ES2293708T3

ES2293708T3 - Vacunas que contienen una saponina y un esterol.

Info

Publication number: ES2293708T3
Application number: ES99201323T
Authority: ES
Inventors: Nathalie Marie-Josephe Claude Garcon; Martin Smithkline Beecham Biologicals S.A. Friede
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1995-04-25
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2016-04-01
Also published as: DE69637254T2; ATE373487T1; BG101995A; CZ296216B6; HU227944B1; SI0822831T1; SA96170297B1; BG63491B1; DZ2026A1; NO974859D0; RO119068B1; KR100463372B1; EP0955059A3; CA2217178A1; CN1248737C; BR9608199B1; EP0955059B1; NO974859L; EP0822831B2; CN1289065C

Abstract

Una composición de vacuna que comprende un antígeno, QS21, y un esterol, caracterizada porque (a) la razón de QS21 frente a dicho esterol es de 1:1 a 1:100 p/p, (b) la QS21 es al menos un 90%, pura, y (c) la composición de vacuna contiene un vehículo liposomial.

Description

Vacunas que contienen una saponina y un esterol.

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas, a procedimientos para su producción y a su uso en medicina. En particular, la presente invención se refiere a vacunas que contienen un antígeno, la fracción activa inmunológicamente derivada a partir de la corteza del Quillaja Saponaria Molina, conocida como QS21, y un
esterol.

Las fracciones de saponina inmunológicamente activas que tienen actividad adyuvante derivadas a partir de la corteza del árbol de América del Sur Quillaja Saponaria Molina, se conocen en la técnica. Por ejemplo, la QS21, también conocida como QA21, se describen una fracción purificada mediante HPLC del árbol Quillaja Saponaria Molina y su procedimiento para su producción (como QA21) en la Patente de EE.UU. N°. 5.057.540. Igualmente, la saponina de Quillaja ha sido descrita como un adyuvante por Scott y otros, en Int. Archs. Allergy Appl. Immun., vol. 77, pág. 409. Sin embargo, el uso de la QS21 como un adyuvante esta asociada con ciertos inconvenientes. Por ejemplo cuando la QS21 se inyecta en un mamífero como una molécula libre, se ha observado que se produce necrosis, es decir, muerte de tejido localizado, en el sitio de inyección.

De manera sorprendente se ha encontrado ahora que la necrosis en el sitio de inyección puede evitarse mediante el uso de formulaciones que contienen una combinación de QS21 y un esterol. Los esteroles preferidos incluyen \beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. Estos esteroles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el colesterol se describe en el Merck Index, 11ª Ed., pág. 341, como un esterol que se da en la naturaleza hallada en la grasa animal.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona por lo tanto una composición de vacuna que comprende un antígeno, QS21, y un esterol, caracterizada porque la razón de QS21: esterol es de 1:1 a 1:100 (p/p) y porque el QS21 es al menos puro al 90%. Preferiblemente las composiciones de la invención contienen QS21 en forma sustancialmente pura, es decir, la QS1 está al menos pura al. 95% y lo más preferiblemente al menos pura al 98%. Las composiciones de la invención que comprenden QS21 y colesterol muestran una reactividad disminuida cuando se comparan con composiciones en las que el colesterol está ausente, mientras que se mantiene el efecto adyuvante. Además, se sabe que el QS21 se degrada bajo condiciones básicas en las que el pH es de aproximadamente 7 o superior. Una ventaja adicional de las presentes composiciones, es que la estabilidad de QS21 a hidrólisis mediada por bases está potenciada en las formulaciones que contienen colesterol.

La razón de QS21: esterol será típicamente del orden de 1:100 a y 1:1 en peso. Preferiblemente, se encuentra presente un exceso de esterol, siendo la razón de QS21: esterol de al menos 1:2 p/p. Típicamente para administración humana, la QS21 y el esterol estarán presentes en una vacuna el intervalo comprendido desde aproximadamente 1 \mug hasta aproximadamente 100 \mug, preferiblemente aproximadamente 10 \mug hasta aproximadamente 50 \mug por
dosis.

