WO2014092528A1 - Adyuvante de vacunación, preparación y vacunas que lo contienen - Google Patents

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    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS

Definitions

  • adjuvants capable of enhancing the immune response against the antigen or antigens.
  • the adjuvants are a set of highly heterogeneous additives, which can modulate and enhance the immune response against an antigen, allowing the generation of a protective response generally using smaller doses of antigen.
  • the use of adjuvants has allowed the development of vaccine formulations of selective antigenic stimulation, which allow modulating the immune response towards the production of antibodies (humoral response) and / or cell-mediated (cellular response).
  • the type of immune response induced by an adjuvant is usually a combination of both types of response, sometimes presenting the prevalence of one response over another. For this reason, when designing vaccines it is important to properly select the adjuvant to be used in the formulation, in order to achieve an enhancement of the type of immune response required, towards one of the specific types of humoral or cellular response, or towards a combination of both.
  • adjuvants are products that have the ability to directly stimulate the response of immune system cells to an antigen, or that can act as vehicles, allowing a more efficient presentation of antigens to immune system cells, which a in turn it provokes a better response.
  • adjuvants that are capable of acting as immunostimulants and as antigen vehicles simultaneously have been described.
  • aluminum hydroxide or alumina is one of the few adjuvants approved by the FDA to be used in the formulation of vaccines for human use. It has physical properties that favor antigen binding by stable electrostatic attractions, as well as suspensions that favor phagocytosis by antigen presenting cells. Its mechanism of action has been recently described and is characterized by polarizing the response to a Th2 type profile with the secretion of the IL-4 and IL-5 cytokines, the production of immunoglobulins of the IgG1 isotype, as well as IgE, and secretory IgA and the activation of those lymph nodes and mast cells.
  • Vaccines formulated with alumina also have some practical disadvantages since their preparations are heterogeneous, produce granuloma at the injection site and can become ineffective when frozen, which constitutes a serious problem for its conservation mainly in third world countries (Lindblad, 2004).
  • Saponins are triterpenic or steroidal glycosides widely distributed in the plant kingdom. Due to their structural characteristics they are amphiphilic surfactants, which explains their surfactant properties, their ability to form colloidal solutions, their hemolytic activity and their ability to form mixed micelles with lipids and sterols.
  • the saponins most studied and used as adjuvants are those of the Chilean tree Quillaja saponaria, which have humoral and cellular adjuvant activity, and that have been traditionally used in veterinary medicine (eg formulation of FMD vaccines), as well as saponins of others vegetable species.
  • Quillaja saponaria saponin extracts with adjuvant activity are known and used in the formulation of commercial or experimental vaccines, in particular the saponin preparation called Quil A (Darslgaard, 1974).
  • Quil A polarizes the response to a Th l profile associated with the production of the INF- ⁇ and IL-2 cytokines, stimulates the production of high levels of total IgG antibodies and IgG 1, IgG2a, IgG2b, IgG3, robust DTH responses and cellular activation of CD8 + lymphocytes.
  • Quil A is used in veterinary vaccines, its use in vaccines for human use has been restricted by its intense hemolytic activity and the production of unwanted local reactions (fever, induration, sensitivity, pain) at the injection site (Sun et al., 2009; Kensil et al., 1991).
  • Iiposomes allow the encapsulation of antigenic proteins and peptides in a particulate multimeric form.
  • these formulations due to lack of sufficient immunogenicity, these formulations generally require the use of additional adjuvants to make them effective in stimulating an adequate immune response.
  • ISCOMs Immunostimulatory complexes called ISCOMs are particulate delivery systems of antigens composed of antigen, cholesterol, phospholipid and saponin (Quil A, or other saponin) with potent immunostimulatory activity.
  • ISCOMATRIX® is the particulate adjuvant composed of cholesterol, phospholipids and saponins (Quil A), but does not contain antigen. This adjuvant has essentially the same structure as ISCOMs, consisting of perforated box-like particles, approximately 40 nm in diameter.
  • the antigens can be formulated with the ISCOMATRIX® to produce vaccines with antigen presentation capacity and immunostimulants similar to ISCOMs type formulations, but with a wider range of applicability, since their use is not limited to hydrophobic membrane proteins. Modifications to the formulations of ISCOMs and ISCOMATRIX® have also been developed to achieve a better association of some antigens, as for example described in WO 98/36772.
  • ISCOMs and ISCOMATRIX® combine the advantages of a particulate antigen delivery system with the presence of an adjuvant in situ (Quil A) and therefore have been found to be more immunogenic than other colloidal systems such as liposomes and protein micelles.
  • the ISCOMs and ISCOMATRIX® formulations retain the adjuvant activity of saponins, while increasing their stability, reducing their hemolytic activity and producing less toxicity. These also generate an immune response similar to that obtained by immunizing with simple mixtures of antigen and saponin, but allow substantially smaller amounts of antigen to be used.
  • micellar systems composed mainly of saponins of Q. saponaria and sterols (mainly cholesterol), such as in WO 96/33739, and may also be formulated as emulsions, as described in US 2005/0220814 Al.
  • micellar formulations includes preparation stages due to the poor solubility of some of its ingredients in aqueous solutions, and some of them also involve removal stages of some components as occurs when detergents, or organic solvents are used, depending on the specific formulation procedure. Some preparations also require purification steps of the colloidal solutions prior to their use and formulation of vaccines.
  • Figure 1 Image of transmission electron microscopy (MET) by negative staining of micelles present in a sample of the colloidal solution comprising saponin and colic acid prepared by mixing aqueous solutions of its components.
  • Figure 2 Image of transmission electron microscopy (MET) by negative staining of micelles present in a sample of the colloidal solution comprising saponin and colic acid prepared by the ethanol injection method.
  • Figure 3 Image of transmission electron microscopy (MET) by negative staining with uranyl acetate of micelles present in a sample of the colloidal solution comprising Quillaja brasiliensis saponin and colic acid prepared by the ethanol injection method.
  • Figure 4 Transmission electron microscopy (MET) images by negative staining with micelle uranyl acetate present in: A) sample of colloidal solution comprising saponins from Quillaja saponaria and sodium taurocholate prepared by mixing aqueous solutions of its components and B) colloidal solution sample comprising Quillaja saponaria saponins and sodium taurocholate prepared by the ethanol injection method.
  • Figure 5 Hemolytic activity of different colloidal formulations comprising colic acid and saponin.
  • Figure 6 Titles of total IgG against tetanus toxoid in groups of mice immunized with tetanus toxoid only in saline solution (TT), or with the following adjuvants: saponin (SQS), oily adjuvant (ADYUVAC50), adjuvant colloidal solution comprising acid colic and saponin (CSS25, 25 mg of saponin per dose), or adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin at a higher concentration (CSS50, 50 mg of saponin per dose).
  • SQS saponin
  • ADYUVAC50 oily adjuvant
  • SCS25 oily adjuvant colloidal solution comprising acid colic and saponin
  • S50 adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin at a higher concentration
  • the asterisk (*) indicates significant differences with group TT (P ⁇ 0.05).
  • Figure 7 Evolution of total IgG titers against tetanus toxoid in groups of mice immunized with tetanus toxoid only in saline solution (TT), or with the following adjuvants: saponin (SQS), oily adjuvant (ADYUVAC50), colloidal solution adjuvant comprising colic acid and saponin (CSS25, 25 Dg of saponin per dose), or adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin at a higher concentration (CSS50, 50 ig of saponin per dose).
  • SQS saponin
  • ADYUVAC50 oily adjuvant
  • CSS25 colloidal solution adjuvant comprising colic acid and saponin
  • SPS50 colloidal solution adjuvant comprising colic acid and saponin at a higher concentration
  • Figure 8 Titles of IgG isotypes against tetanus toxoid at day 107 of the experiment in groups of mice immunized with tetanus toxoid only in saline (TT), or with the following adjuvants: saponin (SQS), oily adjuvant (ADYUVAC50), adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin (CSS25, 25 Ll g of saponin per dose), or adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin at a higher concentration (CSS50, 50 ug of saponin per dose).
  • SQS saponin
  • ADYUVAC50 oily adjuvant
  • SCS25 adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin
  • S50 adjuvant colloidal solution comprising colic acid and saponin at a higher concentration
  • the asterisk (*) indicates that the titles of isotypes of IgG 1, IgG2a and IgG2b in the CSS25 and CSS50 groups showed significant differences (P> 0.05) with respect to the values found in all other groups of animals included in the trial.
  • Figure 9 Evolution of the titles of total IgG against TT in sheep.
  • the sheep were immunized on days 0 (prime immunization) and 28 (booster) with TT alone or adjuvant with ADYUVAC50, CSS600 or CSS1200. Data are presented as the mean ⁇ SE.
  • the asterisk (*) indicates significant differences with respect to the control group (TT only); and the symbol (#) indicates significant differences between the ADYUVAC50 and CSS1200 groups.
  • Figure 10 Titles of IgG1 and IgG2 subclasses against TT in sheep at day 76.
  • TT group immunized with tetanus toxoid in saline solution
  • CSS600 group immunized with tetanus toxoid co-administered with adjuvant colloidal solution CSS600
  • CSS1200 group immunized with toxoid tetanus co-administered with the adjuvant colloidal solution CSS 1200.
  • Titles are expressed in Arbitrary Units per mL (UA / mL).
  • Figure 1 1 Specific IgM titers against serum CPS14 of mice immunized on days 1 and 14 with CSP14 with one of the following vaccine preparations: CPS14 in saline solution (2.5 Dg / dose, CPS group 14), CPS 14 together with the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid (2.5 Ig / dose, group CPS14 / CSS25), or with the polysaccharide-protein CPS 14-BSA conjugate together with the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid (1.8 Gg / carbohydrate dose, group CPS14-BSA / CSS25) .
  • Figure 12 Specific IgG titers against serum CPS 14 of mice immunized on days 1 and 14 with CSP14 with one of the following vaccine preparations: CPS 14 in saline solution (2.5 Dg / dose, CPS group 14), CPS 14 together with the colloidal adjuvant solution comprising saponin and colic acid (2.5 I g / dose, CPS group 14 / CSS25), or with the polysaccharide-protein conjugate CPS 14-BSA together with the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid (1.8 Gg / dose of carbohydrate, group CPS14-BSA / CSS25).
  • the present invention provides an adjuvant formulation comprising a saponin or mixtures of saponins and one or more bile acids, such as colic acid or taurocolic acid, in defined proportions, which give rise to the formation of mixed micelles of both types of components, typically filamentous, and that do not necessarily require subsequent stages of purification.
  • bile acids such as colic acid or taurocolic acid
  • a method for the preparation of the formulation is also provided, which does not require the use of additional components, since its preparation is possible by simple mixing of the components dissolved in water or in buffer solutions, which do not require their prior elimination. its use or for vaccine preparation.
  • the formulation has as an advantage that both the final product, as well as the solutions from which it is prepared, are aqueous solutions that can be sterilized by filtration, being possible, for example, the preparation of the final product under aseptic conditions from component solutions previously sterilized by filtration.
  • the final product can also be sterilized by filtration as long as the antigen preparation is also sterilizable by filtration.
  • the preparation process of the present invention essentially comprises the following steps: 1) preparation of the aqueous saponin solution that will be used in the formulation in the presence or absence of a buffer or salts, 2) preparation of a solution of adequate concentration of the solution of the bile acid or its salts to be used, preferably colic acid, in a buffer solution of pH between 7.0 and 9.0, preferably between 7.5 and 8.5, preferably 8.0, 3) the mixture of both solutions so as to obtain relative proportions of bile acid to saponin in ratios preferably between 0.5: 1 and 15: 1 in mass, preferably between 2: 1 and 5: 1, preferably between 2.5: 1 and 4: 1 and more preferably 3: 1, 4) aggregate of the antigen solution, 5) if necessary, the pH is corrected to a range between 5.0 and 7.6, preferably between 6.5 and 7.5 , and a volume correction is made to lead to the final concentrations of adminis traction, and 6) maturation of the mixture at temperatures preferably between 2 ° C and 8 ° C
  • the adjuvant solutions thus obtained consist essentially of a solution comprising saponin and bile acid, which may or may not be associated with the antigen.
  • the antigen can be added after the formulation of the adjuvant solution comprising saponin and bile acid.
  • the adjuvant solution described in the present invention can be used as an adjuvant for different types of antigens, including, but not limited to, viral antigens, proteins, carbohydrates and glycoconjugates, which may or may not be defined, or be complex or antigenic preparations. antigen mixtures.
  • antigens including, but not limited to, viral antigens, proteins, carbohydrates and glycoconjugates, which may or may not be defined, or be complex or antigenic preparations. antigen mixtures.
  • Both the saponins, in particular the saponins of Quillaja saponaria, Quil A and pure saponins isolated from Quil A, as well as the bile acids used in the preparation of the adjuvant formulation are surfactants, and therefore, above certain concentrations may present lithic activity on cells, including red blood cells (hemolytic activity).
  • the formulation object of the present invention by combining the two components of the formulation in suitable proportions, can allow a very significant reduction in the hemolytic activity of the adjuvant formulation.
  • the hemolytic activity of the adjuvant colloidal formulation can be regulated by varying the mass proportion of saponin and bile acid (in particular colic acid or its salts), as well as the total concentration of saponin in the formulation. In this way it is possible to prepare adjuvant formulations containing total concentrations of saponins that alone are capable of producing 100% hemolysis under test conditions, but that properly formulated can present reductions in said activity of between 50% and up to almost 100%, that is, not presenting hemolytic activity under the test conditions.
  • adjuvant formulations retain some lithic capacity, for example when formulations that improve or allow penetration of antigens through mucous membranes are sought, and in the present invention this is possible by regulating the relative proportions between saponin and bile acid.
