JPH06503231A - 胆汁酸塩を含有するｂ型肝炎ワクチン製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 胆゛　塩を　るＢ型　づワクチン １１へ於」 本発明は、肝炎ワクチン及びその製剤に係わる０本発明は全体として、Ｂ型肝炎 抗原を微生物発現系において製造すること、及びその後精製した免疫原分子を、 二次胆汁酸塩を含有する製剤に含有させることに係わる。本発明は特に、Ｂ型肝 炎表面抗原分子を酵母において低温で発現させ、発現した前記分子を精製して、 デオキシコール酸ナトリウムを含有するワクチン製剤に含有させることを教示す る。

元月しと１１− Ｂ型肝炎ウィルス（ｌ（ＢＶ）は、以前“血清肝炎”と呼称され、現在ではＢ型 肝炎として知られている疾病の病原体である。

世界中で２億を越す人々がＨＢＶに持続的に感染していると推定される。米国疾 病管理センターは、米国にはＢ型肝炎の慢性キャリアーが約７０万〜１００万人 存在し、この数が毎年２〜３％（８，０００〜１６，０００人）ずつ増えている と推定している。

Ｂ型肝炎つィルス感染は急性肝疾患の一主要原因であることが知られている。Ｂ 型肝炎ウィルスのキャリアーは、肝硬変、肝広汎壊死、慢性急性肝炎及び肝細胞 症に罹患する危険性が高い。ＨＢＶを伝達する主な伝播体は血液及び血液産物で あるが、涙、母乳、唾液、尿、精液及び膣分泌物中にもウィルス抗原が発見され ている。そのうえ、ＨＢＶは実に安定であり、汚染体液に暴露された環境面上で 何日も生存し得る。感染は、汚染体液によって伝達されたＨＢＶが粘膜面に浸透 し、または皮膚の偶発的もしくは意図的破壊により体内に侵入した場合に起こる 恐れが有る。米国公衆衛生局の免疫診療諮問委員会（ＩＰＡＣ＞は現在、Ｂ型肝 炎病原菌もしくはウィルスに暴露される危険性の高い人（例えば健康管理の専門 家、感染者の性交相手）のために、Ｂ型肝炎ワクチンを用いる暴露前予防法を推 奨している。更に、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に関する試験結果が陽性で ある女性が出産した新生児、及びＨＢＶまたはＨＢｓＡｇ陽性物質に暴露された 人のために、Ｂ型肝炎ワクチンでの能動免疫及びＢ型肝炎免疫グロブリン（ＦＩ ＢＩ［＋＞での受動免疫を用いる暴露後予防法も推奨されている［＾−ｅｒｉｃ ａｎ　Ｈｏｓ　１ｔａｌ　ＦｏｒｍｕｌａｒＳｅｒｖｉｃｅ、　（１９９０）、 　ｐｕｂ、＾５ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　ＨｏｓｐｉｔａｌＰｈａ ｒｍａｃｉｓｔｓ、ｐｐ、１９３１−１９３８］。

ヒトＢ型肝炎ウィルスはゾーン粒子に関係付けられてν）る。この粒子はキャリ アーの血清中に見いだされるもので、臨床的Ｂ型肝炎感染の原因物質として同定 されて０る［本明細書に参考として含まれる国際特許出願公開第［１８７１０１ １２９号及び米国特許第４，９５９．３２３号］。ゾーン粒子は４２ナノメート ル＜ｎｍ）の直径を有する球形膜構造体である。ゾーン粒子は脂質と、ＤＮＡと 、抗原として明確な少なくとも４種の表面及びコアタンパク質成分とから成る。

前記４種のタンパク質成分とは、ＨＢｓＡｇ、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡＨ） 、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ；高感染力との相関関係を示すコア関連の抗原複 合体）、及びＤＮＡポリメラーゼである［＾−ｅｒｉｃａｎ　Ｈｏｓ　１ｔａｌ 　Ｆｏｒｍｕｌａｒ　５ｅｒｖｉｃｅ、　（１９９０）、　ｅｄｓ。

＾ｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｐｈａｒｍａｃ ｉｓｔｓ］、キャリアーの血清中には、ＨＢｓＡｇは含有するが、その他のゾー ン粒子成分はいずれも含有しない脂質粒子から成る直径２２ｎ−の球体も見いだ される［上掲国際特許出願公開第ＮＯ８７１０１１２９号］。世界中で一般に用 いられているＢ型肝炎ワクチンには、将来のＢ型肝炎感染に対する抵抗力をもた らす初回抗原刺激をワクチン接種された人の免疫系に付与するべく、ヒトＢ型肝 炎キャリアーの血漿からか、Ｂ型肝炎ウィルスに感染させた悪性呻乳類細胞系の 培養物からか、または遺伝子操作によってＨＢｓＡｇ遺伝子を発現させた微生物 から単離されたＨＢｓＡｇ含有２２ｎｓ脂質粒子が用いられている。現在、米国 食品医薬品庁（ＦＤ＾）は血漿由来のＢ型肝炎ワクチン、及び組み換えＢ型肝炎 ワクチンのうちのそれぞれ幾つかを国内でヒトに用いることを認可している。そ のうえ、米国内での使用がＦＯ＾によって認可されていない他の幾つかのＢ型肝 炎ワクチンも、世界の他の国々では用いられている０世界中で一般に入手可能な り型肝炎ワクチンは接種された人に、ＨＢＶとその総ての既知血清型（ｔｌＢＶ ｓ；　ａｄｗ、　ａｄｒ；　ａｙｒ、　ａｙｗ）とに起因する感染に対する抵抗 力を付与する。更に、Ｂ型肝炎ワクチンの接種によって、病原体がデルタウィル スである０型肝炎が予防されるはずであり、なぜならデルタウィルスはＨＢｖ感 染の生起下にのみ復製を行なうからである。

しかし、病原体が＾型肝炎ウィルス、非晶非Ｂ型肝炎ウィルス、または肝臓を侵 すことが公知である池のウィルスなど−１−記以外の物質である肝炎は、いずれ のＢ型肝炎ワクチンでもＴ＃できない。

米国で現在入手可能なワクチンは、ＨＢｖ免疫を付与するための接種を長期にわ たって３回実施しなければならない６典型的には、１回目の免疫感１ｔの１力月 後に２回目を行ない、３回目の最後の注射は最初の投与の６力月後に行なうし上 掲静見叶Ｊユ」肢且土口上Ｆｏｒｍ弓１Ｕじ罰ｒｖｉ鱈−］、　Ｈ［ｌＶワクチ ンに対する応答性は、免疫感作される患者の年齢に依存する。

１０歳未満の小児におけるＨＢｓＡｇの血清変換率（感染またはワクチン接種に 応答しての抗体出現を示す尺度）はほぼ１００％である。２０〜３９歳の成人の 場合、血清変換率は９５〜９９％であり、４０歳以上の成人の血清変換率は約９ １％である［Ｐｈ　５ｉｃｉａｎｓ’　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、　（１ ９９０）、　４４ｔｈ　ｅｄ、、　ｐｕｂ。

Ｅ、　Ｂａｒｎｈａｒｔ、　ｐｐ、　１４４１−１４４３］。

Ｂ型肝炎ワクチンの製造に用いられるヒト血漿は、無症候で大きいＨＢＶ価を示 すＨＢＶ感染者の血液から単離され得る。上記のようなキャリアーにおいて典型 的に見いだされるｆ（ＢｓＡｇ濃度は、全血１ミリリツトル当たり約４００マイ クログラム（μｇ／ｌｌ１）である６ヒト血漿の総タンパク質濃度が１リツトル 当たり約６０ミリグラム６ｇ／ｌ）であるので、僅が１５０倍の２２ｎｍ粒子の 精製度が要求されるだけである［Ｃｈａ−ｎｏｃｋ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８４ ）　ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒ ｙ、　Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　ｐｐ、　２ ５１−２５６］、　Ｌがし、（しばしば第１世代ワクチンと呼称される）この種 のワクチンはヒト血漿に由来するので供給が限られる。そのうえ、面清中にヒト 免疫不全ウィルス（Ｈｍなどの、血液によって運ばれる他の感染性汚染ウィルス が存在するがもしれないという理論上の可能性が、上述のような血清由来ワクチ ンが安全であるがどうかについて重大な懸念を惹起する。

米国では、このような懸念にもがかわらず、Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ＆　Ｄｏｈ ｍｅ社によって製造された上述のような血清由来Ｂ型肝炎ワクチンの一種が商品 名”　Ｈｅｐｔａｖａｘ−Ｂ（商標）”の下に販売されていた。しかし、Ｈｅｐ ｔａｖａｘ−Ｂ（商標）はＭｅｒｃｋ社によって自発的に米国市場から回収され 、従ってもはや米国では入手不可能である。

Ｈｅｐｔａｖａｘ−８（商標）製造方法では、ラブドウィルス、ポックスウィル ス、トガウィルス、レオウィルス、ヘルペスウィルス、コロナウィルス、ミクソ ウィルス、ピコルナウィルス、パルボウイルス、並びにレトロウィルス、デルタ 物質及びスローウィルスを含めた動物ウィルスの既知群に加えて感染性Ｂ型肝炎 ウィルス粒子も除去する精製及び不活性化ステップが用いられる。最初の精製は 二重超遠心分離操作によって行ない、続いて三つの連続する不活性化操作、即ち ｐＨ２でのペプシン開裂と、８Ｍ尿素処理と、最後に０．０１２６までのホルマ リン添加とを実施する。精製及び不活性化またＨＢｓＡｇ調製物は、筋肉的注射 に適した懸濁液中に配合する。一般に入手可能なり型肝炎ワクチンは総て筋肉内 に投与するが、筋肉内投与後に出血する恐れの有る患者の場合は皮下投与も許容 可能である。ＨＢｓＡｇは０．６２Ｂ／ｍｌ以下のミョウバン輸１ｕ−）アジュ バント（水酸化アルミニウム）を含有する擬似生理液中に配合する。付加的に、 チメルソル（ｔｈｉ＊ｅｒｓｏｌ）を防腐剤として添加する。血清由来ｌｌＢｓ Ａｇ精製技術の検討には、Ｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅ−仕ｏｄｓ、　ｖｏｌ　彰、　２８３−９４を参照されたい 。

Ｂ型肝炎ワクチンを得る別の方法は、培養した悪性哺乳類細胞系、特にヘパトー マ細胞をＢ型肝炎ウィルスで免疫感作することを含む。このような免疫感作を行 なえば、上記細胞の溶解調製物からｌｌＢｓＡｇを回収することができる［Ｋｎ ｏｗｌｅｓ等の国際特許出願第ＰＣＴ／１Ｉｓ８１１００７７８号］。この方法 はヒト血漿の必要性、即ち感染性汚染物質が存在する可能性を排除するが、ワク チン中に望ましくない腫瘍細胞生成物を用いることと、感染回避に極端な注意を 払わなければならないことと、哺乳類細胞培養物に特有の困難性とのいずれもが この方法の実用性を制限するべく働く。

あるいは他の場合には１組み換え体ＤＮＡ技術が、多数の真核及び原核宿主微生 物での外因性タンパク質産生物の発現を誘導し得る発現媒体の横築を可能にする 。しばしば用いられる真核宿主細胞には、シリヱ五す四！Ｌυ押ユｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅなどの酵母、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＩ　Ｏ）細胞など の哺乳類細胞系が含まれる。外来タンパク質発現の誘導に通常用いられる原核生 物の例には、Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ ｔｉｌｕｓが含まれる。

ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む組み換え体プラスミドでトランスフェクションさせたサ ル腎細胞は、細胞溶解によってがまたは分泌によってＨＢｓＡｇを放出し得る［ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ等のヨーロッパ特許出願第７３　、６５６号］６そのうえ、ラ ットまたはサルの一次肝細胞を、上記抗原を低レベルで発現させる、トランスフ ェクションしたマウスまたはサル細胞系と融合させることによって、）ＩＢｓＡ ｇの高レベル分泌を実現することができる［５ｔｒｅｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　 （１９８８）　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　１ｃａｌ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎ−Ｖａｃ ｃｉｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　ｅｄ、＾ｆａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、 、　ｐｐ、　１５７−１６６］。上記のような細胞系の使用は、ワクチン製剤中 に感染性汚染物質が存在する恐れを軽減すると共に、癌細胞から得た細胞生成物 の使用に関わる懸念を大幅に排除する。

しかし、（キメラであるが、または非融合性の）［Ｉ乳類細胞系の発現生成物と して得られるワクチンは、ワクチン製剤中に少量の望ましくない残留哺乳類タン パク質が存在するのではないかという懸念を生じさせ得、そのようなタンパク質 が存在すると場合によっては、ＨＢｓＡｇで免疫感作した対象において不都合な 免疫原反応が生起する恐れが有る。

即ち、いかなる哺乳類タンパク質も含有しないＢ型肝炎ワクチンが好ましい。

いかなる哺乳類タンパク質も含有しないＨＢｓＡｇ含有Ｂ型肝炎ワクチンの製造 を可能にする一方法に、Ｅ、　ｃｏｌｉなどの原核生物を工学的に処理して抗原 分子を作製するというものが有る。しかし、このような試みでは、細菌において ＨＢｓＡｇが分解され［Ｒｕｔｔｅｒ等のヨーロッパ特許出願第０２０．２５１ 号］、またＨＢｓＡＨが細菌微生物の増殖を阻害する［Ｍｉｙａｈａｒａ等のヨ ーロッパ特許出願第１０５，０４９号］ためにポリペプチド収率が低くなるとい うことが判明している。更に、ＨＢｓＡｇのタンパク質成分は、感染哺乳類細胞 によって産生された場合は通常かなりの翻訳後修飾を受ける。典型的な哺乳類翻 訳後修飾には、特定のポリペプチド配列におけるグリコジル化、並びに場合によ り行なわれるホスホリル化及び／′またはメチル化が含まれる。ヒト血漿の場合 、感染者において産生されるＨＢｓＡｇの約７０〜８０％はグリコジル化される 。哺乳類細胞において上記のような翻訳後修飾を行なう細胞機関は、原核生物に は存在しない、即ち、Ｌｃｏｌｉは、通常ＨＢｓＡｇのタンパク質成分に関連す る炭水化物部分を産生できず、また共有結合させることもできない。

これらの理由から、ワクチンに含有させるのに適したＨＢｓＡｇの製造には、異 種タンパク質を発現させ得る哺乳類細胞系以外の真核細胞系または真核微生物が 好ましく用いられる。形質転換可能な上記真核細胞系には様々な酵母、昆虫細胞 等が含まれる。組み換え体真核微生物において産生されたＰ４合、ＨＢｓＡｇタ ンパク質は上述の翻訳後修飾を受け得る。二のように産生されたＨＢｓＡ４は、 ワクチンを接種された個体において、）ＩＢＶに対抗する初回抗原刺激を付与し て所望の免疫系を創出し得る。現行の組み換えＢ型肝炎ワクチンの総てで用いら れているＨＢｓＡＨタンパク質は酵母において製造され、Ｉ（ＢＹ血清型ａｄｗ に由来する［上掲Ａｍｅｒｉ−硯Ｌ１江江桂上旺−■１４並畦止、　ｐｐ、　１ ９３１〜１９３８］。酵母は好ましい生物であり、なぜなら人間に対して既知の 病原間係を有せず、内毒素及び溶解ウィルスを持たず、かつＧＲＡＳ［安全であ ると一般に認識された（ｌｅｎｅｒａｌｌｙ　ｒｅｃｏｇｎｉ−ｚｅｄ　ａｓ　 ５ａｆｅ）］生物であるからである。

感染個体の免疫系によって侵入異種物質のものであると認識及び同定される可能 性の最も大きいエピトープをもたらすＩＩＢＶの表面タンパク質は、三つの個別 領域ｐｒｅｓ１、ｐｒｅＳ２及びＳを含む）ＩＢＶ大読み取り枠（ＯＲＦ）の翻 訳産物であることが知られている。各ＯＲＦは次のＯＲＦと１枠を成し、また各 ＯＲＦは翻訳開始コドン＾ＴＧで始まる。即ち、上記三つの領域は、（２２６個 のアミノ酸から成り、完全なＨＢｓＡｇ分子を具現する）ポリペプチドＳと、（ アミノ酸２８１個の）ポリペプチドｐｒｅＳ２　＋　Ｓと、（アミノ酸３８６個 の）ポリペプチドｐｒｅｓ１　＋ｐｒｅＳ２　＋　Ｓとの三つのポリペプチドを 規定する。遺伝子工学は本発明で行なうような、ＨＢｓＡｇ産生のためにのみコ ードする様々な微生物発現系の構築を可能にした。

１９８６年にヒトへの使用が認可された（Ｍｅｒｅｋ　５ｈａｒｐ　＆Ｄｏｈ精 ｅ社の）ワクチンＲｅｃｏ諭ｂｉｖａｘ　ＨＢ（商標）は、適当なワクチン製剤 に２２６アミノ酸ＨＢｓＡｇ分子を含有させたものである。

２２６アミノ酸タンパク質Ｓは２４．０００ドルトン＜２４ｋＤ）の見掛けの分 子粟を有する。このワクチンに用いられるＨＢｓＡｇタンパク質は組み換え体酵 母発現系の産物である。タンパク質モノマーが凝集して、感染者の血清がら単離 されるＨＢＳＡｌｌ含有２２０哨粒子より僅かに小さい２０ｎ＋＊球形粒子を構 成する。

Ｂｉｔｔｅｒ等［（１９８８）　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、、　ｖｏｌ、　 ２５．　ｐｐ、　１２３−１４０１は、酵母発現の結果として産生されるＩ（Ｂ ｓＡｇ粒子の大部分が細胞溶解過程の間に集合し得ることを示唆している。血漿 由来のＨＢｓＡｇと、組み換え体酵母発現系由来のＨＢｓＡｇとの広範な免疫学 的比較は、これらのタンパク質がｉｎ　ｖｉｔｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏとの両方で の生物学的アッセイで免疫原応答を引き出すという点で類似することを示す。更 に、分子ｌ　３４ｋＤのポリペプチドｐｒｅＳ２　＋　Ｓも集合して２２ｎｍ粒 子を楕成し、このポリペプチドは免疫原としてマウス及びサルのＨＢｓＡｇタン パク質に等しい［ＥＩＩｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｃａｌ＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ、　ｅｄ、　Ａｒｔｈｕｒ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

