WO2017088081A1 - Gluconobacter cerinus más hanseniaspora osmophila para el control de micosis en plantas y frutos - Google Patents

Gluconobacter cerinus más hanseniaspora osmophila para el control de micosis en plantas y frutos Download PDF

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gluconobacter
hanseniaspora
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Ximena Alejandra BESOAIN CANALES
Fabiola Francisca CADIZ MORALES
Eduardo SALGADO VARAS
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Pontificia Universidad Catolica de Valparaiso
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Definitions

  • grapes are mainly affected by two diseases, cluster rot or acid rot and gray rot, which cause the greatest losses in the crop both in pre and post harvest.
  • the powdery mildew is a disease where the Uncinula necator fungus is able to directly enter the berry and produce microcracks in both leaves and fruits during pre-harvest, and thus allows the entry of other pathogens that only enter through wounds, such as Rhizopus spp., Aspergillus spp. and Penicillium spp., enhancing the disease they cause.
  • Tr ⁇ choderma is one of the most used fungi as a biocontroller of fungal diseases.
  • a number of isolates and various forms of control of different fungal diseases based on this fungus have been patented in the United States and other countries [8-16].
  • Picchia guilliermondii a known yeast with biological control effect, stands out.
  • Picchia has a biocontroller effect on Rhizopus nigr ⁇ cans in tomato fruits in storage.
  • This yeast is able to activate the defense enzymes of the fruit and also competes for the site and nutrients [17].
  • the M8 strain of Picchia guilliermondii was reported as potential biocontroller of Botrytis cinerea in apples under storage conditions and in apple juice. Yeast induces the defense response of the fruit, competes for nitrogen, carbon sources and secretes hydrolytic enzymes [18].
  • the Z1 strain of Picchia guilliermondii is used in citrus fruits mixed with waxes to control blue mold (Penicillium italicum). In orange juice it is able to inhibit the germination of spores. Its mode of action is through competition for nutrients [19].
  • the Picchia caribbica species is able to control Penicillium expansum in apples. However, the oxidative stress tolerance of yeast is improved with the application of ascorbic acid and therefore the effect on Penicilium expansum [20] would be improved.
  • Some acetate esters produced by apples stimulate the germination of conidia of Botrytis cinerea. However, this effect can be suppressed with yeasts such as Cryptococcus laurenthi, Sporobolomyces roseus or Saccharomyces cerevisae, being the first two most effective in suppressing the germination of conidia [21].
  • yeasts such as Cryptococcus laurenthi, Sporobolomyces roseus or Saccharomyces cerevisae, being the first two most effective in suppressing the germination of conidia [21].
  • the butyl acetate produced by apples increases the adhesion of the conidia of Botrytis cinerea, stimulating their germination.
  • Cryptococcus laurenthi and Sporobolomyces roseus can reduce this effect, but not Saccharomyces cerevisiae. This fact reinforces the need for empirical searches of effective biocontroller strains [22].
  • Saccharomyces cerevisiae has been registered in a series of patents as a biological controller for different diseases.
  • a composition and phytosanitary method from said yeast to treat or protect plants from diseases caused by various pathogens [23].
  • yeasts in the biological control correspond to f ⁇ hodotorula and Metschnikowia.
  • a number of species and isolates in formulations have been registered as a method for the control of pre and post harvest diseases, especially blue mold, gray rot, mucor and fruit rot [24].
  • Strains of Metschnikowia species have been registered in patents for the control of fruit decay caused by Penicillium expansum [1].
  • Candida sake CPA-1 plus Fungicover®, Ulocladium oudemansii and chitosan are able to significantly reduce the severity of acid rot, with 40 to 60% inhibition compared to the control.
  • the incidence of the disease was not significantly reduced by any of the treatments [25].
  • Candida saitoana together with a composition of other species of this genus plus enzymes, have been registered as biological control for plant diseases, especially for post-harvest diseases [26].
  • 16 isolates of Saccharomyces and 27 isolates corresponding to yeasts other than Saccharomyces showed antagonistic properties on some of the pathogenic fungi at 25 e C [27].
  • a total of 225 isolates of yeasts from grapes, vineyard soil and grape must were collected to be evaluated on the control of cinematic Botrytis.
  • the 65 isolates corresponded to 15 species that inhibited cinematic Botrytis at 25 e C in vitro conditions. Only one of these isolates, Saccharomyces cerevisiae BSc68, inhibited mycelial growth in grapes at 2 and 25 e C. All isolates determined with antifungal activity came from must in fermentation [28].
  • Bacillus subtillis one of the most studied bacteria as a biocontroller.
  • Bacillus subtillis corresponds to a native strain isolated from soils in central Mexico and has been reported as a biocontroller of Spor ⁇ sorium reilianum in corn in seed treatments [29].
  • biocontroller fungi a series of patents of different Bacillus isolates used for the control of various diseases in plants have been granted [30-39].
  • Pseudomonas Another genre very studied are the Pseudomonas.
  • the CCR04 and CCR80 strains of Pseudomonas corr ⁇ gala have proven very effective in the colonization of pepper roots. In this way they can inhibit infection by Phytophthora capsici in the culture [40].
  • Pseudomonas aeruginosa produces metabolites with antibiotic activity capable of controlling the diseases caused by Xanthomonas spp., So it could be an alternative to the conventional bactericides used for its control [41].
  • Acetic acid bacteria on the other hand, are of special biotechnological interest in the industrial processes involved in the production of cellulose, sorbose and vinegar.
  • the family is known as Acetobacteraceae and has 12 genera [44].
  • the genus Gluconobacter one of the most common among the Acetobactereaceae, includes 14 species of which 5 are used in food manufacturing, mainly because they are harmless to human health [45].
  • These bacteria are strictly aerobic, chemoorganotrophic and Gram-negative. They grow between 4 and 40 e C with an optimum of 30 e C and an optimum pH of 5 to 6 [46]. They live on the surface of vegetables and fruits mainly as saprophytes symbionts.
  • Synthetic fungicides are effective, but they make it difficult to export to more demanding markets due to the potentially harmful effects on animals and plants.
  • Biological fungicides can be harmless and more accepted in different markets, although at present it has been observed that they do not have good levels of efficacy, especially when compared with synthetic fungicides.
  • the need to develop new biological fungicides with improved antifungal activities becomes obvious.
  • numerous antifungal biological control procedures have been developed and patented in several countries, there are currently very few that are used practically in agriculture. This is due, on the one hand, to the high quality requirement and safety of the products required by international markets and, on the other, that the proposed biocontrollers do not achieve the effectiveness required to comply with the trade regulations of the various countries.
  • GAP good agricultural practices
  • the present invention is directed to biological products for the control of plant fungal diseases, compositions comprising them, methods for their preparation and indications for their use.
  • the invention encompasses a biological product for the control of fungal diseases in plants comprising a bacterium of the genus Gluconobacter and a yeast of the genus Hanseniaspora.
  • Gluconobacter may correspond to Gluconobacter cerinus, more preferably Gluconobacter cerinus strain 515 access code RGM2215, deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources.
  • Hanseniaspora may correspond to Hanseniaspora osmophila, more preferably Hanseniaspora osmophila strain 337 access code RGM2214, deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources.
  • the invention also encompasses a method for preparing the biological product for the control of plant fungal diseases, wherein said method comprises mixing at least 1 x10 6 [CFU / ml] of Gluconobacter and at least 1 x10 4 [UFC / ml] of Hanseniaspora, preferably 1 x10 6 [CFU / ml] to 1 x10 8 [CFU / ml] Gluconobacter and 1 x10 4 [CFU / ml] to 1 x10 6 [CFU / ml] Hanseniaspora. Therefore, the biological product for the control of plant fungal diseases comprises at least 1 x10 6 CFU / ml Gluconobacter spp. and at least 1 x10 4 CFU / ml of Hanseniaspora spp.
  • the invention also encompasses a method for the control of plant fungal diseases which comprises administering a biological product comprising a bacterium of the genus Gluconobacter and a yeast of the genus Hanseniaspora to a plant organism.
  • the invention encompasses the use of a biological product comprising a bacterium of the genus Gluconobacter and a yeast of the genus Hanseniaspora, because it serves to treat, prevent, control or cure fungal diseases in plants.
  • diseases that can be treated, prevented, controlled or cured by the use of the product of the present invention include fungal diseases caused by Deuteromycota, including diseases caused by Aspergillus spp., Penicilium spp., Botrytis spp., Among others .
  • the present invention can be used to treat, prevent, control or cure fungal diseases in plants produced by Zygomycota, including f ⁇ hizopus, among others.
  • the product of the invention can be used in fruit plants such as vines, grapefruit, prunus, citrus and berries; fruit vegetables such as tomatoes, paprika, eggplant, Italian squash; and leafy vegetables such as lettuce, chard, spinach.
  • the biological product of the invention can be used to treat, prevent, control or cure acid rot or cluster rot, and gray rot, among other fungal diseases.
  • Figure 1 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with Gluconobacter cerinus (Gc) (strain 515 and 516) and / or Hanseniaspora osmophila (Ho) (strain 336 and 337) is observed. on the development of f ⁇ hizopus pp. in Red Globe cv grape berries. The bars represent the diameter of the lesion generated by the infection of f ⁇ hizopus spp. in grape berries against the different treatments. The figure It shows the effects at 4 (A) and 15 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • Gc Gluconobacter cerinus
  • Ho Hanseniaspora osmophila
  • the concentrations of Gluconobacter cerinus (strain 515 and 516) used are: High Dose (1 x10 8 [CFU / ml]) and Low Dose (1 x10 6 [CFU / ml]).