Los liposomas preferiblemente contienen un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, el cual es preferiblemente, no cristalino a temperatura ambiente, por ejemplo fosfatidilcolina de la yema del huevo, dioleilfosfatidilcolina o dilaurilfosfatidilcolina. Los liposomas pueden contener también un lípido cargado el cual incrementa la estabilidad de la estructura liposoma-QS21 para los liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos la cantidad de lípido cargado es preferiblemente 1-20%, p/p, lo más preferiblemente 5-10%. La razón de esterol a fosfolípido es 1-50% (mol/mol), lo mas preferiblemente 20-25%.

Preferiblemente las composiciones de la invención contienen MPL (monofosforil lípido A 3-desacetilado, también conocido como 3D-MPL). El 3D-MPL se conoce a partir de la Patente GB 2.220.211 (Ribi) en forma de una mezcla de 3 tipos de monofosforil lípido A De-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida se describe en la Solicitud de Patente International 92/116556.

Las composiciones adecuadas de la invención son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sin MPL, y después se agrega el MPL, preferiblemente como partículas de 100 nm. El MPL por lo tanto no esta contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL fuera). Las composiciones en las que el MPL esta contenido dentro de la, membrana de la vesícula (conocidas como MPL dentro) también forman un aspecto de la invención. El antígeno puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Preferiblemente, los antígenos solubles están fuera y los antígenos hidrófobos o lipidizados están contenidos bien dentro o bien fuera de la membrana.

Preferiblemente, las formulaciones de vacuna contendrán un antígeno o una composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmune contra un patógeno humano o animal. Las composiciones de antígeno o antigénicas conocidas en la técnica pueden usarse en las composiciones de la invención, incluyendo antígenos polisacarídicos, composiciones antígenas o antigénicas derivadas de VIH-1 (tales como gpl20 o gpl60), cualquier virus de inmunodeficiencia felina, virus del herpes humano o animal, tal como gD o derivados de la misma o proteína temprana inmediata tal como ICP27 de HSV1 o HSV2, citomegalovirus (especialmente humano) (tal como gB o derivados de la misma), virus varicela zóster (tales como gpl, II o III), o de un virus de la hepatitis tal como el virus de la hepatitis B por ejemplo antígeno de superficie de la hepatitis B o un derivado del mismo, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E, o de otros patógenos víricos, tal como el virus sincitial respiratorio (por ejemplo las proteínas F y G del HSRV o fragmentos inmunógenos de las mismas descritos en la Patente de EE.UU. 5.149.650 o polipéptidos quiméricos que contienen fragmentos inmunógenos procedentes de las proteínas F y G del HSRV, p. ej. la glucoproteína FG descrita en la Patente de EE.UU. 5.194.595), antígenos derivados a partir de cepas de la meningitis tales como meningitis A, B y C, Streptoccoccus pneumonia, virus del papiloma humano, virus Influenza, Haemophilus influenza B (Hib), virus de Epstein Barr (EBV), o derivados procedentes de patógenos bacterianos tales como Salmonella, Neisseria, Borrelia (por ejemplo OspA o OspB o derivados de los mismos), o Chlamydia, o Bordetella, por ejemplo P.69, PT y FHA, o derivados de parásitos tales como Plasmodium o
Toxoplasma.

La glucoproteína D (gD) del HSV o derivados de la misma es un antígeno de vacuna preferido. Está localizado sobre la membrana vírica, y está además en el citoplasma de células infectadas (Eisenberg, R. J. y otros, J. of Virol. 1980 35 428-435). Comprende 393 aminoácidos incluyendo un péptido señal y tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kD. De todas las glucoproteínas de envoltura del HSV, esta es probablemente la mejor caracterizada (Cohen y otros, J. Virology 60 157-166). Se sabe que in vivo juega un papel central en la unión vírica a las membranas de la célula. Además, se ha mostrado que la glucoproteína D es capaz de provocar la neutralización de anticuerpos in vivo y de proteger animales de una infección letal. Una forma truncada de la molécula gD esta exenta de la región de anclaje C-terminal y puede producirse en células de mamíferos en forma de una proteína soluble que se exporta dentro del sobrenadante de cultivo de la célula. Se prefieren tales formas solubles de gD. La producción de formas truncadas de gD se describe en el documento EP 0 139 417. Preferiblemente la gD deriva a partir del HSV-2. Una realización de la invención es una glucoproteína D truncada del HSV-2 de 308 aminoácidos que comprende desde el aminoácido 1 hasta el 306 de la glucoproteína que se da en la naturaleza con la adición de Asparragina y Glutamina en el extremo C-terminal de la proteína truncada exenta de su región de anclaje a la membrana. Esta forma de la proteína incluye el péptido señal que se ha escindido para permitir que la proteína de 283 aminoácidos soluble madura sea secretada a parir de la célula huésped.

