WO2014100879A2 - Método e composições para controle genético de insetos-praga em plantas de algodão através do silenciamento de genes de quitina sintases - Google Patents

Método e composições para controle genético de insetos-praga em plantas de algodão através do silenciamento de genes de quitina sintases Download PDF

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Definitions

  • Patent Descriptive Report for "METHOD AND COMPOSITIONS FOR GENETIC CONTROL OF PEST INSECTS IN COTTON PLANT THROUGH SILENCE OF CHITINE SYNTASES GENES".
  • the present invention relates to the field of control of insect pests that attack agricultural crops, especially cotton, by silencing double-stranded RNA-mediated chitin synthase (dsRNA) genes expressed in cotton plants.
  • dsRNA double-stranded RNA-mediated chitin synthase
  • Agriculture is one of the main pillars of the economy of developing countries. In Brazil, the main crops are soybean, cotton, corn, beans, coffee, sugar cane, among others. However, most of these crops have their production impaired by the incidence of pest insects and diseases. Losses in agricultural production caused by pest insects reach high levels of over 37%, and about 200 plant diseases are known to be caused by phytopathogens (HAQ, SK, et al., Protein proteinase inhibitor genes in combat against insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection Archives of biochemistry and biophysics, v. 431, No. 1. pp. 145-159 (2004). The need to control pest insects and pathogens in agriculture has driven the development of different pesticides that reduce losses and contribute to agribusiness, but are highly toxic not only to the target species, but also to other animals and even humans. .
  • cotton is one of the most attacked by diseases and insect pests, besides presenting high sensitivity to the occurrence imposed by weeds (Beltr ⁇ o, EM, Souza, JG. The cotton agribusiness in Brazil. Embrapa : Brasilia, v.01, 1999).
  • weeds Among the main pest insects, we highlight the cotton boll weevil, Anthonomus grandis (Boheman, CH Description of new species. In Schoenherr, Genera and species Curculionidum cum synonymia hujus Familia, vol. 7, pt. 2. Paris: Roret 461 p.
  • Cotton and its pests coexist for a long evolutionary period. Plant and insect form an interdependent and competitive morphological and biochemical system, most often resulting in the insect's use of part of the plant. This part represents the damage the insect causes to the plant, and depends on the size of the pest population, and the ability of the plant to resist the attack and to recover from damage (Beltr ⁇ o, E., Souza, JG). cotton in Brazil (Embrapa: Bras ⁇ lia, v.01, 1999).
  • the plant versus insect interaction can be viewed in at least two ways: from the insect's point of view, with the plant varying from adequate to completely inadequate as a host, and from the plant's point of view where, the smaller the number of species and abundance of insects associated with it, and the lower the effect these insects have on them, the greater their resistance to these insects (Santos, WJ Identification, biology, sampling and control of cotton pests. In: Embrapa Western Farming, Embrapa Cotton, Cotton: Production Technology, pp. 296p (2002).
  • cotton resistance to pest insects represents the ability of certain cultivars to produce better quality cotton in greater quantities than other cultivars, under attack from the same pest insect population (Freire, EC Cultivars and seed production). improving cotton quality in northeastern and midwestern Brazil (Embrapa / CNPA Newsletter 1997).
  • interfering RNA presents itself as a tool with great potential to combat pest insects, given its specificity and high efficiency in suppressing the target mRNA.
  • RNAi interfering RNA
  • PTGS post-transcriptional gene silencing
  • RNA-1 RNA. interference
  • JR a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation
  • CARTHEW a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation
  • RW Heritabie siencing gene in Drosophila using double-stranded RNA
  • RNAi for insecticide purposes is an important consideration for the use of this technology in practical applications, as the effects on non-afflicted insects can be minimized.
  • this technique allows the use of only sequence fragments, since the translation of a protein is not necessary, which minimizes biosecurity and allergenicity concerns, and represents a probably more effective form of control. than the current ones.
  • Chitin a linear polysaccharide formed by N-acetyl-D-glycosamine residues joined by ⁇ (1-4) bonds, is widespread among insects, which use this versatile biopotimer in various anatomical structures.
  • the two main extraceyeal structures where chitin deposition occurs are the cuticle that lines the epidermis and the peritrophic membrane that covers the midgut.
  • MUTHUKRISHNAN S., et al., China Metabolism in Insec. In Insect Molecular Biology and Biochemistry, 1 ed.; Gilbert, L. i, Ed. Elsevier: London, pp 193-225. 2012).
  • the peritrophic membrane is a functional structure that covers the midgut of insects.
  • the main functions assigned to this membrane are that of mechanical protection against injury to the cells of the midgut (WIGGLESWORTH, V., The Principles of Insect Physiology. 7th ed.; Chapman and Hall: London.Vol. P 827. 1972), a physical barrier against microorganisms (PETERS, W., Peritrophic membranes. Springer-Verlag New York, Vol. 1992), a selective barrier to digestive enzymes and digestion products (DAY, MF; WATERHOUSE, DF, Functions of the John Wiley, New York, Vol.
  • the insect cuticle or exoskeleton is a multifunctional structure that provides physical support as well as its shape, enables locomotion, imparts body sealing, and a range of localized mechanical specializations such as high adhesion. , wear resistance and diffusion control.
  • its mechanical properties are attributed to its main constituent, chitin (VINCENT, JF, et al., Design and mechanical properties of insect cuticle. Arthropod Struct Dev, v. 33, paragraph 3. pp. 87-199 2004).
  • Chitin synthesis and deposition in the cuticle and peritrophic membrane comprise a sequential series of complex biochemical, biophysical, intracellular and extracellular transformations, some of which are still poorly understood (MOUSS ⁇ AN, B., et. exoskeleton requires controlled secretion and shaping of the apical plasma membrane Matrix Biol, v. 26, No. 5. pp. 337-347. 2007) Because it is absent in plants and vertebrates, the biosynthetic pathway of chitin is one of the major targets for insecticide development since 1970 (VERLOOP, A., et al., Benzoylphenyl Ureas - The New Group of Larvicides Interferon with Chitin Deposition.
  • RNAi technology Interrupting or decreasing the synthesis of enzymes that participate in the biosynthesis of insect cuticle and peritrophic membrane constituents through RNAi technology is a specific way of controlling insect pests.
  • Chitin synthase A (or type 1) in insects is the main enzyme involved in cuticle and trachea chitin biosynthesis, however, chytin synthase B (or type 2) in insects is the main enzyme involved in the biosynthesis of cuticle and trachea.
  • peritrophic membrane chitin, both insect chitin synthases have been studied as ideal targets for the development of pest insect control strategies.
  • insecticidal effect of dsRNA molecules on cotton boll weevil, Anthonomus grandis, the main cotton pest in Brazil is shown the insecticidal effect of dsRNA molecules on cotton boll weevil, Anthonomus grandis, the main cotton pest in Brazil.
  • the insecticidal effect is attributed to the inhibition of transcript levels of chitin synthase 1 and 2 enzymes, which caused damage to the development of A. grandis eggs and adults when submitted to dsRNA treatment against these enzymes.
  • the present invention relates to a method for reducing or inhibiting the expression of genes involved in chitin biosynthesis in eukaryotic cells, particularly in animal cells, resulting in the death, inhibition, atrophy or feeding interruption of a target pest.
  • the invention describes nucleic acid molecules substantially similar to the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ. ID No. 6 or fragments or additions thereof.
  • the invention describes dsRNA molecules from selected sequences from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO. 6, or fragments or supplements thereof or stabilized fragment or complement thereof, or the expression of one or more microRNAs (miRNAs) or siRNAs for inhibiting the expression of a target gene in coleopteran pests expressed from these sequences and fragments thereof. same.
  • miRNAs microRNAs
  • the invention also provides a method for suppressing gene expression in a pest beetle, such as cotton boll weevil or related species, which comprises providing the pest with a suppressing amount of the gene in the diet.
  • a pest beetle such as cotton boll weevil or related species
  • least one dsRNA molecule transcribed from a nucleotide sequence substantially similar to the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or fragments or supplements thereof, which has at least one complementary fragment of an mRNA sequence within the pest cells.
  • aspects of the invention are chimeric genes, gene constructs containing the nucleic acid molecules of the present invention, transformation and expression vectors, cells and transgenic organisms, methods for expression of the molecule of the present invention in transgenic organisms, as well as transgenic organisms. as their use in pest control.
  • the invention also comprises a method for obtaining a transgenic plant using the gene constructs of the present invention and a method of producing food or feed comprising obtaining a polynucleotide transformed plant containing a nucleotide sequence substantially similar to the selected sequences.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or fragments or supplements thereof, and the preparation of food or feed from said plant or part thereof.
  • FIG. 1 AntgCHSI cDNA cloning strategy The complete AntgCHSI cDNA sequence was determined by overlapping 3 PCR fragments.
  • FIG. 2 AntgCHS2 cDNA cloning strategy. The complete AntgCHS2 cDNA sequence was determined by overlapping 4 PCR product fragments.
  • Figure 3 Analysis of relative expression of AntgCHSI gene transcripts in A. grandis eggs by qPCR. D-actin and GAPDH were used as reference genes. Relative expression (UA) was calculated based on the expression value for the AntgCHSI dsRNA treatment, which was assigned an arbitrary value of 1. Different letters on the bars indicate significant difference in expression between treatments based on two biological replicas (P ⁇ 0.05, T-test). In the treatments each insect was microinjected with 200 ng of dsRNA GUS (control) and 200 ng of dsRNA AntgCHSI.
  • FIG. 4 Effect of AntgCHSI dsRNA on oviposition of A. grandis eggs.
  • Figure 5 Effect of AntgCHSI dsRNA on neonate larvae from A. grandis microinjected adult insects.
  • A. Larvae from AntgCHSI dsRNA microinjected adults; Detail B from control larvae with dsRNA microinjected adults GUS (control), C and D 1 detail larvae instar with cephalic malformations in Sula Cap.
  • FIG. 6 Effect of AntgCHSI dsRNA on A. grandis development.
  • the microinjection of dsRNA AntgCHSI was ralizada in 3 larvae the urge. After microinjection the larvae were transferred to artificial diet to complete their development. After 10 days the morphology of the insects was evaluated.
  • Figure 7 Analysis of relative expression of Antg-CHS2 transcripts after microinjection of different segments of dsRNA- GAPDH and beta-actin reference genes.
  • Control consisted of administration of H20; 2.
  • dsRNA GUS - consisted of the administration of a 350 bp dsRNA of the gus gene; 3.
  • dsRNA AntgCHS2.1 (SEQ ID NO: 4); 4.
  • dsRNA AntgCHS2.2 SEQ ID NO: 5
  • 5. dsRNA AntgCHS2.3 SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 8 Analysis of relative expression of PCR transcripts Real-time AntgCHS2 after microinjection of different concentrations of AntgCHS2.3 dsRNA (SEQ ID NO: 6) into adult A. grandis insects after 48hs.
  • FIG. 9 Analysis of relative expression of AntgCHS2 real-time PCR transcripts after microinjection of different concentrations of AntgCHS2.3 dsRNA (SEQ ID NO: 6) into A. grandis larvae after 72hs.
  • FIG. 10 Analysis of persistence of Antg-CHS2 silencing after larval development of A. grandis by real-time PCR.
  • AntgCHS2.3 dsRNA microinjection SEQ ID NO: 6 was performed on larvae and silencing was analyzed on adult A. grandis insects after 72h of emergence.
  • FIG 11 Effect of AntgCHS2.3 dsRNA microinjection (SEQ ID NO: 6) on oviposition of A. grandis females.
  • dsRNA GUS was administered;
  • each insect was microinjected with 200 ng dsRNA GUS (control) and 200 ng dsRNA AntgCHS2.3.
  • FIG. 12 Effect of AntgCHS2.3 dsRNA microinjection (SEQ ID NO: 6) on survival of A. grandis females.
  • SEQ ID NO: 6 Effect of AntgCHS2.3 dsRNA microinjection (SEQ ID NO: 6) on survival of A. grandis females.
  • each insect was microinjected with 200 ng dsRNA GUS (control) and 200 ng dsRNA AntgCHS2.3.
  • the present invention describes methods and compositions for pest control, especially cotton pests.
  • the present invention provides recombinant DNA technologies for repressing or post-transcriptionally inhibiting expression of a target sequence in a pest cell. This effect is obtained by feeding one or more pests of double stranded RNA or RNA fragments (miRNA or siRNA) transcribed from all or part of a coding target sequence, thereby controlling the infestation.
  • the present invention relates to specific sequences inhibiting the expression of coding sequences using double stranded RNA (dsRNA) including small interfering RNA (siRNA) to achieve the desired levels of pest control.
  • dsRNA double stranded RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • the present invention provides a method of inhibiting the expression of a target gene in beetles.
  • the method comprises modulating or inhibiting the expression of one or more coleopteran target genes which causes inhibition of development, reproduction and / or infectivity and eventually results in insect death.
  • the present invention relates to the inhibition of chitin synthase family genes in Coleoptera, resulting in disruption of development and malformation of larvae and adult insects, which may result in insect death.
  • the method comprises introducing partially stabilized double stranded RNA (dsRNA), including its modified forms, such as small interfering RNA (siRNA) sequences, into cells or into extracellular medium, such as the midgut, into beetles where dsRNA enters cells and inhibits the expression of at least one or more target genes, and where inhibition exerts a deleterious effect on the pest.
  • dsRNA partially stabilized double stranded RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • the methods and associated compositions may be used to limit or eliminate coleopteran infestation or any host of pests, symbiotic pests, or environment in which the pest is present through one or more compositions comprising the dsRNA molecule described herein. pest diet.
  • the present invention further provides examples of nucleic acid compositions that are homologous to at least a portion of the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or fragments or additions thereof.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or fragments or additions thereof.
  • the invention provides a method for suppressing gene expression of a Coleoptera pest, such as cotton boll weevil or related species, which comprises provide in the pest diet a suppressor gene amount of at least one dsRNA molecule transcribed from a nucleotide sequence as described herein, at least one segment of which is complementary to a miRNA sequence within the pest cells .
  • the method may further comprise the death, nancy, or cessation of pest feeding.
  • a dsRNA molecule, including its modified form such as a siRNA molecule, fed to a pest according to the invention may be of less than about 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or about 100% identity with an RNA molecule transcribed from sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or additions thereof.
  • the present invention further provides a stabilized dsRNA molecule or the expression of one or more miRNAs for inhibiting expression of a target gene in a coleopteran pest expressed from this sequence and fragments thereof.
  • a stabilized dsRNA including a miRNA siRNA molecule, may comprise at least two coding sequences which are arranged in one direction and an antisense orientation with respect to at least one promoter, wherein the nucleotide sequence comprising a sense chain and an antisense chain is related or linked by a spacer sequence of at least from about three to about ten thousand nucleotides, wherein the sense chain and the antisense chain can be formed different lengths, and each of the two parts encode sequences of at least 80% sequence identity, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or 100% sequence identity, to any sequence of one or more nucleotide (s) according to the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO:
  • the invention further provides a fragment or concatamer of a nucleic acid sequence selected from the sequences. selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or additions thereof.
  • the fragment can be defined as causing death, or impairing the development of a harmful organism when expressed as a dsRNA and supplied to the pest.
  • the fragment may, for example, comprise at least about 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 or more contiguous nucleotides of the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or fragments or additions thereof, or a complement thereof.
  • a beneficial DNA segment for use in the present invention is at least 19 to about 23, or about 23 to about 100 nucleotides to about 2000 nucleotides in length or more.
  • Particularly useful for the present invention are DNA sequences, including about 19 to about 400 nucleotides homologous to a pest target sequence.
  • the invention also provides a ribonucleic acid expressed from any such sequence, including a dsRNA.
  • the sequence selected for use in expressing a gene suppressing agent may be constructed from a single sequence derived from one or more target pests and intended for use in expressing an RNA that functions in the suppression of a single gene or family. of genes in one or more target pests, or the DNA sequence may be constructed as a chimera of a plurality of DNA sequences.
  • this gene family is related to the chitin synthase gene family, specifically chitin synthase 1 and chitin synthase 2.
  • the invention provides constructions of
  • Recombinant DNA comprising a nucleic acid molecule encoding a dsRNA molecule described herein.
  • the dsRNA may be formed of a transcription tape of a nucleotide sequence molecule that is at least about 80% to about 100% identical to the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or fragments or additions thereof.
  • Such recombinant DNA constructs may be defined such as the production of dsRNA molecules capable of inhibiting or reducing endogenous target gene (s) expression in a pest cell upon ingestion.
  • the construct may include a nucleotide sequence of the invention operably linked to a promoter sequence that functions in the host cell.
  • the present invention may be used for tissue-specific or constitutive promoters.