  • the concentrations of Hanseniaspora osmophila (strain 336 and 337) used are: High Dose (1 x 10 6 [CFU / ml]) and Low Dose (1 x10 4 [CFU / ml]).
  • the concentration used for Hanseniaspora osmophila (strain 336 and 337) in treatments 2 and 3 is High Dose.
  • the concentration used for Gluconobacter cerinus (strain 515 and 516) in treatments 4 and 5, is High Dose.
  • Grape berries were inoculated with 1 x 10 5 [spores / ml] of f ⁇ hizopus spp.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + f ⁇ hizopus spp. (complete injury) and the negative control corresponds to the Water + Water treatment (absence of injury).
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 2 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with Gluconobacter cerinus (Gc) (strain 515 and 516) and / or Hanseniaspora osmophila (Ho) (strain 336 and 337) is observed.
  • Gc Gluconobacter cerinus
  • Ho Hanseniaspora osmophila
  • the bars represent the diameter of the lesion generated by the infection of Botrytis cinerea in grape berries compared to the different treatments.
  • the figure shows the effects at 4 (A) and 15 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • the doses are the same as those described for Figure 1.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + Botrytis cinerea (complete lesion) and the negative control corresponds to the treatment of Water + Water (absence of injury).
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 3 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with Gluconobacter cerinus (Gc) (strain 515 and 516) and / or Hanseniaspora osmophila (Ho) (strain 336 and 337) is observed on the development of Aspergillus spp. in Red Globe cv grape berries.
  • the bars represent the diameter of the lesion generated by the Aspergillus spp. in grape berries against the different treatments.
  • the figure shows the effects at 4 (A) and 15 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • the doses are the same as those described for Figure 1.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + Aspergillus spp.
  • Figure 4 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with Gluconobacter cerinus (Gc) (strain 515 and 516) and / or Hanseniaspora osmophila (Ho) (strain 336 and 337) is observed. on the development of Penicillium spp. in Red Globe cv grape berries. The bars represent the diameter of the lesion generated by the infection of Penicillium spp. in grape berries against the different treatments.
  • Gc Gluconobacter cerinus
  • Ho Hanseniaspora osmophila
  • the figure shows the effects at 4 (A) and 15 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • the doses are the same as those described for Figure 1.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + Penicillium spp. (complete injury) and the negative control corresponds to the Water + Water treatment (absence of injury).
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 5 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with different concentrations (doses) of Gluconobacter cerinus (Gc) strain 515 and Hanseniaspora osmophila (Ho) strain 337 on the development of f ⁇ hizopus spp. in Red Globe cv grape berries.
  • the bars represent the diameter of the lesion generated by the infection of f ⁇ hizopus spp. in grape berries against the different embodiments of the invention.
  • the figure shows the effects at 4 (A) and 20 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • the concentrations of Gluconobacter cerinus (strain 515) used are: High Dose (1 x10 8 [CFU / ml]) and Low Dose (1 x10 6 [CFU / ml]).
  • the concentrations of Hanseniaspora osmophila (strain 337) used are: High Dose (1 x 10 6 [CFU / ml]) and Low Dose (1 x 10 4 [CFU / ml]).
  • Low Dose for Gluconobacter cerinus and Hanseniaspora osmophila were used. The grape berries were inoculated with 1 x10 5 [spores / ml] f ⁇ hizopus spp.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + f ⁇ hizopus spp. (complete injury) and the negative control corresponds to the Water + Water treatment (absence of injury).
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 6 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with different concentrations (doses) of Gluconobacter cerinus (Gc) strain 515 and Hanseniaspora osmophila (Ho) strain 337 on the development of Botrytis cinerea in grape berries cv Red Globe.
  • the bars represent the diameter of the lesion generated by the infection of Botrytis cinerea in grape berries against different modalities of the invention.
  • FIG. 7 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with different concentrations (doses) of Gluconobacter cerinus (Gc) strain 515 and Hanseniaspora osmophila (Ho) strain 337 on the development of Aspergillus spp. in Red Globe cv grape berries.
  • the bars represent the diameter of the lesion generated by the Aspergillus spp. in grape berries against different embodiments of the invention.
  • the figure shows the effects at 4 (A) and 20 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • the doses are the same as those described for Figure 5.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + Aspergillus spp. (complete injury) and the negative control corresponds to the Water + Water treatment (absence of injury).
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 8 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), where the effect of treatment with different concentrations (doses) of Gluconobacter cerinus (Gc) strain 515 and Hanseniaspora osmophila (Ho) strain 337 on the development of Penicillium spp. in Red Globe cv grape berries.
  • the bars represent the diameter of the lesion generated by the infection of Penicillium spp. in grape berries against different embodiments of the invention.
  • the figure shows the effects at 4 (A) and 20 (B) days after infection with the pathogenic fungus.
  • the doses are the same as those described for Figure 5.
  • the positive control corresponds to the treatment of Water + Penicillium spp.
  • Figure 9 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), which compares the effect of the biological product of the invention and a commercial standard treatment on the incidence (A and C) and severity (B and D) of the cluster rot (pathology produced by f ⁇ hizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp., and / or Penicillium spp.) in Red Globe cv table grapes that presented wounds (A and B) or did not present them (C and D) .
  • the commercial standard was Switch ® 62.5 wg which is formulated: Cyprodinyl (37.5% w / w) plus Fludioxynil (25% w / w).
  • the control corresponds to Red Globe cv table grapes without treatment.
  • the letters to the Right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 10 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), which compares the effect of the biological product of the invention and a commercial standard treatment on the incidence (A and C) and severity (B and D) of the Gray rot (pathology produced by Botrytis cinerea) in Red Globe cv table grapes that presented wounds (A and B) or that did not present them (C and D).
  • 10 different clusters were analyzed, each with 10 berries.
  • the bars represent the percentage of grapes with symptoms in the analyzed cluster (A and C) or the diameter of the lesion caused by the infection in the grapes caused by gray rot (B and D). Data were obtained at 5 days post infection, and at a 24 ° C incubation.
  • the doses are the same as those described for Figure 9.
  • the commercial standard was Switch ® 62.5 wg which is formulated: Cyprodinyl (37.5% w / w) plus Fludioxinyl (25% w / w).
  • the control corresponds to Red Globe cv table grapes without treatment.
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 1 1 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), which compares the effect of the biological product of the invention and a commercial standard treatment on the incidence (A and C) and severity (B and D) of cluster rot (pathology produced by f ⁇ hizopus spp., Botrytis cinerea, Aspergillus spp., and / or Penicillium spp.) in Red Globe cv table grapes after a cold shock. Grapes that presented wounds (A and B) and grapes that did not (C and D) were evaluated.
  • the bars represent the percentage of grapes with symptoms in the analyzed cluster (A and C) or the diameter of the lesion caused by the infection in the grapes caused by the rotting of the cluster (B and D). Data were obtained at 5 days post infection, and at an incubation of 0 ° C, followed by 6 days at room temperature. The doses are the same as those described for Figure 9.
  • the commercial standard was Switch ® 62.5 wg which is formulated: Cyprodinyl (37.5% w / w) plus Fludioxinyl (25% w / w).
  • the control corresponds to Red Globe cv table grapes without treatment.
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 12 shows a graph of Treatment v / s Injury diameter (cm), which compares the effect of the biological product of the invention and a commercial standard treatment on the incidence (A and C) and severity (B and D) of the Gray rot (pathology produced by Botrytis cinerea) in Red Globe cv table grapes after a cold shock. Grapes presenting wounds (A and B) and grapes not presenting them (C and D). The bars represent the percentage of grapes with symptoms in the analyzed cluster (A and C) or the diameter of the lesion caused by the infection in the grapes caused by gray rot (B and D). Data were obtained at 5 days post infection, and at an incubation of 0 ° C, followed by 6 days at room temperature.
  • the doses are the same as those described for Figure 9.
  • the commercial standard was Switch ® 62.5 wg which is formulated: Cyprodinyl (37.5% w / w) plus Fludioxinyl (25% w / w).
  • the control corresponds to Red Globe cv table grapes without treatment.
  • the letters to the right of the bars correspond to different categories according to the Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • the present invention relates to a biological product (ie composition) comprising the Gluconobacter bacterium, preferably Gluconobacter cerinus, more preferably Gluconobacter cerinus strain 515 access code RGM2215, deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources, combined with Hanseniaspora yeast, preferably Hanseniaspora osmophila, more preferably Hanseniaspora osmophila strain 337 access code RGM2214, deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources. These microorganisms were isolated from berries from clusters of table grapes, harvested on farms with commercial production destined for export.
  • the Gluconobacter bacteria of the invention has an evident antifungal effect on fungi of various types, including f ⁇ hizopus spp., Botrytis cinerea, Aspergillus spp. and Penicillium spp. More surprisingly, the inventors observed that the addition of Hanseniaspora yeast synergistically enhanced the antifungal effect of Gluconobacter. This effect cannot be inferred from the mere reading of the state of the art since there are no documents that disclose that Hanseniaspora osmophila has antifungal activity, much less that it synergistically enhances the antifungal activity of Gluconobacter.
  • the biological product of the invention ie Gluconobacter + Hanseniaspora
  • the antifungal effect obtained with the biological product of the invention is as much or more effective than the effects obtained with synthetic antifungals, even in conditions of collisions and cold chains, so common in fruit and vegetable packaging for preservation.
  • the biological product The antifungal of the invention is effective and does not have the disadvantages of synthetic antifungal products.
  • the present invention relates to an antifungal product comprising Gluconobacter and Hanseniaspora, which has a surprisingly synergistic and enhanced effect of antifungal activity.
  • it is as much or more effective than synthetic antifungal compounds, but it is a natural product, solving a problem of the technique that has not been satisfactorily resolved at present.