En otro aspecto de la invención, el antígeno de superficie de la hepatitis B es un antígeno de vacuna preferido.

Como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno de superficie de la hepatitis B" o "HBsAg", incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento del mismo que muestre la antigenicidad del antígeno de superficie del HBV. Se entenderá que además de la secuencia de 226 aminoácidos del antígeno de HBsAg (véase Tiollais y otros, Nature, vol. 317, pág. 489, (1985) y referencias allí citadas) HBsAg tal como aquí se describe, puede, si se desea, contener la totalidad o parte de una secuencia pre-S tal como se describe en las referencias anteriores y en el documento EP-A-0 278 940. En particular el HBsAg puede comprender un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos 12-52 seguido de los restos 133-145, seguido de los restos 175-400 de la proteína L de HBsAg con relación al marco de lectura abierto en un virus de la hepatitis B de serotipo ad (a este polipéptido se hace referencia como L*, véase el documento EP 0 414 374). El HBsAg, dentro del alcance de la invención puede incluir también el polipéptido pre-S I-pre-S2-S descrito en el documento EP 0 198 474 (Endotronics) o análogos próximos tales como los descritos en el documento EP 0 304 578 (Mc Cormick y Jones). El HBsAg como se describe en el presente documento puede referirse igualmente a mutantes, por ejemplo el "mutante de escape" descrito en el documento WO 91/14703 o en la Solicitud de Patente Europea Número 0 511 855A1, especialmente el HBsAg en el que la sustitución de aminoácido en la posición 145 es de glicina a
arginina.

Normalmente el HBsAg estará en forma de partículas. Las partículas pueden comprender por ejemplo proteína S sola o pueden ser partículas compuestas, por ejemplo (L*,S) en la que L* es tal como se ha definido anteriormente y S indica la proteína S del HBsAg. La partícula citada se encuentra ventajosamente en la forma en la cual esta expresada en levadura.

La preparación de proteína S de antígeno de superficie de la hepatitis B esta bien documentada. Véanse, por ejemplo, Harford y otros (1983) en Develop. Biol. Standard, 54, pág. 125, Gregg y otros (1987) en Biotechnology, 5, página 479, documentos EP 0 226 846 y EP 0 299 108 y referencias en ellos.

Las formulaciones dentro del alcance de la invención pueden contener también un antígeno antitumoral y ser útiles para tratar cánceres inmunoterapéuticamente.

La preparación de la vacuna se describe de manera general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y otros, University Park Press, Baltimore, Maryland, EE.UU. 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, Patente de EE.UU. 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite, Patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor y otros, Patente de EE.UU.
4.474.757.

La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos en vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de cual inmunógeno específico se emplea y de como se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-1000 meg de proteína, preferiblemente 2-100 meg, lo mas preferiblemente 4-40 meg. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede deducirse mediante estudios estándar que implican observación de las respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.

Las formulaciones de la presente invención pueden usarse tanto para fines profilácticos como terapéuticos.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona por lo tanto el uso de una vacuna de la invención para el tratamiento de pacientes humanos. La invención proporciona un procedimiento de tratamiento que comprende administrar una cantidad eficaz de una vacuna de la presente invención a un paciente. En particular, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de infecciones víricas, bacterianas o parasíticas o de cáncer el cual comprende administrar una cantidad eficaz de una vacuna de la presente invención a un paciente.

Los ejemplos y datos siguientes ilustran la invención.