Ｉｎｃ、、　ｐｐ、　１２７−１３６］。タンパク質ｐｒｅｓ１　＋　ｐｒｅＳ ２＋　Ｓは、凝集して２２ｎ−球形粒子を構成することはせず、ワクチン調製ｆ ’Ｊｐｒｅｓ２＋ｓやＨＢｓＡｇはど免疫原性でない。Ｓ鋤１ｔｈＫｌｉｎｅ社 も、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ　ＨＢ（商標）に用いられるのと同じポリペプチド産 物から成るＨＢＳＡｌｌを含有する、Ｅｎｇｅｒｉｘ−８（商標）と呼称される 酵母由来のＢ型肝炎ワクチンを製造した［止揚＾ｍｅｒｉｃａｎＨｏｓ　１Ｌａ ｌ　Ｆｏｒｍｕｌａｒ　５ｅｒｖｉｃｅ、ｐ、　１９３２］。Ｅｎｇｅｒｉｘ− Ｂ（商標）も、米国内でヒトに用いることを認可されている。

ワクチンＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ　ＨＢ（商標）及びＥｎｇｅｒｉｘ−８（商標） に用いられる組み換え体ＨＢｓＡＨＢｓＡｇ粒子：ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ で作製される。上記２ワクチンのいずれの場合も、まず無傷の１（ＢｓＡｇ含有 粒子を精製し、得られた粒子をホルムアルデヒドで処理してからミョウバンに吸 収させる。この操作で単離するＨＢｓＡｇは哺乳類以外の宿主細胞発現系の産物 であるので、血漿由来Ｂ型肝炎ワクチンの製造で用いられる、ワクチン接種され た患者に感染する恐れの有る汚染ウィルスを不活性化するべく設計されたプロト コルは不要である。

ＨＢｓＡｇを精製し、かつヒトへの注射に適した緩衝液中でミョウバンに吸収さ せたらチメルソルを添加する。

酵母においてｔ（ＢｓＡｇを含めた組み換え体産物を産生させる現行方法は、酵 母を約２５〜３０℃の温度で培養することを含む。酵母の増殖は、回分または連 続増殖方式で実現し得る。典型的には、培養物をグルコース制限下に増殖させて 、周知の酵母増殖阻害因子であるエタノールの生成を最小限に留める。グルコー ス濃度が０．２〜０．５％より高くなると、好気条件下であっても酸化的代謝が 部分的に抑制され、エタノールが生成する。グルコース制限下での増殖は比較的 高い細胞密度の実現を可能にし、従って組み換え体産物を単位体積当たりより多 量に産生させることを可能にする。

炭素制限条件下で培養したＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて１ワツトル当た り数グラムの組み換え体産物を産生させることを可能にする培地配合について、 Ｆｉｅｓｃｈｋｏ等［（１９８７）　ＢｉｏＬｅｃｈ−ｎｏｌｏ　ａｎｄ　Ｂｉ ｏｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　、　ｖｏｌ、　２９．　ｐｐ、　１１１３−１１２１ ］を参照されたい。この方法では、酵母が細胞エネルギー（アデノシン三リン酸 ＾ＴＰ）を発生するのに用いる一炭素源であるグルコースを培地に、所与の温度 で達成され得る特定の酵母増殖速度を下回る速度で添加する。二のような速度で のグルコース添加は必然的に培養酵母の上記特定増殖速度を低下させ、即ち＾Ｔ Ｐ生成に解糖よりはるかに効率的な酸化的代謝プロセスが用いられることを確実 にする。しかし、酵母の特定増殖速度が０．２〜０．２５ｈ−’を上回る場合は エタノールも生成する。Ｗｏｅｈｒｅｒ等［（１９８１）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌ、　Ｂｉｏｅｎ　、。

ｖｏｌ、垣、　ｐｐ、　５６７−５８１］は、培養操作の間中酵母の呼吸商（Ｒ Ｑ−発生００２モル／消費０２モル）を監視することによってグルコース添加速 度のコンピュータ援用制御を行ない、それによってグルコース添加及び特定増殖 速度をエタノールの集積が回避されるように正確に制御し得ることを述べている 。

酵母において組み換え体タンパク質を発現させることは典型的には、所望ポリペ プチドの調節及び産生に必要なりＮ＾配列を収容するのに染色体外性要素を用い ることを含む。このような発現系では通常、細菌−酵母間の゛シャトルベクター ”が用いられ、このベクターはプラスミドが細菌微生物においても酵母において も外来遺伝子配列を維持し、分泌し、かつ伝搬し得るために必要とする遺伝情報 を有する［Ｂｉｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　。

ｖｏｌ、　１５２．　ｐｐ、　６７３−６８４］。そのうえ、上記のような発現 ベクターは、プラスミドコピー数を大きくする手段として酵母２μレプリコンを 用い得る。あるいは他の場合には、所望の遺伝子配列を酵母の染色体に転位（ｔ ｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ベクターを用いて組み込むことも可能である。酵母 への導入（または転位）後、外来ＤＮＡ配列の発現の調節は、構成的となって酵 母生存中の組み換え体ポリペプチドの連続産生を可能にし得るか、またはｆｌＢ ｓＡｇ遺伝子配列をコードするＤＮＡのＭＲＮ＾合成の開始に必要な何等かの制 御要素の抑制解除もしくは活性化によって実現され得る。抑制解除もしくは活性 化は、温度や光の存在といった環境パラメーターを操作することによって、また は何等かの化合物の追加、変更もしくは削除による培地の変更によって達成し得 る。

先に述べたように、Ｂ型肝炎ワクチンに一般に用いられているような組み換え体 ＨＢｓＡｇは酵母での発現及び酵母がちの精製後、凝集して直径Ｚｏｎｅの球形 粒子となる。この粒子はタンパク質と脂質との両方から成る。典型的には、上記 ＨＢｓＡ４含有粒子は約８０重量％のＨＢｓＡｇタンパク質と、約２０重量％の 酵母由来脂質とを含有する。このような酵母由来のＨＢｓＡｇ含有粒子は免疫感 作された個体において、完全なり型肝炎ウィルス粒子によって誘発されるものよ り高レベルの抗体産生を持続的に実現する［５ｋｅｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、　（ １９８１＞Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２９０．　ｐｐ、　５１−５４］、即ち、 酵母由来）ＩＢｓＡＨのための現行の精製方法では、酵母由来ＨＢｓＡｇの粒子 構造の保存が試みられる。そのために、脂質をタンパク質から、タンパク質−タ ンパク質会合の甚だしい破壊を伴わずに解離させるのに本来有効であると判明し ている非イオン性洗剤がイオン性洗剤に替えて用いられており、なぜならいずれ の洗剤を用いてもタンパク質複合体の解離は惹起され得るからである。例えば、 組み換え体ＨＢｓＡｇの酵母からの抽出に非イオン性洗剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ ０ＯＲを用いることを開示している国際特許出願第ＵＳ８６１０１７０４号を参 照されたい。

ＨＢｓＡｇはヒト免疫感作用のＢ型肝炎ワクチンの免疫原成分として作製するの で、精製したバルクＨＢｓＡｇはヒトへり投与に適した組成物に配合しなければ ならない。この配合は、ＨＢｓＡｇの免疫原性が長期にわたって保たれるように 、即ち凝集タンパク質の構造が維持されるように行なわなければならない。加え て、配合製剤中に存在する賦形剤（製剤に添加される不活性巨大分子）、基剤（ ハプテンを結合させる巨大分子）、アジュバント（サイトカイン生成及び免疫応 答を盛んにする小分子）等は、世界中及び米国内の様々な健康機関及び官庁の対 人投与ガイドラインに合致するものでなければならない。

先に述べたように、２種の組み換えＢ型肝炎ワクチンＲｅ−ｃｏ＋＊ｂｉｖａｘ 　ＨＢ（商標）及びＥｎｇｅｒｉｘ−８（商標）がＦｉｌ＾によって、米国内で のヒトへの使用を認可されている。Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ＆　Ｄｏｈ曽ｅ社及 びＳ餉１ｔｈＫｌｉｎｅ社が製造するこれらのワクチン製剤はいずれも、チメル ソルを含有する許容可能な注射用緩衝液中のミョウバンに結合した酵母由来ＨＢ ｓＡｇがち成る。

米国以外の国々では、上記２ワクチンに加えて他の幾つかのＢ型肝炎ワクチンも 用いられているが、それらは米国では未だ使用を認められていない。

改良増殖培地と、高収率のＨＢｓＡｇ生産のために最適化された培養条件と、好 ましい精製及びアジュバント結合操作とを用いれば、世界中で一般に入手可能な ワクチンより優れたワクチン、即ち免疫系への初回抗原刺激付与をより大規模に 行ない得るＢ型肝炎ワクチン製剤を酵母ての組み換え体ＤＮ＾技術を用いて開発 することができる。

１哩へＬＩＬ 本発明は、）ｌＢｓＡｇ及び胆汁酸塩を含有する、哺乳類への投与に適した新規 なり型肝炎ワクチン・製剤を提供することを目的の一つとする。本発明の一解様 において、胆汁酸塩の量は製剤の約１０〜約３０重量％である。約２０重量％の 胆汁酸塩を含有する製剤が特に好ましい。本発明に従って用いられる好ましい胆 汁酸塩はデオキシコール酸塩、特にデオキシコール酸ナトリウムである。ここに 説明したワクチン製剤は更に、約２〜約１２重量％の酵母起源の脂質も含有し得 る。

本発明の第二の目的は、Ｂ型肝炎に罹患しやすい哺乳類種において感染防御免疫 応答を開発する方法であって、そのような補乳頭に本明細書に開示したワクチン 製剤を投与することを含む方法を提供することである。本発明によれば、上記ワ クチン製剤をヒトに投与することが特に好ましい。

本発明は、ワクチン製剤中に用いたＨＢｓＡｇが組み換え体起源であるという特 徴も有する。組み換え体酵母宿主細胞発現の結果として得られる組み換え体ＨＢ ｓＡｇが好ましく、図１に示したＤＮＡ配列を用いて組み換え体Ｓ、　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅから得られれば特に好ましい［配列番号：１］。

本発明はまた、組み換え体プラスミドを導入された酵母、特に）ＩＢｓＡｇをコ ードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを導入されたＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のために最適化された炭素制限低温増殖条件もその一態様とする。

更に、酵母由来ＨＢｓＡｇをバルク精製する方法であって、ＨＢｓＡｇ発現後の 組み換え体酵母を溶解させてＨＢｓＡｇをコロイド状ケイ酸塩、特に＾ｅｒｏｓ ｉｌ　３８０に結合させ、その後ＨＢｓＡｇを溶離し、イオン交換クロマトグラ フィーと、密度勾配超遠心分離と、特にデオキシコール酸塩で好ましくはデオキ シコール酸ナトリウムである胆汁酸塩を用いるゲル濾過クロマトグラフィーとに 掛けることを含む方法も、本発明の別の一態様である。

加えて、ＨＢＳＡｌｌと、特にデオキシコール酸ナトリウムなどのデオキシコー ル酸塩である胆汁酸塩とを含有する精製バルク組み換え体ＨＢｓＡｇワクチン物 質は、ミョウバンを含有する溶液にバルクワクチン物質を添加し、Ｉ（ＢｓＡｇ をミョウバンに結合させ、過剰な溶液を除去するという方法でアジュバント結合 させることができ、アジュバントを添加したワクチン調製物は非経口投与に適し た緩衝液に再懸濁させる。

パ　の　を 図１は、１（ＢｓＡＨの発現を実現し得るｐＧＰＤ−１（ＨＢＳ＞中に見いださ れる１３８２ｂｐ　ＤＮＡフラグメントの説明図である。この配列は、ｍ１３ｍ ｐ９に由来する１５ｂ、のＤＮＡ（下線を付したｂ　ｐ　１〜１５　）と、ＧＰ （ｌポータプルプロモーターと−ｔｌＢｓＡｇ遺伝子の合成５′断片（＾ＴＧの 上流側に隣接する２６ｂｐを含む）と、ＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡ配列とを 含む。

図２はｐＧＰＤ−１（ＨＢＳ）の制限地図である。

本発明の多数の特徴及び利点は、本発明の実施をその好ましい具体例に照らして 説明する以下の詳細な説明を勘案すれば当業者には明らかであろう。

４ｒ１１ 酵母における高レベルのＨＢｓＡｇ発現を誘導するのに用いる組み換え体ベクタ ーの構築、このＤＮＡ配列を取り込んで形質転換した酵母の高細胞密度増殖を達 成する新規な操作、得られたｌＢｓＡｇを、本明細書に述べたように作製及び精 製した該抗原決定基を含有するＢ型肝炎ワクチン製剤が免疫感作されたヒトにお いてＨＢＶ（総ての既知血清型）に対するより高度の感染防御免疫を引き出し得 るように精製する新規な方法を詳述することによって、本発明の実施を以下に説 明する。

酵母における高レベルのＨＢｓＡ）１発現を達成するために、Ｌ直及び酵母の両 方に由来するＤＮＡ複製起源と、きわめて効率的な酵母プロモーターと、酵母特 異的転写終結／ポリアデニル化シグナルと、選択可能なマーカーとを含むプラス ミドｐＧＰＤ−１を開発した。プラスミド基体（ｐｌａｓｍｉｄ　ｂａｃｋ−ｂ ｏｎｅ）は、ただ一つのＥｃｏＲ１部位に挿入された酵母由来の完全な２μプラ スミド（Ｂ型）を有するｐＢＲ３２２がら成る。この構築は、酵母においてもＥ 、　ｃｏｌｉにおいても安定な維持及び増殖を行ない得るプラスミドをもたらす ９このようなプラスミドは、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＲＨ２１８（内在性 ２μアラスミドの欠失したｃｉｒ”単離体）などの酵母株に形質転換されると自 己増幅挙動を示す。プラスミドが適当な発現系を含んでいれば、上記自己増幅挙 動によって所望の異種産物の合成が促進される［Ｂｉｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　（１９８４）　Ｇｅｎｅ、　ｖｏｌ、　３２゜＋＋１１．２６３−２７４；　 Ｂｉｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７）　ＨｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙ−１０１Ｑ　：　Ｒｅｃｏ輪ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ｐａｒｔ　Ｄ、　ｖｏ ｌ、　１５３．　ｐｐ、　５１４−５４４］。内在性２μプラスミドの欠失した 宿主株を用いることによって、内在性プラスミドと導入された組み換え体プラス ミドとの間で起こる恐れの有る組み換えを回避できる。

外来ＨＢｓＡｇ遺伝子の発現の誘導には酵母ＧＰＤプロモーターを用いた。ＧＰ Ｄプロモーターはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がら単 離した。終結／ポリアデニル化シグナルは、酵母由来のＴＤＨ−３遺伝子がら単 離したものを用いた。酵母Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種タンパク質 、特に本発明で用いる２２６アミノ酸ＨＢｓＡｇポリペプチドの発現に適したＤ ＮＡベクターの構築については先に述べた。

本発明により用いるうえで好ましいＨＢｓＡｇをコードする組み換え体プラスミ ドはｐＧＰＤ−１（Ｉ（ＢＳ）である。上＃ＩＪＢ　ｉ　ｔ　ｔ　ｅ　ｒ　ｅ　 ｔａｌ、、　（１９８４）　Ｇｅｎｅ、及び本明細書に参考として含まれる米国 特許第４，９７７．０９２号を参照されたい。外来ＤＮ＾の酵母への導入を可能 にするべく、形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エ レクトロポレーション、及びごく最近開発された、炎熱処理した微視的［ＩＮ＾ 被覆タングステンベレットを酵母に０．２２径ブランクによって導入する操作を 含めた、当業者に公知の多くの操作が開発されている。即ち、高レベルのｔ（Ｂ ｓＡｇ発現のためにコードする組み換え体プラスミドの酵母、特にＳ、　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅへの導入には上記操作や他の代替操作を用い得る。

形質転換が生起すると、本発明のく１個以上の）組み換え体プラスミドを取り込 んだ酵母は、高い細胞密度及び高レベルの外来遺伝子発現を可能にする十分な栄 養素を提供する培地中で炭素制限条件下に増殖し得る。その際、組み換え体産物 （）ＩＢｓＡｇ）が構成的に発現する。グルコース、グリセロール、ラクトース 、マンノース及びモラセスを含めたきわめて様々な炭素源が酵母によって用いら れ得る。培養は約１５〜３０℃の温度範囲にわたって連続式または供給回分式培 養技術によって実施し得る。そのうえ、１５℃より低い培養温度を用いることも 可能であるが、大型発酵容器内の温度をＩＯ’Ｃより低く維持しようとすれば困 難が生じるがもしれない。培地のｐＨは約４３．５〜７．５であり得る。本発明 では供給回分式培養増殖技術を用いる。

培養完了後、ＨＢｓＡｇを保有する酵母を発酵容器から取り出す。所望の産物が 分泌されていないので、細胞ブイヨンではなく細胞を保存して更に処理する。細 胞を、遠心分離または濾過によって回収する。得られた細胞ペーストを等張緩衝 液中で１回以上洗浄する。その後、細胞ペーストからＩ（ＢｓＡｇを直ちに精製 しても、また細胞ペーストを将来の使用に備えて一２０℃で貯蔵してもよい。