  • the invention relates to a biological product comprising a bacterium of the genus Gluconobacter and a yeast of the genus Hanseniaspora.
  • Gluconobacter spp. can be grown in GYC culture medium (glucose 50 [g / L], yeast extract 10 [g / L], calcium carbonate 30 [g / L], agar 25 [g / L], hydrochloric acid 2 [N ] and distilled water 1 L) at 25 e C.
  • GYC culture medium glucose 50 [g / L], yeast extract 10 [g / L], calcium carbonate 30 [g / L], agar 25 [g / L], hydrochloric acid 2 [N ] and distilled water 1 L
  • MLP culture medium peptone 20 [g / L], honey bees 80 [g / L], agar 20 [g / L], distilled water 1 L
  • Gluconobacter spp. any other form of cultivation suitable for Hanseniaspora spp. It will be useful for the purpose of the present invention.
  • Gluconobacter spp. Preferably Gluconobacter cer ⁇ nus, more preferably Gluconobacter cer ⁇ nus 515 access code RGM2215, deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources, with Hanseniaspora spp., Preferably Hanseniaspora osmophila, more preferably strain 337 access code RGM2214, deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources.
  • the microorganisms should be mixed in a proportion of at least 1 x10 6 [CFU / ml] of Gluconobacter and at least 1 x10 4 [CFU / ml] of Hanseniaspora, preferably 1 x10 6 [CFU / ml] to 1 x10 8 [CFU / ml] of Gluconobacter and 1 x10 4 [CFU / ml] to 1 x10 6 [CFU / ml] of Hanseniaspora.
  • the method of counting viable microorganisms in plaque or some other suitable method for this purpose may be used.
  • the microorganisms of the invention may be suspended in culture medium (as described in the preceding paragraphs) or in any other suitable vehicle, such as physiological serum (0.85% NaCI), phosphate buffer (PBS) ), Water peptonated, water with agar, or sterile water.
  • physiological serum (0.85% NaCI
  • PBS phosphate buffer
  • the microorganisms of the invention may be lyophilized or lyophilized after mixing.
  • the invention comprises a method for the control of fungal diseases in plants which in turn comprises administering the biological product to a plant organism.
  • the biological product of the invention can be carried out directly on the plants, including on the stems, leaves, fruits and shoots.
  • the product of the invention may be added directly onto the farmland, either mixed with irrigated water or by itself.
  • the product of the invention may be added on seeds before being stored or before being planted.
  • any means is suitable, including administrations in liquid vehicles (direct jet, spray spray, mixed with irrigated water) or directly as powder in the case of lyophilized use.
  • the use of gel or foam consistency media to contain the biological product described in the present application is also considered within the scope of the protection of the present invention.
  • the biological product with antifungal properties may be used to treat, prevent, control or cure fungal diseases in plants.
  • the present invention includes the prophylactic use of the product on healthy stems, leaves, fruits and seeds, and even on the land to be cultivated.
  • the use of the product of the invention is included on stems, leaves, fruits and seeds that exhibit any symptoms of disease.
  • the invention encompasses the use of a biological product comprising a bacterium of the genus Gluconobactery a yeast of the genus Hanseniaspora, because it serves to treat, prevent, control or cure fungal diseases in plants.
  • diseases that can be treated, prevented or cured by the use of the product of the present invention include fungal diseases caused by Deuteromycota, including diseases caused by Aspergillus spp., Penicilium spp., Botrytis spp., Among others.
  • the present invention can be used to treat, prevent, control or cure fungal diseases in plants produced by Zygomycota, including f ⁇ hizopus, among others.
  • the product of the invention can be used in fruit plants such as vines, grapefruit, prunus, citrus and berries; fruit vegetables such as tomatoes, paprika, eggplant, Italian squash; and leafy vegetables such as lettuce, chard, spinach.
  • the biological product of the invention can be used to treat, prevent, control or cure acid rot or cluster rot and gray rot, among other fungal diseases.
  • EXAMPLE 1 Preparation of the biological product of the invention and protocols of the biological tests.
  • A.- Preparation of Gluconobacter cerinus (strain 515 and 516) The bacteria were grown in the GYC culture medium (Glucose 50 [g / L], Yeast Extract 10 [g / L], Calcium Carbonate 30 [g / L ], Agar 25 [g / L], Hydrochloric acid 2 [N], complete 1 L with distilled water) for 5 days at 25 e C. Once grown, the bacteria were extracted from the culture medium and diluted in water plus 1% agar and 20% tween to break surface tension, leaving the bacteria at the proper concentration (Table 1). Grape berries were inoculated with 10 ⁇ of the bacterial suspension. As a negative control, 10 ⁇ of water was used instead of Gluconobacter.
  • yeast was grown in the MLP culture medium (Peptone 20 [g / L], Honey bees 80 [g / L], Agar 20 [g / L], complete 1 L with distilled water) for 5 days at 25 ° C. Once grown, the yeast is extracted from the culture medium and diluted in water plus 1% agar and tween 20% to break surface tension, leaving the yeasts at the appropriate concentration (Table 1). Grape berries were inoculated with 10 ⁇ of the yeast suspension. As a negative control, 10 ⁇ of water was used instead of Hanseniaspora.
  • V2 where C1 is initial concentration of the solution; V1 is the initial volume of the solution;
  • C2 is the final concentration of the solution and V2 is the final volume of the solution.
  • Grape berries were inoculated with 10 ⁇ of the microbiological suspension.
  • 10 ⁇ of water was used instead of biological product.
  • Ciprodinyl + fludioxynil corresponds to the commercial product Switc ® 62.5 WG that is formulated: Ciprodinyl 37.5% w / w + Fludioxynil 25% w / w.
  • the dose applied was 10 ⁇ (90 g per 100 L of water).
  • Red Globe cv grape berries were infected with pathogenic fungi according to that indicated in point D, concomitantly with the addition of the antifungal compositions according to points A, B, C or E.
  • the infected berries were incubated for 4 days at 24 and C, and the subsequent days until 15 or 20 days were completed, at room temperature.
  • the infected berries were incubated 5 days at 24 ° C.
  • the infected berries were incubated 5 days at 0 ° C and then 6 days at room temperature.
  • EXAMPLE 2 Gluconobacter spp. and Hanseniaspora spp. have a synergistic antifungal effect against Rhizopus spp., Botrytis cinerea, Aspergillus spp. and Penicillium spp.
  • Rhizopus spp. Fig. 1
  • Botrytis cinerea Fig. 2
  • Penicillium spp. Fig. 4
  • Pathogenic fungi were grown and used to infect Red Globe cv grape berries as explained in Example 1.
  • water negative treatment control
  • Hanseniaspora osmophila alone strain 336 or strain 337
  • Gluconobacter cerinus alone strain 515 or strain 516
  • a combination of Gluconobacter and Hanseniaspora in different concentrations Table 1 ).
  • the antifungal effect was estimated as the diameter of the lesion after 4 days (Fig. 1 A, 2A, 3A, 4A) or after 15 days post infection (Fig. 1 B, 2B, 3B, 4B).
  • the experiment was repeated 3 times (biological replicate) and each time analyzed 5 different berries.
  • the results allowed the categorization of treatments according to statistical analysis (Tukey test p ⁇ 0.05).
  • the biological product of the invention (which comprises Gluconobacter cerinus + Hanseniaspora osmophila) has a clear synergistic enhanced effect in relation to the effect obtained by its individual parts (Fig. 1 A). This is evident in the fact that Hanseniaspora osmophila obviously improves the antifungal properties of Gluconobacter cerinus, even though Hanseniaspora osmophila alone has no antifungal effect against Rhizopus spp. (Fig. 1 A).
  • the product of the invention also has an enhanced antifungal effect against Botrytis cinerea (Fig. 2A), Aspergillus spp. (Fig. 3A) and against Penicillium spp. (Fig. 4A).
  • the enhanced synergistic effect of the biological product of the invention is especially evident for the treatment of Penicillium spp., Where Hanseniaspora osmophila and Gluconobacter cerinus exhibit a weak antifungal effect alone, which is clearly increased and improved when both microorganisms are mixed ( Fig. 4A).
  • the biological product of the invention has a surprising effect, impossible to determine without the empirical data disclosed in the present application.
  • EXAMPLE 3 Different concentrations of Gluconobacter spp. and Hanseniaspora spp. have a synergistic antifungal effect against Rhizopus spp., Botrytis cinerea,
  • Example 2 In order to find out if the antifungal effect produced by the present invention is sustained over time, a challenge was carried out as described in Example 2, but evaluating lesion size after 15 days post infection. As seen in Fig. 1 B, 2B, 3B and 4B, the present invention still maintains its antifungal properties. against Rhizopus spp., Botrytis cinerea, Aspergillus spp. and Penicillium spp. even 15 days after inoculation.
  • EXAMPLE 4 The product of the invention is as much or more effective than synthetic commercial antifungals.
  • the antifungal effect on the incidence was estimated as the percentage of fruits affected in a given cluster (Fig. 9A, 9C, 1 0A, 10C) and in severity as the diameter of the lesion ( Fig. 9B, 9D, 10B, 10D).
  • 10 different clusters were analyzed, each with 10 berries.
  • the results allowed the categorization of treatments according to statistical analysis (Tukey test p ⁇ 0.05). According to our results, it is observed that the biological product of the present invention is as effective as the standard synthetic treatment in reducing the signs of cluster rot (acid rot) or gray rot when the plant has not been injured (Fig .9C, 9D, 10C, 10D).