  • tissue-specific promoters may be, but are not limited to, cotton bud flower specific promoters.
  • Nucleic acid constructs according to the invention may comprise at least one non-naturally occurring nucleotide sequence that can be transcribed into single stranded RNA capable of forming a dsRNA molecule in vivo by hybridization.
  • dsRNA sequences may be provided in the diet of a Coleoptera pest to achieve the desired inhibition.
  • the dsRNA molecule is formed by nucleotide sequences substantially similar to the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or additions thereof.
  • a recombinant DNA construct may contain sequences substantially similar to the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or additions thereof.
  • DsRNAs may express from constructs introduced at several different transformation events, or they may be introduced into a single nucleic acid molecule. DsRNAs may be expressed using a single promoter or multiple promoters.
  • the invention provides for a recombinant host cell to have in its genome at least one recombinant DNA sequence that is transcribed to produce at least one dsRNA molecule, which functions when ingested by a Coleoptera pest to inhibit or reduce expression of a target gene in a pest.
  • the dsRNA molecule may be encoded by the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ (DN 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or complements thereof.
  • the present invention also provides a transformed plant cell having in its genome at least one recombinant DNA sequence described herein. Transgenic plants comprising such a transformed plant cell are also provided, including progeny plants of any generation, seeds, and plant products, each comprising recombinant DNA.
  • the methods and compositions of the present invention may be applied to any monocotyledonous and dicotyledonous plant, depending on the desired coleopteran pest control.
  • the present invention describes a plant transformed with a recombinant DNA sequence as described in the sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO. No. 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments, or concatamers or complements thereof, which is transcribed to produce at least one dsRNA molecule, which functions when ingested by a Coleoptera pest to inhibit or reduce expression of a target gene.
  • the invention also provides combinations of methods and compositions for controlling Coleoptera pest infestations.
  • One means of providing a dsRNA method as described herein for protecting plants against insect infestation is in conjunction with one or more insecticidal agents that exhibit characteristics different from those exhibited by dsRNA methods and compositions.
  • one or more Bt proteins may be provided in the insect pest diet in combination with one or more dsRNAs as described herein.
  • the composition formulated for topical or derivative application using a transgenic approach combining dsRNA and Bt methods and compositions can be used to create synergies not previously known in the art to control insect infestation.
  • One synergy is the reduction in the level of expression required for dsRNA (s) or Bt protein (s).
  • each pest control agent When combined, the lowest effective dose of each pest control agent can be used. Insecticidal Bt proteins are believed to create pores through which dsRNA molecules are able to penetrate more effectively into remote spaces from the insect pest gut, or more efficiently to cells in the vicinity of Bt protein lesions, thus requiring less amount of Bt or dsRNA to achieve the desired result of insecticidal action or the desired inhibition or suppression of a specific biological function in the target pest.
  • the present invention therefore provides a composition containing two or more different pesticidal agents toxic to the same pest or insect species wherein at least one of which comprises a dsRNA described herein.
  • the second agent may be an agent selected from the group consisting of a pathogen .
  • a Bacillus thuringiensis insecticidal protein a Bacillus thuringiensis insecticidal protein, a Xenorhabdus insecticidal protein, a Photorhabdus insecticidal protein, a Bacillus laterosporous insecticidal protein, a Bacillus sphaericus insecticidal protein, chitinase family enzymes and a lignin.
  • An insecticidal Bacillus thuringiensis protein may be any of a number of insecticidal proteins, including but not limited to Cryl, Cry8, Cry O, Cry35 TIC851, CryET70, Cry225 TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, CryET33 insecticide protein and CryET34 binary , binary insecticidal protein CryET80 and CryET76, binary insecticidal protein TICIOO and TICIOI, binary protein insecticide PS 149BI, insecticidal VIP protein, protein TIC900 or the like, or combinations of insecticidal proteins ET29 or ET37 with insecticidal proteins TIC810 or TIC812 and insecticidal chimeras of any one of the previous proteins.
  • a ribonucleic acid which is supplied in the diet, may be supplied in an artificial diet formulated to meet the special nutritional needs for a particular pest.
  • the diet may also be a recombinant cell transformed with a DNA sequence constructed for expression of the target agent, RNA or gene suppressing agent.
  • the desired result is phenotypically observed, indicating that the agent was used to inhibit or reduce expression of a target nucleotide sequence. which is inside the pest cells.
  • a target gene can code for the suppression of an essential protein.
  • the target gene is from the chitin synthase family whose function is the constitution of the cuticle, trachea and chitin formation of the peritrophic membrane. Therefore, inhibition or reduction of expression of such gene may affect essential functions for insect survival to be selected from cuticle differentiation and development group, egg formation, larval maturation, larval stage transition, pupation, digestion and assimilation. of nutrients, protection against pathogens.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for improving the yield of a plant subjected to insect pest infestation, said method comprising the steps of: a) introducing a polynucleotide comprising a sequence substantially similar to the sequences selected from the group consisting of of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or supplements thereof or concatamers in said plant, and b) cultivar. the plant to allow expression of said characteristic.
  • Still another aspect of the invention provides agronomically and commercially important products and / or compositions of matter, including, but not limited to, feed, commodities, products and by-products intended for use as food for human consumption or for use. in compositions and products intended for human consumption, including, but not limited to, cottonseed meal, cottonseed oil, cottonseed cake, cotton feather, cotton fiber, cereals, and so on.
  • Such compositions may be defined as containing a detectable amount of a nucleotide sequence set forth herein, and thus are also diagnostic for any transgenic event containing such nucleotide sequences.
  • Such products are useful at least because they are obtainable from crops propagated with less organophosphate pesticides and as a result of their incorporation of the nucleotides of the present invention to control coleopteran pest infestation in plants.
  • Such commodities and commodities may be produced from seeds produced from a transgenic plant, wherein the plant expresses RNA from one or more contiguous nucleotides of the present invention or nucleotides from one or more Coleoptera pests and their respective. you complements.
  • One method of producing such a product comprises obtaining a plant transformed with a polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or fragments or additions thereof or concatamer thereof is also provided in the present invention.
  • a method of producing human or animal feed comprising obtaining a plant transformed with a polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or a fragment or concatamer or complement thereof, and preparing the feed or feed from said plant or part thereof is yet another aspect. of the invention.
  • the invention also provides a computer readable medium having recorded in it a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 and SEQ. ID No. 6 or fragments or additions thereof or concatamer thereof, for use in a number of computer applications, including, but not limited to, DNA identity and search for protein similarity, identity and search, profile characterizations transcription, genome comparisons, and artificial hybridization analyzes.
  • nucleic acid refers to a large molecule which may be single stranded or double stranded, composed of monomers (nucleotides) containing a sugar, a phosphate and a purine or pyrimidine base.
  • a “nucleic acid fragment” is a fraction of a given nucleic acid molecule.
  • “Complementarity” refers to the specific pairing of purine and pyrimidine bases consisting of nucleic acids: thymine adenine pairs and cytosine guanine pairs.
  • the "complement" of a first nucleic acid fragment refers to the second nucleic acid fragment whose nucleotide sequence is complementary to the first nucleotide sequence.
  • nucleotide sequence refers to nucleotide polymer sequences, forming a strand of DNA or RNA, which may be single or double stranded, optionally synthetic, unnatural or with altered nucleotide bases capable of incorporation into DNA or RNA polymers.
  • oligomer refers to short nucleotide sequences, usually up to 100 bases in length.
  • homologous is the linkage between nucleotide sequences of two nucleic acid molecules or between amino acid sequences of two protein molecules. Estimation of such homology is provided by DNA-DNA or RNA-RNA hybridization under stringency conditions as defined in the prior art (as mentioned in US20030074685, Hemes and Higgins, Ed. (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK); or by comparing sequence similarity between two nucleic acid or protein molecules (as mentioned in US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48: 443-453).
  • Gene refers to the nucleotide fragment expressing a specific protein, including regulatory sequences preceding (5 'untranslated region) and following (3' region untranslated) to the coding region.
  • “Native gene” refers to an isolated gene with its own regulatory sequence found in nature.
  • “Chimeric gene” refers to the gene that comprises coding, regulatory and heterogeneous sequences not found in nature.
  • the chimeric gene of the present invention comprises isolated sense or antisense nucleic acid molecules operably linked to active promoters. Gene constructs of the present invention may contain 1 or more chimeric genes and may or may not have introns.
  • Endogenous gene refers to the native gene normally found in its natural location in the genome and is not isolated.
  • An “exogenous gene” refers to a gene that is not normally found in the host organism but is introduced by gene transfer.
  • “Pseudogene” refers to a nucleotide sequence that does not encode a functional enzyme.
  • Coding sequence refers to the DNA sequence that encodes a specific protein and excludes the noncoding sequence.
  • An "interrupted coding sequence” means the sequence that acts as a separator (for example, one or more introns linked through junctions).
  • An "intron” is a nucleotide sequence that is transcribed and present in the pre mRNA, but is removed by cleavage and re-binding of the mRNA within the cell generating a mature mRNA that can be translated into a protein.
  • introns include, but are not limited to, pdk2 intron, castor bean catalase, Delta 12 cotton denaturase intron, Arabidopsis Delta 12 denaturase, ubiquitin intron, SV40 intron, malate synthase gene introns.
  • RNA transcript refers to the product resulting from RNA polymerase catalyzed transcription of a DNA sequence. When the RNA transcript is a perfect copy of the DNA sequence, it is referred to as the primary transcript or it may be an RNA sequence derived from a post-transcriptional process of the primary transcript and is then referred to as mature transcript.
  • Messenger RNA (mRNA) refers to RNA that is without introns.
  • RNA sense refers to an RNA transcript that includes mRNA.
  • Antisense RNA refers to an RNA transcript that is complementary to all parts of a primary transcript or mRNA and that can block the expression of a target gene by interfering with the process. processing, transport and / or translation of your primary transcript or mRNA.
  • antisense RNA can be with any part of the specific gene transcript, i.e., 5 'untranslated sequence, 3' untranslated sequence, introns or coding sequence.
  • antisense RNA may contain regions of ribozyme sequences that enhance the effectiveness of antisense RNA to block gene expression.
  • Ribozyme refers to catalytic RNA and includes specific endoribonuclease sequences.
  • DsRNA (double-stranded) refers to the clamp structure formed between the mRNA or sense RNA sequence, the sequence of a spacer region, and the antisense RNA sequence.
  • Spacer region refers to a nucleotide sequence that is unrelated to the target gene sequence, such as an intron sequence.
  • vector refers to a replicon, such as plasmid, phage or virus, to which other gene sequences or elements (whether DNA or RNA) may be linked. In this way the genes can be replicated along with the vector.
  • a replicon such as plasmid, phage or virus
  • phagemid refers to a vector containing sequence for phage and bacterial replication, this vector has characteristics that meet host cell specifications as well as selection agents and promoters.
  • recombinant vector results from the combination of a commercial vector with nucleic acid molecules of the present invention operably linked to a promoter of interest and a termination signal.
  • Such vectors may be obtained commercially, including those provided by Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Invitrogen (Car-Isbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass. .) and Promega (Madison, Wis.).
  • vectors used in the present invention are pCambia series vectors (BioForge Co.), pB1121 (Chen, Po-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching; To, Kin-Ying Complete sequence of the binary vector pBM 21 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants Molecular Breeding vol.1 1 issue 4 May 2003. p 287-293), pBSK (Addgene Co.), pGEM- T easy (Promega Corporation) tion), pET101 / D-TOPO (Invitrogen).
  • pCambia series vectors BioForge Co.
  • pB1121 Choen, Po-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching
  • To Kin-Ying Complete sequence of the binary vector pBM 21 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants Molecular Breeding vol.1 1 issue 4 May 2003. p 287-293
  • pBSK Additional
  • Substantially similar or substantially similarity refers to nucleic acid fragments in which changes in one or more nucleotide bases do not affect the ability of the nucleic acid fragment to mediate alteration of gene expression by gene silencing through, for example, antisense technology, co-suppression or interfering RNA (RNAi).
  • Substantially similar nucleic acid fragments of the present invention may also be characterized by the percentage similarity of their nucleotide sequences to the nucleotide sequences of the nucleic acid fragments described herein (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.
  • nucleic acid fragments are those whose nucleotide sequences have at least about 40 or 45% sequence identity, preferably about 50% or 55% sequence identity, more preferably about 60% or 65% identity. more preferably about 70% or 75% sequence identity, more preferably about 80% or 85% sequence identity, more preferably about 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity as compared to the reference sequence.
  • dsRNA is by having the nucleotide sequence of the target gene in the sense orientation and a nucleotide sequence in the antisense orientation present in the DNA molecule, and there may or may not be a spacer region between the sense and antisense nucleotide sequences. .
  • the nucleotide sequences mentioned may be from about 19nt to 2000nt or about 5000 nucleotides or more, each having substantial total sequence similarity. with about 40% to 100%. The longer the sequence, the less stringency is required for full substantial sequence similarity.
  • Fragments containing at least about 19 nucleotides should preferably have about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity as compared to the reference sequence, which may have about 2 distinct noncontiguous nucleotides. Preferably fragments above 60bp are used, more preferably fragments between 100 to 600bp.
  • the dsRNA molecule may comprise one or more regions having substantial sequence similarity to regions with at least about 19 consecutive nucleotides of the target gene sense nucleotides, defined as the first region, and one or more regions. regions having substantial sequence similarity to regions with about 19 consecutive nucleotides of the target gene sense nucleotide complement, defined as the second region, where these regions may have base pairs separating them from each other.
  • dsRNA double stranded RNA
  • the invention is also supported by having a gene construct that is capable of being expressed in cells of eukaryotic organisms of interest operably linked to a DNA molecule which when transcribed produces a dsR-NA molecule comprising a first region and a second region, where:
  • the first region comprises a nucleotide sequence of at least about 19 consecutive nucleotides having substantial sequence similarity to at least about 19 consecutive nucleotides of the target gene sense nucleotide sequence;
  • the second region comprises a nucleotide sequence of about at least 19 consecutive nucleotides having substantial sequence similarity to the complement of about at least at least 19 consecutive nucleotides of the sense nucleotide sequence of the target gene;
  • the first and second regions are capable of forming a double-stranded RNA region, which may have, in addition to the total length of the first and second regions, a spacer region therebetween containing at least about 3 nucleotides.
  • Promoter refers to the DNA sequence in a gene, usually located upstream of the coding sequence, which controls expression of the coding sequence by promoting recognition by RNA polymerase and other factors required for transcription itself. In an artificial DNA construct, promoters may also be used to transcribe dsRNA. Promoters may also contain DNA sequences that are involved in the binding of protein factors which control the effect of transcription initiation in response to physiological or developmental conditions.
  • the promoter is a constitutive promoter.
  • promoter activity is stimulated by external or internal factors such as, but not limited to, hormones, chemical compounds, mechanical impulses, and biotic or abiotic stress conditions.
  • the promoter activity may also be regulated in a temporal and spatial manner (such as tissue-specific promoters and regulated promoters during development).
  • the promoter may contain enhancer elements.
  • An enhancer is a DNA sequence that can stimulate promoter activity. It may be an innate promoter element or a heterologous element inserted to increase the level and / or tissue specificity of a promoter.
  • Constutive promoters refer to those who drive gene expression in all tissues at all times.
  • tissue-specific or development-specific promoters are those that drive gene expression almost exclusively in specific tissues, such as leaves, roots, stems, flowers, fruits or seeds, or at specific stages of development in a tissue, as at the beginning or end of embryogenesis.
  • expression refers to the transcription and stable accumulation of dsRNA derived from the nucleic acid fragments of the invention which, together with the cell protein production apparatus, results in altered levels of myo-inositol 1-phosphate synthase.
  • inhibition by interference refers to the production of dsRNA transcripts capable of preventing expression of the target protein.
  • “Appropriate regulatory sequences” refers to nucleotide sequences in native or chimeric genes that are located above (5 'untranslated region), within, and / or below (3' untranslated region) of the nucleic acid fragments of the invention, which control the expression of the nucleic acid fragments of the invention.
  • altered levels refer to the production of gene products in transgenic organisms in amounts or proportions that differ from those in normal or non-transgenic organisms.
  • the present invention also relates to vectors which include chitin synthase 1 and 2 enzyme gene sequences in sense and antisense orientation, and host cells which are genetically engineered with vectors of the invention.
  • Transformation refers to the transfer of the exogenous gene into the genome of a host organism and its genetically stable inheritance.
  • Plants refer to photosynthetic organisms, both eukaryotes and prokaryotes, where the term “developed plants” refers to eukaryotic plants.
  • the nucleic acids of the invention may be used to confer desired treatments on essentially any plant.