ＨＢｓＡｇの酵母からの精製は次のように行なう。本発明により製造したＨＢＳ Ａｌｌ含有細胞ペーストは、初めに非イオン性洗剤を含有する溶液中に再懸濁さ せ得る。再懸濁細胞を細胞破壊装置に掛けて該細胞を溶解させ、可溶性１（Ｂｓ Ａｇを含めたその内容物を周囲の溶液中に放出させる。細胞が溶解したら細胞溶 解液を、膜と、非溶解細胞と、その他の不溶性物質とから成る細胞破片から遠心 分離によって分離する０次に、清澄になったＨＢｓＡｇ含有溶解液をコロイド状 ケイ酸塩と混合し、該ケイ酸塩にＨＢｓＡｇを吸着させる。吸着後、（今やＨＢ ｓＡｇが結合した）コロイド状ケイ酸塩を溶液から遠心分離または濾過によって 分離する。得られたペレットを数回濯いで、分離を免れて残存しているかもしれ ない未吸着物質を除去する。濯ぎ完了後、ＨＢｓＡｇをコロイド状ゲイ酸塩から 溶離する。得られたＨＢｓＡｇ含有溶離液をイオン交換クロマトグラフィーに掛 ける。カラム流出液を回収し、溜めて濃縮する。この濃縮溶液を、臭化カリウム （ＫＢｒ）を添加してから密度勾配超遠心分離に掛ける０分離した勾配分を分画 する。ＨＢｓＡｇを含有する画分を一つに集め、好ましくはデオキシコール酸塩 、特にデオキシコール酸ナトリウムである胆汁酸塩を添加する。この溶液を、デ オキシコール酸塩の存在下にゲル濾過クロマトグラフィーに掛ける。　ＨＢｓＡ ｇを含有すると判明した溶出画分をプールする。

得られた溶液が、精製バルクＨＢｓＡｇである。

加えて、大規模ＨＢｓＡｇ精製方法も開発されており、この方法は次のように実 施され得る。　ＨＢｓＡｇ含有細胞ペーストを、非イオン性洗剤を含有する溶解 緩衝液中に再懸濁させる。得られたホモジナイズされたスラリー中の細胞を、機 械的剪断応力または高圧に晒すことなどによって溶解させる。溶解液を透析濾過 （ｄｉａｒｉｌｔｒａＬｉｏｎ）によって清澄化する。得られた（ＨＢｓＡｇを 含有する）透析Ｐ液をコロイド状ケイ酸塩と混合して、該ケイ酸塩にＨＢｓＡＨ を吸着させる。

ＦＩＢｓＡｇの吸着したコロイド状ケイ酸塩を濾過によって回収する。次に、Ｈ ＢｓＡｇをコロイド状ケイ酸塩から溶離し、Ｐ遇して得られたｒ液に十分量のア フィニティークロマトグラフィー物質を添加してＰ液中の全ＨＢｓＡｇを吸着さ せる。

得られたスラリーを一過して緩衝液を添加し、結合ＨＢｓＡｇを溶離する。溶離 液を回収し、透析一過し、濃縮する。その後、臭化カリウム密度勾配超遠心分離 を行なう。分離した勾配分の分画後、ＨＢｓＡｇを含有する画分をプールし、好 ましくはデオキシコール酸ナトリウムであるデオキシコール酸塩などの胆汁酸塩 を添加する。得られた溶液をゲル濾過に掛ける。十分に精製されたＨＢｓＡｇを 含有する画分を回収し、プールしたものが、ＨＢｓＡｇを含む２０ｎｍ粒子を含 有する精製バルク調製物である。

本発明に述べるように精製したｆｉｌ（ＢｓＡｇを含む２０ｎｍ粒子を生化学的 に分析したところ、この免疫原性粒子がその重量に基づき約８０％のタンパク質 （ＨＢｓＡｇ）と、約１８％のデオキシコール酸ナトリウムと、約２％の酵母由 来脂質とから成ることが判明した。

５〜２００μｇ／−１の）ＩＢｓＡｇを含有する上記バルク精製物を次に、ヒト への投与に許容可能なアジュバント含有製剤に変換する。得られるワクチン製剤 をヒトに投与するのであれば、ＦＤ＾によって使用を認可されたアジュバントの みを用いるべきである。そのようなＦＤ＾認可アジュバントに、いずれも通常“ ミョウバン”と呼称される水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの二つが 有る。選択したアジュバントをバルク精製ＨＢＳＡｌｌ溶液に添加する。この混 合物を遠心分離に掛け、上清をデカンテーションにより除去する。

得られたペレットを１回洗浄する。洗浄したペレットを、ヒｌ−への投与に適し た緩衝液中に再懸濁させる。あるいは他の場合には、アジュバント添加を、製剤 の遠心分離を要せずに行なうことも可能である。このことは、精製バルク１１［ １ｓＡｇを哺乳類への投与に適した溶液に、最終ｌｌＢｓＡｇ濃度が１キ定のワ クチンに必要な濃度となるように添加することによって達成できる。精製バルク Ｈ［ｌｓＡｇを添加する溶液は、デオキシコール酸塩、特にデオキシコール酸ナ トリウムなどの胆汁酸塩と、ミョウバン、特に水酸化アルミニウムと、適当な生 理緩衝液とから成る。アジュバントを添加し、配合の済んだＨＢｓＡｇワクチン は、認可されたＦｉｌ＾規則にｔＫって包装し、または稀釈してから包装し得る 。こうして、ＨＢｓＡ８を主成分とするＨＢＶワクチンでの患者の免疫感作が可 能となる。

本発明をより詳細に説明するために、以下の実施例を示す、加えて、これらの実 施例は本発明の好ましい具体例を提示するが、本発明の範囲を限定するものでは ない。

Ｘ１目１ 寒ＪＩＪＬＬ ベクター Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで異種遺伝子を発現させるために、酵母ＧＰＤプロモ ーターを選択した。Ｈｏ１ｌａｎｄら［（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、ｖ。

１、　１７．　ｐｐ：　４９００−０７；　（１９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、ｖｏｌ、２５５．　Ｐｐ、２５９６−２６０５；及び（１９８３）　Ｊ、 Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、２５８．　Ｐｐ−５２９１−９９］は、Ｓ、ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に見いだされるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ ゲナーゼをコードする非タンデム式に反復する３種の構造遺伝子の各々を単離及 び配列決定した。ＧＰＤは工業用パン酵母の乾燥型巣の５％までを占め、この酵 素をコードするｍＲＮＡは酵母ポリアデニル化ｍＲＮＡ全量の２〜５％に相当す る［Ｈｏ１ｌａｎｄら、　（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、前出１． ３種のアイソザイムのうちの１種は残りのアイソザイムよりも著しく多量に存在 する［Ｊｏｎｅｓら　、　（１９７２）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、、　ｖｏｌ。

え２．　ｐｐ、　１８５−９］、この最も多量に存在するアイソザイムをコード する遺伝子はｐｇａｐ４９１と呼称される［Ｈｏ１ｌａｎｄら、　（１９７９ａ ）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、　２５４．　Ｐｐ、５４６６−７４］ 、Ｂｉ　ｔｔｅｒら［（１９８４）　Ｇｅｎｅ。

前出］は、この特定のＧＰＤアイソザイム用のプロモーターを単離及び配列決定 した。

本発明で使用するにあたり、まず最初に機能的ＧＰＤプロモーターをｐｐ６ｙ　 ［Ｍｕｓ　ｔ　ｉら、　（１９８３）Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ、２５．　ｐＩ）、　１ ３３　４３］から２．１ｋｂ（キロベース）　Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグ メントとして単離した。このフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製 した後、ゲルから切り出し、ＤＮＡを単離及び精製した０次にＤＮＡをＴ　ａ　 ｑ　Ｔで消化した。消化後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してＧＰＤ プロモーターを含む６５３ｂｐ　（塩基対）フラグメントを他の消化産物から分 離した０次にこのフラグメントを含むゲルの領域を切り出し、フラグメントを溶 離した１次にこのＧ　Ｐ　Ｒプロモーターを含むフラグメンｌ−を、予めＡｃｃ Ｉで消化し且つまだ挿入されていないベクターの再連結を阻止するようにアルカ リホスファターゼで処理しておいたＭ１３ｍｐ９にクローニングした。大腸菌株 ＪＭ１０９で形質転換及び発芽後生長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）後、先に発芽して いた単離プラークからＲＦ（複製型）ＤＮＡを精製した。適正な方向でＧＰＤを 含む（即ちファージのポリリンカー中でＢａｍ８１部位に隣接するＧＰＤ転写開 始部位を有する）ことが認められた産物Ｍ１３クローンからのＲＦ　ＤＮＡを次 いでＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した６アガロースゲル電気泳動後、Ｇ ＰＤプロモーターを含むフラグメントをゲルから切り出し、次いでＤＮＡを単離 及び精製した。

同様にｐ　Ｂ　Ｒ／　２μプラスミド構築物をＢａｍＨｒ及びＨｉｎｄｌＩＩで 消化した。消化したベクターは、電気泳動により３４６ｂｐ　ｐＢＲ３２２イン サートから分離した後、切り出し、単離及び精製することができる。あるいはベ クターがＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉインサートに再連結できないように、 制限産物をアルカリホスファターゼで処理した後、フェノール抽出してもよい。

いずれの場合も得られるベクターＤＮＡ調製物はＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ　 ＧＰＤプロモーター含有フラグメントに連結される。得られるベクターをｐＧＰ Ｄと命名する。

本発明で使用されるＨＢｓＡｇを産生させるために使用される発現ベクターｐＧ ＰＤ−１の構築を完了するために、酵母ＴＲＰ１遺伝子を組み込んだ。ＴＲＰ　 １遺伝子は、形質転換後に選択可能なマーカーを提供すると共に、有効な終結及 びポリアデニル化シグナルを酵母ＲＮＡポリメラーゼＩＩに提供する。使用した ＴＲＰ　１遺伝子は、Ｔｓｃｈｕｍｐｅ　ｒ及びＣａｒｂｏｎ［（１９８０）　 Ｇｅｎｅ。

ｖｏｌ、　１０．　ｐｐ、１５７−６６コにより記載されているように単離及び 精製した８５２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩｒフラグメントであった。先にＡｍ ｅｒｅｒら［（１９８１）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＴｈｉｒｄ 　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ：　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａ ｍ、ｐｐ、１８５−９７］は、く形成されるｍＲＮＡが両方の遺伝子ともセンス 鎖から構成されるような方向即ち５′から３°に向かって）異種遺伝子及び後続 のＴＲＰ　１遺伝子を含む発現ベクター構築において、ＴＲＰ１遺伝子は異種遺 伝子の解読後に有効な転写終結及びボリアデニル化シグナルを提供することを立 証した。

ＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌｌｌ　ＴＲＰＩ選伝子フラグメントの連結に備えてｐＧＰＤ をＢａｍＨＩで消化した後、アルカリホスファターゼ処理し、次いでフェノール 抽出した。

Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで開裂させ、ホスファターゼで処理したベクターと、精製８５ ２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ　ＴＲＰ１フラグメントと、リン酸化Ｂ　ａ　 ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩリンカ−を適量使用して連結反応を行った。こ の連結の結果、Ｇ　Ｐ　Ｄ転写終結シグナルに隣接するＢａｍＨ１部位と、ＴＲ ＰＩ遺伝子の５°のＥｃｏＲ１部位とが再構成された。

しかしながら、ＴＲＰ　１遺伝子の３°のＢａｍＨＩ及びＢｇｌｌＩ部位の５° オーバーハングをアニーリングした結果、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＭの両方のこれ らの認識部位は失われた。連結及び細菌形質転換後、種々のクローンからのプラ スミドＤＮＡを制限解析し、どのクローンがＧＰＤプロモーターに対して適正な 方向でＴＲＰ　１遺伝子を有するプラスミドを含むかを決定した６適正な方向に ＴＲＰｌを念むクローンをｐＧＰＤ−１と命名した。

上述したように、ＨＢｓＡｇは２２６アミノ酸からなるポリペプチドである。こ のポリペプチドをコードする遺伝子はＨＢ　Ｖ血清型ａｄｗゲノムにおいて約１ ４００ｂｐの寸法のＢａｍＨＩフラグメントに組み込まれた［Ｖａ　Ｉ　ｅｎｚ ｕｅｌａら、　（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ、ｖ。

１、２８０．　ｐｐ、８１５−１９］、このＢａｍＨＩフラグメントはタンパク 質の翻訳開始コドンの５°の非コーディングＤＮＡ１２６ｂｐと、３°非翻訳Ｈ ＢＶ　ＤＮ八へ７３ｂｐと、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（クローニングアーチファクト ）２３ｂｐとを含む、ＢａｍＨＩ消化及びアガロースゲル電気泳動によるフラグ メント分離後、ＨＢｓＡｇをコードする１４００ｂｐのフラグメントを切り出し 、ＤＮＡを単離及び精製した。

酵母シャトルベクターＹＲｐ７　［５ｔｒｕｈ　ｌら、（１９７９）　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ、ヱ６．　ｐｐ、１０３５−３ ９１を同様にＢａｍＨＩで消化した。ＢａｍＨＩ消化後、ＹＲｐ７をアルカリホ スファターゼで処理した後、フェノール抽出した９次にＨＢｓＡｇをコードする １４００ｂＰのＢａｍＨｒフラグメントにＢ　ａ　ｍ　ＨＩで開裂させたＹＲｐ ７を連結し、プラスミドｐＨＢｓ八ｇを生成した。非コーディング３°ＨＢＶ及 びｐＢＲ３２２ＤＮＡを除去するために、ｐＨＢｓＡｇを）ｌｐａｌで完全に消 化した後、ＨｉｎｄｌＩＩで部分的に消化した。次にベクターを大腸菌ＤＮＡポ リメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、平滑末端を生成した。次に このＤＮＡ混合物を連結し、ｐＢＲ及びＩ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　３　’非コーディング 配列を欠失するクローンをｐＨＢｓと命名した。

更に、ｐＨＢｓをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化することにより、ＨＢｓＡｇ開 始コドンの５′の非コーディングＨＢＶ　ＤＮＡを欠失させた。この２１８ｂｐ フラグメントは更にＨＢｓＡｇの最初の３２個のアミノ酸のコーディング情報を 含んでいた。このコーディング情報を復元するために、合成り　ａ　ｍ　ＨＩ　 ７”　Ｘ　ｂ　ａ　Ｉフラグメントを生成した。この合成フラグメントのＤＮＡ 配列を図１（配列番号、１）に示す。合成フラグメントは非必須５′非翻訳ＤＮ Ａを除去するのみならず、合成フラグメントの５“非翻訳部分はＡが豊富でＧが 欠乏するように構成され、Ａｍｅｒｅｒら［（１９８’ｌ）前出コによるとこの ような特徴は高度に発現させる酵母タンパク質において有効な翻訳開始に重要で あると確認された。ＡＴＧの５′末端にすぐ近接する２７ｂｐはＨｏ１ｌａｎｄ ら［（１９７９）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、　２５４．　ｐｐ、　 ９８３９−４５］により記載されている５′非翻訳ＧＰＤリーダーに対応する。

更に、アミノ酸コーディング情報を提供する合成りＮＡフラグメントの部分に、 Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎら［（１９８１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ。

２５７、　ｐｐ、　３０２６−３１］により開示されているように高度に発現さ れる酵母遺伝子で優先的に使用されるコドンを組み込んだ０合成りａｍＨＩ／Ｘ ｂａＩフラグメントを含むプラスミドをｐＨＢｓ−２と命名した。

次いでＨＢｓＡｇをコードするフラグメントを単離できるように、ｐＨＢｓ−２ をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　 ＲＩ消化後、サンプルを８１ヌクレアーゼ処理し、平滑末端を生成した０次にＨ ＢｓＡｇをコードする平滑末端を有する８５０ｂｐフラグメント（完全なコーデ ィング配列については図１［配列番号：１コを参照のこと）をアガロースゲル電 気泳動により他の消化産物から分離した。次にＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡを 切り出し、精製した。ｐＧＰＤ−１をＢａｍＨＩで開裂し、同様にＳ１ヌクレア ーゼで平滑末端化した後、ホスファターゼ処理及びフェノール抽出した１次に８ １で平滑末端にしたＨＢｓＡｇをコードする８５０ｂＰフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩで消化し且つＳｌで処理したｐＧＰＤ−１に連結してｐＧＰＤ−１（ＨＢｓ ）を生成し、その後、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＲＨ２１８に導入した。ｐＧ ＰＤ−１（ＨＢＳ）の制限地図を図２に示す。

及１１１ ＨＢｓＡ　Ｂの　。

以下の説明は４００Ｌ容発酵槽を使用する組換えＨＢｓＡｇの製造方法に間する ものであり、該方法ではＨＢｓＡｇ含有発現ベクター（ｐＧＰＤ−１（ＨＢＳ） ）を含むＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｒ）（２１８を約２５℃で炭素制限条件下に培養する。

本実施例に記載する全手順は特に指定しない限り無菌的に実施する。特に指定し ない限り、本実施例中で使用される全滅菌手順は、滅菌しようとする装置又は溶 液を１２１〜１２３℃に３０±５分間加熱することにより実施する。

ＶＭＳ　（酵母最少塩）５００ｍＬを収容する８個の接種用フラスコの各々に、 冷凍グリセロールストックとして保存しておいたＲＨ２１８ｐＧＰＤ−１５００ μｌを接種することにより初期シード培養物を調製する。これらの培養物を次に ３０±２℃で４０〜５０ｖｒ間２７５±２５ＲＰＭで回転振盪機に置く、これら の培養物が約４〜６のＯＤ６゜。に達したらプールし、以下に記載するように予 め準備しておいた４００Ｌ容発酵槽に移す。

シード培養物の増殖に伴って発酵培地を次のように調製する。グルコース３２０ ｇ、イノシトール３．２ｇ及びＩＭ　Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０をＨ３Ｏに溶解させ 、最終容量を３．３３Ｌとする。溶解後、この溶液を滅菌する。冷却後、微量金 属溶液（表１　）４８０ｍＬ、ビタミン溶液（表２）４８０ｍＬ及び濾過滅菌し た１％（Ｗ／Ｖ）チアミン溶液６４ｍＬを加える。

表１：　！ｔＪｉ＊　ｉ’ｌＪＭ 微量金属溶液は、精製Ｈ２０を含む合計ロット容量の約９００６に成分を溶解さ せ、溶解後、所望の最終ロット容量に調整し、０．２μｍフィルターで濾過滅菌 することにより調製する。