  • the biological product of the present invention is even more effective than the synthetic standard in reducing the diameters of lesions caused by pathogenic fungi when the plants have previously been injured (Fig. 9A, 9B, 10A, 10B), demonstrating a surprising effect of the combination of Gluconobacter and Hanseniaspora in reducing the severity of infections acquired through wounds.
  • the biological product of the present invention is as much or more effective than commercial synthetic antifungal products.
  • the biological product of the present invention exerts a clear effect in reducing the severity of infections acquired through wounds, an effect that is not observed as effectively with the commercial synthetic antifungal. This aspect clearly represents an advantage of the present invention over the prior art.
  • EXAMPLE 5 The product of the invention is as much or more effective than commercial antifungals in the presence of low temperatures.
  • the biological product of the invention is as much or more effective than the synthetic antifungal, even after having gone through the cold shock (Fig. 1 1 and 12).
  • the antifungal effect of the biological product of the invention is especially good against gray rot in the presence of wounds (Fig. 12) under the conditions tested, reinforcing the protective effect of wounds that the combination of Gluconobacter and Hanseniaspora ej e rce n.
  • the biological product of the invention remains effective even in the presence of cold shocks.
  • the efficacy of the present invention with respect to the decrease in the incidence and severity of plant diseases caused by fungi is even greater than that obtained with synthetic antifungal compounds.
  • Hermosa, M., et al. Composition comprising fungi ofgenus Trichoderma used as biological control agent and the applications thereof 2005, Newbiotechnic, SA, Seville (ES), University of Salamanca, Salamanca (ES): United States, p. 1-9.
  • Pseudomonas aeruginosa produces secondary metabolites that have biological activity against plant pathogenic Xanthomonas species.

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Abstract

La presente invención se refiere a un producto biológico útil para el control de enfermedades fúngicas en vegetales que comprende una bacteria del género Gluconobacter y una levadura del género Hanseniaspora. Se incluye, además, un método para preparar el mencionado producto biológico y usos del mismo para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas.

Description

GLUCONOBACTER CERINUS MÁS HANSENIASPORA OSMOPHILA PARA EL CONTROL DE MICOSIS EN PLANTAS Y FRUTOS.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se ha demostrado que las principales afecciones que afectan los frutos en pre y postcosecha son causadas por géneros de hongos correspondientes a Rhizopus, Botrytis, Aspergillus y Penicillium, los cuales tienen el potencial de producir distintos tipos de enfermedades, incluyendo las enfermedades denominadas pudrición del racimo y pudrición gris [1 ]. Para el control de patógenos fúngicos en plantas se han utilizado diversas estrategias, incluyendo el uso de compuestos químicos que son potencialmente perjudiciales para la salud humana, sin mencionar que pueden seleccionar cepas patógenas resistentes.
La exportación a mercados distantes de productos agrícolas perecibles supone importantes desafíos para que arriben en condiciones adecuadas y soporten su comercialización [2, 3]. Por ejemplo la uva es afectada principalmente por dos enfermedades, pudrición del racimo o pudrición ácida y pudrición gris, que causan las mayores pérdidas en el cultivo tanto en pre como en post cosecha.
Los principales factores que influyen en el índice de daño causado por pudrición del racimo al momento de la cosecha, 60 y 120 días post-almacenaje refrigerado, corresponden a la incidencia de oídio y una fertilización nitrogenada elevada, entre otros [2]. El oídio es una enfermedad donde el hongo Uncinula necator es capaz de ingresar en forma directa a la baya y producir microfisuras tanto en hojas como en los frutos durante la precosecha, y de esta forma permite el ingreso de otros patógenos que sólo ingresan a través de heridas, como Rhizopus spp., Aspergillus spp. y Penicillium spp., potenciando la enfermedad que estos causan.
Para evitar las significativas pérdidas que pueden provocar estos patógenos, se han invertido numerosos recursos económicos para aumentar las aplicaciones de fungicidas sintéticos. Sin embargo, desde hace 25 años, el control químico de las enfermedades se ha dificultado debido al continuo desarrollo de resistencia por parte de los patógenos a los fungicidas de síntesis, independientemente de su modo de acción o combinación.
i En Chile se han presentado casos de resistencia específica y otros más complejos como la resistencia a multidroga [4]. En el campo, la resistencia específica a ingredientes activos, como benzimidazoles, fenilcarbamatos y dicarboximidas, fue detectada poco después de su introducción [5].
En el año 2009 se presentó el primer reporte de aislado de Botrytis cinérea con resistencia multidroga en Chile [6]. Este tipo de resistencia está asociada al uso reiterado de fungicidas sintéticos de uso normal como fludioxinilo, ciprodinilo, pirimetanil y fenhexamida [4]. Por lo tanto, en Chile no sólo existe resistencia específica sino que hoy en día también existen casos más complejos como la resistencia multidroga [4].
Debido a las razones antes expuestas, se ha puesto énfasis en el control biológico de patógenos vegetales mediante el uso de otros organismos que impidan o dificulten el desarrollo de los patógenos, sin afectar la viabilidad del cultivo o la salud de los consumidores.
En este sentido, actualmente es posible encontrar numerosos artículos referentes al control biológico de enfermedades por patógenos vegetales, entre los cuales se destaca el uso de hongos filamentosos, levaduras o bacterias como agentes biocontroladores.
El primer control biológico de enfermedades de post-cosecha se hizo en 1977 por Tronsmo y Dennis, donde se publicó que el uso del hongo Tríchoderma servía para el control de pudrición gris en frambuesas[7]. Tríchoderma es uno de los hongos más usados como biocontrolador de enfermedades fúngicas. De hecho, en Estados Unidos y en otros países se han patentado una serie de aislados y diversas formas de control de diferentes enfermedades fúngicas basadas en este hongo [8-16]. De acuerdo a los reportes encontrados para el biocontrol de patógenos mediante el uso de levaduras, destaca Picchia guilliermondii, una conocida levadura con efecto de control biológico. Picchia tiene efecto biocontrolador sobre Rhizopus nigrícans en frutos de tomate en almacenaje. Esta levadura es capaz de activar las enzimas de defensa del fruto y además compite por el sitio y nutrientes [17]. La cepa M8 de Picchia guilliermondii fue reportada como potencial biocontrolador de Botrytis cinérea en manzanas bajo condiciones de almacenaje y en jugo de manzana. La levadura induce la respuesta de defensa de la fruta, compite por nitrógeno, fuentes de carbono y secreta enzimas hidrolíticas [18]. La cepa Z1 de Picchia guilliermondii es usada en cítricos en mezcla con ceras para el control de moho azul (Penicillium italicum). En jugo de naranja es capaz de inhibir la germinación de esporas. Su modo de acción es a través de la competencia por nutrientes [19]. La especie Picchia caribbica es capaz de controlar Penicillium expansum en manzanas. Sin embargo, con la aplicación de ácido ascórbico se mejora la tolerancia al estrés oxidativo de la levadura y por lo tanto se mejoraría el efecto sobre Penicilium expansum [20].
Algunos ásteres de acetato producidos por manzanas estimulan la germinación de conidias de Botrytis cinérea. Sin embargo, este efecto puede ser suprimido con levaduras como Cryptococcus laurenthi, Sporobolomyces roseus o Saccharomyces cerevisae, siendo las dos primeras más efectivas en la supresión de la germinación de conidias [21 ]. Por otra parte, el butil acetato producido por las manzanas incrementa la adhesión de las conidias de Botrytis cinérea, estimulando su germinación. Sin embargo, Cryptococcus laurenthi y Sporobolomyces roseus pueden reducir este efecto, no así Saccharomyces cerevisiae. Este hecho refuerza la necesidad de realizar búsquedas empíricas de cepas biocontroladoras eficaces [22].
Saccharomyces cerevisiae ha sido registrada en una serie de patentes como controlador biológico para diferentes enfermedades. Por ejemplo una composición y método fitosanitario a partir de dicha levadura para tratar o proteger plantas de enfermedades causadas por varios patógenos [23].
Otros géneros importantes de levaduras en el control biológico corresponden a fíhodotorula y Metschnikowia. Una serie de especies y aislados en formulaciones han sido registrados como método para el control de enfermedades de pre y post-cosecha, en especial moho azul, pudrición gris, múcor y pudriciones de frutos [24]. Cepas de especies de Metschnikowia han sido registradas en patentes para el control del decaimiento de frutas causado por Penicillium expansum [1 ].
En cuanto al control biológico de enfermedades en uvas, podemos mencionar que Candida sake CPA-1 plus Fungicover®, Ulocladium oudemansii y quitosán son capaces de reducir significativamente la severidad de pudrición ácida, con 40 a 60% de inhibición comparado con el control. Sin embargo la incidencia de la enfermedad no fue significativamente reducida por alguno de los tratamientos [25].
Por otra parte, Candida saitoana, junto a una composición de otras especies de este género más enzimas, han sido registrados como control biológico para enfermedades de plantas, en especial para enfermedades de post-cosecha [26]. Además, 16 aislados de Saccharomyces y 27 aislados correspondientes a levaduras distintos de Saccharomyces mostraron propiedades antagonistas sobre algunos de los hongos patógenos a 25e C [27]. En otro trabajo realizado por los mismos autores, se recolectó un total de 225 aislados de levaduras provenientes de uvas, suelo de viñedos y mosto de uva para ser evaluados sobre el control de Botrytis cinérea. Los 65 aislados correspondieron a 15 especies que inhibieron a Botrytis cinérea a 25e C en condiciones in vitro. Sólo uno de estos aislados, Saccharomyces cerevisiae BSc68, inhibió el crecimiento micelial en uvas a 2 y 25e C. Todos los aislados determinados con actividad antifúngica provenían de mosto en fermentación [28].
