WO2016159652A1 - 조직투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

조직투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Definitions

  • composition for the prevention and treatment of eye diseases comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor agent as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating ocular diseases, including a fusion protein in which a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor agent are fused as an active ingredient, and more specifically, a tissue-penetrating peptide and an anti- Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ocular diseases, including a fusion protein fused with vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) preparation, and a tissue-penetrating peptide and anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) ) Converting a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding the fusion protein to which the agent is fused into a host cell; Culturing the superior cells; And a method for producing an anti-vascular endothelial growth factor agent having improved resistance and efficacy, comprising recovering the fusion protein from the cell, administering an effective amount of the fusion protein according to the present invention to
  • the macula lutea is the part of the eye that is densely packed with cells in the retina of the eye to receive light most clearly and accurately, and macular degenerat ion is a disease that causes degeneration of the macular degeneration due to various causes. ).
  • the macular degeneration is one of the three major causes of blindness together with glaucoma and diabetic retinopathy.
  • the most common cause of macular degeneration is increased age, and other causes of family history, race, and hobby are known to cause macular degeneration, and damage to the macula results in loss of the ability to recognize details such as small prints, facial features, or small objects. do.
  • macular degeneration There are two types of macular degeneration, non-exudative (dry) macular degeneration and exudative (wet) macular degeneration, and 90% of people with macular degeneration have a dry form of symptoms.
  • dry macular degeneration waste products form a yellow precipitate called drusen that can accumulate in the tissue under the macula. Can be.
  • the presence of drusen interferes with blood flow to the retina, especially the macula, and when the blood flow decreases, it reduces the supply of nutrients to the macula, stopping or contracting the efficient action of photosensitive cells.
  • wet macular degeneration new, weak blood vessels grow in or below the retina, causing liquid and blood to leak into the space below the macula.
  • choroidal neovascularization where the choroid is the region of the vessels below the retina and neovascularization refers to the growth of new blood vessels in tissues, as can be inferred from the name of choroidal neovascularization. In this case, blood vessels develop from the choroid into the macula and grow.
  • macular degeneration is considered to be a disease that is common to older people, it is known that the number of patients in their 4s and 50s has recently increased rapidly. The main causes of the lowered age group of macular degeneration are increased dietary intake, westernization, smoking and drinking. , Bad lifestyles such as UV exposure are pointed out.
  • Diabetic Macular Edema is explained by the thickening of the retina and / or hard alum within a disc diameter of the center of the retina.
  • DME and diabetic retinopathy are microvascular complications in diabetic patients, weaken vision, and eventually cause blindness. Patients with DR may progress to DME and develop DME after destruction of the blood-retinal barrier due to leakage of expanded permeable capillaries and microaneurysms.
  • DME is associated with choroidal neovascularization that penetrates damaged or tissue-broken Brook membranes.
  • the representative therapeutic agents used for the prevention or treatment of various ocular diseases related to neovascularization in the eye including macular degeneration, diabetic macular edema, ranibizumab, bevacizumab, beep Alf ibercept, conbercept, and the like.
  • biopharmaceuticals for the treatment of major eye diseases such as macular degeneration and diabetic retinal edema, including the aforementioned drugs are mainly used for the treatment of diseases of the posterior eye including the retina in the form of intraocular injections.
  • ranibizumab and aflibercept as eye drops to solve problems such as decreased patient convenience, increased side effects, and psychological fears.
  • the fourth and fourth domains are Fc-linked fusion proteins that are currently being developed as eye drops, but reportedly, bioavailability is known to be less than about 5% (Wang et al., 2013. PLOS ONE).
  • Ranibizumab, sold under the brand name Lucentis was noted as a breakthrough treatment by 90% of patients with macular degeneration at the time of development, but only 30% of patients with banung patients showed improvement in vision.
  • resistance is caused by continuous drug administration (Syed et al., 2012. Nature Rev. Drug Discov.) To improve this, the binding force to VEGF-A is increased by 100 times or more.
  • Appliverscept an Fc fusion antibody designed to inhibit VEGF-B and P1GF, was released in 2011, but has shown rapid growth, but there is no difference in clinical efficacy between the two products.
  • 10% of patients with anti-VEGF agents are not expected to have a therapeutic effect, which is thought to be caused by growth factor-dependent neovascular bypass pathways other than VEGF-A.
  • resistance was induced and drug reactivity decreased with increasing frequency of administration (Lux et al., 2007. Br. J. Ophthalmol.). It is known to be a result of vascular strengthening and pericyte-dependent VEGF production resulting from increased coverage of pericyte, which contributes to stabilizing endothelial cells in the rat.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of eye diseases comprising a fusion protein fused to a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) preparation as an active ingredient. .
  • Another object of the present invention is the step of (a) converting a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding a fusion protein fused to a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) preparation into a host cell ; (b) culturing the cells; And (c) recovering the fusion protein from the cell, and providing a method of producing an anti-vascular endothelial growth factor agent having improved resistance and improved efficacy.
  • ant i-VEGF anti-vascular endothelial growth factor
  • Another object of the present invention is to treat an ocular disease comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a fusion protein fused with a tissue-permeable tempide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent.
  • a tissue-permeable tempide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent are fused.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of eye diseases comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular blood cell growth factor (ant i-VEGF) preparation as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of eye diseases comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular blood cell growth factor (ant i-VEGF) preparation as an active ingredient.
  • ant i-VEGF anti-vascular blood cell growth factor
  • the present invention provides a host comprising a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding a fusion protein fused with a tissue-permeable peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent.
  • the present invention comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of a fusion protein in which a tissue permeable peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent are fused.
  • a tissue permeable peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent are fused.
  • the present invention provides a preparation for treating ophthalmic diseases comprising a fusion protein in which a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent are fused as an active ingredient.
  • a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent are fused as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of eye diseases comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent as an active ingredient. to provide.
  • vascular endothelial growth factor -A (VEGF-A) is well known to induce blood ejection (extravasat ion). This is also called the vascular permeabi li factor. This action is known to be due to binding to the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR2).
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor
  • vascular endothelial growth factor -A mutations although not able to bind to the vascular endothelial growth factor receptor, are vascular permeable. This is an example of how this is being promoted. This suggests that there is another receptor of vascular endothelial growth factor-A (Stacker et al., 1999. J. Biol. Chem.).
  • Neuropilin is a transmembrane glycoprotein and has two forms, NRP1 and NRP2.
  • Neurophylline acts as a core receptor for VEGF receptors (VEGFRs) by binding VEGF family ligands.
  • NRP1 functions as a co-receptor of VEGFRl, VEGFR2, VEGFR3 and binds to various VEGF ligands.
  • NRP2 acts as a co-receptor of VEGFR2 and VEGFR3, contributing to lymphatic tube formation (lymphangiogenesis) and cell adhesion (adhesion).
  • NRPl / NRP2 acts as a co-receptor of Plexin family receptors and binds to secreted semaphorin 3-family ligands (class 3 semaphorins: Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, and Sema3G).
  • the tissue permeability is a tissue that specifically recognizes and accumulates neurophyllin overexpressed tissue, or widens the cell gap of vascular endothelial cells to promote the out-of-vascular flow of drugs, and serves as a barrier to water-soluble molecules. By means of adjusting the corneal cell gap it means having one of the properties to promote the distribution of drugs in the eye.
  • the term "neuropilin (NRP)" in the present invention is a transmembrane glycoprotein, and has two forms of NRP1 and NRP2. Neurophyllin consists of five domains. From the N-terminus, al / a2 domains are classified as CUB domains, and the Ig-like C2 type portion of semaphorin binds.
  • this site forms a complex with plexin and serves to increase the binding force with semaphorin-plexin.
  • the bl and b2 domains of neuropilins are classified as FV / VIII domains, and the C-terminal sites of VEGF family ligands or secreted semaphorin 3 family ligands (secreted Sema3s) bind.
  • the VEGF ligand and the semaphorin trifamily ligands have a recognition site (RXRR, Arg-X-Arg-Arg) of purine proteolytic enzymes, and are commonly used at the C-terminus by arginine (Furin processing). Arg) ends with amino acid residues (Adams et al., 1997.
  • Anti-vascular endothelial growth factor preparations bind to molecules that interfere with the interaction between VEGF and native VEGF receptors, such as VEGF or VEGF receptors to prevent or otherwise inhibit the interaction between VEGF and VEGF receptors. It includes molecules.
  • VEGF antagonists include anti-VEGF antibodies, anti-VEGF receptor antibodies and VEGF receptor-based chimeric molecules.
  • fusion refers to the integration of two molecules having different or identical functions or structures, and fusion by all physical, chemical or biological methods in which tissue-permeable peptides can bind to anti-vascular endothelial growth factor preparations. Can be.
  • the fusion may preferably be by a linker peptide, which may bind, for example, to the C-terminus of the Fab (antigen binding fragment) or Fc fragment of the antibody.
  • the ocular disease of the present invention preferably means ocular disease caused by angiogenesis.
  • the expression “ocular disease due to angiogenesis” means any disease of the eye by or related to blood vessel growth or proliferation, or by vascular leakage.
  • the binding of neurophilin receptors increases the tissue permeability of the drug, and the cover age of the per icyte may be deteriorated and thus the effect may be exerted in patients who exhibit resistance to the drug.
  • the dosing cycle is improved and the development of eye drops is possible.
  • the variant of ranibizumab introduced a point mutation in which the cysteine (C) is substituted with serine (S) in the amino acid sequence of ranibizumab greatly increases productivity.
  • the effect of increasing productivity was maintained even in the improved fusion of the tissue permeable peptide (TPP) to the ranibizumab variant (Example 1).
  • the affinity to the neurophilin receptor of the fusion protein fused with a tissue-permeable peptide to the C-terminus of the ranibizumab variant was compared with the tight junction between endothelial cells and the ability.
  • the fusion protein was found to bind very well to a level similar to that of neurophylline receptor NRP 1 and Sema3A ligand.
  • the adhesion and resolution between endothelial cells was very excellent (Example ⁇ 1-3>).
  • a fusion protein fused with a tissue-permeable peptide at the C-terminus of the ranibizumab variant may improve permeability through binding with a neurophylline receptor distributed in eye endothelial cells.
  • the degree of permeability was compared over time ( ⁇ Example 4>).
  • the anti-vascular endothelial growth factor preparations in which the tissue-penetrating peptide was conjugated started permeation from corneal epithelial tissue from 1 hour of experiment, and confirmed that the intraocular drug distribution was significantly higher than ranibizumab at 2 hours.
  • the possibility of dose control and administration interval increase through permeability improvement was confirmed.
  • the fusion protein according to the present invention rapidly penetrates the cornea, a tissue that acts as a barrier to water-soluble molecules, to reach the inside of the eyeball compared to ranibizumab.
  • the formulation could be developed as an eye drop by improving the formulation.
  • the effect of increasing the permeability of eye tissues by the fusion of tissue-permeable peptides was similarly observed in the whole ant ibody form having a large molecular weight and complex protein structure.
  • a fusion protein fused with a tissue-permeable peptide at the FC-terminus of bevacizumab in the form of immunoglobulin G (IgG) also showed a markedly increased eye permeability compared to bevacizumab, an improved body of bevacizumab according to the present invention. It can also be seen that the therapeutic effect can be developed as a drug.
  • the fusion protein fusion protein form of VEGF receptors (VEGFR1, VEGFR2) to the Fc fragment was also applied to the tissue-penetrating peptide at the FC-terminus in the same manner as bevacizumab.
  • the drug may be developed as a drug having a significantly improved therapeutic effect compared to the Fc fusion protein.
  • the angiogenesis inhibitory effect of the fusion protein and ranibizumab of the present invention and the neovascular inhibitory effect in the drug resistance model were evaluated using various animal disease models. Experimental results using a corneal neovascular model showed that the fusion protein of the present invention exhibited significant neovascularization effects of at least 50% compared to the control group. It was confirmed that it was possible to increase the efficacy by the tissue-permeable peptide fused at the C-terminus by showing an effect equivalent to ranibizumab (Example ⁇ 5-1>).
  • the fusion protein of the present invention showed more than twice the efficacy of ranibizumab compared to ranibizumab in angiogenesis inhibitory effect in the drug resistance model, in combination with ant i-VEGF aptaraer and ant i-PDGF ant ibody preparation.
  • Levels similar to those of the administered literature (Jo et al., 2006. Am. J. Pathol. 168), with about 70% of patients receiving ranibizumab who had only been maintained without vision improvement. It can be expected that there will be (Example ⁇ 5-2>).
  • the superior effect of inhibiting angiogenesis in ocular disease of the fusion protein according to the present invention is a model of choroidal neovascularization (CNV) used as an actual macular degeneration efficacy model and an oxygen-induced neovascularization (0IR) model used as a retinopathy efficacy model.
  • CNV choroidal neovascularization
  • IR oxygen-induced neovascularization
  • the same is observed in the present invention, and it can be predicted that the therapeutic effect will be remarkably enhanced in comparison with ranibizumab ( ⁇ Example 6>, ⁇ Example 7>).
  • prevention means any action that inhibits or delays the progression of eye diseases by administration of a composition of the present invention.
  • treatment refers to any action by which administration of a composition of the present invention improves or advantageously alters the symptoms of an ocular disease. More specifically, the term 'treatment' refers generically to ameliorating the symptoms of eye diseases, which may include treating, substantially preventing, or improving the condition of eye diseases, as long as they originate from eye diseases. It includes, but is not limited to, alleviating, restraining, or preventing branch symptoms or most symptoms.
  • the term 'effective amount' refers to an amount that improves the symptoms of an ocular disease when administered to an individual, and includes an amount that heals or substantially prevents or improves an ocular disease.
  • the term 'individual' may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, or may be a cell, tissue, organ or the like derived from the animal. The subject may be a patient in need of treatment. All.
  • composition according to the invention can be administered to any mammal, including humans, by any means.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, or rectal Administration.
  • the immunogenic complex protein according to the present invention may be administered in a monograph or in combination with a known compound having the effect of preventing and treating a target disease.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention to the human body may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition, and degree of disease of the patient. 10 mg / day, preferably 0.1 to 2 mg / day per eye. In the case of eye drops, the dosage range is from 0.01 mg to 1 ml of eye drop, preferably 0.01 to 10 mg / day. In addition, divided doses may be administered at regular intervals according to the judgment of the doctor or pharmacist.
  • the composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, and the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide and calcium hydrogen phosphate.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.01 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be in various forms suitable for any route of administration, including but not limited to injections, eye drops, eye ointments, ocular implants, and when formulated it is commonly used layering agents, extenders, binders It may be prepared using a diluent or excipient such as a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant.
  • injectables include, but are not limited to, intraocular injection including intravitreal injection and conjunctival injection. Injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.
  • Suitable carriers for the injection of the present invention include physiological saline, bacteriostatic water, cremofo ER EL (Basp, Pa., NJ) or Phosphate Complete Brine (PBS).
  • the composition must be sterile and must be fluid enough to be easily injected.
  • the composition must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.
  • the carrier may be a solvent or a dispersion medium containing, for example, water, ethane, polyols (such as glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), and appropriate mixtures thereof.
  • Proper fluidity can be maintained using, for example, a coating such as lecithin, maintaining the required particle size in the case of dispersions, and using surfactants.
  • Microbial action can be prevented by the use of various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutane, phenol, ascorbic acid, chimerosal and the like.
  • isotonic agents for example, sugars, polyalcohols such as manny, sorbitan, trehalose, sodium chloride in the compositional process.
  • Absorption of the injectable composition can be enhanced by including in the composition an agent that delays absorption, such as aluminum monostearate, hyaluronic acid, and gelatin.
  • the eye drops may be water soluble ophthalmic solutions, non-aqueous ophthalmic solutions or ophthalmic emulsions.
  • conventionally known optional ingredients in eye drops for example, Layers, viscous agents, stabilizers, isotonic agents, preservatives and the like can be blended.
  • buffers such as a citrate, a phosphate, an acetate, an amino acid salt, are mentioned as a buffer.
  • polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cell rose, methyl cell rose, povidone, hydroxypropyl methyl cell rose, ethyl cell rose, hydroxyethyl sal rose, carmellose, polyethylene glycol, chondroitin or salts thereof Can be mentioned.
  • salts such as sodium chloride and potassium chloride
  • Polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol
  • Sugars such as glucose, sucrose and trehalose
  • Sugar alcohols such as Xilitle and Solbi
  • Polyethers such as polyethylene glycol
  • Amide sulfonic acids such as taurine, etc.
  • the pH at room temperature is preferably 4.5 to 8.5, more preferably 5.5 to 8, particularly Preferably it is 6-8.
  • the pH is measured using a pH meter at room temperature (eg, Accumet model 25 pH / Ion meter, manufactured by Fisher Scient ific).
  • Some ophthalmic drugs have poor permeability through the eye barrier and cannot be administered by eye drops. Thus, ointments can be used to extend contact time and increase the amount of drug absorbed.
  • water-insoluble polymers include ethyl sal, ethylene vinyl acetate copolymer, polymethacrylate, ethyl methacrylate, methyl methacrylate, trimetal ammonium ethyl, copolymer, and methacrylate. Acid metal, butyl methacrylate, dimetal aminoethyl methacrylate, copolymer, etc. are mentioned.
  • biodegradable polymers include polylactic acid, polylactic acid, glucolic acid co-polymer, polycyanoacrylate, polyalkylcyanoacrylate, poly? ⁇ , and caprolactone.
  • water-soluble polymer cellulose derivatives such as hydroxypropane metal cellulose loose furate, carboxymethyl ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, calcium alkynate, chitosan, albumin, gelatin, methacrylic acid Acid metal copolymer etc. are mentioned.
  • oil-soluble component include tripalmitin, cetyl alcohol, cholesterol, various phospholipids, cetyl palmitate, and cholesterol palmitate.
  • carrier components usually have a sustained release (slow release function) of the active ingredient containing an ophthalmic therapeutically active substance.
  • a carrier component with a high specific gravity which can be used without participating in a specific gravity regulator
  • hydroxypropyl methyl cellulose phthalate 200731 weight 1.65
  • hydroxypropyl methyl salo phthalate 220824 weight 1.82
  • carboxymethyl Ethyl salose specific gravity 1.59
  • specific gravity regulators used for specific gravity adjustment of carrier particles include, for example, insoluble components such as titanium oxide (4.17), tripotassium phosphate (specific gravity 3.14), anhydrous potassium hydrogen phosphate (specific ratio 2.89), and phosphoric acid.
  • the insert is similar to a soft contact lens placed on the cornea, except that it is usually placed in the upper appendage rather than attached to the open cornea, or less frequently in the lower conjunctival sac. Inserts are generally made of a biologically soluble material that dissolves or disintegrates in the tear fluid while releasing the drug.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations may be mixed with Tyros with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose or gelatin. Can be formulated. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc may also be used. Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions and syrups. Water and liquid paraffin, which are commonly used as simple diluents, may include various excipients, for example wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives. .
  • compositions of the present invention may be used in any physiologically acceptable carrier, parasitic agent or stabilizer (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edite, Al fonso, R., ed, Mack Publishing Co. (Easton, PA: 1995)).
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include monolayer solutions such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids; Antioxidants including ascorbic acid; Low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; Proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; Amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; Monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose, trehalose, or dextrin ol; Chelating agents such as EDTA; Sugar alcohols such as manny or sorbbi; Salt-forming counterions such as sodium; And / or nonionic surfactants such as tungsten, pluronics or polyethylene glycol (PEG).
  • monolayer solutions such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids
  • the present invention provides a pharmaceutical composition characterized in that the tissue-permeable peptide comprises any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 7.
  • the tissue-permeable peptide represented by the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7, the amino acid sequence and the length of the binding site of the VEGF A ligand that binds to the blb2 domain of neurophylline, sema known to bind to neurophylline It is a peptide designed based on the similarity of their C-terminal sequences by analyzing the nucleotide sequences of the Purine C-terminal sequences of Forin 3A and Semaphorin 3F.
  • the present invention provides the anti-vascular endothelial growth factor preparations include bevacizumab, ranibizumab, r84 (PLoS One. 2010 Aug 6; 5 (8) ), Aplibercept (af l ibercept), convergence (cdnbercept), CT0KW02005056764A2), D0M15-10-1KW02008149147A2), D0M15-26-
  • EPI-0030 W02011023130A1
  • a pharmaceutical composition comprising an agent used to prevent or treat an ocular disease, a biosimilar thereof, and a variant thereof, more preferably Rani. Bizumab, bevacizumab, Able Libercept, and Conceptcept may be, but are not limited to.
  • the term 'biosimi lar' refers to similarity in terms of quality, efficacy and safety by imitating patent-expired original biopharmaceuticals already developed / sold using biotechnology such as genetic recombination and cell culture technology. Means a drug that has been proven to replicate.
