WO2014178741A2 - Sonda de ácido péptido nucleico, estojo e método para detectar e / ou quantificar escherichia coli o157 : h7 e respectivas aplicações - Google Patents

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Rui Jorge ALVES ROCHA
Laura Isabel Macieira Cerqueira
Maria João Lopes DA COSTA VIEIRA
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • This invention relates to a method for detecting relevant microorganisms in both clinical and food safety. To this end, a PNA probe for the detection of Escherichia coli O157: H7 strains was developed.
  • the present invention includes the PNA FISH procedure and its application to a kit for the detection and / or quantification of Escherichia coli O157: H7, which can be used in both clinical and food fields.
  • the Escherichia coli species includes a heterogeneous group of bacteria that are part of the normal intestinal tract microflora of humans and animals (Gyles, 2007). These bacteria are typically harmless, but a considerable number of strains are pathogenic. Pathogenic strains of E. coli are classified according to their virulence factors, their pathogenicity and their serotype. There are six classes of pathogenic E. coli, enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteroinvasive E. coli (EEC), and diffuse adherent E. coli (DAEC) and enterohemorrhagic E. coli (EHEC) (Sheibani, 2007).
  • ETEC enterotoxigenic E. coli
  • EPEC enteropathogenic E. coli
  • EAEC enteroaggregative E. coli
  • EEC enteroinvasive E. coli
  • DAEC diffuse adherent E. coli
  • EHEC strains are perhaps the most due to their high virulence and their association with life-threatening complications (Sheibani, 2007).
  • E. coli serotype O157: H7 serotype is based on O [Ohne] antigen - determined by cell wall lipopolysaccharide - and H [Haunch] antigen due to flagellar protein is the most commonly isolated. (Gyles, 2007).
  • E. coli O157: H7 The infectious dose of E. coli O157: H7 is reported to be very low - about 1-100 CFU / mL - lower than most enteric pathogens (Robinson and McKillip, 2010).
  • the virulence of this microorganism is mainly due to three factors. The first and most important is the production of Shiga-like toxins (Stxs), called Stxl and Stx2. These toxins are currently among the most potent cytotoxins capable of affecting eukaryotic cells (Robinson and McKillip, 2010).
  • Stxs Shiga-like toxins
  • locus enterocyte effacement (a pathogenicity island encoding a battery of specialized virulence factors) and the presence of plasmid pO157 (encoding a type II secretion system, an enterohemolysin, a lymphocyte inhibitor and potential adhesins, among others). ) are also needed (Robinson and McKillip, 2010).
  • HUS haemolytic uremic syndrome
  • TTP thrombotic thrombocytopenic purpura
  • Die die
  • HUS affects the renal endothelial cells ' and can lead to acute renal failure (Robinson and McKillip, 2010).
  • HUS has a significantly higher mortality rate and, in case of survival, patients usually have permanent renal sequelae.
  • TTP In addition to the typical symptoms of HUS, TTP It is associated with neurological symptoms such as headaches, seizures, lethargy and encephalopathy (Robinson and McKillip, 2010).
  • E. coli O157 H7 outbreaks detected in the US, 25% of affected people were hospitalized, 5-10% developed HUS or TTP, and 1% died (Pennington, 2010).
  • cattle In relation to environmental reservoirs, cattle usually serve as the primary and natural reservoir of E. coli O157: H7 and it is estimated that 10 - 80% of all animals are colonized by this bacterium (Yoon and Hovde, 2008). Other animals such as goats, sheep and pigs may also be carriers. Results from a study including 90 microbiologically confirmed outbreaks (occurring between 1982 and 2006) show that the sources of transmission to humans were food in 42.2% of cases; dairy products by 12.2%; contact with animals in 7.8%; water in 6.7%, environment in 2.2% and unknown in 28.9% of outbreaks (Pennington, 2010).
  • Sorbitol fermentation testing has been suggested as the simplest method for detecting E. coli O157: H7, as this bacterium does not have the enzyme ⁇ -glucorunidase.
  • Most existing culture methods have been developed based on this feature.
  • other properties of this bacterium such as inability to ferment rhamanose and tolerance to tellurite, have also been explored (Raji et al., 2003).
  • These cultivation techniques remain an integral aspect of quality control during food processing. relatively inexpensive, technically simple and have high specificity and sensitivity.
  • these methods are also very time consuming, laborious and unable to detect E. coli O157: H7 strains, which ferment sorbitol and are susceptible to tellurite (Raji et al, 2003.).
  • culture methods such as ISO 16654, generally include a poorly specific agglutination assay (detection of O157 or H7 antigen) since O157 and H7 antigens are present in other Escherichia coli species.
  • These antibodies may also cross-react with other E. coli serotypes, other Escherichias, and other members of the Enterobacteriaceae family (Raji et al., 2003).
  • FISH is a widely applied molecular method for the identification of microorganisms. This method is based on the specific binding of small oligonucleotides (probes) on specific regions of ribosomal RNA (rRNA) due to their high abundance, universal cell distribution and use as a phylogenetic marker.
  • the probe is bound to a fluorochrome and, after a hybridization step, fluorescence can be detected due to the high number of rRNA copies within the cell.
  • PNA nucleic acid peptide
  • the present invention relates to a nucleic acid peptide (PNA) probe and associated method for detecting E. coli serotype O157 (i.e. identify or quantify).
  • PNA nucleic acid peptide
  • the probe described in the present invention recognizes the 23S rRNA of the microorganism in question or the genomic sequences corresponding to said rRNA.
  • PNA probes have inherent physicochemical characteristics that, when applied to a method based on FISH technology, allow for faster, more robust and specific analysis than using a DNA probe.
  • the developed method can match the best times described for the other molecular methods even when the sample type requires an enrichment step prior to analysis.
  • the speed, coupled with the reliability of the method, may determine the timely and appropriate treatment of contamination and / or infection from both a clinical and food safety perspective.
  • Another aspect of the present invention relates to the development of a kit based on the application of this probe to the fluorescent in situ hybridization (FISH) technique, which allows detection of E. coli O157 in a diverse set of biological samples from a simply and quickly.
  • the PNA probe which allows the presence of E. coli O157 to be detected, may in a preferred embodiment detect the target sequence in the rRNA, rDNA or complementary sequences of the E. coli O157 rRNA.
  • One embodiment of the present invention is a description of an E. coli O157 detection and / or quantification PNA probe characterized by having at least 86% similarity to the sequence SEG ID No. 1 -5'- CAA CAC ACA GTG TC -3, preferably 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% similarity to to sequence SEG ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3.
  • the sequences described above are linked to at least one type of detectable moiety.
  • the type of detectable moiety to be used may be selected from one of the following groups: a conjugate, a branched detection system, a chromophore, a fluorophore, a radioisotope, an enzyme, a hapten or a luminescent compound, among others. .
  • the fluorophore group may be at least one of the following: Alexa series fluorophores, cyanines, 5- (and -6) Carboxy-2 ', 7'-dichlorofluorescein, 5-ROX (5-carboxy-X -rhodamine, triethylammonium salt), among others.
  • E. coli O157 presence or absence detection and / or quantitation kit in biological samples.
  • the kit may further comprise at least one of the following solutions: a fixation solution, a hybridization solution and a wash solution.
  • the fixing solution may comprise paraformaldehyde and ethanol, namely 2-8%. (weight / vol) paraformaldehyde and 25-90% (vol / vol) ethanol and / or the hybridization solution may comprise formamide.
  • hybridization may preferably be by fluorescence.
  • biological samples may come from blood, air, food, water, biopsies or feces, among others.
  • the present invention encompasses the PNA probe / reagents, methods and kit for detecting or quantifying E. coli O157 strains.
  • the probe described herein allows specific detection of E. coli O157 by binding to rRNA, genomic sequences corresponding to rRNA (r), or sequences complementary thereto.
  • the higher specificity of PNA probes allows for better discrimination of related nucleotide sequences. This is of particular importance for this probe since there are some E. coli O157 phylogenetically related microorganisms that have only one nucleotide difference (nucleotide at position 8 of the probe described in this invention) in the selected target region.
  • Other non-O157: H7 strains of Escherichia coli are examples of this.
  • the PNA probe described in this invention has 14 nucleotides with the following nucleotide sequence:
  • the probe to be used for detection can be up to 86% identical to the aforementioned sequence.