Por otro lado, entre los reportes encontrados para el biocontrol de patógenos mediante el uso de bacterias, encontramos a Bacillus subtillis, una de las bacterias más estudiadas como biocontrolador. Bacillus subtillis corresponde a una cepa nativa aislada de suelos del centro de México y que ha sido reportada como biocontrolador de Sporísorium reilianum en maíz en tratamientos aplicados a semillas [29]. Al igual que en el caso de los hongos biocontroladores, han sido concedidas una serie de patentes de diferentes aislados de Bacillus utilizados para el control de varias enfermedades en plantas [30-39].
Otro género muy estudiado son las Pseudomonas. Las cepas CCR04 y CCR80 de Pseudomonas corrúgala han demostrado ser muy efectivas en la colonización de raíces de pimiento. De esta manera pueden inhibir la infección por Phytophthora capsici en el cultivo [40]. Pseudomonas aeruginosa, por su parte, produce metabolitos con actividad antibiótica capaz de controlar las enfermedades causadas por Xanthomonas spp., por lo que podría ser una alternativa a los bactericidas convencionales usados para su control [41 ]. Además, se ha reportado que las bacterias Pseudomonas fluorescens, Serratia liquefaciens, Serratia plymuthica, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis y Bacillus polymyxa han sido registradas para el control de Botrytis cinérea y Alternaría brassicola en repollo [42].
En Chile la bacteria Serratia plymuthica CCGG2742 fue aislada desde bayas de uvas y registrada como patente en Estados Unidos para el control de enfermedades de vegetales, en particular para prevenir la infección de Botrytis cinérea en frutos susceptibles de ser infectados [43].
Las bacterias ácido acéticas (BAA), por otra parte, son de especial interés biotecnológico en los procesos industriales involucrados en la producción de celulosa, sorbosa y vinagre. La familia es conocida como Acetobacteraceae y cuenta con 12 géneros [44]. El género Gluconobacter, uno de los más comunes entre las Acetobactereaceae, incluye 14 especies de las cuales 5 son usadas en la manufactura de alimentos, principalmente porque son inofensivas para la salud humana [45]. Estas bacterias son estrictamente aeróbicas, quimioorganótrofas y Gram-negativo. Crecen entre 4 y 40e C con un óptimo de 30e C y un pH óptimo de 5 a 6 [46]. Viven en la superficie de vegetales y frutos principalmente como saprofitos simbiontes. En bacterias aisladas a partir de frutas y flores en Tailandia, se encontraron 45 aislados del género Gluconobacter. De estos, 17 cepas correspondieron a Gluconobacter oxydans, 12 cepas a Gluconobacter cerínus, 9 cepas a Gluconobacter frateurii y 6 cepas a Gluconobacter thailandicus [47]. En una colecta realizada desde uvas con pudrición en tres viñedos de Adelaide Hills (Australia del Sur), se encontraron 9 especies diferentes de bacterias ácido acéticas, entre las cuales, 4 especies correspondieron al género Gluconobacter. Gluconobacter cerínus fue la principal especie identificada en los mencionados viñedos[48]. En uvas podridas o infectadas con Botrytis spp., el número de bacterias ácido acéticas se incrementa drásticamente, pasando de unas pocas a alrededor de 1 x106 [UFC/ml] después de la infección por Botrytis spp. [49]. Cuando esto ocurre, las especies de BAA pueden comenzar a dominar.
Actualmente, casi no existen reportes de bacterias del género Gluconobacter en control biológico. Sin embargo, se ha reportado el uso de Gluconobacter oxydans con actividad antifúngica y antipatulina en jugo de manzanas [45]. La bacteria fue aislada desde la superficie de frutas de manzana y, en condiciones in vitro, fue capaz de reducir en un 42,3 % el diámetro del crecimiento micelial de Penicillium expansum. Por otra parte, se mostró un alto nivel de eficiencia y completa prevención en la acumulación de patulina en jugo de manzana. Para evitar el desarrollo de enfermedades en frutos y hojas provocadas por patógenos fúngicos, se recurre frecuentemente al empleo de fungicidas sintéticos o tratamientos en base a productos naturales y/o biológicos. Los fungicidas sintéticos son eficaces, pero dificultan la exportación a mercados más exigentes debido a los efectos potencialmente perjudiciales en animales y plantas. Los fungicidas biológicos, por su parte, pueden ser inocuos y más aceptados en distintos mercados, aunque en la actualidad se ha observado que no presentan buenos niveles de eficacia, sobre todo cuando se comparan con fungicidas sintéticos. A la luz de estos antecedentes, se hace obvia la necesidad de desarrollar nuevos fungicidas biológicos con actividades antimicóticas mejoradas. Aun cuando se han desarrollado y patentado en varios países numerosos procedimientos de control biológico antifúngico, actualmente son muy pocos los que se usan de forma práctica en la agricultura. Esto se debe, por una parte, a la alta exigencia de calidad e inocuidad de los productos requeridos por los mercados internacionales y, por otra, a que los biocontroladores propuestos no alcanzan la efectividad que se requiere para cumplir las normativas comerciales de los diversos países. Esto provoca que los productores y exportadores necesariamente recurran a los productos sintéticos, los cuales se encuentran bajo estrictos controles por parte de las buenas prácticas agrícolas (BPA) y son objeto de exigentes fiscalizaciones en los mercados de destino. Además, la opinión pública los considera poco amigables con la salud humana y con el medio ambiente.
Por estas razones se hace necesario contar con un producto biológico y/o natural capaz de controlar en forma eficaz los principales agentes causantes de enfermedades en la pre y post-cosecha de frutos y/o plantas, que no genere problemas de restricciones de comercialización en mercados de destino, que no presente resistencia, que sea compatible con el almacenaje y transporte refrigerado, amigable con el medio ambiente y seguro para la salud humana.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dirigida a productos biológicos para el control de enfermedades fúngicas vegetales, composiciones que los comprenden, métodos para su preparación e indicaciones para su uso.
La invención abarca un producto biológico para el control de enfermedades fúngicas en vegetales que comprende una bacteria del género Gluconobacter y una levadura del género Hanseniaspora. En algunos aspectos, Gluconobacter puede corresponder a Gluconobacter cerinus, más preferentemente a Gluconobacter cerinus cepa 515 código de acceso RGM2215, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos. Por su parte, Hanseniaspora puede corresponder a Hanseniaspora osmophila, más preferentemente a Hanseniaspora osmophila cepa 337 código de acceso RGM2214, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos.
La invención también abarca un método para preparar el producto biológico para el control de enfermedades fúngicas vegetales, donde dicho método comprende mezclar al menos 1 x106 [UFC/ml] de Gluconobacter y al menos 1 x104 [UFC/ml] de Hanseniaspora, preferentemente 1 x106 [UFC/ml] a 1 x108 [UFC/ml] de Gluconobacter y 1 x104 [UFC/ml] a 1 x106 [UFC/ml] de Hanseniaspora. Por consiguiente, el producto biológico para el control de enfermedades fúngicas vegetales comprende al menos 1 x106 UFC/ml de Gluconobacter spp. y al menos 1 x104 UFC/ml de Hanseniaspora spp.
La invención abarca, además, un método para el control de enfermedades fúngicas vegetales que comprende administrar un producto biológico que comprende una bacteria del género Gluconobacter y una levadura del género Hanseniaspora a un organismo vegetal.
En otro aspecto, la invención abarca el uso de un producto biológico que comprende una bacteria del género Gluconobacter y una levadura del género Hanseniaspora, porque sirve para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas. En una modalidad, las enfermedades susceptibles de ser tratadas, prevenidas, controladas o curadas por el uso del producto de la presente invención incluye enfermedades fúngicas producidas por Deuteromycota, incluyendo enfermedades producidas por Aspergillus spp., Penicilium spp., Botrytis spp., entre otras. Además, la presente invención puede usarse para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas producidas por Zygomycota, incluyendo fíhizopus, entre otros. Adicionalmente, el producto de la invención puede utilizarse en plantas frutales como vides, pomáceas, prunus, cítricos y bayas; hortalizas de fruto como tomate, pimentón, berenjena, zapallo italiano; y hortalizas de hojas como lechugas, acelgas, espinacas.
Finalmente, el producto biológico de la invención se puede usar para tratar, prevenir, controlar o curar la pudrición ácida o pudrición de racimo, y la pudrición gris, entre otras enfermedades fúngicas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más particular de las modalidades preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos.