表２．　亘≦４ユーイ１Ｌ液− ［ビタミン溶液は、（ａ）精製Ｈ２０の合計ロフト容置の約４　ｏｇ及びＩＯＮ 　ＮａＯＨの合計ロット容量の５．６５±０１９％にビオチン、葉酸及びリボフ ラビンを溶解させ、溶解後、精製Ｈ２０を含む合計ロット容量の５％に調整し、 （ｂ）精製Ｈ２ｏの合計四ツｌ−容量の約２．０％及びＩＯＮ　ＮａＯ，Ｈの合 計ロフト容量の９４．２±０．１９６６にピリドキシン及びナイアシンを溶解さ せ、溶解後、精製Ｈ２０を含む合計ロフト容量の２．５％に調整し、（Ｃ）精製 Ｈ２０の合計ロット容量の約２．０％及びｌ０ＮＮａＯＨの合計ロット容量の０ ．１８８±０．０１９％にパントテン酸を溶解させ、溶解後、精製Ｈ２０を含む 合計ロフト容量の２．５％に調整し、（ｄ）以上３種の溶液を合わせて精製Ｈ２ ０を含む合計ロット容量に調整し、（ｅ）０．２μｍフィルターで濾過滅菌する ことにより調製する。］ 約１４ＯＬの８２０を４０ＯＬ容発酵槽に加える０次にカザミノＷ！１４０４０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２１６０ｇ、（ＮＨ＋）　２Ｓ　Ｏ＊　６００　ｇ及びＤｏｗ 　Ｐ２Ｏ００消泡剤１゜ｍＬを発酵槽に加える。次に発酵槽及びその内容物を滅 菌する。滅菌後、発酵槽の温度調節器を２５℃に設定（発酵槽の内容物を２５± ２℃に保温）する０次に発酵培地３゜３３Ｌを槽に加える。得られた溶液のｐ　 ＨをＨ，ＰＯ，又はＮＨ，ＯＨにより４．５±０．２に調整した（ｐＨ調節器を ４．５に設定）する。通気速度は１６０±１６ｓｌｐｍ（リットル、７分）に設 定し、背圧は０．３４±０．０７バールに調節する。撹拌は初期は２００±２Ｏ ＲＰＭとし、溶存酸素（ＤＯ）増幅器を１００±５％に調節する。

呼吸商（ＲＱ：　生成ＣＯ２モル／消費０２モル）を決定できるように排ガスを 監視する。培養物は初期は培地中でグルコースを消費し、部分的にエタノールに 代謝する。グルコースを完全に消費後、培養物はエタノールが存在する場合には エタノールを代謝する。ＲＱ＜１ならば培養物はエタノールを代謝している。１ ≦ＲＱ≦１．１ならばグルコースは完全にＣＯ□及びＨ，Ｏに代謝されている。

ＲＱ＞１．１ならばグルコースからエタノールへの部分的な酸化が行われている ことを示す、供給培地添加の開始後、エタノールの蓄積を避けるためにＲＱは１ ．１未満に維持すべきである。ＲＱは、ＲＱが所望の範囲になるまで供給培地添 加速度を低下させることにより調節することができる。

グルコース４８ｋｇ、イノシトール３．０ｇ及びＩＭＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ ｚ　Ｏ１’　３５０　ｍ　Ｌを十分な水に加えて熱及び撹拌下に溶解させること により滅菌撹拌供給槽内で供給培地６０Ｌを調製する。完全な溶解後、この溶液 を滅菌する。更に、カザミノ酸９．８４ｋｇ、ＫＨ２ＰＯ４２５７ｇ及び（ＮＨ ４）２３０．　４５０ｇから構成される溶液３０Ｌを調製し、６０±１０分間滅 菌する０両方の溶液を室温に冷却後、濾過滅菌した１％＜　ｗ　／　ｖ　）チア ミン溶液１２９ｍＬ、微量金属溶液６０８ｍＬ及びビタミン溶液６０８ｍＬをカ ザミノ酸含有溶液３０Ｌに加える。十分に混合後、この溶液を供給培地溶液６０ Ｌと結合する。次に供給培地槽を発酵槽に接続する。

発酵の進行に伴ってｐＨを４．５±０．２に維持し、温度を２５±２℃に維持す る。Ｄｏは、空気流、撹拌及び／又は背圧を増加させることにより約５０％飽和 に維持する。

Ｄｏは２５％未満に低下させてはならない、培養物の０Ｄ６ｏｏは４時間毎に監 視する。供給培地は下記表３に示すような流速で加える。

退」し 更に、ＲＱは１時間毎に監視する。ＲＱが１．１を越えたならば供給培地流速を １段階低いレベルに減少させる。

ＲＱが１．１未満であるならば、供給培地流速を１段階上のレベルに増加させる （しかしながら、流速は所与のＯＤ６゜。かどのような値であろうとも表３に示 す値を越えるべきでない）。

８０（ＯＤ、。。く１２０になったら、発酵槽を５〜１５℃に冷却し、供給培地 添加を中止することにより発酵を停止させる。更に、培地容量を推定できるよう に撹拌を停止する。培地の最終容量に関する推定の実施後、２００〜２５０ＲＰ Ｍで撹拌を再開し、発酵槽を限外濾過装置に接続し、密閉系とする。限外ｒ過装 置は１０００００分子量カットオフを有する濾過膜を備える。

次にこの系を使用して培養物をその推定最終容量の５０±５％に濃縮する。この 最初の２倍濃縮後、培養物の推定最終容量を復元するために十分な酵母細胞洗浄 緩衝液（ＹＣＷＢ：　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，０）を加える。この洗浄手順を更に２回繰り返す。最後に、培養物を推 定最終容量の５０±５％に濃縮する。次に濃縮培養物を発酵槽からアリコートと して取り出し、細胞ペースト状に濃縮するためにサンプルバッグを収容するＩＬ 容遠心分離びんに入れる。びんを４±２℃で２０±２分間４０００±２００ＲＰ Ｍで回転させる。上清を廃棄し、細胞ペレットを計量する。計量後、ＨＢｓＡｇ 粒子を精製すべき時点までペレットを一４０℃又は冷却器に保存する。

支１１工 ＨＢｓＡ　の　自・　゛ 以下の説明は４００Ｌ容発酵槽を使用する組換えＨＢｓＡｇの別の製造方法に関 するものであり、この方法ではＨＢｓＡｇ含有発現ベクター（ｐＧＰＤ−１（Ｈ ＢＳ））を含むＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＲＨ２１８を炭素制限条件下で低温 で培養する０本実施例に記載する全手順は特に指示しない限り無菌的に実施する 。本実施例で使用される全滅菌手順は、滅菌すべき装置又は溶液を１２１〜１２ ３℃に３０±５分間加熱することにより実施する。

ＶＭＳ　５００ｍＬを収容する８個の接種用フラスコの各々に凍結グリセロール ストックとして保存しておいたＲＨ２１８ｐＧＰＤ−１５００μｌを接種する。

これらの培養物を次に３０±２℃で４０〜５０時間２７５±２５ＲＰＭで回転撹 拌機におく。これらの培養物が約４〜６のＯＤ６゜。に達したらプールし、以下 に記載するように予め準備しておいた４００Ｌ容発酵槽に移す。

ｄＨ２０１１７±６Ｌを発酵槽に加える。次にカザミノ酸３０３０ｇ、ＫＨ２Ｐ Ｏ４１６２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ＋　４５０　ｇ及びＤｏｗ　Ｐ２Ｏ００消泡 剤１０ｍＬを槽に加える。次に発酵槽及びその内容物を滅菌する。滅菌後、槽を ２５±２℃に冷却し、発酵温度調節器を２５℃に設定する。次に以下に記載する ような濃縮発酵培地を発酵槽に加える。

濃縮発酵培地は、ＩＬの最終容量に達するまでグルコース約２４０ｇ、イノシト ール約２．４ｇ及びＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２０約１１８ｇをｄＨ２０中で結合 することにより調製する。次のこの溶液を滅菌する６溶液をほぼは室温に冷却後 、微量金属類溶液〈実施例２、表１参照＞３６０ｍＬ、１％チアミン溶液４８ｍ Ｌ及びビタミン溶液３６０ｍＬ　（実施例２２表２参照）を加える。混合後、こ の溶液を上述のように発酵槽に加える。

次に、ｐＨ４，５に設定したｐＨ調節器の制御下で発酵槽の内容物をＮＨ，ＯＨ 又はＨＩ　Ｐ　Ｏ、によりｐＨ４，５±０．２に調整する。槽の通気速度は１６ ０±１６ｓｌｐｍ、背圧は０．３４±０．０７バールに設定する。撹拌は２゜Ｏ ±２ＯＲＰＭに設定し、溶存酸素（Ｄ、Ｏ，）増幅器は１００±５％に設定する 。更に滅菌Ｄｏｗ　Ｐ２Ｏ００を発酵槽に追加する。

次にプールしておいたシード培養物を発酵槽に移す。発酵培養物の初期ＯＤ　ｓ ｏｏは約０．１である。呼吸商を計算し、この呼吸商を使用してエタノール形成 を最小にするように供給量を調整する。最初は培養物のＰＨは４．５±０゜２に 維持すべきであり、温度は２５±２℃に維持すべきである６更に、溶存酸素（Ｄ 、Ｏ，）レベルは撹拌、空気流量、酸素流量及び背圧を組み合わせて増加させる ことにより５０％飽和を越えるように維持されるべきである（背圧は１０バール を越えるべきでない）。Ｄ　Ｏｏは２５％飽和を下回るべきでない。光学密度、 Ｒ，Ｑ、及びエタノール濃度は発酵の過程を通して４時間毎に監視すべきである 。

発酵の開始後、供給培地を次のように調製する。撹拌供給槽内で撹拌及び熱の存 在下に最終容量１６０Ｌになるように十分なｄＨ２０にグルコース１２３ｋｇ、 イノシトール７６７ｇ及びＭｇ５Ｏ，・７８２０　８５０　ｇを溶解させること により供給培地１　（ＦＭＩ）を調製する。これらの化合物の完全な溶解後、Ｆ ＭＩを滅菌する。滅菌後、ＦＭｌをほぼ室温に冷却する。１％チアミン溶液３３ ０ｍＬ、微量金属類溶液１５５０ｍＬ及びビタミン溶液１５５０ｍＬを加える。

別の撹拌供給槽内で撹拌及び熱の存在下に最終容量７０Ｌになるように十分なｄ Ｈｚｏにカザミノ酸２５．２ｋｇ、ＫＨ２Ｐ０．　６５７ｇ及び（Ｎ　Ｈ４）　 ２　Ｓ　Ｏ４１１５０ｇを加えることにより供給培地２　（ＦＭ２）を調製する 。全ＦＭ２成分の溶解後、この溶液を滅菌する。

はぼ室温に冷却後、ＦＭ２をＦＭＩに混合する。この供給培地を収容する槽を次 に発酵槽に装着する。

発酵培養物のＯＤ　ｉ。。が０．８に達し、エタノール（Ｅｔ　ＯＨ）濃度が０ ．５８／１未満になったら５０ｍＬ／時の初期速度で供給培地の添加を開始する 。供給速度は表４のスケジュールに従って調節する。

表４：　調節供給速度 ＥｔＯＨ測定が不可能な場合には、次のスケジュールを使用してもよい。

調節供給速度 ５．０以上の０Ｄ６ｏｏに達したら温度設定点を１５℃に下げ、ｐＨ設定点を５ ．５に調節する。ｐＨは５．５±０゜２に維持すべきであり、培養温度は１５± ２℃に維持すべきである。３００Ｌの合計発酵容量が得られたら液体を排出し、 合計培養物容量を２５ＯＬに減少させる。０Ｄｓｏ。

＝９０±５に達してから３０±６時間後、供給培地及び空気／酸素供給を中止す ることにより発酵を終了する。

撹拌を中止し、最終培養物容量を推定する。最終容量を推定後、１２０±２ＯＲ ＰＭで撹拌を再開する。０．１μｍ以上の粒子を排除する濾過膜を備え、発酵槽 に接続され、予め滅菌された閉鎖限外濾過システム（Ｒｏｍｉｃｏｎ）を使用す ることにより、細胞ブロスを元の容量の５０±５％に濃縮する。あるいは、０． ４５μｍの孔径を有する膜を使用するミリボアシステムを使用して細胞ブロスを 濃縮することもできる。濃縮後、予め調製した滅菌５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８， ０の緩衝液の添加により培養物容量を元の容量±５％に増加させる。濃縮及び緩 衝液添加を更に４回実施する。

最後に、細胞ブロスを元の容量の４０±５％に濃縮し、濃縮培養物を発酵槽に戻 す、濃縮培地を１５０±５０ＲＰＭで撹拌する。ＯＤ、。０を測定し、撹拌を一 時的に中断して推定最終濃縮ブロス容量を得る。発酵槽及びその内容物を次に迅 速に冷却する。冷却後、濃縮ブロスをサンプルバッグに分配する。次にサンプル バッグを計量する。計量後、サンプルをＨＢｓＡｇのために処理するまで−４０ 〜−８０℃で保存する。

支１１先 也影ＬＫＬ１１ 以下の実施例は実施例２で製造されるようなＨＢｓＡｇの典型的な精製で使用さ れる手順を説明する。こうして製造されるＨＢｓＡｇはヒトワクチン組成物中で 使用するので、本実施例に記載する手順は最終調製物が無菌で且つ発熱物質を含 まないように実施される。このような手順は一般的であり、製薬業者に知られて いる。特に指定しない限り、精製工程中のいかなる時点でもＨＢｓＡｇ含有溶液 の温度は１０°Ｃを越えるべきでない、更に、特に指定しない限り本実施例に記 載する全混合手順は、溶液の飛散や発泡を最小にし且つ溶液成分の沈降を阻止す るために十分な速度に設定されたＢｒｉｎｋｍａｎホモジナイザーのようなオー バーヘッドミキサーを使用して５±３℃で実施する。

（ａ）ｆｆｌｌｌＬ 実施例２で製造したようなＨＢｓＡｇ含有細胞ペースト４７００＋５０ｇを２× 溶解用緩衝液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ、　１０％ 　［ｖ／Ｖ］グリセロール、０．５％［ｖ　／　ｖコＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ ，ｐＨ８）５０００＋５０ｍＬと結合する０次に注射用蒸留水（ＷＦｒ）を使用 して溶液容量を９９５０±５０ｍＬに調整する。この時点における溶液の容量は １０１００Ｏ０を越えてはならない。溶液温度は、細胞溶液を収容する槽を適当 な温度の水浴内におくことにより５±３℃に維持すべきである。次にオーバーへ ７ドミキサーを使用して細胞ペーストを完全に再懸濁させる。再懸濁後、溶液の ＯＤ　ｓｏｏを３０測定する。平均溶液０Ｄｓｏｏは７５〜１２５にすべきであ る。

再懸濁後、２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基を使用して溶液のｐＨをｐＨ７，９±０．２に調 整する。溶液温度は５±３℃に維持すべきである。この溶液を次にＤｙｎｏ　Ｍ ｉｌｌ（Ｇｆｅｎ　Ｍｉｌｌｓ、　Ｉｎｃ、、Ｍａｙｗｏｏｄ。

ＮＪ）のような細胞破壊装置に通して、細胞を溶解させる。

Ｄｙｎｏ　Ｍｉｌｌボア７流速は３７００＋１００ｍＬ／時、Ｄｙｎｏ　Ｍｉｌ ｌチラーは−２０〜−３０℃に設定すべきである。まず最初に細胞懸濁液を非撹 拌下にＤｙｎｏ　Ｍｉｌｌ撹拌チャンバにポンプ導入する。材料がチャンバ出口 から流出し始めたら軸速度３３５０ＲＰＭ及び撹拌ディスク周速度（ｐｅｒｉｐ ｈｅｒａｌ　ｓｐｅｅｄ）１４ｍ／秒で撹拌を開始する。撹拌の開始後にチャン バがら流出する細胞溶解物の最初の２００±２５ｍＬを収集し、未溶解細胞懸濁 液に戻す。撹拌チャンバから流出する付加的な全細胞溶解物を５±ＩＬのアリコ ートとして水冷収集槽に回収する。細胞懸濁液材料が完全にＤｙｎｏ　Ｍｉ１１ 入口管に流入後、流入ポンプを遮断する。次に入口管を細胞懸濁液容器がら分離 し、１×溶解用Ｍ衝液５００土５０ｍＬを収容する槽に再接続する。再び流入ポ ンプのスイッチを入れ、１×溶解用Ｉｆ衝液が完全に入口管に吸引されるまで運 転させ、完全に吸引された時点で細胞溶解物の収集を停止する。次に各収集槽中 の細胞溶解物の容量を測定する。

（ｂ）　ン＊ｉ−二（（二、− 次に細胞溶解物を以下に記載するように遠心分離により清澄化する。細胞溶解物 をＩＬ容ポリプロピレン遠心分離びんに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＪＳ４．２ｏ− ターに入れる。次にこれらのサンプルをＢｅｃｋｍａｎ　Ｊ６−Ｂ遠心分離機（ チャンバ温度０℃）で４１００±１１００ＲＰで１２０±５分間回転させる。遠 心分離後、上清を注意深くデカントし、プールした後、清澄化した溶解物の最終 容量を測定する。この清澄化溶解物の２５μｌアリコートを取り出し、タンパク 質アッセイにかけて溶液中の合計タンパクｌｉＬ＆有量を決定する。この関連で 有用な１種のアッセイてはサンプルをＷＦＩで１００倍に希釈し、クーマシーブ ルー結合アッセイ（通称Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）に清澄化した溶解物の合計 タンパク質含有量を確認後、この数字に０．７５を乗じ、完全なＨＢｓＡｇ吸着 に必要なＡｅｒｏｓｉｌ　３８０の量を算出する。ミキサーを使用して計算量の Ａｅｒｏｓｉｌを清澄化溶解物に加えて５〜１０分間撹拌する。Ａｅｒｏｓｉｌ の添加が完了したら、５±３°Ｃの冷所で更に８〜１６時間撹拌を続け、タンパ ク質を吸着させる。