  • the present invention employs compounds that have on their own surface-active activity for the preparation of the adjuvant formulation, both are part of the formulation, so the addition and subsequent removal of detergents is not required, as is the case in other adjuvant preparations in which its use is necessary to solubilize the less water soluble components.
  • additional solvent removal stages are not required, for example by means of dialysis, the manufacturing process of the product is easier to scale at an industrial level, as it is also simpler to produce it according to good practices of manufacturing (GMP).
  • the present invention also does not require the use of centrifugation steps in its preparation, as may occur in the case of formulations based on liposomes or ISCOMS, which in those cases can hinder production escalation.
  • the adjuvant object of the present invention can be manufactured directly from aqueous solutions of its components, so unlike other adjuvants such as that described in US Patent 6,506,386 B l, it does not require for its production of the previous preparation of liposomes containing cholesterol.
  • the colloidal adjuvant formed by saponins and bile acids object of the present invention is an aqueous colloidal solution, which can be prepared by aseptic mixing of the sterile solutions of its components, which can be sterilized by filtration.
  • Vaccines that include aluminum salts as adjuvants also require the maintenance of a rigorous cold chain, and vaccines can lose activity if they are subjected to temperatures too low that can cause freezing.
  • the adjuvant formulations of the present invention are homogeneous aqueous colloidal solutions comprising saponins and bile acids and of low viscosity that can be sterilely prepared by filtration. This represents an advantage over other adjuvant preparations consisting of oil-in-water or water-in-oil emulsions, some of which cannot be filtered for sterilization, and which can be difficult to administer parenterally due to their high viscosity, which can lead to an incorrect dosage requiring the use of specialized personnel.
  • the present invention because it is homogeneous aqueous colloidal solutions of low viscosity, has advantages for human use compared to formulations containing aluminum salts as adjuvants, since the latter being suspensions can frequently cause granulomas and pain. at the injection site. Due to the same reasons, the present invention has advantages over adjuvant formulations that require the use of emulsions, some of which are of high viscosity and because of the local inflammation and pain reactions they produce cannot be used in vaccines for human use. .
  • the adjuvant formulation object of the present invention using higher concentrations of saponins and bile acids, and use it directly in veterinary vaccines without causing appreciable local effects, for example using formulations containing up to 3.0 mg of saponins per mL or more, preferably between 0. 120 mg / mL and 2.40 mg / mL of saponins, without causing appreciable local effects when administered to animals, sheep for example, parenterally.
  • the adjuvant object of the present invention can also be prepared at a concentration greater than that which will be used in the vaccine formulation, for example 10 times more concentrated, and then be diluted to the concentration of the final formulation using a suitable vehicle, such as for example PBS or isotonic saline.
  • a suitable vehicle such as for example PBS or isotonic saline.
  • the adjuvant object of the present invention can also be prepared by other methods, for example by ethanol injection method.
  • bile acid for example colic acid dissolved in ethanol
  • saponin for example 0.240 mg / mL
  • the alcohol of the formulation can be removed, for example, by diafiltration if the formulation requires it, or in the case of some veterinary vaccines or for human use, not removed from the formulation if its presence does not cause undesirable side effects and does not affect the activity of the vaccine.
  • the saponins used in the present invention are preferably saponins of the Quillaja saponaria, Quillaja brasiliensis, or Gypsophila tree, although saponins of other origins can be used.
  • the present invention particularly includes adjuvant formulations comprising Quillaja brasiliensis saponins and at least one bile acid, in which filamentous micelles are present, including their form of preparation.
  • saponins are used in concentrations between 60 Dg / mL and 3000 C g / mL, preferably in concentrations between 120 Lig / mL and 2400 ij g / mL, more preferably between 240 Dg / mL and 1200 ug / mL, depending on the animal species, the type and amount of antigen included in the vaccine, and the volume administered per dose.
  • the formulation may typically contain an amount of saponin in the range of 1 Dg to 100 Cig per dose, preferably in the range of 10 Dg to 50 Dg per dose.
  • the adjuvant formulations included in the present invention contain a bile acid, typically colic acid or other bile acid such as taurocolic acid among others, and a saponin in a mass ratio in a range of 0.5 to 15, preferably in a range of 1 to 8, preferably in a range of 2 to 5, preferably in a range of 2.5 to 4, more preferably in a ratio of 3.
  • the adjuvant formulations included in the present invention may be prepared by mixing solutions in water or in buffer of the components, as well as by the solvent injection method, in which the bile acid in an ethanol solution is quickly added to a solution in water or saponin buffer.
  • the present invention includes vaccines or immunostimulatory preparations that include the adjuvant described in the present invention together with an antigen, mixture of antigens or antigen preparations, including preventive or therapeutic vaccines for animal or human use.
  • the antigens that can be formulated together with the adjuvant described in the present invention can be well defined or not antigens, mixtures of antigens, including toxoids and bacterins, as well as antigen preparations containing viral or parasitic antigens.
  • the vaccines described in the present invention consist of adjuvant comprising saponin and one or more bile acids, preferably colic acid, together with viral, bacterial or parasitic antigens, as well as tumor antigens and chemically modified antigens, including, but not excluding other types , protein antigens, polysaccharide antigens, carbohydrate antigens, glycoproteins and protein-carbohydrate conjugates, mucopolysaccharides, glycolipids and other glycococonjugates and nucleic acids, both natural or modified, as synthetic or recombinant, or mixtures of antigens, such as in multivalent vaccines.
  • adjuvant comprising saponin and one or more bile acids, preferably colic acid, together with viral, bacterial or parasitic antigens, as well as tumor antigens and chemically modified antigens, including, but not excluding other types , protein antigens, polysaccharide antigens, carbohydrate antigens, glycoproteins and protein-carbo
  • the antigens to be used in the vaccines included in the present invention may preferably be in aqueous solution or in aqueous salt solutions, or they may also be suspensions or emulsions of antigenic preparations that may include preservatives, detergents, salts and other additives necessary for the antigen preparation, together with the adjuvant composed of one or more bile acids and saponins.
  • the colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention has as advantages over the use of the same saponin and at the same concentration, as well as with oily adjuvants, generating a more intense immune response than the previous ones, as well as the fact that the antibody titres generated against the co-administered antigenic preparation remain at higher values for a longer time, indicating that co-administration with an antigenic preparation is capable of inducing a more effective and lasting immune response than the antigen alone or co-administered solely with saponin or with an oily adjuvant.
  • colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention can also be formulated so that the concentration of saponin in the final formulation is sufficient to adjuvant different antigen preparations, allowing its adjustment to the doses of antigen that are necessary to generate an effective immune response according to the type of antigen, as well as the proportion of its components can be regulated within certain ranges in order to decrease the hemolytic activity of the preparation and / or improve its adjuvant activity.
  • colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention does not necessarily require the removal of the possible excess of any of its components that may be in a relative excess, or not forming part of micelles, and can be used directly for the preparation of vaccine formulations, which represents an advantage due to its greater simplicity in the production and scaling process.
  • the colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention has a very good ability to induce more intense immune responses against antigens co-administered therewith.
  • This adjuvant containing saponin and bile acids is capable of inducing a more intense immune response against co-administered antigens of different nature, including, but not excluding other types of antigens, antigens of a protein nature, polysaccharides, protein-polysaccharide conjugates and other types of glycocomposites.
  • the colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention When co-administered with an antigen, the colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention generates a more intense immune response against this antigen, and which lasts longer after immunization, which represents an advantage to the effects. of generating a more lasting immune response, which may eventually allow the use of immunization schedules with periodic immunizations more spaced in time than in the case that is immunized with an antigen or together with other adjuvants such as saponin.
  • the colloidal adjuvant comprising bile acids and saponin described in the present invention and in this aspect is capable of inducing a more intense immune response for a given dose of antigen, which may eventually reduce the doses of antigens required to generate protective immune responses.
  • the colloidal adjuvant formed by bile acids and saponin described in the present invention stimulates a more intense immune response than the administration of the antigen alone, and generates a balanced immune response since it induces both a Thl and Th2 type response, which constitutes an advantage in cases where it is necessary to induce a humoral and / or cellular response to generate protection against some pathogens, such as viruses, intracellular pathogens and against tumor antigens in the case of preventive or therapeutic vaccines against tumor diseases.
  • EXAMPLE 1 Preparation of adjuvant solutions (supramolecular complexes, CSS) comprising saponin and colic acid or their salts by mixing their aqueous solutions.
  • the saponins used can be of different origins, including those of Quillaja saponaria, Quillaja brasiliensis, Gypsophila sp., And other plant species, as well as preparations of saponins such as Quil A, or isolated saponins such as the so-called QS-21.
  • Colic acid and its salts are well known natural compounds, and for the preparation of the adjuvant formulation, colic acid or its salts of varying degrees of purity can be used, preferably with a purity greater than 90%, preferably greater than 98%.
  • the present example describes the preparation of the colloidal adjuvant solution composed of colic acid or its salts and the commercial saponin QP 1000 (Natural Response, Chile), or Quil A (Aquila Biopharmaceuticals, USA).
  • a solution of 10 mg / mL concentration of colic acid is prepared in a phosphate buffer of pH 8.0 (solution A) and an aqueous solution of Quillaja saponaria saponins of 10 mg / mL (solution B).
  • solution A phosphate buffer of pH 8.0
  • solution B aqueous solution of Quillaja saponaria saponins of 10 mg / mL
  • solution B aqueous solution of Quillaja saponaria saponins of 10 mg / mL
  • 40 mL of the formulation 4.8 mL of solution A and 1.60 mL of solution B are mixed, and 33.60 mL of isotonic saline solution is added, giving a final pH of the mixture of approximately 7.5.
  • the mixture is allowed to ripen at approximately 4 ° C between 24 and 72 hours before use.
  • Figure 1 shows one of the transmission electron microscopy (ET) images obtained for said formulation, mainly showing the formation of filiform mixed micelles of different length but with a relatively uniform diameter. These mixed micelles are formed at a concentration of saponins below the critical micellar concentration of saponin, although higher concentrations of saponin may also be employed.
  • EXAMPLE 2 Preparation of adjuvant solutions (supramolecular complexes, CSS) comprising Quillaja saponaria saponins and colic acid or their salts by the ethanol injection method.
  • This example shows an alternative method for the preparation of colloidal adjuvant solutions containing saponin and colic acid, using the ethanol injection method.
  • the solution is incubated at 4 ° C with stirring for 48 h before performing the transmission electron microscopy analysis. Samples were prepared for observation by negative staining using a 2% phosphotungstic acid solution.
  • Figure 2 shows an electron microscopy image showing the presence of filiform micelles of variable length and relatively uniform width.
  • the zeta potential values determined by PCS Photo Correlation Spectroscopy for the formulations described in example 1 and in example 2 are within the range of -14.0 mV to -20.9 mV, demonstrating that said formulations comprise micelles negatively charged.
  • EXAMPLE 3 Preparation of adjuvant colloidal solutions containing colic acid and Quillaja brasiliensis saponins.
  • This example shows a method for the preparation of colloidal solutions of Quillaja brasiliensis and colic acid saponins using the ethanol injection method, showing that it is possible to formulate mixed micelles of the filiform type using saponins derived from another plant species.
  • this colloidal solution the same experimental conditions detailed in Example 2 were used, with the only difference that a solution of Quillaja brasiliensis saponins of 240 ⁇ Jg / mL was used.
  • Quillaja brasiliensis saponins were obtained from an aqueous solution of leaves by solid phase extraction in reverse phase and eluting with a gradient of methanol in water.
  • FIG. 3 shows a transmission electron microscopy image with negative staining using uranyl acetate, where the presence of filiform micelles of variable length is observed and of relatively uniform width.
  • EXAMPLE 4 Preparation of adjuvant colloidal solutions (supramolecular complexes, CSS) comprising saponins of Quillaja saponaria and taurocolic acid or their salts by the above methods.
  • This example describes the preparation of colloidal solutions of saponins from Quillaja saponaria and sodium taurocholate, demonstrating that it is possible to formulate mixed micelles of the filiform type using another bile acid or its salts.
  • saponins in particular those of Quillaja saponaria, have a strong adjuvant activity, but have the disadvantage of their ability to produce cell lysis, in particular red blood cell hemolysis, which may lead to undesirable side effects when administered in parenteral form
  • the hemolytic activity of saponins can be used as an estimate of their potential to produce undesirable local effects, so that the development of formulations containing saponins while presenting less hemolytic activity has advantages for use as adjuvants in immunogenic formulations and vaccines in particular.
  • micellar formulations of Quillaja saponaria and colic acid saponins can be achieved, with reduced hemolytic activity, as well as the variation of said hemolytic activity by modifying the mass ratio between colic acid (or its salts) and saponin
  • the hemolytic activity test of the different formulations was performed as described in Silveira et al., Vaccine 29 (201 1) 9177-9182.
  • the hemolytic activity of formulations A to H. is shown in Figure 5.
  • AD formulations contain a final saponin concentration of 0.208 mg / mL
  • EF formulations contain a final saponin concentration of 0.240 mg / mL.
  • Formulation A corresponds to a solution of saponins alone, with a concentration of 120 mg / mL
  • formulation E corresponds to a solution of saponins alone, with a concentration of 0.240 mg / mL. Both formulation A and E produce 100% hemolysis according to the method used for its determination.
  • the hemolytic activity of adjuvant colloidal formulations comprising colic acid and saponin varies with the mass ratio of colic acid to saponin.
  • the series of formulations with a final concentration of saponins of 0, 120 mg / mL it was found that hemolysis was 46%, 3% and 0% for formulations B, C and D containing a ratio of colic acid to saponin of 1, 3 and 4 (m / m), respectively.