  • the invention has use for various plant species, including species of the genera Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, coconuts, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycoperosicon, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Pani- eum Pannesetum Passiflora Persea Phaseolus Pistachia Pisum Pyrus Prunus Psidium Raphanus Ricinus Secale Senecio Sinapis Solanum Sorghum Theobromus Trigonella Triticum Vicia Vitis Vigna and Zea.
  • the promoter is a plant expressed promoter.
  • plant expressed promoter means a DNA sequence that is capable of initiating and / or controlling transcription in a plant cell. This includes any plant promoter; any promoter of non-plant origin which is capable of directing expression in a plant cell, for example viral or bacterial promoters such as Ca V35S (as mentioned in US20030175783, Hapster et al., 988 Mol. Gen.
  • tissue-specific or organ-specific promoters including but not limited to seed-specific promoters (WO8903887), primordial organ-specific promoters (as mentioned in US20030175783, An et al., 1996 The Plant Celi 8, 15 -30), stem specific promoters (as mentioned in US200301 5783, Keller et al., 1988 EMBO J.
  • leaf specific promoters (as mentioned in US20030175783, Hudspeth et al ., 1989 Plant Mol Biol 12: 579-589), mesophil-specific promoters, root-specific promoters (as mentioned in US20030175783, Keller et al., 1989 Deves Genes. 3: 1639-1646), tubers (as mentioned in US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323: 1330), vascular tissue specific promoters (as mentioned in US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359 -369), esp. stamen-specific (WO8910396, WO9213956), dehiscence zone specific promoters (WO97 3865); and the like.
  • the transcription termination signal and the polyadenylation region of the present invention includes, but is not limited to, SV40 termination signal, HSV TK adenylation signal, Agrobacterium tumefasciens (non-palpine synthase) gene termination signal. ), CaMV RNA 35S gene termination signal, Trifolium subterranean (SCSV) attack terminating virus signal, Aspergillus nidulans trpC gene termination signal, and the like.
  • the present invention also includes providing the dsRNA molecules, which may be obtained by transcription of the molecules contained in the buildings' gene and that are useful for the methods according to the invention.
  • Another object of the present invention is to provide eukaryotic cells, and eukaryotic organisms containing dsRNA molecules of the invention, or containing the chimeric genes or gene constructs capable of producing dsRNA molecules of the invention.
  • Gene constructs may be stably integrated into the genome of cells of eukaryotic organisms.
  • gene constructs may be provided in a DNA molecule capable of autonomously replicating in the cells of eukaryotic organisms such as viral vectors.
  • the gene construct or dsRNA may also be transiently arranged in the cells of eukaryotic organisms.
  • the gene constructs or chimeric gene of the invention may be introduced into the desired host plant genome by a variety of conventional techniques. For example, it can be introduced directly into plant cell genomic DNA using techniques such as electroporation and microinjection of plant cell protoplasts, or the construct can be introduced directly into plant tissue using ballistic methods such as bombardment of coated particles. with DNA.
  • Microinjection techniques are known in the state of the art and well described in scientific and patent literature.
  • the introduction of gene constructs using polyethylene glycol precipitations is described in Paszkowski et al. Embo J, 3: 2717-2722, 1984 (as mentioned in US20020 52501).
  • Electroporation techniques are described in From et al. Proc. Natl. Acad. Know. USA 82: 5824, 1985 (as mentioned in US20020152501).
  • Ballistic transformation techniques are described in Klein et al. Nature 327: 70-73, 1987 (as mentioned in US20020152501).
  • the gene constructs may be combined with appropriate T-DNA flanking regions and introduced into the conventional Agrobacterium tumefasciens host vector.
  • the virulence function of the host Agrobacterium tumefasciens will direct the insertion of the gene constructs and adjacent marker into the plant cell DNA when the cell is infected with the bacterium.
  • Agrobacterium tumefasciens-mediated transformation techniques including disarmament and the use of binary vectors, are well described in the scientific literature (as mentioned in US patent application 20020152501, Horsch et al. Science 233: 496-498, 1984; and Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803, 1983).
  • Transformed plant cells that are derived from any of the transformation techniques described above can be cultured to regenerate an entire plant that has the transformed genotype and then the desired phenotype such as absence or reduction of chytinous formation of coleopteran insects such as such as the cuticle and / or peritrophic membrane.
  • Such regeneration techniques rely on the manipulation of certain phytohormones in tissue culture growth media, typically containing a biocidal and / or herbicidal marker, which must be introduced together with the desired nucleotide sequence. Plant regeneration from protoplast culture is described in Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, pp.
  • the enzyme in eukaryotic cells responsible for generating small RNA molecules with about 21 dsRNA nucleotides can be saturated by including too many dsRNA sequences (i.e. complementary RNA molecules) that are unrelated to the nucleotide sequence of the target gene or gene to be silenced.
  • Embodiments of the present invention may be effective against a variety of pests.
  • pests include, but are not limited to, insects, fungi, bacteria, nematodes, mites, protozoan pathogens, animal parasites, and the like.
  • Pests of particular interest are pest insects, particularly pest insects that cause significant damage to agricultural plants.
  • insects pests and other similar pests such as, for “example, insects of the orders Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermapte- m, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera , Trichoptera, etc., in particular Coeleoptera, especially Anthonomus grandis, Diabrotica virgifera, Tenebrio molitor, Tribolium castaneum, Phoracantha semipunctata, Lxus angustatus, Acanthoscelides obtectus, and other coleopters that cause damage to wood and plants of the Scolytidae families.
  • ⁇ tion of most cultivars include, but are not limited to: Corn - Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, elasmopalpus, Diatraea saccharalis Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi, Diabrotica undecim-punctata howardi, Me lanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus leucopterus, Melanoplus femurrubrum,
  • the present invention is further defined in the following Examples.
  • Example 1 Nucleotide sequence identification of Anthonomus grandis chitin synthase 1 and chitin synthase 2 enzymes for dsRNA preparation.
  • grandis chitin synthase 1 and chitin synthase 2 total RNA was isolated from adult eggs, larvae and insects using Trizol (Invitrogen) following the protocol indicated by the manufacturer.
  • CDNA was synthesized from 5Dg of total RNA using the Superscript II TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR kit (Invitrogen) using oligo NV-d (T) 30-AP (Table I).
  • degenerate primers corresponding to conserved regions found in catalytic domains of chitin synthases of other insects were used. Two consecutive PCR steps were performed using degenerate primers.
  • the first PCR step consisted of catalytic domain segment amplification between the conserved amino acids DPDYYEFE and LHPQE using degenerate oligonucleotides for the sense primer and antisense primer.
  • the PCR conditions in this first step were as follows: 1 DL diluted cDNA (1: 20), 2.0 DL 10X High Fidelity Buffer, 0.8 DL MgSO 4 (50mM), 0.4 DL dNTP ( 10 mM), 0.4 DL of each oligonucleotide (10 DM), 0.2 DL (1 U) of Taq Platinum® High Fidelity (Invitrogen) and 14.8 DL of H 2 O.
  • the first step diluted 1 20 product was used as a template and oligonucleotide primers were used between the DGDIDF (sense primer) and QYDQGEDRW or GPGTIFLM (antisense primer) regions.
  • PCR reactions with degenerate primers were performed using the following conditions: 94 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 48 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 1 minute.
  • FIG. 1 illustrates the steps of cloning AntgCHS cDNA synthesized from RNA extracted from A. grandis eggs. Oligonucleotides used in the cloning and AntgCHSI steps are listed in Table I.
  • Figure 2 illustrates the steps of cloning the AntgCHS2 cDNA. synthesized from RNA extracted from A. grandis larvae and adults. The oligonucleotides used in the AntgCHS2 cloning steps are listed in Table II. The full sequence of AntgCHSI SEQ ID NO: 1 cDNA and AntgCHS2 SEQ ID NO: 3 cDNA were obtained by overlapping the fragments obtained by the 5 'and 3' RACE.
  • AntgCHSI S E CGGGGATATTGA I I I CCAACC
  • the design of the double stranded RNA segment consisted of choosing fragments between 80 bp and 600 bp (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) using the template sequences.
  • BLOCK-iT TM RNAi Designer program available at http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress was used, which analyzes sequences and indicates regions most likely to be used for gene silencing. .
  • dsRNA double stranded RNA
  • PCR DNA templates for double stranded RNA (dsRNA) synthesis by in vitro transcription were synthesized by PCR, the oligonucleotide sequences are listed in Table III.
  • Selected cDNA target regions were amplified by PCR reactions using specific primers flanked by the minimal T7 promoter sequence (5'-TAA-TACGACTCACTATAGGGAGA) using the following conditions: 94 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 1 minute. After amplification, PCR products were cloned into the pGEM-T-easy vector for confirmation of the target sequence by sequencing.
  • dsRNA synthesis was performed using 0.5 pg of PCR product from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 flanked with T7 RNA polymerase promoter region, as a template for a transcription reaction volume of 20 pl_, as described in the ME-GAscript® T7 High Yieid (Ambion) kit manual protocol, the reaction contained 7.5mM of each ribonucleotide ATP, CTP, GTP and UTP, 1x buffer and 50U of T7 RNA polymerase.
  • the reaction was incubated for 16 h at 37 ° C, followed by DNAse I treatment for 15 minutes.
  • the reaction products were incubated at 70 ° C for 5 minutes and cooled to room temperature (22 ° C).
  • phenol / chloroform extraction and subsequent precipitation with isopropyl alcohol were followed as described by the manufacturer of the MEGAscript® T7 High Yield (Ambion) kit.
  • the dsRNA was dissolved in DEPC treated water. The integrity of dsRNA was evaluated by 1% agarose gel electrophoresis and quantification was obtained by spectrophotometry. The final concentration of each dsRNA was adjusted to 200 ng / DL for use in microinjection assays for gene silencing evaluation.
  • dsRNA samples were used in bioassays against cotton boll weevil.
  • the dsRNA was prepared from sequences identified as described in Example 1.
  • the microinjection was performed using a 10 DL Hamilton syringe.
  • Each insect was given 1 DL of aqueous solution containing or not dsRNA.
  • Larval injection was performed in the dorsal region between the fourth or fifth abdominal segment. In adult insects there was a need to lift one of the elytres to expose the abdomen, the site of microinjection.
  • insects After injection the insects were: 1) maintained under standard dietary feeding conditions as described by Monnerat et al (MONNERAT, RG, et al., Mass rearing of the cotton boll weevil Anthonomus grandis in the laboratory. Technical Announcement, 46, Embrapa -Cenargen: Bras ⁇ lia, 2000), 2) removed when necessary according to the experimental period, 3) frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until total RNA extraction.
  • Monnerat et al MONNERAT, RG, et al., Mass rearing of the cotton boll weevil Anthonomus grandis in the laboratory.
  • Technical Announcement, 46, Embrapa -Cenargen: Bras ⁇ lia, 2000 2) removed when necessary according to the experimental period, 3) frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until total RNA extraction.
  • AntgCHSI silencing on phenotypic parameters of A. grandis females was determined by AntgCHSI dsRNA microinjection bioassays (SEQ ID NO: 2) in adult females.
  • the phenotypic parameters quantified were oviposition, egg viability and mortality of adult insects.
  • Each experimental unit consisted of 6 48hs adult female insects microinjected with 200ng dsRNA and 8 non-microinjected adult male insects, the experimental period was 12 days. The insects were kept in small cages, where the cage floor was made with mesh to allow egg collection. Male insects were marked with silver gliter to facilitate identification. Bioassay monitoring was performed every 48 hours, at which time water and artificial diet were offered ad libitum.
  • the bioassay consisted of three biological replicates with three technical replicates.
  • the control treatment consisted of dsRNA application of an unrelated gene.
  • dsRNA with Escherichia coli gus gene sequence was used.
  • Tukey's multiple comparisons test was used to analyze the data obtained from the bioassays.
  • Eggs obtained from this experiment were subjected to real time PCR analysis of AntgCHSI expression as described in example 5.
  • larvae of the third instar were microinjetadas with 200ng AntgCHSI dsRNA.
  • Each experimental unit consisted of 20 larvae.
  • the bioassay consisted of three biological replicates with three technical replicates. The experimental period was 10 days. After this period the larvae were counted and the phenotypes obtained were analyzed and photographed.
  • Chitin synthase 2 (AntgCHS2) enzyme were evaluated several variables as follows: 1- influence of dsRNA segment size; 2- locating the target dsRNA sequence within the AntgCHS2 cDNA sequence (SEQ ID NO: 3); 3 - effect of microinjected dsRNA concentration; 4- persistence of silencing during insect development phases. The details of these experiments are described below.
  • AntgCHS2-1 (SEQ ID NO: 4)
  • AntgCHS2-2 the centrally located dsRNA
  • AntgCHS2-3 the 3 'end located dsRNA, called AntgCHS2-3 (SEQ ID NO: 6)
  • the segments chosen for the synthesis of dsRNAs were 213, 587 and 184 bp, respectively.
  • AntCHSB-3 / insect dsRNA concentrations SEQ ID NO: 6
  • This dsRNA was chosen from the three available because it is specific for A. grandis, and smaller (184 bp), which decreases the possibility of cross-silencing effect with non-target genes.
  • a total of 12 adult insects were microinjected. After 72 hours four insects were randomly selected, frozen in liquid nitrogen and kept at -80 ° C. Synthesis of cDNAs from different treatments as well as qRT-PCR analysis were performed as described in example 5.
  • Larvae were microinjected with dsRNA to assess persistence of the effect of RNAi on adult insects.
  • laRNAi RNAi larval
  • Huvenne and Smagghe for this type of experiment.
  • Huvenne and Smagghe for this type of experiment.
  • Third instar larvae of development were microinjected with 200 ng of dsRNA AntgCHS2-3 (SEQ ID NO: 6) and placed on artificial diet.
  • Adult insects aged 72 hours underwent real-time PCR analysis as described in example 5.
  • AntgCHS2 silencing on phenotypic parameters of A. grandis females was performed by microinjection bioassays in adult females.
  • the phenotypic parameters quantified were oviposition, egg viability and mortality of adult insects.
  • Each experimental unit consisted of 16 microinjected 48hs adult female insects with 200ng dsRNA and 8 non-microinjected adult male insects, the experimental period was 12 days. The insects were kept in small cages, where the cage floor was made with mesh to allow egg collection. Male insects were marked with silver gliter to facilitate identification. Bioassay monitoring was performed every 48 hours, at which time water and artificial diet were offered ad libitum. The bioassay consisted of three biological replicates with three technical replicates.
  • control treatment consisted of dsRNA application of an unrelated gene, in which case dsRNA was used. with E. coli gus gene sequence. To analyze the data obtained from the bioassays, a variance analysis was applied, followed by Tukey's multiple comparisons test, at 5% significance level.
  • qRT-PCR real-time quantitative PCR
  • CDNA was synthesized using the SuperScript TM III Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen) from 1 Dg of Ambion® DNAse I RNAse-free TM (Invitrogen) treated total RNA using the NV-d (T) 30-AP oligonucleotide (see Table i).
  • the real time PCR reaction was performed on the 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) using SYBR TM Green as the intercalating fluorophore. Oligonucleotide sequences used for transcript evaluation are described in Table IV. Each reaction was performed with 2 DL of a 1: 20 dilution of cDNA, 0.2 DM of each oligonucleotide in a total volume of 10 DL.
  • the qRT-PCR program consisted of an initial step at 95 ° C for 10 minutes followed by 40 cycles of 95 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • Example 6 Results of dsRNA microinjection bioassays and gene silencing evaluation for Chitin synthase 1 enzyme in A Grandis (AntgCHSI)
  • Example 7 Results of the dsRNA Microinjection Bioassays and Functional Evaluation of Chitin Synthase 2 Enzyme Gene Silencing (AntgCHS2) in A grandis.
  • the cDNA sequence of the Anthonomus grandis Chitin synthase 2 (or B) gene was identified, whose size was 4729 nucleotides (SEQ ID NO 3). Within this sequence three regions of different sizes (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6) were selected to serve as a template for the synthesis of dsRNA molecules as described in Example 1. It was verified by bioassays. The results from microinjection and the results of real - time PCR analysis showed that dsRNAs of different sizes, ranging from 80 bp to 600 bp, were able to suppress the number of AntgCHS2 transcripts without statistically differing between treatments.

