WO2015133590A1 - 新規タンパク質脱アミド酵素 - Google Patents

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麻由 中野
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雅子 平賀
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein deamidase, a polynucleotide encoding the enzyme, a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant in which the vector is introduced, a method for producing the enzyme, and a protein using the enzyme It relates to a deamidation method.
  • Protein deamidation improves various functional properties of proteins (Non-patent Document 1). Therefore, it is expected that the use of proteins will be expanded by protein deamidation.
  • glutamine and asparagine have an amide group. These are converted to glutamic acid and aspartic acid, respectively, by deamidation.
  • Deamidation increases the negative charge of the protein and lowers the isoelectric point. This greatly increases the solubility and water dispersibility of the protein.
  • the electrostatic repulsion increases, the interaction between proteins, that is, the associating property decreases.
  • the tertiary structure of the protein is loosened, the higher order structure is changed, and the hydrophobic region embedded in the molecule is exposed on the surface of the molecule. It is known that force, emulsification stability, foamability and foam stability are improved.
  • Protein deamidation methods can be divided into chemical methods and enzymatic methods. Many chemical deamidation methods have been reported by mild acid or alkali treatment. However, there are problems such as being non-specific reaction, accompanied by cleavage of peptide bond under acid or alkaline conditions, and generation of unexpected by-products. In addition, facilities for using chemical substances are necessary, and the burden on the environment is large. Enzymatic methods can overcome such problems of chemical methods.
  • Examples of the enzymatic deamidation method include a method using protein glutaminase (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 2), a method using protease (Non-Patent Documents 3 and 4), and a method using transglutaminase (Non-Patent Documents).
  • References 5 methods using peptide glutaminase (Non-Patent Documents 6 to 7) and the like have been reported.
  • protein glutaminase can catalyze a deamidation reaction for a macromolecular protein without side reactions.
  • protease and transglutaminase the main reactions are cleavage of peptide bond and cross-linking reaction by formation of isopeptide bond between glutamine and lysine, respectively, and peptide glutaminase catalyzes deamidation of low molecular weight peptide Since they are enzymes, both have problems.
  • Protein glutaminase is considered to be highly practical as an enzyme having high deamidation ability for high molecular weight proteins.
  • Non-patent Documents 8 to 11 disclose the function improvement of wheat protein, milk protein (casein and whey protein) and soybean protein by protein glutaminase.
  • Patent Documents 3 to 7 patent knowledge relating to the quality improvement of, for example, yogurt, ice cream, coffee whitener, noodles, and livestock meat by protein glutaminase has also been reported (Patent Documents 3 to 7).
  • this protein glutaminase is based on glutamine residues in proteins and does not act on asparagine residues at all (Non-patent Documents 2 and 12).
  • amino acids constituting plant and animal proteins contain a large amount of asparagine, and it is preferable to deamid not only glutamine but also asparagine in order to obtain a further functional modification effect by deamidation.
  • Asparaginase (EC No .: 3.5.1.1) is widely known as an enzyme that catalyzes the hydrolysis of asparagine to aspartic acid.
  • asparaginase is an enzyme that specifically acts on free asparagine and cannot deamidate asparagine residues in peptides or proteins having a large molecular weight.
  • an enzyme that catalyzes a reaction for deamidating an N-terminal asparagine residue having a free ⁇ -amino group is known (Non-patent Document 13).
  • this enzyme cannot deamidate asparagine residues in proteins other than N-terminal asparagine residues.
  • An object of the present invention is to provide a novel protein deamidase (protein asparaginase) that catalyzes a reaction for deamidating an asparagine residue in a protein.
  • the present inventor has used a screening system that uses a peptide having an asparagine residue as the only N source, and does not involve degradation or cross-linking of the protein, and asparagine residue in the protein.
  • a microorganism producing an enzyme that catalyzes a reaction that specifically deamidates a group has been found, and the present invention has been completed.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • [1] A protein having an activity of catalyzing a reaction of deamidating an asparagine residue in the protein.
  • [2] The protein according to [1], which has substantially no activity of catalyzing a reaction of hydrolyzing a peptide bond in the protein.
  • [3] The protein according to [1] or [2], which is the protein according to (A), (B), or (C) below: (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11, the amino acid sequence of positions 63 to 1260, 245 to 1378, positions 245 to 1260, or positions 131 to 1260 of SEQ ID NO: 10, or positions 47 to 1257 of SEQ ID NO: 11.
  • a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of 1 to 10 amino acid residues, and having an activity of catalyzing a reaction of deamidating an asparagine residue in the protein; (C) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11, the amino acid sequence of positions 63 to 1260, 245 to 1378, positions 245 to 1260, or positions 131 to 1260 of SEQ ID NO: 10, or positions 47 to 1257 of SEQ ID NO: 11.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity and having an activity of catalyzing a reaction of deamidating an asparagine residue in the protein.
  • [4] The protein according to any one of [1] to [3], which is the protein according to the following (a), (b), or (c): (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, or 9, the amino acid sequence at positions 240 to 1355 of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence at positions 181 to 1180 or 67 to 1180 of SEQ ID NO: 5, and the sequence A protein comprising the amino acid sequence of positions 193 to 1172 or 70 to 1172 of No. 7, or the amino acid sequence of positions 146 to 989 or 21 to 989 of SEQ ID No.
  • a protein comprising an amino acid sequence including an addition and having an activity of catalyzing a reaction of deamidating an asparagine residue in the protein;
  • C the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, or 9, the amino acid sequence at positions 240 to 1355 of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence at positions 181 to 1180 or 67 to 1180 of SEQ ID NO: 5, and the sequence An amino acid sequence having positions of 193 to 1172 or 70 to 1172 of No. 7 or an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of positions 146 to 989 or 21 to 989 of SEQ ID NO: 8, and A protein having an activity of catalyzing a reaction of deamidating an asparagine residue in the protein.
  • [5] A polynucleotide encoding the protein according to any one of [1] to [4].
  • [6] A recombinant vector comprising the polynucleotide according to [5].
  • [7] A transformant into which the recombinant vector according to [6] has been introduced.
  • [8] Including culturing the transformant according to [7] in a medium, producing the protein according to any one of [1] to [4], and collecting the protein from the culture.
  • [9] Including culturing a microorganism having the ability to produce the protein according to any one of [1] to [4] in a medium, producing the protein, and collecting the protein from the culture.
  • the microorganism is a bacterium belonging to the class Actinobacteria.
  • the bacterium is a bacterium belonging to the genus Luteimicrobium, the genus Agromyces, the genus Microbacterium, or the genus Leifsonia.
  • the bacterium is Luteimicrobium album, Agromyces sp., Microbacterium testaceum, Leifsonia xyli, or Leifsonia aquatica ( Leifsonia aquatica).
  • the processing enzyme is a protease.
  • a method for producing a modified food or drink or a raw material thereof comprising causing the protein according to any one of [1] to [4] to act on a food or drink or a raw material containing the protein and / or peptide.
  • Example 2 which shows the result of SDS-PAGE of protein asparaginase derived from Luteimicrobium album.
  • Example 5 which shows the analysis result by HPLC of the insulin B chain processed with the protein asparaginase derived from Luteimicrobium album.
  • the photograph (Example 6) which shows the result of the isoelectric focusing of casein processed with the protein asparaginase derived from Luteimicrobium album.
  • Control group treatment group with water
  • test group 1 treatment group with protein asparaginase (0.68 U / ml)
  • test group 2 treatment group with protein asparaginase (2.7 U / ml).
  • Example 6 A photograph showing the results of SDS-PAGE of casein treated with various enzymes (Example 6). Control group: treated with water, test group 2: treated with protein asparaginase (2.7 U / ml), comparative group: treated with protein glutaminase (10 U / ml). “-TG” does not use transglutaminase, and “+ TG” uses transglutaminase.
  • the figure (Example 7) which shows the analysis result by HPLC of the insulin B chain processed with the protein asparaginase derived from Leifsonia xyli.
  • the photograph (Example 9) which shows the result of SDS-PAGE of the protein asparaginase derived from Agromyces sp.
  • Lane 1 hydrophobic chromatography purified fraction
  • lanes 2-6 anion exchange chromatography purified fraction.
  • FIG. The figure which shows the result of the alignment of sequence number 2, 5, 7, 8, and 9.
  • Blueprint of pro sequence fusion protein asparaginase The photograph (Example 12 ⁇ 1>) which shows the result of SDS-PAGE of the pro sequence fusion protein asparaginase derived from Agromyces sp. Secreted and expressed by Corynebacterium glutamicum.
  • the arrow indicates the position of the target protein.
  • the photograph which shows the result of SDS-PAGE of the pro sequence fusion protein asparaginase expressed in the microbial cell by Escherichiacoli Example 12 ⁇ 2>).
  • the arrow indicates the position of the target protein.
  • Protein deamidase The present invention provides a protein deamidase.
  • protein deamidase refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction of deamidating an asparagine residue in the protein. This activity is also referred to as “protein asparaginase activity”. In the present invention, the protein deamidase is also referred to as “protein asparaginase”.
  • “Asparagine residue in protein” refers to an asparagine residue present in a protein other than an N-terminal asparagine residue having a free ⁇ -amino group.
  • the protein deamidase deamidates an N-terminal asparagine residue having a free ⁇ -amino group as long as it has an activity of catalyzing such a reaction of deamidating an “asparagine residue in protein”. It may or may not have an activity of catalyzing the reaction.
  • the protein deamidase may or may not have an activity of catalyzing a reaction for deamidating monomeric asparagine.
  • a protein that is deamidated by a protein deamidase is also referred to as a “substrate protein”.
  • the length of the substrate protein is not particularly limited as long as it is 2 residues (dipeptide) or more.
  • the length of the substrate protein may be, for example, 2 residues (dipeptide) or more, 3 residues (tripeptide) or more, 10 residues or more, 50 residues or more, or 100 residues or more. That is, unless otherwise specified, the substrate protein also includes embodiments called peptides, such as oligopeptides and polypeptides.
  • protein asparaginase activity can be measured using, for example, the production of ammonia accompanying deamidation of asparagine residues.
  • protein deamidase is allowed to act on a peptide (Cbz-Asn-Gly, etc.) containing two or more residues that contain an asparagine residue and no glutamine residue.
  • Asparaginase activity can be calculated. Specifically, for example, protein asparaginase activity can be calculated under the conditions described in the Examples.
  • the protein asparaginase activity was determined by adding 25 ⁇ L of an enzyme solution of appropriate concentration to 125 ⁇ L of 0.2 ⁇ mol / L phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 ⁇ mmol / L Cbz-Asn-Gly, and then at 37 ° C. for 60 minutes. After the incubation, the reaction can be stopped by adding 150 ⁇ L of a 12% trichloroacetic acid solution, and the ammonia concentration in the supernatant can be measured.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute under these conditions is defined as 1 unit (U) of protein asparaginase activity.
  • the protein deamidase has substantially no activity of catalyzing a reaction for deamidating a glutamine residue in the protein.
  • This activity is also referred to as “protein glutaminase activity”.
  • the glutamine residue is hydrolyzed to a glutamic acid residue and ammonia by deamidation. Therefore, protein glutaminase activity can be measured based on, for example, production of ammonia accompanying deamidation of a glutamine residue.
  • protein deamidase is allowed to act on a peptide having two or more residues (such as Cbz-Gln-Gly) containing a glutamine residue and no asparagine residue. Glutaminase activity can be calculated.
  • protein glutaminase activity can be calculated by carrying out an enzyme reaction instead of Cbz-Asn-Gly in the measurement conditions for protein asparaginase activity described in the Examples, instead of Cbz-Gln-Gly. That is, the protein glutaminase activity is obtained by adding 25 ⁇ L of an enzyme solution of an appropriate concentration to 125 ⁇ L of 0.2 ⁇ mol / L phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 ⁇ mmol / L Cbz-Gln-Gly, and then at 37 ° C. for 60 minutes.
  • the reaction can be stopped by adding 150 ⁇ L of a 12% trichloroacetic acid solution, and the ammonia concentration in the supernatant can be measured.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute under these conditions is defined as 1 unit (U) of protein glutaminase activity.
  • Protein deamidase has substantially no protein glutaminase activity
  • the ratio of protein glutaminase activity to protein asparaginase activity in protein deamidase ie, specific activity of protein glutaminase activity / protein asparaginase activity Specific activity
  • the ratio of specific activity can be calculated by measuring protein asparaginase activity and protein glutaminase activity, respectively.
  • the protein deamidase preferably has substantially no activity that catalyzes a reaction of hydrolyzing a peptide bond in a protein. This activity is also referred to as “protease activity”.
  • Protease activity can be measured, for example, by a known technique. Specifically, for example, protease activity can be calculated using azocasein as a substrate under the following conditions. Specifically, 0.5 mL of an enzyme solution with an appropriate concentration was added to 1.0 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1% azocasein, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then 12% trichloroacetic acid solution 2.0 Add mL to stop the reaction.
  • the supernatant A 405 is measured.
  • As a control in place of the test group to which 0.5 mL of water was added instead of the enzyme solution, and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing azocasein to subtract the effect of the color of the components that could be included in the enzyme solution.
  • the test section using 1.0 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing no azocasein is treated in the same manner, and the A 405 of the supernatant is measured. Based on the measured values of these A 405, calculates the amount of increase in A 405 by the enzyme.
  • protease activity that increases A 405 by 0.01 per minute under these conditions is defined as 1 unit (U) of protease activity.
  • Protein deamidase has substantially no protease activity means that, for example, when a protein is treated with protein deamidase so that deamidation of asparagine residues occurs to a desired degree. Before and after, there may be no significant reduction in the molecular weight of the protein due to cleavage of the peptide bond.
  • a protein deamidase has substantially no protease activity
  • a ratio of protease activity to protein asparaginase activity in protein deamidase that is, ratio of specific activity of protease activity / ratio of protein asparaginase activity). Activity may be 1/100 or less, 1/1000 or less, 1 / 10,000 or less, or 0 (zero). The ratio of specific activity can be calculated by measuring protein asparaginase activity and protease activity, respectively.
  • the protein deamidase has substantially no activity of catalyzing a reaction for crosslinking the protein. This activity is also referred to as “protein cross-linking activity”.
  • the protein crosslinking activity can be measured, for example, by a known method.
  • Protein deamidase has substantially no protein cross-linking activity means, for example, when a protein is treated with protein deamidase so that deamidation of an asparagine residue occurs to a desired degree. Before and after, it may be that no significant polymerization of the protein due to cross-linking is observed.
  • a protein deamidase has substantially no protein cross-linking activity specifically refers to, for example, 500 ⁇ L of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2% w / v sodium caseinate. Add 25 ⁇ L of enzyme solution adjusted to 2.7 ⁇ U / ml as protein asparaginase activity, react at 37 ° C for 1 hour, and then inactivate the enzyme by treatment at 100 ° C for 5 minutes. Even if the amount is 90% or more, or 95% or more of the amount of non-crosslinked casein in the control group (sample in which 25 ⁇ L of water was added instead of the enzyme solution and reacted similarly) Good.
  • “Amount of uncrosslinked casein” can be measured and compared by a known method. Measurement and comparison of “amount of non-cross-linked casein” may be performed, for example, by measuring the molecular weight distribution by gel filtration chromatography, and confirming the position and concentration of the target band by SDS-PAGE. May be implemented.
  • protein deamidase examples include bacterial protein deamidase belonging to the class Actinobacteria.
  • Bacteria belonging to the class Actinobacteria include bacteria belonging to the family Microbacteriaceae such as bacteria belonging to the genus Leifsonia, bacteria belonging to the genus Microbacterium, bacteria belonging to the genus Agromyces, bacteria belonging to the genus Luteimicrobium, etc. Bacteria belonging to the unclassified family.
  • Examples of the genus Leifsonia include Leifsonia xyli and Leifsonia aquatica.
  • Examples of the bacteria belonging to the genus Microbacterium include Microbacterium testaceum.
  • Agromyces bacteria examples include one species of the genus Agromyces (Agromyces sp.) Obtained in Examples described later.
  • Examples of the bacteria belonging to the genus Luteimicrobium include Luteimicrobium album. That is, the protein deamidase may be a protein derived from such a bacterium, for example.
  • the amino acid sequence of the protein deamidase of Lutei microbium album AJ111072 (NITE P-01650) and the base sequence of the gene encoding it are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
  • the amino acid sequence of the protein deamidase of AJ111073 (NITE BP-01782) belonging to the genus Agromyces and the base sequence of the gene encoding it are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • the amino acid sequence of the protein deamidase of Microbacterium testaceum is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence of the protein deamidase of Leifsonia xyly AJ111071 (NITE P-01649) is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence of the protein deamidase from Leifsonia aquatica is shown in SEQ ID NO: 9. That is, the protein deamidase may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, or 9, for example.
  • the protein deamidase may be a protein encoded by a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6, for example.
  • the expression “having an (amino acid or base) sequence” includes the case of “including the (amino acid or base) sequence” and the case of “consisting of the (amino acid or base) sequence”.
  • the Lutei Microbium album AJ111072 (NITE P-01650) was issued on July 5, 2013 by the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center (Postal Code 292-0818, Kisarazu Kazusa Kimono, Chiba, Japan) No. 2-5-8 (No. 122) is deposited under the accession number NITE P-01650.
  • NITE BP-01782 One species of Agromyces genus AJ111073 was founded on December 11, 2013 by the National Institute for Product Evaluation Technology, Patent Microorganism Depositary Center (Postal Code 292-0818, Kisarazu Kazusa Kamaji 2, Chiba Prefecture, Japan) Room No.-5-8) 122) under the deposit number NITE P-01782 and transferred to the international deposit under the Budapest Treaty on March 4, 2015, with the deposit number NITE BP-01782 (receipt number NITE ABP) -01782).
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, or 9 can include a prepro region (pre sequence and pro sequence).
  • a protein containing a prepro region is also referred to as “prepro protein”.
  • a protein that does not contain a presequence and contains a prosequence is also referred to as a “proprotein”.
  • a protein that does not contain a prepro region is also referred to as a “mature protein”.
  • the protein deamidase is, for example, a protein having a portion of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, or 9 excluding the prepro region (ie, the amino acid sequence of the mature protein) Alternatively, it may be a protein having a portion of the amino acid sequence excluding the presequence (that is, the amino acid sequence of a proprotein).
  • the amino acid sequence of the mature protein of the protein deamidase of the Luteimicrobium album corresponds to positions 240 to 1355 of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of the mature protein of one protein deamidase of the genus Agromyces corresponds to positions 181 to 1180 of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the mature protein of the protein deamidase of Microbacterium testaseum corresponds to positions 193 to 1172 of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence of the mature protein of the Lefsonia xyly protein deamidase corresponds to positions 146-989 of SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence of the proprotein of one protein deamidase of the genus Agromyces corresponds to positions 67 to 1180 of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the proprotein of the protein deamidase of Microbacterium testaseum corresponds to positions 70 to 1172 of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence of the proprotein of the Lefsonia xyly protein deamidase corresponds to positions 21-989 of SEQ ID NO: 8.
  • the protein deamidase is, for example, a base sequence encoding the amino acid sequence of the portion excluding the prepro region in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 (that is, a base sequence encoding the amino acid sequence of the mature protein).
  • the protein may be a protein encoded by a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of the portion excluding the pre-sequence (that is, a base sequence encoding the amino acid sequence of a proprotein). May be.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of the mature protein of the protein deamidase of the Luteimicrobium album corresponds to positions 718-4068 of SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of the mature protein of one protein deamidase belonging to the genus Agromyces corresponds to positions 541 to 3543 of SEQ ID NO: 6.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of the proprotein of one protein deamidase of the genus Agromyces corresponds to positions 199 to 3543 of SEQ ID NO: 6. Note that the position of the N-terminal residue of the mature protein may be around several residues, for example, depending on various conditions such as the type of processing enzyme.
  • “several residues” may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 residues. That is, for example, the amino acid sequence of a mature protein of one protein deamidase of the genus Agromyces may correspond to positions 181 ⁇ several residues to 1180 of SEQ ID NO: 5. In one embodiment, the amino acid sequence of the mature protein of one protein deamidase of the genus Agromyces may correspond to positions 177 to 1180 of SEQ ID NO: 5.
  • the protein deamidase may be a protein having a common amino acid sequence of amino acid sequences of two or more protein deamidases, for example.
  • a common amino acid sequence can be determined by alignment with the amino acid sequences of two or more protein deamidases.
  • the alignment results of SEQ ID NOs: 2 and 5 are shown in FIG. 7, and their common amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the alignment results of SEQ ID NOs: 2, 5, 7, and 8 are shown in FIG. 8, and their common amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the alignment results of SEQ ID NOs: 2, 5, 7, 8, and 9 are shown in FIG. That is, the protein deamidase may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11, for example.
  • the protein deamidase may be, for example, a protein having a partial amino acid sequence corresponding to each protein deamidase among the common amino acid sequences of the amino acid sequences of two or more protein deamidases.
  • the amino acid sequence of the portion corresponding to the protein deamidase is the amino acid sequence at positions 63 to 1260 of SEQ ID NO: 10 (corresponding to one kind of protein deamidase belonging to the genus Agromyces), and the amino acids at positions 47 to 1257 of SEQ ID NO: 11 Sequence (corresponds to protein deamidase of Microbacterium testesium), amino acid sequence at positions 59 to 1258 of SEQ ID NO: 11 (corresponding to one protein deamidase of the genus Agromyces), or 96 to 1101 of SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence (corresponding to the protein deamidase of Reifsonia xyli).
  • the protein deamidase is, for example, a protein having a portion of the amino acid sequence corresponding to the mature protein of each protein deamidase among the common amino acid sequences of the amino acid sequences of two or more protein deamidases. Alternatively, it may be a protein having a portion of the amino acid sequence corresponding to the proprotein of each protein deamidase.
  • amino acid sequence of the portion corresponding to the mature protein of the protein deamidase As the amino acid sequence of the portion corresponding to the mature protein of the protein deamidase, the amino acid sequence at positions 245 to 1378 of SEQ ID NO: 10 (corresponding to the mature protein of the protein deamidase of Lutei Microbium album), SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of positions 245 to 1260 (corresponding to the mature protein of one protein deamidase of the genus Agromyces), amino acid sequence of positions 241 to 1378 of SEQ ID NO: 11 (of the protein deamidase of the Luteimicrobium album) Corresponding to the mature protein), amino acid sequence of positions 244 to 1258 of SEQ ID NO: 11 (corresponding to the mature protein of one protein deamidase of the genus Agromyces), amino acid sequence of positions 244 to 1257 of SEQ ID NO: 11 (microbacterium ⁇ Testaseum protein deamidation Corresponds to the mature protein of the enzyme), 244-1101 of the
  • the amino acid sequence of the portion corresponding to the proprotein of protein deamidase is the amino acid sequence at positions 131 to 1260 of SEQ ID NO: 10 (corresponding to the proprotein of one kind of protein deamidase belonging to the genus Agromyces), Amino acid sequence at positions 129 to 1258 (corresponding to a proprotein of one type of protein deamidase belonging to the genus Agromyces), amino acid sequence at positions 120 to 1257 of SEQ ID NO: 11 (proprotein of a protein deamidase from Microbacterium testaseum) And the amino acid sequence at positions 120 to 1101 of SEQ ID NO: 11 (corresponding to the proprotein of the protein deamidase of Reifsonia xyly).
  • the protein deamidase is a protein deamidase exemplified above (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, 9, 10, or 11, or their It may be a variant of a protein having a partial amino acid sequence.
  • a gene encoding a protein deamidase also referred to as “protein deamidase gene” may be a protein deamidase gene exemplified above (for example, SEQ ID NO: 3 or 6) as long as the original function is maintained. Or a gene having a partial base sequence thereof).
  • Such a variant in which the original function is maintained may be referred to as a “conservative variant”. Examples of conservative variants include the protein deamidases exemplified above, homologues of genes encoding them, and artificially modified variants.
  • the original function is maintained means that the variant of the gene or protein has a function (activity or property) corresponding to the function (activity or property) of the original gene or protein. That is, “the original function is maintained” means that, in the case of a protein deamidase, a protein variant has protein asparaginase activity.
  • “original function is maintained” means that a variant of the gene encodes a protein in which the original function is maintained (that is, a protein having protein asparaginase activity). That means.
  • protein deamidase homologs examples include protein deamidases produced by microorganisms obtained by the screening methods described below.
  • protein deamidase homologs include proteins obtained from public databases by BLAST search or FASTA search using the amino acid sequence as a query sequence.
  • the homologue of the protein deamidase gene can be obtained, for example, by PCR using chromosomes of various microorganisms as templates and oligonucleotides prepared based on these known gene sequences as primers.
  • the protein deamidase has the above amino acid sequence (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 7, 8, 9, 10, or 11, or a part thereof (mature It may be a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of the protein part or proprotein part).
  • the above “one or several” varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, Preferably, it means 1-20, more preferably 1-10, even more preferably 1-5, particularly preferably 1-3.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids described above is a conservative mutation that maintains the protein function normally.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • the protein deamidase is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, based on the entire amino acid sequence. Particularly preferably, it may be a protein having an amino acid sequence having a homology of 99% or more. In the present specification, “homology” may refer to “identity”.