  • the variant of the present invention is characterized in that the cysteine, which is an amino acid of the heavy chain constant 1 domain and the light chain constant domain, is deleted or substituted with another amino acid residue including serine, except cysteine. It provides a pharmaceutical composition.
  • ranibizumab in which the last cysteine in the nucleotide sequence of ranibizumab was changed to serine was prepared (Example ⁇ 1-1>) .
  • the present invention is a ranibizumab (ranibizumab) is a variant consisting of a light chain having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 and a heavy chain having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 It provides a pharmaceutical composition, characterized in that.
  • the tissue permeable peptide of the one aspect may further include a linker template.
  • the linker peptide may consist of 1 to 50 amino acids, bar Preferably it may consist of 4-20, more preferably 4-15 amino acids.
  • the linker peptide may be composed of glycine (Glycine, G), serine (Sine) or alanine (alanine, A), preferably the sequence of the linker peptide is (GA) n or (GGGGS) ' ⁇ Consisting of amino acid sequences (wherein n and m are each independently an integer from 1 to 20, and means the number of times the sequence in parentheses is repeated), more preferably GAGA or (GGGGS 3 ).
  • the tissue-penetrating peptide was confirmed to produce a fusion protein fused to ranibizumab variants through the linker.
  • the fusion protein is a form in which TPP # 2 is linked with a linker ((GGGGS) 3 ) to the ranibizumab variant (IDB0061) according to the present invention, and is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14 Protein (IDB0062); In the form Raney connected in non - mainstream Thank variant (IDB0061) TPP # 5, the linker ((GGGGS) 3) in accordance with the present invention, the fusion protein (IDB0064) consisting of amino acids sequence shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18; In bevacizumab, a TPP # 2 is linked to a heavy chain by a linker ((GGGGS) 3 ), and is a fusion protein (IDB0072) consisting of an amino acid sequence
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used to treat ocular diseases according to any neovascular system.
  • the expression 'ocular disease along neovascularization' means any disease of the eye by or related to blood vessel growth or proliferation or by blood vessel leakage.
  • the ocular diseases according to angiogenesis include proliferative vitreoretinopathy, macular degeneration, pigment retinopathy, diabetic retinopathy, choroidal neovascularization, neovascular glaucoma, ischemic optic neuropathy, prematurity retinopathy, prematurity retinopathy, epidemic keratoconjunctivitis, neovascular iris Disease, posterior keratofibrosis, atopic keratitis, keratoconjunctivitis keratitis, psoriatic psoriatic keratitis, flicative keratoconjunctivitis, scleritis and diabetic macular edema, more preferably macular degeneration and diabetes It may be, but is not limited to, sex macular edema.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding a fusion protein fused to a tissue-permeable peptide and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent Converting to host cells; (b) culturing the cells; And (c) recovering the fusion protein from the cell, and providing a method for producing an anti-vascular endothelial growth factor agent having improved resistance and improved efficacy.
  • the nucleic acid sequence encoding the fusion protein may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, and SEQ ID NO: 23.
  • the nucleic acid encoding the light and heavy chains of the ranibizumab improver IDB0062 according to the present invention is in the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15, respectively, and the nucleic acids encoding the light and heavy chains of IDB0064 are SEQ ID NO: 17 and The nucleic acids encoding the base sequence of SEQ ID NO: 19 and the light and heavy chains of the bevacizumab modifier IDB0072 are as described in nucleotide sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 23, respectively.
  • the vector refers to an expression vector prepared by a person skilled in the art to express the fusion protein of the present invention by inserting the polynucleotide of the present invention into the vector according to any method known in the art using an appropriate transcription / translation control sequence.
  • the polynucleotide sequence cloned according to the present invention may be operably linked to an appropriate expression control sequence, and the operably linked gene sequence and expression control sequence may be combined with a selection marker and a replication initiation point (repl icat ion or igin). It can be included in one expression vector that it contains.
  • the expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell.
  • One such regulatory sequence is one selected from the group consisting of a promoter for transcription, a sequence of operators to regulate transcription, a sequence encoding a suitable mRNA liposome binding site, and a sequence that controls termination of transcription and translation. It may contain the above.
  • the vector used as the mother vector of the expression vector is not particularly limited, and this invention Any plasmid, virus or other mediator commonly used for expression in microorganisms used as host cells in the art may be used.
  • the plasmids include E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119, pET-22b (+)), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUBllO and pTP5), and yeast-derived plasmids ( ⁇ 13, ⁇ 24 and YCp50).
  • the virus may be, but is not limited to, an animal virus such as a retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, and a crypt virus such as baclovirus.
  • the host cell can choose to control the expression of the inserted sequence or to produce the desired product from the gene in a particular desired manner.
  • Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the translation and post-translational processing and modification of proteins. Suitable cell lines or host systems can be chosen that provide the desired modification and processing of the heterologous protein expressed.
  • Expression in yeast can produce biologically active products.
  • Expression in eukaryotic cells can increase the likelihood of 'natural' folding.
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention may use any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E.
  • yeast Sacharomycecerevisiae
  • nasal cells e.g., human cells
  • CH0 cell line Choinese hamster ovary
  • W138, ⁇ , COS-7, 293 as host cells
  • HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines Methods for transforming host cells by delivering the vector into the host cells are known. Any method is possible and is not specifically limited.
  • Escherichia coli can be transformed by heat shock or electroporat ion methods, and calcium phosphate precipitat ion, DEAE-dextran method, and electricity can be used to construct production cell lines using animal cells.
  • Electroporat ion, direct microinject ion, DNA-loaded liposome method, lipofectamine-DNA complex, cell sonication traits may be altered by sonicat ion, gene bombardment using high veloci ty microprojectiles, polycat ion, and receptor-mediated transfect ion. You can switch. Some of these techniques can be refined for in vivo or ex vivo use. Cultivation of the transformed cells is carried out under appropriate conditions that allow the expression of the fusion protein, which can be carried out according to methods well known to those skilled in the art.
  • the transformed cells can be cultured in large quantities by conventional culture methods.
  • As the culture medium a medium consisting of a carbon source, a nitrogen source, vitamins and minerals may be used.
  • a 2X YT medium may be used.
  • Culture of the cells is possible under normal cell culture conditions and can be incubated for 10 hours to 40 hours, for example, in the temperature range of 15 ° C to 45 ° C.
  • Centri fugat ion or filtrat ion may be used to remove the cells in the culture and recover only the culture medium, which steps may be performed by the skilled person as needed.
  • the culture medium (filtrate) from which the cells have been removed can be stored and stored for a short period of time so as not to lose its activity in the usual way.
  • Fusion proteins expressed in transformed cells can be purified in a conventional manner, for example salting out (eg ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (acetone, ethanol). Purification of the fusion protein of the present invention by applying a single or a combination of techniques such as protein fraction precipitation, dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography, affinity chromatography, and ultrafiltration.
  • salting out eg ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation
  • solvent precipitation acetone, ethanol
  • Purification of the fusion protein of the present invention by applying a single or a combination of techniques such as protein fraction precipitation, dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography, affinity chromatography, and ultrafiltration.
  • the pharmaceutical composition comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide of the present invention and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent is an improved tissue permeability of the anti-vascular endothelial growth factor formulation.
  • the intraocular injection improves the drug delivery to the choroidal tissues, and can be developed as an eye drop as well as the effect of treating, reducing the dose, or increasing the cycle of drug-resistant patients.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of a fusion protein fused with a tissue permeable peptide and an anti-vascular endothelial growth factor antigen binding fragment (Fab).
  • Figure 1B is a schematic diagram showing the binding of the fusion protein fused with VEGF and neurophyllin receptor -1 fused to the tissue-penetrating peptad and anti-vascular endothelial growth factor.
  • FIG. 1C is a schematic diagram of ameliorators in which tissue-permeable peptides are bound to various vascular endothelial growth factor inhibitor forms (Fab, whole IgG, Fc fusion protein).
  • Figure 2 is a result of analyzing the main product according to the production of ranibizumab and the fusion protein of the present invention by HPLC (IDB0062: Fab fusion protein fused with ranibizumab variants and tissue-permeable peptide TPP # 2).
  • AU means an arbitrary unit.
  • Figure 3 shows the results of the analysis of the primary purified products of the fusion proteins in a 12% non-reducing SDS-PAGE gel (IDB0062, Fab fusion protein fused with the ranibizumab variant and tissue-permeable peptide TPP # 2; IDB0064, Fab fusion protein fused with ranibizumab variant and tissue permeable peptide TPP # 5).
  • FIG. 4A shows the results of binding affinity analysis of ranibizumab, ranibizumab variants, and VEGF of the fusion proteins according to the present invention.
  • Figure 4B is a result of evaluating the binding ability of the tissue-penetrating peptides and neuropillin receptor -1 of the fusion protein according to the present invention (IDB0061, ranibizumab variant; IDB0062, ranibizumab variant and tissue permeable peptide TPP # 2 fusion) Fab fusion protein; Fc-TPP # 2, Fc fusion protein in which the tissue-permeable peptide TPP # 2 is fused to the FC-terminus of IgGl.
  • IDB0061 ranibizumab variant
  • IDB0062 ranibizumab variant and tissue permeable peptide TPP # 2 fusion
  • Fc-TPP # 2 Fc fusion protein in which the tissue-permeable peptide TPP # 2 is fused to the FC-terminus of IgGl
  • Figure 5A is a result of evaluating the storage conditions of the fusion protein according to the present invention.
  • 5B is a result of evaluating the stability of the fusion protein with repeated shock / thawing.
  • Figure 6A is a result of evaluating the angiogenesis inhibitory effect in the corneal neovascular prevention model in the renal neovascular prevention model of ranibizumab, ranibizumab variants and fusion proteins according to the present invention.
  • FIG. 6B is a graph showing the numerical results of FIG. 6A.
  • 7A is a result of evaluation of angiogenesis inhibitory effect in the corneal neovascular resistance model in the neovascular resistance model of ranibizumab and the fusion protein according to the present invention.
  • FIG. 7B is a graph showing the numerical results of FIG. 7A.
  • 7C is a result of evaluating the pericyte coverage reduction effect of ranibizumab and the fusion protein according to the present invention.
  • Figure 8A is the result of evaluation by the ocular osmolality oligoscope microscope of the fusion protein ranibizumab improved IDB0062 according to the present invention.
  • 8B is a graph showing the numerical results of FIG. 8A.
  • 8C is a result of analyzing the distribution of FITC conjugat ionized protein in the cross section of eye tissues reacted for 2 hours by fluorescence microscopy with DAPI staining.
  • FIG. 8D is a graph showing numerical results of FIG. 8C.
  • Figure 8E is a result of analyzing the fragments of the retinal tissue by confocal microscopy, the distribution according to the retinal permeability of IDB0062.
  • Figure 9A is the result of evaluating the ocular performance of the fusion protein bevacizumab improved IDB0072 according to the present invention through a light microscope.
  • 9B is a graph showing the numerical results of 9A.
  • FIG. 10A shows the inhibition of proliferation of choroidal neovascularization following drug treatment in ranibizumab and the choroidal neovascularization (CNV) model of the fusion protein according to the present invention.
  • FIG. FIG. 10B is a graph showing the results of FIG. 10A numerically.
  • FIG. 11A is a result of analyzing by fluorescence microscopy that leakage of the end of blood vessels is suppressed by drug treatment in ranibizumab and the oxygen-induced retinopathy (0IR) model of the fusion protein according to the present invention.
  • FIG. 11B is a graph showing the numerical results of FIG. 11A.
  • 12A is a fluorescent microscope after i solect in B4 staining that the formation of neovascularization and vascular bundles (tufts) is suppressed by drug treatment in ranibizumab and oxygen-induced retinopathy (0IR) model of the fusion protein according to the present invention. This is the result of analysis.
  • FIG. 12B is a graph showing numerical results of FIG. 12A.
  • FIG. FIG. 13 shows the results of intraocular injection of IDB0062 and ranibizumab in rats, followed by analysis of the amount of drug present in retinal tissues by western blot assay.
  • ranibizumab The low production yield of ranibizumab is due to the need for complex post-processing due to the low culture productivity of the Fab fragment and the polymorphism of the produced protein through periplasmic expression.
  • the ranibizumab variant IDB0061 was produced. Through this, it was confirmed that the production yield was dramatically improved by increasing the culture productivity and simplifying the purification process.
  • ranibizumab synthesizes the gene by changing the last cysteine of seranibisumab nucleotide sequence to serine. Since transformaUon to SUPEX5 (KCTC 12657BP) production cell line was then subjected to expression test.
  • the construction of the light chain portion of ranibizumab variant IDB0061 is as follows. The nucleic acid sequence of ranibizumab was obtained from related patents, and codon optimization was performed. Based on this, the nucleic acid of the Fab light chain variable region (VL) containing the signal sequence was synthesized, and the CL region of the Fab was ant i-.
  • a vector of albumin Fab SL335 was prepared by PCR using pr imer (SEQ ID NOs: 24, 25) as a template.
  • pr imer SEQ ID NOs: 24, 25
  • the construction of the heavy chain portion of ranibizumab variant IDB0061 is as follows. Retrieving a Raney non - mainstream Thank of the nucleic acid sequence from the patent and the nucleic acid of the codon optimized as a rear Based on this working signal sequence (gl II) a heavy chain variable region (VH) Fab contains, synthesized, CH1 domain of the Fab Was prepared by PCR using a pr imer (SEQ ID NO: 32, 33) as a template of the SL335 vector, an ant i- albumin Fab.
  • Point mutat ions were generated in the amino acid sequence of ranibizumab using methods commonly used in the field of protein engineering. Specifically, cysteine, the 214th amino acid in the light chain amino acid sequence of Rani vizumab (serine) and cysteine, the 226th amino acid in the heavy chain amino acid sequence of ranibizumab, was substituted with serine.
  • the light and heavy chain amino acid sequences of the ranibizumab variant IDB0061 in which the point mutations occurred were represented by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10, respectively, and the nucleic acid sequences encoding them were represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11, respectively.
  • ranibizumab variant IDB0061 was cloned into pHEKA vector and trans format ion to SUPEX5 strain. Specifically, competent cel l 100 ⁇ was put in the lmra cuvette, and 3 ⁇ l of the DNA was added thereto, followed by electric shock at 1800 V to introduce a gene to complete the production cell line. Inoculate 1% ( ⁇ / ⁇ ) of ranibizumab and IDB0061-producing cell lines in 50 ml of 2x YT media (100 mM potassium phosphate buffer, H 7.2, 50 ug / ml kanamycin) for 18 hours at 220 ° C at 28 ° C. The preculture was carried out.
  • 2x YT media 100 mM potassium phosphate buffer, H 7.2, 50 ug / ml kanamycin
  • the present inventors can bind both neurophylline l (NRPl) and 2 to the C-terminus of ranibizumab or specifically bind to neurophylline 1 to increase the efficacy and overcome resistance of ranibizumab, an anti-VEGF agent.
  • Tissue permeable peptide t issue penetrating peptide, TPP
  • TPP Tissue permeable peptide
  • FIG. 1 The schematic diagram of the fusion protein in which ⁇ is fused to ranibizumab is shown in FIG. 1. Specifically, various ⁇ s (peptides specifically binding to neurophylline receptors) described in Table 3 at the C-terminus of ranibizumab variant IDB0061 prepared in Example ⁇ 1-1> by April Bio A fused fusion protein and a cell line producing the same were produced.
  • ⁇ # 2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the ⁇ shown in Table 3 is a modification of the C-terminal sites of VEGF 165 and semaphorin 3-family ligands, which are intrinsic ligands of neurophylline
  • TPP # 5 is As the blb2 domain protein of neurophylline 1 and the blb2 domain protein of neurophyllin 1 as competitors, a peptide derived from a clone that selectively binds to the bl domain of neurophyllin 1 was isolated and identified.
  • fusion of Avast in to act as a bivalent to the neurophylline receptor is designed to have tissue permeability with similar affinity to VEGF and Sema3A ligand.
  • the production of the light chain portion of ⁇ fused ranibizumab variant IDB0062 was obtained by obtaining a nucleic acid sequence of ranibizumab from the relevant patent, and after the codon optimization process, based on the light chain variable region (which contains a signal sequence) VL) nucleic acid was synthesized, and the light chain constant region (CL) C-terminal cysteine was synthesized with a nucleic acid (CL'-l inker-TPP # 2) including a linker and TPP # 2 sequence in some of the serine-substituted sequences. It was.
  • the CL region of the Fab was prepared by PCR using primers (SEQ ID NOs: 24, 25) using SL335, which is an anti-albumin Fab, as a template, and primers (SEQ ID NO: 24) using the synthesized CL'-linker-TPP # 2 nucleic acid template. No. 26, 27) to prepare a CL'-linker-TPP # 2 by PCR. These two products were linked by linking PCR to prepare CL-1 inker -TPP # 2 oligonucleotide.
  • VL was prepared using a primer (SEQ ID NOs: 28, 29), and then an assembly PCR using a primer (SEQ ID NOs: 30, 31, BamHI and Xhol sequences) with CL-linker-TPP # 2.
  • SEQ ID NOs: 28, 29 a primer for PCR amplification of a VL sequence.
  • the production of the heavy chain portion of the ranivarizumab variant IDB0062 fused to ⁇ # 2 was obtained from the related patents of the ranibizumab mutant from a related patent, and after the codon optimization process, the heavy chain containing the signal sequence (glll) was included.
  • Nucleic acid of the variable region (VH) was synthesized, and the nucleic acid (CH1'-1 inker-TPP # 2) including the linker and TPP # 2 sequences in some sequences in which the cysteine of the heavy chain constant region (CHI) was substituted with serine.
  • the CH1 region of the Fab consists of a primer of the SL335 anti- albumin Fab as a template.
  • VH was prepared using a primer (SEQ ID NO: 36, 37) as a template of the synthesized VH nucleic acid, and then subjected to assembly PCR using a primer (SEQ ID NO: 38, 39, EcoRI and Hindlll sequences) together with CL-linker-TPP # 2. The final VH-CH1-1 inker-TPP # 2 sequence was completed.
  • the light chain was digested with BamHI and X) I, the heavy chain with EcoRI and Hindlll, and cloned into the pHEKA vector digested with the same restriction enzyme.
  • PHEKA vector containing the IDB0062 sequence completed by the above method was trans format ionized to SUPEX5 strain. Specifically, the competent cell ⁇ in a 1 ⁇ cuvette, 3 ⁇ 1 of the DNA was added thereto, followed by electric shock at 1800V to introduce a gene to complete the production cell line.
  • the light chain and heavy chain amino acid sequences of IDB0062 thus prepared were represented by SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14, respectively, and the nucleic acid sequences encoding them were represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15, respectively.
  • Example ⁇ 1-2> affinity for the neurophyllin receptor and the tight junction and the ability between endothelial cells were compared.
  • affinity for neurophylline receptors was performed for NRP Kneuropilin 1).
  • SPR surface plasmon resonance
  • Biacore2000 GE Healthcare
  • each of the neuropilrin 1 domains was immobilized in 10 mM Na-acetate complete solution (pH 4.0) and immobilized on a CM5 sensor chip (GE Healthcare, USA) at about 1,000 response units (RU).
  • HBS-EP buffer (lOmM HEPES, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20, pH 7.4, GE Healthcare) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ 1 / min, and VEGF165 was 5nM at 80nM and semaphorin 3A at 62. 5 ⁇ , TPP was analyzed at a concentration of 25625M to 1.5625uM. Regeneration of CM5 chip after binding / dissociation analysis was performed by flowing buffer (20mM NaOH, 1M NaCl, pH 10.0) at 30 ⁇ 1 / min for 1 minute. It became.
  • the sensorgrams obtained by 3 min of binding and 3 min of dissociation were normalized and subtracted from the blank cel l to calculate affinity.
  • the tight junction lysis between the endothelial cells was evaluated by measuring the degree of inhibition of VE-cadherin and E-cadherin of the proteins. Inhibition of the expression of VE-cadherin and E-cadherin in endothelial cells is known to impair the tight junct ion between the endothelial cells, and through the intraocular administration of the drug to the intravenous Or tissue penetration).
  • As an experimental method for indirectly confirming vascular permeability enhancement of TPP changes of VE-cadherin through Western blot were confirmed.
  • vascular permeability enhancement seeded HUVEC cells at 3 ⁇ 10 5 per well in 6-wel l plates. After incubation for 24 hours, Western blot was performed by treating TPP with luM for 10 minutes. The gels subjected to SDS_PAGE were transferred to PVDF membranes and examined using a primary antibody (SantaCruz) that recognizes VE-cadherin and ⁇ -act in and a secondary antibody (SantaCurz) bound to HRP. The assay was performed using ImageQuant LAS4000 mini ( GE Healthcare).