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • Probe sequence selection was initially made by aligning rDNA sequences of the target microorganism with closely related microorganism sequences. This allowed us to identify potentially useful regions that will then be evaluated based on other parameters such as specificity, hybridization temperature, guanine / cytosine percentage, binding free energy and secondary structure.
  • the 3 steps of the FISH procedure, fixation / permeabilization, hybridization, and washing must be developed and optimized for the selected probe.
  • This process usually involves the following parameters: temperature, formamide and ethanol concentration, and hybridization and wash time. Note that due to the complexity of the process and the large number of variables, it is not always possible to develop a method for each sequence and as such, many alternatives and sequences are often tested.
  • the detected fluorescent signal is usually the result of specific binding of the small probes to the tens or hundreds of copies of rRNA in the bacterial cytoplasm.
  • This detectable fraction of the probe which reports the existence of a stable complex formed by the probe and target, is selected from one of the following groups: a conjugate, a branched detection system, a chromophore, a fluorophore, a radioisotope, an enzyme. a hapten or luminescent compound.
  • the method described in the present invention comprises contacting a sample with at least one PNA probe with sequence similar to that described above. Accordingly, the analysis is based on a single assay with a definitive opinion contrary to conventional E. coli O157 detection methods which are based on phenotypic characteristics and have given several days to provide the result.
  • kits suitable for carrying out the assay to detect, i.e. find, identify or quantify, E. coli O157 present in biological samples includes the PNA probe and other reagents or compounds selected for performing in situ hybridization assays.
  • a kit suitable for carrying out the assay to detect, identify or guarantee E. coli O157 also contains a fixation, hybridization and wash solution.
  • the method is intended to be an adjunctive diagnostic means for therapeutic decision making and quality control.
  • the implementation of this method in the identification of E. coli O157 will thus allow the clinical treatment to be adapted to the bacterium in question and to prematurely identify contamination foci.
  • PNA probes can be applied directly to the slide prepared sample, as the application of these probes does not involve the use of reagents or enzymes for cell membrane permeabilization prior to hybridization. However, it needs some of the most commonly used compounds in hybridizations. Thus, probes are usually included in cases that allow easier handling by users. If the desired approach involves PNA-FISH analysis by flow cytometry, the probe may be applied to the suspension sample using the same compounds for hybridization.
  • nucleotide includes natural and unnatural molecules commonly known to those using nucleic acid related technology to thereby generate polymers that specifically bind to nucleic acids.
  • nucleotide sequence When the term “nucleotide sequence” is used, it is the same as referring to a segment of a polymer that contains subunits, in this case nucleotides.
  • target sequence means an E. coli O157 nucleotide sequence that is intended to be detected in the assay, where the nucleotide portion of the probe is designed to hybridize.
  • PNA probe means a PNA subunit polymer that has a nucleotide sequence and is specific for hybridizing to a target sequence of the microorganism of interest.
  • PNA molecules are DNA mimics, in which the negatively charged sugar-phosphate structure is replaced by an electrically neutral, achiral, formed by repeated units of N - (2-aminoethyl) glycine.
  • detecttable fraction it refers to molecules that can be attached to the probe to thereby make the probe detectable by an instrument or method.
  • sample refers to any biological sample that may contain the target microorganism or sequence for detection. Samples may be clinical (eg blood, urine, faeces, etc.), food (meat, eggs, infant formula, milk, etc.) or environmental (eg water).
  • Figure 1 shows partial alignment of 23S rDNA sequences for probe selection.
  • the anti-parallel complementary sequence of the EcoPNA1169 probe is shown above the alignment and sequences completely complementary to the probe are highlighted.
  • 16S and 23S rDNA sequences were available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Web site (http: // www. Ncbi. Nlm..nih. Gov / BLAST /). This selection included 6 sequences from E. coli O157: H7, 6 non-O157: H7 E. coli strains and related species belonging to the Enterobacteriaceae family ( Figure 1). The sequences of interest were aligned using the ClustalW program available from the European Bioinformatics Institute (EBI, www.ebi.ac.uk/clustalw/). A conserved region on the 23S rRNA of all E.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • coli O157: H7 strains was identified ( Figure 1). Criteria for selection of the final probe sequence included: percent Guanine / Citusin; the type of secondary structures and the hybridization temperature. After evaluation of these parameters, the following sequence was chosen: 5'-CAA CAC ACA GTG TC-3 '. This hybrid sequence at positions 1169 to 1183 of strain TW14359 E. coli O157: H7 (accession number: CP__001368). The probe was called EcoPNA1169 due to the initial position of the sequence. Subsequently, the selected sequence was synthesized and the amine terminally coupled alligonucleotides coupled to the fluorochrome Alexa Fluor 594.
  • coli O157: H7 that did not react with the TnECs probe and the total number of non-E strains. coli O157: H7 examined. Sensitivity was calculated as ECs / TECs x 100, where ECs is the number of E. coli O157: H7 strains detected by the probe and TECs is the total number of E. coli O157: H7 strains in the database.
  • the EcoPNA1169 probe detects all 80 E. coli O157: H7 sequences, but also 11 other sequences, out of a total of 91 sequences detected (last accessed, July 2012). Thus, the theoretical sensitivity specificity values were 88 and 100%, respectively.
  • the 11 non-E. coli O157: H7 strains detected by the EcoPNA1169 probe included 3 non-O157 E. coli, 7 Salmonella spp. and 1 Cronobacter strain.
  • the PNA probe of this invention preferably contains 14 nucleotides and may be at least 86% identical to the sequence SEQ ID No. 1 - 5'-CAA CAC ACA GTG TC -3 ', preferably 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% similarity to the sequence SEQ ID No. 1 -5'- CAA CAC ACA GTG TC -3.
  • this invention also contemplates variations in probe nucleotide sequences. Such variations may include deletions, insertions, among others. As for example one of the following sequences:
  • the detectable fraction of the PNA probe may include different types of molecules, such as dextran conjugates, chromophores, fluorophores, radioisotopes, enzymes, hapten, chemiluminescent compound among others.
  • fluorophores from Alexa series, Alexa Fluor series, cyanines, 5- (and -6) Carboxi-2 ', 7' - dichlorofluorescein, 5- ROX (5-carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt).
  • the present invention provides a method for determining the presence of E. coli O157 using a nucleotide sequence with at least 86% homology to the 14 nucleotide region described herein - SEQ ID No. 1.
  • the method may contemplate contacting a sample with the PNA probe described herein with the bacterial target sequence under suitable hybridization conditions or suitable in situ hybridization conditions (as shown in EXAMPLE 1).
  • the method can be divided into: sample preparation (including enrichment step where necessary), fixation, hybridization, washing and visualization of results (see EXAMPLE D ⁇
  • the method may be performed on adhered or suspended cells.
  • the PNA FISH procedure involves 4 steps: fixation and permeabilization of the sample; probe hybridization; washing of the unbound probe and observation under the fluorescence microscope.
  • the following steps is a possible optimization of optimization conditions, without the intention of being limiting:
  • PNA probe hybridization and the target sequence There are several factors that influence PNA probe hybridization and the target sequence. These include percent formamide (or other denaturing chemical reagent), saline concentration and hence ionic strength, percent ethanol, hybridization and wash temperature, detergent concentration, pH and the like.
  • non-target sequences i.e. non-E. coli O157: H7 sequences
  • the hybridization and wash temperatures were varied between 53 and 61 ° C;
  • the ethanol concentration was varied between 50 and 80% and different hybridization times were also tested (30, 45, 60 and 90 minutes).
  • NT non-toxigeninc E. coli
  • EPEC enteropathogenic E. coli (epidemiologically implicated as pathogens, but virulence mechanism not related to excretion of enterotoxins); ND - Not determined; NR - non-relevant information for the present study; * - Isolates; SGSC - Salmonella Genetic Stock Center; ATCC - American Type Culture Collection; NCTC - National Collection of Type Cultures; CECT - Spanish Type Culture Collection.
  • the samples to be analyzed may come from food, biopsies, blood, water, feces, among others.
  • Samples containing E. coli O157: H7 generally have low levels of contamination. For this reason a sample enrichment step that facilitates the detection process.
  • This enrichment step can be done in various types of culture media, from complex rich media (such as peptone buffered water and soy broth trypticase) to selective media such as: GN (Gram Negative) broth, R & F® Enr : chmont Broth (R & F-EB) or E. coli (EC) broth (Vimont et al., 2006).