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Abstract

A presente invenção está relacionada ao controle de infestação de praga através da inibição ou redução da expressão de genes da família da quitina sintase. A invenção provê ainda métodos e composições para o controle de pragas, através da alimentação de uma ou mais moléculas de RNA de fita dupla provida pela presente invenção. A invenção descreve ainda um método de obtenção de plantas transgênicas que expressem moléculas de RNA de fita dupla. A presente invenção é preferencialmente utilizada para plantas de algodoeiro.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO E COMPOSIÇÕES PARA CONTROLE GENÉTICO DE INSETOS-PRÂGA EM PLANTAS DE ALGODÃO ATRAVÉS DO SILENCIAMENTO DE GENES DE QUITINA SINTASES".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos- praga que atacam lavouras agrícolas, especialmente algodoeiros, através do silenciamento de genes de quitina sintases mediado por RNA dupla fita (dsRNA) expresso em plantas de algodão.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A agricultura é um dos principais pilares da economia de países em desenvolvimento. No Brasil, as principais culturas produzidas são: soja, algodão, milho, feijão, café, cana-de-açúcar, entre outras. No entanto, a maioria destas culturas tem a sua produção prejudicada pela incidência de insetos-praga e doenças. As perdas na produção agrícola causadas por ín- setos-praga chegam a níveis elevados de mais de 37% e sabe-se que cerca de 200 doenças de plantas são causadas por fitopatógenos (HAQ, S. K., et al., Protein proteinase inhibitor genes in combat against insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection. Archives of biochemistry and biophysics, v. 431 , n. 1. p. 145-159. 2004). A necessidade de controlar os insetos-praga e patógenos na agricultura tem impulsionado o desenvolvimento de diferentes pesticidas que diminuem as perdas e contribuem com o agronegócio, porém, são altamente tóxicos, não somente à espécie alvo, como também aos outros animais e até aos humanos.
O algodoeiro é, dentre todas as plantas domésticas e cultiváveis, uma das mais atacadas por doenças e insetos-praga, além de apresentar alta sensibilidade à ocorrência imposta por plantas daninhas (Beltrão, E. M., Souza, J. G. O agronegócio do algodão no Brasil. Embrapa: Brasília, v.01 , 1999). Dentre os principais insetos-praga, destaca-se o bicudo-do- algodoeiro, Anthonomus grandis (Boheman, C. H. Description of new speci- es. In Schoenherr, Genera et species Curculionidum cum synonymia hujus Fa- miliae, vol. 7, pt. 2. Paris: Roret. 461 p., 1843), considerado uma das pragas mais sérias da cultura do algodão, encontrando-se dispersa no México, Cuba, Haiti, Venezuela, Colômbia, Paraguai e Brasil. Este inseto utiliza os botões florais e frutos do seu hospedeiro como fonte de alimento e local de desenvolvimento, causando prejuízos diretos à comercialização da fibra de algodão. Os níveis de infestação crescem rapidamente e os prejuízos podem atingir até 100% da produção, caso as medidas de controle não sejam adequadas. Este inseto representa um grande potencial de dano, sendo considerado praga-chave no planejamento e controle de insetos nocivos à cultura, principalmente devido à dificuldade de controle pelos inseticidas químicos.
O algodoeiro e suas pragas coexistem por um longo período evolutivo. Planta e inseto formam um sistema morfológico e bioquímico interdependente e competitivo, resultando na maioria das vezes, na utilização de parte da planta pelo inseto. Essa parte utilizada representa o dano causado pelo inseto à planta, e depende do tamanho da população da praga, e da habilidade da planta em resistir ao ataque e de se recuperar do dano sofrido (Beltrão, E. . , Souza, J. G. O agronegócio do algodão no Brasil. Embrapa: Brasília, v.01 , 1999).
A interação planta versus inseto pode ser visualizada de pelo me- nos duas maneiras: do ponto de vista do inseto, com a planta variando de adequada a completamente inadequada como hospedeira e, por outro lado, do ponto de vista da planta onde, quanto menor o número de espécies e abundância de insetos associados a ela, e quanto menor o efeito que esses insetos exercem sobre elas, maior a sua resistência sobre esses insetos (Santos, W. J. Identificação, biologia, amostragem e controle das pragas do algodoeiro. In: Embrapa Agropecuária Oeste; Embrapa Algodão. Algodão: tecnologia de produção. , p. 296p. 2002).
Entre um extremo e outro de resistência das plantas aos insetos- praga, existe um completo e extensivo arsenal de mecanismos de ataque e contra-ataque a ação dos insetos, que vão desde um simples impedimento morfológico a complexos componentes fitoquímicos, que interferem direta- mente no processo metabólico envolvido na utilização da planta como nos- pedeira do inseto. Em termos práticos, a resistência do algodoeiro aos inse- tos-praga representa a habilidade de certas cultivares produzirem algodão de melhor qualidade em maior quantidade que outros cultivares, sob ataque da mesma população de inseíos-praga (Freire, E. C. Cultivares e produção de semente na melhoria da qualidade do algodão no nordeste e centro- oeste do Brasil. Boletim informativo Embrapa/ CNPA. 1997).
Atualmente, tem surgido uma necessidade para o desenvolvimento de métodos mais seletivos, sem ação sobre o meio ambiente, não persistentes e biodegradáveis e que se adaptem bem a programas de controle de insetos-praga.
Devido aos perigos associados ao controle químicos de insetos, diversas abordagens moleculares para o controle de pragas em plantas foram desenvolvidas. A mais de trinta anos a utilização do Bacíííus thuríngíen- sis, vem se mostrando uma alternativa segura, e cada vez mais suas ento- motóxinas são transferidas para variedades comerciais. Campos plantados com as variedades íransgênicas apresentam uma redução drástica na utilização de inseticidas em todo o mundo, o que adicionalmente causa uma diminuição de casos de envenenamento e também um aumento no número de insetos benéficos nas plantações.
Atualmente, o RNA interferente, apresenta-se como uma ferramenta com grande potencial para o combate de insetos pragas, tendo em vista sua especificidade, e alta eficiência na supressão do mRNA alvo.
O mecanismo de RNA interferente (RNAi) é um fenómeno que ocorre naturalmente nas células e em diversos organismos eucarióticos. Tal processo, descrito primeiramente em plantas, foi denominado como silenciamento gênico pós-transcricional, ou PTGS (NAPOLI, C , et al., Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in Trans. Plant Celi, v. 2, n. 4. p. 279-289. 1990). No entanto, a primeira descrição de silenciamento gênico em animais, assim como sua melhor compreensão, foi obtida em Cae- norhabditis elegans, nematóide de vida livre e organismo modelo (FIRE, A,, et al. , Potent and specific genetic interference by double-síranded RNA in Caenorhabditis etegans. Nature, v. 391 , n. 6669. p. 806-81 1. 1998). Atual- mente sabe-se que esse processo participa de forma integrai na regulação da expressão gênica em várias plantas e outros eucariotos (LILLEY, C. J., et al., Recent progress in the development of RNA interference for plant parasi- tic nematodes. Molecular Plant Pathology, v. 8, n. 5. p. 701 -7 1 . 2007).
Seu mecanismo de ação baseia-se principalmente na introdução de um RNA dupla fita em um organismo aivo, por microinjeção ou ingestão (FIRE, A. , et al. , Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, v. 391 , n. 6669. p. 806-81 1 . 1998). Esse RNA dupla fita inicia um processo de silenciamento gêníco pós- transcricional, através da degradação de mRNAs homólogos, causando uma diminuição na síntese da proteína correspondente (MEISTER, G.; TUSCHL, T. , Mechanisms of gene siiencing by double-stranded RNA. Nature, v. 431 , n. 7006. p. 343-349. 2004), dificultando a sobrevivência ou até mesmo le- vando o parasito a morte.
Desde a sua descrição iniciai a técnica transformou-se em uma ferramenta valiosa para a genômica funcional de insetos, em particular no estudo de função gênica em Drosophila melanogaster (MESQUITTA, L.; PATERSON, B. M. , Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-Í): a role for nautilus in embryoniç somatic muscle formation. Proc Natl Acad Sei U S A, v. 96, n. 4. p. 1451-1456. 1999; KEN- NERDELL, J. R.; CARTHEW, R. W. , Heritabie gene siiencing in Drosophila using double-stranded RNA. Nat Biotechnol, v. 18, n. 8. p. 896-898. 2000). Trabalhos recentes mostraram a viabilidade de plantas que produziam dsR- NA na resistência contra insetos pragas. Essas plantas transgênicas produziram dsRNA específicos contra genes essenciais no trato digestivo dos insetos causando mortalidade em 24h depois do contato com o RNAi (BAUM, J. A., et al., Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol, v. 25, n. 1 1. p. 1322-1326. 2007; AO, Y. B., et a . , Silenc- ing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plantmediated RNAi irnpairs iarval tolerance of gossypol. Nat Biotechnol, v. 25, n. 1 1. p. 1307- 1313. 2007). A aplicação de RNAi in planta tem um grande potencial como uma abordagem para o manejo de insetos. A especificidade do RNAi para fins inseticidas é uma consideração importante para o uso desta tecnologia em aplicações práticas, já que os efeitos sobre inseíos não-afvo podem ser minimizados. Dentre outras vantagens, esta técnica permite o uso de apenas fragmentos de sequências, tendo em vista que a tradução de uma proteína não é necessária, o que minimiza as preocupações com biosseguran- ça e alergenicidade, e representa uma forma de controle provavelmente mais eficaz do que as atuais.
A quitina, um polissacarídeo linear formado por resíduos de N- acetil-D-glicosamina unidos por ligações β (1 -4), é amplamente difundida entre os insetos, os quais utilizam este versátil biopotímero em várias estruturas anatómicas. As duas principais estruturas extraceiuiares onde ocorre a deposição de quitina são a cutícula que reveste a epiderme e a membrana peritrófica que recobre o intestino médio. (MUTHUKRISHNAN, S., et aí., Chi- tin Metabolism in Insecís. In Insect Molecular Biology and Biochemistry, 1 ed. ; Gilbert, L. i, Ed. Elsevier: London, pp 193-225. 2012).
A membrana peritrófica é uma estrutura funcionai que recobre o intestino médio dos insetos. As principais funções atribuídas a esta mem- brana são a de proteção mecânica contra injúria as células do intestino médio (WIGGLESWORTH, V. , The principies of insect physiology. 7 ed. ; Cha- pman and Hall: London.Vol. p 827. 1972), uma barreira física contra microorganismos (PETERS, W., Peritrophic membranes. Springer-Verlag New York,Vol. 1992), uma barreira seletiva para enzimas digestivas e produtos de digestão (DAY, M. F.; WATERHOUSE, D. F. , Functions of the alimentary system. John Wiley.New York.Vol. p 299-310. 1953) e atuação no mecanismo de reciclagem de enzimas digestivas, fenómeno conhecido como circulação ectoendoperitrófica (TERRA, W. R. , Physiology and Biochemistry of Insect Digestion - an Evolutionary Perspective. Brazilian Journal of Medicai and Biological Research, v. 21 , n. 4. p. 675-734. 1988; TERRA, W. R.; FERREIRA, C, Insect Digestive Enzymes - Propertíes, Comparímentalíza- tion and Funcíion. Comparative Biochemistry and Physiology BBiochemistry & Molecular Biology, v. 109, n. 1. p. 1-62. 1994; TERRA, W. R., The origin and functions of the insect periírophic membrane and perifrophic gel. Archi- ves of fnsect Biochemistry and Physíoíogy, v. 47, n. 2. p. 47-61 , 2001).
A cutícula de insetos ou exoesqueleto é uma estrutura multifunci- onal, que serve de suporte físico, como também lhe dá a sua forma, possibilita a locomoção, confere a impermeabilização do corpo, e urna gama de especializações mecânicas localizadas, como elevado grau de adesão, resistência ao desgaste e controle de difusão. Nesta estrutura, suas propriedades mecânicas são atribuídas ao seu principal constituinte, a quitina (VINCENT, J. F., et a!., Design and mechanical properties of insect cuticle. Arthropod Struct Dev, v. 33, n. 3. p. 87-199. 2004).
A síntese e a deposição de quitina na cutícula e na membrana peritrófica compreendem uma série sequencial de complexas transformações bioquímicas, biofísicas, intracelulares e extracelulares, algumas das quais ainda pouco entendidas (MOUSSÍAN, B., et a(., Assembíy of the Dro- sophila íarval exoskeleton requires controlled secretion and shaping of the apical plasma membrane. Matrix Biol, v. 26, n. 5. p. 337-347. 2007). Por estar ausente em plantas e vertebrados, a via biossintética da quitina é um dos principais alvos para o desenvolvimento de inseticídas, desde 1970 (VER- LOOP, A., et al., Benzoylphenyl Ureas - A New Group of Larvícides Interfe- ring with Chitin Deposition. In Pesticide Chemistry in the 20t Century, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY: Vol. 37, pp 237-270. 1977). Dentre as enzimas envolvidas na síntese de quitina em insetos, enfoque especial tem sido dado à última etapa da via que é mediada pela enzima quitina sintase (EC 2.4.1 .16), a qual catalisa a polimerização da quitina a partir de monôme- ros ativados de UDP-N-acetilglicosamína (MERZENDORFER, H., The cellu- lar basis of chitin synthesis in fungi and insects: common principies and diffe- rences. Eur J Celi Biol, v. 90, n. 9. p. 759-769. 201 1 ).
A interrupção ou a diminuição da síntese de enzimas que partici- pem da biossíntese de constituintes da cutícula e da membrana peritrófica dos insetos por meio da tecnologia do RNAi apresenta-se como uma forma especifica de controle de insetos pragas. A quitina sintase A (ou tipo 1) em insetos é a principal enzima envolvida na biossíntese de quitina da cutícula e da traqueia, no entanto, a qui- íina sintase B (ou tipo 2) em insetos é a principal enzima envolvida na biossíntese de quitina da membrana perítrófíca, ambas quitinas sintases de inse- tos tem sido estudadas como alvos ideais para o desenvolvimento de estratégias de controle de insetos-praga.
Na presente invenção é mostrado o efeito inseticida de moléculas de dsRNA sobre o bicudo do algodoeiro, Anthonomus grandis, a principal praga da cotonicultura do Brasil. O efeito inseticida é atribuído à inibição dos níveis de transcritos das enzimas quitina sintase 1 e 2, que ocasionou danos ao desenvolvimento de ovos e adultos de A. grandis quando submetidos ao tratamento de dsRNA contra estas enzimas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada com um método para redu- zir ou inibir a expressão de genes envolvidos na biossíntese de quitina em células eucariótícas, particularmente em células animais, resultando na morte, inibição, atrofia ou interrupção de alimentação de uma praga alvo.
Em uma concretização a invenção descreve moléculas de ácido nucleicos substancialmente similares às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas. A invenção descreve moléculas de dsRNA, a partir das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas ou fra- gmento ou complemento desta, estabilizada ou a expressão de um ou mais microRNAs (miRNA) ou siRNAs para inibição da expressão de um gene- alvo, em coleóptero-praga, expressado destas sequências e fragmentos das mesmas.
A invenção descreve ainda composições contendo moléculas de ácido nucleico substancialmente similar às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ÍD N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas, para o controle de insetos-praga, particularmente o bicudo-do-algodoeiro (Antho- nomus grandis).
A invenção provê também um método para supressão de expressão gênica em um coleóptero-praga, como o bicudo-do-algodoeiro ou espé- cie correlata, que compreende a etapa de fornecimento na dieta da praga de uma quantidade supressora do gene, contando com pelo menos uma molécula de dsRNA, transcrita de uma sequência de nucleotídeos substancialmente similar às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas, que tenha pelo menos um fragmento complementar de uma sequência do mRNA no interior das células da praga.
São também aspectos da invenção, genes quiméricos, construções gênicas contendo as moléculas de ácido nucleico da presente inven- ção, veíores de transformação e expressão, células e organismos transgêni- cos, métodos para a expressão da molécula da presente invenção em organismos transgênicos, bem como o uso das mesmas no controle de pragas. A invenção compreende, também, um método para obtenção de uma planta transgênica utilizando as construções gênicas da presente invenção e um método de produção de comida ou alimento, compreendendo a obtenção de uma planta transformada com polinucleotídeos contendo uma sequência de nucleotídeos substancialmente similar às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas, e o preparo de comida ou alimento a partir da referida planta ou parte da mesma.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - Estratégia de clonagem do cDNA de AntgCHSI A sequência completa do cDNA de AntgCHSI foi determinada peia sobreposição de 3 fragmentos de PCR.
Figura 2 - Estratégia de clonagem do cDNA de AntgCHS2. A sequência completa do cDNA de AntgCHS2 foi determinada pela sobreposição de 4 fragmentos de produtos de PCR. Figura 3 - Análise da expressão relativa de transcritos do gene AntgCHSI em ovos de A. grandis por qPCR. D-actina e GAPDH foram utilizados como genes de referência. A expressão relativa (UA) foi calculada com base no valor de expressão para o tratamento de dsRNA AntgCHSI , a qual foi atribuído um vaior arbitrário de 1 . Diferentes letras sobre as barras indicam diferença significante da expressão entre os tratamentos baseado em duas replicas biológicas (P<0,05, teste-T). Nos tratamentos cada inseto foi microinjetado com 200 ng de dsRNA GUS (controle) e 200 ng de dsRNA AntgCHSI .