  • TPP # 2-fused Fc (Fc-TPP # 2) binds to the neurophylline receptor (NRP 1) at a high level (similar to that of Sema3A igand), as shown in Table 4 below. It has been shown to significantly inhibit VE-cadherin. In the case of Fc (Fc-TPP # 5) fused with TPP # 5, the binding force with NRP 1 was higher than that of Sema3A, and the effect of VE-cadherin was more excellent. IDB0062 was also confirmed to bind to neurophyllin receptor (NRP 1) at high levels, and the degree of VE-cadherin inhibition was also inhibited similarly to Fc-TPP # 2.
  • the productivity of IDB0062 was confirmed in the same manner as in Example ⁇ 1-1>. As a result, as shown in Table 1, it was confirmed that IDB0062 fused with TPP # 2 to IDB0061 also showed about 5 times higher productivity than ranibizumab.
  • the purity of the first purified product using the adsorption column was analyzed by HPLC. HPLC analysis experiment was carried out in the following manner. The purified product was first purified using an adsorption column, concentrated using amicon (Mi l ipore, 10K), and exchanged with formulat ion buf fer (10 mM hist idine, 0.1% tween20, 10% trehalose) to give a final concentration of 0.5 mg / Dilute to tnl.
  • TPP # 5 in which the VE-cadherin inhibitory effect was confirmed in Example ⁇ 1-3> was linked by a linker to produce a fused ranibizumab modifier IDB0064 and confirmed productivity. .
  • IDB0064 Specific production process of IDB0064 is as follows. Gene cloning was performed to bind IDB0061 to a new ⁇ , ⁇ # 5. A specific primer (SEQ ID NOs: 40, 41, 42) was used to replace C-terminal ⁇ from ⁇ # 2 to ⁇ # 5 with IDB0062 as a template, and the first sequence shared by TPP # 2 and ⁇ # 5 was used. The primer was prepared by holding the anneal ing region and then extending the TPP # 5 sequence.
  • PCR was carried out 30 cycles in the order of denaturat ion (95 ° C, 40sec), anneal ing (65 ° C, 40sec), extent ion (72 ° C, lmin) and then Fab light chain-TPP # 5 Of and Fab
  • the gene of heavy chain-TPP # 5 was obtained.
  • the light chain portion of the PCR product was treated with BamHI and Xhol, and the heavy chain portion was treated with EcoRI and Hindl ll and then inserted into the pHEKA vector by l igat ion and trans-format ion into the production cell line SUPEX5.
  • IDB0064 The light and heavy chain amino acid sequences of IDB0064 prepared as described above were represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18, respectively, and the nucleic acid sequences encoding them were represented by SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19, respectively.
  • IDB0064 production sachets were inoculated with 1% ( ⁇ / ⁇ ) in 50 ml of 2 X YT media ClOOmM potassium phosphate buffer, H 7.2, 50 ug / ml kanamycin) and incubated for 18 hours at 28 ° C at 220 rpm for 18 h.
  • the binding capacity of IDB0062 to the neurophilin 1 receptor was confirmed to maintain similar binding activity as the control drug (Fc-TPP # 2). This means that the ⁇ # 2 peptide fused to the C-terminus of ranibizumab binds well to neurophyllin 1 receptor.
  • the plate was washed three times, and then treated with Goat ant i-human kappa light chain Ab-HRP (Sigma Aldrich, A7l64) in a buffer of 5,000 times, treated with ⁇ per well and reacted at 37 ° C for 1 hour. .
  • Goat ant i-human kappa light chain Ab-HRP Sigma Aldrich, A7l64
  • TMB substrateCBethyl, E102 was treated with ⁇ per well for 2 ⁇ 3 minutes and the stop solutionClN HC1) was treated with ⁇ per well after the reaction was finished, and the value was measured at 450nm using an ELISA plate reader.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • carbonate coating buffer 0.1M NaHC0 3 , pH 9.6
  • SPL Immunoplate Maxi binding
  • the plate is washed three times, and the Goat anti-human kappa light chain Ab-HRP (Sigraa Aldrich, A7164) is added to the blocking buffer. Diluted 5,000 times, treated with ⁇ per well and reacted at 37 ° C for 30 minutes. After washing the plate 7 times, TMB substrate (Bethyl, E102) was treated with ⁇ ⁇ . Per well, and after 2-3 minutes reaction, stop solut ionClN HC1) was treated with ⁇ ⁇ . Per well to stop reaction and 450nm using ELISA plate reader. The value was measured at. As shown in FIG.
  • the ELISA assay of IDB0062 confirmed that the VEGF-A binding ability was somewhat inferior to ranibizumab, and that VEGF-A was changed as the tertiary structure of IDB0062 was changed by a sequence change of a specific amino acid. It was expected that the binding CDRCComp ary-Det erm ini ng region) was partially changed. However, since the binding capacity of ranibizumab is considerably higher than that of a general antibody, it is believed that this weakening of binding does not result in a substantial decrease in clinical efficacy.
  • the first purified tablets were changed to formulat ion buffer, concentrated to the concentration used in animal experiments (5mg / ml), and then subjected to stability experiments. Stability experiments by storage conditions were divided by ⁇ ⁇ ⁇ and stored at 4 ° C and -80 ° C for 5 weeks, thawed in ice for 1 week, and analyzed by VEGF binidng ELISA assay. ⁇ / thawing stability was evaluated by VEGF binding ELISA assay by taking some samples while repeating the sample was frozen at -80 ° C and thawed on ice five times.
  • IDB0062 was stable at VEGF-A binding capacity up to 5 weeks storage at 4 ° C and -80 ° C, even if the physical shock through 5 times repeated cold / thaw As it did not affect, it was judged that there would be no stability deterioration due to the amino acid sequence change.
  • ex-vivo ocular penetrat ion model was constructed to evaluate the efficacy of ranibizumab improved ocular permeability.
  • TPP fused at the C-terminus of IDB0062 could actually improve tissue permeability through binding to neurophylline receptors that are highly distributed in ocular endothelial cells
  • the extracted eye was subjected to FITC conjugat ion ranibizumab. And the degree of permeability was compared after soaking in IDB0062 solution.
  • the protein sample was exchanged with lOOmM sodium carbonate buffer (H 9.0), the concentration was corrected to lmg / ml, and then mixed with FITC (lmg / ml in DMS0) for 2 hours at room temperature. .
  • the reaction was carried out by applying different reaction numbers of FITC per protein. After removing the FITC that was not conjugat ion using PD-10 desalting column, the buffer was changed to PBS and the purified product was quantitatively used as a sample for evaluation of efficacy. Conjugat ion results showed that F.P rat io of ranibizumab and IDB0062 were 1.127 and 1.133, indicating that almost the same number of moles of FTTC were bound per molecule of protein.
  • IDB0062 began to penetrate into the eye rapidly through the cornea and the posterior eye from 1 hour of experiment and reached a 2 hour distribution in ocular tissue and vitreous compared to the control drug ranibizumab. 4 times significantly increased. DAPI staining can be used to clearly distinguish and analyze ocular tissues. Unlike ranibizumab, IDB0062 shows an excessive distribution of protein inside the cornea (FIG. 8C, white arrow). It can be seen that about 10-fold increase compared to bizumab (FIG. 8D). FIG.
  • FIG. 8E shows the cross-section of ocular retinal tissue, while the control drug ranibizumab is mostly near the sclera, while IDB0062 passes through the ret ina pigment epithel ial cel l (RPE) layer to the retina.
  • RPE pigment epithel ial cel l
  • the whole antibody (bevacizumab) protein such as bevacizumab (Whole ant ibody) protein has a high molecular weight and complex protein tertiary structure, which is inferior to tissue penetration. Nevertheless, the same experiment was conducted to overcome these physical limitations by fusing tissue permeable peptides at the C-terminus of bevacizumab and to improve the permeability compared to the control drug bevacizumab.
  • the manufacturing process of the bevacizumab improved body IDB0072 is as follows.
  • IDB0072 is a form of antibody fusion protein in which TPP is fused by a linker to the C-terminus of bevacizumab, and the amino acid sequence of TPP is shown in Table 3 above.
  • TPP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 can bind to neurophylline 1 and 2
  • TPP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 to 7 is specific to neurophylline 1 only By combining It is possible.
  • TPP # 2 in TPP shown in Table 3 is a modification of the C-terminal region of VEGF 165 and semaphorin 3-family ligands, which are intr insic ligands of neurophylline
  • TPP # 5 is a blb2 domain of neurophylline 1 Isolation and identification of an artificial peptide derived from a selectively binding clone, of which TPP # 2 is fused with bevacizumab using a linker to act as a bivalent to the neurophylline receptor, resulting in similar affinity to VEGF and Sema3A ligands.
  • IDB0072 fused to TPP # 2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at the C-terminus of bevacizumab was prepared.
  • IDB0072 was cloned into the p C DNA3.4 vector.
  • the light and heavy chain amino acid sequences of IDB0072 are set forth in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22, respectively, and the nucleic acid sequences encoding them are as described in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 23, respectively.
  • Plasmids encoding the light chain protein were transfected using Neon eletroporesis, and then inoculated at 3> ⁇ 1 () 6 cel ls in T25 f lask and cultured at 37 ° C. After securing stable cel l using a selection marker, the bioreactor was incubated for 7 days in a suspended state using serum-free SFM4CH0 (Hyclone) at lOOrpm, 37 ° C, pH 7.2, and 50% D0 2 . The supernatant was separated from the cells by centrifugation and sterilized using a 0.22 filter.
  • SFM4CH0 Hyclone
  • the protein fused with the purified antibody heavy chain constant region and the peptide specifically binding to the selected NRP1 was quantified using the absorbance and the extinction coefficient at the corrected 280nm wavelength.
  • bevacizumab and IDB0072 were exchanged with 100 mM sodium carbonate buffer (pH 9.0) and the concentration corrected to 3 mg / ml.
  • the mixture was mixed with FITC (lmg / ml in DMSO) and reacted at room temperature for 2 hours.
  • IDB0072 reacted by applying different moles of FITC per protein from the control drug bevacizumab to enjoy the difference in conjugat ions due to TPP # 2 fusion.
  • Example ⁇ 4-1> In order to evaluate the activity of the produced bevacizumab improved IDB0072 was confirmed by binding all SPR assay for neurophyllin 1 receptor. As shown in Table 5, the binding capacity of IDB0062 to the neuropilin 1 receptor showed similar binding activity to the control drug (Fc-TPP # 2) and ranibizumab monomer IDB0062. This means that the TPP # 2 peptide fused at the C-terminus of bevacizumab also binds to the neurophyllin 1 receptor as IDB0062.
  • IDB0072 also improved eye permeability compared to the control drug bevacizumab. At 1 and 2 hours IDB0072 can be found to increase the intraocular distribution significantly about 1.5 times compared to bevacizumab (Fig. 9B). In addition, despite having a large molecular weight and structure, IDB0072 was found to be distributed to the cornea through the conjunctiva compared to bevacizumab. As a result, even in antibodies having a large molecular weight and complex structure, tissue permeability can be significantly increased by connecting tissue-penetrating peptides to the Fc C-terminus. These results demonstrate the possibility of improving eye tissue permeability by linking tissue-permeable peptides to various Fc fusion proteins, including antibody proteins.
  • a corneal neovascular model was constructed and divided into preventive and resistant models to compare the effects of angiogenesis inhibition and angiogenesis reduction with Rani bizumab.
  • a corneal neovascular model induced by alkaline burns was constructed as follows. Salose filter paper was cut into 2 ⁇ diameter and prepared and soaked in 1M NaOH solution. The mice were 6-week-old female C57BL / 6. After anesthesia (Zolet il 40mg / kg + Rompun 5mg / kg, IP), NaOH filter paper was placed on the left cornea for 30 seconds to induce alkaline burns, followed by layer washing with 40ml PBS. Corneal neovascular animal model was constructed.
  • drugs were treated from the day of induction of alkali burn, and each drug was administered 4 times a day by 5 ⁇ 1 at a concentration of 5 mg / ml for 5 days.
  • the eye was extracted and soaked in 4% paraformaldehyde solution for one hour and fixed.
  • the cornea was separated using an anatomical microscope.
  • the separated corneas were further fixed in 4% paraformaldehyde solution for 12 hours.
  • the fixed cornea was washed with PBS and reacted with blocking buf fer (PBS, 0.3% BSA, 0.1% Tr i ton X100) at room temperature for 2 hours.
  • the primary antibody (BD pharmingen) specific to vascular endothelial cell marker PECAM-KCD31) and the primary antibody (Mi 1 1 ipore) specific to NG-2 (per i cyte marker) were reacted overnight in the gut and secondary fluorescent antibody.
  • Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, Li fe Technologies reacted for 4 hours at room temperature to stain the tissue.
  • the corneas were transferred to slides and mounted using an anatomical microscope with incisions in four directions toward the center of the cornea.
  • the corneal slides with completed mounting were checked for vascular and peri cyte patterns using a fluorescence microscope / confocal microscope. As shown in FIG.
  • IDB0062 inhibited neovascularization by about 25-30% more than ranibizumab, resulting in a significant preventive effect of at least 50% compared to vehicle. And IDB0061 also showed the same efficacy as ranibizumab, indicating that the decrease in VEGF binding ability due to the change of ranibizumab structure does not affect the actual neovascular inhibition effect, but is enhanced by -TPP fused at the C-terminus. Confirmed that it is possible.
  • IDB0062 showed more than 30% of the neovascular reduction effect compared to vehicle and increased more than 2 times the efficacy of ranibizumab which showed no significant effect (FIG. 7B). These results were compared with ant i-VEGF aptamer. It is similar to the results of the literature in combination with ant i-PDGF ant ibody preparation (Jo et al., 2006. Am. J. Pathol.). Therefore, IDB0062 of the present invention was predicted to have improved vision in about 70% of ranibizumab-administered patients who only maintained without improvement of vision. In addition, as shown in FIG.
  • the IDB0062 treatment group was found to have a significantly reduced per i cyte coverage of nearly 40% compared to the vehi cle treatment group, which is intended to treat patients who exhibit resistance to existing drugs.
  • the results are similar to those of PDGF inhibitors being developed as concomitant medications. IDB0062 is therefore expected to be used as a monotherapy for resistance therapy, which is known to occur in 45% of patients receiving ant i-VEGF inhibitors.
  • Choroidal neovascular i zat ion (CNV), a model of age-related macular degenerat ion, is laser-induced choroidal Induced by neovascularization method and confirmed the therapeutic effect of ranibizumab improved IDB0062.
  • rats were randomly divided into 5 groups of 10 animals per group as shown in Table 6.
  • the drug was administered intraocularly using a hamilton syringeChamilton, USA).
  • the same amount of vehicle was administered to the CNV group and 100 ⁇ g / eye of ranibizumab as a control drug.
  • Subjects who had surgical injuries due to drug administration or subjects who had turbidity of the lens were excluded from the experiment.
  • the ranibizumab 100 ug administered group and the IDB0062 50 ug administered group suppressed angiogenesis by about 31% compared to the vehicle group, and the angiogenesis was suppressed about 36% in the IDB0062 100 ug administered group. It was confirmed. As a result, it was confirmed that IDB0062 shows the same neovascular inhibitory effect as ranibizumab at half the dose of ranibizumab.
  • Oxygen-induced retinopathy as a model of ret inopathy of prematurity
  • mice used mice born from the mating of 7-8 weeks old C57BL / 6 purchased from Coretech. At 7 days of age, mice (postnatal day 7, P7) were placed in an oxygen chamber and adjusted to maintain 75% (hyperoxia) oxygen concentration in the chamber (P7-P11) for 5 days. Illumination in the laboratory was allowed to equalize at 12 hour intervals, the temperature was maintained at 24 ⁇ 2 ° C, and the feed and drinking water were fed freely. After 5 days, ret inal angiogenesis was induced by exposure in the indoor atmosphere (normoxia) outside the chamber for 5 days ( ⁇ 12_ ⁇ 7). Immediately after exposure to normoxia on day P12 for drug administration randomly divided into 5 groups of 10 animals per group as described in Table 7.
  • the drug is hami lton syringe (Hami l ton, USA) Intraocular administration was performed for each group. The same dose of vehicle was administered to the 0IR group and 10 ug / eye of ranibizumab as a control drug. Subjects who had surgical injuries due to the drug administration or subjects who had turbidity of the lens were excluded from the experiment.
  • Oxygen-Induced Retinopathy (OIR) ⁇ Experiment 3 ⁇
  • IDB0062 15 U g administration group has a dense and stable structure of blood vessels, and shows no visible leakage. see.
  • streptavidin TRITC was diluted 1: 500 and reacted for 4 hours at 37 ° C, followed by 30 minutes of washing with PBS (BX51, Olympus, Japan). Observed under.
  • neovascularization When P7 mice are in hyperoxia for 5 days and then transferred to normoxia, they are placed in relative ischemia. At this time, the retina grows in excess of neovascularization.
  • the characteristics of neovascularization formed at this time are the fact that blood vessels grow from the retina to the vitreous, the avascular area, and form a special structure called tufts, an irregular vascular form that is easy to leak. to be.
  • the formation of these tufts can be used as a quantitative measure of neovescularization.
  • the salt-colored blood vessels in the vehicle group is characterized by the normal retinal vessels of the blood vessels are clearly separated and relatively thin and stable structure, the irregular and thick blood vessels together form the tufts Many new blood vessels were observed.
  • Ranibizumab is identified as one band at about 48 kDa in non-reducing SDS-PAGE analysis because the heavy and light chains are linked by disulfide bonds.
  • SDS-PAGE analysis shows two bands (heavy and light) at 28kDa.
  • the amount of drug present in the retina was about 3.6 times higher than that of ranibizumab. This results in the fact that TPP specifically binds to NRP1 expressing tissues, showing the possibility of targeting the retinal tissue, which is a disease region, for various diseases due to neovascularization of the retina.
  • Intraocular injections may increase the chance of eliminating VEGF by binding to the tissue rather than by spreading within the vi treous, resulting in the same effect at lower doses.
  • IDB0062's superior efficacy is the result of efficacy evaluation using hyperretinal model.
  • a pharmaceutical composition comprising a fusion protein fused with a tissue-penetrating peptide of the present invention and an anti-vascular endothelial growth factor (ant i-VEGF) agent as an active ingredient is compared with conventional anti-vascular endothelial growth factor preparations. It not only inhibits various growth factors related to neovascularization other than endothelial growth factor but also reduces the peri cyte coverage. It is thought to be able to treat augmented and drug resistant patients. In addition, since the drug delivery to the choroidal tissue is improved during intraocular injection, it is highly applicable to the industry because it is highly likely to be developed as an eye drop by reducing the dose or increasing the administration cycle and improving the eye permeability.

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Abstract

본 발명은 조직투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 발명에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 조직투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자(anti-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 조직투과성 펩타이드와 항-혈관 내피세포 성장인자(anti-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포로 전환시키는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 내성 극복 및 효능이 향상된 항-혈관 내피세포 성장인자 제제를 생산하는 방법, 본 발명에 따른 융합단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 안질환 치료 방법, 그리고 본 발명에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 제제를 제조하기 위한 용도에 대한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 기존의 항-혈관 내피세포 성장인자 제제와 비교하여 혈관 내피세포 성장인자 이외의 신생혈관과 관련된 다양한 성장인자를 저해할 뿐만 아니라 pericyte coverage를 감소시켜 효능이 증대되고 약물 내성환자까지 치료할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 안구 내 주사 시 맥락막 조직으로의 약물 전달력이 개선되어 투여용량 감소 또는 투여주기 증대 및 안구 투과도 개선을 통해 점안제로 개발될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제가 융합된 융합단백 질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 출원은 2015년 3월 31일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0045684 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로， 보다 구체적으로는 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물， 그리고 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 코딩하 핵산 서열을 포함하는 재조합 백터를 숙주세포로 전환시키는 단계; 상가 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포로 부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 내성 극복 및 효능이 향상된 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제를 생산하는 방법， 본 발명에 따른 융합단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 안질환 치료 방법， 그리고 본 발 명에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 제제를 제조하가 위 한 용도에 대한 것이다.