吸着手順後、Ａｅｒｏｓｉｌ含有懸濁液をＩＬ容ポリプロピレジびんに移し、Ｊ Ｓ４．２０−ター内でＪ６−Ｂ　（チャンバ温度０℃）に入れて４１００±１１ ００ＲＰで１０〜１５分間遠心分離する。保持されているペレットを乱さないよ うに上清を注意深くデカントする。ペレットを各びんから抽出し、適当な容器内 で結合する。遠心分離後の清澄化溶解物に等しい量のＴＮＥ（２０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ。

１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８）を計り取る０次にタンパク 質を吸着したＡｅｒｏｓｉｌを取り出した各遠心分離びんを少量のこのＴＮＥで 濯ぐ。ペレットを収容する容器と同一の容器内でこれらの濯ぎ液を合わせる。次 にＴＮＥの残量をこの容器に加える。低温室（５±３℃）でこれらのペレットを 再懸濁させる。再懸濁の完了後、混合を更に２０±１０分間続ける。溶液を再び 上述のように遠心分離し、ペレットを保持し、ＴＮＥに再懸濁する。タンパク質 を吸着したＡｅｒｏｓｉｌをＴＮＥで濯ぐこの段階は、上述と同一の手順を使用 して同様に３回実施する。一方、遠心分離段階後、ペレットを再び保持し、溶離 手順にかけ、吸着したタンパク質を遊離させる。

溶離手順は、タンパク質を吸着したＡｅｒｏｓｉｌを含有するペレットを適当な 容器に収集することにより行う。

清澄化溶解物の容量の２倍に等しい溶離用緩衝液（１０ｍ、Ｍ　ホウ酸ナトリウ ム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％［ｗ　／　ｖ　］デオキシコール酸ナトリウ ム、ｐＨ〜９．２５）を計り取る。少量の溶離用緩衝液を使用し、再懸濁すべき ペレットを取り出した遠心分離びんを濯ぐ。これらの溶離用ｌ！衝漬液ぎ液を次 に、予め計り取っておいた溶離用［漬液の残部と共に、ペレットを移した容器に 加える。再び冷蔵室（５±３℃）内でオーバーヘッドミキサーを使用してペレッ トを再懸濁させる。溶液中にＡｅｒｏｓｉｌ塊が認められなくなったら、混合を 続けながらＩＯＮ　ＮａＯＨを使用して溶液のｐＨを９．２５±０．０５に調整 する。

このＰＨ調整後、混合を更に７５±１０分間続ける。

このスラリーをＩＬ容ポリプロピレン遠心分離びんに入れた後、ＪＳ４．２０− ターでＪ６−Ｂ　（チャンバ温度Ｏ℃）内で４１００＋１０１００ＲＰ’２５〜 ３０分間遠心分離する。Ａｅｒｏｓｉｌがら溶離したタンパク質を含有する上清 が形成されたら、この上清を注意深くデカントし、保存する。ペレットを廃棄す る。上清をプールし、この溶液のｐＨを２Ｎ　ＭＣＩにより８．０＋０．１に調 整する。

次にこのＰＨを調整したＡｅｒｏｓｉｌ溶離液の容量を測定し、容量Ａと呼称す る。その後、イオン交換クロマトグラフィーを行うまでこの溶離液を５±３℃で 保存する。

（以下余白） （ｅ）イオン交換クロマトグラフィー ＤＥＡＥセルロースカラムを以下のように調製する。各１０リツトルの出発細胞 懸濁液に対して６７５ｏ±２００ｍ１の床容積を有するＤＥＡＥセルロースカラ ムを準備する。ＤＥＡＥカラム緩衝液は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０ ２％（ｗ／ｖ）メタ重亜＠酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１１Ｍ　ＮａＣ ｌ、ｐＨ８である。カラムは５±３℃の低温室内で操作する。カラム溶出は、分 光光度計において２７５〜２８５　ｎ　ｍ及び１〜２ＡＵＦＳでモニターする。

１．０ｍｖの範囲で速度０１〜０．２ｍｍ／汁にセットしたチャートレコーダー を分光光度計に取り付けてスペクトル吸収を経時的に記録する。カラム床を準備 したら、安定なＵＶ吸収ベースラインが成立するまでＤＥＡＥ緩衝液をカラムに 注入する。ｐ　Ｈ調整されたＡｅｒ。

ｓｉｌ溶出液（ｅｌｕａｔｅ）をＤＥＡＥセルロースカラムに添加する前に、以 下の溶液（各々の温度４±４℃を有する）を以下の式によって計算される量で溶 出用の液に混合する。

ｉ　）ＡＸｏ、００８４＝加えるべき０．５Ｍ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８の容積； ｉｉ）　Ａｘｏ、０２１　＝加えるべきＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の容積 ：及び １ｉｉ）ＡＸｏ、００２１−加えるべき１０％（ｗ／ｖ）メタ重亜硫酸ナトリウ ムの容積。

上記溶液をＡｅｒｏｓｉｌ溶出液に加えたら、ｌ０ＮＮａＯＨまたは２ＮＨＣＩ を使用して溶液のｐＨを８゜０２±０．０３に調整する。また、ＥＤＴＡ、Ｔｒ 　ｉ　５−ＨＣＩ及びメタ重亜硫酸ナトリウムを加える前に、Ａｅｒｏｓｉｌ溶 出液１０リットル当たり約５ＭのＮａＣ１を加えることにより（導電率測定器を 使用して２２±２℃で測定したときの）溶液の導電率を１４．１±Ｑ　、　３　 ｍ　ｍ　ｈ　ｏ　／ｃｍに調整する。

溶液の導電率を調整した後、床表面より上の全てのＤＥＡＥカラムＭ衝液を漬液 し、Ａｅｒｏｓｉ＋溶出液をＤＥＡＥ−セルロースカラムに慎重に添加する。十 分な量の試料を添加したら、例えば試料溶液の表面がカラム床の上面より１０ｃ ｍ以上高くなったときは、カラム流を、先にＤＥＡＥカラムＭＮ液をカラムにポ ンプ注入したときと同じ流速に維持する。溶液表面とカラム床の上面との間に所 望のスペースを維持するように試料を添加し続ける。カラム溶出をＵＶによって モニターする。カラム床容積の約３０？６に等しい初期溶出液（ｅｆｆｌｕｅｎ ｔ）は廃棄する。この時点から、カラムから流出する全ての溶出液を回収し、保 存する。全てのタンパク質含有液をカラムに添加したら、カラムを、カラム床溶 液の１．４倍（±４００ｍ１）に等しい量のＤＥＡＥカラム緩衝液で洗浄する。

全てのカラム溶出液を同じ容器中に回収する。溶出液を回収した後、溶出液は、 濃縮するまで５±３℃で最高１２時間貯蔵し得る。

カットオフ分子量１００，０００ダルトンの２カセツトのポリスルホン膜（Ｍｉ ！ｌ１ｐｏｒｅ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ＰＴＨＫ　００００５）を使用するＭｉ　 ｌ　Ｉ　１ｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ限外濾過装置によって、溶出液を濃縮す る。限外ｒ過装置は、２．０００±５００ｍ１のＤＥＡＥカラムＭＷＩ液を該装 置に螺動ポンプ流速５００±２００ｍ１／分で２回通すことにより、平衡化する と共に空気をパージしておく。濃縮過程の間、全溶液は４±４℃の温度に維持す べきである。濃縮装置の保有容積（膜力セット及びチューブの内部容積）は２５ ０ｍ１を超えるべきではない。溶出液濃縮の間、ポンプ流速（ＦＭ流速＋保持液 （ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）流速）は約１．０００ｒｎｌ／分であるべきであり、こ のうち戸液流速は２８０±５０ｍ１／分であり、保持液流速は７２０±５０ｍ１ ／分である。溶出液量が４．０±０．２リツトル（保有量を含む）に濃縮された ら、濃縮を停止し、濃縮溶出液に４２０．０±０．５ｇ／リットルのＫＢｒを加 え、混合して溶解する６更に、３００±３ｍｌのＤＥＡＥカラム緩衝液中に１２ ６±１ｇのＫＢｒを溶解した溶液を別に調製し、５±３℃で貯蔵しておく。ＫＢ ｒを濃縮溶出液に溶解したら、流速を約５００ｍ１／分（Ｐ液流速１４０±２５ ｍ１／分：保持液流速３６０±２５ｍ１／分）に低減して、溶出液量が１．５± ０．２リツトルに減量されるまで更に濃縮を続ける。この時点で、ポンプ流速を 更に約２５０ｍ１／分（炉液流速４０±６ｍ１／分：保持液流速２１０±９ｍｌ ／分）まで低減する。容積が３５０±１０ｍ１（保有量は除く）になるまで濃縮 を続ける。

この時点で、濃縮されたＫＢｒ含有溶出液を膜力セット系にポンプ流速約２５０ ｍ１／分で５±２分間再循環させる。再循環は、ろ液出口は閉鎖して溶液が保持 液出口のみから流出するようにすることにより可能となる。再循環後、先に調製 したＤＥＡＥカラム榎衝液／漬液　Ｂ　ｒ溶液を使用して限外濾過装置を洗浄す るが、これは、ポンプを停止し、入口チューブを限外濾過装置からＤＥＡＥカラ ム緩衝液／漬液Ｂｒ溶液を含む槽に移すことにより行なう。次いでポンプを始動 し、試料容器中の合計量が６５５〜６６０ｍ１となるまで運転し、最終濃縮溶出 液を得るにの溶液を、ＫＢｒ密度勾配超遠心を実施するまで５±３℃で貯蔵する 。

（ｆ）ｉｆＪＬ呈【」ＬＬ 超遠心処理の準備のため、濃縮溶出液を約１５℃に温める。各６５０ｍ１の濃縮 溶出液に、９０．８ｇのグリセロールを加える。グリセロールを加えた後、試料 の屈折率（ＲＩ）を測定する。これは１．３８９０±０．００３０であらねばな らない。試料のＲＩ測定値がこの値より小さい場合には、要求値が得られるまで ＫＢｒを加えて溶解する。Ｒ■測定値が要求値を超えている場合には、要求値が 得られるまでＤＥＡＥカラム緩衝液を加える。要求されるＲＩが得られたら、試 料の終容積を測定する。次いで試料を４０ｍ１ポリアロマ−Ｑｕ　ｉ　ｃｋ−Ｓ ｅａ　！試験管（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａｎカタログ番号３４２６９９）中に３００ ±０．５ｍｌアリコートとして分配する。試験管中に分配したら、次のように予 め調製しておいたＴ　Ｎ　Ｅ　／　Ｋ　Ｂ　ｒ溶液を試料上に重層する。１０５ ．２±０．１ｇのＫＢｒを４００±５ｍｌのＴＮＥ中に溶解する。このＴ　Ｎ　 Ｅ　／　Ｋ　Ｂ　ｒ溶液のＲＩは１．．３６２０土０．０００２であらねばなら ない、測定値が要求値を超えている場合には、正しいＲＩが得られるまでＴＮＥ を加える。しかしながら、ＲＩ測定値が要求値より小さい場合には、適正値が得 られるまでＫＢｒを加えて溶解する。

重層用溶液が制御された方法で分配されることを確認して試料−上層の界面の乱 れを最小化するため、螺動ポンプを使用して最初は重層用溶液を１〜２ｍｌ／分 の流速で分配する。各試験管において、重層用溶液を試料の上方Ｉｃｍ以上の高 さまで添加したら、ポンプ流速を増大することができる。全ての試験管が充填さ れたなら、それらを密封し、Ｂｅｃｋｍａｎ５０．２Ｔｉローター内に慎重に置 き、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｌ８−５５超遠心機（または等価の装置）に装填する。次 いで試料を４５，０００ｒｐｍ（２４５，０００Ｘｇ）、１５±１℃で１５．０ ±０．５時間遠心する。

試料を遠心している間、試料を試験管から取り出すのに必要な装置を準備するこ とができる。１つ以上の螺動ポンプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＩまたは等価の装 置）を、液体を流速４．ＯＯ±０．０４ｍ１／分で分配するように較正する。更 に、Ｇ１１ｓｏｎ　Ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒフラクション澗コレク ターまたは等価の装置を、各較正螺動ポンプと接続してセットする。コレクター は、フラクションを０．５分間隔で回収するようにセットする。

各試験管から２０〜２１個のフラクションが回収される。

■試験管当たり２０個のフラクションを回収するのであれば、最初の１９個はそ れぞれ２．００±０．０２ｍ１を含む。

１試験管当たり２１個のフラクションを回収するのであれば、最初の２０個はそ れぞれ２．００±０．０２ｍ１を含む。

いずれのケースでも、最終フラクション（フラクション２０または２１）は２ｍ １未満を含み得る。

超遠心が完了したら、試料を含む試験管をローターから慎重に取り外し、垂直に 置く、試料の取り出し／分画化処理の問、試料は１５〜３０℃に維持することが できる。一旦ポンプ及びフラクションコレクターをセットしたら、各超遠心管の 頂部を慎重に取り外ず。次いで、Ｐｉｐｅｔｍａｎ　Ｐ２Ｏ０（Ｇｉｌｓｏｎ） 自動ピペッタ−または等価の装置を使用して各遠心管から４００±２０μｍを慎 重に取り出す。この４００μｍは、試験管の頂部から溶液のみを取り出すように ピペットの先端を液体表面のすぐ下に入れることにより取り出す必要がある。各 試験管がら得たこの最初の４００μｍは、その試験管における最後のフラクショ ン容器（２０または２１）内に入れる。各試験管内の残りの溶液は、１００μＩ 　Ｄａｄｅ毛管ピペット（または等価の装置）を、較正螺動ポンプの流入チュー ブに取り付けることにより上から取り出す、ピペットを遠心管の頂部にある開口 内に、更に管内の液体中に、管の底部に達するまで慎重に挿入する。そうしてポ ンプを始動させる。液体がポンプの流出チューブから現れそうになったときにフ ラクションコレクターを始動させる。遠心管から全てのフラクションを回収した ら、それらは５±３℃で保管すべきである。１つの特定の管において２１個のフ ラクションが回収された場合にはフラクション２０及び２１をプールする。

上述のごとく各管を分画化したら、種々の管から得た同じ番号のフラクションを 全て混合する。混合したフラクション１０〜２０を、ＨＢｓＡｇの存在及び全タ ンパク質含有量について２度ずつアッセイする。ＨＢｓＡｇアッセイ用の希釈液 を作るため、初期ＨＢｓＡｇ濃度は８００μｇ／ｍ＋とする。ＨＢｓＡｇ及び全 タンパク質の両アッセイのだめに各フラクションから取り出し希釈液を作るのに 使用されるアリコートは、２０　ｔｔ　Ｉを超える必要はない、ＨＢＳΔｇアッ セイは、市販のイムノアッセイ（Ａｕｓｚｙｍｅ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を使用して実施する。全タンパク質アッセイは、上述の Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって実施する。各混合フラクション（１０〜２０ ）についてＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ及び全タンパク質濃度が得られたら、各フラクショ ンの比活性を計算することができる（ＨＢｓＡｇｆ４度［μｇ／ｍｌ］−＋−全 タンパク質濃度［ｔｔｇ／ｍ　１　］）、１ｉＢｓ八ｇ４度がへ３０μｇ／＋ｎ 　１以上であって比活性が０．２以上であるフラクションをプールし、容積を測 定する。これらのフラクション中に存在するＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの合計μｇをｘ １算する。

（ｇ）ゲル゛過クロマトグラフィー 精製処理の次のステップは、Ｓ−４００カラム緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ト（ ＣＩ、１３５ｍＭＮａＣｌ、０゜２１°６［Ｗ／Ｖ］ナトリウムデオキシコレー ト、ｐＨ８゜２〜８．５）で予め平衡化しておき直列に並べた３つの５ｅｐｈａ ｃｒｙｌ　Ｓ−４００カラム（各々１３ｃｍＸ５０ｃｍ）によるゲル濾過クロマ トグラフィーを含む、Ｓ−４００カラムは５±３℃の低温室で操作ずべきである 。カラム流速は、８０±５ｍ１／時を分配するように較正された螺動ポンプをカ ラム流入チューブに取り付けることにより制御する。カラム溶出液は、分光光度 計において２７５〜２８５ｎｍ及びＩＡＵＦＳでモニターする必要があり、測定 値は、チャートレコーダーによって１０ｍｖの範囲で０゜１　＝　０　、２　ｍ 　ｍ　／分の速度で記録する必要がある。Ｓ−４００力ラムＭ衝液をカラムに、 安定なＵＶ吸収ベースラインが成立するまで注入し、成立時点でポンプを停止す る。

自動フラクションコレクターを、カラムから１３．０±０゜３ｍｌの溶出フラク ションを回収するようにセットする。

プールしたＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを含む密度勾配フラクションをカラムに添加する 前に、ＨＢｓＡｇ試料容積の０．０１に等しい員のＷＦＩ中１０％ナトリウムデ オキシコレート（Ｗ７・’ｖ）をＨＢｓＡｇ含有溶液に加える。この溶液の新た な容積を記録する。このナトリウムデオキシコレ−）／ＨＢｓＡｇ含有溶液をＳ −４００カラムに流速８０±５ｍ１／分で添加する。溶出液のモニタリング及び レコーディングも開始する。カラムから溶出した最初の２５０±２０　＋ｎ　Ｉ は捨て、それからフラクション回収を開始する。２００個の１３±３ｍｌのフラ クションを回収する。Ｓ−４００カラムから溶出すべき第２ＵＶ吸収ピークは、 フラクション１００〜１２０の間に中心があるはずである。実際のピーク中心を 与えるフラクションの位置を決定し、そのフラクションの両側の１７個のフラク ションを保持する。これらのフラクションの各々から取った７μｌを、銀染色に よる５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。更に、各フラクションにおけるＨＢｓ Ａｇ及び全タンパク質含有量もアッセイする。かかるアッセイにおいて、ＨＢｓ Ａｇ濃度は３００μｇ／ｍ＋であり、全タンパク質濃度は４００μｇ／ｍｌであ ると推定し得る。このアッセイには、各フラクションから５０μｍ以下を取り出 せばよい。節約のため、１つおきのフラクションにのみアッセイを実施してもよ い、そのときは、実際にはアッセイしなかったフラクションにおけるタンパク質 濃度値を導出するために補間法を使用することができる。アッセイが完了したら 、各フラクションの比活性（ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ濃度［μｇ／ｍ　ｌ　］十全タン パク質濃度Ｅμｇ／ｍ＋］）を計算する。