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Ejemplos 1.1 Procedimiento de preparación de liposomas

Una mezcla de lípido (tal como fosfatidilcolina, bien procedente de yema de huevo o bien sintética) y colesterol en disolvente orgánico, se secó bajo vacío (o como alternativa bajo una corriente de gas inerte). Se agrego después una solución acuosa (tal como solución salina tamponada con fosfato), y el recipiente se agitó hasta que todo el lípido estuvo en suspensión. Esta suspensión se microfluidizó después hasta que el tamaño del liposoma se redujo a 100 nm, y después se filtró de manera estéril a través de un filtro de 0,2 \mum. La extrusión o el tratamiento con ultrasonidos pueden reemplazar esta etapa. Típicamente la razón de colesterol: fosfatidilcolina es de 1:4 (p/p), y la solución acuosa se agrego para dar una concentración de colesterol final de 5 a 50 mg/ml. Si se agrega MPL en solución orgánica al lípido en solución orgánica los liposomas finales contienen MPL en la membrana (denominado como MPL
dentro).

Los liposomas tienen un tamaño definido de 100 nm y se denominan como SUV (para pequeñas vesículas unilamelares). Si esta solución se congela y descongela de manera repetida las vesículas se fusionan formando estructuras multilamelares grandes (MLV) de un tamaño que varía desde 500 nm hasta 15 \mum. Los liposomas por sí mismos son estables a lo largo del tiempo y no tienen capacidad fusogénica.

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1.2 Procedimiento de formulación

El QS21 en solución acuosa se agregó a los liposomas. Esta mezcla se agregó después a la solución de antígeno la cual puede si se desea contener MPL en la forma de partículas de 100 nm.

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1.3 La actividad lítica de la QS21 se inhibe mediante liposomas que contienen colesterol

Cuando la QS21 se agrega a eritrocitos, ellos se lisan liberando hemoglobina. Esta actividad lítica puede medirse también usando liposomas que contengan colesterol en su membrana y un colorante fluorescente retenido, carboxifluoresceína -puesto que los liposomas se lisan el colorante se libera lo cual puede monitorizarse mediante espectroscopia de fluorescencia. Si los liposomas fluorescentes no contienen colesterol en su membrana no se observa lisis de los liposomas.

Si QS21 se incuba con liposomas que contienen colesterol antes de añadirse a eritrocitos, la lisis de los eritrocitos se disminuye dependiendo de la razón de colesterol a QS21. Si se usa una razón 1:1 no se detecta actividad lítica. Si los liposomas no contienen colesterol, la inhibición de la lisis requiere un exceso de fosfolípido de mil veces sobre QS21.

Lo mismo sigue siendo cierto usando liposomas fluorescentes para medir la actividad lítica.

En el gráfico que figura a continuación, la actividad lítica de 4 \mug de QS21 tratada con liposomas que carecen de colesterol (1 mg de lecitina de yema de huevo por ml) o que contienen colesterol (1 mg de lecitina, 500 \mug de colesterol por ml), se midió mediante fluorescencia.

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Los datos muestran que la QS21 se asocia de una manera específica con el colesterol en una membrana, causando, de esta forma, la lisis (de células o de liposomas fluorescentes).

Si la QS21 se asocia en primer lugar con colesterol en liposomas, ya no es lítica frente a células u otros liposomas. Esto requiere una razón mínima de 0,5:1 de colesterol:QS21 (p/p).

El colesterol es insoluble en soluciones acuosas y no forma una suspensión estable. En presencia de fosfolípidos el colesterol reside dentro de la bicapa fosfolípídica que puede formar una suspensión estable de vesículas denominadas liposomas. Para evitar la necesidad de agregar fosfolípidos se ensayo un derivado soluble. El sebacato de polioxietanilcolesterol es soluble en agua a una concentración de 60 mg/ml sin embargo incluso con un exceso de 2000 veces (p/p) sobre QS21 no se detectó ninguna reducción en la actividad lítica de la QS21.

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1.4 Estabilidad incrementada de la QS21 mediante liposomas que contienen colesterol

La QS21 es muy susceptible a la hidrólisis a pH superior a 7. Esta hidrólisis puede monitorizarse midiendo la disminución en el pico correspondiente a QS21 en HPLC de fase reversa. Por ejemplo, el gráfico que figura mas adelante muestra que a pH 9 y a una temperatura de 37°C, el 90% de QS21 se hidroliza dentro de 16 horas. Si se agregan liposomas que contienen colesterol a la QS21 a una relación de 2:1 (colesterol: QS21, p/p), no se detecta hidrólisis de la QS21 bajo las mismas condiciones.

