledit domaine extracellulaire est capable de se lier à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO avec une affinité de liaison au moins 50 fois, de préférence au moins 100 fois, avantageusement au moins 200 fois, et de manière tout à fait préférée au moins 500 fois supérieure à son affinité de liaison pour un CO correspondant (c'est-à-dire un CO ayant le même squelette oligochitinique que ledit facteur Nod ou ledit facteur Myc-LCO).
Dans le cas d'un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur kinase à motifs LysM, il peut être constitué par le domaine extracellulaire isolé, ou comprendre en outre un ou plusieurs autres domaines, par exemple un domaine transmembranaire (ou une séquence d'ancrage membranaire) et éventuellement un domaine kinase intracellulaire (qui peut soit posséder une activité kinase, soit en être dépourvu). Il peut s'agir le cas échéant d'un polypeptide chimérique, dans lequel le ou les domaine(s) associé(s) au domaine extracellulaire proviennent d'une ou plusieurs autre(s) protéine(s) que le récepteur kinase à motifs LysM dont est issu ledit domaine extracellulaire. Par exemple, le domaine transmembranaire et le cas échéant le domaine kinase intracellulaire, peuvent provenir d'un ou éventuellement de deux récepteur(s) kinase à motifs LysM différent(s) de celui dont provient ledit domaine extracellulaire. Ce ou ces autre(s) récepteur(s) kinase à motifs LysM peuvent être issus d'une plante de la même espèce que celle dont est issu le domaine extracellulaire, ou d'une ou deux plantes d'espèces différentes. Le domaine extracellulaire peut également être combiné avec les domaines issus de protéines autres que les récepteur(s) kinase à motifs LysM, comme par exemple ceux décrits par DE LORENZO et al. FEBS Letters 585, 1521-1528, 201 1, impliqués dans les réactions de défense, la résistance aux pathogènes ou la productivité des plantes.
La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus, et l'expression dudit récepteur ou dudit polypeptide dans ladite plante.
L'amélioration de la réponse d'une plante aux facteurs Nod et/ou aux facteurs Myc-LCO peut se traduire notamment par l'amélioration des capacités de nodulation et/ou d'endomycorhization de ladite plante ; elle peut se traduire aussi par une meilleure réponse à un traitement par des facteurs Nod et/ou des facteurs Myc-LCO, permettant d'accroître un ou plusieurs des effets bénéfiques de ces facteurs, tels que l'amélioration de la germination, du développement racinaire, de la croissance, du rendement photosynthétique ou de la résistance aux pathogènes.
Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre par les méthodes usuelles, connues en elles-mêmes, du génie génétique et de la transgénèse végétale. Classiquement, il comprend les étapes suivantes :
- la transformation d'une cellule végétale avec un vecteur contenant une cassette d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
- la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression.
Des techniques très nombreuses de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques, (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont connues de l'homme du métier. Le choix de la méthode la plus appropriée dépendra généralement de la plante concernée.
La présente invention a également pour objet des constructions d'ADN recombinant permettant l'expression d'un récepteur kinase à motifs LysM ou d'un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus.
Il s'agit notamment de cassettes d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour ledit récepteur kinase ou ledit polypeptide, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Ledit promoteur peut être le promoteur endogène dudit récepteur kinase à motifs LysM ; dans ce cas, la cassette d'expression peut être avantageusement constituée par la séquence codant pour ledit récepteur kinase, flanquée de 0,5 à 2 kb, de préférence de 1 à 1,5 kb, de séquence génomique en amont.
Alternativement, il peut s'agir d'un promoteur hétérologue.
Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans l'art.
Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques.
Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou- fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs (CHRISTENSEN & QUAIL, Transgenic Res, 5, 213-8, 1996), du lotier (Ljubql, MAEKAWA et al. Mol Plant Microbe Interact. 21, 375-82, 2008) ou d'Arabidopsis (UBQ10, NORRIS et al. Plant Mol. Biol. 21, 895-906, 1993) ou le promoteur « Actine-Intron-actine » du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genêt., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221).
Avantageusement, on utilisera un promoteur conférant une expression spécifique ou préférée dans les tissus de la racine ; à titre d'exemples non-limitatifs, on citera le promoteur de l'allothionéine du maïs, (DE FRAMOND et al., FEBS 290, 103-106, 1991 ; Demande EP 452269), le promoteur de chitinase décrit par SAMAC et al., (Plant Physiol. 93, 907-914, 1990), le promoteur de la glutamine synthétase des racines de soja décrit par HIREL et al. (Plant Mol. Biol. 20, 207-218, 1992), le promoteur RCc3 du riz (Demande PCT WO 2009/016104), le promoteur antiquitine du riz (Demande PCT WO 2007/0761 15), le promoteur du récepteur kinase LRR décrit dans la Demande PCT WO 02/46439, le promoteur ZRP2 de maïs décrit dans le Brevet US 5,633,363, le promoteur LeExtl de tomate (BUCHER et al. Plant Physiol. 128, 911-923, 2002), le promoteur pC02 d'Arabidopsis (HEIDSTRA et al, Gènes Dev. 18, 1964-1969, 2004).
La présente invention englobe également des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants conformes à l'invention peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription, les séquences de tête (leader séquences) et les sites de polyadénylation. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. A titre d'exemples de séquences de ce type fréquemment utilisées chez les plantes, on citera parmi les plus répandues, le terminateur de l'ARN 35S du CaMV, le terminateur du gène de la nopaline synthase, etc. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences « enhancer » de transcription et de traduction).
Parmi les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs, conférant à ces cellules ou organismes un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection : seuls les cellules ou organismes exprimant un gène marqueur de sélection déterminé, sont viables dans des conditions données (conditions sélectives). Des gènes rapporteurs fréquemment employés sont par exemple celui de la beta-glucuronidase (GUS), celui de la luciférase, ou celui de la "green or red fluorescent protein" (GFP/RFP) et leurs dérivés. Des gènes marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistance à un antibiotique, ou également, dans le cas des plantes ou des cellules végétales, à un herbicide. Il existe une très grande variété de gènes marqueurs de sélection parmi lesquels l'homme du métier peut effectuer son choix en fonction des critères qu'il aura lui-même déterminés.
Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu, et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc.
La présente invention englobe également toute cellule-hôte transformée par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus, ce qui inclut en particulier les cellules hôtes transformées par une cassette d'expression ou un vecteur recombinant conforme à l'invention.