  • the protein deamidase is a conservative variant of the above-mentioned common amino acid sequence (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11, or the amino acid sequence of a part thereof (mature protein portion or proprotein portion))
  • a variant may have a mutation introduced into the common part and / or other part in the common amino acid sequence.
  • Such variants are preferably those in which the common portion in the common amino acid sequence is conserved and mutations are introduced in other portions.
  • the protein deamidase has the above base sequence (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 or a part thereof (part encoding a mature protein or proprotein))
  • a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a probe that can be prepared from a base sequence for example, a complementary sequence to the whole or a part of the base sequence.
  • a probe can be prepared, for example, by PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence as a primer and a DNA fragment containing the base sequence as a template.
  • “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • highly homologous DNAs for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • are hybridized and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions of 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC And 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, conditions of washing once, preferably 2 to 3 times.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the protein deamidase may be one obtained by removing the amino acid sequence or the base sequence of the gene encoding the same from the protein deamidases as described above at the time of filing of the present invention.
  • the protein deamidase may be a fusion protein with other amino acid sequences.
  • the “other peptide” is not particularly limited as long as the fusion protein has protein asparaginase activity.
  • the “other amino acid sequence” can be appropriately selected according to various conditions such as the purpose of use. Examples of the “other amino acid sequence” include peptide tags, signal sequences (pre-sequences), pro sequences, and protease recognition sequences.
  • the “other amino acid sequence” may be linked to, for example, the N-terminus or C-terminus of the protein deamidase, or both. As the “other amino acid sequence”, one amino acid sequence may be used, or two or more amino acid sequences may be used in combination.
  • the peptide tag can be used, for example, for detection and purification of the expressed protein deamidase.
  • Specific peptide tags include His tag, FLAG tag, GST tag, Myc tag, MBP (maltose binding protein), CBP (cellulose binding protein), TRX (Thioredoxin), GFP (green fluorescent protein), HRP (horseradish) peroxidase), ALP (Alkaline Phosphatase), and antibody Fc region.
  • An example of a His tag is a 6xHis tag.
  • the signal sequence can be used for secretory production of protein deamidase, for example.
  • the signal sequence include a signal sequence recognized by the Sec system secretory pathway and a signal sequence recognized by the Tat system secretory pathway.
  • Specific examples of the signal sequence recognized by the Sec system secretory pathway include the signal sequence of the cell surface protein of coryneform bacteria. As cell surface proteins of coryneform bacteria, PS1 (CspA) and PS2 (CspB) of C. glutamicum (6-502548) and SlpA (CspA) of C. ammoniagenes (C. stationis) -108675).
  • Specific examples of signal sequences recognized by the Tat secretion pathway include the TorA signal sequence of E. coli, the SufI signal sequence of E.
  • a signal sequence of protein deamidase may be used.
  • the signal sequence can be used by adding to the N-terminal of the protein to be produced, for example.
  • the signal sequence can be used by being added to the proprotein of protein deamidase or the N terminus of the mature protein.
  • the signal sequence is generally cleaved by a signal peptidase when the translation product is secreted outside the cell. Therefore, when a protein deamidase is secreted and produced using a signal sequence, a protein deamidase having no signal sequence can be secreted outside the cell.
  • prosequence examples include a protein deamidase prosequence.
  • pro-sequence of the protein deamidase include the sequence at positions 67 to 180 in SEQ ID NO: 5.
  • the pro sequence can be used by adding to the N-terminal of the protein to be produced, for example.
  • the pro sequence can be used by adding to the N-terminal of the mature protein of protein deamidase, for example.
  • protein deamidase may be constructed and expressed so as to include a signal sequence, a pro sequence, and a mature protein sequence in order from the N-terminal.
  • the protein deamidase in a form having a pro sequence may contribute to the structural stabilization of the protein deamidase.
  • the finally obtained protein deamidase preferably has no prosequence.
  • the protease recognition sequence can be used, for example, for cleavage of the expressed protein deamidase.
  • the protease recognition sequence is preferably a protease recognition sequence with high substrate specificity.
  • Specific examples of a recognition sequence for a protease with high substrate specificity include a recognition sequence for Factor Xa protease and a recognition sequence for proTEV protease.
  • a protease recognition sequence is further introduced between the protein deamidase and the other amino acid sequence.
  • other amino acid sequences can be removed from the expressed protein deamidase using a protease to obtain a protein deamidase having no other amino acid sequence.
  • the protein deamidase gene may be one obtained by substituting an arbitrary codon with an equivalent codon in the base sequence of the protein deamidase gene exemplified above or a conservative variant thereof.
  • the protein deamidase gene may be modified to have an optimal codon depending on the codon usage frequency of the host to be used.
  • the term “gene” is not limited to DNA as long as it encodes a target protein, and may include any polynucleotide. That is, the “protein deamidase gene” may mean any polynucleotide encoding a protein deamidase.
  • the protein deamidase gene may be DNA, RNA, or a combination thereof.
  • the protein deamidase gene may be single-stranded or double-stranded.
  • the protein deamidase gene may be single-stranded DNA or single-stranded RNA.
  • the protein deamidase gene may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a hybrid strand composed of a DNA strand and an RNA strand.
  • a protein deamidase gene may contain both DNA and RNA residues in a single polynucleotide chain.
  • the description regarding DNA such as the exemplified base sequence may be appropriately read according to RNA.
  • the mode of the protein deamidase gene can be appropriately selected according to various conditions such as the usage mode.
  • Protein deamidase can be produced using a host having the ability to produce protein deamidase. That is, the present invention relates to protein deamidation comprising culturing a host having the ability to produce protein deamidase in a medium to produce protein deamidase, and collecting protein deamidase from the culture.
  • a method for producing an amide enzyme is provided. This method is also referred to as “a method for producing the protein deamidase of the present invention”.
  • Protein deamidase can also be produced by expressing a protein deamidase gene in a cell-free protein synthesis system.
  • a host having the ability to produce a protein deamidase may be one that inherently has the ability to produce a protein deamidase and has been modified to have the ability to produce a protein deamidase. There may be.
  • hosts having the ability to produce protein deamidase include bacteria belonging to the actinobacteria family as described above, for example, Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650), Agromyces genus AJ111073 (NITE BP) -01782), Microbacterium testaceum, Leifsonia xyly AJ111071 (NITE P-01649).
  • Examples of the host having the ability to produce protein deamidase include microorganisms obtained by the following screening technique. (1) Inoculate a culture medium containing Cbz-Asn-Gly as the sole N source with a microbial source such as soil, and culture it in an integrated manner. (2) Ingest the culture solution obtained in (1) into an agar medium containing Cbz-Asn-Gly as the only N source to obtain a grown strain. (3) The obtained strain is cultured in an appropriate liquid nutrient medium, and the ammonia releasing activity from Cbz-Asn-Gly and casein in the culture solution is checked.
  • composition of the medium used for enrichment culture can be appropriately set according to the microorganism to be cultured except that Cbz-Asn-Gly is the only N source.
  • culture conditions such as culture temperature can be appropriately set according to the microorganism to be cultured.
  • specific medium components and culture conditions for example, the description relating to the culture of a host having the ability to produce a protein deamidase described later may be referred to.
  • Examples of a host having the ability to produce a protein deamidase include a host into which a protein deamidase gene has been introduced.
  • the host into which the protein deamidase gene is introduced is not particularly limited as long as it can express a functional protein deamidase.
  • the host include bacteria, actinomycetes, yeast, fungi, plant cells, insect cells, and animal cells.
  • Preferred hosts include microorganisms such as bacteria and yeast. More preferred hosts include bacteria.
  • bacteria include gram negative bacteria and gram positive bacteria.
  • Gram-negative bacteria include bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria and the like.
  • Gram-positive bacteria include coryneform bacteria such as Bacillus bacteria and Corynebacterium bacteria. Among them, Escherichia coli can be preferably used as the host.
  • a coryneform bacterium such as Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium stationis is preferably used as the host. (WO2013 / 065869, WO2013 / 065772, WO2013 / 118544, WO2013 / 062029).
  • the protein deamidase gene can be obtained by cloning from an organism having the protein deamidase gene. For cloning, nucleic acids such as genomic DNA and cDNA containing the same gene can be used. Protein deamidase genes can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • the protein deamidase gene is derived from, for example, a microorganism having the ability to produce the protein deamidase as described above (for example, a bacterium belonging to the above-mentioned Actinobacterium class or a microorganism obtained by the above screening method). It can be cloned by the method described below.
  • protein deamidase is appropriately isolated and purified from a microorganism capable of producing protein deamidase, and information on the partial amino acid sequence is obtained.
  • the purified protein deamidase is directly analyzed according to the conventional method by Edman degradation (Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, pages 7990-7997 (1981)) (protein analysis). Sequencer Shimadzu PPSQ-21A, etc.) or by subjecting it to limited hydrolysis by the action of protein hydrolase, separating and purifying the obtained peptide fragments, and analyzing the amino acid sequence of the obtained purified peptide fragments You may implement.
  • the base sequence of the genomic DNA extracted from the microorganism is decoded by a next-generation sequencer (Illumina, Miseq, etc.), and the partial amino acid sequence obtained by the above method is searched. That is, a contig sequence was created from the obtained genomic DNA base sequence using CLC Genomics Workbench (CLC Bio Japan Co., Ltd.), and the enzyme was encoded based on the previously obtained partial amino acid sequence of protein deamidase.
  • the base sequence of the gene can be determined. Based on the determined base sequence, the protein deamidase gene can be cloned by a general method using PCR.
  • the following method can be used.
  • a genomic DNA of a microorganism capable of producing protein deamidase is used as a template
  • a PCR reaction is performed using a synthetic oligonucleotide primer designed based on partial amino acid sequence information, and the target protein deamidase gene is detected.
  • a DNA fragment containing a part is obtained.
  • the PCR method is performed according to the method described in PCR technology [PCR Technology, edited by Erlich HA, Stockton Press, 1989].
  • the base sequence of the amplified DNA fragment is determined by a commonly used method, for example, the dideoxy chain terminator method, it corresponds to the partial amino acid sequence of the protein deamidase in addition to the synthetic oligonucleotide primer sequence in the determined sequence.
  • the sequence is found, that is, the base sequence of a part of the protein deamidase gene of interest can be determined.
  • the full length of the protein deamidase gene can be cloned by performing a hybridization method or the like using the obtained gene fragment as a probe.
  • the gene can be modified by a known method.
  • a target mutation can be introduced into a target site of a gene by site-specific mutagenesis. That is, for example, the coding region of a gene can be modified by site-directed mutagenesis so that an amino acid residue at a specific site of the encoded protein includes substitution, deletion, insertion or addition.
  • site-directed mutagenesis a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, rlErlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., ethMeth.
  • the variant of a protein deamidase gene can be acquired also by a mutation process, for example.
  • Mutation treatment includes a method in which the gene itself is treated in vitro with hydroxylamine or the like, a microorganism having a protein deamidase gene, for example, a bacterium belonging to the class Actinobacteria, X-ray, ultraviolet light, or N-methyl-N′-nitro.
  • NTG -N-nitrosoguanidine
  • EMS ethyl methane sulfonate
  • MMS methyl methane sulfonate
  • MMS Elaprone PCR
  • WP Nature 370, 389 (1994)
  • StEP-PCR Z Zhao, H. Nature Biotechnol. 16, 258 (1998)
  • the method for introducing the protein deamidase gene into the host is not particularly limited.
  • the protein deamidase gene may be retained so that it can be expressed under the control of a promoter that functions in the host.
  • the protein deamidase gene may be present on a vector that autonomously replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or may be introduced on the chromosome.
  • the host may have only one copy of the protein deamidase gene or may have two or more copies.
  • the host may have only one type of protein deamidase gene, or may have two or more types of protein deamidase genes.
  • the promoter for expressing the protein deamidase gene is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the “promoter that functions in the host” refers to a promoter having promoter activity in the host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a native promoter of a protein deamidase gene or a promoter of another gene.
  • the promoter may be a strong promoter so that a high expression level can be achieved.
  • a strong promoter that functions in bacteria of the Enterobacteriaceae family such as Escherichia coli
  • bacteria of the Enterobacteriaceae family such as Escherichia coli
  • T7 promoter, trp promoter, trc promoter, lac promoter, tac promoter, tet promoter, araBAD promoter, rpoH promoter examples include PR promoter and PL promoter.
  • P54-6 promoter As a strong promoter that functions in coryneform bacteria, artificially redesigned P54-6 promoter (Appl. Microbiol.
  • the activity of the promoter can be increased by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO 00/18935).
  • the highly active promoter include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Patent application 2006134574) and pnlp8 promoter (WO2010 / 027045). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotickpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.,. 1, 105-128 (1995)).
  • a terminator for termination of transcription can be arranged downstream of the protein deamidase gene.
  • the terminator is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the terminator may be a host-derived terminator or a heterologous terminator.
  • the terminator may be a terminator specific to a protein deamidase gene or may be a terminator of another gene. Specific examples of the terminator include T7 terminator, T4 terminator, fd phage terminator, tet terminator, and trpA terminator.
  • the protein deamidase gene can be introduced into a host using a vector containing the gene, for example.
  • a vector containing a protein deamidase gene is also referred to as a protein deamidase gene expression vector or a recombinant vector.
  • An expression vector for a protein deamidase gene can be constructed, for example, by ligating a DNA fragment containing the protein deamidase gene with a vector that functions in the host. By transforming the host with an expression vector for the protein deamidase gene, a transformant into which the vector has been introduced can be obtained, that is, the gene can be introduced into the host.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell can be used as the vector.
  • the vector is preferably a multicopy vector.
  • the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene in order to select a transformant.
  • the vector may be equipped with a promoter or terminator for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a vector derived from a bacterial plasmid, a vector derived from a yeast plasmid, a vector derived from a bacteriophage, a cosmid, or a phagemid.
  • vectors capable of autonomous replication in bacteria of the Enterobacteriaceae family such as Escherichia coli, specifically, for example, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (all available from Takara Bio Inc.), pACYC184, pMW219 (Nippon Gene), pTrc99A (Pharmacia), pPROK vector (Clontech), pKK233-2 (Clontech), pET vector (Novagen), pQE vector (Qiagen), pACYC, Hiroshi
  • the host range vector RSF1010 can be mentioned.
  • vectors capable of autonomous replication in coryneform bacteria include, for example, pHM1519 (Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., .48, 2901- 2903 (1984)); plasmids having improved drug resistance genes; plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmid pCRY21 described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • a protein deamidase gene containing a unique promoter region may be directly incorporated into the vector, and the coding region of the protein deamidase is bound downstream of the promoter as described above. It may be incorporated into a vector, or a protein deamidase coding region may be incorporated downstream of the promoter inherent in the vector.
  • the vectors, promoters, and terminators that can be used in various microorganisms are described in detail in, for example, “Basic Course of Microbiology 8, Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan, 1987”, and these can be used.
  • the protein deamidase gene can be introduced onto the host chromosome, for example.
  • Introduction of a gene onto a chromosome can be performed using, for example, homologous recombination.
  • homologous recombination examples include Red-driven integration (WO2005 / 010175), transduction using phages such as P1 phage, methods using conjugative transfer vectors, and functions in the host.
  • a method using a suicide vector that does not have an origin of replication Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced.
  • multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies in the chromosome as a target.
  • sequences in which a large number of copies exist in a chromosome include repetitive DNA sequences (repetitive DNA) and inverted repeats present at both ends of a transposon.
  • a gene can be randomly introduced onto a chromosome by a method using transposon or Mini-Mu (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985, US Pat. No. 5,882,888, EP805867B1).
  • a protein deamidase gene containing a unique promoter region may be directly incorporated into the chromosome, and the coding region of the protein deamidase is bound downstream of the promoter as described above.
  • the protein deamidase coding region may be incorporated downstream of the promoter originally present on the chromosome.
  • the introduction of a gene onto a chromosome can be attributed to, for example, Southern hybridization using a probe having a base sequence complementary to all or part of the gene, or a primer prepared based on the base sequence of the gene. Can be confirmed by PCR.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a transformation method for example, a method in which a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), as described for Bacillus subtilis, a method of preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA (Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E .., 1997. Gene 1: 153-167).
  • recombinant DNA is prepared by transforming DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, into a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast
  • a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • a host that originally has a protein deamidase gene may be modified so that the expression of the protein deamidase gene is increased.
  • Methods for increasing the expression of the protein deamidase gene include increasing the copy number of the protein deamidase gene and improving the transcription efficiency of the protein deamidase gene.
  • Increasing the copy number of the protein deamidase gene can be achieved by introducing the protein deamidase gene into the host.
  • the protein deamidase gene can be introduced as described above.
  • the introduced protein deamidase gene may be derived from the same species or from a different species. Improvement of the transcription efficiency of the protein deamidase gene can be achieved by replacing the promoter of the protein deamidase gene with a stronger promoter. Examples of stronger promoters include those described above.
  • the protein deamidase can be expressed by culturing a host having the ability to produce the above protein deamidase in a medium. At that time, gene expression may be induced as necessary. Host culture conditions and gene expression induction conditions may be appropriately selected according to various conditions such as marker type, promoter type, and host type.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as the host can proliferate and can express protein deamidase.
  • As the medium for example, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and other organic components as required can be used.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates
  • alcohols such as glycerol and ethanol
  • organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
  • Nitrogen sources include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • Sulfur sources include inorganic sulfur compounds such as sulfates, sulfites, sulfides, hyposulfites, thiosulfates,
  • Inorganic ions include calcium ions, magnesium ions, manganese ions, potassium ions, iron ions, and phosphate ions.
  • organic components include organic trace nutrient sources.
  • organic micronutrients include required substances such as vitamin B1, yeast extract containing them, and the like.
  • the culture method may be liquid culture or solid culture, but liquid culture is preferred.
  • the culture is preferably performed aerobically.
  • Examples of the aerobic culture method include a shaking culture method and an aerobic deep culture method using a jar fermenter.
  • the oxygen concentration at that time may be adjusted to, for example, 5 to 50%, preferably about 10% of the saturated concentration.
  • the culture temperature may be, for example, 10 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C., more preferably 25 to 40 ° C.
  • the pH of the medium may be adjusted to, for example, 3 to 9, preferably 5 to 8.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances such as calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used.
  • the culture period may be, for example, 12 hours to 20 days, preferably 1 day to 7 days.
  • Protein deamidase By culturing under the above conditions, a culture containing protein deamidase can be obtained. Protein deamidase accumulates, for example, in the host cell and / or medium. “Cells” may be appropriately read as “cells” depending on the type of host. Depending on the host to be used and the design of the protein deamidase gene, protein deamidase can be accumulated in the periplasm, or protein deamidase can be secreted and produced outside the cells.
  • the protein deamidase may be used as it is contained in the microbial cells or the like, or may be appropriately separated and purified from the microbial cells and used as a crude enzyme fraction or a purified enzyme.
  • the protein deamidase when protein deamidase accumulates in the host cell, the protein deamidase can be recovered by appropriately crushing, dissolving, or extracting the cell.
  • the cells can be recovered from the culture by centrifugation or the like.
  • Cell disruption, lysis, extraction or the like can be performed by a known method. Examples of such a method include ultrasonic crushing method, dynomill method, bead crushing, French press crushing, and lysozyme treatment. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination.
  • the culture supernatant when protein deamidase accumulates in the medium, the culture supernatant can be obtained by centrifugation or the like, and the protein deamidase can be recovered from the culture supernatant.
  • the protein deamidase can be purified by a known method used for enzyme purification. Examples of such methods include ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and isoelectric point precipitation. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination.
  • the protein deamidase can be purified to the desired degree.
  • the purified protein deamidase can be used as a “protein deamidase” for protein deamidation.
  • the protein deamidase may be used in a free state or may be used in the state of an immobilized enzyme immobilized on a solid phase such as a resin.
  • any fraction containing protein deamidase may be used for protein deamidation as “protein deamidase”.
  • the fraction containing the protein deamidase is not particularly limited as long as it is contained so that the protein deamidase can act on the substrate protein.
  • Such fractions include, for example, host cultures capable of producing protein deamidase, cells recovered from the same culture (cultured cells), disrupted cells of the same, Lysates, extracts of the same cells (cell-free extract), treated cells such as immobilized cells obtained by immobilizing the same cells with a carrier such as acrylamide and carrageenan, and culture supernatants recovered from the same culture , Partially purified products thereof (crude products), and combinations thereof. Any of these fractions may be used alone or together with a purified protein deamidase.
  • the recovered protein deamidase may be formulated as appropriate.
  • the dosage form is not particularly limited, and can be appropriately set according to various conditions such as the intended use of the protein deamidase.
  • Examples of the dosage form include solutions, suspensions, powders, tablets, pills, and capsules.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, diluents, surfactants and other pharmacologically acceptable additives.
  • binders for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, diluents, surfactants and other pharmacologically acceptable additives.
  • the method for producing a protein deamidase of the present invention may further include removing the prosequence from the protein deamidase having a prosequence.
  • the removal of the prosequence can be performed, for example, by treating a protein deamidase with a processing enzyme.
  • a protease is mentioned as a processing enzyme. Specific examples of proteases include serine proteases such as subtilisin, chymotrypsin, and trypsin; papain, bromelain, caspase, and calpain.
  • Cysteine proteases such as pepsin, cathepsin, etc .; metalloproteases such as thermolysin, and the like.
  • a protein deamidase when expressed by inserting a recognition sequence of a specific protease between the pro sequence and the mature protein sequence, the pro sequence is specifically removed using the specific protease. be able to.
  • the origin of the protease is not particularly limited, and any protease, animal, plant or the like may be used.
  • the protease a known protease homolog or artificially modified product may be used.
  • protease examples include a culture of a microorganism producing protease, a culture supernatant separated from the culture, a cell separated from the culture, a processed product of the cell, an agricultural, aquatic and livestock product containing protease, Processed products of agricultural, aquatic and livestock products, proteases separated from them, commercially available protease preparations, etc. may be used.
  • the protease may be purified to the desired extent.
  • microorganisms that produce protease include bacteria belonging to the genus Bacillus and fungi belonging to the genus Aspergillus.
  • commercially available protease preparations include those shown in Table 5.
  • Protein deamidase is obtained by centrifuging the culture solution (12,000 rpm, 4 ° C, 20 minutes) to obtain the supernatant as a crude enzyme solution, UF concentration (Sartorius Hydrosart membrane, molecular weight fraction 10,000), hydrophobic chromatography, ion It can be purified by treatment by exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like.
  • UF concentration Sud Cell Hydrosart membrane, molecular weight fraction 10,000
  • hydrophobic chromatography ion It can be purified by treatment by exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like.
  • an asparagine residue in a protein can be deamidated using a protein deamidase. That is, this invention provides the method of deamidating the asparagine residue in protein including making protein deamidase act on protein. This method is also referred to as “deamidation method of the present invention”.
  • One embodiment of the method is a method for producing a protein in which an asparagine residue is deamidated, which comprises allowing a protein deamidase to act on the protein.
  • the protein (substrate protein) to be deamidated by the protein deamidase is not particularly limited as long as it is a protein containing an asparagine residue.
  • the length of the substrate protein is not particularly limited as long as it is 2 residues (dipeptides) or more, and the substrate protein includes embodiments called peptides, such as oligopeptides and polypeptides, unless otherwise specified.
  • the term “protein (substrate protein)” may specifically mean a protein and / or a peptide.
  • the substrate protein may be a natural product or an artificial product.
  • the substrate protein may be the protein itself or a material containing the protein.
  • the substrate protein may be subjected to the deamidation reaction alone (ie, in an isolated state), or may be subjected to the deamidation reaction in a state of being contained in an arbitrary material.
  • substrate proteins include agricultural and aquatic products containing proteins, processed products thereof, and proteins separated from them.
  • a raw material containing vegetable protein grains, such as soybean, wheat, barley, corn, and rice, and those processed goods are mentioned, for example.
  • livestock meat such as beef, pork, and chicken, fish meat, milk, an egg, and those processed products are mentioned, for example.
  • plant proteins examples include soybean proteins such as glycinin, wheat proteins such as gluten, glutenin and gliadin, and corn proteins such as corn gluten meal.
  • Animal proteins include milk proteins such as casein, lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin, egg proteins such as ovalbumin, meat proteins such as myosin and actin, blood proteins such as serum albumin, and tendon proteins such as gelatin and collagen.
  • Substrate proteins include proteins that have been partially decomposed chemically with acids, alkalis, etc., or enzymatically with proteases, chemically modified proteins with various reagents, recombinant proteins produced in appropriate hosts, and synthetic peptides. Can be mentioned.
  • the substrate protein may be subjected to a treatment such as heating, steaming, crushing, freezing, thawing, and drying as appropriate.
  • the material containing protein may contain one type of protein, or may contain two or more types of protein.
  • As the substrate protein one type of protein may be used, or two or more types of proteins may be used.
  • the substrate protein may be, for example, a food or drink containing protein, or a raw material for a food or drink containing protein.
  • the substrate protein may be subjected to a deamidation reaction, for example, in a state of being contained in a food or drink or a raw material thereof.
  • the type and form of the food or drink or its raw material are not particularly limited as long as the food or drink or its raw material contains protein.
  • agricultural, aquatic and livestock products containing proteins, processed products thereof, and proteins separated from them may be used alone as food or drink or as raw materials thereof, and two or more of them may be used.
  • a food or drink or a raw material thereof May be used in combination as appropriate for use as a food or drink or a raw material thereof, or one or more of them may be used in combination with other components as appropriate for use as a food or drink or a raw material thereof.