Figura 4 - Efeito do dsRNA de AntgCHSI sobre a oviposição de ovos de A. grandis. A. Efeito do dsRNA de AntgCHSI sobre a viabilidade de ovos de A. grandis; B. Ovos inviáveis provenientes de fêmeas microinjeta- das com dsRNA de AntgCHSI . Nos tratamentos cada inseto foi microinjetado com 200 ng de dsRNA GUS (controle) e 200 ng de dsRNA AntgCHSI .
Figura 5 - Efeito do dsRNA de AntgCHSI sobre larvas neonatas provenientes de insetos adultos microinjetados de A. grandis. A. Larvas provenientes de adultos microinjetados com dsRNA de AntgCHSI ; B detalhe de larva controle provenientes de adultos microinjetados com dsRNA GUS (controle), C e D detalhe de larvas de 1 o instar com mal formações na cáp- sula cefálica.
Figura 6 - Efeito do dsRNA AntgCHSI sobre o desenvolvimento de A. grandis. A microinjeção do dsRNA AntgCHSI foi ralizada em larvas de 3o instar. Após microinjeção as larvas foram transferidas para dieta artificial para completarem o seu desenvolvimento. Após 10 dias a morfologia dos insetos foi avaliada.
Figura 7 - Análise da expressão relativa de transcritos de Antg- CHS2 após microinjeção de diferentes segmentos de dsRNA- genes de referência GAPDH e beta-actina. 1. Controle consistiu da administração de H20; 2. dsRNA GUS - consistiu da administração de um dsRNA com a se- quência de 350 pb do gene gus; 3. dsRNA AntgCHS2.1 (SEQ ID N° 4); 4. dsRNA AntgCHS2.2 (SEQ ID N° 5); 5. dsRNA AntgCHS2.3 (SEQ ID N° 6).
Figura 8 - Análise da expressão relativa de transcritos por PCR em tempo real de AntgCHS2 depois da microinjeção de diferentes concentrações de dsRNA AntgCHS2.3 (SEQ ID N° 6) em insetos adultos de A. grandis após 48hs.
Figura 9 - Análise da expressão relativa de transcritos por PCR em tempo real de AntgCHS2 depois da microinjeção de diferentes concentrações de dsRNA AntgCHS2.3 (SEQ ID N° 6) em larvas de A. grandis após 72hs.
Figura 10 - Análise da persistência do silenciamento de Antg- CHS2 após o desenvolvimento larval de A. grandis por PCR em tempo real. A microinjeção de dsRNA AntgCHS2.3 (SEQ ID N° 6) foi realizada em larvas é o silenciamento foi analisado em insetos adultos de A. grandis após 72hs da emèrgência.
Figura 11 - Efeito da microinjeção de dsRNA AntgCHS2.3 (SEQ ID N° 6) sobre a oviposição de fêmeas A. grandis. No tratamento controle foi realizada a administração de dsRNA GUS; A. análise da quantidade de ovos/fêmea/dia; B. Análise da oviposição do número de ovos totais. Nos tratamentos cada inseto foi microinjetado com 200 ng de dsRNA GUS (controle) e 200 ng de dsRNA AntgCHS2.3.
Figura 12 - Efeito da microinjeção de dsRNA AntgCHS2.3 (SEQ ID N° 6) sobre a sobrevivência de fêmeas de A. grandis. Nos tratamentos cada inseto foi microinjetado com 200 ng de dsRNA GUS (controle) e 200 ng de dsRNA AntgCHS2.3.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve métodos e composições para o controle de pragas, especialmente pragas de algodão. Por exemplo, a presente invenção fornece tecnologias de DNA recombinante para reprimir ou inibir pós-transcricionalmente a expressão de uma sequência alvo na célula de uma praga. Esse efeito é obtido através da alimentação, para uma ou mais pragas, de cadeia dupla de RNA ou de fragmentos de RNA (miRNA ou siRNA) transcritos a partir de toda ou uma parte de uma sequência alvo que codifica, controlando assim a infestação. Por conseguinte, a presente invenção refere-se a sequências específicas de inibição da expressão de se- quências de codificação, utilizando RNA de cadeia dupla (dsRNA), incluindo pequeno RNA interferente (siRNA), para atingir os níveis pretendidos de controle de pragas.
A presente invenção proporciona um método de inibição da ex- pressão de um gene alvo em coleópteros. Em certas formas de realização, o método compreende a modulação ou inibição da expressão de um ou mais genes-alvo de coleópteros que faz com que ocorra inibição do desenvolvimento, reprodução e/ou infecciosidade e, eventualmente, resulte na morte do inseto. Mais especificamente a presente invenção está relacionada à ini- bição dos genes da família da quitina sintase em coleópteros, resultando na interrupção do desenvolvimento e má formação de insetos larvas e adultos, podendo resultar na morte do inseto. O método compreende a introdução de RNA dupla fita (dsRNA) de forma parcial, estabilizado, incluindo as suas formas modificadas, tais como sequências de pequeno RNA interferente (síRNA), dentro das células ou em meio extracelular, tal como o intestino médio, dentro de coleópteros em que o dsRNA entra nas células e inibe a expressão de pelo menos um ou mais genes alvo, e onde a inibição exerce um efeito deletério sobre a praga. Os métodos e as composições associadas podem ser utilizados para limitar ou eliminar a infestação de coleópteros ou em qualquer hospedeiro de pragas, praga simbionfe, ou ambiente no qual a praga está presente através de uma ou mais composições que compreendem a molécula de dsRNA aqui descrita na dieta das pragas.
A presente invenção proporciona ainda exemplos de composições de ácido nucleico que são homólogas a pelo menos uma porção das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas. Um exemplo específico de tais ácidos nucleicos proporcionados pela invenção está descrito nas SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 6 ou seus complementos.
Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para a supressão da expressão do gene de uma praga coleópteros, tais como bicudo-do-algodoeiro ou de espécies relacionadas, que compreende o pas- so de proporcionar na dieta da praga de uma quantidade gene supressor de pelo menos um dsRNA molécula transcrita a partir de uma sequência nucle- otídica tal como aqui descrito, pelo menos, um segmento do qual é complementar a uma sequência miRNA dentro das células da praga. O método po- de ainda compreender a morte, nantsmo, ou cessação da alimentação da praga. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, alimentada a uma praga de acordo com o invento pode ser de peio menos de cerca de 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou cerca de 100% de identidade com uma molécula de RNA transcrita a partir das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas.
A presente invenção proporciona ainda uma molécula de dsRNA estabilizada ou a expressão de um ou mais miRNAs para a inibição da ex- pressão de um gene alvo numa praga coleóptera expressa a partir desta sequência e os seus fragmentos. Um dsRNA estabilizada, incluindo uma molécula de siRNA miRNA ou pode compreender pelo menos duas sequências de codificação que são dispostos em um sentido e uma orientação anti- sentido em relação a pelo menos um promotor, em que a sequência de nu- cleótideos que compreende uma cadeia com sentido e uma cadeia anti- sentido está relacionada ou ligada por uma sequência espaçadora de, pelo menos, a partir de cerca de três a cerca de dez mil nucleotídeos, em que a cadeia com sentido e a cadeia anti-sentido podem ser formadas de comprimentos diferentes, e cada uma das duas partes codificam sequências de pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos, 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100% de identidade de sequência, a qualquer sequência de um ou mais nucleótido (s) de acordo com as sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complemen- tos destas.
Além disso, a invenção fornece ainda um fragmento ou concatâ- mero de uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir das sequên- cias selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas. O fragmento pode ser definido como causando morte, ou prejudicando o desenvolvimento de um organismo nocivo quando expresso como um dsRNA e fornecido para a praga. O fragmento pode, por exemplo, compreender pelo menos cerca de 19, 21 , 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 ou mais nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas, ou um seu com- plemento. Um segmento de DNA benéfico para uso no presente invento é peio menos 19 a cerca de 23, ou cerca de 23 até cerca de 100 nucleotídeos até cerca de 2000 nucleotídeos de comprimento ou mais. Particularmente útil para a presente invenção são sequências de DNA, incluindo cerca de 19 a cerca de 400 nucleotídeos homólogos a uma sequência alvo de pragas. A invenção proporciona também um ácido ribonucleico expresso a partir de qualquer de tais sequências, incluindo um dsRNA. A sequência selecionada para utilização na expressão de um agente de supressão de gene pode ser construída a partir de uma única sequência derivada de uma ou mais pragas alvo e destinada a ser utilizada na expressão de um RNA que funciona na supressão de um único gene ou família de genes em uma ou mais pragas alvo, ou a sequência de DNA pode ser construída como uma quimera de uma pluralidade de sequências de DNA. Especificamente para a presente invenção essa família de genes está relacionada à família dos genes da qui- tina sintase, especificamente à quitina sintase 1 e quitina sintase 2.
Em ainda outro aspecto, o invento proporciona construções de
DNA recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA aqui descrita. O dsRNA pode ser formado por uma fita de transcrição da molécula de uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, ou fragmentos ou complementos destas. Tais construções de DNA recombinante podem ser definidas como a produção de moléculas de dsRNA, capazes de inibir ou reduzir a expressão do gene alvo endógeno (s) numa célula praga após a ingestão. A construção pode incluir uma sequência nucleotídica do invento operativa- mente ligado a uma sequência de promotor que funciona na célula hospe- deira. A presente invenção pode se utilizar de promotores tecido-específicos ou constitutivos. Preferencialmente para a presente invenção os promotores tecido-específicos podem ser, mas não estão limitados a, promotores específicos para botões florais de plantas de algodão.
Construções de ácido nucleico de acordo com a invenção podem compreender pelo menos uma sequência de nucleótidos que não ocorre naturalmente e que pode ser transcrita em um RNA de cadeia simples, capazes de formar uma molécula de dsRNA in vivo por meio de hibridização. Tais sequências de dsRNA podem ser fornecidas na dieta de uma praga de coleópteros para alcançar a inibição desejada. Preferencialmente para a presente invenção a molécula de dsRNA é formada por sequências de nu- cleotídeos substancialmente similares às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas.
Uma construção de DNA recombinante pode conter sequências substancialmente similares às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas. Os dsRNAs podem expressar a partir de construções introduzidas em vários eventos de transformação diferentes, ou podem ser introduzidos numa única molécula de á- eido nucleico. Os dsRNAs podem ser expressos utilizando um único promotor ou promotores múltiplos. Em um aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira recombinante ter no seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante que é transcrito para produzir pelo menos uma molécula de dsRNA, que funciona quando ingeridos por uma praga de coleópteros para inibir ou reduzir a expressão de um gene alvo em uma praga. A molécula de dsRNA pode ser codificada pelas sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ (D N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas. A presente invenção também proporciona uma célula vegetal transformada tendo no seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombi- nante aqui. descrita. As plantas transgênicas que compreendem um tal célu- la de planta transformada são também fornecidas, incluindo as plantas de progénie de qualquer geração, as sementes, e produtos vegetais, cada uma compreendendo o DNA recombinante.
Os métodos e composições da presente invenção podem ser a- plícados a qualquer planta monocotiledônea e dicotiledônea, dependendo do controle de pragas de coleópteros desejado. Assim, a presente invenção descreve uma planta transformada com uma sequência de DNA recombinante, como descrito as sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ÍD N° , SEQ ÍD N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos, ou concatâmeros ou complementos destas, que é transcrito para produzir pelo menos uma molécula de dsRNA, que funciona quando ingerido por uma praga de coleópteros para inibir ou reduzir a expressão de um gene alvo.
A invenção proporciona também combinações de métodos e composições para controlar infestações de pragas de coleópteros. Um meio de fornecer um método dsRNA como aqui descrito para a protecção de plantas contra a infestação de insetos é em conjunto com um ou mais agentes insecticidas que exibem características diferentes das exibidas pelos métodos e composições de dsRNA. Por exemplo, uma ou mais proteínas de Bt pode ser fornecida na dieta das pragas de insetos, em combinação com um ou mais dsRNAs tal como aqui descrito. A composição formulada para aplicação tópica ou derivada utilizando uma abordagem transgênica, que combina os métodos e as composições de dsRNA com Bt pode ser utilizada para criar sinergias que não eram conhecidos anteriormente na arte para controlar a infestação de insetos. Uma sinergia é a redução no nível de expres- são necessária para o dsRNA (s) ou a proteína de Bt (s). Quando combinadas, a menor dose eficaz de cada um dos agentes de controle de pragas pode se usada. Acredita-se que as proteínas de Bt insecticidas crie poros de entrada através dos quais as moléculas de dsRNA são capazes de penetrar de forma mais eficaz em espaços remotos a partir do intestino da praga de insetos, ou de forma mais eficiente para as células na proximidade das lesões criadas pela proteína Bt, requerendo assim menos quantidade de Bt ou dsRNA para atingir o resultado desejado de ação inseticida ou a inibição desejada ou supressão de uma função biológica específica na praga alvo.
A presente invenção proporciona portanto uma composição que contenha dois ou mais diferentes agentes pesticidas tóxicos para a mesma praga ou espécies de insetos onde, pelo menos, um dos quais compreende um dsRNA aqui descritos. Em certas concretizações, o segundo agente pode ser um agente selecionado a partir do grupo que consiste de uma patati- na,. uma proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, uma proteína Xe- norhabdus insecticida, uma proteína Photorhabdus insecticida, uma proteína de Bacillus laterosporous insecticida, uma proteína de Bacillus sphaericus insecticida, enzimas da família de quitinase e uma lignina. Uma proteína de Bacillus thuringiensis insecticida pode ser qualquer uma de uma série de proteínas inseticidas, incluindo, mas não limitado a Cryl, Cry8, Cry O, Cry35 TIC851 , CryET70, Cry225 TIC901 , TIC1201 , TIC407, TIC417, proteína inseticida CryET33 e binário CryET34, proteína binária inseticida CryET80 e CryET76, proteína inseticida binária TICIOO e TICIOI, binário inseticida da proteína PS 149BI, proteína VIP inseticida, proteína TIC900 ou afins, ou combinações das proteínas insecticidas ET29 ou ET37 com proteínas insecticidas TIC810 ou TIC812 e quimeras inseticidas de qualquer uma das proteínas anteriores.
Um ácido ribonucleico, que é fornecido na dieta, pode ser fornecido em uma dieta artificial formulada para satisfazer as necessidades nutricionais especiais para determinada praga. A dieta também pode ser uma célula recombinante transformada com uma sequência de DNA construída para a expressão do agente alvo, o RNA ou o agente de supressão de gene. Após a ingestão de uma ou mais células transformadas pela praga, o resultado desejado é fenotipicamente observado, indicando que o agente foi utilizado para inibir ou reduzir a expressão de uma sequência nucleotídica alvo que está dentro das células da praga.
Um gene alvo pode codificar para a supressão de uma proteína essencial. Para a presente invenção o gene alvo é da família da quitina sin- tase cuja função é a constituição da formação do cutícula, traquéia e quitina da membrana peritrofica. Portanto, a inibição ou redução da expressão de tal gene poderá afetar funções essenciais para sobrevida do inseto a ser se- lecionada do grupo de diferenciação e desenvolvimento da cutícula, formação do ovo, maturação larval, transição de estágio larval, pupação, digestão e assimilação de nutrientes, proteção contra patógenos.
Um outro aspecto da presente invenção é fornecer um método para melhorar o rendimento de uma planta submetida a infestação de pragas de insetos, compreendendo o referido método os passos de: a) introdução de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência substancialmente similar às sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas ou concatâmeros na referida planta, e b) cultivar a planta de modo a permitir a expressão da referida característica.
Ainda outro aspecto da invenção proporciona produtos agronómica e comercialmente importantes e/ou composições de matéria, incluindo, mas não limitado a, alimentos para animais, produtos de base, produtos e subprodutos que se destinam a serem utilizados como alimentos para consumo humano ou para utilização nas composições e produtos que se destinam ao consumo humano, incluindo, mas não se limitando à farinha de algodão, óleo de algodão, bolos de algodão, pluma de algodão, fibra de algo- dão, cereais, e assim por diante. Tais composições podem ser definidas como contendo uma quantidade detectável de uma sequência de nucleotí- deos aqui estabelecidos, e, assim, também são diagnóstico para qualquer acontecimento transgênico contendo tais sequências de nucleotídeos. Estes produtos são úteis, pelo menos, porque eles são susceptíveis de ser obtidos a partir de culturas propagadas com menos pesticidas organofosforados e como um resultado da sua incorporação dos nucleotídeos da presente invenção para controlar a infestação de pragas de coleópteros em plantas. Tais mercadorias e produtos de base podem ser produzidos a partir de sementes produzidas a partir de uma planta transgênica, em que a planta expresse RNA a partir de um ou mais nucleotídeos contíguos da presente invenção ou nucleotídeos de uma ou mais pragas de coleópteros e respecti- vos complementos.