On entend par cellule ou organisme transformé par un polynucléotide, toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert dudit polynucléotide dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et que l'information génétique apportée par ledit polynucléotide soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra-chromosomique.
Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote ou eucaryote. Dans le cas d'une cellule procaryote, il peut notamment s'agir d'une cellule d'Agrobactérie telles qu! 'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Dans le cas d'une cellule eucaryote, il peut s'agir notamment d'une cellule végétale, issue d'une plante dicotylédone ou monocotylédone. La construction peut être exprimée transitoirement, elle peut aussi être incorporée dans un réplicon extrachromosomique stable, ou intégrée dans le chromosome.
La présente invention a également pour objet une plante transgénique comprenant dans son génome au moins une copie d'un transgène contenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus.
On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par un polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu'ils contiennent dans leur génome au moins une copie du transgène.
Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc ..) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques conformes à l'invention fait également partie de l'objet de la présente invention. L'invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes transgéniques conformes à l'invention, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs et les fruits.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la caractérisation de la protéine LY 3, et la mise en évidence de son rôle dans la perception des LCOs.
EXEMPLE 1 : CARACTÉRISATION D'UN SITE DE LIAISON D'AFFINITÉ ÉLEVÉE POUR LES LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES CHEZ MEDICAGO TRUNCATULA.
Chez Medicago varia et Phaseolus vulgaris, des sites de liaison présentant une affinité élevée pour les facteurs Nod produits par les symbiotes respectifs de ces 2 plantes, ont été précédemment décrits à partir de la fraction membranaire des cellules en culture, et respectivement dénommés MvNFBS2 et PvNFBS2 (GRESSENT et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999; GRESSENT et al, Mol Plant Microbe Interact, 15, 834-9, 2002). MvNFBS2 et PvNFBS2 sont enrichis dans la membrane plasmique. Toutefois, les protéines correspondant à ces sites NFBS2 n'avaient pas été identifiées. Plus récemment, un site de liaison possédant des propriétés comparables, à savoir une affinité élevée pour le facteur Nod de S. meliloti, NodSm-IV(Ac,S,C16:2A2,9), a été mis en évidence dans la fraction membranaire de cellules en culture de Medicago truncatula (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006).
Afin de poursuivre la caractérisation de ce site, des expériences de liaison à l'équilibre de différents chitooligosaccharides (CO) ou lipochitoologosaccharides (LCO) en présence du ligand radioactif LCO-IV (35S, C16:2A2,9), représentatif d'un facteur Nod de S. meliloti, ont été effectuées. Les composés testés présentent des variations au niveau du squelette chitinique (nombre de résidus saccharidiques) et de ses substitutions (présence ou absence du groupement sulfate) ainsi qu'au niveau de la chaîne d'acide gras (longueur de la chaîne et nombre et type d' insaturations) N-acylant le sucre terminal non-réducteur des LCOs. La nomenclature utilisée ici pour désigner ces composés est la suivante : pour les facteurs Nod naturels, l'indication Nod est suivie du nom abrégé de l'espèce bactérienne produisant le facteur Nod concerné; pour les molécules synthétiques, CO désigne un chitooligosaccharide, LCO un lipochitooligosaccharide. Le nombre d'unités saccharidiques est indiqué par un chiffre romain. La nature de la chaîne d'acide gras des LCO, et les éventuelles substitutions sur le squelette oligochitinique (Ac pour O-acétyl, S pour groupement sulfate) sont précisées entre parenthèses.
Ces expériences ont été réalisées avec les fractions membranaires obtenues à partir de cellules en culture du mutant dmi3 de Medicago truncatula (qui n'est capable d'établir ni la symbiose rhizobienne, ni la symbiose endomycorhizienne à arbuscules), car il a été observé qu'elles étaient plus riches en sites de liaison MtNFBS2 que celles des plantes sauvages (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006).
Les cellules en culture ont été obtenues à partir de cals de racines de plantes, produites et récoltées comme décrit par GRESSENT et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999).
Les cellules ont été homogénéisées 6 fois 5 secondes à 4°C dans un broyeur à hélices, dans du tampon d'extraction (Tris-HCl 25 mM pH 8,5, 0,47 M saccharose, 10 mM EDTA, 10 mM dithiothréitol) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (0,1 mM (Amino-2-éthyl)-4-benzènesulfonyle fluorure chlorohydrate (AEBSF), antipaine, leupeptine, aprotinine, pepstatine, chymostatine), puis l'homogénat a été traité comme précédemment décrit par GRESSENT et al. (1999, précité). La fraction membranaire qui sédimente à 45000 x g, a été resuspendue dans du tampon de liaison (tampon Na-cacodylate 25 mM pH 6,0, 0,25 M saccharose, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, cocktail d'inhibiteurs de protéases) ajusté à 50% de glycérol et conservé à -80°C.
Pour les expériences de liaison à l'équilibre, 10 à 50 μg de protéines de fraction membranaire ont été incubées en présence de 0,4, 0,7 ou 2 nM de facteur Nod marqué au 35S, (LCO-IV(35S, C16:2A2,9)) dans du tampon de liaison (volume final 200 μΐ). La composante de liaison non-spécifique a été déterminée en présence de 2 μΜ de LCO-IV(S, C16:2A2,9).
Les expériences de compétition ont été effectuées en présence de concentrations variables en compétiteurs afin de déterminer leurs affinités (¾, K,) pour le site de liaison. Toutes les expérimentations ont été effectuées en triplicata.
Les mélanges réactionnels ont été incubés pendant 1 heure à 0°C dans des plaques de microtitration à 96 puits (Nunc), filtrés pour séparer le ligand radioactif libre de celui lié, les filtres lavés et leur radioactivité mesurée comme décrit précédemment par GRESSENT et al. (1999, précité). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel RADLIG, version 4 (Biosoft, Cambridge, UK).
Les résultats de ces expérimentations sont présentés dans le Tableau II ci-dessous. Tableau II
Composé Affinité (nM)
LCO-IV(S, C16:2A2,9) 15
LCO-IV(C16:2A2,9) 15
Myc-LCO: LCO-IV(S, C16:0) 6
Myc-LCO: LCO-IV(S, C18: 1 A9) 10
Myc-LCO : LCO-IV(C18:1 A9) 11
LCO-ll(C16: 1A9) > 5000
CO-IV > 5000
Le facteur Nod LCO-IV(S, C16:2A2,9), a une affinité élevée (Kd = 15 nM) pour le site de liaison, ainsi que son homologue non sulfaté, le LCO-IV(C16:2A2,9) (Kj = 15 nM). Les LCOs correspondant à des facteurs Myc-LCOs : LCO-IV(S, C18: 1A9) et son homologue non-sulfaté, ainsi que LCO-IV(S, Cl 6:0) sont également reconnus avec une affinité très élevée (Kj de 6 à 1 1 nM). En revanche, le LC0-II(C16: 1A9) et le chitotétraose (CO-IV) ont une affinité très faible (Kj de 5 μΜ et Kj > 2 μΜ, respectivement).