  • a protein deamidase By deamidating a protein-containing food or drink or a raw material thereof with a protein deamidase, a food or drink containing a protein in which an asparagine residue is deamidated or a raw material thereof can be obtained.
  • the food-drinks containing the protein from which the asparagine residue was deamidated can be manufactured using the raw material of the food-drinks containing the protein from which the asparagine residue was deamidated.
  • one aspect of the deamidation method of the present invention includes the action of a protein deamidase on a protein-containing food or drink or a raw material thereof, and a food or drink containing a protein in which an asparagine residue is deamidated. Or a method for producing the raw material.
  • mode of the deamidation method of this invention are also called "the food / beverage products of this invention.”
  • the food / beverage products of this invention can be manufactured by the same method using the raw material similar to normal food / beverage products except processing with protein deamidase. Seasonings are also included in food and drink. Specific examples of the food and drink include mayonnaise, dressing, cream, yogurt, meat products, and bread.
  • the substrate protein may be subjected to a deamidation reaction in the state of, for example, a solution, a suspension, a slurry, or a paste.
  • concentration of the substrate protein in the solution or the like is not particularly limited as long as deamidation is achieved to a desired degree.
  • concentration of the substrate protein in the solution or the like can be appropriately set according to various conditions such as the type and properties of the substrate protein and the desired deamidation rate.
  • the solution containing the substrate protein is not limited to an aqueous solution, and may be an emulsion with fats and oils.
  • the solution containing the substrate protein may be composed of the substrate protein and a solvent, and may contain other components. Examples of other components include salts, saccharides, proteins, fragrances, humectants, and coloring agents.
  • Reaction conditions are not particularly limited as long as deamidation is achieved to a desired extent.
  • the reaction conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type and purity of protein deamidase, the type and purity of protein, and the desired degree of deamidation.
  • the amount of the enzyme may be, for example, 0.001 to 500 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ U, preferably 0.01 to 100 U, more preferably 0.1 to 10 U with respect to 1 g of the substrate protein.
  • the reaction temperature may be, for example, 5 to 80 ° C, preferably 5 to 40 ° C.
  • the pH of the reaction solution may be, for example, 2 to 10, preferably 4 to 8.
  • the reaction time may be, for example, 10 seconds to 48 hours, preferably 10 minutes to 24 hours.
  • Deamidation can be performed to a desired degree.
  • Deamidation rate (number of deamidated asparagine residues in substrate protein / number of asparagine residues in substrate protein before deamidation) is, for example, 0.1% or more, 1% or more, 5 % Or more, 10% or more, or 20% or more, and 100% or less, 70% or less, or 50% or less.
  • Negative protein charge increases due to protein deamidation.
  • effects such as a decrease in isoelectric point (pI), an increase in hydration power, and an increase in electrostatic repulsion can be brought about.
  • protein deamidation changes the higher-order structure of the protein, and can bring about effects such as increased surface hydrophobicity.
  • These effects can bring about an effect of improving protein functionality, such as improvement of solubility / dispersibility, improvement of foamability / foam stability, and improvement of emulsification / emulsion stability. Proteins with improved functionality in this way, for example, greatly expand their uses in the food field.
  • many vegetable proteins have poor functionality such as solubility, dispersibility, emulsification, etc., particularly under mildly acidic conditions that are the pH range of ordinary foods, so many foods such as coffee whiteners, fruit juices, etc.
  • acid beverages, dressings, mayonnaise, creams, etc. was restricted.
  • functionalities such as solubility, dispersibility, emulsification, etc. are improved by deamidating a protein with a protein deamidase, it can be suitably used for many foods.
  • the mineral sensitivity of the protein is lowered, and the soluble mineral content in the solution containing the protein and the mineral can be increased.
  • the absorbability of calcium in food to the human body is improved by solubilizing calcium with an organic acid or casein phosphopeptide. Therefore, if the soluble mineral content in food and drink is increased by deamidating protein with protein deamidase, the absorbability of minerals such as calcium to the human body can be improved. That is, protein deamidase can also be used as an active ingredient of a calcium absorption promoter, for example.
  • HAP animal protein hydrolyzate
  • HVP vegetable protein hydrolyzate
  • miso soy sauce
  • amide enzyme By deamidation with an amide enzyme, effects such as reduction in bitterness and improvement in the rate of proteolysis by proteases can be brought about.
  • hydrophobic peptides are known to cause bitterness, but deamidation can increase the hydrophilicity of peptides and reduce bitterness.
  • deamidation changes the higher-order structure of a protein, which can increase the protease sensitivity of the protein. That is, for example, by deamidation, it is possible to improve the low decomposition rate, which was one of the problems when enzymatically producing HAP and HVP.
  • the deamidation method of the present invention may be, in other words, a method for modifying a protein including allowing a protein deamidase to act on a protein. It may be a method for producing a modified protein.
  • one aspect of the method may be, for example, a method for modifying a food or drink or a raw material thereof, including causing a protein deamidase to act on a food or drink or a raw material containing the protein.
  • the manufacturing method of the modified food / beverage products or its raw material including making an amide enzyme act on the food / beverage products or the raw material containing protein may be sufficient.
  • protein deamidase may be used in combination with protein glutaminase.
  • Protein glutaminase is an enzyme that catalyzes a reaction to deamidate a glutamine residue in a protein.
  • both the asparagine residue and glutamine residue of the protein can be deamidated without causing a reduction in the molecular weight of the protein. That is, when both enzymes are used in combination, the deamidation rate of the protein further increases, and the isoelectric point (pI) of the protein shifts to the acidic side, so that it is more acidic than the pH range where the protein is inherently insoluble. Further improvements in protein functionality can be provided, such as improved solubility at pH.
  • transglutaminase is an enzyme that catalyzes a reaction of binding a glutamine residue and a lysine residue in a protein to crosslink the protein.
  • the protein By cross-linking, the protein can be gelled and the functionality of the protein can be improved. Therefore, transglutaminase is widely used as a protein modifier in the food field and other industrial purposes.
  • transglutaminase converts glutamine residues, which are substrates of transglutaminase, into glutamate residues when protein deamidation is performed with protein glutaminase. Cross-linking reaction is inhibited.
  • the substrate of the protein deamidase is an asparagine residue
  • transglutaminase and the substrate do not compete with each other, and both protein cross-linking and deamidation can be efficiently carried out in combination with transglutaminase.
  • the type of enzyme used in combination with the protein deamidase can be appropriately selected according to various conditions such as the properties of the protein deamidase.
  • the timing and order of adding each enzyme are not particularly limited. Both enzymes may be added simultaneously or at different times.
  • the reaction conditions (enzyme amount, reaction time, reaction temperature, reaction pH, etc.) are not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • the reaction conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type of other enzyme.
  • the amount of protein glutaminase used may be preferably 0.001 to 100 ⁇ U per 1 ⁇ g of substrate protein.
  • the amount of transglutaminase used may be preferably 0.001 to 100 ⁇ U per 1 ⁇ g of substrate protein.
  • protein deamidase can also be used as a protein engineering reagent for protein functional modification.
  • the substrate protein is an enzyme
  • the enzyme chemical properties and physicochemical properties of the enzyme can be modified.
  • the isoelectric point of the enzyme protein is lowered, and the pH stability can be modified.
  • the properties of the enzyme protein such as substrate affinity, substrate specificity, reaction rate, pH dependency, temperature dependency, temperature stability, etc. are modified. can do.
  • the protein deamidase can also be used as a protein analysis and research reagent, such as a protein amide content quantification reagent and a protein solubilization reagent.
  • protein deamidase can be used to improve the extraction efficiency and concentration efficiency of cereal and legume proteins.
  • many proteins of cereals and beans such as wheat and soybeans are insoluble in water, and it is not easy to extract these proteins.
  • a wheat flour or soybean flour suspension with a protein deamidase to increase the solubility of the protein, the protein can be easily extracted, and a high content protein isolate is obtained. be able to.
  • protein deamidase can be used to improve the extraction efficiency of animal proteins.
  • gelatin is industrially produced mainly from cow bone, cow skin, and pig skin.
  • pretreatment with inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid (acid treatment) or pretreatment with lime (alkali treatment) is carried out. It takes.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid (acid treatment) or pretreatment with lime (alkali treatment) is carried out. It takes.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid
  • lime alkali treatment
  • the protein with improved functionality obtained in this way has an excellent effect when used in various foods such as livestock meat, fish products, and noodles, and it can be possible to produce foods having new textures and functions. .
  • Example 1 Screening for protein asparaginase-producing bacteria by enrichment culture
  • a soil sample was inoculated into Medium A (below) containing Cbz-Asn-Gly (Peptide Institute) as the sole nitrogen source and cultured with shaking for 5 days.
  • the culture solution was applied to a plate agar medium of Toryptic soy medium (Difco), and grown colonies were selected and obtained.
  • the obtained colonies were applied to two types of agar medium (containing and not containing Cbz-Asn-Gly 0.3%) similar to the A medium, and strains showing significant differences in growth depending on the presence or absence of Cbz-Asn-Gly were selected. .
  • Example 2 Purification of protein asparaginase derived from Luteimicrobium album From the microorganism obtained in Example 1, Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650) was selected, and the following experiment was performed. went.
  • Medium B (below) was inoculated with Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution.
  • Medium B Yeast Carbon Base dissolved in distilled water (2.34%) and filter sterilized were mixed with autoclaved (121 ° C, 20 minutes) 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) solution in equal amounts. The pH of the medium was adjusted to 7.2.
  • the above culture broth was removed by centrifugation at 4 ° C., 8000 rpm for 15 minutes, and the resulting supernatant was concentrated approximately 25 times with an ultrafiltration membrane (manufactured by Sartorius), followed by Stericup 0.22 Filtered with ⁇ m (Millipore).
  • the filtrate was applied to a column for hydrophobic chromatography Hiprep Octyl FF 16/16 (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.0 M sodium sulfate. 1.0 M to 0 M
  • the adsorbed protein was eluted with a linear sodium sulfate gradient.
  • the active fractions were collected, buffer-exchanged to 20 ⁇ ⁇ mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and equilibrated with the same buffer solution to Hiprep DEAE FF 10/16 (GE Healthcare) And the adsorbed protein was eluted with a linear sodium chloride gradient from 0 to 0.5 M sodium chloride.
  • the active fractions were collected again, and after the same buffer exchange to 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), it was applied to an anion exchange chromatography column Hiprep DEAE FF 10/16 equilibrated with the same buffer.
  • Adsorbed protein was eluted with a linear sodium chloride gradient from M to 0.5 M.
  • the active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane and applied to a gel filtration chromatography column SuperdexTM 200TM10 / 300 equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride. Eluted.
  • the purification table is shown in Table 2.
  • the active fraction was mixed with a reducing agent-containing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sample buffer, heat treated, and then 7.5% homogeneous polyacrylamide gel (Ato, e-PAGEL, E-T7.5L) Electrophoresis was performed, and the gel after electrophoresis was stained with Coomassie brilliant blue. The results are shown in FIG.
  • the protein asparaginase activity was measured by the following procedure using Cbz-Asn-Gly as a substrate.
  • the protein was quantified by the Bradford method using bovine serum albumin as a standard protein.
  • Activity measurement method Add 25 ⁇ L of enzyme solution to 125 ⁇ L of 0.2 mol / L phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 mmol / L Cbz-Asn-Gly, incubate at 37 ° C. for 60 minutes, then 12% trichloro The reaction was stopped by adding 150 ⁇ L of acetic acid solution.
  • the ammonia concentration of the supernatant was measured using F-kit ammonia (manufactured by Boehringer Mannheim) to calculate the protein asparaginase activity.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute was defined as 1 unit (U) of protein asparaginase activity.
  • Example 3 Determination of N-terminal amino acid sequence of protein asparaginase derived from Luteimicrobium album
  • the purified protein asparaginase obtained in Example 2 was subjected to a protein sequencer (Shimadzu PPSQ-21A), and a 5-residue N-terminal amino acid. The sequence was determined.
  • the N-terminal amino acid sequence of protein asparaginase in Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650) was Ala-Val-Thr-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1).
  • Example 4 Determination of full-length amino acid sequence of protein asparaginase derived from Luteimicrobium album
  • the full-length amino acid sequence of protein asparaginase is identified from LC-MS / MS data using the genome sequence obtained by the next-generation sequencer as a database. Determined using the technique to be performed. That is, Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650) was cultured on Tryptic soy agar medium at 30 ° C for 24 hours, genomic DNA was extracted from the grown cells, and the base sequence was extracted with Miseq (Illumina). Acquired.
  • the purified protein asparaginase obtained in Example 2 was subjected to SDS-PAGE, and the target band was excised and digested with trypsin.
  • the digested fragment was subjected to LC-MS / MS analysis to obtain a partial amino acid sequence of the enzyme.
  • the genomic sequence information obtained by the above method the partial amino acid sequence, and the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 1), the protein asparaginase of luteumobium album AJ111072 (NITE P-01650) including the prepro region
  • the amino acid sequence 1355 residues (SEQ ID NO: 2) and the full-length base sequence (SEQ ID NO: 3) of the gene encoding the enzyme were obtained.
  • Example 5 Deamidation of protein with protein asparaginase derived from Luteimicrobium album Insulin B chain (Sigma) was dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer to a concentration of 2.5 mg / ml to obtain a substrate solution. To 45 ⁇ L of the substrate solution, 45 ⁇ L of a protein asparaginase solution (approximately 0.3 U / ml) of Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650) or 45 ⁇ L of water as a control was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 10 ⁇ L of 1 N hydrochloric acid was added to stop the reaction.
  • a protein asparaginase solution approximately 0.3 U / ml
  • Luteimicrobium album AJ111072 NITE P-01650
  • the N-terminal sequence of the insulin B chain in the control group was Phe-Val-Asn-Gln-. Therefore, it was proved by this enzyme that asparagine at the third residue from the N-terminus of the insulin B chain was converted to aspartic acid by deamidation. On the other hand, there was no change in glutamine at the fourth residue from the N-terminus.
  • skim milk powder solution (Yotsuba Milk Industry, low heat type) was dissolved in the same buffer.
  • 10 ⁇ L of protein asparaginase solution (approximately 5 ⁇ U / ml) of Luteimicrobium album AJ111072 (NITENP-01650) was added, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then 12% trichloroacetic acid 100 ⁇ L was added to stop the reaction.
  • the reaction solution was centrifuged, and ammonia in the centrifuged supernatant was quantified with an ammonia measurement F kit (Roche).
  • Example 6 Modification of protein properties by protein asparaginase derived from lutemicrobium album Casein sodium (Nippon Shinyaku, trade name: miprodan) was added to 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) to 2% w / v. Dissolved to give a substrate solution. To 500 ⁇ L of this substrate solution, 25 ⁇ L of protein asparaginase solution (0.68 U / ml or 2.7 U / ml) of Luteimicrobium album AJ111072 (NITE P-01650) was added, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then 100 ° C. The enzyme was inactivated by treatment for 5 minutes.
  • protein asparaginase derived from lutemicrobium album Casein sodium (Nippon Shinyaku, trade name: miprodan) was added to 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) to 2% w / v. Dissolved to give a substrate solution.
  • test group 1 The group to which the 0.68 U / ml enzyme solution was added was designated as test group 1, and the group to which the 2.7 U / ml enzyme solution was added was designated as test group 2.
  • test group 2 25 ⁇ L of water was added instead of the enzyme solution, and the same treatment was performed (control group).
  • control group 25 ⁇ L of water was added instead of the enzyme solution, and the same treatment was performed (control group).
  • the amount of ammonia released when 0.68 U / ml and 2.7 U / ml enzyme solution was added was 1.0 mM and 1.3 mM, respectively.
  • the results of isoelectric focusing (IEF) for these samples are shown in FIG. In each of the samples to which this enzyme was added (test groups 1 and 2), the isoelectric point (pI) was shifted to the acidic side as compared to the control group, and it was confirmed that the protein pI was reduced by deamidation.
  • solubility was investigated with the following method. 200 ⁇ L of each pH buffer (described below) was added to 5 ⁇ L of the sample, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, centrifuged at 15,000 rpm for 5 min, and the protein concentration in the supernatant was quantified by the Bradford method. The relative value when the pH 9.0 protein concentration in the control group was taken as 100% was calculated as solubility, and the results are shown in FIG. In test group 2 to which the present enzyme was added, the solubility increased particularly in the vicinity of pH 5.0 as compared with the control group, and it was confirmed that the protein was improved by deamidation. pH buffer: acetate buffer (pH 4 to 6.0), phosphate buffer (pH 6.0 to 7.5), Tris hydrochloric acid buffer (pH 7.5 to 9.0); all concentrations are 0.2M.
  • Transglutaminase is an enzyme that forms an isopeptide bond between glutamine and lysine residues in a protein and crosslinks the protein. Since both transglutaminase and protein glutaminase use glutamine in the protein as a substrate, there is a problem that the reaction competes when they are used in combination. On the other hand, since the protein asparaginase of the present invention uses asparagine in the protein as a substrate, it does not compete with transglutaminase, and therefore, it is possible to obtain both deamidation effect and crosslinking effect by using them together. it can.
  • transglutaminase a purified product from Activa (registered trademark) TG bulk powder was used, and as the protein glutaminase, a purified product prepared by the method described in WO2006 / 075771 was used.
  • Activa registered trademark
  • protein glutaminase a purified product prepared by the method described in WO2006 / 075771 was used.
  • 25 ⁇ L of protein glutaminase (10 U / ml) was added to 500 ⁇ L of 2% sodium caseinate solution, and the enzyme was inactivated by treatment at 37 ° C. for 1 hour and then at 100 ° C. for 5 minutes. (Comparison zone).
  • transglutaminase was added per 1 g of casein, reacted at 37 ° C for 100 minutes, and then inactivated by treatment at 95 ° C for 5 minutes. Each reaction solution was subjected to SDS-PAGE, and the molecular weight change of casein was examined. The results are shown in FIG. In the comparative group (protein glutaminase-treated casein), cross-linking by transglutaminase was suppressed, whereas in test group 2 (protein asparaginase-treated casein), formation of a cross-linked product was confirmed in the same manner as in the control group. Therefore, it was suggested that by using transglutaminase and protein asparaginase in combination, enhancement of physical properties by cross-linking and improvement of functions such as solubility by deamidation can be expected.
  • Example 7 Analysis of protein asparaginase derived from Leifsonia xyley Leifsonia xyli AJ111071 (NITE P-01649) was selected from the microorganisms obtained in Example 1, and the following experiment was performed.
  • Medium C (below) was inoculated with Reifsonia xyly AJ111071 (NITE P-01649) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution.
  • Medium C 1.17% Yeast Carbon Base dissolved in distilled water and then filter sterilized, and autoclaved (121 ° C., 20 minutes) 1% sodium caseinate (Wako Pure Chemicals) solution were mixed in equal amounts. The pH of the medium was adjusted to 7.2.
  • the protein asparaginase activity in the supernatant was 0.029 ⁇ U / ml.
  • the reaction was stopped by adding 200 ⁇ l of 12% TCA.
  • a mixture in which 12% TCA was added and then the supernatant was added was prepared in the same manner. Ammonia quantification was performed, and the value of the control group was subtracted from the amount of ammonia in the reaction solution after 3 hours of reaction. It was.
  • FIG. 5 shows the results of HPLC analysis of the reaction solutions reacted at 37 ° C. for 2 hours and 8 hours, respectively.
  • reaction for 2 hours peaks of both unreacted substrate and reaction product were observed, and in the case of reaction for 8 hours, all were converted into reaction products.
  • reaction solution after 8 hours of reaction was subjected to a protein sequencer, it was confirmed that the third residue asparagine from the N-terminal sequence of the insulin B chain was converted to aspartic acid by deamidation. Note that there was no change in the fourth residue glutamine from the N-terminus.
  • Example 8 Analysis of protein asparaginase derived from one species of the genus Agromyces (1) From the microorganism obtained in Example 1, one species of the genus Agromyces (Agromyces sp.) AJ111073 (NITE BP-01782) was selected, and experiments were conducted in the same manner as in Examples 2-4. That is, protein asparaginase was purified from the culture solution of one species of Agromyces genus AJ111073 (NITE BP-01782) and subjected to SDS-PAGE. After cutting out the target band, trypsin digestion was performed, and the peptide was fractionated from the tryptic digest of the enzyme and subjected to a protein sequencer (Shimadzu PPSQ-21A).
  • a protein sequencer Shiadzu PPSQ-21A
  • the internal amino acid sequence of 12 residues shown in SEQ ID NO: 4 (Ala-Arg-Gly-Gln-Leu-Ile-Leu-Asp-Thr-Leu-Thr-Met) was determined.
  • a gene encoding the amino acid of SEQ ID NO: 4 was searched.
  • the amino acid sequence 1180 residues (SEQ ID NO: 5) of the protein asparaginase of AJ111073 (NITE BP-01782) and the full-length base sequence (SEQ ID NO: 6) of the gene encoding the enzyme were obtained.
  • Example 9 Analysis of protein asparaginase derived from one species of the genus Agromyces (2) ⁇ 1> Purification of protein asparaginase derived from one species of the genus Agromyces From the microorganisms obtained in Example 1, one species of the genus Agromyces (Agromyces sp.) AJ111073 (NITE BP-01782) was selected and the following experiment was performed. .
  • Culture Medium C (below) was inoculated with one Agromyces genus AJ111073 (NITE BP-01782) and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution.
  • Medium C 1.17% Yeast Carbon Base dissolved in distilled water and then filter sterilized, and autoclaved (121 ° C., 20 minutes) 1% tryptone peptone (Difco) solution were mixed in equal amounts. The pH of the medium was adjusted to 7.2.
  • Bacillus subtilis culture supernatant Bacillus subtilis subsp.
  • Subtilis T JCM1465 was inoculated into the above-mentioned medium C, and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution.
  • the resulting culture was centrifuged at 4 ° C. and 8,000 rpm for 15 minutes to remove the cells and filtered through Stericup 0.22 ⁇ m (Millipore) to obtain a culture supernatant.
  • the adsorbed protein was eluted by a linear gradient of NaCl from 2.0 M to 0 M, and the active fractions were collected and buffer-exchanged to 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0).
  • the adsorbed protein was eluted with a sodium chloride linear concentration gradient from 0 M to 0.5 M using an anion exchange chromatography column Hiprep DEAE FF 10/16 (GE Healthcare) equilibrated with the same buffer.
  • the purification table is shown in Table 4.
  • the active fraction is mixed with a reducing agent-containing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sample buffer, heat treated, electrophoresed with 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, NuPAGE), and gel after electrophoresis Was stained with SimplyBlue SafeStain (manufactured by Invitrogen).
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the results are shown in FIG. Judging from the size of the activity and the density of the band, the molecular weight of the protein asparaginase of AJ111073 (NITE BP-01782), a species of the genus Agromyces, was found to be about 120,000.
  • asparaginase activity acting on free asparagine and protease activity degrading protein were not detected.
  • the sequence containing number 4 was confirmed.
  • the purified protein asparaginase obtained above was subjected to a protein sequencer (PPSQ-21A, Shimadzu Corporation), and the N-terminal amino acid sequence of 5 residues was determined.
  • the N-terminal amino acid sequence of the protein asparaginase (mature protein) of one species of Agromyces AJ111073 (NITE BP-01782) was Ala-Ala-Thr-Glu-Asp (SEQ ID NO: 12).
  • Example 10 Activation of protein asparaginase precursor by processing From the microorganisms obtained in Example 1, Agromyces sp. AJ111073 (NITE BP-01782) was selected and the protein asparaginase in the culture broth We examined a processing enzyme that converts a precursor into a mature form.
  • the culture supernatant of Bacillus subtilis (below) can be added to the culture solution of Agromyces genus AJ111073 (NITE BP-01782) in an amount of 10% v / v and left at room temperature for 30 minutes. An activation effect was obtained (Table 5).
  • Bacillus subtilis culture supernatant Bacillus subtilis subsp.
  • Subtilis T JCM1465 was inoculated into the above-mentioned medium C, and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours to obtain a culture solution. The resulting culture was centrifuged at 4 ° C. and 8,000 rpm for 15 minutes to remove the cells and filtered through Stericup 0.22 ⁇ m (Millipore) to obtain a culture supernatant.
  • N-terminal amino acid sequence of the protein asparaginase precursor of one Agromyces genus AJ111073 was determined to be VPEHGVIASGD (SEQ ID NO: 13), and the mature N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) It was found to be located 114 residues upstream.
  • Example 11 Modification of gelatin with protein asparaginase derived from one species of the genus Agromyces
  • a 5% wt aqueous solution (adjusted to pH 7.0) of pig-derived acid gelatin (manufactured by Nitta Gelatin) was prepared.
  • 1 U, 2 U, or 10 U of protein asparaginase of 1 type AJ111073 (NITE BP-01782) belonging to the genus Agromyces was added to the aqueous solution and treated at 37 ° C. for 2 hours.
  • a solution treated in the same manner with water added instead of the enzyme was prepared.
  • the sample after completion of the reaction was diluted 50 times with water, and the isoelectric point (pI) was examined using a zeta electrometer (Malvern: Zetasizer Nano ZS) with an automatic titrator (MPT-2). It is shown in FIG. As the amount of enzyme added increased, the isoelectric point of gelatin decreased and gelatin with different surface charges could be produced. Thus, by using the protein asparaginase of the present invention, it is possible to control the surface charge that is important in the functional expression of gelatin protein.