La figura 1 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con Gluconobacter cerinus (G.c.) (cepa 515 y 516) y/o Hanseniaspora osmophila (H.o.) (cepa 336 y 337) sobre el desarrollo de fíhizopus pp. en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de fíhizopus spp. en bayas de uva frente a los distintos tratamientos. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 15 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las concentraciones de Gluconobacter cerínus (cepa 515 y 516) utilizadas son: Dosis Alta (1 x108 [UFC/ml]) y Dosis Baja (1 x106 [UFC/ml]). Las concentraciones de Hanseniaspora osmophila (cepa 336 y 337) utilizadas son: Dosis Alta (1 x106 [UFC/ml]) y Dosis Baja (1 x104 [UFC/ml]). La concentración utilizada para Hanseniaspora osmophila (cepa 336 y 337) en los tratamientos 2 y 3, es Dosis Alta. La concentración utilizada para Gluconobacter cerínus (cepa 515 y 516) en los tratamientos 4 y 5, es Dosis Alta. Las bayas de uva fueron inoculadas con 1 x105 [esporas/ml] de fíhizopus spp. El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + fíhizopus spp. (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 2 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con Gluconobacter cerínus (G.c.) (cepa 515 y 516) y/o Hanseniaspora osmophila (H.o.) (cepa 336 y 337) sobre el desarrollo de Botrytis cinérea en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de Botrytis cinérea en bayas de uva frente a los distintos tratamientos. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 15 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 1 . El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + Botrytis cinérea (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 3 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con Gluconobacter cerínus (G.c.) (cepa 515 y 516) y/o Hanseniaspora osmophila (H.o.) (cepa 336 y 337) sobre el desarrollo de Aspergillus spp. en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de Aspergillus spp. en bayas de uva frente a los distintos tratamientos. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 15 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 1 . El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + Aspergillus spp. (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05). La figura 4 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con Gluconobacter cerínus (G.c.) (cepa 515 y 516) y/o Hanseniaspora osmophila (H.o.) (cepa 336 y 337) sobre el desarrollo de Penicillium spp. en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de Penicillium spp. en bayas de uva frente a los distintos tratamientos. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 15 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 1 . El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + Penicillium spp. (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 5 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con distintas concentraciones (dosis) de Gluconobacter cerínus (G.c.) cepa 515 y Hanseniaspora osmophila (H.o.) cepa 337 sobre el desarrollo de fíhizopus spp. en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de fíhizopus spp. en bayas de uva frente a las distintas modalidades de la invención. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 20 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las concentraciones de Gluconobacter cerínus (cepa 515) utilizadas son: Dosis Alta (1 x108 [UFC/ml]) y Dosis Baja (1 x106 [UFC/ml]). Las concentraciones de Hanseniaspora osmophila (cepa 337) utilizadas son: Dosis Alta (1 x106 [UFC/ml]) y Dosis Baja (1 x104 [UFC/ml]). Para el tratamiento 2, se usaron Dosis Bajas para Gluconobacter cerínus y Hanseniaspora osmophila. Las bayas de uvas fueron inoculadas con 1 x105 [esporas/ml] fíhizopus spp. El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + fíhizopus spp. (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05). La figura 6 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con distintas concentraciones (dosis) de Gluconobacter cerínus (G.c.) cepa 515 y Hanseniaspora osmophila (H.o.) cepa 337 sobre el desarrollo de Botrytis cinérea en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de Botrytis cinérea en bayas de uva frente a distintas modalidades de la invención. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 20 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 5. El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + Botrytis cinérea (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05). La figura 7 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con distintas concentraciones (dosis) de Gluconobacter cerínus (G.c.) cepa 515 y Hanseniaspora osmophila (H.o.) cepa 337 sobre el desarrollo de Aspergillus spp. en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de Aspergillus spp. en bayas de uva frente a distintas modalidades de la invención. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 20 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 5. El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + Aspergillus spp. (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 8 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se observa el efecto del tratamiento con distintas concentraciones (dosis) de Gluconobacter cerínus (G.c.) cepa 515 y Hanseniaspora osmophila (H.o.) cepa 337 sobre el desarrollo de Penicillium spp. en bayas de uva cv Red Globe. Las barras representan el diámetro de lesión que genera la infección de Penicillium spp. en bayas de uva frente a distintas modalidades de la invención. La figura muestra los efectos a los 4 (A) y 20 (B) días post infección con el hongo patógeno. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 5. El control positivo corresponde al tratamiento de Agua + Penicillium spp. (lesión completa) y el control negativo corresponde al tratamiento de Agua + Agua (ausencia de lesión). Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05). La figura 9 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se compara el efecto del producto biológico de la invención y un tratamiento estándar comercial sobre la incidencia (A y C) y severidad (B y D) de la pudrición de racimo (patología producida por fíhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp., y/o Penicillium spp.) en uva de mesa cv Red Globe que presentaban heridas (A y B) o que no las presentaban (C y D). En cada experimento se analizaron 10 racimos distintos, cada uno con 10 bayas. Las barras representan el porcentaje de uvas con síntomas en el racimo analizado (A y C) o el diámetro de lesión que genera la infección en la uva provocada por la pudrición del racimo (B y D). Los datos fueron obtenidos a los 5 días post infección, y a una incubación de 24 °C. La concentración de Gluconobacter cerínus (G.c.) cepa 515 fue de 1 x106 [UFC/ml] y la de Hanseniaspora osmophila (H.o.) cepa 337 fue de 1 x104 [UFC/ml]. El estándar comercial fue Switch ® 62.5 wg que viene formulado: Ciprodinilo (37,5 %p/p) más Fludioxinilo (25% p/p). El control corresponde a uvas de mesa cv Red Globe sin tratamiento. Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 10 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se compara del efecto del producto biológico de la invención y un tratamiento estándar comercial sobre la incidencia (A y C) y severidad (B y D) de la pudrición gris (patología producida por Botrytis cinérea) en uva de mesa cv Red Globe que presentaban heridas (A y B) o que no las presentaban (C y D). En cada experimento se analizaron 10 racimos distintos, cada uno con 10 bayas. Las barras representan el porcentaje de uvas con síntomas en el racimo analizado (A y C) o el diámetro de lesión que genera la infección en la uva provocada por la pudrición gris (B y D). Los datos fueron obtenidos a los 5 días post infección, y a una incubación de 24 °C. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 9. El estándar comercial fue Switch ® 62.5 wg que viene formulado: Ciprodinilo (37,5 % p/p) más Fludioxinilo (25 % p/p). El control corresponde a uvas de mesa cv Red Globe sin tratamiento. Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 1 1 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se compara del efecto del producto biológico de la invención y un tratamiento estándar comercial sobre la incidencia (A y C) y severidad (B y D) de la pudrición de racimo (patología producida por fíhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp., y/o Penicillium spp.) en uva de mesa cv Red Globe luego de un choque de frío. Se evaluaron uvas que presentaban heridas (A y B) y uvas que no las presentaban (C y D). Las barras representan el porcentaje de uvas con síntomas en el racimo analizado (A y C) o el diámetro de lesión que genera la infección en la uva provocada por la pudrición del racimo (B y D). Los datos fueron obtenidos a los 5 días post infección, y a una incubación de 0 °C, seguido por 6 días a temperatura ambiente. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 9. El estándar comercial fue Switch ® 62.5 wg que viene formulado: Ciprodinilo (37,5 % p/p) más Fludioxinilo (25 % p/p). El control corresponde a uvas de mesa cv Red Globe sin tratamiento. Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
La figura 12 muestra una gráfica de Tratamiento v/s Diámetro lesión (cm), donde se compara el efecto del producto biológico de la invención y un tratamiento estándar comercial sobre la incidencia (A y C) y severidad (B y D) de la pudrición gris (patología producida por Botrytis cinérea) en uva de mesa cv Red Globe luego de un choque de frío. Se evaluaron uvas que presentaban heridas (A y B) y uvas que no las presentaban (C y D). Las barras representan el porcentaje de uvas con síntomas en el racimo analizado (A y C) o el diámetro de lesión que genera la infección en la uva provocada por la pudrición gris (B y D). Los datos fueron obtenidos a los 5 días post infección, y a una incubación de 0 °C, seguido por 6 días a temperatura ambiente. Las dosis son las mismas que las descritas para la figura 9. El estándar comercial fue Switch ® 62.5 wg que viene formulado: Ciprodinilo (37,5 % p/p) más Fludioxinilo (25 % p/p). El control corresponde a uvas de mesa cv Red Globe sin tratamiento. Las letras a la derecha de las barras corresponden a distintas categorías de acuerdo a la prueba de Tukey (p < 0,05).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un producto biológico (i.e. composición) que comprende la bacteria Gluconobacter, preferentemente Gluconobacter cerínus, más preferentemente Gluconobacter cerínus cepa 515 código de acceso RGM2215, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos, combinada con la levadura Hanseniaspora, preferentemente Hanseniaspora osmophila, más preferentemente Hanseniaspora osmophila cepa 337 código de acceso RGM2214, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos. Estos microorganismos fueron aislados desde bayas provenientes de racimos de uva de mesa, cosechados en predios con producción comercial destinada a la exportación.
Los inventores encontraron que, sorprendentemente, la bacteria Gluconobacter de la invención tiene un efecto antifúngico evidente en hongos de distintos tipos, incluyendo fíhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp. y Penicillium spp. Más sorprendentemente aún, los inventores observaron que la adición de la levadura Hanseniaspora potenciaba sinérgicamente el efecto antifúngico de Gluconobacter. Este efecto no se puede desprender de la mera lectura del estado del arte ya que no hay documentos que divulguen que Hanseniaspora osmophila tenga actividad antifúngica, ni mucho menos que potencie sinérgicamente la actividad antifúngica de Gluconobacter.
Por otra parte, el producto biológico de la invención (i.e. Gluconobacter + Hanseniaspora) exhibe un efecto antifúngico sostenido en el tiempo, incluso varios días después de la inoculación. Además, el efecto antifúngico obtenido con el producto biológico de la invención es tanto o más efectivo que los efectos obtenidos con antifúngicos sintéticos, incluso en condiciones de choques y cadenas de frío, tan comunes en los embalajes de frutas y verduras para su conservación. Por todas estas razones, el producto biológico antifúngico de la invención es eficaz y no presenta las desventajas de los productos antifúngicos sintéticos.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un producto antifúngico que comprende Gluconobacter y Hanseniaspora, que presenta un efecto sorprendentemente sinérgico y potenciado de la actividad antifúngica. Además, es tanto o más eficaz que compuestos antifúngicos sintéticos, pero es un producto natural, solucionando un problema de la técnica que no ha sido resuelto satisfactoriamente al presente. A continuación, sigue una descripción de las modalidades preferidas de la invención.