Le site de liaison présent chez Medicago truncatula possède donc des caractéristiques d'affinité et de sélectivité de liaison similaires à celles précédemment observées pour le site MvNFBS2. Il sera dénommé ci-après MtNFBS2.
EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION D'UN POLYPEPTIDE DE 100 KDA CORRESPONDANT À MTNFBS2
Afin d'évaluer la masse moléculaire de la protéine affine des facteurs Nod responsable des propriétés de liaison de MtNFBS2, un photomarquage à l'aide d'analogues de facteurs Nod, contenant un groupement photoactivable, qui après irradiation à une longueur d'onde donnée forme une espèce réactive pouvant établir une liaison covalente avec les molécules environnantes, a été effectué. La structure chimique des analogues choisis est représentée sur la Figure 1. Ils contiennent un groupement photoactivable azoture (Figure 1A) ou benzophénone (Figure 1B), activés respectivement à 254 et 380 nm, et il a été vérifié que leur affinité pour MtNFBS2 était comparable à celle de LCO-IV(S, C16:2A2,9). Des
35 homologues non-sulfatés de ces molécules ont été synthétisés et marqués au S pour permettre de détecter le complexe stable ligand/protéine affine.
Pour le photomarquage, 5 nM de ligand radioactif et photoactivable, seul ou en présence d'un excès (2 μΜ) de différents compétiteurs, ont été incubées dans du tampon de liaison, dans les mêmes conditions que celles décrites à l'Exemple 1 ci-dessus pour les expériences de liaison à l'équilibre, avec 300 μg de protéines de fraction membranaire obtenues à partir de cellules en culture de Medicago truncatula de type sauvage (A 17), ou du mutant dmi3 de Medicago truncatula. Après 1 heure d'incubation, les échantillons ont été irradiés pendant 5 min. à 254 nm ou 10 min. à 365 nm avec un tube fluorescent à une distance de 4 cm. Le ligand libre a été éliminé par centrifugation, et le culot membranaire a été lavé 2 fois dans le tampon de liaison. Les protéines du culot membranaire ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, et transférées sur membrane de nitrocellulose, et la détection a été effectuée par autoradiographie. L' autoradiographie obtenue avec le ligand contenant le groupement azoture est représentée sur la Figure 2.
Une protéine de poids moléculaire apparent proche de 100 kDa est détectable dans la fraction membranaire obtenue à partir des cellules du mutant dmi3. la liaison du ligand radiomarqué à ce polypeptide est complètement abolie quand l'incubation est effectuée en présence d'un excès de LCO-IV(S, C16:2A2,9). La liaison est également inhibée en présence d'un excès de facteurs Myc-LCOs sulfatés ou non (LCO-IV(S, C18:1A9 et LC0-IV(C18: 1A9), mais pas en présence d'un excès du chitooligosaccharide correspondant (CO-IV). L'absence de marquage spécifique dans la fraction membranaire obtenue à partir des cellules de la plante sauvage suggère que le polypeptide de 100 kDa y est présent en quantité inférieure au seuil de détection.
Les mêmes résultats (non montrés) ont été obtenus avec le ligand radioactif contenant le groupement benzophénone.
Le fait que le polypeptide de 100 kDa soit détecté dans la fraction membranaire de cellules en culture de dmi3 mais pas dans celle des plantes de type sauvage, qu'il se lie sélectivement aux LCOs par rapport aux COs, et qu'il reconnaisse de la même manière les LCOs sulfatés ou non, suggère qu'il correspond à la protéine impliquée dans le site MtNFBS2.
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION ET CARACTÉRISATION D'UN RÉCEPTEUR KINASE À MOTIFS LysM CORRESPONDANT À MTNFBS2
Dans le but d'identifier des protéines candidates pouvant correspondre au polypeptide de 100 kDa, des approches protéomiques et transcriptomiques ont été effectuées.
Plusieurs protéines candidates ont été identifiées sur la base de leur poids moléculaire apparent et d'un niveau d'expression plus important chez les cellules en culture de dmi3 que chez celles issues de plantes de type sauvage.
Parmi ces protéines figuraient des récepteurs kinase à motifs LysM : LYR3,
LYK9, et LYR6. Comme il est connu que les protéines de cette famille sont impliquées dans la perception de molécules contenant un squelette chitinique, ces récepteurs ont été choisis pour la suite des expérimentations.
Les gènes LYR3, LYK9, et LYR6 ont été insérés dans un vecteur binaire, en fusion C-terminale avec une protéine fluorescente (Yellow Fluorescent Protein :YFP) et introduits dans des feuilles de Nicotiana benthamiana par agroinfiltration à l'aide à'Agrobacterium tumefaciens. Parallèlement, les gènes NFP et LYK3 qui codent pour des récepteurs putatifs de facteurs Nod et LYR4 ont été insérés dans les mêmes vecteurs et exprimés dans les mêmes conditions. Pour la construction des vecteurs binaires, la technologie GATEWAY (Invitrogen) a été utilisée. Pour chacun des gènes choisis, la séquence codante complète a été amplifiée par PCR à l'aide d'amorces spécifiques de cette séquence et contenant les sites de recombinaison attBl et attB2 puis introduite par recombinaison BP dans le vecteur d'entrée pDONR 207 (INVITROGEN). Le clone pENTR recombinant ainsi obtenu a ensuite été recombiné avec le vecteur pBinl9-35S-GW-YFP (FROIDURE et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107, 15281 -86, 2010 ; CANONNE et al, Plant Cell, 23, 3498-51 1, 201 1) pour générer le vecteur binaire utilisé pour transformer les plantes. Ce vecteur a été introduit par électroporation dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens qui porte le plasmide ternaire pBBRv/>GN54D (VAN DER FITS et al, Plant Molecular Biology, 43, 495-502, 2000).