Si la relación es de 1:1, se degrada el 10% de la QS21.

Incubación de 20 \mug de QS21 en presencia de SUV que contiene colesterol a pH 9 durante 16 horas a 37ºC

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Se deduce que cuando la QS21 se asocia con liposomas que contienen colesterol se vuelve mucho menos susceptible a la hidrólisis mediada por bases. El producto de hidrólisis se describe como que no tiene actividad adyuvante cuando se da parenteralmente, por tanto las vacunas que contienen QS21 han de formularse a pH ácido y mantenerse a 4°C para mantener la composición adyuvante. El uso de liposomas puede evitar esta exigencia.

1.5 Estudios de reactogenicidad

Se inyectaron ratones en el músculo tibial con 5 \mug de QS21 (o digitonina) agregada para incrementar las cantidades de liposomas (expresadas en términos de \mug de colesterol). La actividad lítica se expreso como \mug de QS21 equivalente, lo cual significa aquella cantidad de QS21 requerida para lograr la misma hemolisis que la muestra.

Después de sacrificar los ratones se valoraron visualmente en el sitio de inyección la rojez, la necrosis y la toxicidad en el músculo.

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3

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Los datos muestran que, cuando la actividad lítica se suprimió mediante la acción de liposomas que contenían colesterol también se suprimió la toxicidad debida a la QS21.

1.6 Reactogenicidad intramuscularmente en conejos Valores en U.I./l

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Los datos muestran que la adición de liposomas que contienen colesterol a la formulación reducen significativamente la elevación en CPK (creatina fosfoquinasa) producida por la QS21. Puesto que el incremento de CPK es una medida del daño muscular esto indica un daño muscular disminuido y se confirma mediante histopatología.

1.7 Unión del complejo liposoma-QS21 a alumbre

La QS21 se incubó con liposomas neutros que contenían colesterol en exceso así como colesterol radioactivo y después se incubó con alumbre (Al(OH)_{3}) en PBS. Solos, ni los liposomas neutros ni la QS21 se unen al alumbre en PBS, sin embargo los liposomas negativamente cargados lo hacen. Cuando están juntos sin embargo, la QS21 y los liposomas neutros se unieron al alumbre. El sobrenadante no contenía ni QS21 (ensayado mediante la prueba de orcinol) ni colesterol radioactivo.

Esto indica que la QS21 se había unido a los liposomas y permite que la combinación liposoma-QS21 se una al alumbre. Esto puede originarse a partir de imponerse una carga negativa en los liposomas mediante la QS21, o para una exposición de regiones hidrófobas en los liposomas. Los resultados implican también que la QS21 no extrae colesterol de la membrana.

Esto indica que las composiciones de la invención pueden usarse en vacunas basadas en alumbre.

1.8 Comparación de QS21/MPL liposomial y QS2I+MPL libre para anticuerpos e inducción mediante CMI

: Se prepararon SUV mediante extrusión (EYPC:colesterol:MPL, 20:5:1).

: Para el MPL fuera, los liposomas se prepararon sin MPL y el MPL se agrego en forma de partículas de 100 nm.

: La QS21 se agrego antes del antígeno. Colesterol:QS21, 5:1 (p/p).

: Los MLV se obtuvieron mediante congelación-descongelación de SUV 3x antes de la adición del antígeno.

Para tener retenido el antígeno, el antígeno se agregó a SUV antes de la congelación-descongelación y la QS21 se agregó después de la congelación-descongelación. Encapsulación de antígeno = 5% dentro, 95% fuera -los ratones (balb/c para gD, B1OBR para RTS) se inyectaron dos veces en la planta de la pata. La gD es la glucoproteína D del virus Herpes Simplex. El RTSs es el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) genéticamente modificado para contener un epitopo del esporozoito del Plasmodium falciparum.

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Los datos muestran que SUV/QS + MPL (fuera) induce altos títulos de anticuerpos al menos tan buenos como QS21 + MPL, así como que induce IL2 un marcador de inmunidad mediada por células, mientras que interrumpe la reactogenicidad de la QS21.