Um método de produção de um produto deste tipo compreende a obtenção de uma planta transformada com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas ou concatâmero das mesmas, e preparação de um produto de base a partir da planta ou parte da mesma também é fornecido na presente invenção. Além disso, um método de produção de alimentação humana ou animal, que compreende a obtenção de uma planta transformada com um polinucleotídeo compreendendo uma sequên- cia selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou um fragmento ou concatâmero ou complemento da mesma, e preparar o alimento ou alimento para animais a partir da referida planta ou parte deste é ainda um outro aspecto da invenção.
A invenção também fornece um meio legível por computador tendo nele registado uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ou fragmentos ou complementos destas ou concatâmero das mesmas, para utilização num certo número de aplicações de computador, incluindo, mas não se limitando a identidade de DNA e busca de similaridade, identidade e pesquisa de similaridade de proteína, caracterizações de perfis de transcrição, comparações entre genomas, e análises de hibridação artificiais.
No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso serão melhor detalhados a seguir.
O termo "ácido nucleico" refere-se a uma grande molécula a qual pode ser fita simples ou fita dupla, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, um fosfato e uma base purina ou pirimidina. Um "fragmento de ácido nucleico" é uma fração de uma dada molécula de ácido nucleico. "Complementaridade" refere-se ao pareamento específico de bases purinas e pirimidinas que consistem de ácidos nucleicos: pares de ade- nina com timina e pares de guanina com citosina. Então, o "complemento" de um primeiro fragmento de ácido nucleico refere-se ao segundo fragmento de ácido nucleico cuja sequência de nucleotídeos é complementar à primeira sequência de nucleotídeos.
Em plantas mais desenvolvidas, ácido desoxirribonucleico (DNA) é o material genético enquanto ácido ribonucleico (RNA) está envolvido na transferência da informação do DNA em proteínas. Um "genoma" é toda parte principal do material genético contida em cada célula de um organismo. O termo "sequência de nucleotídeo" refere-se às sequências de polímeros de nucleotídeos, formando uma fita de DNA ou RNA, as quais podem ser sim- pies ou dupla-fita, opcionalmente sintéticas, não naturais ou com bases de nucleotídeos alteradas capazes de incorporação dentro de polímeros de DNA ou RNA. O termo "oligômero" refere-se a sequências curtas de nucleotídeos, usualmente até 100 bases de comprimento. O termo "homólogo" à ligação entre as sequências de nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucleico ou entre as sequências de aminoácidos de duas moléculas de proteínas. A estimativa de tal homologia é provida através da hibridização de DNA-DNA ou RNA-RNA sob condições de estringência como definido no estado da técnica (como mencionado no documento US20030074685, Ha- mes and Higgins, Ed. (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K); ou pela comparação de similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou proteína (como mencionado no documento US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).
"Gene" refere-se ao fragmento de nucleotídeo que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedentes (região 5' não traduzida) e posteriores (região 3' não traduzida) à região codificadora. "Gene nativo" refere-se a um gene isolado com sua própria sequência reguladora encontrada na natureza. "Gene quimérico" refere-se ao gene que compreende sequências codificadoras, regulatórias e heterogéneas não encontradas na natureza. O gene quimérico da presente invenção compreende moléculas isoladas de ácido nucleicos, na orientação sense ou antisense, ligadas operacionalmente a promotores ativos. Construções gênicas da pre- sente invenção podem conter 1 ou mais genes quiméricos e podem ou não apresentar íntrons. "Gene endógeno" refere-se ao gene nativo normalmente encontrado em sua localização natural no genoma e não é isolado. Um "gene exógeno" refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido por transferência gênica. "Pseudogene" refere-se a uma sequência nucleotídica que não codifica uma enzima funcional.
"Sequência codificadora" refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma "sequência codificadora interrompida" significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais íntrons ligados através de junções). Um "íntron" é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de clivagem e a re-ligação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de íntrons incluem, mas não são limitados a, íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40, íntrons do gene da malato sintase.
"Transcrito de RNA" refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia perfeita da sequência de DNA, ele é referido com transcrito primário ou ele pode ser uma sequência de RNA derivada de um processo pós-transcricional do transcrito primário e é então referido como transcrito maduro. "RNA mensageiro (mRNA)" refere-se ao RNA que está sem íntrons. "RNA sense" refere-se a um transcrito de RNA que inclui o mRNA. "RNA antisense" refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a todas as partes de um transcrito primário ou mRNA e que pode bloquear a expressão de um gene alvo através da interferência no proces- samento, transporte e/ou tradução do seu transcrito primário ou mRNA. A complementaridade de um RNA antisense pode ser com qualquer parte do transcrito gênico específico, isto é, sequência 5' não traduzida, sequência 3' não traduzida, íntrons ou sequência codificadora. Além disso, o RNA anti- sense pode conter regiões de sequências ribozima que aumentam a eficácia do RNA antisense para bloquear a expressão gênica. "Ribozima" refere-se ao RNA catalítico e inclui sequências específicas de endoribonucleases. "DsRNA (dupla-fita)" refere-se a estrutura em grampo formada entre a sequência do mRNA ou RNA sense, a sequência de uma região espaçadora e a sequência do RNA antisense. "Região espaçadora" refere-se à sequência de nucleotídeo que não está relacionada com a sequência do gene alvo, como a sequência de um íntron.
O termo "vetor" diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Preferencialmente um dos vetores de interesse da presente invenção diz respeito ao fagomídeo. O termo "fagomídeo" diz respeito a um vetor que contém sequência para replicação em fago e em bactéria, este vetor tem características que atendem as especificações da célula hospedeira bem como agentes selecionadores e promotores. O termo "vetor recombinante" é resultante da combinação de um vetor comercial com moléculas de ácido nucleico da presente invenção operacionalmente ligadas a um promotor de interesse e um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech La- boratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Car- Isbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados, são os vetores da série pCambia (BioForge Co.), pB1121 (Chen, Po-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching; To, Kin-Ying. Complete sequence of the binary vector pBM 21 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. . Molecular Breeding vol. 1 1 issue 4 May 2003. p. 287-293), pBSK (Addgene Co.), pGEM-T easy (Promega Corpora- tion), pET101/ D-TOPO (Invitrogen). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
"Substancialmente similar" ou "similaridade substancial" refere-se a fragmentos de ácidos nucleicos nos quais mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a habilidade do fragmento de ácido nucleico mediar a alteração da expressão gênica pelo silenciamento gênico através, por exemplo, da tecnologia antisense, co-supressão ou RNA de interferência (RNAi). Fragmentos de ácido nucleico substancialmente similares da presente invenção podem ser caracterizados também pela porcentagem de similaridade de suas sequências de nucleotídeos com as sequências de nu- cleotídeo dos fragmentos de ácidos nucleicos descritas aqui (SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos são aqueles cujas sequências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de sequência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando compa- rada com a sequência de referência.
Uma das formas de se formar o dsRNA é estando presente na molécula de DNA a sequência de nucleotídeos do gene alvo na orientação sense, e uma sequência de nucleotídeos na orientação antisense, podendo haver ou não uma região espaçadora entre as sequências de nucleotídeos sense e antisense. As sequências de nucleotídeos mencionadas podem ser constituídas de cerca de 19nt a 2000nt ou ainda cerca de 5000 nucleotídeos ou mais, cada um tendo uma similaridade substancial de sequência total com cerca de 40% a 100%. Quanto mais longa for a sequência, menos es- tringência é requerida para similaridade substancial total da sequência. Os fragmentos contendo pelo menos cerca de 19 nucleotídeos devem ter preferencialmente cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com a sequência de referência, com possibilidade de ter cerca de 2 nucleotídeos distintos não contíguos. Preferencialmente são utilizados fragmentos acima de 60pb, mais preferencialmente ainda fragmentos entre 100 a 600pb.
Em um dos aspectos da invenção, a molécula de dsRNA pode compreender uma ou mais regiões tendo uma similaridade substancial de sequência para as regiões com pelo menos cerca de 19 nucleotídeos consecutivos dos nucleotídeos sense do gene alvo, definida como primeira região e, uma ou mais regiões tendo uma similaridade substancial de sequência para as regiões com cerca de 19 nucleotídeos consecutivos do complemen- to dos nucleotídeos sense do gene alvo, definida como segunda região, onde essas regiões podem ter pares de bases separando-as uma da outra.
Convenientemente, o dsRNA (RNA de dupla fita) como descrito pode ser introduzido dentro de células hospedeiras pela introdução e possível integração de uma construção gênica contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção, transcrição das mesmas para produção do dsRNA. Portanto, em uma outra concretização, a invenção é também suportada por possuir uma construção gênica que é capaz de ser expressa em células de organismos eucariotos de interesse, operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que quando transcrita produz uma molécula de dsR- NA compreendendo uma primeira região e uma segunda região, em que:
(a) a primeira região compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos cerca de 19 nucleotídeos consecutivos tendo uma similaridade substancial de sequência com pelo menos cerca de 19 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense do gene alvo;
(b) a segunda região compreende uma sequência de nucleotídeos de cerca de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos tendo uma similaridade substancial de sequência com o complemento de cerca de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense do gene alvo;
(c) a primeira e a segunda região são capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual pode ter, além do comprimento total da pri- meira e da segunda região, uma região espaçadora entre elas contendo pelo menos cerca de 3 nucleotídeos.
"Promotor" refere-se à sequência de DNA em um gene, usualmente localizada a montante da sequência codificadora, a qual controla a expressão da sequência codificadora promovendo o reconhecimento pela RNA polímerase e outros fatores requeridos para a própria transcnção. Em uma construção de DNA artificial, promotores podem também ser utilizados para transcrever dsRNA. Promotores podem também conter sequências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteínas as quais controlam o efeito do início da transcrição em resposta a condições fisiológicas ou de desenvolvimento.
Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor constitutivo. Em outro aspecto da invenção, a atividade do promotor é estimulada por fatores externos ou internos tais como, mas não limitado a, hor- mônios, compostos químicos, impulsos mecânicos, e condições de estresse biótico ou abiótico. A atividade do promotor também pode ser regulada de maneira temporal e espacial (como por exemplo, promotores tecido- específicos e promotores regulados durante o desenvolvimento).
O promotor pode conter elementos "enhancers". Um "enhancer" é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela po- de ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido-especificidade de um promotor. "Promotores constitutivos" referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores "tecido-específicos" ou "desenvolvimento-específicos" são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese. O termo "expressão" refere-se a transcrição e acumulação estável do dsRNA derivado dos fragmentos de ácidos nucleicos da invenção que, em conjunto com a aparelhagem de produção de proteína da célula, resulta em níveis alterados de mio-inositol 1 -fosfato sintase. "Inibição por interferência" refere-se a pro- dução de transcritos de dsRNA capazes de prevenir a expressão da proteína alvo.
"Sequências regulatórias apropriadas" referem-se a sequências de nucleotídeos em genes nativos ou quiméricos que estão localizadas acima (região 5' não traduzida), dentro, e/ou abaixo (região 3' não traduzida) dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção, as quais controlam a expressão dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção.
"Níveis alterados" referem-se à produção de produtos gênicos em organismos transgênicos em quantidades ou proporções que diferem daquelas em organismos normais ou não-transgênicos. A presente invenção também relata vetores, os quais incluem sequências do gene das enzimas quitina sintase 1 e 2 na orientação sense e antisense, e células hospedeiras, as quais são geneticamente engenheiradas com vetores da invenção. "Transformação" refere-se a transferência do gene exógeno para dentro do genoma de um organismo hospedeiro e sua herança geneticamente estável.
"Plantas" referem-se a organismos fotossintéticos, ambos eucari- otos e procariotos, onde o termo "plantas desenvolvidas" refere-se a plantas eucariotas. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então, a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos géneros Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassi- ca, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hete- rocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycoper- sicon, Malus, anihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Pani- eum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Como usado aqui, o termo "promotor expresso em plantas" significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de ori- gem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal o qual seja capaz de direcionar a expressão em uma célula vegetal, por exemplo promotores de origem virai ou bacteriana tais como Ca V35S (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hapster et al, 988 Mol. Gen. Genet. 212, 182- 90) e promotores do gene presentes no T-DNA de Agrobaterium; pro- motores tecido-específicos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de patente US20030175783, An et al., 1996 The Plant Celi 8, 15-30), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US200301 5783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), promotores específicos de folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323: 1330), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotores específicos de estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO97 3865); e semelhantes.
O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da no- palina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifo- lium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. A presente invenção também inclui prover moléculas de dsRNA, as quais podem ser obtidas por transcrição das moléculas contidas nas construções' gênicas, e que são úteis para os métodos de acordo com a invenção.
Um outro objeto da presente invenção é prover células eucario- tas, e organismos eucariotas contendo moléculas de dsRNA da invenção, ou contendo os gene quiméricos ou as construções gênicas capazes de produzir moléculas de dsRNA da invenção. As construções gênicas podem estar estavelmente integradas no genoma das células de organismos euca- riotas.
Em outro aspecto da invenção, as construções gênicas podem estar providas em uma molécula de DNA capaz de se replicar de forma autónoma nas células de organismos eucariotas, tais como vetores virais. A construção gênica ou o dsRNA pode também estar disposto de forma tran- siente nas células de organismos eucariotas.
As construções gênicas ou gene quimérico da invenção podem ser introduzidas dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, pode ser introduzido diretamente dentro do DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA.
Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de construções gênicas utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. Embo J, 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente US20020 52501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501 ). Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro Agrobacterium tumefasciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefasciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501 , Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983).
Células de plantas transformadas que são derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e en- tão o fenótipo desejado tal como ausência ou redução da formação de estruturas quitinosas de insetos coleópteras tais como a cutícula e/ou a membrana peritrófica. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser intro- duzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al., Proto- plasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al., Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501 ).
Sem restringir a invenção para um particular modo de ação, espe- ra-se que a enzima em células eucariotas responsável por gerar pequenas moléculas de RNA com cerca de 21 nucleotídeos de dsRNA (como a DICER em Drosophiia) possa ser saturada através da inclusão de um excesso de sequências de dsRNA (isto é, moléculas de RNA complementares) que não estão relacionadas com a sequência de nucleotídeos do gene alvo ou do gene a ser silenciado.
A variação natural na regulação pós-transcricional da expressão do gene alvo ocorrendo entre diferentes linhagens de organismos eucariotos compreendendo a mesma molécula de dsRNA será substituída através da manipulação do espectro de silenciamento gênico. Esse fato pode ocorrer através da inclusão de sequências de nucleotídeos de dsRNA extras não relacionadas com o gene alvo, as quais são operacionalmente ligadas aos dsRNA formados pela primeira e segunda região.
As concretizações da presente invenção podem ser efetivas contra uma variedade de pragas. Para os propósitos da presente invenção, as pragas incluem, mas não estão limitadas a, insetos, fungos, bactérias, ne- matóides, ácaros, patógenos protozoários, parasitas animais, e semelhantes. Pragas de particular interesse são insetos-praga, particularmente inse- tos-praga que causam danos significativos para plantas agrícolas. Entende- se como "insetos-praga" insetos e outras pragas similares tais como, por " exemplo, os insetos das ordens Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermapte- ra, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc, particularmente Co- leoptera, especialmente Anthonomus grandis, Diabrotica virgifera, Tenebrio molitor, Tribolium castaneum, Phoracantha semipunctata, Líxus angustatus, Acanthoscelides obtectus e outros coleópteros que causam danos a madei- ras e plantas agronomicamente importantes das famílias Scolytidae, Ce- rambycidae, Curculionidae e Bostrichida. Insetos-praga da presente inven¬ ção da maioria das cultivares incluem, mas não estão limitadas a: Milho - Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saccharalis, Dia- brotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi, Diabrotica undecim- punctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala im- maculata, Popillia japonica, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus leucop- terus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Hylemya platura, Agromyza parvicornis, Anaphothríps obscrurus, Solenopsis milesta, Tetra nychus urticae; Sorgo - Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicover- pa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltia subterrânea, Phyllophaga crinita, Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., Oulema melanopus, Chaetocnema puli- caria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissus leucopterus leucopterus, Contarínia sorghicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae; Trigo -Pseudaletia unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Macrosiphum avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Melanoplus sanguinipes, Mayetíola destructor, Sitodi- plosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata, Frankliniella fusca, Cephus cinctus, Aceria tulipae; Girassol - Cylindrocupturus adsper- sus, Smicronyx fulus, Smicronyx sordidus, Suleima helianthana, Homoeo- soma electellum, Zygogramma exclamationis, Bothyrus gibbosus, Neolasiop- tera murtfeldtiana; Algodão - Heliothis virescens, lagarta-das-maçãs; Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera exigua, lagarta do cartu- cho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo- do-aigodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis se- ríatus, pulga saltadora do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca Bemisia tabaci; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Franklinkiella fusca, tripés; Te- tranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro-rajado; Arroz - Diatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Co- laspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophilus oryzae, Nephotettix ni- gropictus, Blissus leucopterus leucopterus, Acrosternum hilare; Soja - Pseu- doplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubi- lalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Epilachna varivestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Hylemya platura, Sericothrips variabilis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae; Cevada - Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, Euschistus servus, Jylemya platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Canola - Vrevicoryne brassicae, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum, Meligethes aeneus, Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meli- gethes canadianus, e Meligethes viridescens; Batata - Leptinotarsa decemli- neata.