Les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit à 28°C en milieu YEB (5 g/1 Bacto peptone, 5 g/1 extrait de bœuf, 5 g/1 saccharose, 1 g/1 extrait de levure, 2 mM MgS04) complémenté avec 10 μg/ml de rifampicine, 40 μg/ml de gentamycine, et 50 μg/ml de kanamycine. Elles ont ensuite été récoltées, lavées 3 fois avec une solution 10 mM Acide 2-morpholino éthanesulfonique (MES)/10 mM MgCl2 (pH 5.6), et incubées dans la même solution additionnée de 1 μg/ml d'acétosyringone, à une densité optique (600 nm) finale de 0,25, pendant au moins une heure avant l'infiltration dans les feuilles 2, 3, et 4 de plantes de N, benthamiana âgés de 4 semaines.
Les feuilles ont été observées 72 h après l'agroinfiltration. Dans le cas des protéines recombinantes LYR3/YFP, NFP/YFP, and LYK3/YFP une fluorescence jaune est observée à la périphérie des cellules épidermiques, ce qui suggère une localisation au niveau de la membrane plasmique. Dans le cas de LYK9/YFP, LYR4/YFP, et LYR6/YFP des lésions nécrotiques des feuilles sont observées, ce qui suggère une réaction de type réponse hypersensible, probablement médiée par le domaine kinase de ces protéines, comme déjà observé dans le cas d'autres récepteurs kinase à domaine LysM (MADSEN et al., The Plant Journal, 65, 404-17, 201 1).
En conséquence, des constructions chimériques, dans lesquelles le domaine transmembranaire et le domaine kinase sont remplacés par le domaine transmembranaire et le domaine kinase inactif de NFP, ont été réalisées pour les protéines LYR3, LYR4, LYK9, et LYR6. Pour ces constructions, la méthode de clonage « Golden Gâte » a été utilisée (ENGLER et al., PLOS One, 3(11): e3647, 2008) et le gène chimérique construit a été inséré dans un vecteur binaire pCAMBIA2200 (http://www.cambia.org ; GenBank: AF234313.1) modifié, sous contrôle du promoteur 35S. L'introduction du vecteur binaire dans la souche LBA4404 à' Agrobacterium tumefaciens, et l'agroinfiltration des feuilles de N. benthamiana ont été effectuées comme décrit ci-dessus, à la seule différence que 25 μg/ml de kanamycine (au lieu de 50) ont été utilisés dans le milieu de culture des bactéries transformées.
Les protéines chimériques exprimées par ces constructions contiennent, dans leur portion C-terminale, le domaine transmembranaire et le domaine kinase intracellulaire de NFP, et dans leur portion N-terminale, le domaine extra-cellulaire de LYR3, LYR4, LYK9, ou LYR6. Leur expression dans les feuilles N. benthamiana n'a pas engendré de réponse hypersensible.
3 jours après Γ agro-infiltration, les feuilles de N. benthamiana exprimant les différentes constructions ont été récoltées, et broyées dans l'azote liquide. Des fractions membranaires ont été préparées à partir des broyats, en utilisant le même protocole que celui décrit ci-dessus pour la préparation des fractions microsomales, à ceci près que 0,6 % (p/v) de polyvinyl-polypyrrolidone ont été ajoutés au tampon d'extraction. Après centrifugation à 3000 x g, le surnageant a été collecté et centrifugé à 45000 x g. Le culot résultant (fraction membranaire) a été resuspendu dans du tampon de liaison, et conservé à -80°C en présence de 10% ou 50% de glycérol, jusqu'à utilisation.
Les protéines membranaires ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, et transférées sur membrane de nitrocellulose, et la détection des protéines recombinantes effectuée à l'aide d'anticorps anti-GFP. Parallèlement, les propriétés de liaison spécifique aux LCOs ont été évaluées par liaison à l'équilibre, comme décrit à l'Exemple 1, en utilisant de 0,8 à 2,4 nM de LCO-IV(35S, C16:2A2,9) +/- 2 μΜ LCO-IV(S, C16:2A2,9) non marqué, et de 25 μg à 80 μg de protéines membranaires, selon le niveau d'expression de la protéine marquée avec la YFP.
Les résultats sont illustrés par la Figure 3. 1. LYR3, 2. NFP, 3. LYK3, 4. LYR3-NFP, 5. LYR4-NFP, 6. LYR6-NFP, 7. LYK9-NFP. C : extrait des feuilles non transformées.
Ces résultats confirment que toutes les protéines recombinantes sont exprimées (Figure 3A), mais que seules celles qui contiennent le domaine extracellulaire de LYR3 se lient au ligand LCO (Figure 3B).
La liaison directe de LYR3 aux LCOs a été étudiée par photomarquage.
300 μg de protéines de la fraction membranaire de feuilles de N. benthamiana soit transformées par le vecteur exprimant la protéine LYR3-YFP, soit non-transformées (C) ont été incubés en présence du ligand radioactif et photoactivable contenant le groupement azoture, en présence ou en l'absence de compétiteurs, en utilisant le protocole décrit à l'Exemple 2 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 4.
Ces résultats montrent le marquage sélectif d'une protéine de masse moléculaire apparente de 130 kDa, correspondant à la masse moléculaire attendue de la protéine LYR3-YFP. Les expériences de compétition effectuées en présence du facteur Nod LCO-IV(S, C16:2A2,9), de Myc-LCO sulfaté ou non, (LCO-IV(S, C18: 1A9), ou LCO- IV(C18: 1A9) et de chitotétraose (CO-IV), montrent que, comme pour le site MtNFBS2, la liaison est spécifique des LCOs par rapport aux COs.
Pour mieux caractériser les propriétés de liaison de la protéine LYR3, des expérimentations de liaison à saturation de LCO-IV(35S, C16:2A2,9) et de liaison compétitive en présence de différents COs ou LCOs ont été effectuées. Les résultats sont illustrés sur la Figure 5, ainsi que dans le Tableau III ci-dessous, qui à titre de comparaison, reprend également les résultats observés dans les mêmes expérimentations avec le site MtNFBS2.
Tableau III
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La Figure 5 montre les résultats de diverses expérimentations effectuées avec la protéine LYR3-YFP exprimée dans les feuilles de N. benthamiana : 5a) : courbe de Scatchard d'une expérience de liaison à saturation avec LCO-IV(35S, C16:2A2,9) ; 5 b)-e) : expériences de liaison à l'équilibre avec 0,9 nM LCO-IV(35S, C16:2A2,9) comme ligand marqué, et des concentrations variables de divers LCOs et COs compétiteurs ; b) Myc- LCOs ; c) LCOs avec un nombre variable de résidus GlcNAc ; d) COs avec un nombre variable de résidus GlcNAc ; e) LCOs différant par la longueur de la chaîne d'acide gras, et sulfatés ou non sur le sucre terminal non réducteur.