【배경기술】
황반 (macula lutea)은 눈의 망막에서 시세포가 밀집되어 있어 빛을 가장 선 명하고 정확하게 받아들이는 부분이며, 여러 가지 원인에 의해 이 황반부에 변성이 일어나 시력 장애를 일으키는 질환을 황반 변성 (macular degenerat ion)이라고 한 다. 상기 황반 변성은 녹내장, 당뇨망막증과 함께 실명의 3대 원인 중의 하나이다. 황반 변성을 야기하는 가장 큰 원인은 연령증가이며， 그 외 가족력, 인종， 홉연 등 도 원인으로 알려져 있으며， 황반이 손상되면 작은 활자체, 얼굴 생김새 또는 작은 물체와 같은 세부적인 것을 알아보는 능력을 상실하게 된다. 이러한 황반 변성은 비삼출성 (건성) 황반 변성과 삼출성 (습성) 황반 변성의 두 유형이 있으며， 황반 변 성을 갖는 사람 중 90%는 건성 형태의 증상을 갖는다. 건성 황반 변성에서, 노폐물 이 드루젠 (drusen)이라고 불리는 황색 침전물을 형성하여 황반 아래 조직에 축적될 수 있다. 드루젠의 존재는 망막， 특히 황반으로의 혈류를 방해하게 되고, 혈류가 감소되면 황반으로의 영양분 공급을 감소시켜， 감광성 세포의 효율적 작용을 중지 시키거나 위축시킨다. 습성 황반 변성의 경우， 새로운 약한 혈관이 망막 안 또는 그 아래에서 성장하여 액체 및 혈액이 황반 아래의 공간으로 새어나오게 된다. 습 성 황반 변성은 때때로 맥락막 신생혈관이라고 기술되기도 하는데， 맥락막은 망막 아래쪽 혈관 영역이고 신생혈관은 조직 내 새로운 혈관 성장을 말하는 것으로, 맥 락막 신생혈관이라는 명칭에서 유추할 수 있는 바와 같이 습성 황반 변성의 경우 맥락막으로부터 황반으로 혈관이 신생되어 성장하게 된다. 이러한 황반 변성은 노 인에게 잘 생기는 질환으로 여겨졌으나 최근 들어 4, 50대 환자가 급증하고 있다고 알려져 있으며, 이러한 황반 변성 발병 연령층이 낮아진 주요 원인으로는 지방 섭 취의 증가 등 식생활와서구화 및 흡연, 음주， 자외선 노출 등 좋지 않은 생활습관 이 지적되고 있다. 당뇨병성 황반부종 (Diabet ic Macular Edema, DME)은 망막 중심의 1원반 직경 내의 망막 및 /또는 경성백반의 두꺼워짐으로써 설명된다. DME 및 당뇨망막병증 (Diabet ic Ret inopathy, DR)은 당뇨병이 있는 환자에서의 미세혈관 합병증이며， 시 력을 약하게 만들며， 결국 실명을 유발한다. DR이 있는 환자는 DME가 진행할 수 있 고， 팽창된 고투과성 모세혈관 및 미세동맥류의 누출 때문에 혈액 -망막 장벽의 파 괴 후 DME가 생길 수 있다. DR과 마찬가지로， DME는 손상된 또는 조직 파괴된 브루 크 막을 침투하는 맥락막 신혈관형성과 관련되어 있다. 한편， 상기한 황반 변성, 당뇨병성 황반부종을 비롯한 안구에서의 신생혈관 과 관련된 여러 안질환의 예방 또는 치료를 위해 사용되고 있는 대표적인 치료제로 는 라니비주맙 (ranibizumab) , 베바시주맙 (bevacizumab) , 아플리버셉트 (af l ibercept ) , 컨버셉트 (conbercept ) 등올 들 수 있다. 상기한 약물을 포함하여 현재 개발된 황반 변성 및 당뇨병성 망막부종등 주요 안질환 치료용 바이오의약품 은 주로 안구 내 주사제 형태로 망막올 포함한 안구 후방의 질환을 치료하기 위하 여 사용되고 있다. 최근 주사제의 환자 편의성 감소， 부작용 증가， 심리적 두려움 과 같은 문제를 해결하고자 라니비주맙， 아플리버셉트 등을 점안제형으로 개발하려 는 연구가 시도되고 있지만， 라니비주맙은 토끼에서 임상 절반 용량 (250 U g)으로 2 시간 간격으로 6회 점안 시 3~7일 후에 망막 조직에 도달한다는 실험 결과 (Chen et al . , 2011. Eye) 등에서 보는 바와 같이 안구 투과도가 좋지 못해 병변이 있는 안 구 후방까지 도달하기 힘들며， 점안 시 눈 깜박임에 의한 방수유출로 소실되는 약 물이 많아 점안으로 약리효과를 발휘하기가 어렵다는 문제점이 있다. 또한， 중국에 서 황반 변성 치료제로 2013년 승인된 컨버셉트 (Conbercept, Chengdu Kanghong pharmj는 아플리버셉트와 유사하게 혈관 내피세포 성장 인자 수용체 l(VEGFR-l)의 두 번째 도메안과 VEGFR-2의 세 번째， 네 번째 도메인을 Fc로 연결한 융합단백질로 현재 점안제형으로도 개발 중이지만 보고된 바에 의하면 점안 시 생체이용율은 약 5%미만으로 알려져 있다 (Wang et al . , 2013. PLOS ONE). 또한, 루센티스 (Lucentis)라는 상표명으로 판매되고 있는 라니비주맙은 개발 당시 황반 변성 환자들로부터 90% 정도의 반웅성을 보여 획기적 치료제로 주목받았 으나 반웅환자의 30%만이 시력개선 등의 치료 효과를 보이고 있고 지속적인 약물투 여 시 내성이 유발되는 문제가 발생하고 있다 (Syed et al., 2012. Nature Rev. Drug Discov.). 이를 개선하기 위해 VEGF-A에 대한 결합력이 100배 이상 증대되고 VEGF-B, P1GF 까지도 저해할 수 있도록 고안된 Fc 융합항체인 아플리버셉트가 2011 년 출시되어 급격한 성장세를 보이고 있으나 실제 두 제품간 임상적 효능 차이는 없는 것으로 확인되고 있다. 황반 변성 환자의 약 10%는 anti-VEGF 제제에 대해 무반웅 환자로 치료효과 를 기대할 수 없으며, 이는 상대적으로 VEGF-A 이외의 다른 성장인자 의존적인신생 혈관 우회경로에 의한 원인으로 생각되고 있다. 또한 반복 투여 시 약 45%의 환자 에서 내성이 유발되어 투여횟수가 늘어날수록 약물 반응성이 떨어지는 것으로 확인 되고 있으며 (Lux et al., 2007. Br. J. Ophthalmol.), 이러한 내성의 원인은 반복 적인 anti-VEGF 제제 투여 시 내피세포의 안정화에 기여하는 pericyte의 coverage 증가에서 비롯된 혈관 강화 및 pericyte 의존적 VEGF 생성에 의한 결과로 알려지고 있다. 이에 따라, 최근 안질환치료제 개발동향은 anti-VEGF 제제들의 내성 극복 및 효능 증대의 방법으로 pericyte disassociat ion을 유도하는 PDGF 저해제를 병용요 법제로 개발하는 추세이다. 따라서， (i) VEGF-A 뿐만 아니라 또 다른 신생혈관 관 련 리간드를 차단하는 기능이 추가， (ii) 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제에 대한 내성 극복， (iii) 약물의 효능 증대를 위한 pericyte의 coverage 와해， (iv) 투여 주기의 개선 및 (V) 점안제로의 개발이 가능한 안질환 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 발명자들은 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제에 조직투 과성 펩타이드를 융합할 경우, 약물의 조직투과성이 증대되고, per icyte의 cover age가 와해되어 약물에 대해 내성을 나타내는 환자에 대해서도 그 효과가 발 휘될 수 있으며, 투여용량 감소 또는 투여주기가 개선되고 점안제로의 개발이 가능 하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인 자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인 자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백터를 숙주세포로 전환시키는 단계; (b) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 내성 극복 및 효능이 향상된 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 조직투과성 템타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인 자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질의 유효량올 이를 필요로 하는 개체에 투 여하는 것올 포함하는 안질환 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인 자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내 피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백터를 숙주세포로 전환시키는 단계; (b) 상기 세포를 배 양하는 단계; 및 (c) 상기 세포로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 내 성 극복 및 효능이 향상된 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제를 생산하는 방법을 제 공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 안질환 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 자연계에 존재하는 단백질들 중에서 혈관내피세포 성장인자 -A(VEGF-A)는 혈 액의 분출 (일혈， extravasat ion)을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 이는 다른 이 름으로 혈관투과성인자 (vascular permeabi l i ty factor)로도 불린다. 이 작용은 혈 관내피세포 성장인자 수용체 (VEGFR2)와 결합으로 인한 현상으로 알려져 있는데， 흥 미롭게도 혈관 내피세포 성장인자 -A의 돌연변이 실험에서 혈관내피세포 성장인자 수용체에 결합하지 못하더라도， 혈관투과성이 증진되는 사례를 보여주었다. 이는 혈관내피세포 성장인자 -A의 또 다른 수용체가 존재함을 제시하였다 (Stacker et al . , 1999. J . Biol . Chem. ) . 동 시대에 다른 연구진에서 이 수용체가 뉴로필린 (neuropi l in, NRP)임을 밝혀내었다 (Makinen et al .， 1999. J . Biol . Chem. ) . 뉴로필린은 처음으로 Xenopus nervous system에서 발견되었다. 뉴로필린은 막투과성 당단백질 (transmembrane glycoprotein)로서, NRP1 및 NRP2의 두 가지 형 태가 있다. 뉴로필린은 VEGF 패밀리 리간드 결합에 의해 VEGFRs(VEGF receptors)들 의 공수용체 (coreceptor)로 작용한다. 특히 NRP1은 VEGFRl, VEGFR2, VEGFR3의 공수 용체로 작용하여 다양한 VEGF 리간드와 결합한다. 반면 NRP2는 VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 림프관 형성 (lymphangiogenesis) 및 세포부착 (adhesion)에 기 여한다. 또한 NRPl/NRP2(NRPl/2)는 Plexin family receptors의 공수용체로 작용하 여 분비된 세마포린 3계열 리간드 (class 3 semaphorins ： Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, Sema3G)와 결합한다. 상기 조직투과성이란 뉴로필린을 과발현하는 조직을 특이적으로 인식하여 축 적되거나， 혈관내피세포의 세포간극을 넓혀 약물의 혈관 밖 유출을 촉진시키고， 수 용성 분자에 대한 장벽 (barrier) 역할을 하는 조직인 각막세포간극을 조절하여 안 구 내 약물의 분포를 촉진하는 특성 중 어느 하나의 특성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명에서의 용어 "뉴로필린 (neuropilin, NRP)" 은 막투과성 당단백질 (transmembrane glycoprotein)로서， NRP1 및 NRP2의 두 가지 형태를 갖는다. 뉴로 필린은 크게 5가지 도메인으로 구성되어 있는데， N-말단에서부터 al/a2 도메인은 CUB 도메인으로 분류되며， 세마포린의 Ig-like C2 type 부분이 결합하는 부분이다. 특히 이 부위는 plexin과 복합체를 형성하여 세마포린-플렉신 (plexin)과의 결합력 을 증가시키는 역할올 한다. 뉴로필린의 bl, b2 도메인은 FV/VIII 도메인으로 분류 되며, VEGF 패밀리 리간드나 분비된 세마포린 3 계열의 리간드들의 (secreted Sema3s) C-말단 부위가 결합한다. VEGF 리간드 및 세마포린 3계열 리간드는 퓨린 단백질 가수분해 효소의 인식 부위를 (RXRR, Arg-X-Arg-Arg) 가지고 있어， 퓨린 작 용 (Furin processing)에 의해 공통적으로 C—말단에 아르지닌 (Arg) 아미노산 잔기로 끝난다 (Adams et al . , 1997. ΕΜΒΟ J.). 이러한 VEGF, Sema3s 리간드의 C-말단 Arg 잔기는 뉴로필린 blb2 도메인간의 상호작용에서 매우 중요하다고 보고되어 있다 (Teesalu et al .， 2009. Proc. Natl. Acad. Sci. USA). VEGF 리간드와 뉴로필린 blb2 도메인 간의 결합체 3차 구조가 밝혀져 있어 (Parker et al . , 2012. J. Biol. Chem.), 뉴로필린의 blb2 도메인과 결합에 중요한 VEGF의 아미노산 서열은 알 수가 있다. 하지만， NRP1에 결합하는 Sema3A의 C-말단 어느 부위가 구체적으로 NRP에 결 합하는지는 아직 규명되지 않았다. 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제는 VEGF와 천연 VEGF 수용체 사이의 상호작 용을 방해하는 분자， 예를 들면, VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하여 VEGF와 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않으면 저지하는 분자를 포함한다. VEGF 길항제로는 항 -VEGF 항체, 항 -VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 -기반 키메라 분자가포함된다. 본 발명에 있어서 "융합" 은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일 체화하는 것으로， 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제에 조직투과성 펩타이드가 결합 할 수 있는 모든 물리， 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 링커 펩타이드에 의할 수 있으며， 이 링커 펩타이드는 예를 들면 항체의 Fab (항원결합절편) 또는 Fc 단편의 C-말단에 결합할 수 있다. 본 발명의 안질환은 바람직하게는 혈관 신생에 의한 안질환을 의미한다. 본 원에 사용된 바와 같은 표현 "혈관 신생에 의한 안질환 "은 혈관의 성장 또는 증식 에 의해 또는 혈관 누출에 의해 또는 이들과 관련된 눈의 임의의 질환을 의미한다. 본 발명에 따른 융합단백질에 의하면， 뉴로필린 수용체와의 결합에 의해 약 물의 조직투과성이 증대되고， per icyte의 cover age가 와해되어 약물에 대해 내성을 나타내는 환자에 대해서도 그 효과가 발휘될 수 있으며， 투여주기가 개선되고 점안 제로의 개발이 가능하다. 구체적으로， 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자들이 라니비주맙의 아 미노산 서열에서 시스테인 (C)을 세린 (S)으로 치환하는 점돌연변이를 도입한 라니비 주맙의 변이체는 생산성이 크게 증대되며， 라니비주맙의 변이체에 조직투과성 펩타 이드 (TPP)를 융합시킨 개량체에서도 생산성 증대의 효과는 그대로 유지되었다 (〈실 시예 1>) . 본 발명의 다른 일실시예에서 라니비주맙 변이체의 C-말단에 조직투과성 펩 타이드가 융합된 융합단백질의 뉴로필린 수용체에 대한 친화도와 내피세포 사이의 밀착연접 (t ight junct ion) 와해능을 비교한 결과， 상기 융합단백질은 뉴로필린 수 용체 NRP 1과 Sema3A l igand와 유사한 수준으로 매우 우수하게 결합함을 확인하였 으며， VE-cadherin을 현저히 억제하는 것으로 보아 내피세포 사이의 밀착 연접 와 해능이 매우 우수한 것으로 확인되었다 (실시예 <1-3>) . 본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 라니비주맙 변이체의 C-말단에 조직투과 성 펩타이드가 융합된 융합단백질이 안구 내피세포에 많이 분포하는 뉴로필린 수용 체와의 결합을 통해 투과도를 개선시킬 수 있는지를 확인하기 위하여 적출한 안구 를 상기 융합단백질이 함유된 용액 및 라니비주맙이 함유된 용액에 담근 후 시간별 투과도 정도를 비교하였다 (〈실시예 4>) . 실험 결과 상기 조직투과성 펩타이드가 결 합된 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제는실험 1시간부터 각막 상피조직으로부터 투 과가 시작되어 2시간에는 라니비주맙에 비해 안구 내 약물 분포가 현저히 높음을 확인하여， 투과도 개선을 통한 용량 조절 및 투여간격 증대 가능성을 확인하였다. 즉, 라니비주맙의 안구 투과도가 극히 미약하다는 선행 연구 결과와 비교하 여， 본 발명에 따른 융합단백질은 수용성 분자에 대한 barrier 역할을 하는 조직인 각막을 라니비주맙에 비해 신속히 투과하여 안구 안쪽까지 도달함을 확인하였으므 로 향후 제형 개선을 통해 점안제로의 개발 가능성도 확인할 수 있었다. Fab 형태 의 라니비주맙 개량체 뿐 아니라， 분자량이 크고 단백질의 구조가 복잡한 전체 항 체 (whole ant ibody) 형태에서도 조직투과성 펩타이드의 융합에 의한 안구 조직의 투과도 증가의 효과가 유사하게 관찰되었다. 면역글로불린 G( IgG) 형태의 베바시주 맙의 FC-말단에 조직투과성 펩타이드를 융합한 융합단백질도 베바시주맙과 비교하 여 현저하게 증가한 안구투과능을 나타내어， 본 발명에 따른 베바시주맙의 개량체 도 치료 효과가 증진된 약물로 개발될 수 있음을 알 수 있다. 본 실시예의 결과를 통해 VEGF 수용체들 (VEGFR1 , VEGFR2)을 Fc 단편에 융합 한 융합단백질 형태의 아플리버셉트， 컨버셉트 등에서도 베바시주맙과 동일하게 FC-말단에 조직투과성 펩타이드를 융합할 경우 기존의 Fc 융합단백질에 비해 치료 효과가 현저하게 증진된 약물로 개발될 수 있음을 예측할 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 다양한 동물 질환 모델을 이용하여 본 발명 의 융합단백질과 라니비주맙의 혈관신생 저해효과 및 약물 내성 모델에서의 신생혈 관 저해효과를 비교 평가하였다. 각막 신생 혈관 모델을 이용하여 실험한 결과， 본 발명의 융합단백질은 대조군 대비 50% 이상의 유의적인 신생혈관 저해효과를 나타 냈으며， 라니비주맙과 동등한 정도의 효과를 나타내어 C-말단에 융합된 조직투과성 펩타이드에 의한 효능 증대가 가능함을 확인하였다 (실시예 <5-1〉) . 또한， 약물 내 성 모델에서의 신생혈관 저해효과에 있어서 본 발명의 융합단백질은 라니비주맙 대 비 2배 이상의 우수한 효능을 나타내었으며， 이는 ant i-VEGF aptaraer와 ant i-PDGF ant ibody 제제를 병용투여한 문헌의 결과 (Jo et al . , 2006. Am. J . Pathol . 168)와 유사한 정도의 수치로써， 라니비주맙 투약 환자 중 시력 개선 없이 유지만 되는 약 70%의 환자들에서 시력 개선 가능성이 있을 것으로 예측할 수 있다 (실시예 <5-2>) . 본 발명에 따른 융합단백질의 안질환에서 혈관신생을 억제하는 우수한 효과는 실제 황반 변성 효능 모델로 사용하는 맥락막 신생혈관 (CNV)과 망막병증 효능 모델로 사 용하는 산소유도 신생혈관 (0IR)의 모델에서도 동일하게 관찰되어 라니비주맙과 비 교하여 임상적으로 치료 효과가 현저하게 증진될 것임을 예측할 수 있다 (<실시예 6>, <실시예 7>) . 본 발명에서 사용되는 용어 "예방" 은 본 발명의 조성물의 투여로 안질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 는 본 발명의 조성물의 투여로 안질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 보다 구체적으로 상기 '치료' 는 안질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 안질환을 치유하거나， 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으 며， 안질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치 휴하거나 예방하는 것올 포함하며， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명을 실시함에 있어서， 해당 분야의 통상적인 지식을 가진 기술자는 안 질환의 예방 또는 치료의 효과를 내기 위하여 대상 안질환의 유형 및 중증도， 투여 가 필요한 개체의 연령, 체중， 건강 상태， 성별， 식이 및 배설율 등의 다양한 요인 을 적절하게 고려하여 본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량 (유효량) , 투여 횟수, 투여 경로를 결정할 수 있다. 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 안질 환의 증상을 개선시키는 양을 포괄적으로 지칭하며， 이는 안질환을 치유하거나 실 질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 양을 포함한다. 상기 '개체' 란 동 물, 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유 래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자일 수 있 다. 본 발명에 따른 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방 법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내， 동맥내， 골수내， 경막내, 심장 내， 경피， 피하， 복강내， 비강내, 장관， 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 면역원성 복합 단백질은 단록으로 투여하거나, 대상 질환을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
예를 들어， 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이， 몸무게， 성별, 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며， 일반적 으로 안구 주사의 경우, 안구 당 0.001~10mg/day이며， 바람직하게는 안구 당 0.1~2mg/day일 수 있다. 점안제의 경우, 투여량의 범위는 점안액 1ml 당 O .OOl-lOOmg이며， 바람직하게는 0.01~10mg/day일 수 있다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분할 투여할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀를로오스， 유 당， 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘， 락토스， 만니를, 엿， 아라 비아고무， 전호화전분， 옥수수전분, 분말셀를로오스， 히드록시프로필셀롤로오스， 오파드라이, 전분글리콜산나트륨， 카르나우바 납， 합성규산알루미늄, 스테아린산， 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슴， 백당, 덱스트로스， 소 르비를， 트레할로즈 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0. 1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직 하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 주사제， 점안제， 안연고제, 안구 삽입제형을 포 함하나 이에 한정되지 않는 어떤 투여 경로에 적합한 여러 형태일 수 있고 이를 제 제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결합제, 습윤제, 붕해제， 계면활 성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 주사제의 경우 유리체 강내 주사， 결막주사를 포함한 안구 내 국소적으로 주사하는 방법을 모두 포함하나 이에 한정되지 않는다. 주사제에는 용해제， 등장화제， 현탁화제, 유화제， 안정화 제， 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가포함될 수 있다. 본 발명의 주사제에 적절한 담체는 생리 염수， 세균 발육 저지수, 크레모포 어 EL (미국 뉴저지주 퍼시패니에 소재하는 바스프) 또는 인산염 완층 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에 조성물은 멸균되어야 하며， 쉽게 주사를 놓을 수 있을 정도 의 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 세균 및 진 균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는， 예컨대 물, 에탄을, 폴리올 (예: 글리세를， 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등 )， 및 이의 적절한 흔합물을 함유하는 분산매일 수 있다. 적당한 유동성은, 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 이용하고， 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하며, 계 면활성제를 사용하여 유지할 수 있다. 미생물 작용은 각종 항균제 및 항진균제, 예 컨대 파라벤, 클로로부탄을， 페놀， 아스코르브산， 치메로살 등을 사용하여 예방할 수 있다. 많은 경우에， 조성물 증에 등장제， 예를 들어 당， 폴리알콜， 예컨대 만니 를, 소르비를， 트레할로즈， 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가 능한 조성물의 흡수는， 흡수를 지연하는 제제， 예를 들어 모노스테아르산알루미늄， 히알루론산 및 젤라틴을 조성물 중에 함유시킴으로써 높일 수 있다. 점안제의 경우 수용성 안과용액， 비수용성 안과용액 또는 안과 에멀젼일 수 있다. 본 발명의 점안제에는， 상기 필수성분인 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내 피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질 이외에， 점안제에서의 종래 공지의 임의성분， 예를 들어， 완층제, 점조제， 안정화제， 등장화제， 방부제 등을 배합할 수 있다. 이 중， 완충제로서는 구연산염， 인산염， 초산염, 아미노산염 등 공지의 완충제를 들 수 있다. 또한， 점조제로서는 폴리비닐알콜， 히드록시프로필셀 를로즈， 메틸셀를로즈， 포비돈， 히드록시프로필메틸셀를로즈， 에틸셀를로즈， 히드 록시에틸샐를로즈， 카르멜로스， 폴리에틸렌글리콜， 콘드로이틴 또는 이들의 염을 들 수 있다. 또한， 안정화제로서는 아질산나트륨, 아황산수소나트륨， 메타아황산수 소나트륨 둥의 산화방지제; 에데트산나트륨， 시클로덱스트린， 구연산， 구연산염 등 의 킬레이트제 등을 들 수 있다. 또한， 등장화제로서는 염화나트륨, 염화칼륨 등의 염류; 글리세린， 프로필렌글리콜 등의 다가알콜; 포도당， 자당， 트레할로즈 등의 당류; 자일리틀， 솔비를 등의 당알콜; 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리에테르; 타우린 등의 아미드술폰산 등을 들 수 있다. 또한， 방부제로서는 염화벤잘코늄 (benzalkonium chloride) , 염화벤제토늄 (benzethonium chloride) , 클로로부탄을， 파라옥시안식향산 에스테르, 티메로살 (thimerosal ) , 소르빈산， 소르빈산염, 글루콘 산클로로핵시딘 (chlorohexidinegluconate) 등을 들 수 있다. 본 발명의 점안제에 있어서, 실온에서의 pH는 4.5~8.5가 바람직하고， 보다 바람직하게는 5.5~8， 특히 바람직하게는 6~8이다. pH의 측정은 실온 하에서 pH 미터 (예를 들어， Fi sher Scient i f i c사 제품 Accumet model 25 pH/Ion meter 등)를 이용하여 측정된다. 일부 안과 약물은 안구 장벽을 통한 침투성이 불량하여， 점안제로 투여할 수 없다. 따라서， 연고를 사용하여 접촉시간을 연장하고 흡수되는 약물의 양을 늘릴 수 있다. 