  • the hemolysis percentage was 97%, 28% and 60% for formulations F, G and H containing a ratio of colic acid to saponin of 1, 3 and 4, respectively.
  • EXAMPLE 6 Formulation of vaccines for immunization of animals containing as tetanus toxoid antigen and as an adjuvant the colloidal solution of colic acid and saponin.
  • the tetanus toxoid used is in solution containing 3 mg / mL of protein, equivalent to 450 Lf / mL (flocculant units of toxoid).
  • a solution of 10 mg / mL concentration of colic acid is prepared in a phosphate buffer of pH 8.0 (solution A) and an aqueous solution of QP UF 1000 saponins (Natural Response, Chile) with a concentration of 10 mg / mL (solution B).
  • solution A phosphate buffer of pH 8.0
  • solution B aqueous solution of QP UF 1000 saponins (Natural Response, Chile) with a concentration of 10 mg / mL
  • solution B For the preparation of 40 mL of the immunization formulation, typically 2.90 mL of solution A, 0.96 mL of solution B and 35.94 mL of isotonic saline. 0.2 mL of the tetanus toxoid solution is added to that mixture, and the formulation is allowed to mature at 4 ° C between 12 and 96 hours before use. All solutions used in this example are sterilized using 0.22 filters Jm, and the formulation is prepared by mixing under aseptic conditions
  • EXAMPLE 7 Adjuvant effect of the colloidal solution comprising colic acid and saponin in a murine model using tetanus toxoid (TT) as an antigen, and comparison of the adjuvant activity of said formulation with saponin and with an oily adjuvant.
  • TT tetanus toxoid
  • mice tested received tetanus toxoid (TT) either alone, or adjuvant with saponin (QP UF 1000, Natural Response, Chile), or with the oily adjuvant ADYUVAC50 (Santa Maria Laboratory, convinced), or with the adjuvant colloidal solution composed of saponin and colic acid, prepared as indicated in EXAMPLE 6, but in such a way that the final concentration of saponin is 500 Lig / mL and with a mass ratio of colic acid to saponin equal to 3.
  • Mice groups of 5 animals received two immunizations of TT by s / c route: the first, on day 1 and the second on day 45.
  • the co-immunization was performed with 1.6 ⁇ g (100 ⁇ ) of TT except in the case of the animals of the CSS50 group that were immunized with 3.2 ⁇ g.
  • the different groups received as adjuvant: saponin (QP UF 1000, Natural Response, Chile) (25 ⁇ g) or ADYUVAC50 (Santa Maria Laboratories, prepared according to manufacturer's instructions) or colloidal solutions of saponin and colic acid prepared according to EXAMPLE 6 (called CSS25 and containing 25 ⁇ g of saponin per dose) or colloidal adjuvant solution of saponin and colic acid prepared as indicated above with a final concentration of saponin of 500 Dg / mL (called CSS50 and containing 50 ⁇ g of saponin per dose) in a final volume of 100 ⁇ L.
  • the control group received only TT (1.6 IZ g in saline, 100 QL).
  • the second dose (day 45) was formulated with half of antigen (0.8 ⁇ g) and adjuvant, with the exception of the ADYUVAC50 group in which the antigen was reduced by half (0.8 ⁇ g), but the amount of adjuvant per dose was maintained.
  • the animals were bled on days 1, 45, 66, 107, 147 and 167 after the first immunization and the sera frozen at -20 ° C until processing. Total IgG titers and IgG isotypes against TT in the sera of mice were evaluated by ELISA.
  • Figure 6 shows the total IgG antibody titers against tetanus toxoid (TT) in this test on days 0, 45 and 66 in the murine model when immunized with antigen alone, or with the antigen together with the different adjuvants, and includes the anti-TT IgG titers corresponding to the primary response and the response after a second administration of the immunizing formulation.
  • TT tetanus toxoid
  • This adjuvant colloidal solution that includes Colic acid and saponin is also more effective in stimulating a humoral immune response than saponin alone, as well as the commercial oily adjuvant ADYUVAC50, since it induces the secretion of significantly higher titers against the antigen with which it is co-administered.
  • Figure 7 shows the evolution of total IgG titers against tetanus toxoid in the different groups of mice immunized with the different vaccine formulations described in this EXAMPLE.
  • colloidal adjuvant formulations containing colic acid and saponin induce the production of significantly higher IgG titers against the co-administered antigen and that they remain at higher levels for longer than when the antigen is administered. alone or together with saponin or with the oily adjuvant ADYUVAC50.
  • This result demonstrates that the colloidal adjuvant containing colic acid and saponin is effective in generating a more intense and lasting humoral response than that generated by the administration of antigen alone or together with saponin or formulated together with an oily adjuvant in the form of an emulsion. .
  • the titers of the IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulin subclasses in serum of the different groups of experimental animals immunized against TT are shown in Figure 8.
  • the total IgG titers in the CSS25 group were even higher than those presented by the CSS50 group although they showed no statistically significant differences from each other (P> 0.05).
  • the CSS adjuvant stimulated the production of higher titers of the IgG l, IgG2a and IgG2b subclasses.
  • this EXAMPLE demonstrates that the colloidal adjuvant formulation comprising colic acid and saponin stimulates a more intense and lasting immune response when co-administered with tetanus toxoid than that induced by the antigen alone (tetanus toxoid), or when administered together with saponin as an adjuvant or formulated together with the oil adjuvant ADYUVAC50, in which case the vaccine formulation is forming an emulsion.
  • the generation of a balanced immune response is also demonstrated because by using as an adjuvant the solution comprising colic acid and saponin, a balanced increase in the secretion of the IgG 1, IgG2a and IgG2b isotypes against the co-administered antigen is achieved. , suggesting the stimulation of an immune response of both humoral and cellular type, which is important to generate protective immune responses in particular for intracellular pathogens, viruses and against tumor antigens for cancer therapy.
  • EXAMPLE 8 Adjuvant effect of colloidal solution of colic acid and saponin in sheep using tetanus toxoid (TT) as an antigen, and comparison of the adjuvant activity of said formulation with an oily adjuvant.
  • sheep were immunized with vaccine formulations containing the colloidal adjuvant comprising colic acid and saponin and tetanus toxoid called CSS600 and CSS 1200, prepared as described in EXAMPLE 6. Such preparations contain a mass ratio of colic acid. to saponin equal to 3, and 5 Lf of tetanus toxoid per mL.
  • the sheep used were kept in natural field conditions during the experiment and had not received prior immunization against tetanus toxoid.
  • the sheep were divided into 5 groups of 10 animals each, and received two immunizations by s / c route, in on days 1 and 28 of the experiment. Animals belonging to the different groups received 1 mL of different vaccine preparations, all containing the same amount of antigen equivalent to 5 Lf of tetanus toxoid per mL of vaccine.
  • the vaccine formulations used were: tetanus toxoid in saline solution (group TT), tetanus toxoid formulated with the oily adjuvant ADYUVAC50 (Santa Maria Laboratory, Republic) used to prepare the formulation according to the manufacturer's instructions (group ADYUVAC50), tetanus toxoid formulated with colloidal adjuvant containing colic acid and saponin prepared as indicated in EXAMPLE 6 called CSS600 (CSS600 group) and tetanus toxoid formulated with colloidal adjuvant containing colic acid and saponin prepared as indicated in EXAMPLE 6 called CSS1200 ( CSS1200 group).
  • the animals were bled on days 1, 28, 76 and 195 after the first immunization and the sera were stored at -20 ° C until processing.
  • Total IgG titers and IgG isotypes against TT in sheep sera were evaluated by ELISA. To do this, plates (Greiner Bio-One) were sensitized with a solution of TT (100 ⁇ g / mL) in PBS (100 L / well) overnight at 4 ° C.
  • Figure 9 shows the total anti-TT IgG titers in sheep belonging to the different test groups.
  • Figure 9 also shows that the use of colloidal adjuvant formulations containing colic acid and saponin, called CSS600 and CSS1200 also generate high antibody titers against the co-administered antigen even 194 days after the first immunization, with titers of higher antibodies in a statistically significant way with respect to the immunized group without using adjuvant (TT group).
  • This experiment demonstrates that colloidal adjuvant formulations containing colic acid and saponin are as efficient as the oily adjuvant, in the immunization scheme used, to generate high antibody titers against the co-administered antigen and that said humoral immune response has a high duration in the time.
  • oily adjuvants in general have the disadvantage of producing significant side effects (granuloma, erythema, abscess and inflammation) at the site of inoculation (Aucoutiirier et al. 2006; Buonavoglia et al .; Gupta et al. 1 93; Hilgers et al. 1994).
  • adjuvants comprising saponin and bile acids described in the present invention while promoting an intense humoral response did not show any appreciable side effects. This aspect is of great economic importance, since the local side effects associated with the immunization process not only cause pain and discomfort to the animal, but also have negative effects on the quality of meat and skins (Hilgers et al. 1994).
  • the doses of saponins used per animal in the CSS formulations used in this example contain 0.6 and 1.2 mg of saponins, which are lower doses than those used in other trials, despite which the generation of an intense humoral immune response, with antibody titers similar to those obtained with the oily adjuvant (ADYUVAC50).
  • EXAMPLE 9 Immunization assay of mice using as a Streptococcus pneumoniae serotype 14 capsular polysaccharide antigen (CPS 14) or a CPS conjugate with bovine serum albumin (BSA), together with the adjuvant formulations comprising colic acid and saponin.
  • CPS 14 Streptococcus pneumoniae serotype 14 capsular polysaccharide antigen
  • BSA bovine serum albumin
  • CPS 14 Streptococcus pneumoniae serotype 14 capsular polysaccharide
  • Applied and Environmental Microbiology 67 (2001), 969-971
  • a conjugate of this polysaccharide with antigens were used as antigens Bovine serum albumin, called CPS 14-BSA, prepared as indicated in Suárez et al., Journal of Chromatography - A, 1213 (2008), 169-175.
  • mice (30 g) of the strain Balb / c were used. These animals were acclimatized for a period of 30 days prior to immunization tests, with a day / night cycle of 12/12 hours, under controlled humidity and temperature conditions. Water and granulated food were provided ad libitum.
  • mice were divided into three groups of 8 animals each.
  • the animals were immunized on day 1 (prime immunization) and on day 14 (booster) subcutaneously with 100 nL of vaccine preparation.
  • the vaccine preparations used for the immunization of the different groups were: saline solution of CPS 14 with a concentration of 25 ⁇ g / mL (control group CPS 14), solution of CPS 14 in the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid prepared according to is indicated in EXAMPLE 6 with a concentration of CPS 14 of 25 ⁇ g / mL (CPS group 14 / CSS25), or a solution of polysaccharide-CPS 14-BSA protein conjugate in the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid prepared according to It is indicated in EXAMPLE 6 with a concentration of carbohydrates in the solution of 18.0 ⁇ g / mL (CPS group 14-BSA / CSS25).
  • FIG. 1 1 shows the IgM titres for the different groups of animals, in which it is observed that the co-administration of the capsular polysaccharide CPS14 together with the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid generates the production of higher titers of Specific IgM against CPS 14 than the administration of CPS14 in saline.
  • Figure 12 shows the IgG titers for the different groups of animals, in which it is observed that in the case of co-administration of the capsular polysaccharide CPS 14 together with the adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid, production was generated. of higher titers of specific IgG against CPS14 than the administration of CPS 14 in saline. It can be seen in Figure 12 that while the anti-CPS 14 IgG titers remained practically constant and at a low level throughout the experiment, in the group immunized with CPS 14 together with adjuvant colloidal solution comprising saponin and colic acid (group CPS14 / CSS25) higher antibody titers were generated that remained higher than in the previous group throughout the entire experiment.
  • colloidal adjuvant comprising saponin and colic acid could also exhibit adjuvant activity when co-administered with antigens comprising polysaccharides or carbohydrates and proteins.

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Abstract

La presente invención incluye la composición, preparación y empleo como adyuvante para uso animal o humano, de una formulación que comprende por lo menos un ácido biliar o sus sales y saponina, para potenciar la respuesta inmune contra un antígeno, que puede estar bien definido o no, incluyendo pero sin limitarse a bacterinas, antígenos y preparados antigénicos virales, bacterianos, parasitarios, y antígenos asociados con enfermedades tales como distintos tipos de cáncer. Los antígenos empleados pueden ser aislados de patógenos, así como productos de su modificación química o enzimática, antígenos recombinantes o sintéticos, o mezclas de los anteriores.

Description

ADYUVANTE DE VACUNACIÓN, PREPARACIÓN Y VACUNAS QUE
LO CONTIENEN
ESTADO DE ARTE
Muchas vacunas requieren de la incorporación de componentes denominados adyuvantes capaces de potenciar la respuesta inmune contra el o los antígenos. Los adyuvantes son un conjunto de aditivos sumamente heterogéneo, que pueden modular y potenciar la respuesta inmune contra un antígeno, permitiendo la generación de una respuesta protectora empleando generalmente dosis menores de antígeno. El uso de adyuvantes ha permitido el desarrollo de formulaciones vacunales de estimulación antigénico selectivas, que permiten modular la respuesta inmune hacia la producción de anticuerpos (respuesta tipo humoral) y/o mediada por células (respuesta tipo celular). El tipo de respuesta inmune inducida por un adyuvante suele ser una combinación de ambos tipos de respuesta, a veces presentando la prevalencia de una respuesta sobre otra. Por este motivo, cuando se diseñan vacunas es importante seleccionar adecuadamente el adyuvante a ser empleado en la formulación, de forma de lograr una potenciación del tipo de respuesta inmune requerida, hacia uno de los tipos específicos de respuesta humoral o celular, o hacia una combinación de ambas.