Las palabras "un" o "una" se pretende que abarquen uno/a o más, a menos que se especifique lo contrario. En un aspecto, la invención se refiere a un producto biológico que comprende una bacteria del género Gluconobacter y una levadura del género Hanseniaspora. Gluconobacter spp. se puede cultivar en medio de cultivo GYC (glucosa 50 [g/L], extracto de levadura 10 [g/L], carbonato de calcio 30 [g/L], agar 25 [g/L], ácido clorhídrico 2 [N] y agua destilada 1 L) a 25e C. Además, cualquier otra forma de cultivo adecuada para Gluconobacter spp. será útil para el propósito de esta invención. Por su parte, Hanseniaspora spp. se puede cultivar en medio de cultivo MLP (peptona 20 [g/L], miel de abejas 80 [g/L], agar 20 [g/L], agua destilada 1 L) a 25e C. Al igual que para Gluconobacter spp., cualquier otra forma de cultivo adecuada para Hanseniaspora spp. será útil para el propósito de la presente invención. Para obtener el producto de la presente invención, es necesario mezclar Gluconobacter spp., preferentemente Gluconobacter cerínus, más preferentemente Gluconobacter cerínus 515 código de acceso RGM2215, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos, con Hanseniaspora spp., preferentemente Hanseniaspora osmophila, más preferentemente cepa 337 código de acceso RGM2214, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos. Los microorganismos deberán mezclarse en una proporción de al menos 1 x106 [UFC/ml] de Gluconobacter y al menos 1 x104 [UFC/ml] de Hanseniaspora, preferentemente 1 x106 [UFC/ml] a 1 x108 [UFC/ml] de Gluconobacter y 1 x104 [UFC/ml] a 1 x106 [UFC/ml] de Hanseniaspora. Para poder estimar el número de UFC, se podrá utilizar el método de conteo de microorganismos viables en placa, o algún otro método adecuado para tal efecto. Para poder mezclar los microorganismos de la invención, estos podrán estar suspendidos en medio de cultivo (como los descritos en los párrafos precedentes) o en cualquier otro vehículo adecuado, como por ejemplo suero fisiológico (NaCI 0,85 %), amortiguador fosfato (PBS), agua peptonada, agua con agar, o agua estéril. Alternativamente, los microorganismos de la invención podrán mezclarse liofilizados o liofilizarse después de ser mezclados.
En otro aspecto, la invención comprende un método para el control de enfermedades fúngicas en plantas que a su vez comprende administrar el producto biológico a un organismo vegetal. Para administrar el producto biológico de la invención se podrá realizar directamente sobre las plantas, incluyendo sobre los tallos, hojas, frutos y brotes. Alternativamente, el producto de la invención podrá agregarse directamente sobre la tierra de cultivo, ya sea mezclado con las aguas de regadío o por sí solo. Alternativamente, el producto de la invención podrá agregarse sobre semillas antes de ser almacenadas o antes de ser plantadas. Para administrar el producto de la invención, cualquier medio es adecuado, incluyendo administraciones en vehículos líquidos (chorro directo, pulverización por spray, mezclado con las aguas de regadío) o directamente como polvo en el caso de usarse liofilizado. El uso de medios con consistencia de gel o espuma para contener el producto biológico descrito en la presente solicitud también está considerado dentro del ámbito de la protección de la presente invención.
En otro aspecto de la invención, el producto biológico con propiedades antifúngicas podrá usarse para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso profiláctico del producto sobre tallos, hojas, frutos y semillas sanos, e incluso sobre la tierra que será cultivada. Además, se incluye el uso del producto de la invención sobre tallos, hojas, frutos y semillas que presenten cualquier síntoma de enfermedad.
Adicionalmente, la invención abarca el uso de un producto biológico que comprende una bacteria del género Gluconobactery una levadura del género Hanseniaspora, porque sirve para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas. En una modalidad, las enfermedades susceptibles de ser tratadas, prevenidas o curadas por el uso del producto de la presente invención incluye enfermedades fúngicas producidas por Deuteromycota, incluyendo enfermedades producidas por Aspergillus spp., Penicilium spp., Botrytis spp., entre otras. Además, la presente invención puede usarse para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas producidas por Zygomycota, incluyendo fíhizopus, entre otros. Adicionalmente, el producto de la invención puede utilizarse en plantas frutales como vides, pomáceas, prunus, cítricos y bayas; hortalizas de fruto como tomate, pimentón, berenjena, zapallo italiano; y hortalizas de hojas como lechugas, acelgas, espinacas. Finalmente, el producto biológico de la invención se puede usar para tratar, prevenir, controlar o curar la pudrición ácida o pudrición de racimo y la pudrición gris, entre otras enfermedades fúngicas. La invención se comprenderá mejor por medio de los siguientes ejemplos, los que son meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención. Varios cambios y modificaciones a las modalidades descritas serán evidentes para los expertos en la materia y tales cambios pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 : Preparación del producto biológico de la invención y protocolos de los ensayos biológicos.
A.- Preparación de Gluconobacter cerinus (cepa 515 y 516) La bacteria se cultivó en el medio de cultivo GYC (Glucosa 50 [g/L], Extracto de levadura 10 [g/L], Carbonato de Calcio 30 [g/L], Agar 25 [g/L], Ácido clorhídrico 2 [N], completar 1 L con agua destilada) durante 5 días a 25e C. Una vez crecida, la bacteria se extrajo desde el medio de cultivo y se diluyó en agua más agar al 1 % y tween 20 % para romper tensión superficial, dejando las bacterias a la concentración adecuada (Tabla 1 ). Las bayas de uva se inocularon con 10 μΙ de la suspensión bacteriana. Como control negativo, se usó 10 μΙ de agua en vez de Gluconobacter.
Tabla 1. Concentraciones utilizadas para inocular vegetales
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B.- Preparación de Hanseniaspora osmophila (cepa 336 y 337) La levadura se cultivó en el medio de cultivo MLP (Peptona 20 [g/L], Miel de abejas 80 [g/L], Agar 20 [g/L], completar 1 L con agua destilada) durante 5 días a 25 °C. Una vez crecida, la levadura se extrae desde el medio de cultivo y se diluye en agua más agar al 1 % y tween 20 % para romper tensión superficial, dejando las levaduras a la concentración adecuada (Tabla 1 ). Las bayas de uva se inocularon con 10 μΙ de la suspensión de levaduras. Como control negativo, se usó 10 μΙ de agua en vez de Hanseniaspora.
C- Preparación del producto biológico que comprende Gluconobacter y Hanseniaspora.
Para preparar el producto de la invención, se mezclaron volúmenes de solución concentrada con Gluconobactery otra solución concentrada de Hanseniaspora. Para lograr la concentración deseada, de acuerdo a la Tabla 1 , se realizó el cálculo de C1 * V1 = C2 *
V2, donde C1 es concentración inicial de la solución; V1 es volumen inicial de la solución;
C2 es la concentración final de la solución y V2 es el volumen final de la solución. Así se tomó un volumen de solución según el resultado del cálculo y se diluyó mezclando
Gluconobacter y Hanseniaspora en una sola solución.
Las bayas de uva se inocularon con 10 μΙ de la suspensión microbiológica. Como control negativo, se usó 10 μΙ de agua en vez de producto biológico.
D.- Infección con los hongos patógenos Rhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp. y/o Penicillium spp.
Los hongos patógenos Rhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp. y/o Penicillium spp. se cultivaron en medio PDA 39 [g/L] Difco™ durante 7 días a 24 °C para Rhizopus spp., Aspergillus spp. y/o Penicillium spp. y durante 10 días a 24 eC, bajo luz negra (320 nm) para Botrytis cinérea. Luego, 10 μΙ (1 x105 [esporas/ml]) (Tabla 1 ) se utilizaron para inocular las bayas de uva. Como control negativo, se usó 10 μΙ de agua en vez de suspensión de esporas de hongos patógenos.
E.- Preparación de antifúngico sintético comercial de uso estándar (Ciprodinilo + Fludioxinilo). Ciprodinilo + fludioxinilo corresponde al producto comercial Switc ® 62.5 WG que viene formulado: Ciprodinilo 37,5 % p/p + Fludioxinilo 25 % p/p. La dosis aplicada fue de 10 μΙ (90 g por cada 100 L de agua).
F.- Determinación del efecto antifúngico.
Para determinar el efecto antifúngico del producto biológico de la presente invención y de sus controles, se infectaron bayas de uvas cv Red Globe con hongos patógenos de acuerdo a lo indicado en el punto D, concomitantemente con la adición de las composiciones antifúngicas de acuerdo a los puntos A, B, C o E. En el caso de las Fig. 1 a 8, las bayas infectadas se incubaron por 4 días a 24 eC, y los días subsiguientes hasta completar 15 o 20 días, a temperatura ambiente. En el caso de las Fig. 9 y 10, las bayas infectadas se incubaron 5 días a 24 °C. En el caso de las Fig. 1 1 y 12, las bayas infectadas se incubaron 5 días a 0 °C y luego 6 días a temperatura ambiente. Para las Fig. 9A, 9B, 10A, 10B, 1 1 A, 1 1 B, 12A y 12B, se analizaron bayas con heridas o sin ellas. Las heridas, de aproximadamente 2 mm de profundidad, se realizaron en las bayas de uva por los investigadores. El efecto antifúngico se determinó luego de la incubación, midiendo el diámetro de las lesiones producidas por los hongos patógenos (estimación de la severidad) o calculando el porcentaje de bayas afectadas en un racimo dado (índice de la incidencia).
EJEMPLO 2: Gluconobacter spp. y Hanseniaspora spp. presentan un efecto antifúngico sinérgico contra Rhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp. y Penicillium spp.