Se muestran a continuación resultados adicionales de un segundo experimento comparando QS21 y QS21 en presencia de colesterol (SUV) en ratones balb/c con gD del HSV como antígeno:

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1.9 Comparación de gpl20 más MPL/QS21 liposomial con MPL/QS21 libre

: Liposomas = SUV conteniendo MPL en la membrana.

Colesterol:QS21 = 6:1

La respuesta se puso a prueba dos semanas después de una inmunización

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Después de una segunda inmunización:

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Los datos muestran que la QS21 asociada con liposomas que contienen colesterol y MPL induce una respuesta Thl/ThO igual a MPL + QS21.

A esta razón de colesterol a QS21, la QS21 es no tóxica en conejos (mediante CPK).

En un segundo experimento se inmunizaron ratones balb/c intra-planta del pie con gpl20 en presencia de QS21 o QS21 + SUV conteniendo colesterol. Se midió la actividad de los linfocitos T citotóxicos en células del bazo.

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Esto demuestra que la QS21 sola induce actividad CTL, y que la QS21 en presencia de liposomas que contienen colesterol induce actividad CTL al menos tan buena como, o mejor que, la QS21 sola.

2. Vacunas 2.1 Formulación de partículas L*,S de HBsAg

Las partículas L*,S de HBsAg pueden formularse como sigue:

se incubaron 10 \mug de partículas/dosis de L*,S de HBsAg 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación. El volumen se ajustó usando agua para inyección y una solución de PBS y se completo hasta un volumen final de 70 \mul/dosis con una solución acuosa de QS21 (10 \mug/dosis). El pH se mantuvo a 7 \pm 0,5.

Se prepararon formulaciones similares usando 1 y 50 \mug de L*,S de HBsAg y usando además el antígeno S de HBsAg.

Estas formulaciones pueden ensayarse en el modelo terapéutico subrogado de marmota usando antígenos de HBV de marmota como un modelo.

Modelo de marmota

La DQ QS21 (es decir, QS21/colesterol o QS21 interrumpida) puede ensayarse en el modelo terapéutico de marmota donde los animales son infectados crónicamente con el virus. La vacuna de virus de la hepatitis de marmota específica puede mezclarse con la QS21 como tal o DQ y con o sin MPL y administrarse a los animales cada mes durante 6 meses. La eficacia de la vacuna puede evaluarse a través de la depuración del DNA vírico.

2.2 Modelo de cobaya (HSV) 2.2.1 Modelo profiláctico

Grupos de 12 cobayas Hartley hembras se inyectaron todos ellos intramuscularmente en el día 0 y en el día 28 con las formulaciones siguientes:

Primer experimento:

: 5 \mug de gD + 50 \mug de QS21 + SUV

: conteniendo 50 \mug de colesterol

: 5 \mug de gD + 100 \mug de QS21 + SUV

: conteniendo 100 \mug de colesterol 5 \mug de gD

: + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 250 \mug

: de colesterol

: 5 \mug de gD + 50 \mug de QS21

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Segundo experimento:

: 5 \mug de gD + 12,5 \mug de MPL + 12,5 \mug de QS21 + SUV conteniendo

: 62,5 \mug de colesterol, o se dejaron sin tratar.

Los animales se sangraron a los 14 y 28 días después de la segunda inmunización, y los sueros se probaron para sus títulos de anticuerpo mediante ELISA especifico de gD.

Los animales se pusieron a prueba después intravaginalmente con 10^{5} pfu de cepa MS de HSV-2. Se evaluaron directamente desde el día 4 hasta el 12 para evaluación de las lesiones herpéticas primarias. Las puntuaciones fueron como sigue:

Lesiones vaginales

-: hemorragia = 0,5

-: rojez durante uno o 2 días sin hemorragia = 0,5

-: rojez y hemorragia durante un día = 1

-: rojez sin hemorragia permanente al menos 3 días = 1.

Vesículas herpéticas externas

-: <4 vesículas pequeñas = 2

-: >= 4 vesículas pequeñas o una vesícula grande 4 > = 4 lesiones grandes 8 lesiones grandes de condensación = 16

-: lesiones grandes de condensación en la totalidad del área genital externa = 32.