  • complex rich media such as peptone buffered water and soy broth trypticase
  • selective media such as: GN (Gram Negative) broth, R & F® Enr : chmont Broth (R & F-EB) or E. coli (EC) broth (Vimont et al., 2006).
  • Trypticase Soy Broth is the most frequently used enrichment medium.
  • Antibiotics such as novobiocin (most common), cefixime, cefsulodine or vancomycin, and other selective compounds (eg bile salts - inhibiting non-Enterobacteriaceae strains); They are often added to this medium to promote selective enrichment. These media are then incubated for a period ranging generally between 16 and 24 hours (overnight growth) at 35 to 42 ° C.
  • novobiocin most common
  • cefixime cefsulodine or vancomycin
  • other selective compounds eg bile salts - inhibiting non-Enterobacteriaceae strains
  • Incubation temperature does not appear to be related to the type of serotype sought (Vimont et al, 2006.), but some authors have shown that 0157: H7 strains generally have an average optimal temperature of about 40 ° C.
  • the recommended ISO for detection of 0157 in food samples includes a pre-enrichment in mTSB at 41,5 ° ⁇ .
  • the PNA FISH method described in this document has been tested on two different types of food samples: ground beef, unpasteurized milk (two matrices commonly associated with E. coli O157: H7 infections) artificially contaminated with concentrations ranging from 0, 01 to 100 CFU / g or 25 ml food sample.
  • Two strains of E. coli 0157: H7 were used (CCC-5-12 and CECT 4267) for inoculation and the samples were analyzed simultaneously by ISO 16654: 2001.
  • mTSB achieved the best detection limit, while the use of higher temperatures (41.5 ° C) did not appear to improve the detection rate of E. coli O157.
  • the good performance of mTSB may be related to the selective nature of this medium, which includes novobiocin and bile salts that partially inhibit the growth of microflora in foods.
  • this medium includes novobiocin and bile salts that partially inhibit the growth of microflora in foods.
  • the composition of the medium is the determining factor for growth of this bacterium. Growth rates of ⁇ 0.5 h-1 (at 41.5 ° C) and 0.4 h-1 were observed for strains grown in mTSB, while those grown in BPW showed values of 0.07 h- 1 for both temperatures.
  • the sensitivity and specificity values for both mTSB and BPW media at 37 ° C were determined based on the results shown in Table 3.
  • the specificity values obtained were both 100% (95% confidence interval [CI], 69, 87 - 100), while sensitive values were 94.44% (95% CI, 70.63 - 99.71) for mTSB and 55, 55% (95% CI, 31.35 - 77.59) for BPW.
  • the best performance was for mTSB + N, it should be possible to standardize the enrichment step to allow for the simultaneous detection of different food pathogens.
  • the implementation of the FISH PNA method can save at least 2 days in detecting E. coli O157: H7 compared to the traditional protocol.
  • This step can be performed on any epifluorescence microscope with a fluorophore sensitive filter in question.
  • the present invention further contemplates a kit for carrying out the assay that determines the presence of E. coli O157: H7.
  • the kit in this invention comprises a PNA probe similar to at least 86% to the sequence SEQ ID NO: 1 and other reagents or compositions that are selected for the assay.
  • PNA probes their characteristics, methods and kit of this invention are suitable for analysis of nucleic acids present or not internally in the organism of interest.
  • this invention may be used for both organism analysis or analysis of the extracted or derived nucleic acids of the organism of interest, so that the source of the target sequence is not a limitation in this invention.
  • EXAMPLE 1 E. coli serotype 0157: H7 detection in different sample types (clinical, food or environmental)
  • the sample was immersed in a solution of 4% (wt / vol) paraformaldehyde and 50% (vol / vol) ethanol for ten minutes each.
  • hybridization solution containing: 10% (wt / vol) dextran sulfate (Sigma); 10mM NaCl (Sigma); 30% (vol / vol) formamide (Sigma); 0.1% (wt / vol) sodium pyrophosphate (Sigma); 0.2% (weight / vol) polyvinylpyrrolidone (Sigma); 0.2% (wt / vol) Ficol (Sigma), 5 mM disodium EDTA (Sigma); 0.1% (vol / vol) Triton X-100 (Sigma); 50 mM Tris-HCl (pH 7.5; Sigma) and 200nM PNA probe.
  • the samples were covered with coverslips (to ensure uniform spreading of the probe), placed in small damp boxes (to prevent evaporation of the hybridization solution) protected from light and incubated for 45 minutes at 59 ° C. Washing:
  • the coverslips were removed and the slides immersed in a preheated wash solution at 59 ° C containing 5mM Tris Base, 15mM NaCl and 1% (vol / vol) Triton X (pH 10). The samples were then placed in the oven at hybridization temperature for 30 minutes. Subsequently, the slides were removed from the wash solution and dried at 57 ° C in the same incubator for approximately 5 minutes. Prior to microscope visualization, a drop of non-fluorescent immersion oil (Merck) and coverslip were placed. The slides were stored in the dark for a maximum of 24 hours before microscopy.
  • a drop of non-fluorescent immersion oil Merck
  • the results are obtained by observing the fluorescence microscope with a filter suitable for the detection of the Alexa Fluor 594 fluorochromo attached to the PNA probe.
  • EXAMPLE 2 Detection of Salmonella and E. coli O157: H7 in feces.
  • 25g of faeces were mixed with 225ml of mTSB. Different amounts of sample may be used, but maintaining a ratio of 1/10 (weight / vol).
  • the samples were then incubated overnight (18 to 22h) at 37 ° C and 120 rpm. After enrichment, 15 ⁇ l of sample was placed on a suitable slide and mixed with 15 ⁇ l of 1% Triton X-100 to minimize the intrefrence of autofluorescent particles. Finally the sample was air dried or oven dried at 59 ° C for about 5 minutes.
  • Hybridization was performed as described previously in Example 1 with a slight difference.
  • the hybridization solution contained two probes: PNA probe to detect Salmonella and PNA probe to detect E. coli O157: H7, each at a concentration of 200nM.
  • Results were obtained by observing with the filter fluorescence microscope suitable for detection of Alexa Fluor 594 and 488 fluorochromes attached to the PNA probes.
  • Gyles CL Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J Anim Sci 2007, 85 (13 Suppl): E45-62.

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Abstract

A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de uma sonda de ácido péptido nucleico (PNA) para a deteção de Escherichia coli serotipo O157: H7 em diferentes tipos de amostras. PNA é uma molécula sintética análoga ô molécula de DNA que, devido ôs suas propriedades físico-químicas, permite uma análise mais rápida e mais sensível do que as sondas de ADN. Estas sondas são combinadas com hibridação in situ fluorescente (FISH), uma técnica de biologia molecular, que permite a visualização direta do microrganismo na amostra. A combinação destas duas tecnologias permitiu o desenvolvimento de um procedimento de FISH mais rápido, mais simples e mais eficiente. Este teste pode ser aplicado a uma grande variedade de amostras, tais como alimentos, sangue, biopsias, fezes, água e outras amostras clínicas, ambientais ou da indústria agrícola e alimentar. A presente invenção também inclui o desenvolvimento do kit de deteção e respetivo processo para a identificação de E. coli O157: H7 utilizando os tipos de amostras acima mencionadas.

Description

DESCRIÇÃO
SONDA DE ACIDO PEPTIDO NUCLEICO, ESTOJO E MÉTODO PARA DETECTAR E / OU QUANTIFICAR ESCHERICHIA COLI O157:H7 E
RESPECTIVAS APLICAÇÕES
Campo da invenção :
Esta invenção diz respeito a um processo para a deteção de microrganismos relevantes quer na área clinica quer para a segurança alimentar. Para esse efeito, uma sonda de PNA para a deteção de estirpes de Escherichia coli O157 :H7, foi desenvolvida .
Para além da sonda, a presente invenção inclui o procedimento de PNA FISH e sua aplicação a um kit para a detecção e/ou quantificação de Escherichia coli O157: H7, que pode ser usado quer na área clinica quer na área alimentar.