  • test group A and test group B The group in which acid gelatin and alkali gelatin were treated with enzyme were designated as test group A and test group B, respectively.
  • water was added instead of the enzyme and the same treatment was carried out to obtain a control group A and a control group B, respectively.
  • these samples were diluted 50-fold with water, and the isoelectric points (pI) were examined in the same manner as described above.
  • the pIs of the control groups A and B were 8.98 and 5.03, respectively.
  • the pIs of test sections A and B were 4.85 and 4.81, respectively, and it was confirmed that pI was shifted to the acidic side.
  • test group A the enzyme-treated acid gelatin (test group A) caused a significant change in pI, indicating that the electrical properties of gelatin were greatly changed.
  • pI enzyme-treated alkaline gelatin
  • test group A and test group B The group treated with the enzyme treatment of acid gelatin and alkali gelatin was designated as test group A and test group B, respectively.
  • test group A and test group B As a control, water was added instead of the enzyme and the same treatment was carried out to obtain a control group A and a control group B, respectively.
  • pI isoelectric point
  • the pI of the control sections A and B were 8.63 and 5.25, respectively.
  • the pIs of Test Zones A and B were 4.59 and 4.61, respectively, confirming that pI was shifted to the acidic side.
  • test group A the enzyme-treated acid gelatin (test group A) caused a significant change in pI, indicating that the electrical properties of gelatin were greatly changed.
  • pI enzyme-treated alkaline gelatin
  • protein asparaginase can be expected to increase the quality and added value of gelatin widely used in food, medical and industrial applications.
  • Example 12 Heterologous expression of protein asparaginase ⁇ 1> Secretion expression of protein asparaginase derived from one species of Agromyces by Corynebacterium glutamicum ⁇ 1-1> Construction of secretory expression plasmid of protein asparaginase When protein asparaginase is heterologously expressed, Expression of protein asparaginase in a form having a sequence on the N-terminal side may contribute to structural stabilization of protein asparaginase. When expressing a target protein in a fused form with an amino acid sequence other than the target protein, a specific protease recognition sequence having a high substrate specificity is placed between the amino acid sequence of the target protein and the fused amino acid sequence.
  • the target fusion protein is easily obtained by cleaving the expressed fusion protein with a specific protease.
  • the recognition sequence (IEGR) of the Factor Xa protease or the ProTEV protease between the base sequence encoding the protein sequence amino acid residue of the protein asparaginase and the base sequence encoding the mature protein asparaginase By constructing a pro-sequence fusion protein asparaginase gene into which a base sequence encoding the recognition sequence (ENLYFQ) is inserted and expressing the pro-sequence fusion protein asparaginase, using these proteases, the pro-sequence fusion protein asparaginase can be easily produced from the pro-sequence fusion protein asparaginase. It is possible to remove the sequence and obtain the mature protein asparaginase.
  • a CspB promoter region was placed immediately before the DNA sequence (SEQ ID NO: 16), and a DNA sequence (SEQ ID NO: 18) with a restriction enzyme KpnI on the 5 'side and a recognition sequence for BamHI on the 3' side was synthesized as an artificial gene.
  • the plasmid was synthesized by the method and cloned into a plasmid vector pPK4 (Corynebacterium-E.coli shuttle vector carrying a kanamycin resistance gene; JP-A-9-322774).
  • the synthesized DNA sequence (SEQ ID NO: 18) and pPK4 were simultaneously cleaved at two sites with restriction enzymes KpnI and BamHI, both DNA fragments were ligated, and a competent cell of Escherichia coli JM109 strain (manufactured by TaKaRa) was obtained.
  • the cells were transformed, spread on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, and cultured at 37 ° C. overnight. Thereafter, a single colony was separated from the appearing colonies to obtain transformants. Plasmid DNA was extracted from the obtained transformant by a conventional method, the target plasmid was confirmed by DNA sequencing, and this was named pPK4-Pro-TEV-PA.
  • C. glutamicum YDK010 strain (WO2004 / 029254) was transformed with pPK4-Pro-TEV-PA, and YDK010 / pPK4 -Pro-TEV-PA strain was obtained.
  • the C. glutamicum YDK010 strain is a cell surface protein PS2 (CspB) -deficient strain of C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) (WO2004 / 029254).
  • AJ12036 was established on March 26, 1984, by the Institute of Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Biological Deposit Center, Postal Code: 292-0818, Address: Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Kazusa Kamashika 2-5-8 Room 120) was deposited as an international deposit and was given the deposit number FERM BP-734.
  • YDK010 / pPK4-Pro-TEV-PA strain was added to MM liquid medium (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, iron sulfate heptahydrate containing 25 mg / l kanamycin. Hydrate 0.03g, manganese sulfate tetrahydrate 0.03g, thiamine hydrochloride 0.45mg, biotin 0.45mg, DL-methionine 0.15g, and calcium carbonate 50g adjusted to pH 7.0 with water to 30 ° C And cultured for 72 hours.
  • this fusion protein has a ProTEV recognition sequence at the junction between the pro sequence and the mature protein asparaginase, mature protein asparaginase can be obtained by cleaving this fusion protein with ProTEV. Therefore, the fusion protein in the crude enzyme solution (culture supernatant) was cleaved with ProTEV to process it into mature protein asparaginase, and it was examined whether protein asparaginase activity was observed.
  • the crude enzyme solution (culture supernatant) obtained as described above was concentrated about 9 times using Vivaspin 10,000 MWCO (manufactured by GE Healthcare) and processed by ProTEV.
  • pCold TF DNA is a cold shock expression vector designed to express a target gene in a form in which the target protein is fused to a target protein using a trigger factor (TF), a chaperone, as a solubilizing tag. It is. Cloning was performed by the following procedure using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). Amplification of the pCold TF DNA fragment was performed by PCR using pCold TF DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22.
  • Amplification of the DNA fragment for cloning encoding the fusion protein was performed by PCR using the synthesized DNA sequence (SEQ ID NO: 19) as a template and primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • Prime STAR GXL (TOYOBO) was used as the polymerase.
  • PCR was performed 30 cycles of “98 ° C.-10 seconds, 60 ° C.-15 seconds, 68 ° C.-60 seconds”.
  • the amplified fragments were ligated by In-Fusion reaction, E. coli JM109 strain was transformed with the reaction product, spread on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight.
  • a strain having an asparaginase (proPA_Agro) expression plasmid (named pCTF-proPA_Agro) was obtained.
  • PCTF-proPA_Agro was extracted from the obtained strain using a plasmid extraction kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • pCTF-proPA_Agro was used to transform E. coli Rosetta2 strain (Novagen) to produce proPA_Agro expression strain E. coli Rosetta2 / pCTF-proPA_Agro. This expression strain was cultured overnight at 37 ° C. in LB agar medium (Difco) supplemented with ampicillin to a final concentration of 100 ⁇ g / ml, and seed culture was performed.
  • - ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added and the culture temperature was lowered to 15 ° C. to induce transcription of pCTF-proPA_Agro from the cspA promoter (cold induction). After culturing at 15 ° C. for 24 hours, the cells were collected by centrifugation. As a control, the cells just before the low temperature induction were collected in the same manner.
  • the molecular weight of the TF-proPA_Agro fusion protein which is the target protein in this expression experiment, is estimated to be about 176 kDa.
  • this fusion protein has the protease ProTEV cleavage recognition site (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln) at the junction between the pro sequence and mature PA, this fusion protein is cleaved with ProTEV (Novagen) By doing so, you can get mature PA. Therefore, the PA in the crude extract after induction at low temperature was cleaved with ProTEV to process it into mature PA, and examined whether PA activity was observed.
  • the crude enzyme solution obtained as described above was concentrated about 20 times using Vivaspin 10,000 MWCO (GE Healthcare) and processed with ProTEV. When PA activity was measured using the concentrated crude enzyme solution after ProTEV treatment, it was 0.069 U / ml. From the above results, E. coli was able to express bacterial asparaginase derived from one species of the genus Agromyces.
  • Example 12 Unless otherwise specified, the experimental procedure is the same as that of Example 12 ⁇ 2-1>.
  • Amplification of the pCold TF DNA fragment was performed by PCR using pCold TF DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22.
  • Amplification of the DNA fragment for cloning encoding the fusion protein was performed by PCR using the synthesized DNA sequence (SEQ ID NO: 25) as a template and primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28.
  • the amplified fragments were ligated by In-Fusion reaction, and E. coli JM109 strain was transformed with the reaction product.
  • Plasmid extraction was performed from the obtained strain, transformation of E.coli Rosetta2 strain (Novagen), cultivation of proPA_Leif expression strain, and preparation of a crude extract were performed.
  • the crude extract was subjected to electrophoresis, as shown in FIG. 12, a remarkable protein band was observed in the vicinity of the target molecular weight of 159 kDa in the sample after low temperature induction as compared with that before low temperature induction with the expression plasmid. It was done.
  • the molecular weight of the TF-proPA_Leif fusion protein which is the target protein in this expression experiment, is estimated to be about 159 kDa.
  • this fusion protein has the protease ProTEV cleavage recognition site (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln) at the junction between the pro sequence and mature PA, this fusion protein is cleaved with ProTEV (Novagen) By doing so, you can get mature PA. Therefore, the PA in the crude extract after induction at low temperature was cleaved with ProTEV to process it into mature PA, and examined whether PA activity was observed.
  • the crude enzyme solution was concentrated about 20 times using Vivaspin 10,000 MWCO (GE Healthcare) and treated with ProTEV for 2 hours to cleave the pro sequence. When the PA activity was measured using the concentrated crude enzyme solution after ProTEV treatment, it was 0.047 U / ml. From the above results, the protein asparaginase derived from Leifsonia xyli could be expressed in cells by E. coli.
  • Example 12 Unless otherwise specified, the experimental procedure is the same as that of Example 12 ⁇ 2-1>.
  • Amplification of the pCold TF DNA fragment was performed by PCR using pCold TF DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23.
  • Amplification of the DNA fragment encoding the fusion protein was performed by PCR using the synthesized DNA sequence (SEQ ID NO: 29) as a template and the primers of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32.
  • the amplified fragments were ligated by In-Fusion reaction, and E. coli JM109 strain was transformed with the reaction product.
  • Plasmid extraction was performed from the obtained strain, transformation of E.coli Rosetta2 strain (Novagen), cultivation of proPA_Micro expression strain, and preparation of a crude extract were performed.
  • the crude extract was subjected to electrophoresis, as shown in FIG. 12, a remarkable protein band was observed in the vicinity of the target molecular weight of 174 kDa in the sample after low temperature induction as compared with that before low temperature induction with the expression plasmid. It was done.
  • the molecular weight of the TF-proPA_Micro fusion protein which is the target protein in this expression experiment, is estimated to be about 174 kDa.
  • this fusion protein has the protease ProTEV cleavage recognition site (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln) at the junction between the pro sequence and mature PA, this fusion protein is cleaved with ProTEV (Novagen) By doing so, you can get mature PA. Therefore, the PA in the crude extract after induction at low temperature was cleaved with ProTEV to process it into mature PA, and examined whether PA activity was observed.
  • the crude enzyme solution was concentrated about 20 times using Vivaspin 10,000 MWCO (GE Healthcare) and treated with ProTEV for 2 hours to cleave the pro sequence. When PA activity was measured using the concentrated crude enzyme solution after ProTEV treatment, it was 0.022 U / ml. From the above results, protein asparaginase derived from Microbacterium testaceum could be expressed in cells by E. coli.
  • the present invention provides a novel protein deamidase (protein asparaginase) that catalyzes a reaction for deamidating an asparagine residue in a protein.
  • the enzyme can be used to deamidate asparagine residues in proteins to improve protein functionality.
  • SEQ ID NO: 1 N-terminal amino acid sequence of protein asparaginase derived from Luteimicrobium album (5 residues)
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of protein asparaginase derived from Luteimicrobium album (including prepro region)
  • SEQ ID NO: 3 Full length nucleotide sequence of protein asparaginase gene derived from Luteimicrobium album
  • SEQ ID NO: 4 Internal amino acid sequence of protein asparaginase derived from Agromyces sp. (12 residues)
  • SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of protein asparaginase derived from Agromyces sp.
  • SEQ ID NO: 6 Full length of the protein asparaginase gene derived from Agromyces sp.
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of protein asparaginase derived from Microbacterium testaceum
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of protein asparaginase derived from Leifsonia xyli
  • SEQ ID NO: 9 derived from Leifsonia aquatica
  • Amino acid sequence of protein asparaginase SEQ ID NO: 10: consensus amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 and 5
  • SEQ ID NO: 11 consensus amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 5, 7, and 8
  • SEQ ID NO: 12 mature protein of protein asparaginase from Agromyces sp.
  • SEQ ID NO: 13 N-terminal amino acid sequence (11 residues) of a precursor (proprotein) of protein asparaginase derived from Agromyces sp.
  • SEQ ID NO: 14 Recognition sequence of Factor Xa protease
  • SEQ ID NO: 15 Recognition sequence of ProTEV protease
  • SEQ ID NO: 16 Nucleotide sequence SEQ ID NO: 17 encoding a prosequence fusion protein asparaginase derived from Agromyces sp.
  • glutamicum Amino acid sequence of prosequence fusion protein asparaginase derived from Agromyces sp.
  • glutamicum SEQ ID NO: 18 Insertion fragment containing a gene encoding prosequence fusion protein asparaginase derived from Agromyces sp. For secretion expression by C. glutamicum SEQ ID NO: 19: Agromyces sp. Derived prosequence fusion protein asparaginase for gene expression in bacterial cells by E. coli SEQ ID NO: 20: Agromyces sp. Derived pro for gene expression in bacterial cells by E. coli Amino acid sequence number of sequence fusion protein asparaginase No.
  • Primer SEQ ID NO: 25 Base sequence of gene encoding pro sequence fusion protein asparaginase derived from Leifsonia xyli for intracellular expression by E. coli SEQ ID NO: 26: Leifsonia xyli for intracellular expression by E. coli Amino acid sequences of pro sequence fusion protein asparaginase SEQ ID NO: 27, 28: primer SEQ ID NO: 29: base sequence of gene encoding pro sequence fusion protein asparaginase derived from Microbacterium testaceum for intracellular expression by E. coli SEQ ID NO: 30: E. coli Amino acid sequence of Probacterium fusion protein asparaginase derived from Microbacterium testaceum for intracellular expression by SEQ ID NOs: 31 and 32: primers

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Abstract

タンパク質中のアスパラギン残基の側鎖アミド基に直接作用して、側鎖カルボキシル基とアンモニアを遊離する作用を有する新規タンパク質脱アミド酵素、それを生産する微生物、それをコードする遺伝子、その製造法及び用途を提供する。アクチノバクテリア綱に分類される細菌を培養し、タンパク質脱アミド酵素を生産せしめ、培養物より該酵素を採取する。

Description

新規タンパク質脱アミド酵素
　本発明は、新規タンパク質脱アミド酵素、同酵素をコードするポリヌクレオチド、同ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、同ベクターが導入された形質転換体、同酵素の製造法、および同酵素を利用したタンパク質の脱アミド化法に関するものである。
　タンパク質の脱アミド化は、タンパク質の様々な機能特性の向上をもたらす（非特許文献１）。そのため、タンパク質の脱アミド化により、タンパク質の用途が拡大すると期待される。タンパク質を構成するアミノ酸の内、アミド基を有するのはグルタミン及びアスパラギンである。これらは脱アミド化によりそれぞれグルタミン酸及びアスパラギン酸に変換される。脱アミド化によりタンパク質の負電荷が増加し、等電点が低下する。これにより、タンパク質の可溶性、水分散性が大きく増大する。また、静電反発力の増加に伴い、タンパク質間の相互作用すなわち会合性が低下する。また、タンパク質の三次構造がほぐれ、高次構造が変化し、分子内部に埋まっている疎水性領域が分子表面に露出するため、脱アミド化タンパク質は両親媒性を有するようになり、タンパク質の乳化力、乳化安定性、起泡性、泡沫安定性が向上することが知られている。
　タンパク質の脱アミド化手法は、化学的手法と酵素的手法に分けられる。化学的脱アミド化手法としては、温和な酸またはアルカリ処理による方法が多数報告されている。しかしながら、いずれも非特異的反応であること、酸やアルカリ条件下ではペプチド結合の切断も伴うこと、予期せぬ副生成物を生じること等が問題となる。また化学物質を用いるための設備が必要であり、環境面での負荷も大きいことが課題である。このような化学的手法の問題点を克服できるのが酵素的手法である。酵素的脱アミド化手法としては、例えば、プロテイングルタミナーゼを用いる方法（特許文献１～２、非特許文献２）、プロテアーゼを用いる方法（非特許文献３～４）、トランスグルタミナーゼを用いる方法（非特許文献５）、ペプチドグルタミナーゼを用いる方法（非特許文献６～７）等の方法が報告されている。
　これらの中で、副反応を伴わず、高分子のタンパク質に対して脱アミド化反応を触媒できるのはプロテイングルタミナーゼのみである。プロテアーゼ、トランスグルタミナーゼでは、それぞれペプチド結合の切断、グルタミンとリジン間でのイソペプチド結合の形成による架橋反応が主反応であること、ペプチドグルタミナーゼは低分子化されたペプチドの脱アミド化を専ら触媒する酵素であることから、いずれも課題がある。プロテイングルタミナーゼは、高分子のタンパク質に対する高い脱アミド化能を有する酵素として実用性が高いと考えられる。既に、プロテイングルタミナーゼによる、小麦タンパク質、乳タンパク質（カゼインや乳清タンパク質）や大豆タンパク質の機能向上に関する知見がある（非特許文献８～１１）。食品実系においても、プロテイングルタミナーゼによる、例えば、ヨーグルト、アイスクリーム、コーヒーホワイトナー、麺類、畜肉類等の品質向上に関する特許知見も報告されている（特許文献３～７）。ただし、このプロテイングルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基を基質とするものであり、アスパラギン残基には全く作用しないことが明記されており（非特許文献２、非特許文献１２）、処理効果には限界がある。事実、植物、動物タンパク質を構成するアミノ酸には、アスパラギンが多く含まれており、脱アミド化による更なる機能改質効果を得るには、グルタミンだけでなくアスパラギンも脱アミドすることが好ましい。
　アスパラギナーゼ（EC 番号：3.5.1.1）は、アスパラギンのアスパラギン酸への加水分解を触媒する酵素として広く知られている。しかし、アスパラギナーゼは遊離のアスパラギンに特異的に作用する酵素であり、ペプチド或いは分子量の大きなタンパク質中のアスパラギン残基を脱アミドすることはできない。また、フリーのα－アミノ基を有するＮ末アスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する酵素が知られている（非特許文献１３）。しかし、同酵素は、Ｎ末アスパラギン残基以外の、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化することはできない。
　以上の通り、タンパク質中のアスパラギン残基（フリーのα－アミノ基を有するＮ末アスパラギン残基以外）を脱アミド化する酵素は知られていない。
特開２００１－２１８５９０ 特開２００５－０５２１５８ ＷＯ２０１１／０２４９９４ ＵＳ２０１３－２２７１０ ＷＯ２０１１／１０８６３３ 特開２００９－２１９４１９ ＷＯ２００６／０７５７７１
Hamada J. S. 1994. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 34, 283. Yamaguchi S, Jeenes DJ and Archer DB. 2001. Eur. J. Biochem. 268(5), 1410. Kato A., Tanaka A., Matsudomi N., Kobayashi K. 1987. J. Agric. Food Chem., 35, 224. Kato, A., Tanaka, A., Lee, Y., Matsudomi, N. & Kobayashi, K. 1987 J. Agric. Food Chem. 35, 285. Motoki M., Seguro K., Nio N., Takinami K. 1986. Agric. Biol. Chem., 50, 3025-3030. Hamada J. S., Marshall W. E. 1989. J. Food. Sci., 54, 598-601, 635. Hamada J. S., Marshall W. E. 1988. J. Food. Sci., 53, 1132-1134, 1149. Suppavorasatit I., De Mejia E. G., Cadwallader K. R. 2011. J. Agric. Food Chem., 59, 11621. Yong Y. H., Yamaguchi S., Matsumura Y. 2006. J. Agric. Food Chem., 54, 6034. Miwa,N., Yokoyama, K., Noriki Nio,N. Sonomoto, K. 2013. J. Agric. Food Chem., 61, 2205. Miwa,N., K. Yokoyama, K., Wakabayashi,H. Nio,N. 2010. Int. Dairy J., 20, 393. 食品酵素化学の最新技術と応用―フードプロテオミクスへの展望―，2004年　ISBNコード：978-4-7813-0127-3  第三章　p.147 Stewart AE, Arfin SM, Bradshaw RA. 1994. J. Biol. Chem. 1994 Sep 23; 269(38): 23509-17.
