WO2014107784A1 - Processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos - Google Patents

Processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos Download PDF

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells

Definitions

  • Patent Descriptive Report "COLLECTION PROCESS FOR FREEZING AND STORAGE OF TRUNK CELLS FROM DECIDENT Teeth PULP".
  • the present invention relates to a collection process for freezing and storing stem cells from primary tooth pulp, more precisely opening another possibility of collecting stem cells.
  • PI 0513773-0 A Stem cells obtained from deciduous pulp or permanent teeth and dental germs, capable of producing Human bone tissue. This technology provides for the isolation, growth, application for production of autologous bone "in vitro", with the preservation of this living bone and its application in bone tissue reconstruction in patients.
  • the collection process for freezing and storing stem cells from primary teeth pulp deals with the sequence of procedures from primary teeth collection, stem cell isolation, expansion, to storage of stem cells under favorable conditions. and when necessary, and for the operation of the process a Collection Kit was developed to allow the Dentist to perform the collection in his own office according to pre-established technical protocols and deadlines. which was called the collection kit.
  • COLLECTION (Phase 1): The collection of primary teeth will be done by accredited dentists and pediatric dentists, after signature, by the child's parents or legal guardian and the responsible physician, of the service contract. It will be recommended that before extraction the child is healthy and free of oral infectious diseases. It will also be recommended that before the time of extraction the tooth be inspected for possible cavities or infections. The service can only be hired by parents or legal guardians of children free of infectious diseases at the time of tooth extraction.
  • the tooth be washed with 10 mL saline solution (solution included in the Collection Kit) inspected by accredited clinicians (A) and immediately immersed in collection media, packed in a collection tube (included in the Collection Kit), placed in the Collection Kit box and stored in a refrigerator (average temperature 4 ° C) until time of shipment.
  • PROCESSING (Phase 3): Upon arrival of the material, the tooth will be visually inspected for caries or infectious conditions that may increase the risk of cell culture contamination or decrease the efficiency of dental pulp stem cell isolation. The tooth will undergo three washes in PBS IX (phosphatebuffered saline) solution: 137 mMNaCl; 2.7 mMKCl; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH adjusted to 7.4) for 1 minute, 1 solution wash 1% povidoneiodine for 2 minutes, 1 wash in 0.1% sodium thiosulfate solution for 1 minute and 1 wash in PBS IX solution for 30 seconds.
  • PBS IX phosphatebuffered saline
  • the root will be separated from the dental crown using a sterile disposable scalpel.
  • the dental pulp will be accessed and isolated with the aid of Gracey's lime or curette, washed twice in antibiotic-supplemented PBS IX solution (100U / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin).
  • the pulps will be placed in type I and II collagenase solution and incubated at 37 ° C for 40 minutes.
  • the culture flasks will be monitored daily and bottles with contamination or evidence of onset of contamination will be discarded immediately. Flasks with healthy cell populations will be monitored for cell growth, with culture medium changed every 3 days, and also quality control (B).
  • FREEZING AND STORAGE phase 4: After reaching semi-confluence, the culture medium will be removed and the cells will be washed once with PBS IX. We will add PBS IX and the cells will be released from the bottom of the bottles using the CellLifter (Corning) instrument.
  • Cells will be counted using CellCountess R AutomatedCellCounter (Life Technologies) and aliquots of 0.5x10 5 cells will be diluted in cell freezing medium (20% basal medium, 70% AB-HumanSerum and 10% dimethylsulfoxide) in cryotubes and frozen at a reduction of 1 ° C per minute (with the aid of the 5100 Cryo 1 ° C Freezing Container - ThermoScientific apparatus) to -85 ° C and then transferred to gallons of liquid nitrogen.
  • cell freezing medium (20% basal medium, 70% AB-HumanSerum and 10% dimethylsulfoxide
  • cryotubes frozen at a reduction of 1 ° C per minute (with the aid of the 5100 Cryo 1 ° C Freezing Container - ThermoScientific apparatus) to -85 ° C and then transferred to gallons of liquid nitrogen.
  • the Collection Kit in which the collected material will be transported is stored in a Styrofoam container, disposable tube with 10 ml saline, collection tube (2 ml volume) with a 5 ml collection medium (Stern Pro MSC SFM XenoFreelOOU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin), 1 packet of liquid ice and 1 instruction sheet for storing the tooth and shipping the kit.
  • a Styrofoam container disposable tube with 10 ml saline, collection tube (2 ml volume) with a 5 ml collection medium (Stern Pro MSC SFM XenoFreelOOU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin), 1 packet of liquid ice and 1 instruction sheet for storing the tooth and shipping the kit.