Antecedentes da invenção :
A espécie Escherichia coli inclui um grupo heterogéneo de bactérias que fazem parte da microflora normal do trato intestinal de seres humanos e animais (Gyles, 2007) . Estas bactérias são tipicamente inócuas, mas um número considerável de estirpes são patogénicas. As estirpes patogénicas de E. coli são classificadas de acordo com os seus fatores de virulência, a sua patogenicidade e o seu serotipo. Existem seis classes de E. coli patogénicas, E. coli enterotoxigénica (ETEC) , E. coli enteropatogénica (EPEC) , E. coli enteroagregativa (EAEC) , E. coli enteroinvasiva (EIEC) , E. coli aderente difusa (DAEC) e a E. coli enterohemorrágica (EHEC) (Sheibani, 2007). Entre as E. coli patogénicas, as estipes de EHEC são, talvez, a mais importantes devido à sua elevada virulência e sua associação com complicações potencialmente fatais (Sheibani, 2007). Dentro do grupo de EHEC, a E. coli serotipo O157: H7 (serótipo baseia-se no O [Ohne] antigénio - determinado pelo lipopolissacárido da parede celular - e o H [Haunch] antigénio devido à proteína flagelar) é a mais comummente isolada (Gyles, 2007).
A dose infecciosa de E. coli O157: H7 está descrita como sendo muito baixa - cerca de 1-100 CFU / mL - mais baixa do que a maioria dos agentes patogénicos entéricos (Robinson e McKillip, 2010) . A virulência deste microrganismo deve-se maioritariamente a três fatores. O primeiro, e o mais importante, é a produção de toxinas do tipo Shiga (Stxs), chamadas Stxl e- Stx2. Estas toxinas estão atualmente entre as citotoxinas mais potentes capazes de afetarem células eucarióticas (Robinson e McKillip, 2010) . Embora o tipo de Stx produzida influencie diretamente a gravidade da doença, a produção de Stxs por si só é insuficiente para a E. coli O157 :H7 se tornar patogénica. O apoio do locus enterocyte effacement (uma ilha de patogenicidade que codifica uma bateria de fatores de virulência especializados) e a presença do plasmídeo pO157 (codifica um sistema de secreção de tipo II, uma enterohemolisina, um inibidor de linfócitos e potenciais adesinas, entre outros) são também necessários ( Robinson e McKillip, 2010) .
Os sintomas da infeção por EHEC são muito diversos, podendo a infeção originar desde casos assintomáticos até casos letais. Os sintomas da doença geralmente desaparecem uma semana depois. Em casos graves os pacientes podem desenvolver o síndrome hemolítico-urêmico (HUS) , Púrpura Trombocitopenica Trombótica (TTP) , ou até mesmo morrer (Robinson e McKillip, 2010). O HUS atinge as células endoteliais renais ' e pode levar à insuficiência renal aguda (Robinson e McKillip, 2010) . O HUS tem taxa de mortalidade significativamente mais elevada e, no caso de sobrevivência, os pacientes geralmente ficam com sequelas renais permanentes. Para além dos sintomas típicos de HUS, a TTP está associada a sintomas neurológicos como dores de cabeça, convulsões, letargia e encefalopatia (Robinson e McKillip, 2010). Para os surtos de E. coli O157:H7 detetados nos EUA, 25% das pessoas afetadas foram hospitalizados, 5-10% desenvolveram SHU ou TTP e 1% morreram (Pennington, 2010) .
Em relação aos reservatórios ambientais, geralmente o gado bovino serve de reservatório primário e natural de E. coli O157 :H7 e estima-se que 10 - 80% de todos os animais são colonizados por esta bactéria (Yoon e Hovde, 2008). Outros animais, como cabras, ovelhas e porcos podem também ser portadores. Resultados de um estudo que inclui 90 surtos confirmados microbiologicamente (ocorridos entre 1982 e 2006) , mostram que as fontes de transmissão para os seres humanos foram alimentos em 42,2% dos casos; produtos lácteos em 12,2%; contato com animais em 7,8%; água em 6,7%, ambiente em 2,2% e desconhecidas em 28,9% dos surtos (Pennington, 2010).
Antes dos produtos alimentares serem libertados para o consumidor, estes devem passar por um controlo de qualidade que permite avaliar a existência de contaminações. A importância do controle de qualidade, leva à necessidade de implementar métodos de deteção rápidos, sensíveis e fiáveis, bem como versáteis, de forma a adaptar-se facilmente às necessidades das diferentes linhas de produção e de processamento de alimentos. Estes métodos podem reduzir substancialmente o tempo, o trabalho e custo global do processo de deteção.
O teste para a fermentação de sorbitol tem sido sugerido como método mais simples de deteção de E. coli O157: H7, pois esta bactéria não possui a enzima β-glucorunidase . A maioria dos métodos de cultura existentes foram desenvolvidos com base nesta característica. No entanto outras propriedades desta bactéria, tais como a incapacidade de fermentar rhamanose e tolerância ao telurito, têm sido também exploradas (Raji et al., 2003). Estas técnicas de cultura continuam a ser um aspeto integral de controlo de qualidade durante o processamento de alimentos por serem relativamente baratos, tecnicamente simples e apresentarem elevada especificidade e sensibilidade. No entanto, estes métodos são também muito demorados, laboriosos e incapazes de detetar estirpes de E. coli O157: H7, que fermentam o sorbitol e são suscetiveis ao telurito (Raji et al, 2003.). Falham também na deteção de patógenos em números mais baixos (<200 amostra CFU / g) . Adicionalmente, os métodos de cultura, tais como a norma ISO 16654, incluem geralmente um ensaio de aglutinação (detecção de antigeno O157 ou H7) pouco especifico, uma vez que os antigénios O157 e H7 estão presentes em outras espécies de Escherichia coli. Estes anticorpos também podem reagir de forma cruzada com outros serotipos de E. coli, outras Escherichias e de outros membros da família Enterobacteriaceae (Raji et al., 2003) .
FISH é um método molecular amplamente aplicado para a identificação de microrganismos. Este método baseia-se na ligação específica de oligonucleótidos pequenos (sondas) em regiões específicas do RNA ribossomal (rRNA) , devido à sua distribuição celular elevada abundância, universal e utilização como um marcador filogenético. A sonda está ligada a um fluorocromo e, após uma etapa de hibridizaçâo, a fluorescência pode ser detetada devido ao número elevado de cópias de rRNA dentro da célula. Mais recentemente, as sondas de ácido péptido nucleico (PNA) têm sido aplicadas na deteção microbiana (Cerqueira et al., 2008) . Estas moléculas que mimetizam o DNA são capazes de hibridar especificamente com ácidos nucleicos complementares obedecendo às regras de Watson-Crick . A ligação destas moléculas à sequencia alvo é mais forte uma vez que o PNA tem uma unidade repetida neutra de N- (2-aminoethil) glicina em vez da carga negativa do grupo açúcar-fosfato . O uso adequado dessa molécula na tecnologia de FISH tornou o procedimento mais robusto, mais rápido e mais eficiente, e permitiu o desenvolvimento de vários métodos de PNA FISH para a deteção de organismo patogenico (Cerqueira et al., 2008). Neste documento apresenta-se o desenvolvimento de um novo método de PNA FISH para a deteção específica de E. coli O157 em alimentos e amostras clínicas. Este é o primeiro método de PNA FISH desenvolvido para detetar um sorotipo específico.
Sumário da Invenção
O presente invento refere-se a uma sonda de ácido péptido nucleico (PNA) e método associado, para detetar o serótipo O157 da espécie E. coli (isto é identificar ou quantificar) .
A sonda descrita na presente invenção reconhece o 23S rRNA do microrganismo em questão ou as sequências genómicas correspondentes ao rRNA mencionado. As sondas de PNA têm características físico-químicas inerentes à sua estrutura que, quando aplicadas a um método baseado na tecnologia FISH, permitem uma análise mais rápida, robusta e específica do que usando uma sonda de DNA.
Uma das vantagens deste método é o facto de a sonda funcionar de forma robusta numa grande variedade de amostras biológicas, o que geralmente não acontece para os outros métodos moleculares de deteção.
Outro aspeto relevante é o tempo necessário à deteção. 0 método desenvolvido consegue igualar os melhores tempos descritos para os restantes métodos moleculares, mesmo quando o tipo de amostra exige um passo de enriquecimento anterior à análise. A rapidez, aliada à fiabilidade do método, poderá determinar o tratamento atempado e adequado da contaminação e/ou infeção quer numa perspetiva clínica quer de segurança alimentar.
Outro dos aspetos da presente invenção relaciona-se com o desenvolvimento de um estojo, baseado na aplicação desta sonda à técnica de hibridação fluorescente in situ (FISH), que permite a deteção da E. coli O157 num variado conjunto de amostras biológicas, de uma forma simples e rápida. A sonda de PNA, que permite detetar a presença de E. coli O157, poderá numa realização preferencial, detetar a sequência alvo no rRNA, no rDNA ou nas sequências complementares do rRNA de E. coli O157.