점안제에 사용할 수 있는 담체성분으로서 비수용성 고분자로는 에틸샐를 로스， 에틸렌초산비닐 공중합체， 폴리메탈메타아크릴레이트, 아크릴산에틸 메타크 릴산메틸 ·메타크릴산염화트리메탈암모늄에틸 ·코폴리머， 메타크릴산메탈 ·메카크 릴산부틸 ·메타크릴산디메탈아미노에틸 ·코폴리머 등을 들 수 있다. 생체 내분해성 고분자로는， 예컨대 폴리유산， 폴리유산，글루콜산 공증합체, 폴리시아노아크릴레 이트， 폴리알킬시아노아크릴레이트， 폴리 · ε ·카프로락톤 등을 들 수 있다. 수용 성고분자로는， 히드록시프로판메탈셀를로스후다레이트， 카르복실메틸에틸셀를로스， 히드톡시프로필셀를로스 등의 셀를로스 유도체, 알킨산칼슘, 키토산， 알부민, 젤라 틴， 메타크릴산 ·메타크릴산메탈 ·코폴리머 등을 들 수 있다. 유지성 성분으로는 트리팔미틴, 세틸알콜, 콜레스테롤, 각종 인지질류， 팔미틴산세틸， 팔미틴산콜레스 테를 등을 들 수 있다. 이런 담체성분은 통상 안과용 치료 활성물질을 함유한 약효 성분의 서방기능 (서서히 방출하는 기능)을 갖는다. 또， 비중조정제를 참가하지 않 고 사용가능한 비중이 높은 담체성분으로는, 예컨대 히드록시프로필메틸셀를로스프 탈레이트 200731(비증 1.65)， 히드톡시프로필메틸샐를로스프탈레이트 220824(비중 1.82) , 카르복시메틸에틸샐를로스 (비중 1.59) 등을 들 수 있다. 그러나， 이런 담체 성분을 이용할 경우에도 역시 비중조정제를 첨가해 비중값을 높이는 것이 바람직하 다. 본 발명에 있어서， 담체입자의 비중조정에 사용되는 비중조정제로는， 예컨대 산화티탄 (4.17)과 같은 불용성 성분， 인산삼칼륨 (비중 3. 14)， 무수인산수소칼륨 (비 중 2.89)， 인산수소칼륨 ·이수화물 (비중 2.30)과 같은 난용성 성분， 염화나트륨 (비 중 2. 17)， 염화칼륨 (비중 1.98)， 염화칼슘 (비중 2.0)， 염화마그네슴 (비중 2.41) , 탄산나트륨 (비중 2.53)， 인산이수소나트륨 (비중 1.95)， 인산일수소나트륨 (비중 1.7)， 인산이수소칼륨 (비중 2.34)과 같은 수용성 성분 등을 들 수 있다. 삽입체는 일반적으로 열린 각막에 부착되기 보다는 상부 맹관에 배치되거나 또는 덜 빈번하게는 하부 결막 낭에 배치된다는 점 이외에는 각막에 배치되는 소프 트 콘택트렌즈와 유사하다. 삽입체는 일반적으로 약물을 방출하면서 누액중에 용해 되거나 붕해되는 생물학적 가용 물질로 제조된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제, 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함 되며, 이러한 고형제제는 Tyros 에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분., 칼슘 카보네이트， 수크로오스， 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되 는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예 를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한， 본 발명의 치료용 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체， 부 형제 또는 안정화제 (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edi t ion, Al fonso , R. , ed, Mack Publ ishing Co . (Easton, PA: 1995) )를 추가로 포 함할 수 있다. 허용가능한 담체， 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에 서 수용자에게 비독성이고， 완층용액， 예를 들어 인산， 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제 ; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단 백질， 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체， 예를 들 어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산， 예를 들어 글리신， 글루타민， 아스파라긴， 아르기 닌 또는 리신; 단당류， 이당류 및 글루코스， 만노스， 트레할로즈， 또는 덱스트린 올 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제， 예를 .들어 EDTA; 당 알콜， 예를 들어 만니 를 또는 소르비를; 염 -형성 반대이온， 예를 들어 나트륨; 및 (또는) 비이온성 계면 활성제， 예를 들어 트원， 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 조직투과성 펩타이드 는 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포 함하는 것을 특장으로 하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 표시된 조직투과성 펩타이드는， 뉴로필린의 blb2 도메인에 결합하는 VEGFA리간드의 결합부위 아미노산 서열 및 길이를 분석하고， 뉴로필린에 결합한다고 알려진 세마 포린 3A 및 세마포린 3F의 퓨린 C-말단 서열 의 염기서열을 분석하여 이들의 C-말 단의 서열이 유사함을 바탕으로 설계된 펩타이드이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항 -혈관 내피세포 성 장인자 제제는 베바시주맙 (bevacizumab) , 라니비주맙 (ranibizumab)， r84(PLoS One . 2010 Aug 6；5(8) ) , 아플리버셉트 (af l ibercept ) , 컨버셉트 (cdnbercept )， CT0KW02005056764A2) , D0M15-10-1KW02008149147A2) , D0M15-26-
593(W02008149143A2) , PRS-050(Mross et al . , 2013. PLoS One) , CT-322(Dineen et al . , 2008. BMC Cancer) , ESBA903(Asmus et al . , 2015. Eur J Pharm Biopharra. ) 및 EPI-0030(W02011023130A1)로 구성된 군으로부터 선택된， 안구 질환을 예방하거나 치료하는데 사용되는 제제， 이들의 동등생물의약품 (biosimi lar) 및 변이체를 포함 하는 약학적 조성물을 제공하며， 보다 바람직하게는 라니비주맙, 베바시주맙, 아플 리버셉트, 컨버셉트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 '동등생물의약품 (biosimi lar)' 이란, 유전자재조합 및 세포배양기술 등 생명공학기술을 활용하여 이미 개발 /판매되고 있는 특허 만료된 오리지널 바이 오 의약품을 모방하여 품질， 효능 및 안전성의 측면에서 동등성을 입증한 복제 의 약품을 의미한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명의 상기 변이체는 중쇄 불변 1 도메인 및 경쇄 불변 도메인의 아미노산인 시스테인은 결실되거나, 시스테인을 제외하고 세린을 포함하는 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 약학 적 조성물을 제공한다. 본 발명의 일실시예에서는 라니비주맙의 아미노산 서열을 변환하는 단백질 엔지니어링 방법으로， 라니비주맙의 뉴클레오티드 서열 중 마지막 시스테인이 세린 으로 변경된 라니비주맙 변이체를 제작하였다 (실시예 <1-1>) . 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 상기 변이체는 서열번호 8 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서 열을 갖는 중쇄로 이루어진 라니비주맙 (ranibizumab) 변이체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물올 제공한다. 상기 일 양상의 조직투과성 펩타이드는 링커 템타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 바 람직하게는 4 내지 20개， 더욱 바람직하게는 4 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한， 상기 링커 펩타이드는 글라이신 (glycine, G)， 세린 (serine, S) 또 는 알라닌 (alanine, A)으로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 상기 링커 펩타이드의 서열은 (GA)n 또는 (GGGGS)„^ 아미노산 서열로 이루어진 것 (단， 상기 n 및 m은 각 각 독립적으로， 정수 1 내지 20이며， 괄호 안의 서열이 반복되는 횟수를 의미한다 . )일 수 있고， 더욱 바람직하게는 GAGA 또는 (GGGGS)3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 조직투과성 펩타이드 (TPP)가 상기 링커를 통해 라 니비주맙 변이체에 융합된 융합단백질을 제작하여 그 효과를 확인하였다. 상기 융 합단백질은 본 발명에 따른 라니비주맙 변이체 ( IDB0061)에 TPP#2가 링커 ( (GGGGS)3) 로 연결된 형태로서， 서열번호 12 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이 루어진 융합단백질 ( IDB0062) ; 본 발명에 따른 라니비주맙 변이체 ( IDB0061)에 TPP#5 가 링커 ( (GGGGS)3)로 연결된 형태로서， 서열번호 16 및 서열번호 18로 표시되는 아 미노산 서열로 이루어진 융합단백질 ( IDB0064) ; 베바시주맙에서 중쇄에 TPP#2가 링 커 ((GGGGS)3)로 연결된 형태로서， 서열번호 20 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 융합단백질 ( IDB0072) 등이다. 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 임의의 신생혈관에 따른 안질환을 치료 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 표현 '신생혈관에 따른 안질환' 은 혈관의 성장 또는 증식에 의해 또는 혈관 누출에 의해 또는 이들과 관련된 눈의 임의의 질 환을 의미한다. 혈관 신생에 따른 상기 안질환은 증식 유리체 망막병증， 황반 변성， 색소성 망막증， 당뇨병성 망막증， 맥락막 신생혈관, 신생혈관성 녹내장， 허혈성 시신경 장 애， 조숙아 망막증, 미숙아 망막증， 유행성 각결막염， 신생혈관성 홍채질환， 후수 정체 섬유증식증， 아토피성 각막염， 상각막윤부 각막염， 위상편 건선 각막염， 플릭 텐성 각결막염， 공막염 및 당뇨성 황반 부종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으 며， 보다 바람직하게는 황반 변성 및 당뇨성 황반 부종일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 (a) 조직투과성 펩타이드 와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백터를 숙주세포로 전환시키는 단계; (b) 상기 세포 를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하 는 내성 극복 및 효능이 향상된 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제를 생산하는 방법 을 제공한다. 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 13， 서열번호 15， 서열번 호 17， 서열번호 19 , 서열번호 21 및 서열번호 23으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다. 구체적으로， 본 발명에 따른 라니비주맙 개량체인 IDB0062의 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 핵산은 각각 서열번호 13과 서열번호 15의 염기서열에， IDB0064의 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 핵산은 각각 서열번호 17과 서열번호 19의 염 기서열에, 그리고 베바시주맙 개량체인 IDB0072의 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 핵산 은 각각 서열번호 21과 서열번호 23의 염기서열에 기재되어 있는 바와 같다. 또한 상기 백터는 당업자들이 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 본 발명 의 폴리뉴클레오티드를 백터내로 삽입하여 적절한 전사 /해독 조절서열을 이용하여 본 발명의 융합단백질을 발현하도록 제조된 발현백터를 말한다. 본 발명에 따라 클로닝된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며， 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열 과 발현 조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (repl icat ion or igin)을 같이 포함하 고 있는 하나의 발현 백터 내에 포함될 수 있다. '작동가능하게 연결 (operably l inked)' 된다는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 (핵산) 서열이 발현 조절 서열의 유 전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현 조절 서열 (expression control sequence) ' 이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열 은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임와의 오퍼레이터 서 열， 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조 절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 발현 백터의 모백터로 사용되는 백터는 특별한 제한이 없으며， 이 발명 이 속하는 기술분야에서 숙주세포로 사용되는 미생물에서의 발현을 위하여 통상적 으로 사용되는 모든 플라스미드， 바이러스 또는 기타 매개체 등이 사용 가능하다. 예컨대， 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 등이 있으며， 상기 바이러스는 레트 로바이러스， 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스， 배클로 바이러스와 같은 곤층 바이러스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니 다. 상기 숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방 식으로 유전자로부터 목적 생성물을 생산할 수 있는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적 인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질 의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현 은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 '천연' 폴딩 의 가능성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며， 예컨대， E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E.coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등이 사용될 수 있으며, 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주， 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같 은 바실리 (bacilli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonel la typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스 (Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 균주가숙주세포로서 이용될 수 있다. 또한， 본 발명의 백터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로 서， 이스트 (Saccharomycecerevisiae), 곤층 세포 및 사람 세포 (예컨대， CH0 세포주 (Chinese hamster ovary) , W138, ΒΗΚ, COS-7, 293,HepG2, 3Τ3, RIN 및 MDCK 세포 주) 등이 이용될 수 있다. 백터를 숙주세포 내로 전달하여 숙주세포를 형질전환 시키는 방법은 공지의 방법이면 어떠한 것이든 가능하며 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들어， 대장균을 이용할 경우 열층격 (heat shock)이나 electroporat ion 방법을 통해 형질전환할 수 있으며 동물세포를 이용한 생산세포주 구축 시 인산칼슘침전법 (calcium phosphate precipitat ion) , DEAE-dextran법, 전기천공법 (electroporat ion) , 직접 미세주입법 (direct microinject ion) , DNA-로딩 리포좀 (DNA- loaded 1 iposome)법， 리포펙타민- DNA 복합체 ( l iofectamine-DNA complex)법, 세포 음파분쇄법 (cel l sonicat ion) , 고 속미세분사 (high veloci ty microproject i le)를 이용한 유전자 폭격법 (gene bombardment ) , 다양이온 (polycat ion)법 및 수용체 매개 형질전이법 (receptor- mediated transfect ion)에 의하여 형질전환할 수 있다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 개량될 수 있다. 형질전환 세포의 배양은 융합단백질의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하 에서 수행하며， 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있 다. 형질전환 세포는 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배 지로는 탄소원， 질소원， 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며， 예 를 들어, 2X YT배지를 사용할 수 있다. 세포의 배양은 통상의 세포 배양 조건상에 서 가능하며 예를 들어， 온도범위 15°C 내지 45°C에서 10시간 내지 40시간 동안 배 양할 수 있다. 배양액 중의 세포를 제거하고 배양배지만을 회수하기 위해 원심분리 (centri fugat ion) 또는 여과 ( f i ltrat ion) 과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당 업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 균체를 제거한 배양배지 (여액)는 통상적인 방 법에 따라 넁장하여 그 활성을 잃지 않도록 단기 보존할 수 있다. 형질전환 세포 (또는 형질전환체)에서 발현시킨 융합단백질은 통상의 방식으 로 정제될 수 있으며， 예를 들에 염석 (예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침 전)， 용매 침전 (아세톤， 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)， 투석， 겔 여과， 이온 교환， 역상 칼럼 크로마토그래피， 친화 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토 그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 융합단백 질을 정제할 수 있다 (Maniat is et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. (1982)； Sambrook et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)； Deutscher , M. , Guide to Protein Puri f icat ion Methods Enzymology, vol . 182. Academic Press . Inc . , San Diego, CA(1990) ) . [유리한 효과]
본 발명의 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제 제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 항 -혈관 내피세 포 성장인자 제제의 조직투과성이 개선되고 안구 내 주사 시 맥락막 조직으로의 약 물 전달력이 개선되어 약물 내성환자의 치료， 투여용량 감소 또는 투여주기 증대의 효과를 나타낼 뿐만 아니라 점안제로 개발할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1A는 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 항원결합절편 (Fab)이 융합된 융합단백질의 모식도이다. 도 1B는 조직투과성 펩타아드와 항 -혈관 내피세포 성장인자가 융합된 융합단백질이 VEGF 및 뉴로필린 수용체 -1 과 결합하는 양상을 나타낸 모식도이다. 도 1C는 다양한 혈관 내피세포 성장인자 억제제 형태들 (Fab, 전 항체 (whole IgG) , Fc 융합단백질)에 조직투과성 펩타이드가 결합된 개량 체들의 모식도이다. 도 2는 라니비주맙과 본 발명의 융합단백질의 생산에 따른 주요 산물을 HPLC 로 분석한 결과이다 ( IDB0062: 라니비주맙 변이체와 조직투과성 펩타이드 TPP#2가 융합된 Fab 융합단백질) . AU는 임의의 단위 (arbitrary unit )를 의미한다. 도 3은 본 발명에 따른 융합단백질들의 1차 정제물을 12% non-reducing SDS- PAGE gel에서 분석한 결과이다 ( IDB0062 , 라니비주맙 변이체와 조직투과성 펩타이드 TPP#2가 융합된 Fab 융합단백질; IDB0064, 라니비주맙 변이체와 조직투과성 펩타이 드 TPP#5가융합된 Fab 융합단웩질) . 도 4A는 라니비주맙, 라니비주맙 변이체 및 본 발명에 따른 융합단백질의 VEGF에 대한 결합친화도 분석 결과이다. 도 4B는 조직투과성 펩타이드와 본 발명에 따른 융합단백질의 뉴로필린 수용체 -1에 대한 결합능을 평가한 결과이다 ( IDB0061 , 라니비주맙 변이체; IDB0062, 라니비주맙 변이체와 조직투과성 펩타이드 TPP#2가 융합된 Fab 융합단백질; Fc-TPP#2, IgGl의 FC-말단에 조직투과성 펩타이드 TPP#2가 융합된 Fc 융합단백질) . 도 5A는 본 발명에 따른 융합단백질의 보관 조건별 안정성을 평가한 결과이 다. 도 5B는 반복적인 넁 /해동에 따른 융합단백질의 안정성을 평가한 결과이다. 도 6A는 라니비주맙， 라니비주맙 변이체 및 본 발명에 따른 융합단백질의 신 생혈관 예방 모델에서 혈관 신생 억제효과를 각막신생혈관 예방 모델에서 평가한 결과이다. 도 6B는 도 6A에서의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 7A는 라니비주맙 및 본 발명에 따른 융합단백질의 신생혈관 내성 모델에 서 혈관 신생 억제효과를 각막신생혈관 내성 모델에서 평가한 결과이다. 도 7B는 도 7A에서의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 7C는 라니비주맙 및 본 발명에 따른 융합단백질의 pericyte coverage 감소 효과를 평가한 결과이다. 도 8A는 본 발명에 따른 융합단백질인 라니비주맙 개량체 IDB0062의 안구투 과성올 현광현미경을 통해 평가한 결과이다. 도 8B는 도 8A에서의 결과를 수치화하 여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 8C는 2시간 반응시킨 안구 조직 단면에서 FITC conjugat ion된 단백질의 분포를 DAPI 염색과 함께 형광현미경을 통해 분석한 결과 이다. 도 8D는 도 8C에서의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 8E는 망막 조직의 단편을 공초점현미경으로 분석한 결과로 IDB0062의 망막 투과능에 따 른 분포를 분석한 결과이다. 도 9A는 본 발명에 따른 융합단백질인 베바시주맙 개량체 IDB0072의 안구투 과능을 현광현미경을 통해 평가한 결과이다. 도 9B는 9A에서의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 10A는 라니비주맙 및 본 발명에 따른 융합단백질의 맥락막 신생혈관 (CNV) 모델에서 약물 처리에 따라 맥락막 신생혈관의 증식의 억제되는 양상을 보여주는 그림이다. 도 10B는 도 10A의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 11A는 라니비주맙 및 본 발명에 따른 융합단백질의 산소유도 망막병증 (0IR) 모델에서 약물 처리에 의해 혈관 말단에서 누수 현상이 억제되는 것을 형광 현미경을 통해 분석한 결과이다. 도 11B는 도 11A의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 12A는 라니비주맙 및 본 발명에 따른 융합단백질의 산소유도 망막병증 (0IR) 모델에서 약물 처리에 의해 신생혈관 및 혈관 다발 (tufts)의 형성이 억제되 는 것을 i solect in B4 염색 후 형광현미경을 통해 분석한 결과이다. 도 12B는 도 12A의 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 13은 IDB0062와 라니비주맙을 rat에 안구 내 주사한 뒤 시간별 망막 조직 에 존재하는 약물의 양을 western blot assay를 통해 분석한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명올 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
조직투과성 펩티드가 욥함된 라니비주탑 개량체 제작
<1-1> 생산성이 증가된 라니비주맙 변이체 IDB0061의 제작
라니비주맙의 낮은 생산 수율 문제는 Fab fragment의 낮은 배양 생산성과 periplasmic expression을 통한 생산 단백질의 다형성으로 복잡한 후처리 공정이 필요하기 때문이다. 이를 극복하기 위하여 돌연변이 도입 등 단백질 엔지니어링 을 통해 라니비주맙의 특정 아미노산 서열을 변환시킴으로써， 생산된 단백질이 대 부분 세포 외부로 배출되도록 하여 발현율을 높이고 균일한 형태의 단백질만 생산 되도록 생산 세포주를 최적화하여 라니비주맙 변이체인 IDB0061를 생산하였다. 이 를 통해 배양 생산성을 높이고 정제 공정을 단순화하여 생산수율이 획기적으로 개 선됨을 확인하였다. 구체적으로， 라니비주맙의 아미노산 서열을 변환하는 단백질 엔지니어링 방 법은 라니비주맙 nucleot ide sequence 중 마지막 cysteine을 serine으로 변경하여 유전자를 합성한다. 이후 SUPEX5(KCTC 12657BP) 생산세포주에 transformaUon한 후 발현 테스트를 진행하였다. 라니비주맙 변이체 IDB0061의 경쇄 부분의 제작 과정은 다음과 같다. 라니비 주맙의 핵산서열을 관련 특허로부터 입수하고 코돈 최적화 작업을 진행한 뒤 이를 바탕으로 signal sequence가 포함되어 있는 Fab 경쇄 가변부 (VL)의 핵산을 합성하 였으며， Fab의 CL 영역은 ant i-albumin Fab인 SL335의 백터를 주형으로 pr imer (서 열번호 24， 25)를 이용해 PCR하여 제작하였다. 라니비주맙 변이체 IDB0061의 중쇄 부분의 제작 과정은 다음과 같다. 라니비주맙의 핵산서열을 관련 특허로부터 입수 하고 코돈 최적화 작업을 진행한 뒤 이를 바탕으로 signal sequence (gl I I )가 포함 되어 있는 Fab 중쇄 가변부 (VH)의 핵산을, 합성하였으며， Fab의 CH1 영역은 ant i- albumin Fab인 SL335의 백터를 주형으로 pr imer (서열번호 32， 33)를 이용해 PCR하 여 제작하였다.