L'analyse de Scatchard montre la présence d'une seule classe de sites de liaison, avec une affinité Kd = 25 nM pour le facteur Nod LCO-IV(S, C16:2A2,9), similaire à celle de MtNFBS2 (Kd = 15 nM). Tous les Myc-LCOs testés présentent une affinité similaire (Fig 5b, Tableau II). La longueur de la chaîne oligosaccharidique a une influence sur les propriétés de liaison à la protéine LYR3: le LCO-V a une affinité légèrement plus élevée que le LCO-IV, et la liaison du LCO-II est très faible (Fig 5c, Tableau III). Tous les COs testés présentent également une affinité très faible (Fig 5d, Tableau III). L'augmentation de la longueur de la chaîne d'acide gras de Cl 6:2 à Cl 8:2 induit une augmentation d'environ 3 fois de l'affinité (Fig. 5e). En revanche, LYR3 ne montre pas de sélectivité importante vis- à-vis de la structure de la chaîne d'acide gras, car des LCOs avec des chaînes en C16 contenant 0, 1 ou 2 insaturations ont des affinités similaires (Tableau III), et les différences d'affinité entre les Myc-LCOs (C16:0 ou C18:1A9) et les facteurs Nod (C16:2,A2,9), qui portent des chaînes d'acide gras différentes, sont peu importantes (inférieures à 2 fois). De même, la sulfatation sur le sucre terminal non-réducteur n'affecte pas non plus significativement les propriétés de liaison (Fig. 5 e, Tableau III).
Le peptidoglycane, qui constitue un ligand pour certaines protéines à domaine LysM (WILLMANN et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 19824-9) a également été testé dans des expérimentations de liaison à l'équilibre; aucune compétition avec le LCO radioactif pour la liaison à LYR3 n'a été observée (résultats non montrés).
EXEMPLE 4 : CARACTÉRISATION DES CAPACITÉS DE LIAISON AVEC LES LCOs DES PROTEINES HOMOLOGUES DE MtLYR3 CHEZ DES LÉGUMINEUSES ET DES NON-LÉGUMINEUSES
Les plus proches homologues de MtLYR3 ont été recherchés sur la base des homologies de séquence avec le domaine extracellulaire chez les légumineuses d'intérêt agronomique (Pisum sativum, le pois ; Glycine max, le soja ; Phaseolus vulgaris, le haricot), ainsi que chez la légumineuse modèle Lotus japonicus, le lotier. Cette recherche d'homologue a été étendue à des non légumineuses dont le génome est séquencé : Prunus persica (la pêche), Solanum lycopersicum (la tomate) et Arabidopsis thaliana. .
Chez les légumineuses, des orthologues de MtLYR3 ont été identifiés chez P. sativum, P. vulgaris et L. japonicus. Chez G. max, les orthologues existent en deux exemplaires en raison d'une duplication du génome. Les gènes correspondant ont été clonés et séquencés. Quelques rares différences de séquence par rapport aux séquences dans les bases de données ont été observées qui pourraient être expliquées par la utilisation des variéties de plantes différents ou les erreurs de séquençage dans les bases de données. Les gènes clonés ont été introduits dans des vecteurs binaires, en fusion C-terminale avec la protéine fluorescente YFP, et introduits dans des feuilles de Nicotiana benthamiana par agroinfiltration à l'aide à'Agrobacterium tumefaciens, comme décrit à l'Exemple 3 ci-dessus. Les fractions membranaires ont été isolées, leur contenu protéique a été analysé par électrophorèse en conditions dénaturantes, suivie d'immunodétection à l'aide d'anticorps anti-GFP comme décrit à l'Exemple 3, et leur capacité d'interaction avec les LCOs a été déterminée par liaison à l'équilibre, comme décrit à l'exemple 1, en présence de 1 nM de LCO-IV (35S, C16:2A2,9). La valeur de liaison spécifique est déterminée par différence entre la valeur de la liaison totale et celle de la liaison non spécifique obtenue pour une incubation en présence d'un excès (2 μΜ) de ligand non-marqué. A titre de comparaison, la capacité d'interaction des récepteurs LjNFR5 et LjNFRl de L japonicus identifiés pour jouer un rôle dans la nodulation par une approche génétique (MADSEN et al., Nature, 425, 637-40, 2003; RADUTOIU et al., Nature, 425, 585-92, 2003a) et orthologues respectifs de NFP et LYK3 chez M. truncatula, a été déterminée dans les mêmes conditions.
Les résultats obtenus sont illustrés par la Figure 6, qui montre l'activité de liaison des fractions membranaires de feuilles de Nicotiana benthamiana exprimant A) les orthologues de LYR3 de G. max (GmLYR3-l l et GmLYR3-l), P. vulgaris (PvLYR3 , P. sativum (PsLYR3) et L japonicus (LjLYS 12); B) LjLYS12, LjNFR5, et LjNFRl .
Ces résultats montrent que tous les orthologues de MtLYR3 interagissent avec le LCO-IV(35S, C16:2A2,9). En revanche, les récepteurs NFR1 et NFR5 de L. japonicus ne montrent pas d'interaction avec ce LCO.
Pour mieux caractériser les propriétés de liaison aux LCOs des orthologues de MtLYR3, des expérimentations de liaison à saturation et de liaison compétitive en présence de différents COs ou LCOs ont été effectuées. Les résultats sont illustrés par le Tableau IV ci-dessous.
Tableau IV
Figure imgf000019_0001
Ces résultats montrent que tous les orthologues présentent une affinité élevée, très proche de celle de MtLYR3, et comparable pour les Myc-LCOs et le facteur Nod LCO-IV( S, C16:2A2,9), Ils confirment que les protéines LYR3 reconnaissent spécifiquement la structure lipo-chitooligosaccharidique puisque les COs présentent une faible affinité.