Um das realizações da presente invenção é a descrição de uma sonda de PNA de deteção e/ou quantificação de E. coli O157 caracterizada por ter pelo menos 86% de semelhança com à sequência SEG ID No. 1 -5'- CAA CAC ACA GTG TC -3, de preferência 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de semelhança com à sequência SEG ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3.
Numa realização ainda mais preferencial, as sequências anteriormente descritas encontra-se ligada a pelo menos um tipo de fração detetável. Sendo que, o tipo de fração detetável a utilizar poderá ser selecionado a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente, entre outros.
Numa realização ainda mais preferencial o grupo fluoróforo poderá ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2' , 7' -diclorofluoresceina, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio) , entre outros.
É ainda objeto da presente invenção um estojo de deteção da presença ou ausência e/ou quantificação E. coli O157 em amostras biológicas .
Sendo que numa realização mais preferencial o estojo poderá ainda apresentar pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.
Ora numa realização ainda mais preferencial a solução de fixação poderá compreender paraformaldeido e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformaldeido e 25-90% (vol/vol) de etanol e/ou a solução de hibridação poderá compreender formamida.
É também objeto da presente invenção a descrição de um método de deteção de E. coli O157 ou de deteção da E. coli O157 em amostras biológicas, que utiliza a sonda de PNA anteriormente mencionada e que compreende os seguintes passos:
• contacto da sonda de PNA com amostras biológicas;
• hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas amostras biológicas;
• detecção da hibridação como indicativo da referida deteção e quantificação nas amostras biológicas, a hibridação poderá ser feita de preferência por fluorescência .
Ora, as referidas amostras biológicas podem ser proveniente de sangue, ar, alimentos, água, biópsias ou fezes, entre outras.
É ainda objeto da presente invenção a utilização das sondas de PNA anteriormente descritas, a utilização dos estojos anteriormente descritos e da metodologia para serem aplicadas numa metodologia de deteção de E. coli O157, ou de deteção de E. coli O157 a em amostras biológicas.
Descrição geral da invenção
A presente invenção engloba a sonda de PNA/ reagentes, métodos e estojo destinados à deteção ou quantificação de estirpes de E. coli O157.
A sonda aqui descrita permite a deteção especifica dé E. coli O157 através da ligação ao rRNA, sequências genómicas correspondentes ao rRNA (r) , ou ainda sequências complementares às mesmas. A maior especificidade das sondas de PNA (relativamente às sondas de DNA) permite uma melhor discriminação de sequências de nucleótidos relacionadas. Isto tem particular importância para esta sonda uma vez que existem alguns microrganismos filogeneticamente relacionados com E. coli O157 que apresentam apenas um nucleótido de diferença (nucleótido na posição 8 da sonda descrita nesta invenção) na região alvo selecciona. São exemplos desta situação outras estirpes de Escherichia coli não- O157:H7.
A sonda de PNA descrita nesta invenção tem 14 nucleótidos com a seguinte sequência nucleotidica :
SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3'.
No entanto, a sonda a usar na deteção por ser até 86% idêntica à sequência acima mencionada.
Esta sonda é aplicada à análise por hibridação in situ fluorescente (FISH) , que, no caso de amostras positivas para E. coli O157, resulta na emissão de um sinal fluorescente detectável quer através de microscopia de fluorescência quer através de citometria de fluxo.
O desenvolvimento da nova sonda de PNA-FISH foi realizado de forma empírica com recurso a softwares específicos. A seleção da sequência da sonda foi feita inicialmente através do alinhamento de sequências de rDNA do microrganismo alvo, com sequências de microrganismos muito relacionados. Isto permitiu identificar as regiões potencialmente úteis que depois serão avaliadas com base em outros parâmetros como: especificidade, temperatura de hibridação, percentagem de guanina/citosina, energia livre de ligação e estrutura secundária.
Após o desenho e síntese da sonda, as 3 etapas do procedimento de FISH, fixação/permeabilização, hibridação e lavagem, têm que ser desenvolvidos e otimizados para a sonda selecionada. Este processo geralmente envolve os seguintes parâmetros: temperatura, concentração de formamida e etanol, e tempo de hibridação e lavagem. De referir gue, devido à complexidade do processo e ao grande número de variáveis existentes, nem sempre é possível desenvolver um método para cada seguência e como tal, muitas vezes várias alternativas e seguências são testadas.
Uma hibridação bem sucedida permite depois aferir da presença/ausência e mesmo concentração de um microrganismo, por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou PCR em tempo real. O sinal fluorescente detetado é geralmente o resultado da ligação específica das pequenas sondas às dezenas ou centenas de cópias de rRNA existentes no citoplasma da bactéria. Essa fração detetável da sonda, gue reporta a existência de um complexo estável formado pela sonda e o alvo, é selecionada a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente .
O método descrito na presente invenção compreende o contacto de uma amostra com pelo menos uma sonda de PNA com sequência semelhante à anteriormente descrita. Conseguentemente, a análise é baseada num único ensaio com um parecer definitivo contrariamente aos métodos convencionais de deteção de E. coli O157 gue se baseiam em características fenotípicas e reguerem vários dias a fornecer o resultado.
É ainda objeto da presente invenção um estojo adequado à execução do ensaio para detetar, isto é encontrar, identificar ou quantificar, E. coli O157 presente em amostras biológicas. 0 estojo da invenção inclui a sonda de PNA e outros reagentes ou compostos selecionados para a realização dos ensaios de hibridação in situ.
Numa realização ainda mais preferencial, o de um estojo adequado à execução do ensaio para detetar, identificar ou guantificar E. coli O157 contém ainda uma solução de fixação, hibridação e lavagem.
Preferivelmente, o método pretende ser um meio de diagnóstico coadjuvante para a decisão terapêutica e controlo de qualidade. A implementação deste método na identificação de E. coli O157 permitirá deste modo, adequar o tratamento clinico à bactéria em causa e identificar prematuramente focos de contaminação.
As sondas de PNA podem ser aplicadas diretamente na amostra preparada em lâmina, já que a aplicação destas sondas não envolve o uso de reagentes ou enzimas para a permeabilização das membranas celulares antes da hibridação. No entanto, necessita de alguns dos compostos mais utilizados nas hibridações. Assim, as sondas são normalmente incluídas em estojos que permitam um mais fácil manuseamento por parte dos utilizadores. Se a abordagem pretendida envolver a análise do PNA-FISH por citometria de fluxo, a sonda poderá ser aplicada na amostra em suspensão, utilizando os mesmos compostos para a hibridação.
Descrição detalhada da invenção I - Definições a) Como usado neste documento, termo "nucleótido" inclui moléculas naturais e não naturais normalmente conhecidas por quem utiliza tecnologia relacionada com ácidos nucleicos, para desse modo gerar polímeros que se ligam especificamente a ácidos nucleicos . b) Quando usado o termo "sequência de nucleótidos", é o mesmo que referir um segmento de um polímero que contém subunidades, neste caso os nucleótidos. c) O termo "sequência alvo" significa uma sequência de nucleótidos de E. coli O157 que se pretende que seja detetada no ensaio, onde a porção de nucleótidos da sonda é desenhada para hibridar . d) O termo "sonda de PNA" significa um polímero de subunidades de PNA que apresenta uma sequência de nucleótidos e é específica para hibridar com uma sequência alvo do microrganismo de interesse. As moléculas de PNA são mímicas das de DNA, na qual a estrutura carregada negativamente de açúcar-fosfato é substituída por uma aquiral e eletricamente neutra formada por unidades repetidas de N - (2-aminoetil) glicina. e) Quando é usado o termo "fração detetável", este refere-se a moléculas que podem ser ligadas à sonda, para, assim, tornar a sonda detetável por um instrumento ou método. f) O termo "amostra" refere-se a qualquer amostra biológica que pode conter o microrganismo ou sequência alvo para a deteção. As amostras poderão ser clínicas (por exemplo: sangue, urina, fezes, etc.) , alimentares (carne, ovos, formulas infantis, leite, etc.) ou ambientais (por exemplo: água).