【표 11
쿨로 ¾에 사률한프라이머 CprifflB ) 서¾
Figure imgf000024_0001
단백질 엔지니어링 분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 라니비주 맙의 아미노산 서열에 점돌연변이 (point mutat ion)를 일으켰다. 구체적으로， 라니 비주맙의 경쇄 아미노산 서열 중 214번째 아미노산인 시스테인 (cysteine)이 세린 (serine)으로 치환되었으며， 라니비주맙의 중쇄 아미노산 서열 중 226번째 아미노 산인 시스테인 (cysteine)이 세린 (serine)으로 치환되었다. 상기 점 돌연변이가 일 어난 라니비주맙 변이체 IDB0061의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 서열번호 8 및 서열번호 10으로 각각 표시하였으며， 이를 인코딩하는 핵산 서열을 서열번호 9 및 서열번호 11로 각각 표시하였다.
PCR을 통해 최종 완성된 라니비주맙 변이체 IDB0061의 서열은 pHEKA vector 에 cloning하고， SUPEX5 strain에 trans format ion하였다. 구체적으로, lmra 큐벳에 competent cel l 100 μ ΐ를 넣고 여기에 상기 DNA를 3 μ 1 첨가한 뒤 1800V로 electric shock을 주어 유전자를 도입하여 생산세포주를 완성하였다. 라니비주맙과 IDB0061 각각의 생산세포주를 2x YT media(100mM potassium phosphate buffer , H 7.2， 50 u g/ml kanamycin) 50ml에 1%(ν/ν) 접종하여 28°C에 서 220rpm으로 18시간 배양하여 전배양을 진행하였다. 2x YT media를 1L baff led f lask에 180ml씩 넣고 멸균한 본배양 배지에 미리 제균한 1M potassium phosphate (pH 7.2) 20ml과 50 y g/ml kanamycin을 첨가한 뒤 0D600이 약 0.15가 되 도톡 전배양액을 접종한다. 이후 28 °C , 220rpm에서 0D600이 0.5~0 ·7 사이가 될 때 까지 배양한 뒤 O. lmM IPTG를 첨가하고 온도를 20°C로 낮춰 발현을 유도한다. 발현 유도 21시간 후 배양액은 원심분리를 통해 상등여액을 회수하고 depth f i lter와 membrane steri le f i lter를 이용해 여과한 뒤 protein L column에 loading하여 목 적 단백질올 정제하였다. 본 발명에 따른 라니비주맙 변이체 IDB0061과 원래의 라니비주맙의 생산성을 비교한 결과， 표 2에서 보이는 바와 같이， IDB0061은 기본 배지를 사용한 batch culture만으로도 라니비주맙에 비해 높은 생산성을 가지는 것을 확인하였으며, 세 포 파쇄 없이 배양액에서 흡착 컬럼을 사용한 one-step 공정으로 95% 이상의 순도 로 정제가 가능하여 공정의 단순화가 가능하였다. 【표 2]
라니비주¾과 M.발병에 it Ε|Ι Η|Τ¾Γ 이체와： ¾체의 ¾ 비교
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l: Anti-VEGF antibody툑허 (PC WS19'98/D06S 4, Geaei e b.) ¾고
2: Movartis 는최 ¾¾제¾의 순도률 ¾시 · ¾에 비|해' IOBOOGt, !DB0062fe Protedn L
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<l-2> 라니비주맙 변이체와 조직투과성 펩티드의 융합
본 발명자들은 항 -VEGF 제제인 라니비주맙의 효능 증대 및 내성 극복을 위해 라니비주맙의 C-말단에 뉴로필린 l(NRPl) 및 2에 모두 결합하거나 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합할 수 있는 조직투과성 펩타이드 (t issue penetrat ing pept ide , TPP)를 융합하고자 하였으며 , ΤΡΡ의 아미노산 서열은 하기 표 3에 나타내었다. 표 3의 서열목록 중 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 ΤΡΡ는 뉴로필린 1 및 2에 모두 결합이 가능하며， 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열을 갖는 ΤΡΡ는 뉴로 필린 1에만 특이적으로 결합이 가능하다. 라니비주맙에 ΤΡΡ가 융합된 융합단백질의 모식도를 도 1에 나타내었다. 구체적으로， 에이프릴바이오에 의뢰하여 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 라니비주맙 변이체 IDB0061의 C-말단에 하기 표 3에 기재된 다양 한 ΤΡΡ (뉴로필린 수용체에 특이적으로 결합하는 펩타이드)들이 융합된 융합단백질 및 이를 생산하는 세포주를 제작하였다. 한편, 표 3에 나타낸 ΤΡΡ 중， 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ΤΡΡ#2는 뉴로필린의 intrinsic l igand인 VEGF165 및 세마포린 3계열 리간드들의 C-말단 부위 를 변형한 것이고， TPP#5는 뉴로필린 1의 blb2 도메인 단백질과 동시에 뉴로필린 2 의 blb2 도메인 단백질을 경쟁자 (compet itor)로 이용하여 뉴로필린 1의 bl 도메인에 선택적으로 결합하는 클론으로부터 도출된 펩타이드를 분리 동정한 것으로서， 여기 에 링커로 Avast in을 융합하여 뉴로필린 수용체에 bivalent로 작용할 수 있도록 함 으로써 VEGF와 Sema3A 리간드와 비슷한 친화력을 갖으면서도 조직투과성을 가질 수 있게 design하였다. 【표 3]
Tissue pedoe raitioe peptide (WP
Figure imgf000027_0001
TPP가 결합되어 있지 않는 라니비주맙 변이체 IDB006K라니비주맙에 점돌연 변이만 도입한 형태)에 TPP#2 펩타이드가 링커에 의해 연결되어 있는 형태인 IDB0062의 제작 과정은 다음과 같다.
구체적으로， ΤΡΡ가 융합된 라니비주맙 변이체 IDB0062의 경쇄 부분의 제작은 라니비주맙의 핵산서열을 관련 특허로부터 입수하고 코돈 최적화 작업을 진행한 뒤 이를 바탕으로 signal sequence가 포함되어 있는 경쇄 가변부 (VL)의 핵산을 합성하 였으며， 경쇄 불변부 (CL) C-말단의 cysteine이 serine으로 치환된 일부 서열에 linker와 TPP#2 서열을 포함한 핵산 (CL'-l inker-TPP#2)을 합성하였다. Fab의 CL 영 역은 anti-albumin Fab인 SL335와 백터를 주형으로 primer (서열번호 24， 25)를 이 용해 PCR하여 제작하였고， 합성한 CL'-linker-TPP#2 핵산을 주형으로 primer (서열 번호 26， 27)를 이용해 PCR하여 CL'-linker-TPP#2를 제작하였다. 이 두 product는 linking PCR을 통해 연결하여 CL-1 inker -TPP#2 올리고뉴클레오타이드를 제작하였 다. 합성한 VL 핵산을 주형으로 primer (서열번호 28， 29)를 이용해 VL을 제작한 뒤 CL-linker-TPP#2와 함께 primer (서열번호 30， 31, BamHI과 Xhol 서열 포함)를 이용 해 assembly PCR을 수행하여 최종 VL-CL-1 inker -TPP#2 서열을 완성하였다.
ΤΡΡ#2가 융합된 라니비주맙 변이체 IDB0062의 중쇄 부분의 제작은 라니비주 맙의 핵산서열을 관련 특허로부터 입수하고 코돈 최적화 작업을 진행한 뒤 이를 바 탕으로 signal sequence(glll)가 포함되어있는 중쇄 가변부 (VH)의 핵산을 합성하였 으며 중쇄 불변부 (CHI) C-말단의 cysteine이 serine으로 치환된 일부 서열에 linker와 TPP#2 서열을 포함한 핵산 (CH1'-1 inker-TPP#2)을 합성하였다. Fab의 CH1 영역은 anti— albumin Fab인 SL335의 백터를 주형으로 primer (서열번호 32， 33)를 이용해 PCR하여 제작하였고， 합성한 CHl'-linker-TPP 핵산을 주형으로 primer (서열 번호 34, 35)를 이용해 PCR하여 CHl'-linker-TPP#2를 제작하였다. 이 두 product는 linking PCR을 통해 연결하여 CH1-1 inker-TPP#2 올리고뉴클레오타이드를 제작하였 다. 합성한 VH 핵산을 주형으로 primer (서열번호 36， 37)를 이용해 VH을 제작한 뒤 CL-linker-TPP#2와 함께 primer (서열번호 38， 39， EcoRI과 Hindlll 서열 포함)를 이용해 assembly PCR을 수행하여 최종 VH-CH1-1 inker-TPP#2 서열을 완성하였다. PCR을 통해 최종 완성된 fragment 중 경쇄는 BamHI과 X )I으로， 중쇄는 EcoRI과 Hindlll로 절단한 뒤 동일 제한효소로 절단된 pHEKA vector에 cloning하였다. 상기 방법으로 완성된 IDB0062 서열을 포함하는 pHEKA vector는 SUPEX5 strain에 trans format ion하였다. 구체적으로， 1瞧 큐벳에 competent cell ΙΟΟμΙ를 넣고 여 기에 상기 DNA를 3μ1 첨가한 뒤 1800V로 electric shock을 주어 유전자를 도입하 여 생산세포주를 완성하였다. 이와 같이 제작된 IDB0062의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 서열번호 12 및 서열번호 14로 각각 표시하였으며， 이를 인코딩하는 핵산 서열을 서열번호 13 및 서열번호 15로 각각 표시하였다.
<1-3>라니비주맙 개량체 IDB0062의 선별
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 다양한 라니비주맙 개량체 후보 단백질들에 대하여， 뉴로필린 수용체에 대한 친화도와 내피세포 사이의 밀착연접 (tight junction) 와해능을 비교하였다. 먼저 뉴로필린 수용체에 대한 친화도는 NRP Kneuropilin 1)에 대하여 수행 되었다. 구체적으로, TPP의 뉴로필린 1 도메인에 대한 결합력을 확인하기 위하여 Biacore2000(GE Healthcare)을 이용하여 SPR(surface plasmon resonance)을 수행하 였다. 구체적으로， 뉴로필린 1 도메인 각각을 10mM Na-아세테이트 완층액 (pH 4.0) 에 회석하여 CM5 센서칩 (GE Healthcare, USA)에 약 1,000 response units(RU)으로 고정화하였다. HBS-EP 완충액 (lOmM HEPES, 2mM ethylenediaminetetraacet ic acid, and 0.005% surfactant P20, pH 7.4， GE Healthcare)을 30μ 1/min 유속으로 분석하 였으며， VEGF165는 80nM에서 5nM, 세마포린 3A를 luM에서 62·5ηΜ, TPP는 25uM에서 1.5625uM의 농도로 분석하였다. 결합 /해리 분석 후 CM5칩의 재생 (regeneration)은 완충액 (20mM NaOH, 1M NaCl , pH 10.0)을 30μ 1/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행 되었다. 결합 3분， 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램 (sensorgram)은 blank cel l과 비교하여 정상화 (normal izat ion) 및 절감 (subtract ion)하여 친화도를 계산하였다. 또한 상기 내피세포 사이의 밀착연접 와해능은， 상기 단백질들의 VE- cadherin 및 E-cadherin 저해정도를 측정하여 평가하였다. 내피세포에서 VE- cadherin 및 E-cadherin의 발현이 저해되면 내피세포 사이의 밀착면접 (t ight junct ion)이 꽈해되는 것으로 알려져 있으며， 이를 통해 약물의 안구 내 투여시 맥 탁막 조직으로의 전달력 (또는 조직투과력)이 높아진다. 구체적으로, TPP의 혈관 투 과성 증진을 간접적으로 확인할 수 있는 실험방법으로， 웨스턴 블롯을 통한 VE- cadherin의 변화를 확인하였다. 구체적으로， 혈관 투과성 증진은 6-wel l 플레이트 에 HUVEC 세포를 웰 당 3X 105개로 시딩. (seeding)한 후 24시간 배양한 뒤 TPP를 luM 로 10분간 처리하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. SDS_PAGE를 수행한 겔은 PVDF 막에 옮기고 VE-cadherin 및 β -act in을 인지하는 1차 항체 (SantaCruz)와 HRP가 결합된 2차 항체 (SantaCurz)를 이용하여 검 하였으며， 분석은 ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare)를 이용하였다. 실험 결과， 하기 표 4에서 보이는 바와 같이 TPP#2가융합된 Fc(Fc-TPP#2)가 뉴로필린 수용체 (NRP 1)와 높은 수준 (Sema3A l igand와 유사한 수준)으로 결합함을 확인하였으며， VE-cadherin을 현저히 억제함을 나타내었다. TPP#5가 융합된 Fc(Fc- TPP#5)의 경우에는 NRP 1과의 결합력은 Sema3A보다 높았으며 VE-cadherin에 대한 쩌해 효과도 더욱 뛰어난 것으로 나타났다. IDB0062 역시 뉴로필린 수용체 (NRP 1) 와 높은 수준으로 결합하는 것을 확인했으며， VE-cadherin 저해 정도 역시 Fc- TPP#2와 유사하게 저해되는 것으로 확인된다.
【표 4]
ΤΡΡ 선
Figure imgf000029_0001
<l-4> 라니비주맙 개량체 IDB0062의 생산성 확인
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 IDB0062의 생산성을 확인하였다. 그 결과， 상기 표 1에서 보이는 바와 같이， IDB0061에 TPP#2를 융합한 IDB0062 역시 라니비주맙 대비 5배 가량 높은 생산성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 흡착컬럼을 이용한 1차 정제물에 대한 순도를 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 실험은 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 흡착컬럼을 이용해 1차 정제 한 정제물은 amicon(Mi l ipore, 10K)을 이용해 농축한 후 formulat ion buf fer (10mM hist idine, 0.1% tween20, 10% trehalose)로 교환하여 최종 농도가 0.5mg/tnl이 되 도록 희석하였다. 분석기기는 Waters Al l iance e2695를 사용하였으며 column은 BioSui te 250 UHR SEC(4.6x300隱， 4um, Waters)을 사용하였고 이동상은 20mM potassium phosphate buffer (250mM KC1 , pH 6.2)를 이용하였다. 분석'방법은 상기 농축 시료를 20 μ 1 inject ion하여 0.35ml/min 유속으로 20분 동안 분석하였고 단백 질 peak는 UV 280nm 파장에서 분석하였다. 실험 결과， 라니비주맙은 세 개의 주요 성분이 흔합되어 있고 이 중 3번째 성분만이 활성 성분임에 반해 IDB0062는 단일한 형태로 생산됨을 확인하였다 (도 2) .
<1-5> 라니비주맙 개량체 IDB0064의 제작과 생산성의 확인
라니비주맙 개량체 IDB0062에 이어， 실시예 <1-3>에서 VE-cadherin 저해 효 과가 확인된 TPP#5가 링커에 의해 연결되어 융합된 라니비주맙 개량체 IDB0064를 제작하고 생산성올 확인하였다.
IDB0064의 구체적인 제작 과정은 다음과 같다. IDB0061에 새로운 ΤΡΡ인 ΤΡΡ#5를 결합시키기 위하여 유전자 클로닝을 수행하였다. IDB0062를 주형으로 C-말 단의 ΤΡΡ를 ΤΡΡ#2에서 ΤΡΡ#5로 교체하기 위해 특정 primer (서열번호 40, 41， 42)를 이용하였는데， TPP#2와 ΤΡΡ#5가 공유하는 앞부분 서열에 anneal ing region을 잡고 그 뒤로 TPP#5의 서열을 연장하여 primer를 제작하였고 이를 이용해 클로닝을 진행 하였다. PCR은 denaturat ion(95°C , 40sec) , anneal ing( 65 °C , 40sec) , extent ion(72 °C , lmin)의 순서로 30 사이클을 수행하여 Fab 경쇄 ( l ight chain)-TPP#5와 Fab 중 쇄 (heavy chain)-TPP#5의 유전자를 얻었다. PCR산물 중 경쇄 부분은 BamHI과 Xhol 을， 중쇄 부분은 EcoRI과 Hindl l l를 처리한 후 pHEKA vector에 l igat ion하여 삽입 하고 생산세포주인 SUPEX5에 trans format ion하였다. 이와 같이 제작된 IDB0064의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 서열번호 16 및 서열번호 18로 각각 표시하였으며， 이를 인코딩하는 핵산 서열을 서열번호 17 및 서열번호 19로 각각 표시하였다. 상기 제작된 IDB0064의 생산세포주의 생산성을 확인하였다. IDB0064 생산세 포주를 2 X YT mediaC lOOmM potassium phosphate buffer , H 7.2 , 50 u g/ml kanamycin) 50ml에 1%(ν/ν) 접종하여 28°C에서 220rpm으로 18시간 배양하여 전배양 을 진행하였다. 2 X YT media를 1L baff led f lask에 180ml씩 넣고 멸균한 본배양 배지에 미리 제균한 1M potassium phosphate (pH 6.4) 20ml과 50 y g/ml kanamycin을 첨가한 뒤 0D6∞이 약 0.15가 되도록 전배양액을 접종한다. 이후 28°C , 220rpm에서
0D600이 0.5-0.7 사이가 될 때까지 배양한 뒤 0.05mM IPTG를 첨가하고 온도를 20°C 로 낮춰 발현을 유도한다. 발현 유도 21시간 후 배양액은 원심분리를 통해 상등여 액을 회수하고 depth f i lter와 membrane steri le f i lter를 이용해 여과한 뒤 protein L column에 loading하여' 목적 단백질을 정제하였다. 정제 결과， 표 2와 도 3에서 보이는 바와 같이， 인위적인 염기서열로 제작한 TPP#5 sequence를 IDB0061Fab에 연결시켰을 때에도 발현이 잘 유도되어 1차 정제만으로 비교적 순도 높은 목적 단백질을 약 3~½g/L의 생산성으로 얻을 수 있음을 확인하였다.