Chez les non-légumineuses, les gènes PpLYR3, SILYR3 et AtLysM-RLK4 ont été clonés, les protéines correspondantes ont été exprimées dans les feuilles de N. benthamiana, et leur capacité de liaison aux LCOs a été déterminée par des expérimentations de liaison à l'équilibre, comme décrit ci-dessus pour les protéines LYR3 de légumineuses. Les résultats sont illustrés par la Figure 7, qui montre l'activité de liaison des fractions membranaires de feuilles de Nicotiana benthamiana exprimant PpLYR3, S1LYR3 ou AtLysM-RLK4 avec le facteur Nod LCO-IV(35S, C16:2A2,9). Ces résultats montrent que la protéine de P. persica (PpLYR3) interagit avec le LCO testé. En revanche l'interaction de ce LCO avec S1LYR3 apparaît très faible, et aucune interaction avec les fractions membranaires préparées à partir des feuilles exprimant AtLysM-RL 4 n'a pu être détectée.
Cette absence de liaison apparente pouvant provenir de la dissociation rapide de l'interaction, en raison d'une faible affinité du facteur Nod pour ces protéines, des expérimentations complémentaires de photomarquage par affinité ont été effectuées. Les protéines, préalablement immuno-purifiées à partir des extraits de N. benthamiana à l'aide d'un anticorps anti-GFP greffé sur des billes magnétiques (Chromotek, Allemagne), ont été incubées en présence d'un analogue contenant un groupement photoactivable azoture, selon le protocole décrit dans l'Exemple 2 ci-dessus.
Les résultats de ce photomarquage sont illustrés sur la Figure 8. A : AtLysM-RLK4 ; B : S1LYR3 ; C : PpLYR3 et MtLYR3. Le compétiteur utilisé est indiqué au dessus de la piste correspondante par la présence d'un signe +.
Dans le cas de AtLysM-RLK4 (Figure 8 A), le photomarquage n' apparaît pas spécifique puisqu'il est également observé en présence d'un excès de compétiteurs qu'il s'agisse de LCOs (facteurs Nod et Myc-LCOs) ou de COs (à chaînes courte ou longue). AtLysM-RLK4 semble donc dépourvue de capacité d'interaction avec les LCOs. Pour S1LYR3 (Figure 8B), l'interaction est partiellement inhibée par un excès de LCOs mais pas par un excès de COs, suggérant que cette protéine reconnaît les lipo-chitooligosaccharides mais avec une faible affinité et une sélectivité différente de MtLYR3 et de ses orthologues.
Dans le cas de PpLYR3 et MtLYR3 (Figure 8C) l'interaction avec le dérivé photo-activable apparaît spécifique, car elle est inhibée lorsque l'incubation est effectuée en présence d'un excès de compétiteur LCO.
L'interaction de PpLYR3 avec le facteur Nod LCO-IV(35S, C16:2A2,9) a été caractérisée plus en détail au moyen d'expériences de saturation et de compétition. Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 9. Ces résultats montrent que PpLYR3 présente une affinité élevée pour le facteur Nod (¾ = 15 nM) comparable à celle de MtLYR3. De même PpLYR3 reconnaît spécifiquement les LCOs puisque l'interaction avec les COs (CO-IV et CO-VIII) est de faible affinité (Ki > 5 μΜ).
EXEMPLE 5 : CRÉATION DE PROTÉINES CHIMÈRES CONTENANT LE DOMAINE EXTRACELLULAIRE DE LYR3 ET APPLICATION À LA CRÉATION DE PLANTES DONT LES RÉACTIONS DE DÉFENSE SONT INDUCTIBLES PAR LCOS
LysM-RLKl ou Chitin Elicitor Receptor Kinase 1 (AtCERKl) est un acteur majeur de la perception de la chitine chez A. thaliana (MIYA et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 19613-19618 ; WAN et al., Plant Cell 20:471-481 ; IIZASA et al., J Biol Chem 285:2996-3004 ; PETUTSCHNIG et al, J Biol Chem 285(37):28902-2891 1). La perception de la chitine par le domaine extracellulaire d'AtCERKl et sa transduction via les domaines transmembranaire et kinase, entraîne des réponses cellulaires rapides comme la production d'espèces réactives de l'oxygène, des variations de la teneur en calcium cytosolique ou du pH intracellulaire, conduisant à l'activation de gènes de défense. En vue de créer des plantes dont les réactions de défense pourraient être induites via l'interaction des LCOs avec le domaine extracellulaire de LYR3, des constructions permettant la production de protéines chimériques, constituées du domaine extracellulaire de LYR3 (LYR3-ED) fusionné à un domaine transmembranaire (TM) et au domaine intracellulaire kinase (Kin) de AtCERKl ont été générées. Pour ces constructions, la méthode de clonage « Golden Gâte » a été utilisée (ENGLER et al., PLOS One, 3(1 1): e3647, 2008). Les gènes chimériques LYR3- ED/AtCERK 1 -TM-Kin ainsi que LYR3-ED-TM/ AtCERKl-Kin, portant une double étiquette HA et Strep-tagll, ont été insérés dans un vecteur binaire pCAMBIA2200 (http://www.cambia.org ; GenBank: AF234313.1) modifié, sous contrôle du promoteur 35S. Une construction permettant la reconstitution du gène CERK1 à partir des séquences nucléotidiques codant son domaine extracellulaire et son domaine transmembranaire fusionné à son domaine intracellulaire kinase, (AtCERKl-ED/AtCERKl -TM-Kin) a été réalisée selon la même approche. Ces différentes constructions ont été introduites chez Agrobacterium tumefaciens GV3101 et chez Agrobacterium rhizogenes MSV440 afin de transformer de façon stable ou transitoire un mutant cerkl d'A. thaliana exprimant la sonde calcique aequorine décrit par WAN et al. (Plant Physiology 160:396-406, 2012). Les protocoles de transformation établis par CLOUGH et BENT (The Plant Journal 16 : 735-743, 1998) et par MARION et al. (The Plant Journal 56: 169-179, 2008) ont été respectivement appliqués. Les plantes transgéniques obtenues permettent de suivre les variations calciques résultant de la perception des LCOs par la protéine chimérique ainsi que la mise en place des réactions de défense.
Le récepteur EFR est responsable de la perception de l'éliciteur bactérien EF-Tu (elongation factor thermo unstable) se traduisant, au niveau cellulaire par exemple par la production d'éthylène ou d'espèces réactives de l'oxygène (ZIPFEL et al., Cell 125, 749- 760, 2006). Selon un principe identique, des constructions permettant la production de protéines chimériques constituées du domaine extracellulaire de LYR3 (LYR3-ED) fusionné à un domaine transmembranaire (TM) et au domaine intracellulaire kinase (Kin) du récepteur EFR, ont été générées. Les plantes transgéniques obtenues permettent de suivre, suite à l'application de LCOs, les réponses de défense caractéristiques du récepteur EFR.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un polynucléotide choisi parmi :
- un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM dont le domaine extracellulaire flanqué du peptide signal possède au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 98% d'identité de séquence, et au moins 65%, et par ordre de préférence croissante, au moins 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la région 1-274 de la protéine LYR3 de Medicago truncatula de séquence SEQ ID NO: 2 ;
- un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur kinase à motifs LysM ;
pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO.