En general los adyuvantes son productos que tienen la capacidad de estimular directamente la respuesta de las células de sistema inmune a un antígeno, o que pueden actuar como vehículos, permitiendo una presentación más eficiente de los antígenos a las células del sistema inmune, lo que a su vez provoca una mejor respuesta. Sin embargo, se han descrito algunos adyuvantes que son capaces de actuar como inmunoestimulantes y como vehículos de antígenos simultáneamente.
Pese a su importancia, pocos son los adyuvantes actualmente en uso tanto en medicina humana como veterinaria. En particular, el hidróxido de aluminio o alúmina es uno de los pocos adyuvantes aprobados por la FDA para ser utilizado en la formulación de vacunas para uso humano. Posee propiedades físicas que favorecen la unión de los antígenos mediante atracciones electrostáticas estables, así como también forma suspensiones que favorecen la fagocitosis por las células presentadoras de antígeno. Su mecanismo de acción ha sido descrito recientemente y se caracteriza por polarizar la respuesta hacia un perfil de tipo Th2 con la secreción de las citoquinas IL-4 e IL-5, la producción de inmunoglobulinas del isotipo IgGl, así como IgE, e IgA secretoria y la activación de esosinófílos y mastocitos. Por otro lado, la estimulación de la población de linfocitos Th2 ejerce un efecto antagónico sobre las células Thl inhibiendo su diferenciación celular, por lo que la alúmina no sería el adyuvante indicado para combatir patógenos intracelulares (Lambrecht et al., 2009; Petrilli et al., 2007; Brewer et al., 1999). Las vacunas formuladas con alúmina presentan además algunos inconvenientes prácticos ya que sus preparaciones son heterogéneas, producen granuloma en el sitio de inyección y pueden volverse inefectivas al ser congeladas, lo que constituye un serio problema para su conservación principalmente en países del tercer mundo (Lindblad, 2004).
Diversos productos han demostrado poseer actividad adyuvante, incluyendo sales minerales como hidróxido o fostatos de aluminio, liposomas, productos naturales incluyendo saponinas y muchos otros. En particular algunas saponinas de origen vegetal han demostrado ser muy efectivas como adyuvantes. Las saponinas son glicósidos triterpénicos o esteroidales de amplia distribución en el reino vegetal. Debido a sus características estructurales son agentes tensoactivos anfifílicos, lo que explica sus propiedades surfactantes, su capacidad para formar soluciones coloidales, su actividad hemolítica y su capacidad para formar micelas mixtas con lípidos y esteróles. Las saponinas más estudiadas y empleadas como adyuvantes son las del árbol chileno Quillaja saponaria, que presentan actividad adyuvante humoral y celular, y que han sido empleadas tradicionalmente en medicina veterinaria (ej. formulación de vacunas contra la fiebre aftosa), así como saponinas de otras especies vegetales. Extractos de saponinas de Quillaja saponaria con actividad adyuvante son conocidos y empleados en la formulación de vacunas comerciales o experimentales, en particular el preparado de saponinas denominado Quil A (Darslgaard, 1974). También se ha descrito el aislamiento de saponinas puras o en mezclas mejor definidas, a partir del producto Quil A, que mantienen su actividad adyuvante y que presentan menor toxicidad que Quil A, por ejemplo la saponina denominada QS-21 , que ha sido usada o está siendo estudiada como adyuvante para distintos tipos de vacunas (patentes EP 0 362 279 B l y U.S. Pat. No. 5,057,540). Kensil también reportó el aislamiento y actividad adyuvante de otras saponinas aisladas de Quil A, entre ellas las denominadas QS-7, 17, 18 y 21 , siendo esta última la más estudiada y empleada como adyuvante.
Las saponinas de Quil A o saponinas purificadas como QS-21 , ya sea en solución o formuladas en micelas mixtas (ISCOMs o ISCOMATRIX®) promueven fuertes respuestas inmunes (humoral y celular con activación de CTL) contra una gran variedad de antígenos. Quil A polariza la respuesta hacia un perfil Th l asociada con la producción de las citoquinas INF-γ e IL-2, estimula la producción de altos niveles de anticuerpos IgG total e isotipos IgG l , IgG2a, IgG2b, IgG3, robustas respuestas de DTH y activación celular de linfocitos CD8+. Si bien Quil A es utilizada en vacunas veterinarias, su empleo en vacunas de uso humano se ha visto restringido por su intensa actividad hemolítica y la producción de reacciones locales no deseadas (fiebre, induración, sensibilidad, dolor) en el sitio de inyección (Sun et al., 2009; Kensil et al., 1991 ).
Se ha demostrado que algunos sistemas coloidales basados en saponinas cuando se coadministran con diversos antígenos presentan una intensa actividad adyuvante, capacidad de modulación de la respuesta inmune y reducidos efectos secundarios.
Actualmente existe un creciente interés en el desarrollo de formulaciones coloidales como sistemas de entrega de antígeno. Los Iiposomas, por ejemplo, permiten la encapsulación de proteínas y péptidos antigénicos en una forma multimérica particulada. Sin embargo, debido a la falta de suficiente inmunogenicidad, estas formulaciones generalmente requieren del empleo de adyuvantes adicionales para lograr que sean efectivos en la estimulación de una respuesta inmune adecuada.
Los complejos inmunoestimulantes denominados ISCOMs son sistemas particulados de entrega de antígenos compuestos por antígeno, colesterol, fosfolípido y saponina (Quil A, u otra saponina) con una potente actividad inmunoestimulante. Se denomina ISCOMATRIX® al adyuvante particulado compuesto por colesterol, fosfolípidos y saponinas (Quil A), pero que no contiene antígeno. Este adyuvante tiene esencialmente la misma estructura que los ISCOMs, consistiendo en partículas tipo caja perforada, de aproximadamente 40 nm de diámetro. Los antígenos pueden ser formulados con el ISCOMATRIX® para producir vacunas con capacidad de presentación del antígeno e inmunoestimulantes similares a las formulaciones tipo ISCOMs, pero con un rango de aplicabilidad más amplio, ya que su empleo no está limitado a proteínas hidrofóbicas de membrana. También se han desarrollado modificaciones de las formulaciones de ISCOMs e ISCOMATRIX® para lograr una mejor asociación de algunos antígenos, como por ejemplo se describe en la patente WO 98/36772.
ISCOMs e ISCOMATRIX®, combinan las ventajas de un sistema particulado de entrega de antígeno con la presencia de un adyuvante in situ (Quil A) y por ende se ha visto que son más inmunogénicos que otros sistemas coloidales como liposomas y micelas proteicas. Las formulaciones de ISCOMs e ISCOMATRIX® retienen la actividad adyuvante de las saponinas, a la vez que incrementan su estabilidad, reducen su actividad hemolítica y producen menor toxicidad. Estas también generan una respuesta inmune similar a la obtenida al inmunizar con mezclas simples de antígeno y saponina, pero permiten emplear cantidades de antígeno sustancialmente menores.
Varias formulaciones vacunales tipo ISCOMs o conteniendo ISCOMATRIX® han sido aprobadas para uso veterinario, por ejemplo contra virus de la influenza equina. Se han descrito otros sistemas micelares compuestos principalmente por saponinas de Q. saponaria y esteróles (principalmente colesterol), como por ejemplo en el documento de patente WO 96/33739, pudiendo también estar formuladas como emulsiones, como por ejemplo se describe en el documento de patente US 2005/0220814 Al . En la preparación de dichas formulaciones se emplean distintas técnicas para solubilizar los componentes más lipofílicos de la preparación, en particular los esteróles, que incluyen el uso de detergentes, su disolución previa en solventes orgánicos adecuados previamente a su mezcla con soluciones acuosas de saponinas y/o antígenos, la formación de films lipidíeos y su disolución por efecto de saponinas o detergentes y la emulsificación de los componentes lipidíeos previamente a su mezcla con saponinas. La obtención de todas estas formulaciones micelares incluye etapas de preparación debido a la poca solubilidad de algunos de sus ingredientes en soluciones acuosas, y algunas de ellas implican además etapas de remoción de algunos componentes como ocurre cuando se emplean detergentes, o solventes orgánicos, según sea el procedimiento específico de formulación. En algunas preparaciones también se requieren etapas de purificación de las soluciones coloidales previamente a su uso y formulación de vacunas.
Una alternativa al empleo de saponinas de la especie Quillaja saponaria Molina es el empleo de saponinas extraídas del árbol Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. et Tul.) Mart, nativo del sur de Brasil y Uruguay, cuyas saponinas han demostrado ser efectivas como adyuvantes, con una actividad similar a Quil A frente a antígenos virales (Silveira et al., Vaccine 29 (201 1), 9177-9182).
EXPLICACIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) por tinción negativa de micelas presentes en una muestra de la solución coloidal que comprende saponina y ácido cólico preparada por mezclado de soluciones acuosas de sus componentes. Figura 2: Imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) por tinción negativa de micelas presentes en una muestra de la solución coloidal que comprende saponina y ácido cólico preparada por el método de inyección de etanol. Figura 3: Imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) por tinción negativa con acetato de uranilo de micelas presentes en una muestra de la solución coloidal que comprende saponina de Quillaja brasiliensis y ácido cólico preparada por el método de inyección de etanol.
Figura 4: Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (MET) por tinción negativa con acetato de uranilo de micelas presentes en: A) muestra de solución coloidal que comprende saponinas de Quillaja saponaria y taurocolato de sodio preparada por mezcla de soluciones acuosas de sus componentes y B) muestra de solución coloidal que comprende saponinas de Quillaja saponaria y taurocolato de sodio preparada por el método de inyección de etanol. Figura 5: Actividad hemolítica de distintas formulaciones coloidales que comprenden ácido cólico y saponina.
Figura 6: Títulos de IgG total contra toxoide tetánico en los grupos de ratones inmunizados con toxoide tetánico solo en solución salina (TT), o con los siguientes adyuvantes: saponina (SQS), adyuvante oleoso (ADYUVAC50), solución coloidal adyuvante que comprende ácido cólico y saponina (CSS25, 25 mg de saponina por dosis), o solución coloidal adyuvante que comprende ácido cólico y saponina a mayor concentración (CSS50, 50 mg de saponina por dosis). El asterisco (*) indica diferencias significativas con grupo TT (P < 0.05).
Figura 7: Evolución de los títulos de IgG total contra toxoide tetánico en los grupos de ratones inmunizados con toxoide tetánico solo en solución salina (TT), o con los siguientes adyuvantes: saponina (SQS), adyuvante oleoso (ADYUVAC50), so lución coloidal adyuvante que comprende ácido cólico y saponina (CSS25, 25 Dg de saponina por dosis), o solución coloidal adyuvante que comprende ácido cólico y saponina a mayor concentración (CSS50, 50 ig de saponina por dosis).
Figura 8: Títulos de isotipos de IgG contra toxoide tetánico al día 107 del experimento en los grupos de ratones inmunizados con toxoide tetánico solo en solución salina (TT), o con los siguientes adyuvantes: saponina (SQS), adyuvante oleoso (ADYUVAC50), solución coloidal adyuvante que comprende ácido cólico y saponina (CSS25, 25 Ll g de saponina por dosis), o solución coloidal adyuvante que comprende ácido cólico y saponina a mayor concentración (CSS50, 50 u g de saponina por dosis). El asterisco (*) indica que los títulos de isotipos de IgG 1 , IgG2a y IgG2b en los grupos CSS25 y CSS50 presentaron diferencias significativas (P> 0.05) con respecto a los valores hallados en todos los demás grupos de animales incluidos en el ensayo.
Figura 9. Evolución de los títulos de IgG total contra TT en ovejas. Las ovejas fueron inmunizados los días 0 (primo-inmunización) y 28 (refuerzo) con TT solo o adyuvantizado con ADYUVAC50, CSS600 o CSS1200. Los datos son presentados como la media ± SE. El asterisco (*) indica diferencias significativas con respecto al grupo control (sólo TT); y el símbolo (#) indica diferencias significativas entre los grupos ADYUVAC50 y CSS1200.
Figura 10: Títulos de subclases de IgGl e IgG2 contra TT en ovejas al día 76. TT: grupo inmunizado con toxoide tetánico en solución salina, CSS600: grupo inmunizado con toxoide tetánico coadministrado con la solución coloidal adyuvante CSS600, CSS1200: grupo inmunizado con toxoide tetánico coadministrado con la solución coloidal adyuvante CSS 1200. Los títulos se expresan en Unidades Arbitrarias por mL (UA/mL). Figura 1 1 : Títulos de IgM específicos contra CPS14 en suero de ratones inmunizados en los días 1 y 14 con CSP14 con uno de los siguientes preparados vacunales: CPS14 en solución salina (2,5 Dg/dosis, grupo CPS 14), CPS 14 junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (2,5 Ig/dosis, grupo CPS14/CSS25), o con el conjugado polisacárido-proteína CPS 14- BSA junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (1 ,8 Gg/dosis de carbohidrato, grupo CPS14-BSA/CSS25).
Figura 12: Títulos de IgG específicos contra CPS 14 en suero de ratones inmunizados en los días 1 y 14 con CSP14 con uno de los siguientes preparados vacunales: CPS 14 en solución salina (2,5 Dg/dosis, grupo CPS 14), CPS 14 junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (2,5 I g/dosis, grupo CPS 14/CSS25), o con el conjugado polisacárido-proteína CPS 14- BSA junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (1,8 Gg/dosis de carbohidrato, grupo CPS14-BSA/CSS25).