ＨＢｓＡｇ濃度が２０μｇ／ｍ＋より大きくて比活性が０．４より大きいフラク ションを、風袋重量を量っである透明な容器内にプールする。フラクションをプ ールした後、容器を再び計量し、プール材料の正味重量を決定する。この材料の アリコートを取り、Ｌ　ＯＷ　ｒｙタンパク質アッセイを実施する。［、ｃ）　 ｗ　ｒｙアッセイによって決定されたタンパクｖＩ濃度が１００μｇ　／　ｍ　 Ｉより小さいならば、これは精製バルクＨＢｓＡｇを与えるので、この材料にこ れ以上行なうべきことはない。しかしながら、タンパク質濃度が１００μｇ／ｍ ｌを超えているならば、タンパク質濃度を１００μｇ　／　ｍ　１に調整するの に十分な量のＳ−４００カラムＷｉ衝液を加え、この時点でこの材料は精製バル クＨＢｓＡｇを与える。精製バルクＨＢｓＡｇは、使用するまで５±３℃に貯蔵 する。

えｔＬｆｌｉ 別のＨＢｓＡｇ精製方法 以下の実施例では、実施例２で製造したＨＢｓＡｇの典型的な大規模精製に使用 される工程を記述する。このように製造されたＨＢｓＡｇはヒトワクチン製剤化 に使用されるので、本実施例に記載の全ての工程は、調製物が無菌で且つ発熱物 質非含有であることを保証するように実施される。かかる工程は、医薬製造分野 において一般的であり、当業者にはよく知られている。特に記載しない限り、精 製処理の間にＨＢｓＡｇ含有溶液の温度が１０℃を超えるべきではない。

（ａ＞！ｆｆｌｌＬＬ ＨＢｓＡｇ（＋）酵母細胞培養物を遠心によって回収し、２３．０七〇、５ｋｇ の新たに調製したかまたは凍結しておいた細胞ペーストを、５±３°Ｃに維持し た２０±０．５リットルの再懸濁＃ｌｌ液液５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８，０）中に再懸濁させる。或いは、培養物を濾過によって回収す る場合は、３２．５±０．５ｋｇの細胞ペーストを１０リツトルの再懸濁Ｍ階液 中に分散させる。

４Ｍ胞ベーストの再懸濁は、オーバーヘッドミキサーを使用して実施する。一旦 細胞ベース１〜が完全に再懸濁したら、溶液のＯＤ　６ｏｏを測定し、再懸濁Ｍ ｌｒＩＩ液を更に加えることによりＯＤ６゜０の値を約１１０に調整する。次い で溶液の容積を測定し、再懸濁細胞溶液の容積の１０％に等しい量のグルセロー ルを加える。次いでＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（登録商標）を終濃度０．５％ま で加える。得られた溶液のｐＨをＩＯＮ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使用し て７゜９±０，２に調整する。

Ｄｙｎｏ　Ｍｉ　Ｉ　Ｉ　ＫＤ−５（Ｇｌｅｎ　Ｍｉ　Ｉ　Ｉｓ。

Ｉ　ｎｃ、、Ｍａｙｗｏｏｄ、ＮＪ）を流速３０リットル／時で使用することに より細胞を溶解する。回収した最初の３．０００±２５ｍ１は、細胞懸濁液のま だ溶解していない両分に戻す、以降の回収から細胞溶解物を得る。最後の細胞懸 濁液がＤｙｎｏ　Ｍｉｌｌに入ったら、更に２．５±０．５リツトルの溶解＃１ ．衝液を槽に加える。最後の溶解緩衝液が装置内に入ったら、溶解物の回収を停 止する。

（ｂ）Ｌ？ＲＩ Ａｍｉｃｏｎ　ＭＰＤ−１００濾過装置及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＰｒｏＳｔａ ｋ　Ｍｏｄｕｌｅを使用して限外−過／透析沢過することによって溶解液を清澄 化する。装置は、２０平方フイートの０．６５μｍ膜を含んでいる。

濾過プロセスにおいて、溶解液を当初容積の５０±５％まで濃縮する。濃縮Ｐ液 を回収し、その温度が１５℃を超えないようにする。、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８からなる細胞洗浄Ｍ清液を、溶解液が当初容 積に回復するまで保持液に加える。濃縮を繰り返し、希釈及び濃縮を更に２回繰 り返す。４回の濃縮で得られたＰ液を混合し、清澄化溶解液を得る。

（ｃ）吸」し 上記清澄化処理に続き、清澄化溶解液１リツトル当たり・１０ｇのコロイド状シ リケートＡｅｒｏｓｉ！　３８０を５〜１０分間かけて加える。完全な混合を保 証するためにＡｅｒｏｓｉｌ添加の間ずっとオーバーヘッドミキサーを使用する 。５±３℃で更に８〜１６時間混合を続行する。

この精製工程に使用される全ての混合処理は、溶液成分の沈降を防ぐのに十分な 速度のものである。しかしながら、使用する混合速度は、溶液の飛散及び気泡を 最小限しか惹起しないものである必要がある。

次いで、各々が１８インチ×１８インチの大きさの７つのプレートと６つのフレ ームからなり９００ｇのＣｅ　Ｉ　ｉｔｅ　５３５濾過助剤で予め被覆されたＶ ａｌｌｅｙ　Ｆｏｕｎｄｒｙフィルタープレスを使用し、Ａｅｒｏｓｉ１３８０ に吸着したＨＢｓＡｇを未吸着のＨＢｓＡｇから分離する。１，０００ｇのＣｅ １ｉｔｅ　５３５をＨＢｓＡｇ、’Ａｅｒｏｓｉｌ　３８０溶液中に混合する。

次いでこの（ｇＦ＆をフィルタープレスに流速１５ガロン／分で注入するが、プ レス内の圧力は７５ボンド／平方インチを決して超えないようにする。この分離 処理は室温（２２土５℃）て実施することができる。回収したＰ液は捨て、ベレ ット化した材料は、Ａｅｒｏｓｉｌ　３８０を添加する前の清澄化細胞溶解液に 等しい容積（±１００ｍ１）までのＴＮＥ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ ０ｍＭ　ＮａＣｌ。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐ’Ｈ８）中に、ミキサーを使用して室温で完全に再懸濁さ せる。溶液を更に２０土１０分間混合フィルタープレスを９００ｇのＣｅ１ｉｔ ｅ　５３５で再び被覆し、溶液をプレスに流速１５ガロン７／分で通す。

ここでもＰ液は捨てる。ペレットを適当な容器に移し、コロイド状シリゲートを 加える前の清澄化溶解液の容積（±２００ｍ１）に等しい容積の室温のＡｅｒｏ ｓｉｌ　３８０溶出緩衝液（１０ｍＭ　ホウ酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、０ ．２５％［ｗ　／　ｖコナトリウムデオキシコレート、ｐＨ〜９．２５）中に再 懸濁させる。ベレットが完全に再懸濁したら、ＩＯＮ　ＮａＯＨを用いて溶液の ｐＨを９゜２５土０．０５に調整する。室温で更に１６〜２４時間混合する。次 いでこの溶液をＣｅ　ｌ　ｉ　ｔｅ被覆フィルタープレスにもう一回流速１５ガ ロン／分で通し、今回は、溶出ＨＢｓＡｇを含むＰ液を保持する。２ＮＨＣ１を 使用して溶液のｐＨを８．０±０．１に調整し、溶液の容積を記録する。次いで Ａｅｒｏｓｉ！溶出液のｐＨ条件及びイオン強度を、この溶液を加えるＤＥＡＥ セルロースのそれと整きするように調整する。２２土２℃で測定したときの溶液 の導電率を、５Ｍ　ＮａＣ１を加えることにより１４．３土０．３ｍｍｈｏ／ｃ ｍに調整する。溶液の容積を記録し、５±３°Ｃで貯蔵する。

（ｅ）イ　ン・六　クロマトグラフィー２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、５ｍＭ　 ＥＤＴＡ、１１０〜１２０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０２％＜ｗ／ｖ）メタ重亜硫酸 ナトリウム、ｐＨ８からなる樹脂緩衝液で予め平衡化しておいたＤＥＡＥセルロ ース樹脂を、ｐＨ調整しＡｅｒｏｓｉｌ　３８０溶出したＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ含 有溶液１リフドル当たり１６ｋｇの量で加える。全てのＤＥＡＥセルロース樹脂 が均一に分散するまで溶液を５±３℃で混きし、この時点から更に１時間撹拌す る。次いて得られたスラリーを、各々が蛎動ポンプに接続された２つの平底のブ フナー漏斗（Ｂｅｌ　Ａｒｔ−Ｈ１４６２１，内径１８インチ、深さ１１．５イ ンチ、または等価の器具）に流し込む。溶液を漏」に、漏斗内の液体レベルが樹 脂床の上面に達するまで流速５リットル／分で注入する。ＤＥＡＥセルロース／ ）［ＢｓＡｇ含有スラリーを、当初溶液の全てが２つの漏斗の一方に添加され、 溶液レベルが樹脂床の上面まで下がるまで加え続ける。ＤＥＡＥセルロースを加 える前のＨＢｓＡｇ（＋）溶出液の容積の３０％に等しい容積の樹脂ｙｉｆｌＩ 液を等しく分け、２つの漏斗の各々に注ぎ込む。この溶液を、樹脂床が乾燥する まで５リットル／分でポンプ注入する。この溶液を先のＰ液と一緒にプールし、 容積を測定する。

ＤＥＡＥセルロース精製溶液を、２５±１リツトルのＤＥＡＥカラム緩衝液を流 速３ガロン／分で通すことにより平衡化しておいたＡｍ１ｃｏｎ　ＭＰＤ−１０ ０限外濾過装置及び１つのＲｏｍｉｃｏｎ中空ファイバーカートリッジを使用し て限外濾過及び濃縮する。使用する溶液の温度は１５°Ｃを超えるべきではない 。装置にＤＥＡＥセルロース精製材料を添加した後、溶液を装置に流速７ガロン ／分（Ｐ液流速は１．０００±１００ｍ１／分）で、溶液が６０±２リツトルに 濃縮されるまでポンプ注入する。４±３℃に冷却した６０±２リツトルの濃縮透 析濾過緩衝液（ＣＤＢ：１０ｍＭ　ホウ酸ナトリウム、６ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｏ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１１１ｍＭ　ＮａＣ１，０゜０２％メタ重亜硫酸ナト リウム、ｐＨ７，５）を保持液に加え、溶液を再び６０±２リツトルまで濃縮す る。この操作を更にもう一回繰り返し、保持液の容積が２０±１リツトルになる まで濃縮を続ける。保持液１リツトル当たり４２０．０±０．５ｇの臭化カリウ ム（ＫＢｒ）を加える。溶液を室温で、全てのＫＢｒが溶解するまで混合する。

保持液の容積が１００±１リットルになるまで流速５ガロン／分で溶液を濃縮し 続ける６温度を１０±５°Ｃに維持するために濃縮溶液は氷上に置く６ボンブ流 速を約３．０ガロン／分に低減する。保有量（ｈｏｌｄ−ｕｐ　ｖｏｌｕｍｅ） を除き、保持液の容積が１．５リツトルになるまで濃縮を続ける。溶液を５±２ 分間装置に再循環してもそれ以上は濃縮されない。保持液を装置から流速１ガロ ン、７分でポンプで汲み出し、保有分を保持液と混合する。ＫＢｒを含むこの濃 縮溶液を５±３℃で貯蔵する。

（ｆ）【（苑１糺ｌ（ 濃縮溶液のｐＨを１．　ＯＮ　Ｎ　ａ　ＯＨを使用して９．０±０１に調整する 。溶液の総容積を測定し、］、　ｍ　ｌ当たり０１４ｇのグリセロールを加える 。グリセロール添加後の新たな容積を記録し、ＩＯＮ　ＮａＯＨを使用してｐｉ −１を９．０±０．１に再調整する。溶液の屈折率（ＲＩ　）は１゜３８９０± ０．００３０であるべきである。溶液のＲＩ測定値がこの値より小さい場合には 、所望の値が得られるまでＫＢｒを加えて溶解する。ＲＩが１．３８９０±０． ００３０より大きい場合には、適正なＲＩが得られるまでＤＥＡＥ樹脂緩衝液を 加える。許容範囲内のＲＩ値を得るためにＫＢｒまたはＤＥＡＥ樹脂ＩＩ衝液の 漬液れかを加える必要があった場合には、溶液の新たな容積を測定し記録する。

溶液は、使用するまで５±３℃で貯蔵する。

５．０００±５０ｍ１のＴＮＥＩ衝液の漬液をｌ０ＮＮａＯＨを使用して９．０ ±０．１に調整することにより、ＫＢｒ密度勾配超遠心に使用する重層溶液を調 製する０次いで溶液に１，３１５．０±１．０ｇのＫＢｒを加え、Ｒ７を測定す る。ＲＩが１．３６２０±０．０００２を超えている場合には、溶液のＲＩが所 望の範囲内になるまでＴＮＥ榎衝液漬液える。ＲＩが指定値より低い場合には、 正しいＲ１値が得られるまでＫＢｒを加えて溶解する。この重層溶液を使用し、 遠心の間に試料を重層することのほかに、密度勾配系から空気を取り除く。ｋ− ３超遠心ローター（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）を脱気し、１０．０ ００回転、″分（ｒｐｍ）で遠心した後、濃縮ＫＢｒ含有試料をローターの底部 に流速５リットル／時でポンプ注入し、重層溶液を上向きに変位させる。５００ ±１００ｍ１の試料を添加したら、ポンプ流速を１０リットル／時に増大する。

試料添加の間、ローター内に気泡が導入しないよう最も注意を払う必要がある。

添加したら、生成物含有試料を３５゜０００ｒｐｍに加速し、８±０．５時間遠 心する。ローターをＯｒｐｍに減速すると、ローターは緊縮（ｃ　ｏ　ｎ　ｔ　 ｒａｃｔ）Ｌ、試料の一部を強制的に外に出す。この溶液を回収し、ローター緊 縮画分（ｒｏｔｏｒ　ｃｏｎｔｒａｃＬｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ、ＲｃＶ）とラベ ルする。ローターが停止したら、ローターに添加するのに使用したポンプを反転 させ、ローターの内容物を１００±２０ｍ１フラクションで回収する。これらの フラクションを５±３℃で貯蔵する。各フラクションから試料を取り、全タンパ ク質含有量、ＨＢｓＡｇ含有量についてアッセイし、比活性を計算する（［μｇ 　ＨＢｓＡｇ／ｍｌ］、’［、ｃｚｇ　全タンパク質／ｍｌ］）、約ｉ３０．ｕ ｇ／ｍ＋以上のＨＢｓＡｇを含んでおり比活性が約０．２より大きいフラクショ ンをブールし、この溶液のＰＨを２Ｎ　ＨＣＩを用いて８．２±０．１に調整す る。

（ｇ）ゲル　゛クロマトグラフィー 次に、プールしたフラクション試料をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけ る。ゲル濾過の前に、０．２１％Ｗ　／’　Ｖのナトリウムデオキシコレートを 試料に加える。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１３５ｍＭ　ＮａＣ１，０゜２１ ％（Ｗ／Ｖ）ナトリウムデオキシコレート、ｐＨ８゜５で平衡化しておいた５ｅ ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、５±３℃に置いた 適当な大きさのカラムに加える。カラム流入口に接続した螺動ポンプによって調 節されるカラム流速は４００±４０ｍ１／時である。カラムからの溶出液を２７ ５〜２８０ｎｍで連続的にモニターする。溶出液吸収ベースラインが安定化して から、ＨＢｓＡｇ含有調製液をカラムに添加する。６．０±０５リツトルを溶出 させると、各々が約２００ｍ１を含む７５個のフラクションが回収される。クロ マトグラフィー実施の間、紫外光吸収物質の第２溶出ピークはフラクション５５ 〜７０の間に存在するはずである。この吸収ピークの中心を与えるフラクション の前後に回収される１７個のフラクションを保存する。これらのフラクションの 各々を全タンパク質及びＨＢｓＡｇ含有量についてアッセイし、比活性を計算す る。２０μｇ　／　ｍ　１以上のＨＢｓＡｇを含んでおり比活性が０．４を超え ているフラクションをプールするにの材料を５土３℃で貯蔵する。これで精製バ ルクＨＢｓＡｇを得たことになり、ＨＢＶワクチン製造に使用することができる 。

え１１１ ＨＢｓＡｇ粒子分析 実施例４で得られた高度に精製されたＨＢｓＡｇ粒子の脂質定量分析を以下のよ うに実施した。実施例２に記載のごとく製造した精製ＨＢｓＡｇをまず水に対し て３日間の長時間にわたり透析した。透析後、試料中に存在するエルゴステロー ル、中性脂質の量を測定した。０．６ｍｌの氷酢酸中にＯ〜８０μｇのエルゴス テロールを含む標準溶液を調製した。かかる溶液の各々に０．４ｍｌの塩化第二 鉄試薬を加えた。塩化第二鉄試薬は、濃硫酸２１ｍ１を、２０ｍ１の水中に５０ ０ｍｇの塩化第二鉄を含む溶液４ｍｌと混合することにより調製した。次いで標 準溶液を混合し、３０分間放置してから、５５０ｎｍにおける吸収を測定して標 準曲線を作成した。精製及び透析したＨＢｓＡｇ調製液の試料を同じものを３つ ずつ分析した。調製液の１ｍｌアリコートを高速真空濃縮器において蒸発乾固し た。各ベレットを０．６ｍｌ氷酢酸中に再懸濁させた。ベレット溶解後、０．４ ｍｌの塩化第二鉄試薬を各試料に加えた。試料を十分に混合し、室温で３０分間 インキュベートした。