II - Breve Descrição das figuras
A figura 1 apresenta o alinhamento parcial das sequências de rDNA 23S para seleçâo da sonda. A sequência complementar anti- paralela da sonda EcoPNA1169 é apresentada por cima do alinhamento e sequencias completamente complementares à sonda encontram-se salientadas. III - Descrição
Concepção da sonda de PNA:
Para identificar oligonucleótidos potencialmente úteis para usar como sonda, foram escolhidas 16S and 23S rDNA sequências disponíveis no sítio do National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (http : / /www . ncbi . nlm..nih . gov/BLAST/ ) . Esta seleção contemplou 6 sequências de E. coli O157 :H7, 6 E. coli não-O157:H7 e estirpes de espécies relacinadas pertencentes à família Enterobacteriaceae (Figura 1). As sequências de interesse foram alinhadas usando o programa ClustalW disponível no European Bioinformatics Institute (EBI, www.ebi.ac.uk/clustalw/). Foi identificada uma região conservada no rRNA 23S de todas as estirpes de E. coli O157:H7 (Figura 1). Os critérios para seleção da sequência final da sonda incluíram: a percentagem de Guanina/Citusina; o tipo de estruturas secundárias e a temperatura de hibridação. Após a avaliação destes parâmetros, foi escolhida a seguinte sequencia: 5'-CAA CAC ACA GTG TC-3' . Esta sequencia híbrida nas posições 1169 a 1183 da estirpe TW14359 E. coli O157 :H7 (número de acesso: CP__001368). A sonda foi chamada de EcoPNA1169 devido à posição inicial da sequência. Posteriormente, a sequência selecionada foi sintetizada e os aligonucleótidos acoplados, no terminal amina, ao fluorocromo Alexa Fluor 594.
Avaliação teórica do desempenho da sonda de PNA:
Após a concepção da sonda, o seu desempenho foi avaliado através da determinação dos valores teóricos da sensibilidade e da especificidade. Estes parâmetros foram avaliados com recursos ao programa acima mencionado, ProbeCheck disponíveis na base de dados SILVA . de rRNA. Para esta estimativa teórica apenas sequências de boa qualidade com pelo menos 1900 pb foram consideradas, assim como estirpes de E. coli com serótipo atribuído. A sonda foi alinhado com um total de 180.344 sequências presentes na base de dados para a subunidade grande do RNA (23S/28S, LSU) . Também foi testado contra a base de dados para a subunidade pequena (16S/18S, SSU) para avaliar a existência de uma possível hibridação com as sequências de 16S rRNA. A especificidade foi calculada como nECs/TnECs x 100, onde nECs representa o número de estirpes não-E. coli O157 :H7 que não reagiu com a sonda e TnECs o número total de estirpes não-E. coli O157 :H7 examinadas. A sensibilidade foi calculada como ECs/TECs x 100, onde o ECs é o número de estirpes de E. coli O157 :H7 detectados pela sonda e TECs é o número total de estirpes de E. coli O157 :H7 existentes na base de dados.
Através do programa probeCheck, foi possível verificar que a sonda EcoPNA1169 detectas todas as 80 sequências de E. coli O157 :H7, mas também 11 outras sequencias, num total de 91 sequencias detetadas (ultimo acesso, Julho de 2012). Assim, os valores teóricos de especificidade de sensibilidade foram de 88 e 100%, respetivamente . As 11 estirpes não E. coli O157 :H7 detetadas pela sonda EcoPNA1169, incluíram 3 E. coli não-O157, 7 Salmonella spp. e 1 estirpe de Cronobacter.
A sonda de PNA desta invenção contém preferencialmente 14 nucleótidos e poderá ser pelo menos 86% idêntica à sequência SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3', de preferência 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de semelhança com à sequência SEQ ID No. 1 -5'- CAA CAC ACA GTG TC -3.
Alternativamente, esta invenção contempla também variações nas sequências nucleotídicas das sondas. Tais variações podem incluir deleções, inserções entre outras. Como por exemplo uma das seguintes sequências:
• SEQ ID No. 2 - 5'- AAC AAC ACA CAG TG -3';
• SEQ ID No. 3 - 5'- AAC ACA CAG TGT CG -3';
• SEQ ID No. 4 - 5'- AAC AAC ACA CAG TGT C -3';
• SEQ ID No. 5 - 5'- CAA CAC ATA GTG TC -3'. Fração detetável da sonda de PNA:
Não limitado aos seguintes exemplos, a fração detetável da sonda de PNA pode incluir diferentes tipos de moléculas, como conjugados de dextrano, cromóforos, fluoróforos, radioisótopos, enzimas, hapteno, composto quimioluminescente entre outros.
Como exemplo, entre a classe dos fluoróforos são preferíveis para utilização (mas não limitados a) : fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2 ' , 7 ' - diclorofluoresceína, o 5-ROX ( 5-carboxi-X-rodamina , sal trietilamónio) .
Método :
A presente invenção apresenta um método para a determinação da presença de E. coli O157 usando uma sequência de nucleótidos com pelo menos 86% de homologia com a região de 14 nucleótidos aqui descrita - SEQ ID No. 1.
O método pode contemplar o contacto de uma amostra com a sonda de PNA descrita neste documento com a sequência alvo da bactéria sob condições de hibridação adequadas ou condições de hibridação in situ adequadas (como apresentado no EXEMPLO 1) .
O método pode ser dividido em: preparação das amostras (que contempla o passo enriquecimento, quando necessário) , fixação, hibridação, lavagem e visualização dos resultados (ver EXEMPLO D ·
O método pode ser realizado em células aderidas ou em suspensão.
Optimização do protocolo:
O procedimento de PNA FISH envolve 4 etapas: fixação e permeabilização da amostra; hibridação da sonda; lavagem da sonda não-ligada e observação ao microscópio de fluorescência. Os seguintes passos é uma optimização possível das condições de optimização, sem ter a intenção de ser limitativo:
Existem vários fatores que influenciam a hibridação da sonda de PNA e a sequência alvo. Estes incluem a percentagem de formamida (ou outro reagente químico desnaturante) , a concentração salina e consequentemente a força iónica, a percentagem de etanol, a temperatura de hibridação e lavagem, a concentração de detergente, o pH entre outros.
Para identificar as condições óptimas de hibridação, pode ser necessário fixar os diferentes fatores e variar cada fator isoladamente até se encontrar um grau de discriminação desejado.
Quanto mais próxima se encontra uma sequência alvo de outra não- alvo na amostra, maior terá que ser o grau de rigor na definição dos diferentes fatores que influenciam a hibridação. Nesta invenção sequências não-alvo (isto é, sequencias não- E. coli O157 :H7), podem ter apenas um nucleótido de diferença em relação às sequências alvo, sendo necessário um elevado nível de descriminação de forma a evitar hibridações não específicas.
Para melhor compreender o comportamento da sonda EcoPNA1169 e assim determinar as melhores condições de hibridação, as temperaturas de hibridação e lavagem foram variadas entre 53 e 61°C; a concentração de etanol foi variada entre 50 e 80% e diferentes tempos de hibridação foram também testados (30, 45, 60 e 90 minutos ) .
Após a optimização de todos os parâmetros referidos anteriormente, a sondas descrita neste documento apresentou os melhores resultados nas seguintes condições:
Foram preparados esfregaços de cada cultura bacteriana (cerca de 20 μL) em lâminas adequadas à visualização em microscópio de fluorescência. Os esfregaços foram imersos em 4% (peso/vol) paraformaldeído (Sigma) durante 10 minutos, seguido por 50% (vol /vol) etanol, também durante 10 minutos. Depois de secas ao ar, as amostras foram então cobertas com 20 μl de solução de hibridação contendo: 10% (peso/vol)de sulfato dextran (Sigma); 10 mM de NaCl (Sigma); 30% (vol/vol) de formamida (Sigma); 0,1% (peso/vol) pirofosfato de sódio (Sigma); 0,2% (peso/vol) polivinilpirrolidona (Sigma); 0,2% (peso/vol) Ficol (Sigma), 5 mM de EDTA dissódico (Sigma); 0,1% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma); 50 mM Tris-HCl (pH 7,5; Sigma) e 200nM de sonda PNA. As amostras foram cobertas com lamelas, colocados em pequenas caixas húmida protegidas da luz e incubadas por 45 minutos a 59°C. Posteriormente, as lamelas foram retiradas e as lâminas foram submersas numa solução de lavagem previamente aquecida (59°C) durante 30 minutos, contendo 5 mM Tris Base (Sigma) , 15 mM de NaCl (Sigma) e 1% (vol/vol) de Triton X (pH 10; Sigma) . Posteriormente, as lâminas foram removidas da solução de lavagem e secas a 59°C na mesma incubadora durante aproximadamente 5 minutos. Antes da visualização ao microscópio, foi colocada uma gota de óleo de imersão não-fluorescente (Merck) e lamela. As lâminas foram armazenadas no escuro por um periodo máximo de 24 horas antes da microscopia.