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención proporciona una formulación adyuvante que comprende una saponina o mezclas de saponinas y uno o más ácidos biliares, como por ejemplo ácido cólico o ácido taurocólico, en proporciones definidas, que dan lugar a la formación de micelas mixtas de ambos tipos de componentes, típicamente filamentosas, y que no requieren necesariamente de etapas posteriores de purificación.
También se proporciona un método para la preparación de la formulación, el cual no requiere del uso de componentes adicionales, ya que es posible su preparación por simple mezcla de los componentes disueltos en agua o en soluciones buffer, que no requieren de su eliminación previa a su uso o para la preparación de vacunas. La formulación presenta como ventaja que tanto el producto final, así como las soluciones a partir de las cuales se prepara, son soluciones acuosas que pueden ser esterilizadas por filtración, siendo posible, por ejemplo, la preparación del producto final en condiciones asépticas a partir de las soluciones componentes previamente esterilizadas por filtración. El producto final también puede ser esterilizado por filtración siempre y cuando el preparado antigénico sea también esterilizable por filtración. El proceso de preparación de la presente invención comprende fundamentalmente las siguientes etapas: 1) preparación de la solución acuosa de saponinas que será utilizado en la formulación en presencia o no de un buffer o de sales, 2) preparación de una solución de concentración adecuada de la solución del ácido biliar o sus sales a utilizar, preferentemente ácido cólico, en una solución buffer de pH entre 7,0 y 9,0, preferentemente entre 7,5 y 8,5, preferentemente 8,0, 3) la mezcla de ambas soluciones de forma tal de obtener proporciones relativas de ácido biliar a saponina en relaciones preferentemente entre 0,5: 1 y 15: 1 en masa, preferentemente entre 2: 1 y 5: 1 , preferentemente entre 2,5: 1 y 4: 1 y más preferentemente 3: 1, 4) agregado de la solución de antígeno, 5) en caso de ser necesario se corrige el pH a un rango de entre 5,0 y 7,6, preferentemente entre 6,5 y 7,5, y se realiza una corrección de volumen para llevar a las concentraciones finales de administración, y 6) maduración de la mezcla a temperaturas preferentemente entre 2 °C y 8 °C, preferentemente entre 3 °C y 5 °C, durante un período preferentemente de entre 12 y 96 horas, más preferentemente entre 24 y 72 horas. De acuerdo a las concentraciones requeridas de antígeno y adyuvante en el producto final se procede o no a realizar una dilución del producto con una solución adecuada para su administración a animales o humanos.
Las soluciones adyuvantes así obtenidas consisten fundamentalmente en una solución que comprende saponina y ácido biliar, que pueden estar asociadas o no con el antígeno. En forma alternativa, el agregado del antígeno puede realizarse con posterioridad a la formulación de la solución adyuvante que comprende saponina y ácido biliar.
La solución adyuvante descrita en la presente invención puede utilizarse como adyuvante para diferentes tipos de antígenos, incluyendo, pero sin excluir a otros, a antígenos virales, proteínas, carbohidratos y glicoconjugados, que pueden ser definidos o no, o tratarse de preparados antigénicos complejos o mezclas de antígenos. Tanto las saponinas, en particular las saponinas de Quillaja saponaria, Quil A y saponinas puras aisladas de Quil A, así como los ácidos biliares utilizados en la preparación de la formulación adyuvante son tensoactivos, y por lo tanto, por encima de determinadas concentraciones pueden presentar actividad lítica sobre células, incluyendo glóbulos rojos (actividad hemolítica). Sin embargo, la formulación objeto de la presente invención, al combinar en proporciones adecuadas los dos componentes de la formulación, puede permitir una reducción muy apreciable de la actividad hemolítica de la formulación adyuvante. La actividad hemolítica de la formulación coloidal adyuvante puede regularse variando la proporción en masa de la saponina y del ácido biliar (ácido cólico en particular o sus sales), así como de la concentración total de saponina en la formulación. De esta forma es posible preparar formulaciones adyuvantes conteniendo concentraciones totales de saponinas que por sí solas son capaces de producir un 100% de hemolisis en las condiciones de ensayo, pero que formuladas adecuadamente pueden presentar reducciones en dicha actividad de entre un 50% y hasta casi un 100%, es decir, no presentando actividad hemolítica en las condiciones del ensayo. Sin embargo, en algunos casos es conveniente que las formulaciones adyuvantes conserven cierta capacidad lítica, por ejemplo cuando se buscan formulaciones que mejoren o permitan la penetración de antígenos a través de mucosas, y en la presente invención esto es posible de lograr regulando las proporciones relativas entre las saponina y el ácido biliar.
Si bien la presente invención emplea para la preparación de la formulación adyuvante compuestos que tienen por sí solos actividad tensoactiva, ambos forman parte de la formulación, por lo que no se requiere la adición y posterior remoción de detergentes, como si ocurre en otras preparaciones adyuvantes en que su uso es necesario para solubilizar los componentes menos hidrosolubles. A su vez, como no se requiere de etapas adicionales de remoción de solventes, por ejemplo por medio de diálisis, el proceso de fabricación del producto es más sencillo de escalar a nivel industrial, así como también es más simple producirlo de acuerdo a buenas prácticas de manufactura (GMP). La presente invención tampoco requiere del uso de etapas de centrifugación en su preparación, como puede ocurrir en el caso de formulaciones basadas en liposomas o ISCOMS, lo que en esos casos puede dificultar el escalado de la producción. El adyuvante objeto de la presente invención se puede manufacturar directamente a partir de soluciones acuosas de sus componentes, por lo que a diferencia de otros adyuvantes como el descrito en el documento de patente US 6,506,386 B l , no requiere para su producción de la preparación previa de liposomas conteniendo colesterol.
El adyuvante coloidal formado por saponinas y ácidos biliares objeto de la presente invención es una solución acuosa coloidal, que puede prepararse por mezclado en condiciones asépticas de las soluciones estériles de sus componentes, las cuales pueden ser esterilizadas por filtración. Esto representa una ventaja en relación con otros adyuvantes como la alúmina que consisten en suspensiones, por lo que no pueden ser esterilizadas por filtración, o pueden decantarse de la solución luego de un estacionamiento prolongado antes de su uso, lo que hace necesario su agitación para lograr la uniformización del contenido en los recipientes en los cuales se dispensan las vacunas que los contienen. Las vacunas que incluyen sales de aluminio como adyuvantes también requieren del mantenimiento de una cadena de frío rigurosa, y las vacunas pueden perder actividad si son sometidas a temperaturas demasiado bajas que puedan causar congelamiento. Las formulaciones adyuvantes de la presente invención son soluciones coloidales acuosas homogéneas que comprenden saponinas y ácidos biliares y de baja viscosidad que pueden ser preparadas en forma estéril por filtración. Esto representa una ventaja frente a otras preparaciones adyuvantes que consisten en emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, algunas de las cuales no pueden ser filtradas para su esterilización, y que pueden ser difíciles de administrar por vía parenteral debido a su elevada viscosidad, lo que puede llevar a una dosificación incorrecta requiriendo del empleo de personal especializado. La presente invención, debido a que se trata de soluciones coloidales acuosas homogéneas de baja viscosidad, presenta ventajas para el uso humano frente a las formulaciones que contienen como adyuvantes a sales de aluminio, ya que éstas últimas por ser suspensiones frecuentemente pueden provocar granulomas y dolor en el sitio de inyección. Debido a las mismas razones, la presente invención presenta ventajas frente a formulaciones adyuvantes que requieren del uso de emulsiones, algunas de las cuales son de alta viscosidad y por las reacciones locales de inflamación y dolor que producen no pueden ser empleadas en vacunas de uso humano. Sin embargo, también es posible preparar la formulación adjuvante objeto de la presente invención, empleando concentraciones más elevadas de saponinas y de ácidos biliares, y emplearla directamente en vacunas de uso veterinario sin provocar efectos locales apreciables, por ejemplo usando formulaciones conteniendo hasta 3,0 mg de saponinas por mL o más, preferentemente entre 0, 120 mg/mL y 2,40 mg/mL de saponinas, sin provocar efectos locales apreciables al ser administrada a animales, ovinos por ejemplo, en forma parenteral. El adyuvante objeto de la presente invención también puede prepararse a una concentración mayor que la que será utilizada en la formulación de la vacuna, por ejemplo 10 veces más concentrado, y luego ser diluido a la concentración de la formulación final empleando un vehículo adecuado, como por ejemplo PBS o solución salina isotónica.
El adyuvante objeto de la presente invención también puede prepararse por otros métodos, por ejemplo por método de inyección de etanol. En este método de preparación, se agrega el ácido biliar, por ejemplo ácido cólico disuelto en etanol a una solución acuosa de la saponina, por ejemplo de 0,240 mg/mL, en un volumen de alcohol no mayor al 10% del volumen final, preferentemente no mayor al 8% del volumen final, y a una concentración tal que la relación de masas entre el ácido biliar o sus sales y la saponina en la preparación final sea de entre 0,5 y 15, preferentemente en una relación entre 2 y 5, preferentemente entre 2,5 y 4, más preferentemente de 3. El alcohol de la formulación puede ser removido, por ejemplo, por diafiltración si la formulación lo requiere, o en el caso de algunas vacunas veterinarias o para uso humano, no removerse de la formulación si su presencia no causa efectos secundarios indeseables y no afecta la actividad de la vacuna.
Las saponinas empleadas en la presente invención son preferentemente saponinas del árbol Quillaja saponaria, de Quillaja brasiliensis, o de Gypsophila, aunque pueden utilizarse saponinas de otros orígenes. La presente invención incluye particularmente formulaciones adyuvantes que comprenden saponinas de Quillaja brasiliensis y al menos un ácido biliar, en la cuales se hallan presentes micelas filamentosas, incluyendo su forma de preparación.
Preferentemente en la presente invención pueden emplearse preparaciones de saponinas bien conocidas por su actividad adyuvante como Quil A, o saponinas aisladas, preferentemente QS-21, pero sin descartar el uso de otras fracciones o preparados de saponinas, en particular de Quillaja saponaria, u otras saponinas puras. En la presente invención, y típicamente para uso veterinario, las saponinas son empleadas en concentraciones entre 60 Dg/mL y 3000 C g/mL, preferentemente en concentraciones entre 120 Lig/mL y 2400 ij g/mL, más preferentemente entre 240 Dg/mL y 1200 ug/mL, dependiendo de la especie animal, del tipo y cantidad de antígeno incluido en la vacuna, y del volumen administrado por dosis. Para uso humano típicamente la formulación puede contener una cantidad de saponina en un rango de 1 Dg a 100 Cig por dosis, preferentemente en un rango de 10 Dg a 50 Dg por dosis.
Las formulaciones adyuvantes incluidas en la presente invención contienen un ácido biliar, típicamente ácido cólico u otro ácido biliar como el ácido taurocólico entre otros, y una saponina en una proporción de masas en un rango de 0,5 a 15, preferentemente en un rango de 1 a 8, preferentemente en un rango de 2 a 5, preferentemente en un rango de 2,5 a 4, más preferentemente en una relación de 3. Las formulaciones adyuvantes incluidas en la presente invención pueden ser preparadas por la mezcla de soluciones en agua o en buffer de los componentes, así como también por el método de inyección de solvente, en el cual el ácido biliar en una solución de etanol es agregado rápidamente a una solución en agua o buffer de saponina. La presente invención incluye vacunas o preparaciones inmunoestimulantes que incluyan al adyuvante descrito en la presente invención junto con un antígeno, mezcla de antígenos o preparados antigénicos, incluyendo vacunas preventivas o terapéuticas de uso animal o humano. Los antígenos que pueden ser formulados junto con el adyuvante descrito en la presente invención pueden ser antígenos bien definidos o no, mezclas de antígenos, incluyendo toxoides y bacterinas, así como preparaciones antigénicas que contengan antígenos virales o parasitarios. Las vacunas descritas en la presente invención consisten en adyuvante que comprende saponina y uno o más ácidos biliares, preferentemente ácido cólico, junto con antígenos virales, bacterianos o parasitarios, así como también antígenos tumorales y antígenos modificados químicamente, incluyendo, pero sin excluir otros tipos, antígenos proteicos, antígenos polisacarídicos, antígenos a carbohidratos, glicoproteínas y conjugados proteína-carbohidrato, mucopolisacáridos, glicolípidos y otros glicococonjugados y ácidos nucleicos, tanto naturales o modificados, como sintéticos o recombinantes, o mezclas de antígenos, como por ejemplo en vacunas multivalentes.
Los antígenos a ser utilizados en las vacunas incluidas en la presente invención podrán estar preferentemente en solución acuosa o en soluciones acuosas de sales, o también podrán tratarse de suspensiones o emulsiones de preparados antigénicos que pueden incluir preservantes, detergentes, sales y otros aditivos necesarios para el preparado antigénico, junto con el adyuvante compuesto por uno o más ácidos biliares y saponinas.
El adyuvante coloidal que comprende ácidos biliares y saponina descritos en la presente invención presenta como ventajas frente al uso de la misma saponina y a la misma concentración, así como respecto a adyuvantes oleosos, el generar una respuesta inmune más intensa que los anteriores, así como el hecho que los títulos de anticuerpos generados contra el preparado antigénico co-administrado se mantienen en valores más elevados durante más tiempo, lo que indica que la coadministración con un preparado antigénico es capaz de inducir una respuesta inmune más efectiva y duradera que el antígeno solo o co-administrado únicamente con saponina o con un adyuvante oleoso.