EXEMPLOS
A presente invenção é ainda definida nos seguintes Exemplos.
Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.
Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sam- brook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipula- ções experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como "solução de lise", "SSC", "SDS", etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).
Exemplo 1 - Identificação de sequência de nucleotídeos das enzimas Quitina sintase 1 e Quitina sintase 2 de Anthonomus grandis para preparo do dsRNA.
Ovos, larvas e insetos adultos de A. grandis foram obtidos do Laboratório de bioecologia e semioquímicos de insetos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia em Brasília-DF. A colónia foi alimentada com dieta artificial como descrito por Monnerat et al (MONNERAT, R. G., et al., Criação massal do bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis em laboratório. Comunicado Técnico, 46, Embrapa-Cenargen: Brasília, 2000) e mantida a 26 ± 2 °C, umidade relativa de 60 ± 0% e fotofase de 12 horas. Para a clonagem e sequênciamento de quitina sintase 1 e quitina sintase 2 de A. grandis o RNA total foi isolado de ovos, larvas e insetos adultos utilizando Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo indicado pelo fabricante. O cDNA foi sintetizado a partir de 5Dg de RNA total utilizando o kit Superscript II TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) utilizando oligo NV-d(T)30-AP (Tabela I). Para a amplificação inicial de segmentos de Quitina sintase 1 e Quitina sintase 2 de A. grandis foram utilizados iniciadores degenerados correspondendo a regiões conservadas encontradas em domínios catalíticos de Quitinas sintases de outros insetos. Fo- ram realizadas duas etapas consecutivas de PCR utilizando iniciadores degenerados. A primeira etapa de PCR consistiu na amplificação do segmento no domínio catalítico entre os aminoácidos conservados DPDYYEFE e LHPQE, utilizando oligonucleotídeos degenerados para o oligonucleotídeo iniciador senso e para o iniciador antisenso. As condições de PCR nesta primeira etapa foram as seguintes: 1 DL de cDNA diluído (1 :20) , 2,0 DL de tampão 10X High Fidelity, 0,8 DL de MgS04 (50mM), 0,4 DL de dNTP (10 mM), 0,4 DL de cada oligonucleotídeo (10 DM), 0,2 DL (1 U) de Taq Plati- num® High Fidelity (Invitrogen) e 14,8 DL de H2O. Na segunda etapa foi utilizado como molde o produto da primeira etapa diluído 1 :20 e foram utiliza- dos oligonucleotídeos iniciadores entre as regiões DGDIDF (iniciador senso) e QYDQGEDRW ou GPGTIFLM (iniciador antisenso). Nas duas etapas as reações de PCR com os iniciadores degenerados foram realizadas utilizando as seguintes condições: 94°C por 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 48°C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 mi- nuto.
Para obter a sequência completa de cDNA de quitinas sintases, as extremidades 5' e 3' foram amplificadas utilizando oligonucleotídeos específicos desenhados a partir da região conservada sequênciada previamente. A Figura 1 ilustra as etapas da clonagem do cDNA de AntgCHS sin- tetizado a partir do RNA extraído de ovos de A. grandis. Os oligonucleotídeos utilizados nas etapas da clonagem e AntgCHSI estão listados na Tabela I. Já a figura 2 ilustra as etapas da clonagem do cDNA de AntgCHS2 sintetizado a partir do RNA extraído de larvas e adultos de A. grandis. Os oiigonucleotídeos utilizados nas etapas da clonagem de AntgCHS2 estão listados na Tabela II. A sequência completa do cDNA de AntgCHSI SEQ ID N° 1 e do cDNA de AntgCHS2 SEQ ID N° 3 foram obtidas pela sobreposição dos fragmentos obtidos pelo 5' e 3' RACE.
Tabela I - Lista de oligonucleotídeos utilizados na clonagem de
AntgCHSI
N° çio TamaOligonucleotídeo
Nome do oligofragnho
nucleotídeo mento Dire(figura 1) (Pb) Tipo Sequência (5'-3')
ção
GAATTCACGCGTCGACTAG-
NV-d(T)30-AP A D
TAGCATATGTAC(T)30VN
QuiSyntFor2010- GAYCCNGAYTAYTAYGAR-
S D DPD TTYGAR
1268
QuiSyntRev3270- A D YTCYTGNGGRTGNA LHP
QuiSyntFor2400-
S D G A YG G N G A YATYG A YTTY DGD
1 588
QuiSyntRev2960- CATVAGGAADATVG-
A D GPG TDCCGGGDCC AR
TTAATCGTTGTGGATA I I I AA-
5'CHS1fw S E
TAG
Antg2 2530
GAAAAACATCCGGGACTACA- CHSI conservado A E
CAGTACGCA
rv
AntgCHSI conservado S E CGGGGATATTGA I I I CCAACC
2675
fw
3
AgQS1 GTWc122
A E TGACTTACACCAACTTATCC
19rv
Tabela II - Lista de oligonucleotídeos utilizados na clonagem de
AntgCHS2
N° do Tama Oligonucleotídeo
Nome do oligonu- fragmen- maDire
cleotídeo to (figura nho re- Tipo Sequência (5'-3')
2) (pb) ção
GAATTCACGCGTCGACTAG-
NV-d(T)30-AP A D
TAGCATATGTAC(T)30VN
QuiSyntFor2010- GAYCCNGAYTAYTAYGAR-
S D DPD TTYGAR
1268
QuiSyntRev3270- A D YTCYTGNGGRTGNA LHP
QuiSyntFor2400-
S D G A YG G N GA YATYG A YTTY DGD 1 324
QuiSyntRev2700- A D CCANCKRTCYTC- QYD NCCYTGRTCRTAYTG
CAAATTTCTCAAAAATCG-
5'-1AntgCHS2fw S E
CCACC
2601
Antg- A E AACATGAGAAATATCGTTCC CHS2conservadorv
G G G ATTTTG AAATC ATA CTT-
5'-2AntgCHS2fw S E
731 GGTA
AntgCHS2-c8194- G C G AG CATC AAAAAC C ATA- A E
Rv TCC
CGGGGATATTGATTT-
AgQSconservadofw S E
CCAACC
2450
TCCGAATTCACGCGTCGAC- GTW-AP A E
TAGTAGCA
O desenho do segmento de RNA dupla fita consistiu na escolha de fragmentos entre 80 pb e 600 pb, (SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 ) utilizando como molde as sequências do cDNA Antg- CHS1 e AntgCHS2. Para o desenho de RNA dupla fita foi utilizado o pro- grama BLOCK-iT™ RNAi Designer (disponível em http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress), que analisa as sequências e indica regiões de maior probabilidade para uso em silenciamento gênico.
Os moldes de DNA para a síntese do RNA dupla fita (dsRNA), por transcrição in vitro, foram sintetizados por PCR, as sequencias dos oligonu- cleotideos estão listads na tabela III. As regiões-alvos selecionadas do cDNA foram amplificadas atravez de reações de PCR utilizando iniciadores específicos flanqueados pela sequência mínima do promotor T7 (5'- TAA- TACGACTCACTATAGGGAGA) utilizando as seguintes condições: 94°C por 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 se- gundos e extensão a 72 °C por 1 minuto. Após amplificação, os produtos de PCR foram clonados no vetor pGEM-T-easy para confirmação da sequência alvo por sequênciamento. Os produtos de PCR das sequencias alvos obtidos e sequênciados sem as regiões da sequência do promotor T7 estão descritas nas sequências SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6. O detalhamento das sequencias SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 estão descritas no exemplo 4.
Tabela III - Oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR para a síntese dos moldes para a transcrição in vitro de dsRNA
Figure imgf000037_0001
Após a confirmação da sequência molde a síntese de dsRNA foi realizada utilizando 0,5 pg do produto de PCR das sequências SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6, flanqueadas com a região promo- tora da RNA polimerase do T7, como molde para um volume de reação de transcrição de 20 pl_, conforme descrito no protocolo do manual do kit ME- GAscript® T7 High Yieid (Ambion), a reação continha 7,5mM de cada ribo- nucleotideo ATP, CTP, GTP e UTP, tampão 1x e 50U de T7 RNA polimerase.
A reação foi incubada por 16 hs a 37°C, seguido por tratamento com DNAse I por 15 minutos. Para alinhamento do RNA fita dupla, os produtos da reação foram incubados a 70°C por 5 minutos e resfriados em temperatura ambiente (22°C). Para purificação dos produtos da transcrição se- guiu-se uma extração com fenol/clorofórmio e subsequente precipitação com álcool isopropílico, coforme protocolo descrito pelo fabricante do kit MEGAscript® T7 High Yield (Ambion). O dsRNA foi dissolvido em água tratada com DEPC. A integridade do dsRNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1 % e a quantificação foi obtida por espectrofotometria. A concentração final de cada dsRNA foi ajustada para 200 ng/DL para ser utilizados nos ensaios de microinjeção para avaliação do silenciamento gênico.
Exemplo 2 - Bioensaios de microinjeção de dsRNA em Antho- nomus grandis
Amostras quantificadas de RNA dupla fita (dsRNA) foram utilizadas em bioensaios contra o bicudo do algodoeiro. O dsRNA foi preparado a partir de sequências identificadas conforme descrito no exemplo 1. Para o procedimento de microinjeção em A. grandis insetos adultos e larvas foram previamente anestesiados em gelo por 10 minutos. A microinjeção foi reali- zada utilizando uma seringa Hamilton de 10 DL, em cada inseto foi aplicado 1 DL de solução aquosa contendo ou não o dsRNA. A injeção na larva foi realizada na região dorsal entre o quarto ou quinto segmento abdominal. Nos insetos adultos houve necessidade de levantar um dos élitros para expor o abdómen, local da microinjeção. Depois da injeção os insetos foram: 1 ) mantidos em condições padrões de alimentação em dieta artificial como descrito por Monnerat et al (MONNERAT, R. G., et al., Criação massal do bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis em laboratório. Comunicado Técnico, 46, Embrapa-Cenargen: Brasília, 2000), 2) retirados quando necessário de acordo com o período experimental, 3) congelados em nitrogénio lí- quido e estocados a -80°C até o momento da extração do RNA total.
Exemplo 3 - Bioensaios de microinjeção de dsRNA em Anthonomus grandis para análise funcional de AntgCHS
A avaliação do silenciamento de AntgCHSI sobre parâmetros fe- notípicos de fêmeas de A. grandis foi determinado por meio de bioensaios de microinjeção de dsRNA AntgCHSI (SEQ ID N° 2) em fêmeas adultas. Os parâmetros fenotípicos quantificados foram oviposição, viabilidade de ovos e mortalidade dos insetos adultos. Cada unidade experimental consistiu em 6 insetos fêmeas adultas com 48hs de idade microinjetadas com 200ng de dsRNA e 8 insetos machos adultos não microinjetados, o período experimental foi de 12 dias. Os insetos foram mantidos em pequenas gaiolas, onde o piso da gaiola foi confeccionado com tela para permitir a coleta de ovos. Os insetos machos foram marcados com gliter prateado para facilitar a identificação. O monitoramento do bioensaio foi realizado a cada 48hs, momento no qual eram ofertadas água e dieta artificial ad libitum. O bioensaio consistiu em três réplicas biológicas com três réplicas técnicas. O tratamento controle consistiu na aplicação de dsRNA de um gene não relacionado, no caso, foi utilizado dsRNA com sequencia do gene gus de Escherichia coli. Para analisar os dados obtidos nos bioensaios foi aplicada uma análise de variância, seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey, ao nível de 5% de significância. Os ovos obtidos desse experimento foram submetidos a análise da expressão de AntgCHSI por PCR em tempo real como descrito no exemplo 5.
Para avaliar o efeito silenciamento AntgCHSI sobre a formação de larvas neonatas, ovos obtidos do experimento de silenciamento descrito anteriormente foram perfurados mecanicamente com um pinça entomológi- ca para romper a casca do ovo e permitir a eclosão das larvas. As larvas fo- ram mantidas em dieta artificial por sete dias. Após esse período as larvas foram contadas e os fenótipos foram analisados. Os ovos do tratamento controle (dsRNA GUS) também foram submetidos ao mesmo processo de perfuração da sua casca.
Para analisar a função biológica de AntgCHSI durante o desen- volvimento de pupas de A. grandis, larvas de 3o instar foram microinjetadas com 200ng de dsRNA AntgCHSI . Cada unidade experimental consistiu em 20 larvas. O bioensaio consistiu em três réplicas biológicas com três réplicas técnicas. O período experimental foi de 10 dias. Após esse período as larvas foram contadas e os fenótipos obtidos foram analisados e fotografados.
Exemplo 4 - Bioensaios de microinjeção de dsRNA AntgCHS2 em Anthonomus grandis para análise funcional de AntgCHS2
Nos ensaios de microinjeção visando a análise do silenciamento da enzima Quitina sintase 2 (AntgCHS2) foram avaliadas diversas variáveis como descrito a seguir: 1- influência do tamanho do segmento de dsRNA; 2- localização da sequência de dsRNA alvo dentro da sequência de cDNA de AntgCHS2 (SEQ ID N° 3); 3- efeito da concentração de dsRNA microinjeta- do; 4- persistência do silenciamento durante as fases de desenvolvimento do inseto. Os detalhes destes experimentos são descritos a seguir.
1 - Localização da sequência alvo dentro da sequência de cDNA de AntgCHS2 e do tamanho do segmento de dsRNA para o silenciamento:
Para avaliar o efeito da posição da sequência alvo dentro da se- quência do cDNA de AntgCHS2 para o silenciamento foram selecionadas três regiões para síntese do dsRNA: o dsRNA localizado na extremidade 5', denominado AntgCHS2-1 (SEQ ID N° 4), compreendendo a região entre os nucleotídeos 425-638 do cDNA de AntgCHS2; o dsRNA localizado na região central, denominado AntgCHS2-2 (SEQ ID N° 5), compreendendo a região entre os nucleotídeos 2379-2966 do cDNA; e o dsRNA localizado na extremidade 3', denominado AntgCHS2-3 (SEQ ID N° 6), compreendendo a região entre os nucleotídeos 4373-4557 do cDNA. Os segmentos escolhidos para a síntese dos dsRNAs tinham os tamanhos de 213, 587 e 184 pares de bases, respectivamente.
Neste ensaio foram microinjetados 200 ng de dsRNA por inseto' adulto, no total de 12 insetos. Após 72 hs quatro insetos foram selecionados aleatoriamente, congelados em nitrogénio liquido e mantidos a -80 °C. A síntese dos cDNAs dos diferentes tratamentos, bem como a análise por qRT- PCR foram realizados conforme descrito no exemplo 5. Foram realizados dois tratamentos controles, um controle consistiu da aplicação de água tratada com DEPC e o outro controle consistiu da microinjeção de dsRNA GUS.
2- Efeito da dose de dsRNA microinjetado
Para avaliar o efeito da concentração de dsRNA microinjetado sobre o silenciamento de AntgCHS2 foram testadas as concentrações de 50, 00 e 200 ng de dsRNA AntCHSB-3/inseto (SEQ ID N° 6). Este dsRNA foi escolhido dentre os três disponíveis por ser especifico para A. grandis, e ter o menor tamanho (184 pb), o que diminui a possibilidade do efeito de silenciamento cruzado com genes não alvos. Neste ensaio, foi microinjetado um total de 12 insetos adultos. Após 72 hs quatro insetos foram seleciona- dos aleatoriamente, congelados em nitrogénio liquido e mantidos a -80 °C. A síntese dos cDNAs dos diferentes tratamentos, bem como a análise por qRT-PCR foram realizados conforme descrito no exemplo 5.