Avaliação da especificidade e sensibilidade experimentais da sonda :
Para testar a especificidade e sensibilidade experimentais da sonda de PNA, o protocolo acima descrito foi aplicado a 53 estirpes. Foram incluídas 18 estirpes E. coli 0157 :H7 e 25 estirpes não-E. coli O157 :H7. As duas estirpes de E. coli O157 (CCC-18-12 e CCC-26-12) com "H" antígeno não caracterizado, foram excluídas dos cálculos ._Adicionalmente, foram incluídas 8 estirpes pertencentes ao mesmo género e família (Escherichia , Salmonella , Enterobacter, Shigella and Klebsiella) . Os resultados mostram que a hibridação ocorre apenas com estirpes de E. coli O157 :H7 e, portanto, os valores de especificidade e sensibilidade obtidos foram ambos de 100%.
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NT - non-toxigeninc E. coli; EPEC - enteropathogenic E. coli (epidemiologically implicated as pathogens, but virulence mechanism is not related to the excretion of enterotoxins) ; ND - Not determined; NR - non-relevant information for the present study; * - Isolates; SGSC - Salmonella Genetic Stock Centre; ATCC - American Type Culture Collection; NCTC - National Collection of Type Cultures; CECT - Spanish Type Culture Collection .
Enriquecimento :
As amostras a analisar podem ser provenientes de alimentos, biópsias, sangue, água, fezes entre outros.
As amostras contendo E. coli O157 :H7 apresentam geralmente baixos niveis de contaminação. Por este motivo é recomendado um passo de enriquecimento da amostra que facilita o processo de detecção. Este passo de enriquecimento pode ser feito em vários tipos de meio de cultura, desde meios ricos complexos (tais como a água tamponada peptonada e o trypticase soy broth) até meios selectivos tais como: GN (Gram Negative) broth, R & F® Enr: chmont Broth (R&F-EB) ou E. coli (EC) broth (Vimont et al . , 2006) .
Trypticase Soy Broth (TSB) é o meio de enriquecimento mais frequentemente utilizado. Antibióticos tais como a novobiocina (o mais comum) , cefixima, cefsulodina ou a vancomicina, e outros compostos selectivos (ex. sais biliares - inibir as estirpes não-Enterobacteriaceae) ; são frequentemente adicionados a este meio para promover um enriquecimento selectivo. Estes meios são, em seguida, incubados durante um período que varia geralmente entre 16 e 24 horas (overnight growth) a 35 até 42 ° C. No entanto, os dados relativos à eficácia dos protocolos de enriquecimento são muito poucos e diferem de estudo para estudo.
A temperatura de incubação, não parece estar relacionada com o tipo de serotipo procurado (Vimont et al, 2006.), mas alguns autores demonstraram que as estirpes de 0157 :H7 apresentam geralmente uma temperatura óptima média de cerca de 40 ° C. Na verdade, a ISO recomendada para a deteção de 0157 em amostras alimentares (ISO 16654:2001 - Microbiology de alimentos para consumo humano e animal - Método horizontal para a detecção de Escherichia coli O157) inclui um pré-enriquecimento no meio mTSB a 41,5 ° C.
Para avaliar a influência do meio de enriquecimento e da temperatura de incubação no limite de deteção do método de PNA FISH, foram usamos dois meios diferentes a 37 e 41,5 ° C. Foi selecionados o meio seletivo mTSB com novobiocina (MTSB + N) , que é atualmente recomendado pela International Organization for Standardization (ISO 16654:2001) e o BPW (buffered peptonated water) , um meio não seletivo amplamente utilizados nos protocolos de enriquecimento de vários agentes patogénicos, que também tem sido aplicada na deteção de E. coli O157 :H7.
0 método de PNA FISH descrito neste documento foi testado em dois tipos diferentes de amostras de alimentos: carne moída, leite não pasteurizado (duas matrizes comumente associado a infeções por E. coli O157 :H7) artificialmente contaminados com concentrações de que variam de 0,01 a 100 CFU / g ou 25 ml de amostra de alimento. Duas estirpes de E. coli 0157 :H7 foram utilizados (CCC-5-12 e CECT 4267) para inoculação e as amostras foram analisadas simultaneamente pela ISO 16654:2001. Como se observa no quadro 2, o mTSB permitiu obter o melhor limite de deteção, enquanto o uso de temperaturas mais elevadas (41,5 ° C) não pareceu melhorar a taxa de deteção da E. coli O157. O bom desempenho do mTSB pode estar relacionado com a natureza seletiva deste meio, que inclui novobiocina e sais biliares que inibem parcialmente o crescimento da microflora existente nos alimentos. No entanto, após a determinação da taxa de crescimento de ambas as estirpes de E. coli em BPW e mTSB, foi possível observar que a composição do meio (e não os fatores seletivos) é o factor determinante para o crescimento desta bactéria. Foram observadas taxas de crescimento de ~ 0,5 h-1 (a 41,5 °C) e de 0,4 h-1 para as estirpes cultivadas em mTSB, enquanto que as cultivadas em BPW apresentaram valores de 0,07 h-1 para ambas as temperaturas. Para melhor quantificar o desempenho de cada um dos métodos de enriquecimento, os valores de sensibilidade e de especificidade para ambos os meios, mTSB e BPW a 37 ° C, foram determinadas com base nos resultados presentes na Tabela 3. Os valores de especificidade obtidos foram ambos de 100% (intervalo de confiança [IC] de 95%, 69, 87 - 100), enquanto os valores sensíveis foram de 94,44% (IC 95%, 70,63 - 99,71) para mTSB e 55, 55% (IC 95%, 31,35 - 77,59) para BPW. Embora o melhor desempenho se tenha verificado para mTSB + N, deverá ser possível padronizar a etapa de enriquecimento de forma a permitir a deteção simultânea de diferentes patogénicos alimentares . Outra característica importante a ter em conta ao otimizar protocolos de FISH é que alguns componentes alimentares podem apresentar um forte sinal de autofluorescência, e assim interferir com a deteção da bactéria. Para eliminar/reduzir este fenómeno, podem ser adicionado uma etapa adicional antes doprocesso de hibridação Foram testadas duas abordagens diferentes: um paço de centrifugação (para remover partículas de alimentos) e o uso de um detergente (Triton X-100, 1%) para emulsionar os compostos lipídicos. Ambos os paços diminuíram o sinal de autofluorescência, mas o detergente apresentou uma redução mais significativa e também pareceu melhorar o sinal de fluorescência. Isto pode acontecer porque o detergente poderá também ajudar na permeabilização celular.
Em relação ao tempo de deteção do ensaio, a implementação do método de FISH PNA pode poupar pelo menos 2 dias na deteção de E. coli O157: H7 relativamente ao protocolo tradicional.
Em conclusão, observou-se que o método de PNA FISH aqui descrito apresenta um limite de deteção de 1 CFU por 25 g de alimento, depois de uma etapa de enriquecimento overnight em mTSB. A comparação com o método de cultura tradicional evidenciou um valor de especificidade de 100% e sensibilidade de 94%. Finalmente observou-se também que o uso de compostos seletivos e temperatura mais elevada representa apenas uma melhoria limitada no limite de deteção do método.
Tabela 2 - Resultados de PNA FISH obtidos na deteção de E. coli O157 :H7 em diferentes matrizes alimentares inoculadas com concentrações bacterianas entre 0,01 e 100 CFU por 25g ou ml de alimento. Os resultados apresentados incluem 3 ensaios independentes .
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a - Samples that tested positive by PNA FISH/Total positive samples determined by culture method; b - samples that tested negative by PNA FISH/Total negative samples determined by culture .
Tabela 3 - Comparação entre os resultados de cultura (ISO 16654:2001, considerada o gold standard) e os resultados de PNA FISH relativamente à deteção de E. coli O157 :H7 em 30 amostras de carne picada após uma pré-enriquecimento em mTSB e BPW a 37°C.