El adyuvante coloidal que comprende ácidos biliares y saponina descritos en la presente invención también se puede formular de manera que la concentración de saponina en la formulación final sea suficiente para adyuvantizar diferentes preparados antigénicos, permitiendo su ajuste a las dosis de antígeno que son necesarias para generar una respuesta inmune efectiva según el tipo de antígeno, así como también se puede regular, dentro de ciertos rangos, la proporción de sus componentes de forma de disminuir la actividad hemolítica de la preparación y/o mejorar su actividad adyuvante. El adyuvante coloidal que comprende por ácidos biliares y saponina descrito en la presente invención no requiere necesariamente de la remoción del posible exceso de alguno de sus componentes que puedan estar en un exceso relativo, o no formando parte de micelas, pudiendo emplearse directamente para la preparación de formulaciones vacunales, lo que representa una ventaja por su mayor sencillez en el proceso de producción y escalado.
El adyuvante coloidal que comprende ácidos biliares y saponina descritos en la presente invención presenta una muy buena capacidad para inducir respuestas inmunes más intensas contra antígenos coadministrados con el mismo. Este adyuvante conteniendo saponina y ácidos biliares es capaz de inducir una respuesta inmune más intensa contra antígenos coadministrados de distinta naturaleza, incluyendo, pero sin excluir otros tipos de antígenos, antígenos de naturaleza proteica, polisacáridos, conjugados proteína-polisacárido y otros tipos de glicocompuestos. Al ser coadministrado con un antígeno, el adyuvante coloidal que comprende ácidos biliares y saponina descritos en la presente invención genera una respuesta inmune más intensa contra este antígeno, y que perdura por más tiempo luego de la inmunización, lo que representa una ventaja a los efectos de generar una respuesta inmune más duradera, lo que eventualmente puede permitir el uso de esquemas de inmunización con inmunizaciones periódicas más espaciadas en el tiempo que en el caso que se inmunice con un antígeno o junto con otros adyuvantes como por ejemplo saponina.
El adyuvante coloidal que comprende ácidos biliares y saponina descritos en la presente invención y en este aspecto es capaz de inducir una respuesta inmune más intensa para una dosis dada de antígeno, lo que puede eventualmente reducir las dosis de antígenos requeridas para generar respuestas inmunes protectoras.
El adyuvante coloidal formado por ácidos biliares y saponina descritos en la presente invención estimula una respuesta inmune más intensa que la administración del antígeno por sí solo, y genera una respuesta inmune balanceada ya que induce tanto una respuesta de tipo Thl como Th2, lo que constituye una ventaja en los casos en que es necesario inducir una respuesta humoral y/o celular para generar protección contra algunos patógenos, como por ejemplo virus, patógenos intracelulares y contra antígenos tumorales en el caso de vacunas preventivas o terapéuticas contra enfermedades tumorales.
La presente invención se ilustra mediante los ejemplos que se describen a continuación, pero sin que estos representen una limitación a dicha invención.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 : Preparación de soluciones adyuvantes (complejos supramoleculares, CSS) que comprenden saponina y ácido cólico o sus sales por mezcla de sus soluciones acuosas. Las saponinas empleadas pueden ser de diferentes orígenes, entre ellas las de Quillaja saponaria, Quillaja brasiliensis, Gypsophila sp., y otras especies vegetales, así como preparados de saponinas como Quil A, o saponinas aisladas como por ejemplo la denominada QS-21. El ácido cólico y sus sales son compuestos naturales bien conocidos, y para la preparación de la formulación adyuvante puede emplearse ácido cólico o sus sales de distinto grado de pureza, preferentemente con una pureza mayor a 90%, preferentemente mayor al 98%.
En el presente ejemplo se describe la preparación de la solución coloidal adyuvante compuesta por ácido cólico o sus sales y la saponina comercial QP 1000 (Natural Response, Chile), o Quil A (Aquila Biopharmaceuticals, USA).
Se prepara una solución de ácido cólico de concentración 10 mg/mL en un buffer fosfato de pH 8,0 (solución A) y una solución acuosa de saponinas de Quillaja saponaria de 10 mg/mL (solución B). Para la preparación de 40 mL de la formulación se mezclan 4,8 mL de la solución A y 1 ,60 mL de la solución B, y se agregan 33,60 mL de solución salina isotónica, dando un pH final de la mezcla de aproximadamente 7,5. La mezcla se deja madurar a aproximadamente 4°C entre 24 y 72 horas antes de su uso. En la Figura 1 se muestra una de las imágenes de microscopía electrónica de transmisión ( ET) obtenidas para dicha formulación, mostrando principalmente la formación de micelas mixtas filiformes de distinta longitud pero con un diámetro relativamente uniforme. Estas micelas mixtas se forman a una concentración de saponinas por debajo de la concentración micelar crítica de la saponina, aunque también pueden emplearse concentraciones de saponina mayores. Por experimentos de difusión por diálisis pasiva, y cuantificación de la concentración de ácido cólico en las cámaras externa e interna de la bolsa de diálisis se observa una mayor concentración en la cámara interna, demostrando que la formación de las micelas mixtas de saponina y ácido cólico inhibe la difusión pasiva de éste último a través de la membrana de diálisis, lo que está de acuerdo con la formación de micelas mixtas de ambos componentes. EJEMPLO 2: Preparación de soluciones adyuvantes (complejos supramoleculares, CSS) que comprenden saponinas de Quillaja saponaria y ácido cólico o sus sales por el método de inyección de etanol.
En este ejemplo se muestra un método alternativo para la preparación de las soluciones coloidales adyuvantes conteniendo saponina y ácido cólico, empleando el método de inyección de etanol.
Se prepara una solución de saponina de concentración 240 μg/mL en buffer TBS pH=7.4, y a 2,775 mL de esta solución se agregan por inyección rápida 225 de una solución alcohólica de ácido cólico de concentración 9,6 mg/mL, para dar una solución coloidal con una relación en masa de ácido cólico a saponina de 3 a 1. La solución se incuba a 4 °C con agitación durante 48 h antes de realizar el análisis de microscopía electrónica de transmisión. Las muestras se prepararon para observación por tinción negativa empleando una solución de ácido fosfotúngstico al 2%. En la Figura 2 se muestra una imagen de microscopía electrónica donde se observa la presencia de micelas filiformes de longitud variable y de ancho relativamente uniforme.
Los valores de potencial zeta determinados por PCS (Photo Correlation Spectroscopy) para las formulaciones descritas en el ejemplo 1 y en el ejemplo 2 se hallan dentro del rango de -14,0 mV a -20,9 mV, demostrando que dichas formulaciones comprenden micelas cargadas negativamente.
EJEMPLO 3: Preparación de soluciones coloidales adyuvantes conteniendo ácido cólico y saponinas de Quillaja brasiliensis.
En este ejemplo se muestra un método para la preparación de soluciones coloidales de saponinas de Quillaja brasiliensis y ácido cólico empleando el método de inyección de etanol, mostrando que es posible formular micelas mixtas de tipo filiforme empleando saponinas derivadas de otra especie vegetal. Para la preparación de esta solución coloidal se emplearon las mismas condiciones experimentales detalladas en el Ejemplo 2, con la única diferencia que se empleó una solución de saponinas de Quillaja brasiliensis de 240 ÍJg/mL. Las saponinas de Quillaja brasiliensis se obtuvieron de una solución acuosa de hojas por extracción en fase sólida en fase reversa y eluyendo con un gradiente de metanol en agua. Las saponinas fueron detectadas por cromatografía en capa fina y comparación con un estándar de Quil A. En la Figura 3 se muestra una imagen de microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa empleando acetato de uranilo, donde se observa la presencia de micelas filiformes de longitud variable y de ancho relativamente uniforme.
EJEMPLO 4: Preparación de soluciones coloidales adyuvantes (complejos supramoleculares, CSS) que comprenden saponinas de Quillaja saponaria y ácido taurocólico o sus sales por los métodos anteriores.
En este ejemplo se describe la preparación de soluciones coloidales de saponinas de Quillaja saponaria y taurocolato de sodio, demostrando que es posible formular micelas mixtas de tipo filiforme empleando otro ácido biliar o sus sales.
Para la preparación de estas soluciones coloidales se emplearon los métodos siguientes: a) método descrito en el ejemplo 1 y b) método descrito en el ejemplo 2, y en ambos casos, las concentraciones finales de saponinas de Quillaja saponaria y taurocolato de sodio fueron de 400 μg/mL y 1200 μg/mL, respectivamente. En la Figura 4 se muestran las imágenes de microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa empleando acetato de uranilo: A) según el método descrito en el ejemplo 1 y B) según el método descrito en el ejemplo 2, donde en ambos casos se observa la presencia de micelas filiformes de longitud variable y de ancho relativamente uniforme. EJEMPLO 5: Preparación de soluciones coloidales adyuvantes conteniendo saponina y ácido cólico o sus sales en distintas relaciones de masas (m/m) y su efecto en la reducción de la actividad hemolítica de la formulación.
Se ha demostrado que las saponinas, en particular las de Quillaja saponaria, poseen una fuerte actividad adyuvante, pero presentan como inconveniente su capacidad de producir lisis celular, en particular hemolisis de glóbulos rojos, que pueden dar lugar a efectos secundarios indeseables al ser administrados en forma parenteral. La actividad hemolítica de las saponinas se puede emplear como una estimación de su potencial para producir efectos locales indeseables, por lo que el desarrollo de formulaciones que contengan saponinas y a la vez presenten una menor actividad hemolítica posee ventajas para su uso como adyuvantes en formulaciones inmunogénicas y vacunas en particular.
En el presente ejemplo se muestra cómo se pueden lograr formulaciones micelares de saponinas de Quillaja saponaria y ácido cólico, con reducida actividad hemolítica, así como también la variación de dicha actividad hemolítica al modificar la relación de masas entre el ácido cólico (o sus sales) y saponina.
Para este ejemplo se prepararon distintas formulaciones, variando las proporciones en masa de ácido cólico y saponinas de Quillaja saponaria. Para las formulaciones se empleó una solución de ácido cólico de 10 mg/mL en buffer fosfato pH 8,0 (solución A), y una solución acuosa de saponinas de saponina QP UF 1000 (Natural Response, Chile) de concentración 10 mg/mL (solución B), y cantidades necesarias de suero salino ¡sotónico para completar un volumen de 10 mL como se detalla en la Tabla 1. Tabla 1 : Composición de formulaciones comprendiendo ácido cólico y saponina con distintas relaciones en masa (m/m) entre ambos componentes.
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El ensayo de actividad hemolítica de las distintas formulaciones fue realizado como se describe en Silveira et al., Vaccine 29 (201 1) 9177-9182. En la Figura 5 se muestra la actividad hemolítica de las formulaciones A a H. Las formulaciones A-D contienen una concentración final de saponinas de 0, 120 mg/mL, y las formulaciones E-F contienen una concentración final de saponinas de 0,240 mg/mL. La formulación A corresponde a una solución de saponinas solas, de concentración 0, 120 mg/mL, y la formulación E corresponde a una solución de saponinas solas, de concentración 0,240 mg/mL. Tanto la formulación A como la E producen un 100% de hemolisis de acuerdo al método empleado para su determinación.
Como se observa en la Figura 5, la actividad hemolítica de las formulaciones coloidales adyuvantes que comprenden ácido cólico y saponina varía con la relación de masas de ácido cólico a saponina. Para la serie de formulaciones con una concentración final de saponinas de 0, 120 mg/mL se encontró que la hemolisis fue del 46%, 3% y 0% para las formulaciones B, C y D que contienen una relación de ácido cólico a saponina de 1, 3 y 4 (m/m), respectivamente. Para la serie de formulaciones con una concentración final de saponina de 0,240 mg/mL se encontró que el porcentaje de hemolisis fue del 97 %, 28 % y 60% para las formulaciones F, G y H que contienen una relación de acido cólico a saponina de 1, 3 y 4, respectivamente.
Este ejemplo demuestra que la actividad hemolítica de las formulaciones que comprenden ácido cólico y saponina dependen de la concentración final de saponina y de la relación de masas de ácido cólico a saponina, por lo que es posible, regulando la composición de la mezcla, disminuir o minimizar su actividad hemolítica, y por lo tanto, sus potenciales efectos secundarios locales.
EJEMPLO 6: Formulación de vacunas para inmunización de animales conteniendo como antígeno toxoide tetánico y como adyuvante la solución coloidal de ácido cólico y saponina.
En este ejemplo se utiliza como antígeno toxoide tetánico. El toxoide tetánico empleado se halla en solución conteniendo 3 mg/mL de proteína, equivalentes a 450 Lf/mL (unidades floculantes de toxoide).
En primer lugar se prepara una solución de ácido cólico de concentración 10 mg/mL en un buffer fosfato de pH 8,0 (solución A) y una solución acuosa de saponinas QP UF 1000 (Natural Response, Chile) de concentración 10 mg/mL (solución B). Para la preparación de 40 mL de la formulación de inmunización, típicamente se mezclan 2,90 mL de la solución A, 0,96 mL de la solución B y 35,94 mL de solución salina isotónica. A esa mezcla se adicionan 0.2 mL de la solución de toxoide tetánico, y la formulación se deja madurar a 4°C entre 12 y 96 horas antes de su uso. Todas las soluciones utilizadas en este ejemplo son esterilizadas empleando filtros de 0,22 ¡Jm, y la formulación es preparada por mezclado en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar.