2) Procédé pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1, et l'expression dudit récepteur ou dudit polypeptide dans ladite plante.
3) Cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
4) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon la revendication 3.
5) Cellule-hôte transformée par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1.
6) Plante transgénique, comprenant dans son génome au moins une copie d'un transgène contenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109734785A (zh) * 2019-03-13 2019-05-10 深圳市伊山万瑞科技有限公司 一种来源于苦参的蛋白质及其编码基因与应用
WO2020035486A1 (fr) * 2018-08-13 2020-02-20 Aarhus Universitet Plantes génétiquement modifiées exprimant des récepteurs hétérologues qui reconnaissent les lipo-chitooligosaccharides
WO2020035488A1 (fr) * 2018-08-13 2020-02-20 Aarhus Universitet Récepteurs lysm génétiquement modifiés ayant une spécificité et une affinité d'agoniste modifiées
WO2021233904A1 (fr) * 2020-05-19 2021-11-25 Aarhus Universitet Motifs de récepteur lysm

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136243B (zh) * 2017-06-27 2022-07-12 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 改造禾谷类作物识别结瘤因子并增加根瘤菌定殖数目的方法
CN112021027B (zh) * 2020-09-09 2022-03-29 山东爱果者生物技术有限公司 一种用于提高植物抗逆性以及促进花芽分化的方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0452269A2 (fr) 1990-04-12 1991-10-16 Ciba-Geigy Ag Promoteurs à préférence tissulaire
WO1991015496A1 (fr) 1990-04-06 1991-10-17 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Substances de structure lipo-oligosaccharidique propres a jouer le role de signaux symbiotiques plantes-specifiques, leurs procedes de production et leurs applications
WO1994000466A1 (fr) 1992-06-29 1994-01-06 Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A. Signaux de nodulation de rhizobiaceae a large spectre d'hote
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
WO1997048819A1 (fr) 1996-06-20 1997-12-24 The Scripps Research Institute Promoteurs du virus de la mosaique des nervures du manioc et leurs utilisations
WO2002046439A2 (fr) 2000-12-04 2002-06-13 Universiteit Utrecht Nouveaux promoteurs specifiques des racines activant l'expression d'une nouvelle kinase de type recepteur du domaine lrr
WO2005063784A1 (fr) 2003-12-30 2005-07-14 Bayer Cropscience Sa Composes synthetiques utiles comme agents de nodulation des legumineuses et procedes de preparation de ces composes
WO2007070960A1 (fr) * 2005-12-23 2007-06-28 The University Of Queensland Protéines de récepteurs de facteur de nodulation de soja, acides nucléiques codant pour ces protéines et applications
WO2007076115A2 (fr) 2005-12-23 2007-07-05 Arcadia Biosciences, Inc. Plantes monocotyledones ayant un rendement efficace en azote
WO2009016104A1 (fr) 2007-07-27 2009-02-05 Crop Design N.V. Plantes ayant des caractères se rapportant au rendement qui sont améliorés et leur procédé de fabrication
WO2010049817A2 (fr) 2008-10-29 2010-05-06 Institut National De La Recherche Agronomique Lipochito-oligosaccharides stimulant la symbiose mycorhizienne arbusculaire

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0715354A2 (pt) * 2006-08-07 2015-06-23 Univ Missouri Quinases semelhantes a receptor lysm para melhora da resposta de defesa de plantas contra fungos patogênicos

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015496A1 (fr) 1990-04-06 1991-10-17 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Substances de structure lipo-oligosaccharidique propres a jouer le role de signaux symbiotiques plantes-specifiques, leurs procedes de production et leurs applications
EP0452269A2 (fr) 1990-04-12 1991-10-16 Ciba-Geigy Ag Promoteurs à préférence tissulaire
WO1994000466A1 (fr) 1992-06-29 1994-01-06 Institut National De La Recherche Agronomique - I.N.R.A. Signaux de nodulation de rhizobiaceae a large spectre d'hote
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
WO1997048819A1 (fr) 1996-06-20 1997-12-24 The Scripps Research Institute Promoteurs du virus de la mosaique des nervures du manioc et leurs utilisations
WO2002046439A2 (fr) 2000-12-04 2002-06-13 Universiteit Utrecht Nouveaux promoteurs specifiques des racines activant l'expression d'une nouvelle kinase de type recepteur du domaine lrr
WO2005063784A1 (fr) 2003-12-30 2005-07-14 Bayer Cropscience Sa Composes synthetiques utiles comme agents de nodulation des legumineuses et procedes de preparation de ces composes
WO2007070960A1 (fr) * 2005-12-23 2007-06-28 The University Of Queensland Protéines de récepteurs de facteur de nodulation de soja, acides nucléiques codant pour ces protéines et applications
WO2007076115A2 (fr) 2005-12-23 2007-07-05 Arcadia Biosciences, Inc. Plantes monocotyledones ayant un rendement efficace en azote
WO2009016104A1 (fr) 2007-07-27 2009-02-05 Crop Design N.V. Plantes ayant des caractères se rapportant au rendement qui sont améliorés et leur procédé de fabrication
WO2010049817A2 (fr) 2008-10-29 2010-05-06 Institut National De La Recherche Agronomique Lipochito-oligosaccharides stimulant la symbiose mycorhizienne arbusculaire

Non-Patent Citations (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARRIGHI ET AL., PLANT PHYSIOLOGY, vol. 142, 2006, pages 265 - 79
BENSMIHEN S. ET AL.: "Contribution of NFP LysM Domains to the Recognition of Nod Factors during the Midicago trunculata/ Sinorhizobium meliloti Symbiosis", PLOS ONE, vol. 6, no. 11, 8 November 2011 (2011-11-08), pages 1 - 11, XP002690278 *