<실시예 2>
라니비주맙 개량체 IDB0062의 2가 (bivalent ) 특성 확인
라니비주맙 개량체 IDB0062의 VEGF-A 및 뉴로필린 1 수용체에 대한 결합력 을 확인하였다.
<2-1>뉴로필린 1 수용체에 대한 결합력 SPR(Biacore2000) assay
IDB0062와 IDB0072의 NRP1에 대한 결합능을 확인하기 위하여 SPR assay를 실 시하였다. EDC/NHS mixture로 Biacore CM5 chip을 활성화시킨 후 타겟 단백질인 NRP1을 고정화버퍼 (10mM sodium acetate, pH5.5)에 회석하여 Rmax :200으로 계산하 여 최종 79Ru로 고정하였다. 그 후 IDB0062, IDB0072 시료를 12.5nM~400nM까지 HBSEP buffer에 회석하여 분석을 수행하였다. 분석 유속은 30 μ 1/min으로 수행하였 고 결과 그래프를 토대로 센서그램을 얻어 Kd값을 산출하였다. 표 4에서 보이는 바와 같이， 뉴로필린 1 수용체에 대한 IDB0062의 결합력은 대조약물 (Fc-TPP#2)과 유사한 결합활성을 유지함 ί확인하였다. 이는 라니비주맙의 C-말단에 융합된 ΤΡΡ#2 펩타이드가뉴로필린 1수용체에 잘 결합함을 의미한다.
<2-2>뉴로필린 1수용체에 대한 결합력 ELISA assay
EL ISA plate(SPL, Immuno late Maxi binding)에 NRP1 (자체 생산)을 carbonate coating buffer(0.1M NaHC03, pH 9.6)에 희석하여 10yg/ml의 최종 농도 로 만들어 웰당 ΙΟΟμΙ씩 넣고 37°C에서 2시간 코팅하였다. 이후 plate를 3회 세척 한 뒤 37°C에서 1시간 동안 blocking(4% smim milk, pH 7.4)을 진행하고 3회 세척 후 각각의 시료를 적절 배수로 희석하여 웰당 ΙΟΟμΙ씩 처리하여 37°C에서 1시간 반응시켰다. 시료 반웅이 종료되면 plate를 3회 세척한 뒤 Goat ant i -human kappa light chain Ab-HRP( Sigma Aldrich, A7l64)를 blocking buffer에 5,000배 회석하여 웰당 ΙΟΟμΙ씩 처리하고 37°C에서 1시간 반응시켰다. Plate를 5회 세척 후 TMB substrateCBethyl, E102)를 웰당 ΙΟΟμΙ씩 처리하고 2~3분 반응 후 stop solutionClN HC1)를 웰당 ΙΟΟμΙ 처리하여 반웅을 종료하고 ELISA plate reader를 이용하여 450nm에서 값을 측정하였다.
ELISA assay에서도 뉴로필린 1 수용체에 대한 IDB0062의 결합력은 대조약물 (Fc-TPP#2)과 동등 정도임을 확인하였다 (도 4B). 따라서 TPP#2 펩타이드는 라니비 주맙의 C-말단에 융합되었을 때 그 특성이 유지됨을 재확인하였다.
<2-3> VEGF에 대한 결합력 ELISA assay
ELISA plate(SPL, Immunoplate Maxi binding)에 VEGF(R&D system, 293-VE- 500/CF)을 carbonate coating buffer(0.1M NaHC03, pH 9.6)에 희석하여 최종 3μ g/ml의 농도로 만들어 웰당 ΙΟΟμΙ씩 넣고 37°C에서 2시간 코팅하였다. 이후 plate 를 3회 세척한 뒤 37°C에서 1시간 동안 blocking(4% smim milk, pH 7.4)을 진행하 고 3회 세척 후 각각의 시료를 적절 배수로 희석하여 웰당 ΙΟΟμΙ씩 처리하여 37°C 에서 1시간 반웅시킨다. 시료 반응이 종료되면 plate를 3회 세척한 뒤 Goat anti- human kappa light chain Ab-HRP(Sigraa Aldrich, A7164)를 blocking buffer에 5, 000배 희석하여 웰당 ΙΟΟ μ Ι씩 처리하고 37°C에서 30분간 반응시켰다. Plate를 7 회 세척 후 TMB substrate(Bethyl , E102)를 웰당 ΙΟΟ μ Ι씩 처리하고 2~3분 반응 후 stop solut ionClN HC1 )를 웰당 ΙΟΟ μ Ι 처리하여 반웅을 종료하고 ELISA plate reader를 이용하여 450nm에서 값을 측정하였다. 도 4A에서 보이는 바와 같이 , IDB0062의 ELISA assay를 통해 VEGF-A 결합력 이 라니비주맙에 비해 다소 떨어짐을 확인하였으며， 이는 특정 아미노산의 서열 변 경에 의해 IDB0062의 3차 구조가 변화되면서 VEGF-A가 결합하는 CDRCComp 1 ement ary-Det erm i n i ng Region)이 부분적으로 변화되었기 때문으로 예상되 었다. 하지만 라니비주맙의 결합력은 일반적인 항체에 비해 상당히 높으므로, 이 정도의 결합력 약화가 실질적인 임상적 효능 저하를 가져오지는 않을 것으로 판단 된다.
<실시예 3>
라니비주맙 개량체 IDB0062의 안정성 평가
IDB0062의 특정 아미노산 서열이 변경됨으로써 구조적 변형올 일으켜 VEGF-A 결합력이 라니비주맙에 비해 다소 감소하는 결과를 확인하였으므로， 이러한 변경이 IDB0062의 안정성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 보관 조건별, 반 복 냉 /해동 안정성 분석을 실시하였다.
1차 정제된 정제물을 formulat ion buffer로 변경한 후 동물실험에서 사용하 는 농도 (5mg/ml )로 농축한 뒤 안정성 실험을 진행하였다. 보관 조건별 안정성 실험 은 상기 시료를 ΙΟ μ Ι씩 분주하여 4°C , -80°C에서 5주 동안 보관하면서 1주일 단위 로 꺼내 ice에서 해동시킨 후 VEGF binidng ELISA assay를 통해 분석하였으며, 반 복 넁 /해동 안정성은 상기 시료를 -80°C에서 얼리고 ice에서 해동하기를 5회 반복 하면서 일부 시료를 취해 VEGF binding ELISA assay통해 평가하였다. 그 결과, 도 5에서 보이는 바와 같이， IDB0062는 4°C와 -80°C에서 보관 5주 까지 VEGF-A 결합능이 안정적으로 유지되었으며， 5회 반복 냉 /해동을 통한 물리적 충격을 가해도 활성에는 영향을 미치지 않아 아미노산 서열 변경에 따른 물질의 안 정성 약화는 없을 것으로 판단되었다. <실시예 4>
Ant i-VEGF 제제 개량체의 안구 조직 투과도 평가
라니비주맙 개량체의 안구투과도를 분석하기 위해 ex-vivo ocular penetrat ion 모델을 구축하여 그 효능을 평가하였다. 이와 더불어， 조직투과성 펩 타이드의 융합에 의한 조직투과도 개선 여부를 분자량이 크고 3차 구조가 더 복잡 한 항체 (Fc 융합단백질 포함)에서 평가하기 위해 베바시주맙과 그의 개량체 IDB0072에 대한 안구투과도 분석을 동시에 진행하였다.
<4-1> 라니비주맙 개량체 IDB0062의 조직투과도 평가
IDB0062의 C-말단에 융합된 TPP가 안구 내피세포에 많이 분포하는 뉴로필린 수용체와의 결합을 통해 실제로 조직 투과도를 개선시킬 수 있는 지를 확인하기 위 하여， 적출한 안구를 FITC conjugat ion된 라니비주맙 및 IDB0062 용액에 담근 후 시간별 투과도 정도를 비교하였다. 단백질과 FITC의 conjugat ion 효율을 높이기 위해 단백질 시료를 lOOmM sodium carbonate buffer ( H 9.0)로 교환한 뒤 lmg/ml로 농도를 보정한 후 FITC(lmg/ml in DMS0)와 섞어 상온에서 2시간 반응하였다. TPP#2 펩타이드에는 FTTC가 결합할 수 있는 free amine group이 많기 때문에 단백질당 FITC의 반웅 몰 수를 달리 적용하여 반응시켰다. 이후 PD-10 desalt ing column을 이용해 conjugat ion 되지 않은 FITC를 제거하면서 PBS로 buffer change한 후 정제물을 정 량하여 효능 평가용 시료로 사용하였다. Conjugat ion 결과， 라니비주맙와 IDB0062 의 F/P rat io는 1.127과 1.133으로 단백질 한 분자당 거의 동일한 몰수의 FTTC가 결합되어 있음을 확인하였다. FITC가 conjugat ion된 라니비주맙과 IDB0062 용액을 PBS를 이용해 0.3mg/ml로 희석한 후 C57BL/6 마우스 안구를 적출하여 37°C에서 1시 간， 2시간 동안 담근 뒤 PBS로 10분씩 2회 세척한 후 파라핀 슬라이드를 제작하였 다. Davidson' s solut ion (빙초산:에틸알코올:중화포르말린:증류수 =1 :3 :2 :3)을 이용 해 안구를 4°C에서 4시간 동안 고정한 후 결막 앞쪽 부위 조직을 가위로 일부 절단 하여 파라핀 슬라이드 제작 단계에서 망막조직의 변형을 최소화하였다. 이후 10%(v/v) formal in solut ion을 이용해 4°C에서 overnight 고정 작업을 거친 후 자 동침투기를 이용하여 알코올을 저농도에서 고농도로 높여 조직 내 수분을 제거하고 xylene으로 투명과정을 거친 후 파라핀 침투를 진행하였다. 파라핀 침투가 완료된 조직은 base mold에 넣어 파라핀 블록을 만들었고 박절기를 이용하여 4¾ 절편을 만들었다. 파라핀 절편은 부유항온수조에서 펼처 미리 알부민, poly-L-lycine , sal ine을 코팅한 슬라이드에 부착하였다. 조직 슬라이드는 탈파라핀 과정을 거친 후 바로 mount ing하여 공초점현미경으로 FITC를 관찰하여 안구 조직투과성 및 분포 를 확인하였다. 도 8A와 도 8B에서 보이는 바와 같이， IDB0062는 실험 1시간부터 각막과 안 구 후방을 통해 빠르게 안구 안쪽으로 투과되기 시작했으며 2시간에 이르러 대조약 물인 라니비주맙에 비해 안구 조직 및 vitreous 내 분포량이 4배 가량 유의적으로 증가하였음을 확인할 수 있다. DAPI 염색을 통해 안조직을 명확하게 구별하여 분석 할 수 있는데, 라니비주맙과는 달리 IDB0062의 경우 각막 안쪽에도 단백질이 과량 분포하고 있는 것을 확인할 수 있으며 (도 8C, 흰색 화살표) 안구 내 약물 분포도 라니비주맙 대비 약 10배 가량 증가되어 있는 것올 확인할 수 있다 (도 8D) . 도 8E 데이터는 안구의 망막 조직의 단면을 보여주고 있는데， 대조약물인 라니비주맙은 대부분 공막 (sclera)근처에 존재하는 반면， IDB0062는 ret ina pigment epithel ial cel l (RPE) layer를 지나 망막까지 약물이 도달해 있음을 확인할 수 있다. 결론적으 로, 안구 내 조직투과율이 좋지 못한 라니비주맙에 조직투과성 펩타이드를 연결함 으로써 대조약물 대비 안구 투과율을 약 4배 가량 증가시킬 수 있었고， 이를 통해 약물의 투과도 개선을 통한 투여용량 조절 및 투여간격 증대 가능성， 제형 개선을 통한 점안제 개발 가능성을 확인할 수 있다.
<4-2>베바시주맙 개량체 IDB0072의 조직 투과도 평가
항체 단편 (Fab)에 비해 베바시주맙 (bevacizumab)과 같은 전체 항체 (whole ant ibody) 단백질은 분자량도 크고 단백질의 3차 구조도 복잡하여 조직 투과에 불 리한 특성을 갖는다. 그럼에도 불구하고 베바시주맙의 C-말단에 조직투과성 펩타이 드를 융합함으로써 이러한 물리적인 한계를 극복하고 대조약물인 베바시주맙에 비 해 투과도가 개선되는지 여부를 확인하기 위해 동일한 실험을 진행하였다. 베바시주맙 개량체 IDB0072의 제작 과정은 다음과 같다. IDB0072는 베바시주 맙의 C-말단에 TPP를 링커에 의해 융합한 항체융합단백질의 한 형태로서， TPP의 아 미노산 서열은 상기 표 3에 나타낸 바와 같다. 표 3의 서열목톡 중， 서열번호 1 내 지 4의 아미노산 서열을 갖는 TPP는 뉴로필린 1 및 2에 모두 결합이 가능하며， 서 열반호 5 내지 7의 아미노산 서열을 갖는 TPP는 뉴로필린 1에만 특이적으로 결합이 가능하다. 한편， 상기 표 3에 나타낸 TPP중 TPP#2는 뉴로필린의 intr insic l igand 인 VEGF165 및 세마포린 3계열 리간드들의 C—말단 부위를 변형한 것이고 TPP#5는 뉴 로필린 1의 blb2 도메인에 선택적으로 결합하는 클론으로부터 도출된 인공 펩타이드 를 분리 동정한 것으로서， 이 중 TPP#2를 링커를 이용해 베바시주맙과 융합하여 뉴 로필린 수용체에 bivalent로 작용할 수 있도록 함으로써 VEGF와 Sema3A 리간드와 비슷한 친화력을 갖으면서도 조직투과성을 갖는 IDB0072를 design하였다. 구체적으로， 베바시주맙의 C-말단에 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖 는 TPP#2가 융합된 IDB0072를 생산하는 세포주를 제작하였다. pCDNA3.4 백터에 IDB0072를 클로닝하였다. IDB0072의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 20 및 서열번호 22로 각각 기재하였으며， 이를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 21 및 서열번호 23에 각각 기재된 바와 같다. CHO DG44 세포에 상기 구축된 항체 중쇄불 변부위와 NRP1에 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드와
TM
경쇄사슬 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 Neon eletroporesis를 이용하여 트랜 스펙션 (transfect ion)시킨 후, T25 f lask에 3>〈1()6 cel ls로 접종한 후 37°C에서 배 양하였다. 선별 마커를 이용하여 stable cel l을 확보한 뒤 바이오리액터에서 무혈 청 SFM4CH0 (Hyclone)를 이용하여 부유상태로 7일간 lOOrpm, 37 °C , pH 7.2, 50% D02 조건에서 배양하였다. 상등액은 원심분리를 이용하여 세포와 분리하고 0.22많 필터 를 이용하여 제균하였다.
IDB0072의 배양액을 회수하여 표준 프로토콜을 참조하여 각각의 단백질을 정 제하였다. 단백질 A 컬럼 (MabselectSure resin, GE heal thcare)에 배양액을 적용하 고 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1M 글라이신 완층액을 이용하여 pH 3.0에서 항체 를 용리한 후 1 M Tris 완층액을 이용하여 샘폴을 pH 7.0으로 중화하였다. 용리한 항체 분획은 MILLIPORE Ami con Ultra(30 丽 CO)원심분리 농축기를 사용하여 농축하 고 PBS(pH 7.4) 완층액으로 교환하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1 에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 보정된 280nm 파장에서 흡광 도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 단백질과 FITC의 conjugat ion 효율을 높이기 위해 베바시주맙과 IDB0072를 lOOmM sodium carbonate buffer (pH 9.0)로 교환한 뒤 3mg/ml로 농도를 보정한 후 FITC(lmg/ml in DMSO)와 섞어 상온에서 2시간 반웅하였다. IDB0072는 TPP#2 융합에 의한 conjugat ion 차이를 즐이기 위해 단백질당 FITC의 반응 몰수를 대조약물인 베 바시주맙과 달라 적용하여 반응시켰다. 이후 PI)-10 desalt ing column을 이용해 conjugat ion 되지 않은 FITC를 제거하면서 PBS로 buffer change한 후 정제물을 정 량하여 효능 평가용 시료로 사용하였다. Conjugat ion 결과 베바시주맙과 IDB0072의 F/P rat io는 2.18과 1.98으로 단백질 한 분자당 거의 동일한 몰수의 FITC가 결합되 어 있음을 확인하였다. FITC가 conjugat ion된 베바시주맙과 IDB0072 용액을 PBS를 이용해 0.9mg/ml로 희석한 후 C57BL/6 마우스 안구를 적출하여 37°C에서 1시간, 2 시간 동안 담근 뒤 PBS로 10분씩 5회 세척한 후 파라핀 슬라이드를 제작하였다. 이 후 과정은 실시예 <4-1>과 동일하게 진행하였다. 생산된 베바시주맙 개량체 IDB0072의 활성을 평가하기 위하여 뉴로필린 1 수 용체에 대한 결합력올 SPR assay를 통해 확인하였다. 표 5에서 보는 바와 같이 , 뉴 로필린 1 수용체에 대한 IDB0062의 결합력은 대조약물 (Fc-TPP#2) 및 라니비주맙 개 량체 IDB0062와 유사한 결합활성을 나타내었다. 이는 베바시주맙의 C-말단에 융합 된 TPP#2 펩타이드 역시 IDB0062처럼 뉴로필린 1 수용체에 잘 결합함올 의미한다.
【표 5】
ipp mpi찰€ ¾가
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도 9A에서 보이는 바와 같이, IDB0072 역시 대조약물인 베바시주맙에 비해 안구 투과능을 개선한다는 사실을 확인할 수 있었다. 1시간과 2시간에서 IDB0072는 베바시주맙에 비해 유의적으로 약 1.5배가량 안구 내 분포를 증가시키는 결과를 확 인할 수 있다 (도 9B) . 또한 큰 분자량과 구조를 지님에도 불구하고 베바시주맙에 비해 IDB0072는 결막을 통해 각막으로 확산되어 분포하는 것도 확인할 수 있었다. 이로써 분자량이 크고 구조가 복잡한 항체에서도 Fc C-말단에 조직투과성 펩타이드 를 연결함으로써 조직 투과도를 유의적으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 항체 단백질을 포함해 다양한 Fc 융합단백질에도 조직투과성 펩타이 드를 연결함으로써 안구 조직 투과도를 개선할 수 있다는 가능성을 보여준다.
<실시예 5>
각막 신생혐관 모템을 이용하 라니비주맙 개량체의 효능 평가
IDB0062의 효능 평가를 위해 각막 신생혈관 모델을 구축하였고 예방 모델과 내성 모델로 나누어 혈관 신생 억제 여부와 신생된 혈관을 감소시키는 효능을 라니 비주맙과 비교하였다.