Para la preparación de 40 mL de una formulación análoga a la anterior, pero conteniendo concentraciones finales de saponina de 600 Lig/mL (denominada CSS600) y 5 Lf de toxoide tetánico por mL, se mezclan 7,20 mL de solución A, 2,40 mL de solución B, y 29,95 mL de solución salina isotónica. A esa mezcla se adicionan 0,45 mL de la solución de toxoide tetánico mencionada en la preparación anterior, y la formulación se deja madurar a 4°C entre 12 y 96 horas antes de su uso. Todas las soluciones utilizadas en este ejemplo son esterilizadas empleando filtros de 0,22 Um, y la formulación es preparada por mezclado en condiciones asépticas. Para la preparación de 40 mL de una formulación análoga a la anterior, pero conteniendo concentraciones finales de saponina de 1200 ng/mL (denominada CSS1200) y 5 Lf de toxoide tetánico por mL, se mezclan 14,40 mL de solución A, 4,80 mL de solución B, y 20,35 mL de solución salina isotónica. A esa mezcla se adicionan 0,45 mL de la solución de toxoide tetánico mencionada en la preparación anterior, y la formulación se deja madurar en heladera a 4°C entre 24 y 72 horas antes de su uso. Todas las soluciones utilizadas en este ejemplo son esterilizadas empleando filtros de 0,22 Dm, y la formulación es preparada por mezcla en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar.
EJEMPLO 7: Efecto adyuvante de la solución coloidal que comprende ácido cólico y saponina en un modelo murino empleando toxoide tetánico (TT) como antígeno, y comparación de la actividad adyuvante de dicha formulación con saponina y con un adyuvante oleoso. Para este ejemplo se emplearon ratones adultos (30 g) machos de la cepa Balb/c. Los animales fueron aclimatados por un período de 30 días previo a los ensayos de inmunización, con un ciclo día/noche de 12/12 horas, bajo condiciones controladas de humedad y temperatura. El agua y el alimento granulado fueron provistos ad libitum.
Los grupos de ratones ensayados recibieron toxoide tetánico (TT) ya sea solo, o adyuvantizado con saponina (QP UF 1000, Natural Response, Chile), o con el adyuvante oleoso ADYUVAC50 (Laboratorio Santa Elena, Uruguay), o con la solución coloidal adyuvante compuesta por saponina y ácido cólico, preparada según se indica en el EJEMPLO 6, pero de forma tal que la concentración final de saponina sea de 500 Lig/mL y con una relación en masa de ácido cólico a saponina igual a 3. Los ratones (grupos de 5 animales) recibieron dos inmunizaciones de TT por vía s/c: la primera, en el día 1 y la segunda en el día 45. La primo-inmunización se realizó con 1.6 μg ( 100 μί) de TT salvo en el caso de los animales del grupo CSS50 que fueron inmunizados con 3.2 μg. Los diferentes grupos recibieron como adyuvante: saponina (QP UF 1000, Natural Response, Chile) (25 μg) o ADYUVAC50 (Laboratorios Santa Elena, preparado de acuerdo a instrucciones del fabricante) o soluciones coloidales adyuvantes de saponina y ácido cólico preparada según el EJEMPLO 6 (denominado CSS25 y conteniendo 25 μg de saponina por dosis) o solución coloidales adyuvantes de saponina y ácido cólico preparada como se indicó anteriormente con una concentración final de saponina de 500 Dg/mL (denominado CSS50 y conteniendo 50 μg de saponina por dosis) en un volumen final de 100 μL·. El grupo control recibió sólo TT ( 1 ,6 IZ g en solución salina, 100 Q L). La segunda dosis (día 45) fue formulada con la mitad de antígeno (0.8 μg) y de adyuvante, con la excepción del grupo de ADYUVAC50 en el que el antígeno se redujo a la mitad (0.8 μg), pero la cantidad de adyuvante por dosis se mantuvo. Los animales fueron sangrados en los días 1, 45, 66, 107, 147 y 167 luego de la primera inmunización y los sueros congelados a -20 °C hasta su procesamiento. Los títulos de IgG total e isotipos de IgG contra TT en los sueros de ratones fueron evaluados por ELISA. Se sensibilizaron las placas (Greiner Bio-One) con TT (100 μg/mL) en PBS (100 μί/ροαΐΐο) toda la noche a 4 °C. Después de la sensibilización, se lavaron tres veces con PBS conteniendo 0.05 % (v/v) de Tween 20 (PBS/T) y se bloquearon incubando 1 hora a 37 °C con una solución al 5% (w/v) de leche bovina en polvo en PBS (200 μί/ροϋϊΐΐο). Posteriormente, se lavaron nuevamente como se describió anteriormente y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con los sueros diluidos en PBS/T conteniendo 0.1 % de BSA (w/v) (PBS/T/BSA), sembrados por duplicado (100 μί/ρο ΐΐο). Luego de lavar otra vez, se incubaron 1 hora a 37 °C con diluciones apropiadas en PBS/T/BSA del conjugado a peroxidasa correspondiente: anti-IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, USA), IgGl (Caltag Laboratories, USA), IgG2a o IgG2b (Zymed Laboratories, USA) de ratón (100 μί/ρο Ι1ο). Finalmente, las placas se lavaron y se agregaron 100 μΐ, por pocilio de una solución conteniendo sustrato y cromógeno (H202 + ABTS); 15 minutos después se leyó la DO a 405 nm. En cada placa, se incluyeron diluciones seriadas de un pool de sueros (del experimento correspondiente) para la confección de una curva de calibración, que fue utilizada para expresar el título de anticuerpos en unidades arbitrarias/mL (UA/mL). En la Figura 6 se muestran los títulos de anticuerpos IgG totales contra toxoide tetánico (TT) en este ensayo a los días 0, 45 y 66 en el modelo murino al ser inmunizados con antígeno solo, o con el antígeno junto con los distintos adyuvantes, e incluye los títulos de IgG anti-TT correspondientes a la respuesta primaria y a la respuesta luego de una segunda administración de la formulación inmunizante. En dicha figura se puede observar que la coadministración del antígeno con la solución coloidal adyuvante objeto de la presente invención aumenta tanto la respuesta inmune primaria y secundaria en el modelo murino, demostrando que el adyuvante que comprende saponina y ácido cólico permite la generación de títulos de anticuerpos significativamente más elevados que la administración del antígeno solo. Esta solución coloidal adyuvante que incluye ácido cólico y saponina es también más efectiva para estimular una respuesta inmune humoral que la saponina sola, así como también que el adyuvante oleoso comercial ADYUVAC50, ya que induce la secreción de títulos significativamente más elevados contra el antígeno con el cual es coadministrado. En la Figura 7 se observa la evolución de los títulos de IgG total contra toxoide tetánico en los distintos grupos de ratones inmunizados con las distintas formulaciones vacunales descritas en este EJEMPLO. Se observa en dicha figura que las formulaciones coloidales adyuvantes conteniendo ácido cólico y saponina (grupos CSS25 y CSS50) inducen la producción de títulos de IgG significativamente mayores contra el antígeno coadministrado y que permanecen en niveles más elevados durante más tiempo que cuando se administra el antígeno solo o junto con saponina o con el adyuvante oleoso ADYUVAC50. Este resultado demuestra que el adyuvante coloidal conteniendo ácido cólico y saponina es efectivo para generar una respuesta humoral más intensa y duradera que la generada por la administración de antígeno solo o junto con saponina o en formulado junto con un adyuvante oleoso bajo la forma de una emulsión.
En la Figura 8 se muestran los títulos de las subclases de inmunoglobulinas IgGl , IgG2a e IgG2b en suero de los distintos grupos de animales de experimentación inmunizados contra TT. A nivel general, se puede observar que la producción de IgG total y de los isotipos analizados (IgGl , IgG2a e IgG2b) contra TT al emplear las formulaciones CSS50 y CSS25 tuvieron comportamientos similares. Los títulos de IgG total en el grupo CSS25 fueron aún superiores a los que presentaron el grupo CSS50 a pesar que no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre sí (P > 0.05). El adyuvante CSS estimuló la producción de títulos más elevados de las subclases IgG l , IgG2a e IgG2b. Este perfil de estimulación de la secreción de estos tres isotipos de inmunoglobulinas ha sido descrito para las formulaciones tipo ISCOMs en modelo murino (Sjolander et al. 1997), y es indicativo de la generación de una respuesta balanceada entre los tipos de respuesta Thl y Th2, sugiriendo la estimulación tanto de una respuesta humoral como celular. La formulación CSS también incrementó la duración de la respuesta humoral ya que los títulos de IgG total e isotipos se mantuvieron elevados aún casi 6 meses después de la primo-inmunización.
En resumen, en este EJEMPLO se demuestra que la formulación adyuvante coloidal que comprende ácido cólico y saponina estimula una respuesta inmune más intensa y duradera al ser coadministrado con toxoide tetánico que la inducida por el antígeno solo (toxoide tetánico), o cuando se administra junto con saponina como adyuvante o formulado junto con el adyuvante oleoso ADYUVAC50, en cuyo caso la formulación vacunal está formando una emulsión. En este ejemplo también se demuestra la generación de una respuesta inmune balanceada ya que mediante el uso como adyuvante de la solución que comprende ácido cólico y saponina se logra un aumento balanceado de la secreción de los isotipos IgG l , IgG2a e IgG2b contra el antígeno coadministrado, sugiriendo la estimulación de una respuesta inmune tanto de tipo humoral como celular, lo que es importante para generar respuestas inmunes protectoras en particular para patógenos intracelulares, virus y contra antígenos tumorales para la terapia del cáncer.
EJEMPLO 8: Efecto adyuvante de la solución coloidal de ácido cólico y saponina en ovinos empleando toxoide tetánico (TT) como antígeno, y comparación de la actividad adyuvante de dicha formulación con un adyuvante oleoso. Para el ensayo del presente ejemplo se inmunizaron ovejas con formulaciones vacunales conteniendo el adyuvante coloidal que comprende ácido cólico y saponina y toxoide tetánico denominadas CSS600 y CSS 1200, preparadas como se describe en el EJEMPLO 6. Dichas preparaciones contienen una relación de masas de ácido cólico a saponina igual a 3, y 5 Lf de toxoide tetánico por mL. Las ovejas empleadas, a las que se refiere este ejemplo, fueron mantenidas en condiciones de campo natural durante el experimento y no habían recibido inmunización previa contra toxoide tetánico. Las ovejas fueron divididas en 5 grupos de 10 animales cada uno, y recibieron dos inmunizaciones por vía s/c, en los días 1 y 28 del experimento. Los animales pertenecientes a los distintos grupos recibieron 1 mL de diferentes preparados vacunales, todos conteniendo la misma cantidad de antígeno equivalente a 5 Lf de toxoide tetánico por mL de vacuna. Las formulaciones vacunales empleadas fueron: toxoide tetánico en solución salina (grupo TT), toxoide tetánico formulado con el adyuvante oleoso ADYUVAC50 (Laboratorio Santa Elena, Uruguay) empleado para la preparación de la formulación de acuerdo a las instrucciones del fabricante (grupo ADYUVAC50), toxoide tetánico formulado con el adyuvante coloidal conteniendo ácido cólico y saponina preparado según se indica en el EJEMPLO 6 denominado CSS600 (grupo CSS600) y toxoide tetánico formulado con el adyuvante coloidal conteniendo ácido cólico y saponina preparado según se indica en el EJEMPLO 6 denominado CSS1200 (grupo CSS1200). Los animales fueron sangrados en los días 1 , 28, 76 y 195 luego de la primera inmunización y los sueros fueron conservados a -20 °C hasta su procesamiento. Los títulos de IgG total e isotipos de IgG contra TT en sueros de ovejas fueron evaluados por ELISA. Para ello, se sensibilizaron placas (Greiner Bio-One) con una solución de TT (100 μg/mL) en PBS (100 L/pocillo) toda la noche a 4 °C. Después de la sensibilización, dichas placas se lavaron tres veces con PBS conteniendo 0.05 % (v/v) de Tween 20 (PBS/T) y se bloquearon incubando 1 hora a 37 °C con una solución al 5% (w/v) de leche bovina en polvo en PBS (200 μί/ρο ΐΐο). Luego, se lavaron nuevamente y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con los sueros diluidos en PBS/T conteniendo 0.1% de BSA (w/v) (PBS/T/BSA), sembrados por duplicado (100 μί/ροοϋΐο). Luego de lavar otra vez, las placas se incubaron con un anticuerpo contra IgG total de oveja, o con anticuerpos monoclonales de ratón anti IgGl o IgG2 de oveja durante toda la noche a 4 °C. Luego se lavó de la forma habitual y se agregó un conjugado de peroxidasa con antisuero contra IgG de ratón con diluciones apropiadas en PBS/T/BSA (Jackson Immuno Research Laboratories, USA). Finalmente, las placas se lavaron y se agregó (100 μί/ροοϋΐο) de una solución conteniendo sustrato y cromógeno (H202 + ABTS); 15 minutos después se leyó la DO a 405 nm. En cada placa, se incluyeron diluciones seriadas de un pool de sueros (del experimento correspondiente) para la confección de una curva de calibración, que fue utilizada para expresar el título de anticuerpos en unidades arbitrarias/mL (UA/mL).
En la Figura 9 se muestran los títulos de IgG totales anti-TT en ovejas pertenecientes a los distintos grupos del ensayo.
Todos los grupos inmunizados con toxoide tetánico y un adyuvante (ADYUVAC50, CSS600 y CSS 1200) generaron títulos de IgG anti-toxoide tetánico mayores que los generados en el grupo inmunizado con toxoide tetánico solo en solución salina. Con la primo-inmunización se observaron títulos más elevados de anticuerpos en el grupo ADYUVAC50 que en los grupos CSS600 y CSS 1200, pero luego de la segunda inmunización, al día 76 de experimento, los grupos de animales CSS600 y CSS 1200 presentaron títulos de anticuerpos anti- toxoide tetánico iguales o superiores a los que presentaron los animales del grupo ADYUVAC50, y muy superiores a los que presentaron los animales inmunizados solo con el antígeno en solución salina (grupo TT). En la Figura 9 también se observa que el empleo de las formulaciones coloidales adyuvantes conteniendo ácido cólico y saponina, denominadas CSS600 y CSS1200 también generan títulos elevados de anticuerpos contra el antígeno co-administrado aún a los 194 días de la primera inmunización, con títulos de anticuerpos más elevados en forma estadísticamente significativa respecto del grupo inmunizado sin emplear adyuvante (grupo TT). Este experimento demuestra que las formulaciones adyuvantes coloidales conteniendo ácido cólico y saponina son tan eficientes como el adyuvante oleoso, en el esquema de inmunización empleado, para generar elevados títulos de anticuerpos contra el antígeno co-administrado y que dicha respuesta inmune humoral presenta una elevada duración en el tiempo.