BONO ET AL., PLANT J, vol. 7, 1995, pages 253 - 60
BROGHAMMER ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 109, 2012, pages 13859 - 64
BUCHER ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 128, 2002, pages 911 - 923
BUIST ET AL., MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 68, 2008, pages 838 - 47
CANONNE ET AL., PLANT CELL, vol. 23, 2011, pages 3498 - 511
CHRISTENSEN; QUAIL, TRANSGENIC RES, vol. 5, 1996, pages 213 - 8
DE FRAMOND ET AL., FEBS, vol. 290, 1991, pages 103 - 106
DE LORENZO ET AL., FEBS LETTERS, vol. 585, 2011, pages 1521 - 1528
DENARIE ET AL., ANNU REV BIOCHEM, vol. 65, 1996, pages 503 - 35
D'HAEZE; HOLSTERS, GLYCOBIOLOGY, vol. 12, 2002, pages 79R - 105R
ENGLER ET AL., PLOS ONE, vol. 3, no. 11, 2008, pages E3647
FLIEGMANN ET AL., PLANT PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 49, 2011, pages 709 - 720
FROIDURE ET AL., PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 107, 2010, pages 15281 - 86
GOUGH; CULLIMORE, MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS, vol. 24, 2012, pages 867 - 78
GRESSENT ET AL., MOL PLANT MICROBE INTERACT, vol. 15, 2002, pages 834 - 9
GRESSENT ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 96, 1999, pages 4704 - 9
GUST ANDREA A ET AL: "Plant LysM proteins: modules mediating symbiosis and immunity", 1 August 2012, TRENDS IN PLANT SCIENCE, VOL. 17, NR. 8, PAGE(S) 495-502, ISSN: 1360-1385, XP002690277 *
HEIDSTRA ET AL., GENES DEV., vol. 18, 2004, pages 1964 - 1969
HIREL ET AL., PLANT MOL. BIOL., vol. 20, 1992, pages 207 - 218
HOGG ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 140, 2006, pages 365 - 73
IIZASA ET AL., J BIOL CHEM, vol. 285, pages 2996 - 3004
J.-F. ARRIGHI: "The Medicago truncatula Lysine Motif-Receptor-Like Kinase Gene Family Includes NFP and New Nodule-Expressed Genes", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 142, no. 1, 1 September 2006 (2006-09-01), pages 265 - 279, XP055049474, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/pp.106.084657 *
KAKU ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 103, 2006, pages 11086 - 91
KAY ET AL., SCIENCE, vol. 236, 1987, pages 4805
KHAN ET AL., J PLANT PHYSIOL, vol. 165, 2008, pages 1342 - 1351
KIDAJ ET AL., MICROBIOL RES, vol. 167, 2012, pages 144 - 50
LIMPENS ET AL., SCIENCE, vol. 302, 2003, pages 630 - 3
LOHMANN ET AL., MOL PLANT MICROBE INTERACT, vol. 23, 2010, pages 510 - 21
MADSEN ET AL., NATURE, vol. 425, 2003, pages 637 - 40
MADSEN ET AL., THE PLANT JOURNAL, vol. 65, 2011, pages 404 - 17
MAEKAWA ET AL., MOL PLANT MICROBE INTERACT., vol. 21, 2008, pages 375 - 82
MAILLET ET AL., NATURE, vol. 469, 2011, pages 58 - 63
MAJ ET AL., J CHEM ECOL, vol. 35, 2009, pages 479 - 87
MARION ET AL., THE PLANT JOURNAL, vol. 56, 2008, pages 169 - 179
MCELROY ET AL., MOL. GEN. GENET., vol. 231, 1991, pages 150 - 160
MIYA ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 104, 2007, pages 19613 - 18
MIYA ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 104, pages 19613 - 19618
NORRIS ET AL., PLANT MOL. BIOL., vol. 21, 1993, pages 895 - 906
OLAH ET AL., PLANT J, vol. 44, 2005, pages 195 - 207
OP DEN CAMP ET AL., SCIENCE, vol. 331, 2011, pages 909 - 12
PETUTSCHNIG ET AL., J BIOL CHEM, vol. 285, no. 37, pages 28902 - 28911
PRITHIVIRAJ ET AL., PLANTA, vol. 216, 2003, pages 437 - 45
RADUTOIU ET AL., NATURE, vol. 425, 2003, pages 585 - 92
SAMAC ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 93, 1990, pages 907 - 914
SHIMIZU ET AL., THE PLANT JOURNAL, vol. 64, 2010, pages 204 - 14
SMIT ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 145, 2007, pages 183 - 91
SOULEIMANOV ET AL., J EXP BOT, vol. 53, 2002, pages 1929 - 34
THE PLANT JOURNAL, vol. 16, 1998, pages 735 - 743
VAN DER FITS ET AL., PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 43, 2000, pages 495 - 502
WAN ET AL., PLANT CELL, vol. 20, 2008, pages 471 - 81
WAN ET AL., PLANT CELL, vol. 20, pages 471 - 481
WAN ET AL., PLANT PHYSIOL., PRÉPUBLICATION EN LIGNE, 28 June 2012 (2012-06-28)
WAN ET AL., PLANT PHYSIOLOGY, vol. 160, 2012, pages 396 - 406
WILLMANN ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 108, pages 19824 - 9
ZHANG ET AL., PLANT PHYSIOLOGY, vol. 144, 2007, pages 623 - 36
ZIPFEL ET AL., CELL, vol. 125, 2006, pages 749 - 760

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020035486A1 (fr) * 2018-08-13 2020-02-20 Aarhus Universitet Plantes génétiquement modifiées exprimant des récepteurs hétérologues qui reconnaissent les lipo-chitooligosaccharides
WO2020035488A1 (fr) * 2018-08-13 2020-02-20 Aarhus Universitet Récepteurs lysm génétiquement modifiés ayant une spécificité et une affinité d'agoniste modifiées
CN112739820A (zh) * 2018-08-13 2021-04-30 奥尔胡斯大学 表达识别脂壳寡糖的异源受体的基因改变的植物
CN113166736A (zh) * 2018-08-13 2021-07-23 奥尔胡斯大学 具有改变的激动剂特异性和亲和性的基因改变的LysM受体
US12190997B2 (en) 2018-08-13 2025-01-07 Aarhus Universitet Genetically altered LysM receptors with altered agonist specificity and affinity
AU2019321983B2 (en) * 2018-08-13 2025-11-20 Aarhus Universitet Genetically altered LysM receptors with altered agonist specificity and affinity
CN109734785A (zh) * 2019-03-13 2019-05-10 深圳市伊山万瑞科技有限公司 一种来源于苦参的蛋白质及其编码基因与应用
WO2021233904A1 (fr) * 2020-05-19 2021-11-25 Aarhus Universitet Motifs de récepteur lysm

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