　本発明は、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する新規タンパク質脱アミド酵素（プロテインアスパラギナーゼ）を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アスパラギン残基を有するペプチドを唯一Ｎ源とするスクリーニング系を利用し、タンパク質の分解および架橋を伴わず、タンパク質中のアスパラギン残基を特異的に脱アミド化する反応を触媒する酵素を生産する微生物を見出し、本願発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
［１］
　タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
［２］
　タンパク質中のペプチド結合を加水分解する反応を触媒する活性を実質的に有さない、［１］に記載のタンパク質。
［３］
　下記（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に記載のタンパク質である、［１］または［２］に記載のタンパク質：
（Ａ）配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、配列番号１０の６３～１２６０位、２４５～１３７８位、２４５～１２６０位、若しくは１３１～１２６０位のアミノ酸配列、または配列番号１１の４７～１２５７位、５９～１２５８位、９６～１１０１位、２４１～１３７８位、２４４～１２５８位、２４４～１２５７位、２４４～１１０１位、１２９～１２５８位、１２０～１２５７位、若しくは１２０～１１０１位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、配列番号１０の６３～１２６０位、２４５～１３７８位、２４５～１２６０位、若しくは１３１～１２６０位のアミノ酸配列、または配列番号１１の４７～１２５７位、５９～１２５８位、９６～１１０１位、２４１～１３７８位、２４４～１２５８位、２４４～１２５７位、２４４～１１０１位 、１２９～１２５８位、１２０～１２５７位、若しくは１２０～１１０１位のアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、配列番号１０の６３～１２６０位、２４５～１３７８位、２４５～１２６０位、若しくは１３１～１２６０位のアミノ酸配列、または配列番号１１の４７～１２５７位、５９～１２５８位、９６～１１０１位、２４１～１３７８位、２４４～１２５８位、２４４～１２５７位、２４４～１１０１位 、１２９～１２５８位、１２０～１２５７位、若しくは１２０～１１０１位のアミノ酸配列に対し、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
［４］
　下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質：
（ａ）配列番号２、５、７、８、若しくは９に示すアミノ酸配列、配列番号２の２４０～１３５５位のアミノ酸配列、配列番号５の１８１～１１８０位若しくは６７～１１８０位のアミノ酸配列、配列番号７の１９３～１１７２位若しくは７０～１１７２位のアミノ酸配列、または配列番号８の１４６～９８９位若しくは２１～９８９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２、５、７、８、若しくは９に示すアミノ酸配列、配列番号２の２４０～１３５５位のアミノ酸配列、配列番号５の１８１～１１８０位若しくは６７～１１８０位のアミノ酸配列、配列番号７の１９３～１１７２位若しくは７０～１１７２位のアミノ酸配列、または配列番号８の１４６～９８９位若しくは２１～９８９位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２、５、７、８、若しくは９に示すアミノ酸配列、配列番号２の２４０～１３５５位のアミノ酸配列、配列番号５の１８１～１１８０位若しくは６７～１１８０位のアミノ酸配列、配列番号７の１９３～１１７２位若しくは７０～１１７２位のアミノ酸配列、または配列番号８の１４６～９８９位若しくは２１～９８９位のアミノ酸配列に対し、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
［５］
　［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［６］
　［５］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［７］
　［６］に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
［８］
　［７］に記載の形質転換体を培地で培養し、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
［９］
　［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該タンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
［１０］
　前記微生物が、アクチノバクテリア（Actinobacteria）綱に属する細菌である、［９］に記載の方法。
［１１］
　前記細菌が、ルテイミクロビウム（Luteimicrobium）属、アグロマイセス（Agromyces）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、またはレイフソニア（Leifsonia）属に属する細菌である、［１０］に記載の方法。
［１２］
　前記細菌が、ルテイミクロビウム・アルバム（Luteimicrobium album）、アグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）、ミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）、レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）、またはレイフソニア・アクアティカ（Leifsonia aquatica）である、［１１］に記載の方法。
［１３］
　前記タンパク質をプロセッシング酵素で処理することを含む、［８］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　前記プロセッシング酵素がプロテアーゼである、［１３］に記載の方法。
［１５］
　タンパク質及び／又はペプチドに、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質を作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質及び／又はペプチドの製造法。
［１６］
　前記タンパク質及び／又はペプチドが、飲食品又はその原料に含有されている、［１５］に記載の方法。
［１７］
　さらに、トランスグルタミナーゼ及び／又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び／又はペプチドに作用させることを含む、［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
　タンパク質及び／又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質を作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法。
［１９］
　タンパク質及び／又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質を作用させることを含む、改質された飲食品又はその原料の製造法。
［２０］
　さらに、トランスグルタミナーゼ及び／又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び／又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］
　前記飲食品が、マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、ヨーグルト、肉製品、およびパンから選択される、［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
　前記タンパク質及び／又はペプチド１ｇ当たり、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質が０．００１～５００Ｕ使用される、［１５］～［２１］のいずれかに記載の方法。
Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼのSDS-PAGEの結果を示す写真（実施例２）。 Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼで処理したインスリンB鎖のHPLCによる分析結果を示す図（実施例５）。 Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼで処理したカゼインの等電点電気泳動の結果を示す写真（実施例６）。対照区：水による処理区、試験区１：プロテインアスパラギナーゼ（0.68 U/ml）による処理区、試験区２：プロテインアスパラギナーゼ（2.7 U/ml）による処理区。 各種酵素で処理したカゼインのSDS-PAGEの結果を示す写真（実施例６）。対照区：水による処理区、試験区２：プロテインアスパラギナーゼ（2.7 U/ml）による処理区、比較区：プロテイングルタミナーゼ（10 U/ml）による処理区。「-TG」はトランスグルタミナーゼの併用なし、「+TG」はトランスグルタミナーゼの併用あり。 Leifsonia xyli由来のプロテインアスパラギナーゼで処理したインスリンB鎖のHPLCによる分析結果を示す図（実施例７）。 Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼのSDS-PAGEの結果を示す写真（実施例９）。レーン１：疎水クロマトグラフィー精製画分、レーン２～６：陰イオン交換クロマトグラフィー精製画分。 配列番号２および５のアラインメントの結果を示す図。 配列番号２、５、７、および８のアラインメントの結果を示す図。 配列番号２、５、７、８、および９のアラインメントの結果を示す図。 プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼの設計図。 Corynebacterium glutamicumにより分泌発現させたAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのSDS-PAGEの結果を示す写真（実施例１２＜１＞）。矢印は目的のタンパク質の位置を示す。 Escherichia coliにより菌体内発現させたプロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのSDS-PAGEの結果を示す写真（実施例１２＜２＞）。矢印は目的のタンパク質の位置を示す。
＜１＞タンパク質脱アミド酵素
　本発明は、タンパク質脱アミド酵素（protein deamidase）を提供する。
　本発明において、「タンパク質脱アミド酵素」とは、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。同活性を、「プロテインアスパラギナーゼ（protein asparaginase）活性」ともいう。なお、本発明において、タンパク質脱アミド酵素を、「プロテインアスパラギナーゼ」ともいう。
　「タンパク質中のアスパラギン残基」とは、フリーのα－アミノ基を有するＮ末アスパラギン残基以外の、タンパク質中に存在するアスパラギン残基をいう。なお、タンパク質脱アミド酵素は、このような「タンパク質中のアスパラギン残基」を脱アミド化する反応を触媒する活性を有する限り、フリーのα－アミノ基を有するＮ末アスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、タンパク質脱アミド酵素は、単量体のアスパラギンを脱アミド化する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　本発明において、タンパク質脱アミド酵素により脱アミド化されるタンパク質を、「基質タンパク質」ともいう。基質タンパク質の長さは、２残基（ジペプチド）以上であれば特に制限されない。基質タンパク質の長さは、例えば、２残基（ジペプチド）以上、３残基（トリペプチド）以上、１０残基以上、５０残基以上、または１００残基以上であってよい。すなわち、基質タンパク質には、特記しない限り、オリゴペプチドやポリペプチド等の、ペプチドと呼ばれる態様も包含される。
　アスパラギン残基は、脱アミド化により、アスパラギン酸残基とアンモニアに加水分解される。よって、プロテインアスパラギナーゼ活性は、例えば、アスパラギン残基の脱アミド化に伴うアンモニアの生成を利用して測定できる。例えば、アスパラギン残基を含み、且つ、グルタミン残基を含まない２残基以上のペプチド（Cbz-Asn-Gly等）を基質としてタンパク質脱アミド酵素を作用させ、遊離するアンモニアの量に基づいてプロテインアスパラギナーゼ活性を算出することができる。具体的には、例えば、実施例に記載の条件でプロテインアスパラギナーゼ活性を算出することができる。すなわち、プロテインアスパラギナーゼ活性は、30 mmol/L Cbz-Asn-Glyを含む0.2 mol/ Lリン酸緩衝液（pH6.5）125μLに適切な濃度の酵素溶液25μLを添加して、37℃、60分間インキュベートした後、12％トリクロロ酢酸溶液150μLを加えて反応を停止させ、上清中のアンモニア濃度を測定することにより、測定できる。本発明においては、本条件で、1分間に1μmolのアンモニアを生成する酵素活性を1単位（U）のプロテインアスパラギナーゼ活性とする。
　タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質中のグルタミン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を実質的に有さないのが好ましい。同活性を、「プロテイングルタミナーゼ活性（protein glutaminase activity）」ともいう。グルタミン残基は、脱アミド化により、グルタミン酸残基とアンモニアに加水分解される。よって、プロテイングルタミナーゼ活性は、例えば、グルタミン残基の脱アミド化に伴うアンモニアの生成に基づき測定できる。例えば、グルタミン残基を含み、且つ、アスパラギン残基を含まない２残基以上のペプチド（Cbz-Gln-Gly等）を基質としてタンパク質脱アミド酵素を作用させ、遊離するアンモニアの量に基づいてプロテイングルタミナーゼ活性を算出することができる。具体的には、例えば、実施例に記載のプロテインアスパラギナーゼ活性の測定条件のCbz-Asn-GlyをCbz-Gln-Glyに代えて酵素反応を行うことにより、プロテイングルタミナーゼ活性を算出することができる。すなわち、プロテイングルタミナーゼ活性は、30 mmol/L Cbz-Gln-Glyを含む0.2 mol/ Lリン酸緩衝液（pH6.5）125μLに適切な濃度の酵素溶液25μLを添加して、37℃、60分間インキュベートした後、12％トリクロロ酢酸溶液150μLを加えて反応を停止させ、上清中のアンモニア濃度を測定することにより、測定できる。本発明においては、本条件で、1分間に1μmolのアンモニアを生成する酵素活性を1単位（U）のプロテイングルタミナーゼ活性とする。「タンパク質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼ活性を実質的に有さない」とは、例えば、タンパク質脱アミド酵素におけるプロテインアスパラギナーゼ活性に対するプロテイングルタミナーゼ活性の比率（すなわち、プロテイングルタミナーゼ活性の比活性／プロテインアスパラギナーゼ活性の比活性）が、１００分の１以下、１０００分の１以下、１００００分の１以下、または０（ゼロ）であることであってよい。比活性の比率は、プロテインアスパラギナーゼ活性とプロテイングルタミナーゼ活性をそれぞれ測定し、算出できる。
　タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質中のペプチド結合を加水分解する反応を触媒する活性を実質的に有さないのが好ましい。同活性を「プロテアーゼ活性」ともいう。プロテアーゼ活性は、例えば、公知の手法により測定することができる。具体的には、例えば、アゾカゼインを基質として、以下の条件でプロテアーゼ活性を算出することができる。すなわち、1％アゾカゼインを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）1.0mLに適切な濃度の酵素溶液0.5mLを添加して、37℃で30分間インキューベートした後、12％トリクロロ酢酸溶液2.0mLを加えて反応を停止させる。遠心分離（15,000rpm、4℃、5分間）した後、上清のA405を測定する。対照として、酵素溶液の代わりに水を0.5mL添加した試験区、および、酵素溶液に含まれ得る成分の色による影響を差し引くためにアゾカゼインを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）の代わりにアゾカゼインを含まない50mMTris-HCl緩衝液（pH8.0）を1.0mL用いた試験区についても、同様に処理し、上清のA405を測定する。これらのA405の測定値に基づき、酵素によるA405の増加量を算出する。本発明においては、本条件で、1分間にA405を0.01増加させる酵素活性を1単位（U）のプロテアーゼ活性とする。「タンパク質脱アミド酵素がプロテアーゼ活性を実質的に有さない」とは、例えば、所望の程度にアスパラギン残基の脱アミド化が起こるようにタンパク質をタンパク質脱アミド酵素で処理した際に、処理の前後で、ペプチド結合の切断によるタンパク質の有意な低分子化が認められないことであってよい。また、「タンパク質脱アミド酵素がプロテアーゼ活性を実質的に有さない」とは、例えば、タンパク質脱アミド酵素におけるプロテインアスパラギナーゼ活性に対するプロテアーゼ活性の比率（すなわち、プロテアーゼ活性の比活性／プロテインアスパラギナーゼ活性の比活性）が、１００分の１以下、１０００分の１以下、１００００分の１以下、または０（ゼロ）であることであってよい。比活性の比率は、プロテインアスパラギナーゼ活性とプロテアーゼ活性をそれぞれ測定し、算出できる。
　タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質を架橋する反応を触媒する活性を実質的に有さないのが好ましい。同活性を「タンパク質架橋活性」ともいう。タンパク質架橋活性は、例えば、公知の手法により測定することができる。「タンパク質脱アミド酵素がタンパク質架橋活性を実質的に有さない」とは、例えば、所望の程度にアスパラギン残基の脱アミド化が起こるようにタンパク質をタンパク質脱アミド酵素で処理した際に、処理の前後で、架橋によるタンパク質の有意な高分子化が認められないことであってよい。「タンパク質脱アミド酵素がタンパク質架橋活性を実質的に有さない」とは、具体的には、例えば、2％w/vカゼインナトリウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）500μLに対し、プロテインアスパラギナーゼ活性として2.7 U/mlに調整した酵素溶液25μLを添加し、37℃で1時間反応後、100℃で5分の処理で酵素を失活させた際に、架橋していないカゼインの量が、対照区（酵素溶液の代わりに水を25μL添加して同様に反応を行ったサンプル）における架橋していないカゼインの量の、９０％以上、または９５％以上であることであってもよい。「架橋していないカゼインの量」は、公知の手法により測定および比較できる。「架橋していないカゼインの量」の測定および比較は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量分布を測定することによって実施してもよく、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより目的のバンドの位置及び濃度を確認することによって実施してもよい。
　タンパク質脱アミド酵素としては、例えば、アクチノバクテリア（Actinobacteria）綱に属する細菌のタンパク質脱アミド酵素が挙げられる。アクチノバクテリア綱に属する細菌としては、レイフソニア（Leifsonia）属細菌、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属細菌、アグロマイセス（Agromyces）属細菌等のMicrobacteriaceae科に属する細菌や、ルテイミクロビウム（Luteimicrobium）属細菌等の未分類の科に属する細菌が挙げられる。レイフソニア属細菌としては、レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）やレイフソニア・アクアティカ（Leifsonia aquatica）が挙げられる。ミクロバクテリウム属細菌としては、ミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）が挙げられる。アグロマイセス属細菌としては、後述する実施例で得られたアグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）が挙げられる。ルテイミクロビウム属細菌としては、ルテイミクロビウム・アルバム（Luteimicrobium album）が挙げられる。すなわち、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、このような細菌に由来するタンパク質であってよい。
　ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号２および３に示す。アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号５および６に示す。ミクロバクテリウム・テスタセウムのタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列を配列番号７に示す。レイフソニア・キシリーAJ111071（NITE P-01649）のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列を配列番号８に示す。レイフソニア・アクアティカのタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列を配列番号９に示す。すなわち、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、配列番号２、５、７、８、または９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、配列番号３または６に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
　ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）は、2013年7月5日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  122号室）に、受託番号NITE P-01650の下に寄託されている。
　アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）は、2013年12月11日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  122号室）に、受託番号NITE P-01782の下に原寄託され、2015年3月4日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01782（受領番号NITE ABP-01782）が付与されている。
　レイフソニア・キシリーAJ111071（NITE P-01649）は、2013年7月5日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  122号室）に、受託番号NITE P-01649の下に寄託されている。
　また、配列番号２、５、７、８、または９に示すアミノ酸配列はプレプロ領域（プレ配列およびプロ配列）を含み得る。なお、プレプロ領域を含むタンパク質を「プレプロタンパク質」ともいう。また、プレ配列を含まず、且つプロ配列を含むタンパク質を「プロタンパク質」ともいう。また、プレプロ領域を含まないタンパク質を「成熟タンパク質」ともいう。タンパク質脱アミド酵素は、例えば、配列番号２、５、７、８、または９に示すアミノ酸配列の内、プレプロ領域を除いた部分のアミノ酸配列（すなわち成熟タンパク質のアミノ酸配列）を有するタンパク質であってもよく、プレ配列を除いた部分のアミノ酸配列（すなわちプロタンパク質のアミノ酸配列）を有するタンパク質であってもよい。ルテイミクロビウム・アルバムのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２の２４０～１３５５位に相当する。アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５の１８１～１１８０位に相当する。ミクロバクテリウム・テスタセウムのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７の１９３～１１７２位に相当する。レイフソニア・キシリーのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８の１４６～９８９位に相当する。アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５の６７～１１８０位に相当する。ミクロバクテリウム・テスタセウムのタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７の７０～１１７２位に相当する。レイフソニア・キシリーのタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８の２１～９８９位に相当する。また、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、配列番号３または６に示す塩基配列の内、プレプロ領域を除いた部分のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわち成熟タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列）を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってもよく、プレ配列を除いた部分のアミノ酸配列をコードする塩基配列（すなわちプロタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列）を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。ルテイミクロビウム・アルバムのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号３の７１８～４０６８位に相当する。アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号６の５４１～３５４３位に相当する。アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号６の１９９～３５４３位に相当する。なお、成熟タンパク質のＮ末端残基の位置は、プロセッシング酵素の種類等の諸条件に応じて、例えば、数残基前後する場合がある。ここでいう「数残基」とは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基であってよい。すなわち、例えば、アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５の１８１±数残基～１１８０位に相当してもよい。一態様において、アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５の１７７～１１８０位に相当してもよい。
　タンパク質脱アミド酵素は、例えば、２またはそれ以上のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列の共通アミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。共通アミノ酸配列は、２またはそれ以上のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列でアラインメントを行うことにより決定できる。配列番号２および５のアラインメントの結果を図７に、それらの共通アミノ酸配列を配列番号１０に示す。配列番号２、５、７、および８のアラインメントの結果を図８に、それらの共通アミノ酸配列を配列番号１１に示す。配列番号２、５、７、８、および９のアラインメントの結果を図９に示す。すなわち、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、配列番号１０または１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、２またはそれ以上のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列の共通アミノ酸配列の内、各タンパク質脱アミド酵素に相当する部分のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。タンパク質脱アミド酵素に相当する部分のアミノ酸配列としては、配列番号１０の６３～１２６０位のアミノ酸配列（アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素に相当）、配列番号１１の４７～１２５７位のアミノ酸配列（ミクロバクテリウム・テスタセウムのタンパク質脱アミド酵素に相当）、配列番号１１の５９～１２５８位のアミノ酸配列（アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素に相当）、または配列番号１１の９６～１１０１位のアミノ酸配列（レイフソニア・キシリーのタンパク質脱アミド酵素に相当）が挙げられる。また、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、２またはそれ以上のタンパク質脱アミド酵素のアミノ酸配列の共通アミノ酸配列の内、各タンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当する部分のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、各タンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質に相当する部分のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。タンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当する部分のアミノ酸配列としては、配列番号１０の２４５～１３７８位のアミノ酸配列（ルテイミクロビウム・アルバムのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当）、配列番号１０の２４５～１２６０位のアミノ酸配列（アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当）、配列番号１１の２４１～１３７８位のアミノ酸配列（ルテイミクロビウム・アルバムのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当）、配列番号１１の２４４～１２５８位のアミノ酸配列（アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当）、配列番号１１の２４４～１２５７位のアミノ酸配列（ミクロバクテリウム・テスタセウムのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当）、配列番号１１の２４４～１１０１位のアミノ酸配列（レイフソニア・キシリーのタンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質に相当）が挙げられる。タンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質に相当する部分のアミノ酸配列としては、配列番号１０の１３１～１２６０位のアミノ酸配列（アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質に相当）、配列番号１１の１２９～１２５８位のアミノ酸配列（アグロマイセス属の１種のタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質に相当）、配列番号１１の１２０～１２５７位のアミノ酸配列（ミクロバクテリウム・テスタセウムのタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質に相当）、配列番号１１の１２０～１１０１位のアミノ酸配列（レイフソニア・キシリーのタンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質に相当）が挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素は、元の機能が維持されている限り、上記例示したタンパク質脱アミド酵素（例えば、配列番号２、５、７、８、９、１０、若しくは１１に示すアミノ酸配列、またはそれらの一部のアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、タンパク質脱アミド酵素をコードする遺伝子（「タンパク質脱アミド酵素遺伝子」ともいう）は、元の機能が維持されている限り、上記例示したタンパク質脱アミド酵素遺伝子（例えば、配列番号３若しくは６に示す塩基配列、またはそれらの一部の塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したタンパク質脱アミド酵素やそれをコードする遺伝子のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
　「元の機能が維持されている」とは、遺伝子やタンパク質のバリアントが、元の遺伝子やタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、タンパク質脱アミド酵素にあっては、タンパク質のバリアントが、プロテインアスパラギナーゼ活性を有することをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、タンパク質脱アミド酵素遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわちプロテインアスパラギナーゼ活性を有するタンパク質）をコードすることをいう。
　タンパク質脱アミド酵素のホモログとしては、例えば、後述するスクリーニング方法により得られる微生物が生産するタンパク質脱アミド酵素が挙げられる。また、タンパク質脱アミド酵素のホモログとしては、例えば、上記アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、上記タンパク質脱アミド酵素遺伝子のホモログは、例えば、各種微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
　タンパク質脱アミド酵素は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号２、５、７、８、９、１０、若しくは１１に示すアミノ酸配列、またはそれらの一部（成熟タンパク質部分やプロタンパク質部分）のアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　タンパク質脱アミド酵素が、上記共通アミノ酸配列（例えば、配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、またはそれらの一部（成熟タンパク質部分やプロタンパク質部分）のアミノ酸配列）の保存的バリアントである場合、そのようなバリアントは、元の機能が維持されている限り、当該共通アミノ酸配列中の共通部分および／またはそれ以外の部分に変異が導入されたものであってよい。そのようなバリアントは、当該共通アミノ酸配列中の共通部分が保存され、それ以外の部分に変異が導入されたものであるのが好ましい。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号３若しくは６に示す塩基配列、またはそれらの一部（成熟タンパク質やプロタンパク質をコードする部分）の塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、上記塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素は、上記のようなタンパク質脱アミド酵素の内、そのアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列が本発明の出願時に公知であるものを除いたものであってもよい。
　タンパク質脱アミド酵素は、他のアミノ酸配列との融合タンパク質であってもよい。「他のペプチド」は、融合タンパク質がプロテインアスパラギナーゼ活性を有する限り、特に制限されない。「他のアミノ酸配列」は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。「他のアミノ酸配列」としては、ペプチドタグ、シグナル配列（プレ配列）、プロ配列、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。「他のアミノ酸配列」は、例えば、タンパク質脱アミド酵素のＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。「他のアミノ酸配列」としては、１種のアミノ酸配列を用いてもよく、２種またはそれ以上のアミノ酸配列を組み合わせて用いてもよい。
　ペプチドタグは、例えば、発現したタンパク質脱アミド酵素の検出や精製に利用できる。ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。
　シグナル配列は、例えば、タンパク質脱アミド酵素の分泌生産に利用できる。シグナル配列としては、Sec系分泌経路で認識されるシグナル配列やTat系分泌経路で認識されるシグナル配列が挙げられる。Sec系分泌経路で認識されるシグナル配列として、具体的には、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナル配列が挙げられる。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumのPS1（CspA）及びPS2（CspB）（特表平6-502548）、及びC. ammoniagenes (C. stationis)のSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。Tat系分泌経路で認識されるシグナル配列として、具体的には、E. coliのTorAシグナル配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる（WO2013/118544）。また、シグナル配列としては、タンパク質脱アミド酵素のシグナル配列を用いてもよい。シグナル配列は、例えば、製造するタンパク質のＮ末に付加して利用することができる。シグナル配列は、具体的には、例えば、タンパク質脱アミド酵素のプロタンパク質や成熟タンパク質のＮ末に付加して利用することができる。シグナル配列は、一般的に、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。よって、シグナル配列を利用してタンパク質脱アミド酵素を分泌生産する場合、シグナル配列を有さないタンパク質脱アミド酵素が菌体外に分泌され得る。