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Abstract

Processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a parter da polpa de dentes decíduos, trata-se de um processo que possibilita a coleta de células tronco de dentes decíduos a partir da extração dos mesmos cujo procedimento passa pela COLETA (Fase 1) de células tronco a partir de dentes decíduos que serão extraídos por dentistas e odontopediatras credenciados; ENVIO (Fase 2) no qual o material coletado será enviado ao laboratório dentro de 48 horas após a coleta do dente inserido no Kit de coleta no qual o mesmo será transportado; PROCESSAMENTO (Fase 3) que no momento da chegada do material, o dente será inspecionado visualmente, para identificação de cáries ou condições infecciosas que possam aumentar o risco de contaminação da cultura celular ou diminuir a eficiência do isolamento das células-tronco da polpa dental que em seguida serão expandidas para CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO (fase 4).

Description

Relatório descritivo da patente de invenção: "PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS".
Refere-se a presente invenção, a um processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos, mais precisamente a abertura de mais uma possibilidade de coleta de células tronco.
Durante a fase de estudo e desenvolvimento do processo, foram realizadas inúmeras pesquisas em diversos bancos de dados, sendo identificada a PI 0513773-0 A, sob o título Células tronco obtidas da polpa decídua ou de dentes permanentes e dos germes dentais, capazes de produzir tecido ósseo humano. Essa tecnologia prevê o isolamento, crescimento, aplicação para produção de osso autólogo "in vitro", com a preservação desse osso vivo e sua aplicação na reconstrução do tecido ósseo em pacientes.
O processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos trata da sequência de procedimentos desde a coleta do dente decíduo, isolamento das células tronco, sua expansão, indo até o armazenamento das células tronco em condições favoráveis a sua aplicação quando e se necessário, sendo que, para a operacionalização do processo foi desenvolvido um Kit de Coleta, de modo a permitir que o Dentista possa realizar a coleta em seu próprio consultório de acordo com protocolos técnicos e de prazos para envio pré-estabelecidos o qual denominou-se kit de coleta.
O detalhamento dos procedimentos do processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos e da composição do kit de coleta de coleta será descrito de acordo com as fases listadas abaixo:
COLETA (Fase 1): A coleta de dentes decíduos será feita por dentistas e odontopediatras credenciados, após assinatura, pelos pais da criança ou responsável legal e pelo clínico responsável, do contrato de prestação de serviço. Será recomendado que, antes da extração, a criança esteja saudável e livre de doenças infecciosas orais. Também será recomendado que, antes do momento da extração, o dente seja inspecionado para identificação de possíveis cáries ou infecções. O serviço apenas poderá ser contratado por pais ou responsáveis legais de crianças livres de doenças infecciosas no momento da extração do dente. Será recomendado que, imediatamente em seguida à extração, o dente seja lavado com solução de 10 mL de soro fisiológico (solução incluída no Kit de coleta) inspecionado por clínicos credenciados (A) e seja imediatamente imerso em meio de coleta, acondicionado em tubo de coleta (incluídos no Kit de coleta), colocado na caixa do Kit de coleta e armazenados em geladeira (temperatura média de 4°C) até o momento do envio.
ENVIO (Fase 2): Será recomendado que o Kit de coleta, juntamente com uma cópia do contrato de prestação de serviço, seja enviado ao laboratório dentro de 48 horas após a coleta do dente sendo observado também o controle de qualidade (B).