Se muestran los resultados en la tabla a continuación:

Modelo profiláctico Experimento 1 (col. se refiere a SUV conteniendo colesterol)

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Experimento 2

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La tabla y la gráfica muestran que en el modelo profiláctico, se indujo un nivel muy alto de protección contra la enfermedad primaria tras inmunización con gD/MPL/QS21/SUV. Tanto la incidencia de lesiones externas como la gravedad de las lesiones parecieron reducirse altamente en el grupo de animales inmunizados con gD/MPL/QS21/
SUV.

2.2.2. Modelo terapéutico

En el modelo terapéutico, se pusieron a prueba primeramente cobayas Hartley hembras con 10^{5} pfu de cepa MS de HSV-2. Los animales con lesiones herpéticas se distribuyeron después aleatoriamente en grupos de 16.

El día 21 y el día 42, se inmunizaron cada uno de ellos con una de las siguientes formulaciones:

-: gD + 50 \mug de MPL + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 250 \mug de colesterol,

-: gD + Al(OH)_{3} + 50 \mug de MPL + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 250 \mug de colesterol o se dejaron sin tratar.

Se monitorizaron diariamente desde el día 22 hasta el 75 para evaluación de enfermedad recurrente. La puntuación fue tal como se ha descrito para el modelo profiláctico. Los resultados se muestran en la tabla y gráfica a
continuación:

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(Tabla pasa a página siguiente)

Modelo terapéutico

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Tratamiento inmunoterapéutico realizado los días 21 y 42.

Los resultados muestran que se indujeron igualmente buenos niveles de protección en el modelo terapéutico de infección con HSV-2. La inmunización con gD/MPL/QS21/SUV con o sin alumbre tuvo un marcado efecto sobre la gravedad media de enfermedad recurrente. También redujo ligeramente el número y duración de episodios (véase Tabla).

Claims

1. Una composición de vacuna que comprende un antígeno, QS21, y un esterol, caracterizada porque (a) la razón de QS21 frente a dicho esterol es de 1:1 a 1:100 p/p, (b) la QS21 es al menos un 90%, pura, y (c) la composición de vacuna contiene un vehículo liposomial.

2. Una composición de vacuna como se reivindica en la reivindicación 1 en la que la razón de QS21: esterol es 1:2 p/p.

3. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en la que el liposoma contiene un lípido neutro.

4. Una composición de vacuna de acuerdo la reivindicación 3 en la que el lípido neutro es fosfatidilcolina.

5. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en la que el liposoma contiene un lípido cargado.

6. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la que el esterol se selecciona de \beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol.

7. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el esterol es colesterol.

8. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 la cual contiene 3D-
MPL.

9. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8 en la que el 3D-MPL no está contenida dentro de la membrana vesicular de los liposomas.

10. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8 en la que el 3D-MPL está contenida dentro de la membrana vesicular de los liposomas.

11. Una composición de vacuna tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el antígeno está derivado de cualquiera de virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia felina, virus varicela zóster, virus Herpes Simplex tipo 1, virus Herpes Simplex tipo 2, citomegalovirus humano, virus de la hepatitis A, B, C o E, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma humano, virus Influenza, virus de la meningitis Hib, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium o Toxoplasma.

12. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el antígeno es antígeno de superficie de virus de la hepatitis B.

13. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 en la que el antígeno es partículas compuestas (L*,S) de antígeno de superficie de virus de la hepatitis B.

14. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el antígeno es glucoproteína D de HSV o un derivado de la misma.

15. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el antígeno se deriva del virus Influenza.

16. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el antígeno se deriva de Plasmodium.

17. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el antígeno se deriva de virus del papiloma humano.

18. Una composición de vacuna tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la que el antígeno es un antígeno antitumoral.

19. Una composición de vacuna tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para usar en un medicamento.

20. Uso de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para la fabricación de una vacuna para el tratamiento preventivo de infecciones víricas, bacterianas o parasíticas.

21. Uso de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la fabricación de una vacuna, para el tratamiento inmunoterapéutico de infecciones víricas, bacterianas o parasíticas o cáncer.

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22. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende las etapas de

(i) preparar un liposoma mezclando lípido incluyendo colesterol con una solución acuosa;

(ii) asegurar que el lípido está en suspensión;

(iii) microfluidizar la suspensión hasta que el tamaño liposomial se reduce a 100 nm;

(iv) añadir QS21;

(v) añadir la mezcla resultante a una solución antigénica.