　プロ配列として、具体的には、タンパク質脱アミド酵素のプロ配列が挙げられる。タンパク質脱アミド酵素のプロ配列としては、配列番号５の６７～１８０位の配列が挙げられる。プロ配列は、例えば、製造するタンパク質のＮ末に付加して利用することができる。プロ配列は、具体的には、例えば、タンパク質脱アミド酵素の成熟タンパク質のＮ末に付加して利用することができる。また、タンパク質脱アミド酵素を分泌生産する場合、例えば、Ｎ末から順にシグナル配列、プロ配列、および成熟タンパク質の配列を含むようにタンパク質脱アミド酵素を構成して発現させてもよい。プロ配列を有する形態でタンパク質脱アミド酵素を発現させることが、タンパク質脱アミド酵素の構造安定化に寄与する可能性がある。一方、プロテインアスパラギナーゼ活性の観点から、最終的に得られるタンパク質脱アミド酵素はプロ配列を有さないのが好ましい。
　プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現したタンパク質脱アミド酵素の切断に利用できる。プロテアーゼの認識配列は、基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列であるのが好ましい。基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。Factor Xaプロテアーゼはタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg（=IEGR）（配列番号１４）のアミノ酸配列を、proTEVプロテアーゼはタンパク質中のGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln（=ENLYFQ）（配列番号１５）のアミノ酸配列を認識し、各配列のC末端側を特異的に切断する。例えば、タンパク質脱アミド酵素を、ペプチドタグやプロ配列等の他のアミノ酸配列との融合タンパク質として発現させる場合、タンパク質脱アミド酵素と他のアミノ酸配列との間にさらにプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現したタンパク質脱アミド酵素からプロテアーゼを利用して他のアミノ酸配列を除去し、他のアミノ酸配列を有さないタンパク質脱アミド酵素を得ることができる。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、上記例示したタンパク質脱アミド酵素遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
　なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「タンパク質脱アミド酵素遺伝子」とは、タンパク質脱アミド酵素をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
＜２＞タンパク質脱アミド酵素の製造
　タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主を利用して製造することができる。すなわち、本発明は、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主を培地で培養し、タンパク質脱アミド酵素を生成させること、および培養物よりタンパク質脱アミド酵素を採取すること、を含む、タンパク質脱アミド酵素の製造法を提供する。同方法を、「本発明のタンパク質脱アミド酵素の製造法」ともいう。なお、タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
　タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主は、本来的にタンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有するものであってもよく、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有するように改変されたものであってもよい。
　タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主としては、上記のようなアクチノバクテリア綱に属する細菌、例えば、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）、ミクロバクテリウム・テスタセウム、レイフソニア・キシリーAJ111071（NITE P-01649）、が挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主としては、下記のようなスクリーニング手法により得られる微生物も挙げられる。
（１）Cbz-Asn-Glyを唯一のN源とした培地に、土壌などの微生物給源を接種し集積培養する。
（２）Cbz-Asn-Glyを唯一のN源とした寒天培地に（１）で得られた培養液を摂取し、生育した菌株を得る。
（３）得られた菌株を適当な液体栄養培地で培養し、培養液中のCbz-Asn-Gly及びカゼインからのアンモニア遊離活性をチェックする。
　集積培養に用いられる培地の組成は、Cbz-Asn-Glyを唯一のN源とすること以外は、培養される微生物に応じて適宜設定できる。また、培養温度等の培養条件も、培養される微生物に応じて適宜設定できる。具体的な培地成分や培養条件については、例えば、後述するタンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主の培養に関する記載を参照してもよい。
　タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主としては、タンパク質脱アミド酵素遺伝子が導入された宿主も挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子を導入する宿主は、機能するタンパク質脱アミド酵素を発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。より好ましい宿主としては、細菌が挙げられる。細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌が挙げられる。宿主としては、中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を好適に用いることができる。また、タンパク質脱アミド酵素を菌体外に分泌生産する場合、宿主としては、特に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）やコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）等のコリネ型細菌を好適に用いることができる（WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2013/062029）。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ等の核酸を利用できる。また、タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、具体的には、例えば、上記のようなタンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する微生物（例えば、上記アクチノバクテリア綱に属する細菌や上記スクリーニング手法により得られた微生物）から、以下に記載するような方法でクローニングすることができる。
　まず、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する微生物から適宜タンパク質脱アミド酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列の決定に際しては、例えば、精製したタンパク質脱アミド酵素を直接常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第256巻、第7990～7997頁（1981）〕によりアミノ酸配列分析（プロテインシーケンサー島津製作所PPSQ-21A等）に供してもよいし、タンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を実施してもよい。続いて、同微生物から抽出したゲノムDNAの塩基配列を次世代シーケンサー（イルミナ社、Miseq等）により解読した後、上記手法により得られた部分アミノ酸配列を検索する。すなわち、取得したゲノムDNAの塩基配列からCLC Genomics Workbench（株式会社CLCバイオジャパン）を用いてコンティグ配列を作成し、予め取得していたタンパク質脱アミド酵素の部分アミノ酸配列を基に、該酵素をコードしている遺伝子の塩基配列を決定できる。決定された塩基配列に基づき、一般的なPCRを用いる方法により、タンパク質脱アミド酵素遺伝子をクローニングすることができる。
　PCR法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。まず、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する微生物のゲノムDNAを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行い、目的のタンパク質脱アミド酵素遺伝子の一部を含むDNA断片を得る。PCR法は、PCRテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレス社（Stockton press）、1989年発行〕に記載の方法に準じて行う。次いで、増幅DNA断片について、通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外にタンパク質脱アミド酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、すなわち、目的のタンパク質脱アミド酵素遺伝子の一部の塩基配列を決定することができる。さらに、得られた遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーション法等を行うことによって、タンパク質脱アミド酵素遺伝子の全長をクローニングすることができる。
　また、上記のようにして取得したタンパク質脱アミド酵素遺伝子を適宜改変してそのバリアントを取得することもできる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、遺伝子の目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、タンパク質脱アミド酵素遺伝子のバリアントは、例えば、変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、遺伝子自体をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を保持する微生物、例えばアクチノバクテリア綱に属する細菌を、Ｘ線、紫外線、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルフォネート（EMS）、メチルメタンスルフォネート（MMS）等の変異剤によって処理する方法、エラ－プローンPCR (Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR (Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998)) 等の方法が挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類のタンパク質脱アミド酵素遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類のタンパク質脱アミド酵素遺伝子を有していてもよい。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、タンパク質脱アミド酵素遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、高い発現量を達成できるよう、強力なプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとして、具体的には、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（（EF-Tu））プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　また、タンパク質脱アミド酵素遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、タンパク質脱アミド酵素遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
　タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。タンパク質脱アミド酵素遺伝子を含むベクターを、タンパク質脱アミド酵素遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。タンパク質脱アミド酵素遺伝子の発現ベクターは、例えば、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。タンパク質脱アミド酵素遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むタンパク質脱アミド酵素遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、タンパク質脱アミド酵素のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流にタンパク質脱アミド酵素のコード領域を組み込んでもよい。
　各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　また、タンパク質脱アミド酵素遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体上への遺伝子の導入は、例えば、相同的組み換えを利用して行うことができる。相同組換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）、P1ファージ等のファージを用いたトランスダクション（transduction）、接合伝達ベクターを用いた方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いた方法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、例えば、反復ＤＮＡ配列（repetitive DNA）や、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、例えば、トランスポゾンやMini-Muを用いた方法により、遺伝子を染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むタンパク質脱アミド酵素遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、タンパク質脱アミド酵素のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流にタンパク質脱アミド酵素のコード領域を組み込んでもよい。
　染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
　形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
　また、本来的にタンパク質脱アミド酵素遺伝子を有する宿主を、タンパク質脱アミド酵素遺伝子の発現が増大するよう改変してもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子の発現を増大させる手法としては、タンパク質脱アミド酵素遺伝子のコピー数を増加させることやタンパク質脱アミド酵素遺伝子の転写効率を向上させることが挙げられる。タンパク質脱アミド酵素遺伝子のコピー数の増加は、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を宿主に導入することにより達成できる。タンパク質脱アミド酵素遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入されるタンパク質脱アミド酵素遺伝子は、同種由来であってもよく、異種由来であってもよい。タンパク質脱アミド酵素遺伝子の転写効率の向上は、タンパク質脱アミド酵素遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。より強力なプロモーターとしては上述したような強力なプロモーターが挙げられる。
　上記のようなタンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主を培地で培養することにより、タンパク質脱アミド酵素を発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行ってよい。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、タンパク質脱アミド酵素を発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
　炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
　窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
　イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
　無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
　その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
　培養法は、液体培養であってもよく、固体培養であってもよいが、液体培養が好ましい。培養は、好気的に行うのが好ましい。好気的な培養法としては、振盪培養法や、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が挙げられる。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5～50％に、好ましくは10％程度に調節してもよい。培養温度は、例えば、10～50℃、好ましくは20℃～45℃、より好ましくは25℃～40℃であってよい。培地のpHは、例えば、3～9、好ましくは5～8に調整されてもよい。pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養期間は、例えば、12時間～20日間、好ましくは1日間～7日間であってよい。
　上記のような条件下で培養を行うことにより、タンパク質脱アミド酵素を含む培養物が得られる。タンパク質脱アミド酵素は、例えば、宿主の菌体内および／または培地中に蓄積する。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。尚、使用する宿主及びタンパク質脱アミド酵素遺伝子の設計によっては、ペリプラズムにタンパク質脱アミド酵素を蓄積させることや、菌体外にタンパク質脱アミド酵素を分泌生産させることも可能である。
　タンパク質脱アミド酵素は、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。
　すなわち、例えば、宿主の菌体内にタンパク質脱アミド酵素が蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、タンパク質脱アミド酵素を回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地にタンパク質脱アミド酵素が蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清からタンパク質脱アミド酵素を回収することができる。
　タンパク質脱アミド酵素の精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。タンパク質脱アミド酵素の精製は、所望の程度に行うことができる。
　精製されたタンパク質脱アミド酵素は、「タンパク質脱アミド酵素」としてタンパク質の脱アミド化に利用できる。タンパク質脱アミド酵素は、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
　また、精製されたタンパク質脱アミド酵素に限られず、タンパク質脱アミド酵素を含有する任意の画分を「タンパク質脱アミド酵素」としてタンパク質の脱アミド化に利用してもよい。タンパク質脱アミド酵素を含有する画分は、タンパク質脱アミド酵素が基質タンパク質に作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミド、カラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製されたタンパク質脱アミド酵素と共に利用されてもよい。
　回収したタンパク質脱アミド酵素は、適宜、製剤化してもよい。剤形は特に制限されず、タンパク質脱アミド酵素の使用用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。
　タンパク質脱アミド酵素がプロ配列を有する場合、プロ配列の除去によりプロテインアスパラギナーゼ活性が向上し得る。よって、本発明のタンパク質脱アミド酵素の製造法は、さらに、プロ配列を有するタンパク質脱アミド酵素からプロ配列を除去することを含んでいてもよい。プロ配列の除去は、例えば、タンパク質脱アミド酵素をプロセッシング酵素で処理することにより行うことができる。プロセッシング酵素としてはプロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼとして、具体的には、スブチリシン（subtilisin）、キモトリプシン（chymotrypsin）、トリプシン（trypsin）等のセリンプロテアーゼ（serine protease）；パパイン（papain）、ブロメライン（bromelain）、カスパーゼ（caspase）、カルパイン（calpain）等のシステインプロテアーゼ（cysteine protease）；ペプシン（pepsin）、カテプシン（cathepsin）等の酸性プロテアーゼ（acid protease）；サーモリシン（thermolysin）等のメタロプロテアーゼ（metalloprotease）が挙げられる。また、プロ配列と成熟タンパク質の配列の間に特定のプロテアーゼの認識配列を挿入してタンパク質脱アミド酵素を発現させた場合は、当該特定のプロテアーゼを利用して、プロ配列を特異的に除去することができる。プロテアーゼの由来は特に制限されず、微生物、動物、植物等いずれの由来のものを用いてもよい。また、プロテアーゼとしては、公知のプロテアーゼのホモログや人為的改変体を用いてもよい。プロテアーゼとしては、例えば、プロテアーゼを産生する微生物の培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、該菌体の処理物、プロテアーゼを含有する農水畜産物、該農水畜産物の処理物、それらから分離したプロテアーゼ、市販のプロテアーゼ製剤等のいずれの形態のものを用いてもよい。プロテアーゼは、所望の程度に精製されていてよい。プロテアーゼを産生する微生物としては、バチルス（Bacillus）属細菌やアスペルギルス（Aspergillus）属真菌が挙げられる。市販のプロテアーゼ製剤としては、表５に示すものが挙げられる。
　ここでは、タンパク質脱アミド酵素の製造手順の具体例を説明する。例えば、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主としてルテイミクロビウム・アルバム（Luteimicrobium album）AJ111072（NITE P-01650）を使用する場合、該菌株のグリセロールストックからTryptic soy培地（Difco社製）に1％植菌し、前培養として30℃、24時間の振とう培養を行う。その後、Yeast Carbon Base（Difco社）とポリペプトンを含む培地で30℃、24時間振とう培養を行い（本培養）、タンパク質脱アミド酵素を含有する培養液を得る。タンパク質脱アミド酵素は、培養液を遠心分離（12,000rpm、4℃、20分間）し、上清を粗酵素液として得、UF濃縮（ザルトリウス　ハイドロザルト膜、分子量分画10,000）、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等により処理し、精製することができる。他の宿主を利用する場合も、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）を利用する場合を参考にすることができる。
＜３＞タンパク質脱アミド酵素の利用
　本発明においては、タンパク質脱アミド酵素を利用して、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化することができる。すなわち、本発明は、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質に作用させることを含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する方法を提供する。同方法を、「本発明の脱アミド化法」ともいう。また、同方法の一態様は、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質に作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質の製造法である。
　タンパク質脱アミド酵素により脱アミド化されるタンパク質（基質タンパク質）は、アスパラギン残基を含むタンパク質である限り、特に制限されない。上述の通り、基質タンパク質の長さは、２残基（ジペプチド）以上であれば特に制限されず、基質タンパク質には、特記しない限り、オリゴペプチドやポリペプチド等の、ペプチドと呼ばれる態様も包含される。すなわち、「タンパク質（基質タンパク質）」という用語は、具体的には、タンパク質及び／又はペプチドを意味してよい。基質タンパク質は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。
　基質タンパク質は、タンパク質そのものであってもよく、タンパク質を含有する素材であってもよい。言い換えると、基質タンパク質は、単独で（すなわち単離された状態で）脱アミド化反応に供されてもよく、任意の素材に含有された状態で脱アミド化反応に供されてもよい。基質タンパク質としては、例えば、タンパク質を含有する農水畜産物、それらの加工品、それらから分離したタンパク質が挙げられる。植物性タンパク質を含有する素材としては、例えば、大豆、小麦、大麦、トウモロコシ、および米等の穀物、ならびにそれらの加工品が挙げられる。また、動物性タンパク質を含有する素材としては、例えば、牛肉、豚肉、および鶏肉等の畜肉、魚肉、乳、卵、ならびにそれらの加工品が挙げられる。植物性タンパク質としては、グリシニン等の大豆タンパク質、グルテン、グルテニン、グリアジン等の小麦タンパク質、コーングルテンミール等のトウモロコシタンパク質が挙げられる。動物性タンパク質としては、カゼイン、ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリン等の乳タンパク質、オボアルブミン等の卵タンパク質、ミオシンやアクチン等の肉タンパク質、血清アルブミン等の血液タンパク質、ゼラチンやコラーゲン等の腱タンパク質が挙げられる。また、基質タンパク質としては、酸やアルカリ等により化学的に、あるいはプロテアーゼ等により酵素的に、部分分解されたタンパク質、各種試薬による化学修飾タンパク質、適当な宿主で製造した組換えタンパク質、合成ペプチドも挙げられる。基質タンパク質は、適宜、加熱、蒸煮、粉砕、凍結、融解、乾燥等の処理に供されたものであってもよい。タンパク質を含有する素材は、１種のタンパク質を含有していてもよく、２種またはそれ以上のタンパク質を含有していてもよい。基質タンパク質としては、１種のタンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のタンパク質を用いてもよい。
　基質タンパク質は、例えば、タンパク質を含有する飲食品であってもよく、タンパク質を含有する飲食品の原料であってもよい。言い換えると、基質タンパク質は、例えば、飲食品またはその原料に含有された状態で脱アミド化反応に供されてもよい。飲食品またはその原料の種類や形態は、飲食品またはその原料がタンパク質を含有する限り、特に制限されない。例えば、上述したような、タンパク質を含有する農水畜産物、それらの加工品、およびそれらから分離したタンパク質は、いずれも単独で飲食品またはその原料として利用してもよく、それらの２またはそれ以上を適宜組み合わせて飲食品またはその原料として利用してもよく、それらの１またはそれ以上と他の成分とを適宜組み合わせて飲食品またはその原料として利用してもよい。タンパク質を含有する飲食品またはその原料をタンパク質脱アミド酵素により脱アミド化することにより、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質を含有する飲食品またはその原料が得られる。さらに、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質を含有する飲食品の原料を用いて、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質を含有する飲食品を製造することができる。すなわち、本発明の脱アミド化法の一態様は、タンパク質脱アミド酵素を、タンパク質を含有する飲食品またはその原料に作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質を含有する飲食品またはその原料の製造法であってよい。本発明の脱アミド化法の一態様により得られるアスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質を含有する飲食品を、「本発明の飲食品」ともいう。本発明の飲食品は、タンパク質脱アミド酵素で処理すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。飲食品には調味料も含まれる。飲食品として、具体的には、例えば、マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、ヨーグルト、肉製品、パンが挙げられる。
　基質タンパク質は、例えば、溶液、懸濁液、スラリー、またはペースト等の状態で脱アミド化反応に供してよい。溶液等における基質タンパク質の濃度は、所望の程度に脱アミド化が達成される限り、特に制限されない。溶液等における基質タンパク質の濃度は、基質タンパク質の種類や性状、所望の脱アミド化率等の諸条件に応じて適宜設定できる。基質タンパク質を含有する溶液等は、水溶液に限らず油脂とのエマルジョンであってもよい。基質タンパク質を含有する溶液等は、基質タンパク質と溶媒からなるものであってもよく、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、塩類、糖類、タンパク質、香料、保湿剤、着色料が挙げられる。
　反応条件（酵素量、反応時間、反応温度、反応ｐＨ等）は、所望の程度に脱アミド化が達成される限り、特に制限されない。反応条件は、タンパク質脱アミド酵素の種類や純度、タンパク質の種類や純度、所望の脱アミド化の程度等の諸条件に応じて適宜設定できる。酵素量は、基質タンパク質1 gに対し、例えば、0.001～500 U、好ましくは0.01～100 U、より好ましくは0.1～10 Uであってよい。反応温度は、例えば、5～80℃、好ましくは5～40℃であってよい。反応溶液のpHは、例えば、2～10、好ましくは4～8であってよい。反応時間は、例えば、10秒～48時間、好ましくは10分～24時間であってよい。
　脱アミド化は、所望の程度に行うことができる。脱アミド化率（基質タンパク質中の脱アミド化されたアスパラギンの残基数／基質タンパク質中の脱アミド化前のアスパラギンの残基数）は、例えば、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、または２０％以上であってよく、１００％以下、７０％以下、または５０％以下であってよい。
　タンパク質の脱アミド化により、タンパク質の負電荷が増加する。負電荷の増加に伴い、等電点（pI）の低下、水和力の上昇、静電反発力の上昇等の効果がもたらされ得る。また、タンパク質の脱アミド化により、タンパク質の高次構造が変化し、表面疎水性の上昇等の効果がもたらされ得る。これらの効果により、可溶性・分散性の向上、起泡性・泡沫安定性の向上、乳化性・乳化安定性の向上等の、タンパク質の機能性の改善効果がもたらされ得る。このように機能性が改善されたタンパク質は、例えば、食品分野での用途が大きく拡大する。例えば、多くの植物性タンパク質は、特に通常の食品のpH範囲である弱酸性条件において、可溶性、分散性、乳化性等の機能性が乏しいため、多くの食品、例えば、コーヒーホワイトナー、果汁等の酸性飲料、ドレッシング、マヨネーズ、クリーム等、への使用が制限されていた。しかしながら、タンパク質をタンパク質脱アミド酵素により脱アミド化することにより、可溶性、分散性、乳化性等の機能性が向上すれば、多くの食品に好適に使用できるようになる。
　また、タンパク質をタンパク質脱アミド酵素により脱アミド化することにより、タンパク質のミネラル感受性が低下し、タンパク質とミネラルを含有する溶液中の可溶性ミネラル含量が高まり得る。一般に、食品中のカルシウムの人体への吸収性は、カルシウムを有機酸やカゼインホスホペプチドを用いて可溶化させることにより向上することが知られている。よって、タンパク質をタンパク質脱アミド酵素により脱アミド化することにより、飲食品中の可溶性ミネラル含量が高まれば、カルシウム等のミネラルの人体への吸収性を向上させることができる。すなわち、タンパク質脱アミド酵素は、例えば、カルシウム吸収促進剤の有効成分として利用することもできる。
　また、タンパク質を原料として製造される調味料、例えば、動物性タンパク質の加水分解物（HAP）、植物性タンパク質の加水分解物（HVP）、味噌、醤油等、の製造においては、タンパク質をタンパク質脱アミド酵素により脱アミド化することにより、苦味の低下、プロテアーゼによるタンパク質分解率の向上等の効果がもたらされ得る。一般に、疎水性ペプチドは苦味の原因となることが知られているが、脱アミド化によりペプチドの親水性を高め、苦味を低減することができる。また、脱アミド化によりタンパク質の高次構造が変化し、そのタンパク質のプロテアーゼ感受性が高まり得る。すなわち、例えば、脱アミド化により、HAPやHVPを酵素的に製造する際の問題の一つであった低分解率を改善することもできる。
　このように、脱アミド化により、タンパク質またはそれを含む素材の物性や機能を改変することができる。これら物性や機能の改変を総称して「改質」ともいう。すなわち、本発明の脱アミド化法は、言い換えると、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質に作用させることを含む、タンパク質を改質する方法であってもよく、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質に作用させることを含む、改質されたタンパク質の製造法であってもよい。また、同方法の一態様は、例えば、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質を含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法であってもよく、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質を含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、改質された飲食品又はその原料の製造法であってもよい。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、プロテイングルタミナーゼと併用してもよい。プロテイングルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基を脱アミド化する反応を触媒する酵素である。タンパク質脱アミド酵素とプロテイングルタミナーゼを併用すれば、タンパク質の低分子化を招くことなく、タンパク質のアスパラギン残基とグルタミン残基の両方を脱アミド化することができる。すなわち、両酵素を併用することにより、タンパク質の脱アミド化率はさらに増加し、タンパク質の等電点（pI）はより酸性側に移行するため、本来タンパク質が不溶化しやすいpH域よりも酸性側での溶解性が改善する等の、タンパク質の機能性のさらなる改善効果がもたらされ得る。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、トランスグルタミナーゼと併用してもよい。トランスグルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基を結合しタンパク質を架橋する反応を触媒する酵素である。架橋により、タンパク質をゲル化させることや、タンパク質の機能性を向上させることができる。そのため、トランスグルタミナーゼは、タンパク質の改質剤として食品分野をはじめ産業用に広く利用されている。ここで、タンパク質の架橋と脱アミド化の両方を行う場合、プロテイングルタミナーゼによりタンパク質の脱アミド化を行うと、トランスグルタミナーゼの基質であるグルタミン残基がグルタミン酸残基に変換されるため、トランスグルタミナーゼによる架橋反応が阻害される。一方、タンパク質脱アミド酵素の基質はアスパラギン残基であるため、トランスグルタミナーゼと基質を競合せず、トランスグルタミナーゼとの併用によりタンパク質の架橋と脱アミド化の両方を効率的に行うことができる。
　タンパク質脱アミド酵素と併用する酵素の種類は、タンパク質脱アミド酵素の性質等の諸条件に応じて適宜選択できる。タンパク質脱アミド酵素を他の酵素と併用する場合、それぞれの酵素を添加するタイミングや順番は特に制限されない。両酵素は、同時に添加してもよく、異なるタイミングで添加してもよい。また、タンパク質脱アミド酵素と他の酵素を併用する場合、その反応条件（酵素量、反応時間、反応温度、反応ｐＨ等）は、所望の効果が得られる限り特に制限されない。反応条件は、他の酵素の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、タンパク質脱アミド酵素をプロテイングルタミナーゼと併用する場合、プロテイングルタミナーゼの使用量は、基質タンパク質1 g当たり、好ましくは0.001～100 Uであってよい。また、例えば、タンパク質脱アミド酵素をトランスグルタミナーゼと併用する場合、トランスグルタミナーゼの使用量は、基質タンパク質1 g当たり、好ましくは0.001～100 Uであってよい。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質の機能改変用のタンパク質工学用試薬としても使用できる。基質タンパク質が酵素である場合は、その酵素の酵素化学的性質や物理化学的性質を改変する事が出来る。例えば、酵素タンパク質をタンパク質脱アミド酵素により脱アミドすることにより、酵素タンパク質の等電点が低下し、pH安定性を改変することができる。また、酵素タンパク質の活性部位の構造や電気的環境を変化させることにより、その酵素タンパク質の基質親和性、基質特異性、反応速度、pH依存性、温度依存性、温度安定性等の性質を改変することができる。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質のアミド含量定量用試薬、タンパク質の可溶化用試薬等の、タンパク質の分析用および研究用試薬としても使用できる。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、穀類や豆類のタンパク質の抽出効率や濃縮効率を向上させるために利用できる。一般に、小麦や大豆等の穀類や豆類のタンパク質は水に不溶性のものが多く、それらのタンパク質を抽出することは容易ではない。しかしながら、例えば、小麦粉や大豆粉の縣濁液をタンパク質脱アミド酵素で処理し、タンパク質の可溶性を高めることにより、タンパク質を容易に抽出することができ、また、高含量のタンパク質単離物を得ることができる。