<5-1> 예방 모델
IDB0062와 라니비주맙의 신생혈관 저해효과를 비교하기 위해 알칼리 화상으 로 유도한 각막 신생혈관 모델을 다음과 같이 제작하였다. 샐를로오스 필터페이퍼 를 직경 2睡 원으로 잘라 준비한 후 1M NaOH 용액에 담가두었다. 마우스는 6주령 암컷 C57BL/6를 사용하였으며 마취 (Zolet i l 40mg/kg+Rompun 5mg/kg, IP) 후 좌안 각막에 NaOH 필터페이퍼를 올려 30초 동안 알칼리 화상을 유도한 후 40ml PBS로 층 분히 세척하여 각막신생혈관 동물 모델을 구축하였다. 예방 모델의 경우 알칼리 화 상을 유도한 당일부터 약물을 처리하였는데, 각 약물은 5mg/ml의 농도로 1회 5 μ 1 씩 하루 4회 점안 투여를 진행하였으며 총 5일 동안 투여를 진행하였다. 투여가 종 료된 후 안구를 적출한 뒤 4% 파라포름알데히드 용액에 한 시간 담가두어 고정하였 고， PBS로 세척한 후 해부현미경을 이용해 각막을 분리하였다. 분리된 각막은 다시 4% 파라포름알데히드 용액에 12시간 추가 고정하였다. 고정된 각막은 PBS로 세척한 후 상온에서 blocking buf fer (PBS, 0.3% BSA, 0. 1% Tr i ton X100)로 2시간 동안 반 응시킨다. 혈관 내피세포 마커인 PECAM-KCD31)에 특이적인 1차 항체 (BD pharmingen)와 per i cyte 마커인 NG-2에 특이적인 1차 항체 (Mi 1 1 ipore)를 넁장에서 overnight 반웅시키고 2차 형광 항체 (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, Li fe Technologies)는 상온에서 4시간 반응하여 조직을 염색하였다. 염색 과정이 종료된 각막은 슬라이드에 옮긴 후， 해부현미경을 이용하여 각막의 중심부를 향해 네 방향 으로 절개선을 넣어 mount ing하였다. Mount ing이 완료된 각막 슬라이드는 형광현미 경 /공초점현미경을 이용하여 혈관과 per i cyte의 양상을 확인하였다. 예방 모델 실험 결과， 도 6에서 보이는 바와 같이 IDB0062는 라니비주맙 대 비 25-30% 정도 더 신생혈관을 저해하여 vehicle 대비 50% 이상의 유의적인 예방효 과를 나타냈으며， IDB0061도 라니비주맙과 동등한 효능을 나타내어 라니비주맙 구 조변화에 따른 VEGF 결합력 저하가 실제 신생혈관 억제 효능에 영향을 미치지 않으 면서 C-말단에 융합된 TPP에 의한 -효능 증대가 가능함을 확인하였다.
<5-2> 내성 모델
내성 모델은 예방 모델과 동일한 방법으로 알칼리 화상을 유도하였고 각막 신생혈관이 충분히 올라올 수 있도록 10일 동안 방치하였다. 투여 농도와 주기는 예방 모델과 동일하며 투여는 알칼리 화상 10일 후부터 10일 동안 진행하여 생성된 신생혈관을 감소시키는 정도를 라니비주맙과 비교하였다 (이후 각막 슬라이드를 제 작하는 과정은 예방 모델과 동일함) . 도 7A에서 보이는 바와 같이， vehicle과 라니비주맙 처리군에서는 각막까지 혈관이 발달해 있지만 IDB0062 처리군은 혈관이 안구 바깥쪽 ( l imbus)에만 국소적으 로 분포하여 신생혈관이 줄어들었음을 확인하였다. 결과적으로 IDB0062는 vehicle 대비 30% 이상의 유의적인 신생혈관 감소 효능을 나타내었고 유의적 효능을 나타내 지 못한 라니비주맙 대비 2배 이상 효능이 증가되었으며 (도 7B) , 이러한 결과는 ant i -VEGF aptamer와 ant i-PDGF ant ibody 제제를 병용투여한 문헌의 결과와 유사하 다 (Jo et al . , 2006. Am . J . Pathol . ) . 따라서 본 발명의 IDB0062는 라니비주맙 투 약 환자 중 시력 개선 없이 유지만 되는 약 70%의 환자들에서 시력개선 가능성이 있는 것으로 예측되었다. 또한 도 7C에서 보이는 바와 같이， IDB0062 처리군에서는 vehi cle 처리군과 비교하여 유의적으로 40%에 가까운 per i cyte coverage 감소를 확인할 수 있었으며， 이는 기존 약물에 내성을 나타내는 환자를 치료하기 위한 목적으로 병용투여제제로 개발 중인 PDGF 저해제와 유사한 결과이다. 따라서 IDB0062는 ant i -VEGF 저해제 투여 환자의 45%에서 발생하는 것으로 알려진 내성 치료용 단일요법제로 사용 가능 할 것으로 예상되었다.
<실시예 6>
맥락막 ^생 험관 모템을 이용하 라니비주맙 7fl량체의 효능 평가
황반 변성 (age-rel ated macular degenerat ion)의 모델인 맥락막 신생 혈관 (choroidal neovascular i zat ion, CNV)은 laser- induced choroidal neovascularization 방법으로 유도하고 라니비주맙 개량체 IDB0062의 치료 효과를 확인하였다.
7주령 male Brown Norway(BN) rat SLC Japan, Tokyo, Japan)을 1주일동안 순 화시킨 후, pentobarbital sodium (한림제약， 25mg/kg)을 복강 주사하여 마취하였 다. 이후 1 ) tropicamide eye drop으로 동공을 확장시킨 후, diode laser (파장， 532nm; 지름， ΙΟΟμπι; 파워， 150mW; 기간， O.lsec)를 이용하여 optic nerve head 주위로 6군데 광응고(1)1101：0(03 131^011) spot을 만들었다. Bruch' s membrane의 파 괴는 특징적인 bubble의 형성으로 검증하였다. bubble이 형성되지 않거나， 출혈이 발생한 안구는 이후 실험에서 제외하였다. 광웅고 처리 후 rat들은 표 6에 기재된 바와 같이 무작위로 군당 10마리씩 5군으로 나누었다. 약물은 hamilton syringeChamilton, USA)를 이용하여 각 그룹에 맞는 농도를 안구내 투여하였다. CNV 그룹에는 동량의 vehicle을 투여하였으며, 대조약물로는 라니비주맙 100 μ g/eye를 투여하였다. 약물투여로 인한 외과적민 손상이 발생한 개체나， 수정체 흔 탁등이 발생한 개체는 이후 실험 과정에서 제외하였다.
【표 6]
팩 짝신행혈관 ji« (ano실¾군
Figure imgf000040_0001
약물 투여 10일 후, choroidal neovascularizat ion이 발생한 정도를 평가하 였다. 랫의 안구를 적출하여 현미경 하에서 cornea와 sclea 인접 부위에서 안구를 절개한 후 안구의 뒷부분 조직을 이용하여 retina 떼어낸 후 subretina 부위가 포 함된 결막 조직을 분리하였다. 분리한 조직은 4% paraformaldehyde에 1시간 고정 후， PBS로 세척하여 5% Triton X-100 과 1% BSA를 포함한 PBS에 3시간 동안 교반하 였다. 다시 세척 후 PBS에 lmg/ml로 녹인 endothelial cell marker인 isolectin B4(sigma)를 1:50으로 회석하여 4°C에서 overnight 반응시켰다. 0.05% Tween20이 포함된 PBS로 2시간 동안 세척한 후 streptavidin TRITC를 1:500으로 회석하여 37 °C에서 4시간 반웅시킨 후 PBS로 30분 세척하여 형광형미경 (BX51 , Olympus , Japan) 하에서 관찰하였다. Subret ina neovasculari zat ion 부위의 크기는 Image J software(NIH, USA)를 이용하여 분석하였다. 도 10A에서 보이는 바와 같이， vehicle군은 레이저로 상처를 준 부위 안쪽 ( 맥락막)에서 바깥쪽 (망막)으로 검은색으로 표지된 신생혈관이 많이 뻗어 나오는 것 을 확인할 수 있다. 대조약물인 라니비주맙을 100 투여한 군에서는 vehicle군에 비해 신생혈관의 형성이 다소 억제되어 있는 경향을 보이지만 일부 개체에서는 여 전히 뻗어 나오는 혈관이 관찰되고 있다. 반면 IDB0062의 경우， 농도의존적으로 신 생혈관의 형성을 억제하는 경향을 확인할 수 있다. IDB0062 50 y g 투여군에서 대조 약물인 라니비주맙 lOO u g 투여군과 비슷한 정도의 신생혈관 억제효능을 확인할 수 있으며 IDB0062 100 p g 투여군에서는 망막에 l aser에 의한 상흔만 남아있을 뿐 신 생혈관은 대부분 억제되어 있는 것을 확인할 수 있다. 도 10B에서 같이 상기 결과 를 수치화하면， 라니비주맙 100 u g 투여군과 IDB0062 50 u g 투여군에서는 vehicle 군과 비교하여 혈관형성을 약 31%가량 억제되었으며, IDB0062 100 u g 투여군에서는 혈관형성이 약 36% 억제된 것으로 확인되었다. 결과적으로， IDB0062는 라니비주맙 대비 절반 용량으로 라니비주맙와 동일한 신생혈관 억제효능을 나타낸다는 사실을 확인하였다.
<실시예 7>
산소유도 망막병증 모템을 이용한 라니비주맙 개량체의 효능 평가
미숙아 망막병증 (ret inopathy of prematurity)의 모델로 산소유도 망막병증
(oxygen- induced ret inopathy, 0IR)을 발하고 라니비주맙 개량체 IDB0062의 효과 를 확인하였다.
실험 동물은 코아텍에서 구입한 7-8주령 C57BL/6를 교배시켜 태어난 mouse를 사용하였다. 생후 7일째에 mouse(postnatal day 7, P7)를 oxygen chamber에 넣고 5 일 동안 (P7-P11) chamber 내 산소 농도가 75%(hyperoxia)가 유지되도록 조절하였 다. 실험실 내의 조명은 12시간 간격으로 등화 되도록 하였으며， 온도는 24±2°C를 유지하였고 사료와 음용수는 자유 급식하였다. 5일 후 chamber 밖 실내 대기 (normoxia)에서 5일간 (Ρ12_ΡΓ7) 노출시켜 ret inal angiogenesis를 유도하였다. 약 물 투여를 위해 P12일에 normoxia에 노출시킨 직후 무작위로 표 7에 기재된 바와 같이 군당 10마리씩 5군으로 나누었다. 약물은 hami lton syringe(Hami l ton, USA)를 이용하여 각 그룹에 맞는 농도를 안구 내 투여하였다. 0IR 그룹에는 동량의 vehicle을 투여하였으며， 대조약물로는 라니비주맙 10 u g/eye를 투여하였다. 약물 투여로 인한 외과적인 손상이 발생한 개체나， 수정체 흔탁 등이 발생한 개체는 이 후 실험 과정에서는 제외하였다.
【표 7]
산소유도망막병증 (OIR) ΞΜ실험 3·
Figure imgf000042_0001
생후 17일에 망막 부종의 정도를 평가하였다. pentobarbi tal sodium (한림제 약， 25mg/kg)을 복강 주사하여 마취하였다. 개복 후 심장에 dextran(FD40S-lG, sigma; 50mg/ml in PBS) 10 μ 1 주사한 후 10분 후 안구를 적출하여 4% paraformaldehyde 에 10분간 고정 후 ret ina 분리 후 f lat -mounted 망막 슬라이드 를 제작하여 형광형미경 (BX51 , Olympus , Japan) 하에서 관찰하였다. 혈관 밖으로 유출된 형광의 양은 Image J를 이용하여 형광 intensi ty를 정량분석하였다. 도 11A에서 보이는 바와 같이， 약물을 처리하지 않은 vehicle군에서는 중심 부인 opt ic nerve distc 부위와 망막 바깥쪽 혈관 말단 부위에서 leakage에 의한 형광유출이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 대조약물인 라니비주맙 10 U g 처리군에서는 vehicle군에 비해 혈관 누수를 어느 정도 감소시켜주었지만 혈관 말 단 부위에는 여전히 누수된 혈관에 의한 형광유출이 다소 존재하는 것을 확인할 수 있다. 반면 IDB0062 처리군은 농도의존적으로 혈관의 누수를 억제시키는 경향을 보 이며 라니비주맙과 동일용량인 10 y g 이상 투여군에서는 통계적으로 유의적이지 않 지만， 라니비주맙 대비 혈관 누수를 보다 더 효과적으로 억제시킬 수 있다는 가능 성을 확인할 수 있었다 (도 11B) . 특히 IDB0062 15 U g 투여군에서는 혈관의 모양이 조밀하고 안정적인 구조를 취하고 있으며， 누수된 부분이 전혀 보이지 않는 특징을 보인다. 또한 망막에서의 혈관 생성 정도를 평가하였다. 분리한 망막을 4% paraformaldehyde에 3시간 고정 후 PBS로 세척하여 5% Triton X-100 과 1% BSA를 포함한 PBS에서 3시간 동안 교반하였다. 다시 세척 후 PBS에 lmg/ml로 녹인 isolectin B4(L2140, sigma)를 1:50으로 회석하여 4°C에서 overnight 반웅시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 2시간 동안 세척한 후 streptavidin TRITC를 1:500 으로 희석하여 37°C에서 4시간 반웅시킨 후， PBS로 30분 세척하여 형광형미경 (BX51, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다.
P7 mouse가 5일 동안 hyperoxia 조건에 있다가 normoxia로 옮겨지면 상대적 인 ischemia 상태에 놓이게 된다. 이 때 망막에서는 과도한 신생혈관이 자라게 되 는데 이 때 형성된 신생혈관의 특징은 망막으로부터 avascular area인 vitreous쪽 으로 혈관이 자라나온다는 점과 누수되기 쉬운 불규칙한 혈관 형태인 tufts라는 특 이적인 구조를 형성한다는 사실이다. 이러한 tufts의 형성은 neovescularization을 정량하는 척도로 사용될 수 있다. 도 12A에서 확인할 수 있듯이, vehicle군에서 염 색된 혈관들은 혈관끼리의 경계가 명확히 구분되고 비교적 가늘고 안정적인 구조의 정상적인 망막 혈관의 특징을 보이고 있는 데 반하여, 대체로 불규칙하고 굵은 혈 관들이 한데 뭉쳐 tufts를 형성하고 있는 신생혈관이 많이 관찰되었다. 대조약물인 라니비주맙 10ug 처리군에서도 vehicle군과 마찬가지로 tufts의 형태를 띠고 있는 신생혈관이 많이 분포하고 있는 것을 확인할 수 있다. 반면 IDB0062의 경우， 농도 의존적으로 신생혈관으로 규정되는 tufts의 분포를 많이 줄여주었는데， 10Ug 이상 투여군에서는 대부분의 혈관 구조가 명확히 구분되며 tufts의 형태 보다는 조밀하 고 단단한 정상 혈관 형태를 확인할 수 있었다. 이를 수치화하여 그래프로 나타내 면 vehicle군， 라니비주맙 10Ug 처리군， IDB0062 5u 투여군에서는 모두 동일한 신생혈관 형성 정도를 보이는데 반해， IDB0062 10 ug 투여군에서는 이들 대비 약 40% 가량 신생혈관을 저해한다는 사실을 확인할 수 있다 (도 12B). 결론적으로 0IR 모델에서 라니비주맙을 처리함으로써 망막 신생혈관 억제효능은 확인할 수 없었지 만 IDB0062는 라니비주맙과 동일 용량에서 0IR로 유도되는 신생혈관의 형성올 유의 적으로 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
〈실시예 8>
안구 내 주사 후 약물의 분포 분석 라니비주맙과 IDB0062를 안구 내 주사했을 때 조직 내 약물 분포를 확인하기 위하여 망막조직으로부터 단백질을 추출하고 western blot assay를 실시하였다. 안구 내 주사 후 4시간， 72시간이 지난 후 '랫의 안구를 적출한 후 망막을 분 리하였다. 분리한 망막은 PBS를 이용해 3회 세척한 후 lys i s buf fer (20mM Tr i s-Cl , 150mM NaCl , ImM EDTA, 0. 1% tr i ton X-100)로 옮겨 homogeni zer를 이용해 조직을 파쇄하였다. 이후 원심분리 ( 14, 000rpm, 4°C， lOmin)를 이용해 상등액을 회수하였고 bradford 정량법을 통해 lysate의 단백질 함량을 측정하였다. Western blot assay 를 위해 12% non-reducing SDS-PAGE gel을 이용하였다. 단백질 시료는 웰당 40 y g 씩 loading하였 : 25mA에서 1시간 동안 running하였다.—이후 PVDF membrane에 transfer한 후 ant i-kappa ant ibody-HRP(sigma, F3761)를 이용하여 단백질을 detect ion하였고 Bio-Rad사의 chemidoc system을 이용하여 각각의 단백질 밴드를 정량하였다. 라니비주맙은 중쇄와 경쇄가 이황화결합에 의해 연결되어 있기 때문에 non- reducing SDS-PAGE 분석에서 약 48kDa 부위에 하나의 밴드로 확인된다. 반면 IDB0062는 중쇄와 경쇄 사이에 이황화결합이 없기 때문에 같은 조건에서 SDS-PAGE 분석을 하게 되면 28kDa 부위에서 두 개의 밴드 (중쇄와 경쇄)로 나뉘어 확인된다. 도 13에서 보이는 바와 같이， 안구 내 주사 4시간 후 망막에 존재하는 약물의 양은 IDB0062가 라니비주맙에 비해 약 3.6배 가량 높은 것을 확인할 수 있다. 이는 IDB00627> TPP에 의해 NRP1을 발현하는 조직에 특이적으로 결합한다는 사실을 보여 주는 결과로서， 망막의 신생혈관으로 인한 다양한 질병에 대해 질환부위인 망막 조 직에 타겟팅이 가능할 수 있다는 가능성을 보여준다. 약물을 안구 내 주사했을 때 vi treous 내에 퍼져서 존재할 때 보다 병변조직에 결합하게 되면 VEGF를 제거할 수 있는 기회가 증가하여 더 적은 용량으로 동일한 약효를 발휘할 수 있는 가능성이 있고 이러한 결과는 맥락막 신생혈관 모델과 망막병증 모델을 이용한 효능평가에서 IDB0062의 우월한 효능올 뒷받침하는 결과라고 판단된다.
【산업상 이용가능성】
본 발명의 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내괴세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제 제가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 기존의 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제와 비교하여 혈관 내피세포 성장인자 이외의 신생혈관과 관 련된 다양한 성장인자를 저해할 뿐만 아니라 peri cyte coverage를 감소시켜 효능이 증대되고 약물 내성환자까지 치료할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 안구 내 주사 시 맥락막 조직으로의 약물 전달력이 개선되어 투여용량 감소 또는 투여주기 증대 및 안구 투과도 개선을 통해 점안제로 개발될 가능성이 높다는 점에서 산업상 이용 가능성이 우수하다.

Claims

【청구의 범위]
【청구항 1】
조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합 된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
저 U항에 있어서， 상기 조직투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열올 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제는 라니비 주맙 (ranibizumab) , 베바시주맙 (bevacizuraab)， 아플리버솁트 (af l ibercept )， 컨버솁 트 (Conbercept ) , 이들의 동등생물의약품 (biosimi lar) 및 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 변이체는 중쇄 불변 1 도메인 및 경쇄 불변 도메인의 아미노산인 시스테인은 결실되거나, 시스테인을 제외하고 세린을 포함하는 다른 아 미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 3항에 있어서， 상기 변이체는 서열번호 8로 표시되는 경쇄 및 서열번호 10 으로 표시되는 중쇄로 이루어진 라니비주맙 (ranibizumab) 변이체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 융합단백질은 서열번호 12 또는 서열번호 16으로 표시 되는 아미노산 서열; 및 서열번호 14 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 7] 제 1항에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서 열 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약 학적 조성물.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 융합은 링커 펩타이드에 의한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 9】
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 안질환은 증식 유리체 망막 병증， 황반 변성, 색소성 망막^ , 당뇨병성 망막증， 맥락막 신생혈관， 신생혈관성 녹내장， 허혈성 시신경 장애， 조숙아 망막증， 미숙아 망막증， 유행성 각결막염， 신 생혈관성 홍채질환， 후수정체 섬유증식증， 아토피성 각막염, 상각막윤부 각막염， 위상편 건선 각막염, 플릭텐성 각결막염， 공막염 및 당뇨성 황반 부종으로 이루어 진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
【청구항 10】
(a) 조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합된 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 백터를 숙주세포로 전 환시키는 단계 ;
(b) 상기 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 내성 극복 및 효능이 향상된 항 -혈관 내피세포 성장인자 제제를 생산하는 방법.
【청구항 111
제 10항에 있어서, 상기 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제는 라니 비주맙 (ranibizumab) , 베바시주맙 (bevacizumab)， 아플리버셉트 (af l ibercept ) , 컨버 셉트 (conbercept ) , 이들의 동등생물의약품 (biosimi lar) 및 변이체로 이루어진 군에 서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 12]
제 10항에 있어서， 상기 융합은 링커 펩타이드에 의한 것임을 특징으로 하는 방법
【청구항 13】
조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합 된 융합단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 안질 환 치료 방법.
【청구항 14】
조직투과성 펩타이드와 항 -혈관 내피세포 성장인자 (ant i-VEGF) 제제가 융합 된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 안질환 치료용 제제를 제조하기 위한 용 도.
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