Si bien el grupo de ADYUVAC50 presentó los títulos de IgG totales más altos luego de la primo-inmunización, los adyuvantes oleosos en general presentan la desventaja de producir efectos secundarios importantes (granuloma, eritema, absceso e inflamación) en el sitio de inoculación (Aucoutiirier et al. 2006; Buonavoglia et al.; Gupta et al. 1 93; Hilgers et al. 1994). En contraste, los adyuvantes que comprenden saponina y ácidos biliares descritos en la presente invención a la vez que promovieron una intensa respuesta humoral, no presentaron ningún efecto secundario apreciable. Este aspecto es de gran importancia económica, ya que los efectos secundarios locales asociados al proceso de inmunización no solo producen dolor y molestias al animal, sino que tienen efectos negativos sobre la calidad de la carne y las pieles (Hilgers et al. 1994).
Los títulos de las subclases de inmunoglobulinas IgGl e IgG2 se muestran en la Figura 10. Todos los grupos inmunizados con TT y que incluyeron adyuvantes en la formulación dieron títulos cuantificables para ambas subclases de inmunoglobulinas. Sin embargo, sólo los grupos inmunizados con toxoide tetánico incluyendo las formulaciones adyuvantes conteniendo ácido cólico y saponina, denominadas CSS600 y CSS 1200 mostraron diferencias significativas con el grupo control (P < 0.05), dando los títulos más elevados de IgGl e IgG2 al día 76. Es de resaltar que los títulos de ambas subclases de IgG aumentaron en forma similar, lo que indica la capacidad de estos adyuvantes para producir una respuesta inmune contra el antígeno co-administrado más intensa, a la vez que balanceada entre ambos tipos de respuesta. Es de resaltar que las dosis de saponinas utilizadas por animal en las formulaciones CSS empleadas en este ejemplo contienen 0.6 y 1.2 mg de saponinas, las cuales son dosis menores a las empleadas en otros ensayos, pese a lo cual se logró la generación de una intensa respuesta inmune humoral, con títulos de anticuerpos similares a los obtenidos con el adyuvante oleoso (ADYUVAC50).
EJEMPLO 9: Ensayo de inmunización de ratones empleando como antígeno polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 14 (CPS 14) o un conjugado de CPS con seroalbúmina bovina (BSA), junto con la formulaciones adyuvante que comprende ácido cólico y saponina. Para este ejemplo se utilizaron como antígenos: polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 14 (CPS 14) preparado según se indica en Suárez et al., Applied and Environmental Microbiology, 67 (2001), 969-971, y un conjugado de este polisacárido con seroalbúmina bovina, denominado CPS 14- BSA, preparado según se indica en Suárez et al., Journal of Chromatography - A, 1213 (2008), 169-175.
En este ejemplo se emplearon ratones machos adultos (30 g) de la cepa Balb/c. Dichos animales fueron aclimatados por un período de 30 días previo a los ensayos de inmunización, con un ciclo día/noche de 12/12 horas, bajo condiciones controladas de humedad y temperatura. El agua y el alimento granulado fueron provistos ad libitum.
Los ratones se dividieron en tres grupos de 8 animales cada uno. Los animales fueron inmunizados el día 1 (primo-inmunización) y el día 14 (refuerzo) en forma subcutánea con 100 nL de preparado vacunal. Los preparados vacunales utilizados para la inmunización de los distintos grupos fueron: solución salina de CPS 14 con una concentración de 25 μg/mL (grupo control CPS 14), solución de CPS 14 en la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico preparado según se indica en el EJEMPLO 6 con una concentración de CPS 14 de 25 μg/mL (grupo CPS 14/CSS25), o una solución de conjugado polisacárido- proteína CPS 14-BSA en la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico preparado según se indica en el EJEMPLO 6 con una concentración de carbohidratos en la solución de 18,0 μg/mL (grupo CPS 14-BSA/CSS25). Los animales fueron sangrados en los días 1 , 7, 14, 34 y 50 del experimento y los sueros fueron congelados a -20 °C hasta su procesamiento. Los títulos de IgG totales fueron evaluados como está indicado en el EJEMPLO 7, con la diferencia que las placas de ELISA fueron sensibilizadas con CPS 14 (100 Ig/mL) en PBS (100 ¡j L/pocillo) durante toda la noche a 4 °C. Para la determinación de los títulos de IgM se utilizó el mismo procedimiento, con la diferencia que para su detección se emplearon diluciones apropiadas en PBS/T/BSA del conjugado de peroxidasa anticuerpos anti-IgM de ratón (Jackson Immuno Research Laboratories, USA) y se continuó con el análisis como se describe en el EJEMPLO 6. Los títulos de IgM y de IgG fueron expresados en Unidades Arbitrarias por mL (UA/mL) empleando un pool de sueros del experimento para la confección de una curva de calibración. En la Figura 1 1 se muestran los títulos de IgM para los distintos grupos de animales, en la cual se observa que la coadministración del polisacárido capsular CPS14 junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico genera la producción de títulos más altos de IgM específica contra CPS 14 que la administración de CPS14 en solución salina. En la misma Figura 1 1 se observa que la coadministración de CPS14-BSA junto con la solución adyuvante que comprende saponina y ácido cólico generó la producción de títulos más altos de anticuerpos IgM específicos contra CPS14 que la administración de CPS14 en solución salina a los días 7 y 14 luego de la primo-inmunización. A los días 34 y 50 los títulos de IgM específicos contra CPS 14 de los tres grupos del presente EJEMPLO disminuyen a valores similares.
En la Figura 12 se muestran los títulos de IgG para los distintos grupos de animales, en la cual se observa que en el caso de la coadministración del polisacárido capsular CPS 14 junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico se generó la producción de títulos más altos de IgG específica contra CPS14 que la administración de CPS 14 en solución salina. Se observa en la Figura 12 que mientras que los títulos de IgG anti CPS 14 se mantuvieron prácticamente constantes y en un nivel bajo durante todo el experimento, en el grupo inmunizado con CPS 14 junto con solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (grupo CPS14/CSS25) se generaron títulos de anticuerpos más altos que se mantuvieron más elevados que en el grupo anterior a lo largo de todo el experimento. Los resultados de este EJEMPLO demuestran que la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico es efectiva para inducir una respuesta inmune humoral más intensa contra un antígeno polisacarídico cuando es coadministrada con éste, demostrando que es efectiva como adyuvante de vacunación para este tipo de antígenos.
En los resultados de los títulos de IgG anti-CPS14 en los distintos grupos de animales representados en la Figura 12 se observa que los títulos de los anticuerpos IgG específicos contra CPS 14 en el grupo inmunizado con el conjugado polisacárido-proteína junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (grupo CPS14-BSA/CSS25) son más elevados que los títulos del grupo inmunizado con CPS14 en solución salina (grupo CPS 14), así como también del grupo inmunizado con CPS 14 junto con la solución coloidal adyuvante que comprende saponina y ácido cólico (grupo CPS 14/CSS25). Dichos títulos además se mantienen más elevados a lo largo de todo el experimento con respecto a los otros grupos de animales de experimentación, sugiriendo que el adyuvante coloidal que comprende saponina y ácido cólico podría también presentar actividad adyuvante al ser co-administrado con antígenos que comprenden polisacáridos o carbohidratos y proteínas.

Claims

REIVINDICACIONES
1 - Un preparado adyuvante de vacunación que comprende al menos un ácido biliar o sus sales y al menos una saponina.
2- El preparado adyuvante de la reivindicación 1 caracterizado porque la proporción relativa en masa de ácido biliar o sus sales a saponina está en un rango entre 0,5 y 15 (m/m).
3- El preparado adyuvante de la reivindicación 1 caracterizado porque la proporción relativa en masa de ácido biliar o sus sales a saponina está en un rango entre 2 y 5 (m/m). 4- El preparado adyuvante de la reivindicación 1 caracterizado porque la proporción relativa en masa de ácido biliar o sus sales a saponina está en un rango entre 2,5 y 4 (m/m).
5- El preparado adyuvante de la reivindicación 1 caracterizado porque la proporción relativa en masa de ácido biliar o sus sales a saponina es igual a 3 (m/m).
6- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el ácido biliar es ácido cólico o sus sales.
7- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el ácido biliar es ácido taurocólico o sus sales. 8- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque la saponina es un preparado de saponinas de la especie Quillaja saponaria.
9- El preparado adyuvante de las reivindicaciones de 1 a 7 en el cual la saponina es Quil A o un extracto de la misma.
10- El preparado adyuvante las reivindicaciones 1 a 7 donde la saponina es QS- 21. 1 1 - El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque la saponina es un preparado de saponinas de la especie Quillaja brasiliensis.
12- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque la saponina es un preparado de saponinas de la especie Gypsophila sp. 1 3- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque la concentración de saponina se halla en un rango de 60 1. g/mL a 3000 I g/mL.
14- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque la concentración de saponina se halla en un rango de 60 L g/mL a 1200 l:g/mL.
1 - El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque la concentración de saponina se halla en un rango de 1 I g/mL a 100 J g/mL.
16- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque la concentración de saponina se halla en un rango de 10 []g/mL a 50 I¡g/mL.
17- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque la saponina es un preparado de saponinas de Quillaja saponaria y el ácido biliar es ácido cólico o sus sales.
1 8- El preparado adyuvante de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque la saponina es Quil A y el ácido biliar es ácido cólico o sus sales.
19- Una formulación de vacuna para su uso en animales o humanos que comprende un preparado adyuvante como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y uno o más antígenos incluyendo antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos parasitarios, antígenos tumorales, antígenos proteicos, antígenos polisacarídicos, antígenos a carbohidratos, glicoproteínas, conjugados proteína - carbohidrato, mucopolisacáridos, glicolípidos, glicoconjugados y ácidos nucleicos tanto naturales o modificados, sintéticos o recombinantes, o mezclas de antígenos y preparados antigénicos. 20- Una formulación de vacuna como la indicada en la reivindicación 19 que comprende cualquier antígeno o preparado antigénico derivado de Clostridium, Streptococcus, Shigella, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Bordetella, Plamodium, Leptospira, Brucella, Haemophylus o Mycobacterium. 21 - La formulación de vacuna como la indicada en la reivindicación 19 que comprende cualquier antígeno o preparado antigénico derivado de Herpes Virus Bovino, Herpes Simplex Virus, Hepatitis A, B, C o E, o Rotavirus.
22- La formulación de vacuna como la indicada en la reivindicación 19 que comprende un antígeno que comprende carbohidratos o un preparado antigénico derivado de este último, incluyendo conjugados de polisacáridos a proteínas y glicolípidos.
23- La formulación de vacuna como la indicada en la reivindicación 19 en donde el antígeno comprende toxoides bacterianos.
24- Una formulación de vacuna como la indicada en la reivindicación 23 en donde el antígeno es toxoide tetánico.
25- Una formulación de vacuna como la indicada en la reivindicación 19 en donde el antígeno comprende polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae.
26- Una formulación de vacuna según la reivindicación 25 en donde el antígeno es polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 14. 27- Un proceso para la producción de un preparado adyuvante como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende las siguientes etapas: preparación de una solución acuosa de saponina o sus sales, que puede contener o no un buffer; preparación de una solución acuosa del ácido biliar o sus sales, que puede contener o no un buffer; mezclado de las soluciones preparadas en a) y b) en ausencia de detergente adicional, de manera de obtener una proporción relativa de ácido biliar o sus sales a saponina entre 0,5: 1 a 15: 1 en masa; en caso de ser necesario ajuste de pH a un rango de entre 5,0 y 7,6; y maduración de la mezcla preparada en el punto c) a una temperatura de entre 2 y 12 °C, preferentemente a 4 °C, durante 2 o más horas.
28- Un proceso para la producción de un preparado adyuvante como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende las siguientes etapas: preparación de una solución acuosa de saponina o sus sales, que puede contener o no un buffer; preparación de una solución en etanol del ácido biliar o sus sales; inyección rápida de la solución en etanol del ácido biliar a la solución acuosa de la saponina, de manera de obtener una proporción relativa de ácido biliar a saponina entre 0,5: 1 y 15: 1 en masa, y en un volumen tal que no sobrepase el 10% del volumen final de la preparación.
29- Un proceso para la fabricación de una formulación de vacunas para uso animal o humano que incluye el agregado de un antígeno o preparado antigénico al momento de realizar la mezcla de los componentes de la formulación adyuvante preparada como se indica en la etapa c) de las reivindicaciones 27 y 28.
30- Un proceso para la fabricación de una formulación de vacunas para uso animal o humano que comprende las siguientes etapas: tomar una formulación adyuvante preparada de acuerdo a la reivindicación 27 o 28, y agregar a ésta un antígeno o preparado antigénico. 3 1 - El uso de un preparado adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 8 para la formulación de vacunas que comprendan antígenos o preparados antigénicos que requieren de la potenciación y modulación de la respuesta inmune contra dichos antígenos o preparados antigénicos para generar una respuesta inmune efectiva en animales o humanos.
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