　また、タンパク質脱アミド酵素は、動物タンパク質の抽出効率を向上させるために利用できる。例えば、ゼラチンは、主として牛骨、牛皮、および豚皮を原料として工業的に生産される。効率良く高品質のゼラチンを抽出するためには、塩酸や硫酸等の無機酸による前処理（酸処理）あるいは石灰による前処理（アルカリ処理）を行うが、いずれも環境負荷が高く、処理に時間がかかる。一方、タンパク質脱アミド酵素を利用すれば、タンパク質を容易に抽出することができ、且つ、酵素的手法であるため環境負荷を低減できる。
　このようにして得られた機能性の向上したタンパク質は、畜肉、魚肉製品、麺類など種々の食品に使用した場合に優れた効果を示し、新しい食感や機能を有する食品の製造が可能となり得る。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：集積培養によるプロテインアスパラギナーゼ生産菌のスクリーニング
　土壌サンプルをCbz-Asn-Gly（ペプチド研究所）を唯一の窒素源として含有する培地A（下記）に接種し、5日間振とう培養した。該培養液をToryptic soy培地（Difco社製）の平板寒天培地に塗布して、生育したコロニーを選択して取得した。取得したコロニーをA培地と同様の2種類の寒天培地（Cbz-Asn-Gly 0.3％含有と非含有）に塗布し、Cbz-Asn-Glyの有無によって生育に有意差が見られる株を選択した。それら菌株を培地Aで再度培養し、培養液上清を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により分析し、脱アミド化生成物（Cbz-Asp-Gly）の生成が確認できた株をプロテインアスパラギナーゼ生産菌の候補株とした。これらの候補株について、16SrDNA配列解析による相同性検索により属種の同定を行った。結果を表1に示す。
　培地A：蒸留水にYeast Carbon Base（Difco社製）1.17％、Cbz-Asn-Gly 0.3％を溶解後、フィルター濾過滅菌した。培地のpHは7.2に調整した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２：ルテイミクロビウム・アルバム由来プロテインアスパラギナーゼの精製
　実施例１で得られた微生物から、ルテイミクロビウム・アルバム（Luteimicrobium album）AJ111072（NITE P-01650）を選択し、以下の実験を行った。
　培地B（下記）にルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）を接種し、30℃、24時間振盪培養して培養液を得た。
　培地B：蒸留水にYeast Carbon Baseを2.34％溶解後フィルター濾過滅菌したものと、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）済み2％ポリペプトン（日本製薬社製）溶液を等量ずつ混合した。培地のpHは7.2に調整した。
　上述の培養液を、4℃、8000 rpm、15分間の遠心分離により菌体を除去し、得られた遠心上清を限外濾過膜（ザルトリウス社製）により約25倍に濃縮後、Stericup 0.22μm（ミリポア社製）でフィルター濾過した。濾液を1.0 M硫酸ナトリウムを含む20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化した疎水クロマトグラフィー用カラムHiprep Octyl FF 10/16（GEヘルスケア社製）に供し、1.0 Mから0 Mの硫酸ナトリウム直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させた。活性画分を集め、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）へバッファー交換し、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムHiprep DEAE FF 10/16（GEヘルスケア社製）に供して、0 Mから0.5 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させた。再び活性画分を集め、同様にして20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）にバッファー交換後、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムHiprep DEAE FF 10/16に供し、0 Mから0.5 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させた。活性画分を限外濾過膜で濃縮し、0.1 M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラムSuperdexTM200 10/300に供して、同緩衝液で溶離した。精製テーブルを表2に示す。活性画分を還元剤含有SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用サンプルバッファーと混合して熱処理した後、7.5％均一ポリアクリルアミドゲル（アトー, e-PAGEL, E-T7.5L）で電気泳動し、泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー染色した。結果を図１に示す。活性の大きさとバンドの濃さから判断すると、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼの分子量は、約11万であることが判明した。また、最終精製工程により得られた活性画分には、遊離のアスパラギンを脱アミド化するアスパラギナーゼ活性及びタンパク質を分解するプロテアーゼ活性は検出されなかった。
　尚、プロテインアスパラギナーゼ活性の測定は、Cbz-Asn-Glyを基質として、以下の手順で実施した。タンパク質の定量は、Bradford法により、牛血清アルブミンを標準タンパク質として用いて実施した。
活性測定方法：30 mmol/L Cbz-Asn-Glyを含む0.2 mol/Lリン酸緩衝液（pH6.5）125μLに酵素溶液25μLを添加して、37℃、60分間インキュベートした後、12％トリクロロ酢酸溶液150μLを加えて反応を停止させた。反応液を遠心分離（15,000 rpm、4℃、5分間）した後、上清のアンモニア濃度をF-kit ammonia（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて測定し、プロテインアスパラギナーゼ活性を算出した。1分間に1μmolのアンモニアを生成する酵素活性を1単位（U）のプロテインアスパラギナーゼ活性とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３：ルテイミクロビウム・アルバム由来プロテインアスパラギナーゼのN末端アミノ酸配列の決定
　実施例２で得られた精製プロテインアスパラギナーゼをプロテインシークエンサー（島津製作所PPSQ-21A）に供し、5残基のN末端アミノ酸配列を決定した。ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼのN末端アミノ酸配列は、Ala-Val-Thr-Ala-Asp（配列番号１）であった。
実施例４：ルテイミクロビウム・アルバム由来プロテインアスパラギナーゼの全長アミノ酸配列の決定
　プロテインアスパラギナーゼの全長アミノ酸配列は、次世代シーケンサーで得られたゲノム配列をデータベースとしてLC-MS/MSのデータからタンパク質同定を行う手法を用いて決定した。すなわち、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）をTryptic soy寒天培地で30℃、24時間培養し、生育した菌体からゲノムDNAを抽出し、Miseq（イルミナ株式会社）で塩基配列の取得を行った。次に、実施例２で得られた精製プロテインアスパラギナーゼをSDS-PAGEに供し、目的のバンドを切り出し、トリプシン消化した。消化断片をLC-MS/MS分析に供し、同酵素の部分アミノ酸配列を取得した。そして、上述の方法で得られたゲノム配列情報、部分アミノ酸配列、及びN末端アミノ酸配列（配列番号1）から、プレプロ領域を含むルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列1355残基（配列番号2）及び同酵素をコードする遺伝子の塩基配列全長（配列番号3）を取得した。
実施例５：ルテイミクロビウム・アルバム由来プロテインアスパラギナーゼによるタンパク質の脱アミド化
　インスリンB鎖（シグマ社）を2.5 mg/mlとなるよう0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、基質溶液とした。45μLの基質溶液に対し、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼ溶液（約0.3 U/ml）を45μL又は対照として水を45μL添加し、37℃で1時間反応させた後、1 N塩酸を10μL添加して反応を停止させた。その後、遠心上清後の上清をフィルターろ過し、HPLCにより分析した。結果を図２に示す。対照区（実線）のインスリンB鎖の溶出時間が4.88 minであるのに対し、酵素添加区（破線）のインスリンB鎖の溶出時間は4.96 minであり、わずかに溶出時間のずれが見られた。そこで反応後の溶液をプロテインシーケンサー（島津製作所PPSQ-21A）に供したところ、酵素添加区のインスリンB鎖のN末端配列はPhe-Val-Asp-Gln-であることが確認された。一方、対照区のインスリンB鎖のN末端配列はPhe-Val-Asn-Gln-であった。よって、本酵素によりインスリンB鎖のN末端から3残基目のアスパラギンが脱アミドによりアスパラギン酸に変換されることが証明された。一方、N末端から4残基目のグルタミンには変化がなかった。
　続いて、種々タンパク質に対する反応性を調べるために、α-カゼイン（Sigma）、α-ラクトアルブミン（Sigma）、カゼインナトリウム（日本新薬：「ミプロダン」）、乳清タンパク質（ダビスコ社製：「ビプロ」）、豚由来酸ゼラチン（Sigma）、牛由来アルカリゼラチン（Sigma）、魚由来ゼラチン（ニッピ製）、コーンミールグルテン（シグマ社）、卵白アルブミン（シグマ社）をそれぞれ濃度が2％w/vになるようにリン酸ナトリウム緩衝液（0.02 M、pH6.5）に溶解した。また、脱脂粉乳溶液（よつ葉乳業、ローヒートタイプ）6％w/v溶液を同緩衝液に溶解した。各基質溶液100μLに対し、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼ溶液（約5 U/ml）を10μL添加し、37℃で1時間反応させた後、12％トリクロロ酢酸を100μL添加して反応を停止させた。次いで、反応液を遠心分離し、遠心上清中のアンモニアをアンモニア測定用Fキット（ロシュ社）により定量した。表３に示すように、本酵素が様々なタンパク質に対して作用することが確認できた。また、反応終了後の混合液の一部をSDS-PAGEに供し、対照と比較したところ、本酵素によるタンパク質の高分子化及びタンパク質の低分子化は観察されなかった。すなわち、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼには、タンパク質を架橋する活性やプロテアーゼ活性は検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例６：ルテイミクロビウム・アルバム由来プロテインアスパラギナーゼによるタンパク質の性質改変
　カゼインナトリウム（日本新薬、商品名：ミプロダン）を2％w/vとなるよう20mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解し、基質溶液とした。この基質溶液500μLに対し、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072（NITE P-01650）のプロテインアスパラギナーゼ溶液（0.68 U/mlまたは2.7 U/ml）を25μL添加し、37℃で1時間反応後、100℃で5分の処理で酵素を失活させた。0.68 U/mlの酵素溶液の添加区を試験区１、2.7 U/mlの酵素溶液の添加区を試験区２とした。対照として、酵素溶液の代わりに水を25μL添加して同様に処理を行った（対照区）。反応液中のアンモニア定量を行い、対照区の値を差し引いた結果、0.68 U/ml、2.7 U/mlの酵素溶液を添加したときのアンモニア遊離量はそれぞれ1.0 mM、1.3 mMであった。これらのサンプルについて、等電点電気泳動（IEF）を行った結果を図３に示す。本酵素を添加したサンプル（試験区１、２）はいずれも、対照区に比べ等電点（pI）が酸性側にシフトしており、脱アミド化によるタンパク質のpI低下が確認できた。
　対照区及び試験区２のサンプルについて、溶解性を以下の方法で調べた。サンプル5μLに各pHバッファー（下記）を200μL添加し、室温で5分静置後15,000 rpm、5 minで遠心分離を行い、その上清中のタンパク質濃度をブラッドフォード法により定量した。対照区のpH9.0のタンパク質濃度を100％としたときの相対値を溶解度として算出し、その結果を図４に示す。本酵素を添加した試験区２では、対照区に比べて、特にpH5.0付近における溶解性が増加しており、脱アミド化によるタンパク質の溶解性向上が確認された。
　pHバッファー：酢酸バッファー（pH4～6.0）、リン酸バッファー（pH6.0～7.5）、トリス塩酸バッファー（pH7.5～9.0）；いずれも濃度は0.2M。
＜トランスグルタミナーゼとの併用効果＞
　トランスグルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基間にイソペプチド結合を形成し、タンパク質を架橋させる酵素である。トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼは、いずれもタンパク質中のグルタミンを基質とするため、これらを併用すると反応が競合するという課題がある。一方、本発明のプロテインアスパラギナーゼは、タンパク質中のアスパラギンを基質とするので、トランスグルタミナーゼと競合することなく、よって、これらを併用することにより脱アミド化の効果と架橋の効果の両方を得ることができる。そこで、本実施例では、プロテインアスパラギナーゼとプロテイングルタミナーゼについて、トランスグルタミナーゼの併用効果を比較した。トランスグルタミナーゼとしては、アクティバ（登録商標）TG原末からの精製品を、プロテイングルタミナーゼとしては、WO2006/075771記載の方法で調製した精製品を、それぞれ用いた。比較として、カゼインナトリウム 2％v/v溶液500μLに対し、プロテイングルタミナーゼ（10 U/ml）を25μL添加し、37℃で1時間反応後、100℃で5分の処理で酵素を失活させた（比較区）。対照区、試験区２、比較区のカゼイン溶液に、トランスグルタミナーゼをカゼイン1 g当たり6.5U添加し、37℃で100分間反応させた後、95℃で5分処理により酵素を失活させた。各反応液をSDS-PAGEに供し、カゼインの分子量変化を調べた。結果を図４に示す。比較区（プロテイングルタミナーゼ処理カゼイン）ではトランスグルタミナーゼによる架橋が抑制されているのに対し、試験区２（プロテインアスパラギナーゼ処理カゼイン）では対照区とほぼ同様に架橋物の形成が確認できた。よって、トランスグルタミナーゼとプロテインアスパラギナーゼを併用することで、架橋による物性強化と同時に、脱アミド化による溶解性等の機能向上も見込めることが示唆された。
実施例７：レイフソニア・キシリー由来プロテインアスパラギナーゼの解析
　実施例１で得られた微生物から、レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）AJ111071（NITE P-01649）を選択し、以下の実験を行った。
　培地C（下記）にレイフソニア・キシリーAJ111071（NITE P-01649）を接種し、30℃、24時間振盪培養して培養液を得た。
　培地C：蒸留水にYeast Carbon Baseを1.17％溶解後フィルター濾過滅菌したものと、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）済み1％カゼインナトリウム（和光純薬）溶液を等量ずつ混合した。培地のpHは7.2に調整した。
　培養液を15000 rpm、15分遠心分離し得られた上清を用いてプロテアーゼ活性を測定したところ、活性は検出されなかった。また、上清中のプロテインアスパラギナーゼ活性は0.029 U/mlであった。
　2％カゼインナトリウム溶液100μlを基質として100μlの上清と3時間反応させた後、200μlの12％TCAを添加して反応を停止した。対照区として、12％TCAを添加してから上清を添加したものも同様に調製した。それぞれアンモニア定量を行い、3時間反応後の反応液のアンモニア量から対照区の値を差し引いた結果、0.289 mMのアンモニアが遊離し、本菌の生産する酵素がカゼインを脱アミド化することが確認された。
　実施例５と同様の方法により、インスリンB鎖を基質として培養上清と反応させた。37℃で2時間、8時間反応させた反応液を、それぞれHPLC分析した結果を図５に示す。2時間反応したものでは未反応の基質と反応生成物の両方のピークが見られ、8時間反応したものでは全て反応生成物に変換された。8時間反応後の反応液をプロテインシーケンサーに供したところ、インスリンB鎖のN末端配列から3残基目のアスパラギンが脱アミドによりアスパラギン酸に変換されていることが確認された。尚、N末端から4残基目のグルタミンには変化がなかった。
実施例８：アグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼの解析（１）
　実施例１で得られた微生物から、アグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）AJ111073（NITE BP-01782）を選択し、実施例２～４と同様に実験を行った。すなわち、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）の培養液からプロテインアスパラギナーゼを精製し、SDS-PAGEに供した。目的のバンドを切り出した後、トリプシン消化し、酵素のトリプシン消化物からペプチドを分取し、プロテインシークエンサー（島津製作所PPSQ-21A）に供した。その結果、配列番号4に示す12残基の内部アミノ酸配列（Ala-Arg-Gly-Gln-Leu-Ile-Leu-Asp-Thr-Leu-Thr-Met）を決定した。予め次世代シーケンサーにより取得したアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）の全ゲノム配列をデータベースとして、配列番号4のアミノ酸をコードする遺伝子を検索したところ、プレプロ領域を含むアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列1180残基（配列番号5）及び同酵素をコードする遺伝子の塩基配列全長（配列番号6）を取得した。
実施例９：アグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼの解析（２）
＜１＞アグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼの精製
　実施例１で得られた微生物から、アグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）AJ111073（NITE BP-01782）を選択し、以下の実験を行った。
＜１－１＞培養
　培地C（下記）にアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）を接種し、37℃、24時間振盪培養して培養液を得た。
　培地C：蒸留水にYeast Carbon Baseを1.17%溶解後フィルター濾過滅菌したものと、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）済み1%トリプトンペプトン（Difco製）溶液を等量ずつ混合した。培地のpHは7.2に調整した。
＜１－２＞プロテインアスパラギナーゼの活性化処理
　得られた培養液にBacillus subtilisの培養上清（下記）を1/10量混合し、一晩静置した。この操作により、培養液上清のプロテインアスパラギナーゼ活性が0.005U/mlから1.06U/mlに向上した。
　Bacillus subtilisの培養上清：Bacillus subtilis subsp. subtilisT JCM1465を上述の培地Cに接種し、37℃、24時間振盪培養して培養液を得た。得られた培養液を4℃、8,000rpm、15分間の遠心分離により菌体を除去し、Stericup 0.22μm（ミリポア社製）でフィルター濾過し、培養上清を得た。
＜１－３＞プロテインアスパラギナーゼの精製と分子量確認
　活性化処理後の培養液を4℃、40,000rpm、1時間の遠心分離により菌体を除去し、得られた遠心上清をStericup 0.22μm（ミリポア社製）でフィルター濾過した。終濃度2.0MのNaClを溶解し、2.0M NaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化した疎水クロマトグラフィー用カラムHiprep Phenyl FF 10/16（GE ヘルスケア社製）に供した。2.0Mから0MのNaCl直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させて活性画分を集め、20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）へバッファー交換した。同緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムHiprep DEAE FF 10/16（GE ヘルスケア社製）に供して、0Mから0.5Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させた。精製テーブルを表４に示す。活性画分を還元剤含有SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用サンプルバッファーと混合し熱処理後、4-12％Bis-Tris gel(Invitrogen, NuPAGE) で電気泳動し、泳動後のゲルをSimplyBlue SafeStain（Invitrogen製）にて染色した。結果を図６に示す。活性の大きさとバンドの濃さから判断すると、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼの分子量は、約12万であることが判明した。また、最終精製工程により得られた活性画分には、遊離のアスパラギンに作用するアスパラギナーゼ活性及びタンパク質を分解するプロテアーゼ活性は検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜２＞アグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼの内部アミノ酸配列及びN末端アミノ酸配列の決定
　電気泳動後のゲルからプロテインアスパラギナーゼに該当するバンドを切り出し、ゲル内消化を行った。すなわち、切り出したゲル片を洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを含むトリス塩酸緩衝液（ｐH8.5）を加えて、35℃、20時間の処理を行った。次いで、処理後のサンプルを逆相HPLCに供し、断片ペプチドを分離した。分析可能なペプチドピークを分取し、プロテインシークエンサー（Procise 494 HT Protein Sequencing System）に供したところ、Ala-Arg-Gly-Gln-Leu-Ile-Leu-Asp-Thr-Leu-Thr-Met（配列番号４）を含む配列が確認された。また、上記で得られた精製プロテインアスパラギナーゼをプロテインシークエンサー（島津製作所PPSQ-21A）に供し、5残基のN末端アミノ酸配列を決定した。アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼ（成熟タンパク質）のN末端アミノ酸配列は、Ala-Ala-Thr-Glu-Asp（配列番号１２）であった。
実施例１０：プロテインアスパラギナーゼ前駆体のプロセシングによる活性化
　実施例１で得られた微生物から、アグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）AJ111073（NITE BP-01782）を選択し、培養液中のプロテインアスパラギナーゼ前駆体を成熟体に変換するプロセッシング酵素の検討を行った。
　市販の各種プロテアーゼの1%水溶液（液体のものは100倍希釈液）を調製し、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）の培養液に対し5%v/v量添加し、室温で30分静置した。プロテアーゼ処理後の培養液のプロテインアスパラギナーゼ活性を表５に示す。表中、「PA act.」はプロテインアスパラギナーゼ活性を意味する。培養液のプロテインアスパラギナーゼ活性は、活性化前（プロテアーゼ処理前）には0.21U/mLであったが、プロテアーゼ処理により4.6～5.7U/mLにまで向上した。また、Bacillus subtilisの培養上清（下記）をアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）の培養液に対し10%v/v量添加し、室温で30分静置することによっても同様の活性化効果が得られた（表５）。
　Bacillus subtilisの培養上清：Bacillus subtilis subsp. subtilisT JCM1465を上述の培地Cに接種し、37℃、24時間振盪培養して培養液を得た。得られた培養液を4℃、8,000rpm、15分間の遠心分離により菌体を除去し、Stericup 0.22μm（ミリポア社製）でフィルター濾過し、培養上清を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼ前駆体のN末端アミノ酸配列を決定したところ、VPEHGVIASGD（配列番号１３）であり、成熟体のN末端アミノ酸配列（配列番号１２）の114残基上流に位置することがわかった。
実施例１１：アグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼによるゼラチンの改質
　豚由来酸ゼラチン（新田ゼラチン製）の5％wt水溶液（pH7.0に調整）を調製した。水溶液に対し、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼをゼラチン原料1 g当たり1U、2U、または10U添加し、37℃で2時間の処理を行った。比較として、酵素の代わりに水を加えて同様に処理したものを調製した。反応終了後のサンプルを水で50倍希釈し、自動滴定装置（MPT-2）付のゼータ電位計（マルバーン社：ゼータサイザーナノZS）を用いて等電点（pI）を調べた結果を表６に示す。酵素添加量の増加に伴い、ゼラチンの等電点は低下し、表面電荷の異なるゼラチンが作製できた。このように、本発明のプロテインアスパラギナーゼを用いることにより、ゼラチンタンパク質の機能発現において重要な表面電荷を制御することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜プロテイングルタミナーゼとの併用効果（１）＞
　豚由来酸ゼラチンおよび牛由来アルカリゼラチン（いずれも新田ゼラチン製）の5％wt水溶液（pH7.0に調整）をそれぞれ調製した。各水溶液に対し、まずアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼをゼラチン原料1 g当たり15U添加した。続いてすぐに、WO2006/075771記載の方法で調製したプロテイングルタミナーゼ（精製酵素）をゼラチン原料1 g当たり50 U添加し、37℃で2時間の処理を行った。酸ゼラチン、アルカリゼラチンを酵素処理した区を、それぞれ試験区A、試験区Bとした。対照として、酵素の代わりに水を添加して同様に処理を行い、それぞれ対照区A、対照区Bとした。反応終了後、これらのサンプルを水で50倍希釈し、上述と同様の手法で等電点（pI）を調べたところ、対照区A、BのpIがそれぞれ8.98、5.03であったのに対し、試験区A、BのpIはそれぞれ4.85、4.81となり、いずれもpIが酸性側にシフトすることを確認した。特に、酵素処理酸ゼラチン（試験区A）については、pIの著しい変化がもたらされ、ゼラチンの電気的性質が大きく変化することが示された。また、酵素処理アルカリゼラチン（試験区B）についても、pIの更なる低下が認められた。
＜プロテイングルタミナーゼとの併用効果（２）＞
　魚由来酸ゼラチン（ニッピ製）および牛由来アルカリゼラチン（Sigma製）それぞれの1％wt水溶液を20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で調製した。各水溶液に対し、まずアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）のプロテインアスパラギナーゼをゼラチン原料1 g当たり50 U添加し、37℃で1時間の処理を行った。次いで、WO2006/075771記載の方法で調製したプロテイングルタミナーゼ（精製酵素）をゼラチン原料1 g当たり80 U添加し、55℃で1時間の処理を行った。次いで、100℃で5分の処理で酵素を失活させた。酸ゼラチンおよびアルカリゼラチンを酵素処理した区を、それぞれ試験区A、試験区Bとした。対照として、酵素の代わりに水を添加して同様に処理を行い、それぞれ対照区A、対照区Bとした。これらのサンプルについて、ゼータ電位計（マルバーン社：ゼータサイザーナノZS）を用いて等電点（pI）を調べたところ、対照区A、BのpIがそれぞれ8.63、5.25であったのに対し、試験区A、BのpIはそれぞれ4.59、4.61となり、いずれもpIが酸性側にシフトすることを確認した。特に、酵素処理酸ゼラチン（試験区A）については、pIの著しい変化がもたらされ、ゼラチンの電気的性質が大きく変化することが示された。また、酵素処理アルカリゼラチン（試験区B）についても、pIの更なる低下が認められた。
　このように、プロテインアスパラギナーゼにより、食品用途、医療用途、工業用途など幅広く利用されているゼラチンを高品質化や高付加価値化できると期待できる。
実施例１２：プロテインアスパラギナーゼの異種発現
＜１＞Corynebacterium glutamicumによるアグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼの分泌発現
＜１－１＞プロテインアスパラギナーゼの分泌発現プラスミドの構築
　プロテインアスパラギナーゼを異種発現させる場合、本来有するプロ配列をN末端側に有した形態でプロテインアスパラギナーゼを発現させることが、プロテインアスパラギナーゼの構造安定化に寄与する可能性がある。ある目的タンパク質を、当該目的タンパク質以外のアミノ酸配列と融合させた形で発現させる場合、目的タンパク質のアミノ酸配列と、融合させたアミノ酸配列との間に特定の基質特異性の高いプロテアーゼ認識配列を配位する事により、発現した融合タンパク質を特定のプロテアーゼで切断し、簡便に目的タンパク質を得る方法が広く知られている。一方、基質特異性の高いプロテアーゼとして、Factor XaプロテアーゼやProTEVプロテアーゼなどが知られており、それぞれタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg（=IEGR）（配列番号１４）およびGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln（=ENLYFQ）（配列番号１５）の配列を認識して各配列のC末端側を特異的に切断する。よって、例えば、プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼにおいて、プロテインアスパラギナーゼのプロ配列アミノ酸残基をコードする塩基配列と成熟プロテインアスパラギナーゼをコードする塩基配列との間にFactor Xaプロテアーゼの認識配列（IEGR）もしくはProTEVプロテアーゼの認識配列（ENLYFQ）をコードする塩基配列を挿入したプロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ遺伝子を構築し、プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼを発現させる事によって、これらのプロテアーゼを用いて、簡便にプロ配列融合プロテインアスパラギナーゼからプロ配列を除去し、成熟プロテインアスパラギナーゼを得る事が可能となる。
　C. glutamicumのコドン頻度を考慮し、Ｎ末から順に、C. ammoniagenes由来CspAタンパク質のシグナル配列（WO2013/06029）、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列（ENLYFQG）、およびアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体の配列が連結された融合タンパク質（配列番号１７）をコードするDNA配列（配列番号１６）を設計した（図１０）。更に、そのDNA配列（配列番号１６）の直前にCspBプロモータ領域を配置し、5'側に制限酵素KpnＩ、3'側にBamHＩの認識配列を付与したDNA配列（配列番号１８）を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpPK4（カナマイシン耐性遺伝子を搭載したCorynebacterium-E. coliシャトルベクター；特開平9-322774）へクローニングした。具体的には、合成したDNA配列（配列番号１８）およびpPK4を制限酵素KpnＩ及びBamHＩで二ヵ所同時切断後に、両DNA断片を連結し、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TaKaRa製）を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体から常法によりプラスミドDNAを抽出し、DNA配列決定により目的とするプラスミドを確認し、これをpPK4-Pro-TEV-PAと命名した。
＜１－２＞C. glutamicumによるプロテインアスパラギナ－ゼの分泌発現
　次に、常法に従って、pPK4-Pro-TEV-PAでC. glutamicum YDK010株（WO2004/029254）を形質転換し、YDK010/ pPK4-Pro-TEV-PA株を得た。なお、C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）の細胞表層タンパク質PS2（CspB）の欠損株である（WO2004/029254）。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。YDK010/ pPK4-Pro-TEV-PA株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整）で30 ℃、72時間培養した。培養72時間後の培養液を遠心分離（13,800xg, 2分）した後、その上清4μLを還元SDS-PAGEに供し、SimplyBlue SafeStain（Novex製）にて染色を行い、培養液中に分泌されているタンパク質を分析した。その結果、プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼの予想される分子量サイズである115 kDa付近にバンドを確認した（図１１）。プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸組成は酸性アミノ酸が多いため、115 kDaよりもやや高分子量側にシフトしているものと推測された。
　本融合タンパク質は、プロ配列と成熟プロテインアスパラギナーゼの連結部にProTEVの認識配列を有しているため、本融合タンパク質をProTEVで切断することで、成熟プロテインアスパラギナーゼを取得することができる。そこで、粗酵素液（培養上清）中の本融合タンパク質をProTEVにより切断することで成熟プロテインアスパラギナーゼへプロセッシングし、プロテインアスパラギナーゼ活性が認められるかどうかを検討した。上記のようにして得られた粗酵素液（培養上清）をVivaspin 10,000MWCO（GEヘルスケア製）を用いて約9倍に濃縮し、ProTEVによるプロセッシングを行った。プロセッシングは、濃縮粗酵素液40μlに対してProTEV Plus（Promega）4μl、10×buffer（1M NaCl, 500mM Tris-HCl, 50mM CaCl2, pH8.0）10μl、miliQ水 46μlを添加し、25℃で2時間インキュベートすることにより行った。ProTEV処理後の濃縮粗酵素液のプロテインアスパラギナーゼ活性を測定したところ、0.37U/mlであった。以上の結果から、C. glutamicumによりアグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼを分泌発現することができた。
＜２＞E.coliによるプロテインアスパラギナーゼの菌体内発現
＜２－１＞アグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）由来プロテインアスパラギナーゼの発現
　E.coliのコドン頻度を考慮し、Ｎ末から順に、アグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列（ENLYFQG）、およびアグロマイセス属の１種AJ111073（NITE BP-01782）由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体（成熟PA）の配列が連結された融合タンパク質（配列番号２０）をコードするDNA配列（配列番号１９）を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpCold TF DNA（TaKaRa）へクローニングした。pCold TF DNAは、シャペロンであるトリガーファクター（TF）を可溶化タグとして目的タンパク質に融合した形態で目的遺伝子が発現するようにデザインされた、目的タンパク質の転写が低温で誘発されるコールドショック発現ベクターである。クローニングは、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いて以下の手順で実施した。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF DNAを鋳型として、配列番号２１および配列番号２２のプライマーを用いたPCRにより行った。融合タンパク質をコードするクローニング用DNA断片の増幅は、合成したDNA配列（配列番号１９）を鋳型として、配列番号２３および配列番号２４のプライマーを用いたPCRにより行った。ポリメラーゼとしてはPrime STAR GXL（TOYOBO）を使用した。PCRは、「98℃-10秒、60℃-15秒、68℃-60秒」のサイクルを30回実施した。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体から、TFをコードするDNAの下流に正しくプロ配列、ProTEV認識配列、および成熟PA配列の融合タンパク質をコードするDNAが連結された、アグロマイセス属の１種由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ（proPA_Agro）の発現プラスミド（pCTF-proPA_Agroと命名）を有する株を取得した。