3- Persistência do silenciamento durante as fases de desenvolvimento do inseto
Larvas foram microinjetadas com dsRNA a fim de avaliar a persis- tência do efeito do RNAi em inseto adulto. Aqui adotaremos a nomenclatura, laRNAi (RNAi larval), sugerida por Huvenne e Smagghe para esse tipo de experimento (HUVENNE, H., et al., Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. Journal of Insect Physiology, v. 56, n, 3. p. 227-235. 2010). As larvas de terceiro instar de desenvolvimen- to foram microinjetadas com 200 ng de dsRNA AntgCHS2-3 (SEQ ID N° 6) e colocadas em dieta artificial. Insetos adultos com idade de 72 horas foram submetidos às análises por PCR em tempo Real, conforme descrito no exemplo 5.
A avaliação do silenciamento de AntgCHS2 sobre parâmetros fe- notípicos de fêmeas de A. grandis foi realizada por meio de bioensaios de microinjeção em fêmeas adultas. Os parâmetros fenotípicos quantificados foram oviposição, viabilidade de ovos e mortalidade dos insetos adultos. Cada unidade experimental consistiu em 16 insetos fêmeas adultas com 48hs de idade microinjetadas com 200ng de dsRNA e 8 insetos machos adultos não microinjetados, o período experimental foi de 12 dias. Os insetos foram mantidos em pequenas gaiolas, onde o piso da gaiola foi confeccionado com tela para permitir a coleta de ovos. Os insetos machos foram marcados com gliter prateado para facilitar a identificação. O monitoramento do bioensaio foi realizado a cada 48hs, momento no qual eram ofertadas água e dieta artificial ad libitum. O bioensaio consistiu em três réplicas biológicas com três réplicas técnicas. O tratamento controle consistiu na aplicação de dsRNA de um gene não relacionado, no caso, foi utilizado dsRNA com sequencia do gene gus de E. coli. Para analisar os dados obtidos nos bioensaios foi aplicada uma análise de variância, seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey, ao nível de 5% de significância.
Exemplo 5 - Determinação dos níveis de expressão de Antg- CHS1 e AntgCHS2
Para avaliar o efeito do dsRNA sobre a expressão do transcrito alvo (AntgCHSI e AntgCHS2) foi utilizada a técnica de qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real) (KUBISTA, M., et al., The real-time polymerase chain reaction. Molecular aspects of medicine, v. 27, n. 2-3. p. 95-125. 2006). O RNA total de insetos proveientes de cada tratamento foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo indicado pelo fabricante. O cDNA foi sintetizado utilizando o kit SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen) a partir de 1 Dg de RNA total tratado com Ambion® DNAse I RNAse-free™ (Invitrogen) utilizando o olígonucleotídeo NV-d(T)30-AP (ver Tabela i).
A reação de PCR em tempo real foi realizada no equipamento 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando SYBR™ Green, como fluoróforo intercalante. As sequências dos oligonucleotídeos utilizados para a avaliação dos transcritos são descritos na Tabela IV. Cada reação foi realizada com 2 DL de uma diluição 1 :20 de cDNA, 0,2 DM de cada olígonucleotídeo em um volume total de 10 DL. O programa para qRT- PCR consistiu em um passo inicial a 95°C por 10 minutos seguidos por 40 ciclos de 95°C por 20 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos. Para a análise das amplificações, a Ct (do inglês - cycle of the threshold) e a eficiência de amplificação de cada olígonucleotídeo (variando de 90% a 100%) foram determinadas pelo programa Real-time PCR Miner (http://www.miner.ewindup.info/) (ZHAO, S., et al., Comprehensive algorithm for quantitative real-time polymerase chain reaction. Journal of Computatio- nal Biology, v. 12, n. 8. p. 1047-1064. 2005). A análise da expressão relativa baseados nos valores de Cts e utilizando múltiplos genes foi realizada no programa qBasePlus versão 2.0 pelo método de Pfaffl (PFAFFL, M. W., A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nu- cleic Acids Research, v. 29, n. 9. p. e45. 2001). Todos os experimentos de qRT-PCR foram realizados em duas réplicas biológicas e três repetições técnicas. Os genes GAPDH e beta-Actina fora utilizados como genes de referência. A análise estatística foi realizada pelo teste de Tukey ao nível de significância de 0,05% para comparação entre os tratamentos.
Tabela IV-Oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR em tempo real para análise da expressão de AntgCHS e AntgCHS2
Tama¬
Nome do Sequência do Sequência oligonuEficinho do
oíigonu- oligonucleotídeo cleotídeo antisenso ência ampli- cleotídeo senso (5'-3') (5'-3')
com (pb) (%)
AntgCHSI- TGCTCCTGATA- ATCCGGGACTA-
174 105 RT GATTTGATG CACAGTACGCA
AAGGCAT-
AntgCHS2- TCCAAGTCG- TAACGGTGA- 120 101 RT TTGATGACTGC CGAC
AGATCG-
AAGGCGGGAA-
GAPDH-RT TCGAGGG- 166 99
TGACTTTACC TCTGATG
CCTTTAACAC- TGAGGTAGTCGG-
B-Actina-RT 192 102
CCCTGCTATG TCAAGTCA
Exemplo 6 - Resultados dos bioensaios de microinjeção de dsRNA e avaliação do silenciamento do gene para enzima Quitina sintase 1 em A Grandis (AntgCHSI )
Foi identificada a sequência de cDNA do gene da Quitina sintase 1 (ou A) de A. grandis, cujo tamanho foi de 4831 nucleotídeos (SEQ ID NO 1). Dentro desta sequência foi selecionada uma região de 249 pb (SEQ ID NO 2) para servir de molde para a síntese da molécula de dsRNA, conforme descrito no exemplo 1.
Foi verificado por meio dos bioensaios de microinjeção que o dsRNA AntgCHSI (SEQ ID NO 2) foi capaz de suprimir o número de transcritos da Quitina sintase 1 em ovos de A. grandis (Figura 3). Em ensaios de microinjeção do dsRNA AntgCHSI em adultos de A. grandis causou redu- ção da viabilidade dos ovos (Figura 4). Foi observado que as larvas se formaram dentro dos ovos e se movimentavam ativamente, mas não consegui- ram eclodir (Figura 4). Alguns desses ovos inviáveis foram perfurados mecanicamente com o auxilio de uma pinça para forçar a eclosão das larvas. O ovos perfurados foram colocados em dieta artificial para o desenvolvimento das larvas. As larvas provenientes do tratamento com dsRNA AntgCHSI apresentaram má formações na cápsula cefálica e das mandíbulas e foi observado mortalidade total das larvas eclodidas do tratamento com dsRNA AntgCHSI (Figura 5).
Em experimentos de microinjeção de dsRNA AntgCHSI (SEQ ID NO 2) em larvas de último instar foi observado que os todos os insetos si- lenciados não conseguiram se desenvolver em pupa e morreram. Insetos não silenciados desenvolveram-se normalmente e transformaram-se em adultos (Figura 6).
Exemplo 7 - Resultados dos bioensaios de microinjeção de dsRNA e avaliação funcional do silenciamento do gene para enzima Quitina sintase 2 (AntgCHS2) em A grandis.
Foi identificada a sequência de cDNA do gene da Quitina sintase 2 (ou B) de Anthonomus grandis, cujo tamanho foi de 4729 nucleotídeos (SEQ ID NO 3). Dentro desta sequência foram selecionadas três regiões de diferentes tamanhos (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 E SEQ ID NO 6) para servir de molde para a síntese de moléculas de dsRNA, conforme descrito no exemplo 1. Foi verificado por meio dos bioensaios de microinjeção e pelos resultados das análises de PCR em tempo real que dsRNAs de diferentes tamanhos, variando entre 80 pb e 600 pb, foram capazes de suprimir o número de transcritos de AntgCHS2 sem diferirem estatisticamente entre os tratamentos. Do mesmo modo não houve diferença entre as regiões escolhidas como alvo para ao silenciamento, quer seja na extremidade 5', na região central, ou ainda, na extremidade 3' do cDNA (Figura 7). Também por análises de PCR em tempo real foi observado que em insetos adultos micro- injeções de 50 ng de dsRNA foram suficientes para após 72 horas, causar redução drástica do número de transcritos (Figura 8). Para os experimento de microinjeção em larvas, o tratamento que apresentou maior efeito foi a microinjeção de 200 ng de dsRNA por inseto (Figura 9). Foi verificado que o efeito do silenciamento gênico persiste após a metamorfose, ou seja, adultos provenientes de larvas microinjetadas apresentaram redução do número dé transcritos da quitina sintase 2 em relação ao tratamento controle (dsR- NA GÚS) (Figura 10).
Na avaliação de parâmetros fenotípicos causados pela microinje- ção do dsRNA AntgCHS2 (SEQ ID NO 6) verificou-se que após 144 horas as fêmeas microinjetadas com RNAi interromperam a oviposição, causando uma redução de 93% do número de ovos (Figura 1 1). Além disso, a taxa de mortalidade dos insetos aumentou ao longo do tempo atingindo 100% após 240 horas. Foi atribuída a esse fenótipo letal, a interrupção inicial da alimentação que resultou, na interrupção da oviposição, seguido da morte do inse- to. (Figura 12).

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico isolada caracterizada por ser se- lecionado do grupo consistindo de:
a. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma se- quência de ácido nucleico substancialmente similar às sequências selecio- nadas do grupo de SEQ ID No 1 , SEQ ID No2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6;
b. Molécula de ácido nucleico isolada que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos indicada pelas sequências selecionadas do grupo de SEQ ID No 1 , SEQ ID No2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6, sob condições de lavagem de 5X SSC, formamida a 50% e 42°C; poMOmin;
c. Fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos selecionada selecionadas do grupo de SEQ ID No 1 , SEQ ID No2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6, onde a ingestão, por coleópteros-praga de plantas, da sequência de um ribonucleotídeo de filamento duplo, compreendendo pelo menos um filamento complementar do referido fragmento, inibe ou reduz a proliferação da referida praga; e
d. Complemento da sequência de (a), (b) ou (c).
2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por ser selecionada do grupo de SEQ ID No 1 , SEQ ID No2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6.
3. Gene quimérico caracterizado por compreender: a) um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2; e
b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).
4. Construção gênica caracterizada por compreender um ou mais genes quiméricos de acordo com a reivindicação 3.
5. Construção gênica caracterizada por compreender:
(a) uma primeira região compreendendo uma sequência de nucle- otídeos de pelo menos cerca de 19 nucleotídeos consecutivos tendo uma similaridade substancial de sequência com pelo menos cerca de 19 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID No 1 , SEQ ID No2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6;
(b) uma segunda região compreendendo uma sequência de nucleotídeos de cerca de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos tendo uma similaridade substancial de sequência com o complemento de cerca de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID No 1 , SEQ ID No2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6.
6. Construção gênica de acordo com a reivindicação 5 caracterizada pelo fato da primeira e a segunda região serem capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual pode ter, além do comprimento total da primeira e da segunda região, uma região espaçadora entre elas contendo pelo menos cerca de 3 nucleotídeos.
7. Construção gênica de acordo com a reivindicação 6 caracterizada pelo fato da sequência espaçadora ser um íntron.
8. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nu- cleico isolada de acordo com a reivindicação 1 .
9. Vetor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o referido vetor ser capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.
10. Sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo caracteri- zada por ser produzida a partir da expressão de uma molécula de ácido nu- cleico de acordo com a reivindicação 1.
11 . Sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo de acordo com a reivindicação 10 caracterizada pelo fato da ingestão ou assimilação por coleópteros-praga de plantas, da sequência de um ribonucleotídeo de filamento duplo, compreendendo pelo menos um filamento complementar do referido fragmento, inibe ou reduz a proliferação da referida praga.
12. Célula transformada caracterizada por compreender a molé- cuia de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.
13. Célula de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por ser uma célula procariótica.
14. Célula de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por ser uma célula eucariótica.
5. Célula de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por ser uma célula de vegetal ou bactéria.
16. Planta transformada caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.
17. Planta de acordo com a reivindicação 16 caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico ser expressa em uma célula vegetal, sob a forma de uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo, e a ingestão de dieta contendo uma quantidade inibidora, para inseto-praga, da refe- rida sequência do ribonucleotídeo de filamento duplo inibe ou reduz a proliferação da referida praga.
8. Planta de acordo com a reivindicação 17 caracterizada pelo fato do inseto-praga ser selecionado pelo grupo consistindo de Anthonomus grandis, Diabrotica virgifera, Tenebrío molitor, Tribolium castaneum e Hypothenemus hampei, Phoracantha semípunctata, Lixus angustatus, Acan- thoscelides obtectus e outros coleópteros que causam danos a madeiras e plantas agronomicamente importantes das famílias Scolytidae, Cerambyci- dae, Curculionidae e Bostrichida e outros coleópteros.
19. Produto comerciável caracterizado pelo fato de ser produzi- do a partir de uma planta de acordo com a reivindicação 16 onde o referido produto comerciável compreende uma quantidade detectável da molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 1 ou de um ribonucleotídeo expresso a partir da mesma.
20. Método para produzir organismos eucarióticos transgênicos nos quais a expressão de um gene alvo nas células do organismo é reduzida, caracterizado por compreender os estágios de:
I) prover uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ;
II) inserir a molécula obtida em "I" em célula ou células do organismo para produzir uma célula ou células transgênicas; e
III) crescer ou regenerar um organismo eucarioto transgênico da célula ou células transgênicas.
21. Método para controle de infestação de coleópteras caracterizado por compreender o fornecimento, na dieta de um coleóptera-praga, de um agente compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo de acordo com a reivindicação 0.
22. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizado pelo fato da célula do organismo eucarioto compreender ainda uma sequência de plonucleotídeo que codifica um agente pesticida.
23. Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado pelo fato do agente pesticida ser selecionado do grupo consistindo de patatina, uma proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, uma proteína Xenorhab- dus insecticida, uma proteína Photorhabdus insecticida, uma proteína de Bacillus laterosporous insecticida, uma proteína de Bacillus sphaericus insecticida, enzimas da família de quitinase e uma lignina.
24. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizado pelo fato do coleóptero praga ser selecionado do grupo consistindo de Anthono- mus grandis, Diabrotica virgifera, Tenebrio molitor, Tribolium castaneum e Hypothenemus hampei, Phoracantha semipunctata, Lixus angustatus, Acan- thoscelides obtectus e outros coleópteros que causam danos a madeiras e plantas agronomicamente importantes das famílias Scolytidae, Cerambyci- dae, Curculionidae e Bostrichida e outros coleópteros.
25. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizado pelo fato que o modo de atuação da molécula de ácido nucleico ou da sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo, ao ser ingerida ou assimilada pela praga, é o de supressão ou redução da expressão de um gene que execute uma função essencial para sobrevida do inseto.
26. Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizada pelo fato da função essencial para sobrevida do inseto ser selecionada do grupo de diferenciação e desenvolvimento da cutícula, formação do ovo, maturação larval, transição de estágio larval, pupação, digestão e assimilação de nutrientes, proteção contra patógenos.
27. Método para melhorar o rendimento de plantas cultivadas, sujeitas à infestação por insetos-praga, caracterizado por compreender as etapas de:
e. Introdução de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 na referida planta;
f.Cultivo da planta obtida em "a" de modo a permitir a expressão da referida molécula de ácido nucleico, onde essa expressão inibe ou reduz a proliferação da referida praga.
28. Método de acordo com a reivindicação 27 caracterizado pelo fato da expressão da molécula de ácido nucleico produzir uma molécula de RNA que suprime, pelo mesmo, um primeiro gene alvo em um inseto-praga que ingeriu uma porção da referida planta onde o gene alvo execita, pelo menos uma função essencial para sobrevida do inseto ser selecionada do grupo de diferenciação e desenvolvimento da cutícula, formação do ovo, maturação larval, transição de estágio larval, pupação, digestão e assimila- ção de nutrientes, proteção contra patógenos.
29. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizada pelo fato do inseto-praga ser selecionado do grupo consistindo de Anthonomus grandis, Diabrotica virgifera, Tenebrio molitor, Tribolium castaneum e Hypothenemus hampei, Phoracantha semipunctata, Lixus angustatus, Acan- thoscelides obtectus e outros coleópteros que causam danos a madeiras e plantas agronomicamente importantes das famílias Scolytidae, Cerambyci- dae, Curculionidae e Bostrichida e outros coleópteros.
30. Método de produção de um produto comerciável caracterizado pelo fato de compreender a obtenção de uma planta definida de acor- do com a reivindicação 16, ou parte da mesma, e o preparo de um produto comerciável a partir da planta ou parte da mesma.
31. Método de produção de alimento ou ração caracterizado pe- lo fato de compreender a obtenção de uma planta definida de acordo com a reivindicação 16, ou parte da mesma, e o preparo de alimento ou ração a partir da referida planta ou parte da mesma.
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