５５０ｎｍにおいて吸収測定する直前に、試料を簡単に遠心して全ての粒子をベ レット化した。結果は、出発タンパク質１μｇ当たり平均０．０６３μｇのエル ゴステロールを示した。この結果は、遊離及びエステル化の両方のエルゴステロ ールを含んだものである。

調製液試料から全脂質を抽出し、存在する中性及び極性脂質のタイプ及び相対量 を決定した。これは、１容積の精製及び透析酵母誘導ＨＢｓＡｇと、２．５容積 のメタノールと−１，２５容積のクロロホルムとを混合することにより行なった 。この溶液を２分間激しく混合した。更に１゜２５容積のクロロホルムを加え、 溶液を更に３０秒問混合した。最後に、１．２５容積の水を加え、更に３０秒間 混合した。次いで相を分離させ、クロロホルム及び抽出脂質を含む下相を回収し た。

この脂質含有有機相を、比が６０：４０：１：１のヘキサン、エチルエーテル、 酢酸及びメタノールからなる溶出液を使用したシリカゲル（直線状高速）ＴＬＣ ブレーｌ−における薄層クロマトグラフィーによって調査した。試料移動が完了 した後、プレートを乾燥した。次いで、プレートに１ＯＮ［酸を噴霧することに より、中性脂質を可視化した。

反射モードのＳｈｉｍａｄｚｕフライングスポットデンシトメーターを使用して プレートを走査した。得られた結果から、エルゴステロール、）・リグリセリド 及びエルゴステロールエステルがそれぞれ１５．８：１０．１　：４５．３の比 で存在することが明らかとなった。即ち、酵母誘導ＨＢｓＡｇｉＮｉ製物中の中 性脂質物中２２％のエルゴステロール、１４％のトリグリセリド及び６４％のエ ルゴステロールエステルからなる。

出発タンパク質１μｇ当たりには０．０６３μｇのエルゴステロールが伴なうこ とが知られている。この量のエルゴステロールは実際は、０．０１４μｇのエル ゴステロールと０．０４９μｇのエルゴステロールエステルの形態のエルゴステ ロールとからなる。００４９μｇのエルゴステロールエステルの形態のエルゴス テロールは０．０８５μｇのエルゴステロールエステルを与える。即ち、出発タ ンパク質１μｇ当たり全部で０．０９９μｇのステロール（エルゴステロール＋ エルゴステロールエステル）が存在する。

エルゴステロール及びエルゴステロールエステルは、酵母誘導ＨＢｓＡｇ試料中 に認められる中性脂質の８４％を占める。またタンパク質１ｍｇ当たり０．０１ ６μｇのトリグリセリドが存在する。従って、分析したＨＢｓＡｇ調製物はタン パク質１μｇ当たり０．１１５μｇの中性脂質を倉む。

ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリ ン及びホスファチジルイノシトールのような極性脂質は、シリカゲル（直線高速 ）ＴＬＣプレー１−における３次元薄層クロマトグラフィーによって検、出した 。第１次元は、比が６５：２５：４のクロロホルム、メタノール及び水酸化アン モニウムからなる溶剤を使用してクロマトグラフィーを実施した。溶剤をプレー トの全長に移動させてから、プレートを溶剤から取り出し、乾燥させた。第２次 元は、同じ溶剤を使用して同じ方向に実施した。溶剤をプレートの全長に移動さ せた後、プレートを再び取り出し、完全に乾燥させた。第３次元のクロマトグラ フィーは、乾燥したプレートを、比が３０：４０：１０：１０：５のクロロホル ム、アセトン、メタノール、酢酸及び水からなる溶剤において当初移動方向と垂 直に置くことにより実施した。第３次元の移動が完了したら、プレートを溶剤か ら再び取り出し、乾燥させた。存在する種々のリン脂質を、ｐｈｏｓｐｒａｙま たはＩＯＮ硫酸と共に焼く（ｃｈａｒｒｉｎｇ）ことにより可視化した。上述の 酵母誘導ＨＢｓＡｇ調製物の分析は、極めて僅かなリン脂質しか存在しないこと を示した。唯一検出された種はホスファチジルコリンであった。精製透析ＨＢｓ Ａｇ試料中には有意な量のデオキシコレートが検出された。

これとは対照的に、同様に抽出して同じプレート上を移動させた、精製透析酵母 誘導試料と同量のタンパク質を含むヒト血清誘導）（ＢｓＡｇ試料からは、有意 なレベルのホスファチジルコリンは現れたが、デオキシコレートは現れなかった 。

本明細書に記載のごとく製造されたＨＢｓＡｇ調製物とヒト血清誘導ＨＢｓＡｇ 調製物とに見られるリン脂質レベルの相違から、種々の試料中に存在するリン脂 質の量を測定した。２０μｇｚ’ｍｌの無機ポスフェートを含む標準溶液を購入 した。０〜１．６μｇのリンを含むアリコートを同じものを２つずつガラス試験 管に分配した。各試験管に０．３ｍｌのＩＯＮ硫酸を加えた。次いで標準溶液を １５０℃で３時間加熱して存在する全てのタンパク質または有機化合物を酸化し た。化合物は、存在するならば、この処理の間に黒変する。数滴のＨ２Ｏ２を各 標準試料に加え、更に１時間加熱を続け、試験管から色を完全に消した。このイ ンキュベーションの間、全ての水は蒸発し、全ての試料は硫酸と同じ容積まで減 量した。

試料をオーブンから取り出して冷ました後、各試験管に０．６５ｍ１の水を加え 、次いで２００μｌの５％モリブデン酸アンモニウム及び５０μｍのフイスケー サバロウ試薬を加えた０次いで試料を沸騰水浴中に７分間置き、安定に発色させ た。８３０　ｎ　ｒ口における試料の吸収を読取り、標準曲線を作成した。ヒト 血清から精製したＨＢｓＡｇは、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇタンパク質ｌμｇ当たり９． ６　Ｘ　Ｉ　Ｑ−’μｇのリンを含んでおり、これは、タンパク質１μｇ当たり ０゜２３μｇのリン脂質に相当した〔リン脂質分子量（７５０ｇ　７ｍ　ｏ　ｌ 　）をリンの分子Ｊｉ（３１ｇ／ｍｏ　Ｉ）で除算し、９．６Ｘ１０−’μｇリ ン／μｇＨＢｓＡｇタンパク質を乗算した値〕。実施例２に記載のごとく精製し 次いで透析した酵母誘導ＨＢｓＡｇはタンパク質１μｇ当たり４．４×１０゛３ μｇのリン、即ちタンパク質１μｇ当たり０．１０μｇのリン脂質を含んでいた 。精製透析酵母誘導材料において得られた結果は、使用したＴＬＣ条件下でタン パク質１ｍｇ当たり０．１０ｍｇのリン脂質が容易に検出可能であったことから 、極性脂質ＴＬＣ分析において得られた結果と対立した。上記結果は、ホスフェ ート測定に存在したリンが、リン脂質以外のソースに由来するものであったこと を示している。

存在するリンのどれほどがリン脂質に由来するものであるか決定するため、精製 透析酵母誘導）−ｆ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの試料を再び脂質抽出した。リン定量は、 脂質含有有機相及び水相の両方に実施した。結果から、水相中にはタンパク質１ μｇ当たり３．０５ｘｌＯ−’μｇのリンが存在し、一方、有機相中には、タン パク質１μｇ当たり５．８８Ｘ１０−１１ｇのリン、即ちタンパク質１μｇ当た り０．０１４ｇｇのリン脂質が存在することが明らかとなった。上記結果は、精 製酵母誘導ＨＢｓＡｇ調製物中に存在するリンの約１６０もしかリン脂質に由来 せず、リン脂質の９０％以上が抽出され、デオキシコレートによって置き換えら れていたことを示している。ヒト血清誘導調製物及び精製酵母誘導調製物の両方 の中の残りのリンは、クロロホルム／メタノール（２：１）、水、アセトン、エ タノールまたはメタノール洗浄を繰り返しても残りのリンを取り出せないことか ら示唆されるように、タンパク質に結合しているらしい。

上記方法によって、精製透析酵母誘導ＨＢｓＡｇ調製物の組成を決定し得た。脂 質対タンパク質比は０．１２０〜１．００であることが判明した。中性脂質対極 性脂質比は０．１１５〜０．０１４であることが判明した。中性脂質は、００１ ４ｇｇエルゴステロール／μｇタンパク質、０，０８５ｇｇエステル化エルゴス テロール／μｇタンパク質及び０．０１６ｇｇトリグリセリド／μｇタンパク質 からなることが判明した６極性脂質は、主に０．０１４ｇｇ／ホスファチジルコ リン、／μｇタンパク質からなった。従って酵母誘導ＨＢｓＡｇは、上述のごと く調製した場合には、有意な量のデオキシコレートの存在は除いて、約１１％の 脂質と８９％のタンパク質とからなる。デオキシコレートの量は次のように決定 した。全脂質をクロロホルム／メタノール相中に抽出し、タンパク質８．４　ｍ 　ｇ当たり１．９ｍｇのデオキシコレートを回収した。中性脂質分析と組み合わ せた全ホスフェート分析によると、たった０、１６６ｍｇが脂質であった。ＴＬ Ｃプレートにおける移動度によって検証したところ、残り（〜９２％）はデオキ シコレートであった。

Ｘ１ｔ７ アジュバント添加方法 以下のアジュバント添加方法（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ） を使用して、上記実施例２．３及び４で製造且つ精製したＨＢｓＡｇを含むＨＢ Ｖワクチン製剤分製造する。このアジュバント添加プロトコルは、精製バルクＨ ＢｓＡｇを５〜２００μｇ／＋ｅＬ含む製剤に使用し得る。記載の方法は総て無 菌的に実施する。

ＨＢｓＡｇの所望の最終投与量から逆算して、計算式：％式％） （但し、Ｃはｓｇ／ｍＬで表したＨＢｓＡｇの所望の最終濃度である）に従って 精製ＨＢｓＡｇ含有バルク物質に添加すべき５　＄ａｌｕ＋ｍ（水酸化アルミニ ウム）溶液の割合（Ａ＞を計算する。添加すべき５＄ａｌｕ−溶液の量は、アジ ュバントを添加すべきＦＩＢｓＡｇの全ミリグラム数と割合（Ａ）の積として計 算する。５　＄ａｌｕｍ溶液の計算量を、アジュバントを添加した精製バルク物 質を入れるのに十分な大きさの予め秤量した適当な数の遠心分離ボトルに等しく 分配する。次いで０．２５Ｎ　ＮａＯＨを各遠心分離ボトルに、そのボトルに添 加した５＄ａｌｕ＊溶液の容積と１　、１３６の積に等しい量で添加する。得ら れた溶液を遠心分離ボｌ−ルを緩やかに撹拌することにより完全に混合する。

精製バルク物質の好適量を各ボトルに添加する。次いでボトルをキャップし、封 止し、次いで室温で１５０〜２００ＲＰＭで２時間±１０分回転撹拌機に設置す る。ボトルを撹拌機から取り出し、２０℃で１．ＯＯＯｘｇ、約１５±１分回転 させる。この遠心分離液由来の上清をペレットを乱さないようにゆっくりとデカ ンテーションする。ＰＢＳ（リン酸塩でｌ＆ｆｆｉさせた生理食塩水＋１．５ｍ Ｎ　ＮａＨＰＯ４，２，２＋ｎＭ　ＮａＨ２ＰＯ，，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐ Ｈ６゜５）を、遠心分離ボｌ−ルの全容積の２Ｏｆに等しくなる量で添加する。

各ボトルを封止し、ぺνットを再懸濁させるために榎やかに渦巻かせる。ペレフ トが再懸濁したなら、ボトルを再び開け、ＰＢＳをその最大許容量の７ｏｚまで ボトルを一杯にするのに十分な量で各々に添加する。次いてボトルを１．０００ ’−８で１５＋１分で１回以上遠心分離する。再び上清を注意深くデカンテーシ ョンする。アジュバントを添加したＨＢｓＡｇの全量を表すペレット重量を測定 する。

ＨＢｓＡｇの特定の最終濃度を含むアジュバン１〜を添加したＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ 　ｇｇｉ剤を、所望の濃度の抗原を産生するのに必要なＰＢＳの鰻でぺしットを 添加し、緩やかに再懸濁させることにより製造する。再懸濁したペレットを好適 な容器にプールする。このアジュバントを添加したＨＢｓＡｇ製剤を、分配する ためにバイアルに入れ包装するまで２〜８℃で貯蔵する。

Ｂ型肝炎の感染に対して防御免疫を産生するのに必要な抗原量は、ワクチン接種 すべき患者の年令に依存して変動するため、種々の濃度で配合したＨＢｓＡｇを 含むワクチン製剤が必１である。種々の濃度のＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを含む配合 物を製造するために、上記記載のアジュバントを添加したＨＢｓＡｇ含有Ｂ型肝 炎ワクチン配合物の希釈液は、５　＄ａｌｕｍの好適な量を含む好適量のＰＢＳ を、予めアジュバントを添加したワクチン物質の特定量に添加することにより製 造し得る。上記方法により製造したＢ型肝炎ワクチンは、ヒトへの投与に好適で ある。

もう一つのアジュバント添加方法に於いては、好適な溶液は初めから製造してお く。Ｓ−４００力ラムＭ衝液［２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１３５ｍＭ　ＮａＣ ｌ、０．２１ｇ（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、ｐｔ１８．５　：実施 例３及び４のゲル透過クロマトグラフィーで使用したのと同一緩衝液］及びＰＢ Ｓを、孔径０．２０μｌの４７１！３１．１４２ｚｚまたは２９３ｚｚ　Ｐａ１ ｌ　Ｎｙｌｏｎ　６８（登録間１１１）フィルター（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ、製） でＰ遇する。Ｐ液を使用するまで２〜８℃で貯蔵する。さらに、好適量の０．２ ５Ｎ　ＮａＯＨ及び５ｚ＾１ｕ−（すめに０．２μ鴫ナイロンフイルターを使用 してｒ遇する。

成分溶液を濾過後、所望の客員の濃縮水酸化ナトリウム（＾ｔｏｌｌ）ゲル（実 際に溶液重量で計量）を製造する。好適な大きさの容器に、所望の＾ＩＯＲ各キ ログラム毎に５ｚ＾ｌｕ轄１フ５８゜を添加し、次いで０．２５８　Ｎａ０）１ １９９８ｇを添加する。この溶液を室温で１５土２分撹拌する。１５分後、この 溶液のアリコ）　６２５ｍＬをＩＬの遠心分離ボトルに入れる（ボトルを充填す る際、溶液の撹拌は続ける）、サンプルをベックマンＪ６０ローター中１．８０ ＯＲＰＭで回転させる。上清を捨て、各へ１０ＨペレットをＰＢＳ　７０．に再 懸濁させる。再懸濁したベレットをＩＬのガラス滅菌ボトルに移して混合する（ ボトル１個当たり６個の再懸濁したベレッｌ〜）。次いで遠心分離ボトルをＩＯ ｙ　ＰＢＳで濯ぎ、これらの濯ぎ溶液を予め再懸濁したペレットと一緒にプール しておく。次いで各滅菌ボｌ−ルを秤量し、内容物の重量がＩＡｙに達するまで ＰＢＳを添加する。

これらの溶液は、４縮＾１０１１ゲルであり、これを有効サイクル（例えば、１ ２４土１℃で３時間）で蒸気滅菌する。滅菌後。

１藺のボトルからのサンプルを、１００万分の１（＋＋ｐｍ）に換算した＾ｌ　 ＯＩｔ　濃度を測定するために原子吸光によるアルミニウム分析にかける。残り の＾ＩＯＨゲルは使用するまで２±８℃で貯蔵する。

滅菌した＾１０８ゲルを実施例−で製造したように滅菌し、２通して精製したＨ ＢｓＡｇにアジュバントを添加するために使用する。最初に、中間のＨＢｓＡｇ 濃度０．０５０ｚｆＩ／ｍＬに到達するように計算する。以下の等代金使用して 、この計算を実行する。

ａ）出発ＨＢｓＡｇ重量（ｇ）×出発ＨＢｓＡｇ濃度（ｕｉ／＋Ｌ）　＋　０． ０５０ｚｇ／ｍＬ（中間ＨＢｓ＾８濃度）−中間ＨＢｓＡｇ重量（ｇ＞この計算 した中間重量を使用して、以下の等式を使用することによりアジュバントを添加 したＨ１３ｓＡｇ配合物の最終重量を確認する。

ｂ）中間型１　（ｙ）　ｘ　０．０５０ｉｌＦ／ｍＬ（中間濃度）十所望の最終 ＨＢｓＡｇ濃度（肩ｇ／ｍＬ）−最終溶液重量（ｇ＞添加すべき濃縮＾１０］１ ゲル量は、以下のように計算する。

Ｃ）所望の最終アルミニウム濃度（ｐｐｍ）十濃縮＾１０Ｈゲル中のアルミニウ ム濃度（ｐｐｍ）　Ｘ最終溶液重量−添加すべき濃縮＾１０Ｈゲル量 濃縮＾１０８ゲルを含むボトルを１０分撹拌する。アジュバント添加に必要なＳ −４００カラム緩衝液量は、以下のように計算する。

ｄ）中間重量（ｙ）　ＨＢｓＡｇ出発重量（ｙ）−必要なＳ−４００カラム緩衝 液量（Ｉ？） 必要なＰＢＳ量は、以下のように計算する。

ｅ）所望の最終濃度のｔｌＢｓＡｇ（ｉ＋ｇ／ｍＬ）を含む最終溶液重量（ｇ） −中間重量（段階ａ）−添加すべき濃縮＾１０Ｈゲル（段階Ｃ）−必要なＰＢＳ （ｇ） Ｓ−４００カラム１衝液の計算量を、予め秤量した最終受器に入れる。再び風袋 量を計量後、段ｊｔＪｅ）で計算したＰＢＳ量を最終受器に添加する。再び風袋 量を計量後、撹拌し、濃縮した必要な＾ＩＯＨゲル量（段階Ｃ）を添加する。最 後に、再び風袋量を計量後、滅菌の、フィルターで精製した、アジュバントを添 加すべきＨＢｓＡｇ量（重量）を添加する。得られた溶液をゆっくり〜適度な速 度で１５分間撹拌する。この溶液の最終重量は、段階すで計算した重量と対応し ていなければならない。ワクチン投与に好適な最終ＨＢｓＡｇｆｉ度を含むこの バルクのアジュバントを添加したＨＢｓＡＧ配合物は、いつでもバイアルに入れ 、ワクチンキットに入れられるようになっている。