PROCESSAMENTO (Fase 3): No momento da chegada do material, o dente será inspecionado visualmente, para identificação de cáries ou condições infecciosas que possam aumentar o risco de contaminação da cultura celular ou diminuir a eficiência do isolamento das células-tronco da polpa dental. O dente passará por três lavagens em solução de PBS IX ("phosphatebuffered saline": 137 mMNaCl; 2.7 mMKCl; 4.3 mM Na2HP04; 1.47 mM KH2P04, pH ajustado para 7.4) por 1 minuto, 1 lavagem em solução de 1% povidoneiodina por 2 minutos, 1 lavagem em solução de 0.1% tiossulfato de sódio por 1 minuto e uma lavagem em solução de PBS IX, por 30 segundos. A raiz será separada da coroa dental com o uso de bisturi estéril descartável. A polpa dental será acessada e isolada com o auxílio de lima ou cureta de Gracey, lavada duas vezes em solução de PBS IX suplementado com antibiótico (100U/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina). As polpas serão colocadas em solução de colagenase tipo I e II e incubadas a 37°C por 40 minutos. Após a digestão enzimática, adicionaremos meio de cultivo celular Stern Pro MSC SFM XenoFree(Life Technologies / Invitrogen) suplementado com 15% AB-HumanSerum(Corning), 100U/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina e centrifugaremos por 5 minutos a 1500 g. O sobrenadante será descartado e o precipitado será ressuspendido em 5mL de meio de cultivo celular e transferido para garrafas de cultura (Corning) de 25 cm2 de área.
Os frascos de cultivo serão monitorados diariamente e frascos com contaminação ou indícios de início de contaminação serão descartados imediatamente. Frascos com populações celulares saudáveis serão monitorados quanto ao crescimento celular, com troca do meio de cultivo a cada 3 dias, sendo observado também o controle de qualidade (B).
CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO (fase 4): Após atingirem semiconfluência, o meio de cultivo será removido e as células serão lavadas uma vez com PBS IX. Adicionaremos PBS IX e as células serão soltas da base das garrafas com uso do instrumento CellLifter (Corning). As células serão contadas com o uso do equipamento CellCountessRAutomatedCellCounter ( Life Technologies) e aliquotas de 0.5xl05 células serão diluídas em meio de congelamento de células (20% de meio basal, 70% AB- HumanSerum e 10% dimetilsulfoxido), colocadas em criotubos e congeladas com redução de 1°C por minuto (com o auxílio do aparato 5100 Cryo 1°C Freezing Container - ThermoScientific) até -85°C e, a seguir, transferidas para galões de nitrogénio líquido.
O Kit de coleta na qual o material coletado será transportado, é acondicionado em recipiente de isopor, tubo descartável com l Oml de soro fisiológico, tubo de coleta (volume de 2 ml) com a.5 ml de meio coleta (Stern Pro MSC SFM XenoFreelOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina) , 1 pacote de gelo líquido e 1 folheto de instruções para armazenamento do dente e envio do kit.
O processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos além de ser rápido e eficaz, aumenta a possibilidade de armazenamento e recuperação de células tronco, sendo inédito e operacional, portanto atende aos quesitos de ineditismos a aplicabilidade industrial inerentes ao deferimento de uma patente.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1- PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTER DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS, caracterizado por possibilitar a coleta de células tronco de dentes decíduos, sua expansão e posterior congelamento mediante o processo de extração dos mesmos.
2- PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTDi DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Coleta (Fase 1) de dentes decíduos que será feita por dentistas e odontopediatras credenciados, após assinatura, pelos pais da criança ou responsável legal e pelo clínico responsável, do contrato de prestação de serviço. Será recomendado que, antes da extração, a criança esteja saudável e livre de doenças infecciosas orais. Também será recomendado que, antes do momento da extração, o dente seja inspecionado para identificação de possíveis cáries ou infecções. O serviço apenas poderá ser contratado por pais ou responsáveis legais de crianças livres de doenças infecciosas no momento da extração do dente. Será recomendado que, imediatamente em seguida à extração, o dente seja lavado com solução de 10 mL de soro fisiológico (solução incluída no Kit de coleta) inspecionado por clínicos credenciados (A) e seja imediatamente imerso em meio de coleta, acondicionado em tubo de coleta (incluídos no Kit de coleta), colocado na caixa do Kit de coleta e armazenados em geladeira (temperatura média de 4°C) até o momento do envio.
3- PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTD¾ DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Envio (Fase 2) na qual o material coletado será enviado ao laboratório dentro de 48 horas após a coleta do dente sendo observado também o controle de qualidade (B).
4- PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTDi DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por PROCESSAMENTO (Fase 3) que no momento da chegada do material, o dente será inspecionado visualmente, para identificação de cáries ou condições infecciosas que possam aumentar o risco de contaminação da cultura celular ou diminuir a eficiência do isolamento das células-tronco da polpa dental. O dente passará por três lavagens em solução de PBS IX ("phosphatebuffered saline": 137 mMNaCl; 2.7 mMKCl; 4.3 mM Na2HP04; 1.47 mM KH2P04, pH ajustado para 7.4) por 1 minuto, 1 lavagem em solução de 1% povidoneiodina por 2 minutos, 1 lavagem em solução de 0.1% tiossulfato de sódio por 1 minuto e uma lavagem em solução de PBS IX, por 30 segundos. A raiz será separada da coroa dental com o uso de bisturi estéril descartável. A polpa dental será acessada e isolada com o auxílio de lima ou cureta de Gracey, lavada duas vezes em solução de PBS IX suplementado com antibiótico (100U/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina). As polpas serão colocadas em solução de colagenase tipo I e II e incubadas a 37°C por 40 minutos. Após a digestão enzimática, adicionaremos meio de cultivo celular Stern Pro MSC SFM XenoFree(Life Technologies / Invitrogen) suplementado com 15% AB- HumanSerum(Corning), 100U/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina e centrifugaremos por 5 minutos a 1500 g. O sobrenadante será descartado e o precipitado será ressuspendido em 5mL de meio de cultivo celular e transferido para garrafas de cultura (Corning) de 25 cm2 de área.
Os frascos de cultivo serão monitorados diariamente e frascos com contaminação ou indícios de início de contaminação serão descartados imediatamente. Frascos com populações celulares saudáveis serão monitorados quanto ao crescimento celular, com troca do meio de cultivo a cada 3 dias, sendo observado também o controle de qualidade (B).
5- PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO (fase 4) que será realizado após atingirem semiconfluência, o meio de cultivo será removido e as células serão lavadas uma vez com PBS IX. Adicionaremos PBS IX e as células serão soltas da base das garrafas com uso do instrumento CellLifter (Corning). As células serão contadas com o uso do equipamento CellCountessRAutomatedCellCounter ( Life Technologies) e aliquotas de 0.5xl05 células serão diluídas em meio de congelamento de células (20% de meio basal, 70% AB- HumanSerum e 10% dimetilsulfoxido), colocadas em criotubos, com congeladas com redução de 1°C por minuto (com o auxílio do aparato 5100 Cryo 1°C Freezing Container - ThermoScientifíc) até -85°C e, a seguir, transferidas para galões de nitrogénio líquido. 6-PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Kit de coleta na qual o material coletado será transportado, é acondicionado em recipiente de isopor, tubo descartável com 10ml de soro fisiológico, tubo de coleta (volume de 2 ml) com a.5 ml de meio coleta (Stem Pro MSC SFM XenoFreelOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina) , 1 pacote de gelo líquido e 1 folheto de instruções para armazenamento do dente e envio do kit (Fase 4).
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