　得られた株から、プラスミド抽出キットQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いてpCTF-proPA_Agroを抽出した。pCTF-proPA_Agroを用いてE. coli Rosetta2株（Novagen）を形質転換し、proPA_Agroの発現株E. coli Rosetta2/pCTF-proPA_Agroを作製した。本発現株を、終濃度100μg/mlとなるようアンピシリンを添加したLB寒天培地（Difco製）で、37℃にて1晩培養しシード培養を行った。終濃度100μg/mlとなるようアンピシリンを添加した新たなLB培地へ、1μｌのイノキュレートループで植菌し、37℃で3時間程度振とう培養を行った後、終濃度1 mMとなるようイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、培養温度を15℃へ下げて、pCTF-proPA_AgroのcspAプロモーターからの転写を誘導した（低温誘導）。15℃で24時間培養を行った後、菌体を遠心分離にて回収した。また、コントロールとして、低温誘導直前の菌体も同様にして回収した。次に、培養液1 ml分の菌体を、20 mM Tris-HCl (pH8.0) 350μlに懸濁したのち、超音波破砕機UCD-250（コスモバイオ製）を用いて冷却条件下で「30秒ON－30秒OFF」のサイクルを10回繰り返すことで破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（21,600xg, 4℃で10分間）に供して不溶性画分を除き、上清画分を粗抽出液とした。続いて、粗抽出液13μlに、NuPAGE LDSサンプルバッファー（Novex製）5μl、NuPAGEサンプル還元試薬（Novex製）2μlを加え、70℃で10分間熱処理後、NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel（Novex製）を用いて電気泳動を行った。その結果、図１２に示すように、発現プラスミドでの低温誘導前に比べて低温誘導後のサンプルにおいて、目的とする分子量176 kDa付近に顕著なタンパク質のバンドが観察された。なお、TFの理論分子量は52kDa、proPA_Agroの理論分子量は124kDaであるので、今回の発現実験における目的タンパク質であるTF-proPA_Agro融合タンパク質の分子量は約176kDaと推定される。
　本融合タンパク質は、pro配列と成熟PAの連結部にプロテアーゼProTEVの切断認識部位（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）を有しているため、本融合タンパク質をProTEV（Novagen）で切断することで、成熟PAを取得することができる。そこで、低温誘導後の粗抽出液中のPAをProTEVにより切断することで成熟PAへプロセッシングし、PA活性が認められるかどうかを検討した。上記のようにして得られた粗酵素液をVivaspin 10,000MWCO（GEヘルスケア製）を用いて約20倍に濃縮し、ProTEVによりプロセッシングした。ProTEV処理後の濃縮粗酵素液を用いてPA活性測定を行ったところ、0.069U/mlであった。以上の結果から、E.coliによりアグロマイセス属の１種由来プロテインアスパラギナーゼを菌体内発現することができた。
＜２－２＞レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）由来プロテインアスパラギナーゼの発現
　E.coliのコドン頻度を考慮し、Ｎ末から順に、レイフソニア・キシリーAJ111071（NITE P-01649）由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列（ENLYFQG）、およびレイフソニア・キシリーAJ111071（NITE P-01649）由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体（成熟PA）の配列が連結された融合タンパク質（配列番号２６）をコードするDNA配列（配列番号２５）を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpCold TF DNA（TaKaRa）へクローニングした。以下、特記しない限り、実験手順は実施例１２＜２－１＞と同様である。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF DNAを鋳型として、配列番号２１および配列番号２２のプライマーを用いたPCRにより行った。融合タンパク質をコードするクローニング用DNA断片の増幅は、合成したDNA配列（配列番号２５）を鋳型として、配列番号２７および配列番号２８のプライマーを用いたPCRにより行った。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体から、TFをコードするDNAの下流に正しくプロ配列、ProTEV認識配列、および成熟PA配列の融合タンパク質をコードするDNAが連結された、レイフソニア・キシリー由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ（proPA_Leif）の発現プラスミド（pCTF-proPA_Leifと命名）を有する株を取得した。
　得られた株からプラスミド抽出をし、E. coli Rosetta2株（Novagen）の形質転換、proPA_Leif発現株の培養、粗抽出液の調製を行った。粗抽出液を電気泳動に供したところ、図１２に示すように、発現プラスミドでの低温誘導前に比べて低温誘導後のサンプルにおいて、目的とする分子量159 kDa付近に顕著なタンパク質のバンドが観察された。なお、TFの理論分子量は52kDa、proPA_Leifの理論分子量は107kDaであるので、今回の発現実験における目的タンパク質であるTF-proPA_Leif融合タンパク質の分子量は約159kDaと推定される。
　本融合タンパク質は、pro配列と成熟PAの連結部にプロテアーゼProTEVの切断認識部位（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）を有しているため、本融合タンパク質をProTEV（Novagen）で切断することで、成熟PAを取得することができる。そこで、低温誘導後の粗抽出液中のPAをProTEVにより切断することで成熟PAへプロセッシングし、PA活性が認められるかどうかを検討した。粗酵素液をVivaspin 10,000MWCO（GEヘルスケア製）を用いて約20倍に濃縮し、ProTEVで2時間処理しpro配列の切断を行った。ProTEV処理後の濃縮粗酵素液を用いてPA活性測定を行ったところ、0.047U/mlであった。以上の結果から、E.coliによりレイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）由来プロテインアスパラギナーゼを菌体内発現することができた。
＜２－３＞ミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）由来プロテインアスパラギナーゼの発現
　E.coliのコドン頻度を考慮し、Ｎ末から順に、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列（ENLYFQG）、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体（成熟PA）の配列が連結された融合タンパク質（配列番号３０）をコードするDNA配列（配列番号２９）を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpCold TF DNA（TaKaRa）へクローニングした。以下、特記しない限り、実験手順は実施例１２＜２－１＞と同様である。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF DNAを鋳型として、配列番号２２および配列番号２３のプライマーを用いたPCRにより行った。融合タンパク質をコードするDNA断片の増幅は、合成したDNA配列（配列番号２９）を鋳型として、配列番号３１および配列番号３２のプライマーを用いたPCRにより行った。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体から、TFをコードするDNAの下流に正しくプロ配列、ProTEV認識配列、および成熟PA配列の融合タンパク質をコードするDNAが連結された、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ（proPA_Micro）の発現プラスミド（pCTF-proPA_Microと命名）を有する株を取得した。
　得られた株からプラスミド抽出をし、E. coli Rosetta2株（Novagen）の形質転換、proPA_Micro発現株の培養、粗抽出液の調製を行った。粗抽出液を電気泳動に供したところ、図１２に示すように、発現プラスミドでの低温誘導前に比べて低温誘導後のサンプルにおいて、目的とする分子量174 kDa付近に顕著なタンパク質のバンドが観察された。なお、TFの理論分子量は52kDa、proPA_Microの理論分子量は122kDaであるので、今回の発現実験における目的タンパク質であるTF-proPA_Micro融合タンパク質の分子量は約174kDaと推定される。
　本融合タンパク質は、pro配列と成熟PAの連結部にプロテアーゼProTEVの切断認識部位（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）を有しているため、本融合タンパク質をProTEV（Novagen）で切断することで、成熟PAを取得することができる。そこで、低温誘導後の粗抽出液中のPAをProTEVにより切断することで成熟PAへプロセッシングし、PA活性が認められるかどうかを検討した。粗酵素液をVivaspin 10,000MWCO（GEヘルスケア製）を用いて約20倍に濃縮し、ProTEVで2時間処理しpro配列の切断を行った。ProTEV処理後の濃縮粗酵素液を用いてPA活性測定を行ったところ、0.022U/mlであった。以上の結果から、E.coliによりミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）由来プロテインアスパラギナーゼを菌体内発現することができた。
　本発明により、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する新規タンパク質脱アミド酵素（プロテインアスパラギナーゼ）が提供される。一態様においては、同酵素を利用して、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化し、タンパク質の機能性を改善することができる。
　〔配列表の説明〕
配列番号１：Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼのN末端アミノ酸配列（5残基）
配列番号２：Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列（プレプロ領域を含む）
配列番号３：Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼ遺伝子の塩基配列全長
配列番号４：Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼの内部アミノ酸配列（１２残基）
配列番号５：Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列（プレプロ領域を含む）
配列番号６：Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼ遺伝子の塩基配列全長
配列番号７：Microbacterium testaceum由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号８：Leifsonia xyli由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号９：Leifsonia aquatica由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号１０：配列番号２および５の共通アミノ酸配列
配列番号１１：配列番号２、５、７、および８の共通アミノ酸配列
配列番号１２：Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼの成熟タンパク質のN末端アミノ酸配列（5残基）
配列番号１３：Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼの前駆体（プロタンパク質）のN末端アミノ酸配列（11残基）
配列番号１４：Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号１５：ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号１６：C. glutamicumによる分泌発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１７：C. glutamicumによる分泌発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号１８：C. glutamicumによる分泌発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子を含む挿入断片の塩基配列
配列番号１９：E. coliによる菌体内発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２０：E. coliによる菌体内発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号２１～２４：プライマー
配列番号２５：E. coliによる菌体内発現用のLeifsonia xyli由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２６：E. coliによる菌体内発現用のLeifsonia xyli由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号２７、２８：プライマー
配列番号２９：E. coliによる菌体内発現用のMicrobacterium testaceum由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３０：E. coliによる菌体内発現用のMicrobacterium testaceum由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号３１、３２：プライマー

Claims (22)

  1. 　タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
  2. 　タンパク質中のペプチド結合を加水分解する反応を触媒する活性を実質的に有さない、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 　下記（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１または２に記載のタンパク質：
    （Ａ）配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、配列番号１０の６３～１２６０位、２４５～１３７８位、２４５～１２６０位、若しくは１３１～１２６０位のアミノ酸配列、または配列番号１１の４７～１２５７位、５９～１２５８位、９６～１１０１位、２４１～１３７８位、２４４～１２５８位、２４４～１２５７位、２４４～１１０１位、１２９～１２５８位、１２０～１２５７位、若しくは１２０～１１０１位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ｂ）配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、配列番号１０の６３～１２６０位、２４５～１３７８位、２４５～１２６０位、若しくは１３１～１２６０位のアミノ酸配列、または配列番号１１の４７～１２５７位、５９～１２５８位、９６～１１０１位、２４１～１３７８位、２４４～１２５８位、２４４～１２５７位、２４４～１１０１位 、１２９～１２５８位、１２０～１２５７位、若しくは１２０～１１０１位のアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
    （Ｃ）配列番号１０若しくは１１に示すアミノ酸配列、配列番号１０の６３～１２６０位、２４５～１３７８位、２４５～１２６０位、若しくは１３１～１２６０位のアミノ酸配列、または配列番号１１の４７～１２５７位、５９～１２５８位、９６～１１０１位、２４１～１３７８位、２４４～１２５８位、２４４～１２５７位、２４４～１１０１位 、１２９～１２５８位、１２０～１２５７位、若しくは１２０～１１０１位のアミノ酸配列に対し、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
  4. 　下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質：
    （ａ）配列番号２、５、７、８、若しくは９に示すアミノ酸配列、配列番号２の２４０～１３５５位のアミノ酸配列、配列番号５の１８１～１１８０位若しくは６７～１１８０位のアミノ酸配列、配列番号７の１９３～１１７２位若しくは７０～１１７２位のアミノ酸配列、または配列番号８の１４６～９８９位若しくは２１～９８９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２、５、７、８、若しくは９に示すアミノ酸配列、配列番号２の２４０～１３５５位のアミノ酸配列、配列番号５の１８１～１１８０位若しくは６７～１１８０位のアミノ酸配列、配列番号７の１９３～１１７２位若しくは７０～１１７２位のアミノ酸配列、または配列番号８の１４６～９８９位若しくは２１～９８９位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２、５、７、８、若しくは９に示すアミノ酸配列、配列番号２の２４０～１３５５位のアミノ酸配列、配列番号５の１８１～１１８０位若しくは６７～１１８０位のアミノ酸配列、配列番号７の１９３～１１７２位若しくは７０～１１７２位のアミノ酸配列、または配列番号８の１４６～９８９位若しくは２１～９８９位のアミノ酸配列に対し、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  6. 　請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  7. 　請求項６に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
  8. 　請求項７に記載の形質転換体を培地で培養し、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
  9. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該タンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
  10. 　前記微生物が、アクチノバクテリア（Actinobacteria）綱に属する細菌である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記細菌が、ルテイミクロビウム（Luteimicrobium）属、アグロマイセス（Agromyces）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、またはレイフソニア（Leifsonia）属に属する細菌である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細菌が、ルテイミクロビウム・アルバム（Luteimicrobium album）、アグロマイセス属の１種（Agromyces sp.）、ミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）、レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）、またはレイフソニア・アクアティカ（Leifsonia aquatica）である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記タンパク質をプロセッシング酵素で処理することを含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記プロセッシング酵素がプロテアーゼである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　タンパク質及び／又はペプチドに、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質を作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質及び／又はペプチドの製造法。
  16. 　前記タンパク質及び／又はペプチドが、飲食品又はその原料に含有されている、請求項１５に記載の方法。
  17. 　さらに、トランスグルタミナーゼ及び／又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び／又はペプチドに作用させることを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 　タンパク質及び／又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質を作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法。
  19. 　タンパク質及び／又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質を作用させることを含む、改質された飲食品又はその原料の製造法。
  20. 　さらに、トランスグルタミナーゼ及び／又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び／又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 　前記飲食品が、マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、ヨーグルト、肉製品、およびパンから選択される、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記タンパク質及び／又はペプチド１ｇ当たり、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質が０．００１～５００Ｕ使用される、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。
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Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021002435A1 (ja) 2019-07-03 2021-01-07 味の素株式会社 改質したえんどう豆たん白質の製造方法
WO2021049591A1 (ja) * 2019-09-12 2021-03-18 天野エンザイム株式会社 植物タンパク質濃縮物の製造方法
JPWO2021187510A1 (ja) * 2020-03-17 2021-09-23
WO2021201277A1 (ja) 2020-04-03 2021-10-07 天野エンザイム株式会社 蛋白質の脱アミド方法
WO2021251344A1 (ja) 2020-06-08 2021-12-16 天野エンザイム株式会社 タンパク質の食感改良
WO2022014542A1 (ja) 2020-07-13 2022-01-20 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質食品の製造方法
WO2022045151A1 (ja) 2020-08-24 2022-03-03 天野エンザイム株式会社 改変タンパク質の製造方法
JP2022521426A (ja) * 2019-02-26 2022-04-07 アマノ エンザイム ユーエスエー カンパニー，リミテッド 安定なタンパク質製剤
WO2022102723A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 天野エンザイム株式会社 加工植物性タンパク質含有液状組成物の製造方法
WO2022118914A1 (ja) 2020-12-04 2022-06-09 天野エンザイム株式会社 液体酵素製剤
WO2022138872A1 (ja) 2020-12-24 2022-06-30 天野エンザイム株式会社 コメタンパク質含有液状組成物の製造方法
JPWO2022181672A1 (ja) * 2021-02-25 2022-09-01
WO2022215688A1 (ja) 2021-04-05 2022-10-13 アマノ エンザイム ヨーロッパ リミテッド 加工ヘンプタンパク質含有液状組成物の製造方法
WO2022244875A1 (ja) 2021-05-21 2022-11-24 天野エンザイム株式会社 加工オート飲食品又は食品素材の製造方法
JP2023515818A (ja) * 2020-02-28 2023-04-14 インポッシブル フーズ インコーポレイテッド タンパク質生産のための材料および方法
WO2023214553A1 (ja) 2022-05-06 2023-11-09 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有液状組成物の食感改善剤
WO2023214554A1 (ja) 2022-05-06 2023-11-09 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有組成物の増粘剤
WO2023228953A1 (ja) 2022-05-23 2023-11-30 天野エンザイム株式会社 液体酵素製剤
JP2023550969A (ja) * 2020-11-26 2023-12-06 アツィエス・ビオ・デ・オ・オ イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニンを産生することが可能な遺伝子組換え細菌
WO2024010087A1 (ja) 2022-07-07 2024-01-11 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有組成物の香気変化方法及び呈味増強方法
WO2024090579A1 (ja) 2022-10-28 2024-05-02 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質及び油脂を含む液状組成物の乳化性向上剤及び起泡性向上剤
WO2024172142A1 (ja) 2023-02-15 2024-08-22 天野エンザイム株式会社 加工植物性タンパク質含有液状組成物の製造方法
WO2024210190A1 (ja) * 2023-04-06 2024-10-10 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有液状組成物のミネラル富化剤
WO2024257876A1 (ja) 2023-06-14 2024-12-19 天野エンザイム株式会社 液体酵素製剤
WO2025037649A1 (ja) 2023-08-17 2025-02-20 天野エンザイム株式会社 植物性飲食品の起泡性向上方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3415622A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-19 Evonik Degussa GmbH Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases
BE1027671B1 (nl) * 2019-08-12 2021-05-10 Anheuser Busch Inbev Sa Poedervormige eiwitsamenstelling
US20220046952A1 (en) * 2020-08-12 2022-02-17 Ajinomoto Health & Nutrition North America Inc. Production method for bone broth
WO2022045152A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03 天野エンザイム株式会社 タンパク質脱アミド酵素により処理された植物性ミルク
US20240081368A1 (en) * 2021-01-29 2024-03-14 Kansas State University Research Foundation Modified plant proteins with enhanced functional properties for food uses
CN116406733A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 华东师范大学 一种蛋白质谷氨酰胺酶改性酪蛋白及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001218590A (ja) * 1999-12-03 2001-08-14 Amano Enzyme Inc 新規蛋白質脱アミド酵素、それを生産する微生物、それをコードする遺伝子、その製造法及び用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6756221B1 (en) 1999-06-03 2004-06-29 Amano Enzyme Inc. Protein-deamidating enzyme, microorganism producing the same, gene encoding the same, production process therefor, and use thereof
US6251651B1 (en) 1998-06-04 2001-06-26 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Protein-deamidating enzyme, gene encoding the same, production process therefor, and use thereof
CN1304592C (zh) 2001-02-27 2007-03-14 天野酶株式会社 乳蛋白的脱酰胺化方法和乳蛋白的变性方法
ES2547222T3 (es) 2005-01-13 2015-10-02 Ajinomoto Co., Inc. Producto cárnico transformado o producto de pasta de pescado y procedimiento para su producción
JP5497984B2 (ja) 2005-07-07 2014-05-21 天野エンザイム株式会社 ビール又はビール様飲料の製造方法
JP4856665B2 (ja) 2008-03-14 2012-01-18 味の素株式会社 麺類の製造法
EP2474230B1 (en) 2009-08-31 2013-04-03 Ajinomoto Co., Inc. Low-fat or fat-free yoghurt, and process for production thereof
KR101722909B1 (ko) 2010-03-04 2017-04-04 아지노모토 가부시키가이샤 커피 화이트너，이의 제조방법 및 음료의 제조방법
EP2554053B1 (en) 2010-03-31 2015-10-14 Ajinomoto Co., Inc. Ice cream or ice cream-like product and method for producing same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001218590A (ja) * 1999-12-03 2001-08-14 Amano Enzyme Inc 新規蛋白質脱アミド酵素、それを生産する微生物、それをコードする遺伝子、その製造法及び用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. KATO ET AL.: "Effects of Deamidation with chymotrypsin at pH 10 on the Functional Properties of Proteins", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 35, no. 2, 1987, pages 285 - 288, XP055222868 *
M. KIKUCHI ET AL.: "Peptidoasparaginase. An Enzyme for Deamidation of COOH-Terminal Peptide-Bound Asparagine", ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 148, no. 1, 1972, pages 315 - 317, XP024808446, ISSN: 0003-9861 *
WEINSTOCK, G. ET AL.: "PXTG-motif protein cell wall anchor domain protein [Leifsonia aquatica ATCC 14665", NCBI, 2013, XP055357987, Retrieved from the Internet <URL:http://www. ncbi.nlm.nih.gov/protein/ERK71725.1> [retrieved on 20150527] *

Cited By (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022521426A (ja) * 2019-02-26 2022-04-07 アマノ エンザイム ユーエスエー カンパニー，リミテッド 安定なタンパク質製剤
JP2025090842A (ja) * 2019-02-26 2025-06-17 アマノ エンザイム ユーエスエー カンパニー，リミテッド 安定なタンパク質製剤
JP7654553B2 (ja) 2019-02-26 2025-04-01 アマノ エンザイム ユーエスエー カンパニー，リミテッド 安定なタンパク質製剤
WO2021002435A1 (ja) 2019-07-03 2021-01-07 味の素株式会社 改質したえんどう豆たん白質の製造方法
WO2021049591A1 (ja) * 2019-09-12 2021-03-18 天野エンザイム株式会社 植物タンパク質濃縮物の製造方法
JPWO2021049591A1 (ja) * 2019-09-12 2021-03-18
JP2023515818A (ja) * 2020-02-28 2023-04-14 インポッシブル フーズ インコーポレイテッド タンパク質生産のための材料および方法
JPWO2021187510A1 (ja) * 2020-03-17 2021-09-23
JP7813698B2 (ja) 2020-03-17 2026-02-13 天野エンザイム株式会社 蛋白質の架橋方法
WO2021187510A1 (ja) 2020-03-17 2021-09-23 天野エンザイム株式会社 蛋白質の架橋方法
WO2021201277A1 (ja) 2020-04-03 2021-10-07 天野エンザイム株式会社 蛋白質の脱アミド方法
WO2021251344A1 (ja) 2020-06-08 2021-12-16 天野エンザイム株式会社 タンパク質の食感改良
WO2022014542A1 (ja) 2020-07-13 2022-01-20 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質食品の製造方法
WO2022045151A1 (ja) 2020-08-24 2022-03-03 天野エンザイム株式会社 改変タンパク質の製造方法
WO2022102723A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 天野エンザイム株式会社 加工植物性タンパク質含有液状組成物の製造方法
JP2023550969A (ja) * 2020-11-26 2023-12-06 アツィエス・ビオ・デ・オ・オ イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニンを産生することが可能な遺伝子組換え細菌
WO2022118914A1 (ja) 2020-12-04 2022-06-09 天野エンザイム株式会社 液体酵素製剤
WO2022138872A1 (ja) 2020-12-24 2022-06-30 天野エンザイム株式会社 コメタンパク質含有液状組成物の製造方法
WO2022181672A1 (ja) * 2021-02-25 2022-09-01 高梨乳業株式会社 脱アミド化カゼイン及びその製造方法
JPWO2022181672A1 (ja) * 2021-02-25 2022-09-01
JP7823838B2 (ja) 2021-02-25 2026-03-04 高梨乳業株式会社 脱アミド化カゼイン及びその製造方法
WO2022215688A1 (ja) 2021-04-05 2022-10-13 アマノ エンザイム ヨーロッパ リミテッド 加工ヘンプタンパク質含有液状組成物の製造方法
WO2022244875A1 (ja) 2021-05-21 2022-11-24 天野エンザイム株式会社 加工オート飲食品又は食品素材の製造方法
WO2023214554A1 (ja) 2022-05-06 2023-11-09 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有組成物の増粘剤
WO2023214553A1 (ja) 2022-05-06 2023-11-09 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有液状組成物の食感改善剤
WO2023228953A1 (ja) 2022-05-23 2023-11-30 天野エンザイム株式会社 液体酵素製剤
WO2024010087A1 (ja) 2022-07-07 2024-01-11 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有組成物の香気変化方法及び呈味増強方法
WO2024090579A1 (ja) 2022-10-28 2024-05-02 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質及び油脂を含む液状組成物の乳化性向上剤及び起泡性向上剤
WO2024172142A1 (ja) 2023-02-15 2024-08-22 天野エンザイム株式会社 加工植物性タンパク質含有液状組成物の製造方法
EP4666873A1 (en) 2023-02-15 2025-12-24 Amano Enzyme Inc. Production method for processed vegetable protein-containing liquid composition
WO2024210190A1 (ja) * 2023-04-06 2024-10-10 天野エンザイム株式会社 植物性タンパク質含有液状組成物のミネラル富化剤
WO2024257876A1 (ja) 2023-06-14 2024-12-19 天野エンザイム株式会社 液体酵素製剤
WO2025037649A1 (ja) 2023-08-17 2025-02-20 天野エンザイム株式会社 植物性飲食品の起泡性向上方法

Also Published As

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US20170044513A1 (en) 2017-02-16
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