え１１影 ワクチン投与 免疫原分子としてＨＢｓＡｇを含むＨＢＶワクチンは通常、筋肉内（ｉｓ＋）注 射によりヒトに注入する。三角筋は、子供及び大人に筋肉内注射するのに好適な 部位であるが、新生児及び小児の場合には、大腿部の後横部が好ましい注射部位 である。データから、臀部のＨＢＶワクチン注射は筋肉の代わりに脂肪組織に打 たれるので、それ以外の場所よりも血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ） が低くく、Ｂ型肝炎の感染を防御するワクチンの有効性を低下させてしまうこと が示されている。

しかしながら、既に記載の如く、筋肉注射後の出血の危険性のある個体に於いて は、Ｉｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　Ｇ誘導ＨＢＶワクチンは皮下投与しなければならない。

本明細書中で製造したワクチン製剤は、血管または神経の内部またはその近くに 注射すべきではない。

ワクチンキット（ｒｅｇｉｍｅｎ）は、以下のような３回のワクチン投与（ｄｏ ｓｅ）からなる。投与１は幾つかの選択した日に実施する。投与２は最初の投与 から３０日後に実施する。投手３は、最初のワクチン注射から１８０日後に実施 する。本明細書中で製造したＨＢＶワクチン製剤で免疫感作後のＢ型肝炎の感染 に罹らない期間は、確定されていなかった。他の）ＩＢｓＡｇ−誘導ＨＢＶワク チンに関する研究から、免疫後３〜・１年にわたって、１（ＢＶに対する抗体は 、臨床試験に於けるＨＢＶ感染に対する防御を提供するのに必要であると考えら れる抗体レベル１０ｍＩＵ／ｓＬ（ミリ−国際単位）以下に低下し得ることが知 見されている［　５ｔｅｖｅｎｓら、、（１９８７）　ＪＡＭΔ、ｖｏｌ。

２５７、ｐ、２６１２］、ある研究に於いては、ワクチン接種を最初に受けた感 染防御抗体を含む大人の７１ｚは、免疫感作から４．５年後、１０ｍ１Ｕ／ｍＬ 以上のレベルを保持していた。さらに、感染防御抗体の検出可能なレベルをもは や示さなくなった大人の中でも、慢性肝炎に対する防御は持続するようであった （Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｒｅｒｅｎｅｅ、上記）。Ｂ型肝炎 を罹った個体に関しては、ＨＢＶに対する抗体が１０　ｍｌＵ／ｍＬ未満に下が るとき、１回の追加免疫注射による再ワクチン投与が推奨される。

免疫した個体に送達されるＨＢｓＡｇ用量は、患者の年令及び症状により決定す る。ｔ（ＢｓＡｇの免疫学的に有効量とは、所望の免疫学的効果を生み出すよう に、即ち、将来の）ＩＢＶ感染に対して患者を防御的に免疫するように、患者に 投与されなければならないＨＢｓＡｇｉである。１回の注射光たりｌｌＢｓＡｇ ２．５μｇ程度の少量を小さい子供（１１歳以下）に投与でき、１回の投与量た り４０μｇ以下の量のＨＢｓＡＨを大人の血液透析患者に投すし得る。典型的な 大人への投与量は、１回の免疫感作毎に約１０〜２０μｇのＨＢＳ八［ｌを含む が、母親がＨＢｓＡｇ陽性であることが分がっている新生児の場合には、子供へ の投与量は、ＨＢｓＡｇ約２．５μｇ〜１０μｇである。

火」１１ター Ｂ型肝炎ワクチンの比較 Ｂ型肝炎に罹患した個体の血漿がらまたは組換え技術により製造した数種の肝炎 ワクチンを、中国で、ＨＢｓＡｇ及びＩＩ　Ｂ　ｅ　Ａ　ｇ陽性である母から生 まれた小児をＨＢＶの感染から防御するための能力に関して比較した。試験した ワクチンとしては、現在合衆国で市販されているＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ　ＨＢ（ 登録商標）、Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（登録商標）及びＨｅｐａｔａｖａｘ−Ｂ（登 録商標）が挙げられる。研究した小児は、本発明の実施例８に記載されているワ クチン製剤メに従って免疫感作した。最初の投与は、出生捩直後または生後１ケ 月で実施した。その後の免疫感作は、最初の注射の後１７月後及び６ケ月後に実 施した。この研究の間、小児にはＨＢＴＧを投与しなかった。ＨＢＶに対する感 染防御抗体の発生を９ケ月にわたって追跡した。

本研究の結果については表５を参照されたい。

表５から知見され得るように、血漿がら誘導したＢ型肝炎ワクチンを使用する場 合、母から小児へのＨＢＶ感染を有効に防御するには、注射１回当たりＨＢｓＡ ｇ２０〜３０μｇが必要である。ＨＢｓＡｇを１０μｇだけ含む注射では、通常 ３年間にわたってＨＢＶ感染を防げなかった。他方、組換え的に誘導したワクチ ンは、ｔｌＢｓＡｇを等置台む血漿誘導ワクチンにより誘発されたものよりも高 い幾何平均力価（ｇ６（＋＠ｅｔｒｉｃｍｅａｎ　Ｌｉｔｅｒｓ　：　ＧＭＴｓ ）を持つ、ＩＩＢＶに対する抗体を産生じた。

組換え的に誘導したＨＢｓＡｇ５〜１０μｇをワクチン製剤に配合すると、７０ 〜８０ｇの感染阻止率が得られた。本発明のＢ型肝炎ワクチン製剤は、試験した 他のどのワクチンよりも小児に於いてＩＩＢＶに対し非常に高い抗体力価を産生 した。

本発明は、好ましい態様に間して記載してきたが、上記記載の範囲に於いて当業 者には種々の変形が考えられ得ることは公知である。従って、添付の請求の範囲 は、請求した発明の範囲内のこのような総ての変形を包含する。

配列表 （１）一般情報； （１）出霧人：　Ｌａｎｇｌｅｙ、に、Ｅ。

Ｂｉｔｔｅｒ、Ｇ、＾。

５ａｃｈｄｅｖ、Ｒ，Ｋ。

Ｆｉｅｓｃｈｋｏ、Ｊ、Ｃ。

（ｉｉ）発明の名称： （ｉｉ）配列の数：１ （ｉｉ）連絡先； （Ａ）住所：＾Ｈｅｎ　Ｉｎｃ。

（Ｂ）通り：＾ｍｇｅｎ　Ｃｅｎｔｅｒ１８４０　Ｄｅｈａｖｉｌｌａｎｄ　Ｄ ｒｉｖｅ（Ｃ）市：　Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ（Ｄ＞州：　Ｃａ１ｉｆｏｒ ｎｉａ （Ｅ）国：ＵＳ＾ （Ｆ　）ＺＩＰ　：　９１３２０−１７８９（１）コンピューター読取可能形式 。

（Ａ）媒体の種類；３．５インチディスク、０５，１．４ＭＢ（Ｂ）コンピュー ター：＾ｐｐｌｅ　Ｍａｅｉｎｔｏｓｈ（ＣＨ４ｆｊシステム　Ｍａｅｉｎｔｏ ｓｈ　Ｏ５８，０，４（Ｄ）ソフトウェア：　Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｗｏｒｄ　 Ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０ｂ（ｖｉ）本出願データ （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ９２１０７９８２（Ｂ）出願臼：　１９９２年 ９月１８日（Ｃ）分類： （ｖ′ｉｉ）優先権出願データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／７６２，６７８（Ｂ）出願臼：　１９９１年９ 月２０日（２）配列番号、１の情報。

（ｉ＞配列の特徴： ＜Ａ）長さ・１３８２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｆＪＩの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （１１）配列の種類：＠の核酸 （×１）配列の説明：配列番号：１： ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ　ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＧ　ＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡ　ＴＣＡ ＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＡＡＡＧ　５０ＭＴＡＣＧＴＡＡＡ　ＴＡＡＴＴＭ ＴＡＧ　ＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴ　ＣＣＴＭＣＴＴＴＡ　ＴＴＴＡＧＴＣＡＡＡ　 １００ＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴ　ＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＣ ＴＴＴＴＴＡＡＧ　ＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡ　２５０ＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡ　ＡＣ ＧＧＧＣＡＣＡＡ　ＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡ　ＧＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴ ＧＧＡＧ　４００ＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡ　ＣＡＣＡＡＧＧＣＡＡ　ＴＴＧＡＣＣ ＣＡＣＧ　ＣＡＴＧＴＡＴＣＴＡ　ＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣ４５０ＴＴＡＣＡＣＣ ＴＴＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴ　ＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡ　Ａ ＡＧＣＴＧＡＡＡＡ　５００ＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡ　ＴＴＣＴＡ（ＪＴＴＴ　Ａ ＴＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧ　ＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡ　６５０ＣＣ ＣＴＴＴ　Ａ７Ａ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴτＣＴＴＴ　 ＴＧＴ　ＣＴＣＴＧＧ　ＧＴＡ　１３７３Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　工ｍｅ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖ ａｌｈ−＋　ｓｏＪ　＜：５　＜ｏ　ヒ０　０コ←つ　ｈ−Ｅ−４Φ　Ｌ）Ｌｌ 　（Ｊロ　トΦＵ＞　＜ＨＣＪｔ−１（ＪＱＪ　（ＪＱＪ　（Ｊ−ａ　：５　ｈ 　ＬＩ　Ｆ−１■　υ−トの　ＱΦＥ−４ａＪ　ｕｓ＝　ｈｐ　ｕｏ　（り＞　 ｈｘ＝Ｅ−ＩＪ　＜Ｆ−８〜　トψ　＋ｕ　）４−Ｑ：５　ａ：Ｉｈｅ　ｔｒｃ 　）４１１１　＜ｃｕ号３　に３　臣曜　已赳　ギ＝　ギ＝ く○　Ｑ■　ＣＪ：１（ＪＬＩ　＜ＯＣＪΦＬ）ＬＩ＋−＋　Ｅ−ＩａＪ（Ｉａ Ｊ　ｕｕ　＋−＋ＣＪＯ，ｒ　＜Ｈ（Ｊ−Ｅ−１（１）　（Ｊ山　くＨ）−１＞ 　＜ｔ７１　←−Ｅ−４（：　Ｅ−Ｔｏ　ｈΦ０−　じ−　（ＪＱＪ Ｃ，リ　＜＜、ヵ　が芝　８だ　１起 Ｑ　′：３　ト　−　ト　− トの　り二　。二　１二　８菰　赳「 Ｅ−ｔ、Ｊ　＜Ｅ−＋　＜Ｅ−４Ｕ（り　トＱＵべＱ■　Ｑｏ　０α　Ｑ飄　υ −じ［Ｆ］Ｅ−４，ｃ　ｓｏ　ｏｕ　ａ−ｕｕ　じ−Ｈ−←−Ｅ−４ト　ＱＯ← （１）　ｕ＜・Ｅ−１＞　ｏ：＝＋　（、：ＪＱ、　ｈ＝＋　（ＪＬＩ　ｏ：＊ ｏ！−＋　Ｅ−１（ＬＩ　Ｃ：）ｕ　ｈΦ　Ｕｇ　ト０００　←−ト←　ＣＪＪ 　＜←　Ｑ− Ｅ−Ｃ）　Ｅ−４＞　＜：５（ＪＯ（Ｊ（１’ｌ　ｏａ。

←、α　り一　ＪＱ）ＵＳ−＋　＜・−〇　−４ＱＪ　（ｊ＋、）　Ｕ！　（Ｊ Ｉ　Ｕ：！：　Ｅ−ＩＦ−１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （７２）発明者　サクデブ、ラジ・クーマーアメリカ合衆国、カリフォルニア・ ９３０１２、カマリロ、パロマー・サークル・５９５２Ｉ （７２）発明者　フイースクコ、ジョン・シーアメリカ合衆国、カリフォルニア ・９１３０１、アゴウラ・ヒルズ、ガーデン・オークス・コート・２９１３１

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）免疫学的に有効量のＨＢｓＡｇ及びｂ）胆汁酸塩 を含む、哺乳類種に投与するのに好適なＢ型肝炎ワクチン製剤。
2. ２．胆汁酸塩はＨＢｓＡｇ粒子の少なくとも約１０重量％である請求項１に記載 のワクチン製剤。
3. ３．胆汁酸塩の量はＨＢｓＡｇ粒子の約１０〜約３０重量％の範囲である請求項 １に記載のワクチン製剤。
4. ４．胆汁酸塩はＨＢｓＡｇ粒子の約２０重量％である請求項３に記載のワクチン 製剤。
5. ５．さらに脂質約２〜約１２重量％を含む請求項１に記載のワクチン製剤。
6. ６．脂質が酵母由来のものである請求項５に記載のワクチン製剤。
7. ７．胆汁酸塩がデオキシコール酸塩である請求項１に記載のワクチン製剤。
8. ８．デオキシコール酸塩がデオキシコール酸ナトリウムである請求項７に記載の ワクチン製剤。
9. ９．ＨＢｓＡｇが組換体由来のものである請求項１に記載のワクチン製剤。
10. １０．ＨＢｓＡｇが組換え酵母宿主細胞の発現の結果産生される請求項９に記載 のワクチン製剤。
11. １１．酵母宿主細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１０に記載のワク チン製剤。
12. １２．ａ）酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に産生された組換え的に誘導された ＨＢｓＡｇ； ｂ）ＨＢｓＡｇ粒子の約２０重量％からなるデオキシコール酸ナトリウム；及び ｃ）ＨＢｓＡｇ粒子の約２〜約１２重量％からなる酵母誘導脂質を含む、哺乳類 種に投与するのに好適なＢ型肝炎ワクチン製剤。
13. １３．請求項１に記載のワクチンで哺乳類を予防接種することを包含する、Ｂ型 肝炎ウイルスに感染し易い哺乳類種において防御免疫学的応答を生じさせるため の方法。
14. １４．哺乳類がヒトである請求項１３に記載の方法。
15. １５．胆汁酸塩がＨＢｓＡｇ粒子の約１０〜約３０重量％の範囲である請求項１ ３に記載の方法。
16. １６．ＨＢｓＡｇ粒子がさらに、酵母誘導脂質を約２〜１２重量％含む請求項１ ３に記載の方法。
17. １７．胆汁酸塩がデオキシコール酸塩である請求項１３に記載の方法。
18. １８．デオキシコール酸塩がデオキシコール酸ナトリウムである請求項１７に記 載の方法。
19. １９．ＨＢｓＡｇが組換体由来のものである請求項１３に記載の方法。
20. ２０．ＨＢｓＡｇが、組換え酵母宿主細胞発現の結果として産生される請求項１ ９に記載の方法。
21. ２１．酵母宿主細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項２０に記載の方法 。
22. ２２．ａ）ＨＢｓＡｇが発現した宿主細胞を溶解し；ｂ）段階（ａ）からのＨＢ ｓＡｇ含有溶解物を清澄化し；ｃ）段階（ｂ）からのＨＢｓＡｇ含有溶解物中の ＨＢｓＡｇをコロイド状硅酸塩に級着させ； ｄ）段階（ｃ）からのコロイド状珪酸塩から、吸着したＨＢｓＡｇを溶離し； ｅ）段階（ｄ）からの溶離したＨＢｓＡｇをイオン交換クロマトグラフィーにか け； ｆ）段階（ｅ）からのイオン交換で精製したＨＢｓＡｇを密度勾配超遠心分離に かけ； ｇ）段階（ｆ）からの超遠心分離で精製したＨＢｓＡｇをゲルろ過クロマトグラ フィーにかけ；次いで ｈ）段階（ｇ）のゲルろ過からの高度に精製したバルクＨＢｓＡｇを回収する 段階からなる、請求項１に記載のワクチン製剤で使用するのに好適なＨＢｓＡｇ の精製法。
23. ２３．コロイド状珪酸塩がＡｅｒｏｓｉｌ３８０である請求項２２に記載の方法 。
24. ２４．ゲルクロマトグラフィーは胆汁酸塩を使用する請求項２２に記載の方法。
25. ２５．胆汁酸塩がデオキシコール酸塩である請求項２４に記載の方法。
26. ２６．胆汁酸塩がデオキシコール酸ナトリウムである請求項２５に記載の方法。
27. ２７．さらに精製バルクＨＢｓＡｇにアジュバントを添加する段階を含む請求項 ２２に記載の方法。
28. ２８．使用したアジュバントが、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムか らなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
29. ２９．使用したアジュバントが水酸化アルミニウムである請求項２８に記載の方 法。
30. ３０．ａ）温度２０℃〜３０℃、ｐＨ３．５〜６．０で最初に培養物を増殖させ ；次いで ｂ）培養物が好適な細胞密度に達した後、培養温度を約１５℃±３℃に下げる 段階を包含する、外因性ＤＮＡ配列を含む酵母宿主株の炭素制限培養方法。
31. ３１．最初の培養温度が２５℃±１℃である請求項３０に記載の方法。
32. ３２．段階（ａ）のｐＨが４．５±０．２である請求項３０に記載の方法。
33. ３３．段階（ａ）のｐＨが４．５±０．２であり、及び、培養温度を１５±３℃ に下げた後、培養ｐＨを５．５±０．２に調整する請求項３０に記載の方法。
34. ３４．酵母宿主株がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項３０に記載の方法。
35. ３５．外因性ＤＮＡフラグメントがＨＢｓＡｇを発現させる組換えプラスミドを 含む請求項３０に記載の方法。
36. ３６．組換えプラスミドがｐＧＰＤ−１（ＨＢＳ）である請求項３５に記載の方 法。