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Visualização dos resultados :
Esta etapa pode ser realizada em qualquer microscópio de epifluorescência com um filtro sensível ao fluoróforo em questão. Outros filtros presentes no microscópio, que não são capazes de deteta o sinal fluorescente da sonda, foram utilizados a fim de confirmar a inexistência de autofluorescência .
Estojo :
A presente invenção contempla ainda um estojo que permite a realização do ensaio que determina a presença de E. coli O157 :H7.
O estojo nesta invenção compreende uma sonda PNA semelhante pelo menos 86% à sequência SEQ ID No 1 e outros reagentes ou composições que são selecionados para a realização do ensaio.
As sondas de PNA, as suas características, os métodos e estojo desta invenção são apropriados à análise de ácidos nucleicos presentes, ou não, internamente no organismo de interesse. Assim, esta invenção pode ser usada para ambas, análise do organismo ou análise dos ácidos nucleicos extraídos ou derivados do organismo de interesse, fazendo com que a fonte da sequência alvo não seja uma limitação nesta invenção.
Os seguintes exemplos ilustram diferentes situações e- diversos passos de aplicação da invenção, são realizações preferências da presente invenção, sem ter a intenção de ser limitativo em qualquer um dos deles:
EXEMPLO 1; Detecção de E. coli serotipo 0157 :H7 em diferentes tipos de amostras (clinicas, alimentares ou ambientais)
Sequência :
SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3 (acoplada ao Alexa Fluor 594) Preparação das amostras :
As amostras clinicas, alimentares ou ambientais, foram submetidas a um passo de enriquecimento antes da aplicação da sonda de PNA. Isto deve-se ao facto de a E. coli O157 :H7 apresentar geralmente baixos níveis de contaminação. Este passo de enriquecimento pode ser feito no meio recomendado pelo método convencional de análise para cada amostra. No caso de alimentos, rações animais e fezes, foi utilizada o mTSB. As amostras foram depois incubadas por um período de 18 a 22h a 37 °C, a 120 rpm. Após o enriquecimento, 15 μl da cultura foram misturados com 15 de Triton X-100 (1%) diretamente numa lâmina adequada para fluorescência. A lâmina foi colocada cerca de 5 minutos na estufa a 59°C ou deixada ao ar para secar.
Fixação :
Com o objectivo de prevenir a perda de 23S rRNA durante o processo de hibridação, a amostra foi imersa numa solução de 4% (peso/vol) de paraformaldeído e de 50% (vol/vol) etanol durante dez minutos cada.
Hibridação :
Após a fixação, as amostras foram então cobertas com uma gota de solução de hibridizaçâo contendo: 10% (peso/vol) de sulfato dextran (Sigma); 10mM de NaCl (Sigma); 30% (vol/vol) de formamida (Sigma); 0,1% (peso/vol) pirofosfato de sódio (Sigma); 0,2% (peso/vol) polivinilpirrolidona (Sigma); 0,2% (peso/vol) Ficol (Sigma), 5 mM de EDTA dissódico (Sigma); 0,1% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma); 50 mM Tris-HCl (pH 7,5; Sigma) e 200nM de sonda PNA. As amostras foram cobertas com lamelas (para garantir o espalhamento uniforme da sonda) , colocados em pequenas caixas húmida (para impedir a evaporação da solução de hibridação) protegidas da luz e incubadas por 45 minutos a 59°C. Lavagem :
Após o tempo de hibridação as lamelas foram removidas e as lâminas imersas numa solução de lavagem pré-aquecida a 59°C contendo 5mM de Tris Base, 15mM de NaCl e 1% (vol/vol) de Triton X (pH 10) . As amostras foram então colocadas na estufa à temperatura de hibridação durante 30 minutos. Posteriormente, as lâminas foram removidas da solução de lavagem e secas a 57°C, na mesma incubadora, durante aproximadamente 5 minutos. Antes da visualização ao microscópio, foi colocada uma gota de óleo de imersão não-fluorescente (Merck) e lamela. As lâminas foram armazenadas no escuro por um período máximo de 24 horas antes da microscopia .
Resultados :
Os resultados são obtidos através de observação ao microscópio de fluorescência com filtro adequado à detecção do fluorocrómo Alexa Fluor 594 ligado à sonda de PNA.
EXEMPLO 2: Deteção de Salmonella e E. coli O157:H7 em fezes.
Este exemplo pretende ilustrar a possibilidade de utilizar a sonda de E. coli O157 :H7 em conjunto com a sonda de Salmonella spp. previamente desenvolvida no trabalho de Almeida et al., 2010. Estas duas bactérias são causas comuns de gastroenterites e, como tal, a sua rápida deteção de fezes é de extrema importância. O uso de uma abordagem "multiplex" (utilização simultânea de várias sondas) pode simplificar o procedimento e acelerara a dtecção. Estas duas sondas têm temperaturas de hibridação muito próximas e podem portanto ser usadas facilmente num ensaio "multiplex". Sequências :
SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3 (acoplada ao Alexa Fluor 594)
Sequencia do artigo de Almeida et al., 2010: 5'- AGG AGC TTC GCT TGC -3' (acoplada ao Alexa Fluor 488)
Preparação das amostras :
25g de fezes foram misturadas com 225 ml de mTSB. Podem ser usadas diferentes quantidades de amostra, mas mantendo a razão de 1/10 (peso/vol) . Seguidamente, as amostras foram incubadas overnight (18 a 22h) a 37 °C e 120 rpm. Após o enriquecimento, 15 μl de amostra foram colocadas numa lâmina adequada e misturas com 15 μl de 1% Triton X-100 para minimizar a intrefrência de partículas autofluorescentes . Finalmente a amostra foi secar ao ar ou na estufa a 59°C durante cerca de 5 minutos.
Hibridação :
A hibridação foi realizada como descrito anteriormente no Exemplo 1 com uma pequena diferença. A solução de hibridação continha duas sondas: sonda de PNA para detectar Salmonella e sonda de PNA para detectar E. coli O157 :H7, cada uma na concentração de 200nM.
Lavagem:
A lavagem foi realizada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
Resultados :
Os resultados foram obtidos através da observação ao microscópio de fluorescência com filtro adequados à detecção do fluorocromos Alexa Fluor 594 e 488 ligados às sondas de PNA.
Lisboa, 28 de Abril de 2014. Referências :
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Sonda de PNA para a deteção e/ou quantificação de E. coli serotipo O157 :H7 caracterizada por compreender pelo menos uma sequência com 86% de semelhança com a sequência SEQ ID No. 1.
2. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos uma sequência SEQ ID No. 1 e contemplando variações nas sequências nucleóticas das sondas como por exemplo nas seguintes sequências SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5.
3. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por detetar a sequência alvo no rRNA, no rDNA ou nas sequências complementares do rRNA de E. coli O157 :H7.
4. Sonda de PNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter ainda uma sequência com 14 nucleótidos e ter 86% de semelhança com a sequência SEQ ID No 5.
5. Sonda de PNA, de acordo com as reivindicações 1 - 4, caracterizada por se encontrar ligada a pelo menos um tipo de fração detetável.
6. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o tipo de fração detetável da sonda ser selecionado a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente .
7. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o grupo flurofo ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5- (e -6) Carboxi- 2' , 7 ' -diclorofluoresceina, o 5-ROX ( 5-carboxi-X-rodamina , sal trietilamónio) .
8. Estojo para a deteção de E. coli O157 :H7 caracterizado por compreender pelo menos uma das sondas descritas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
9. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.
10. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de fixação compreender paraformaldeido e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformaldeido e 25-90% (vol/vol) de etanol.
11. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de hibridação compreender formamida.
12. Método de deteção de E. coli O157 :H7 caracterizado por utilizar as sondas de PNA descritas na reivindicação 1 a 7 e por compreender os seguintes passos: a. contacto da sonda de PNA com nas referidas amostras; b. hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas referidas amostras; c. deteção da hibridação como indicativo da referida deteção e quantificação nas referidas amostras.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida amostra biológica ser proveniente de alimentos, sangue, ar, água, biópsias ou biópsias.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a hibridação ser por fluorescência.
15. Utilização das sondas de PNA como descritas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada por ser aplicada numa metodologia de deteção de E. coli O157 :H7 em amostras biológicas .
16. Utilização do estojo descrito em qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, caracterizado por ser aplicado na deteção de E. coli O157 :H7 em amostras biológicas.
Lisboa, 28 de Abril de 2014.
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