Con el objetivo de averiguar el efecto antifúngico de Gluconobacter y Hanseniaspora, se realizó un desafío utilizando Rhizopus spp. (Fig. 1 ), Botrytis cinérea (Fig. 2), Aspergillus spp. Fig. 3) o Penicillium spp. (Fig. 4) como hongos patógenos. Los hongos patógenos se cultivaron y se usaron para infectar bayas de uvas cv Red Globe según se explicó en el Ejemplo 1 . Al mismo tiempo de la infección, se agregó agua (control negativo de tratamiento), Hanseniaspora osmophila sola (cepa 336 o cepa 337), Gluconobacter cerinus solo (cepa 515 o cepa 516), o una combinación de Gluconobacter y Hanseniaspora en distintas concentraciones (Tabla 1 ). El efecto antifúngico se estimó como el diámetro de la lesión luego de 4 días (Fig. 1 A, 2A, 3A, 4A) o luego de 15 días post infección (Fig. 1 B, 2B, 3B, 4B). El experimento se repitió 3 veces (replicado biológico) y cada vez se analizaron 5 bayas distintas. Los resultados permitieron la categorización de los tratamientos de acuerdo a análisis estadísticos (prueba de Tukey p < 0,05).
De acuerdo a nuestros resultados, se observa claramente que a los 4 días post infección, ninguna de las cepas de Hanseniaspora osmophila es capaz de disminuir los diámetros de las lesiones producidas por Rhizopus spp. (Fig. 1 A). Por otra parte, se observa que las dos cepas de Gluconobacter cerinus probadas ejercieron un efecto significativo en la disminución de las lesiones producidas por Rhizopus spp., donde la Gluconobacter cerinus cepa 515 ejerció un efecto levemente superior a la cepa 516 (Fig. 1 A). Más importantemente, el producto biológico de la invención (el cual comprende Gluconobacter cerinus + Hanseniaspora osmophila) presenta un claro efecto potenciado sinérgico en relación al efecto obtenido por sus partes individuales (Fig. 1 A). Esto queda de manifiesto en el hecho de que Hanseniaspora osmophila evidentemente mejora las propiedades antifúngicas de Gluconobacter cerinus, aun cuando Hanseniaspora osmophila por sí sola no tiene efecto antifúngico contra Rhizopus spp. (Fig. 1 A). El producto de la invención ejerce, además, un efecto antifúngico potenciado contra Botrytis cinérea (Fig. 2A), Aspergillus spp. (Fig. 3A) y contra Penicillium spp. (Fig. 4A). El efecto sinérgico potenciado del producto biológico de la invención es especialmente evidente para el tratamiento de Penicillium spp., donde Hanseniaspora osmophila y Gluconobacter cerinus exhiben un débil efecto antifúngico por sí solos, el cual se observa claramente incrementado y mejorado cuando ambos microorganismos se mezclan (Fig. 4A).
A la luz de estos resultados es posible concluir que Hanseniaspora potencia sinérgicamente los efectos antifúngicos de Gluconobacter. Por consiguiente, el producto biológico de la invención presenta un efecto sorprendente, imposible de determinar sin los datos empíricos divulgados en la presente solicitud.
EJEMPLO 3: Distintas concentraciones de Gluconobacter spp. y Hanseniaspora spp. presentan un efecto antifúngico sinérgico contra Rhizopus spp., Botrytis cinérea,
Aspergillus spp. y Penicillium spp. sostenido en el tiempo.
Con el objetivo de averiguar si el efecto antifúngico producido por la presente invención es sostenido en el tiempo, se realizó un desafío como el descrito en el Ejemplo 2, pero evaluando tamaño de las lesiones luego de 15 días post infección. Como se observa en las Fig. 1 B, 2B, 3B y 4B, la presente invención aún mantiene sus propiedades antifúngicas contra Rhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp. y Penicillium spp. incluso 15 días después de realizada la inoculación.
Con el objetivo de averiguar el efecto de las concentraciones (i.e. UFC/ml) de Gluconobacter y Hanseniaspora con respecto a la eficiencia del producto biológico de la invención como antifúngico, se realizó otro desafío de acuerdo a lo que se explicó en el Ejemplo 1 , pero esta vez probando concentraciones distintas de Gluconobacter y Hanseniaspora (Tabla 1 ). De acuerdo a lo observado en las Fig. 5 a 8, el producto biológico de la invención ejerce un efecto antifúngico eficaz contra fíhizopus spp., Botrytis cinérea, Aspergillus spp. y Penicillium spp., tanto a los 4 como a los 20 días post-infección. Más importantemente, las Fig. 5 a 8 muestran que, independientemente de las concentraciones de la bacteria y de la levadura, siempre se observa un biocontrol eficaz y de larga duración de las lesiones producidas por patógenos fúngicos. Con estos resultados concluimos que el producto biológico de la invención ejerce un eficaz efecto antifúngico incluso 20 días después de su aplicación. Además, los efectos antifúngicos no se ven grandemente afectados por la concentración de bacteria o de levadura usada.
EJEMPLO 4: El producto de la invención es tanto o más eficaz que antifúngicos comerciales sintéticos.
Con el objetivo de comparar la eficacia antifúngica del producto biológico de la invención con antifúngicos comerciales sintéticos, se realizó un desafío utilizando bayas de uva Red Globe las que fueron inoculadas con los agentes causales de la pudrición de racimo (Fig. 9) o la pudrición gris (Fig. 10). Se analizaron y compararon bayas con heridas (Fig. 9A, 9B, 10A, 10B) o sin ellas (Fig. 9C, 9D, 10C, 10D) para evaluar si esta variable afectaba el efecto antifúngico de la presente invención. Una combinación de Gluconobacter)/ Hanseniaspora, o un antifúngico sintético comercial que comprende Cipronidilo + Fludioxinilo, fue administrado de acuerdo a lo indicado en el ejemplo 1 a las bayas infectadas. Luego de 5 días a 24 °C, el efecto antifúngico en la incidencia se estimó como el porcentaje de frutos afectados en un racimo dado (Fig. 9A, 9C, 1 0A, 10C) y en la severidad como el diámetro de la lesión (Fig. 9B, 9D, 10B, 10D). En cada experimento se analizaron 10 racimos distintos, cada uno con 10 bayas. Los resultados permitieron la categorización de los tratamientos de acuerdo a análisis estadísticos (prueba de Tukey p < 0,05). De acuerdo a nuestros resultados, se observa que el producto biológico de la presente invención es tan eficaz como el tratamiento sintético estándar en disminuir los signos de la pudrición del racimo (pudrición ácida) o la pudrición gris cuando la planta no ha sufrido heridas (Fig. 9C, 9D, 10C, 10D). Más importante, el producto biológico de la presente invención es incluso más eficaz que el estándar sintético en disminuir los diámetros de las lesiones provocadas por hongos patógenos cuando los vegetales han sufrido previamente heridas (Fig. 9A, 9B, 10A, 10B), demostrando un efecto sorprendente de la combinación de Gluconobacter y Hanseniaspora en la disminución de la severidad de infecciones adquiridas a través de heridas.
A partir de estos datos concluimos que el producto biológico de la presente invención es tanto o más eficaz que productos antifúngicos sintéticos comerciales. Además, el producto biológico de la presente invención ejerce un claro efecto en la disminución de la severidad de infecciones adquiridas a través de heridas, efecto que no se observa tan eficazmente con el antifúngico sintético comercial. Este aspecto claramente representa una ventaja de la presente invención con respecto al estado de la técnica.
EJEMPLO 5: El producto de la invención es tanto o más eficaz que antifúngicos comerciales en presencia de bajas temperaturas.
Un aspecto importante de considerar es, si el producto biológico de la invención tolera la exposición a bajas temperaturas y si persiste su efecto cuando es sometido a temperatura ambiente luego de un período de refrigeración (condiciones normales para proceso de comercialización). Con el fin de averiguar si la presente invención mantiene su eficacia en el tiempo luego de un choque de frío, realizamos el mismo desafío que el descrito en el Ejemplo 4, con la excepción de que las bayas infectadas fueron incubadas primeramente 5 días a 0 °C y luego 6 días a temperatura ambiente antes de evaluar la incidencia y la severidad de la enfermedad de la misma manera a la descrita en el Ejemplo 4.
Los resultaros indicaron que el producto biológico de la invención es tanto o más eficaz que el antifúngico sintético, incluso después de haber pasado por el choque frío (Fig. 1 1 y 12). El efecto antifúngico del producto biológico de la invención es especialmente bueno contra la pudrición gris en presencia de heridas (Fig. 12) en las condiciones probadas, reforzando el efecto protector de heridas que la combinación de Gluconobacter y Hanseniaspora ej e rce n . De acuerdo a estos resultados, concluimos que el producto biológico de la invención mantiene su eficacia incluso en presencia de choques de frío. Es más, la eficacia de la presente invención con respecto a la disminución de la incidencia y severidad de enfermedades vegetales producidas por hongos es incluso superior al obtenido con compuestos antifúngicos sintéticos.
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Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un producto biológico para el control de enfermedades fúngicas en vegetales CARACTERIZADO porque comprende una bacteria del género Gluconobacter y una levadura del género Hanseniaspora.
2. Un producto biológico, de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque Gluconobacter es Gluconobacter cerinus.
3. Un producto biológico, de acuerdo a la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque Gluconobacter cerinus corresponde a la cepa 515 código de acceso RGM2215, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos.
4. Un producto biológico, de acuerdo a las reivindicaciones 1 , 2 o 3, CARACTERIZADO porque Hanseniaspora es Hanseniaspora osmophila.
5. Un producto biológico, de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque Hanseniaspora osmophila corresponde a la cepa 337 código de acceso RGM2214, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos.
6. Un producto biológico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO porque comprende al menos 1 x106 [UFC/ml] de Gluconobacter spp.
7. Un producto biológico de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque comprende 1 x106 [UFC/ml] a 1 x108 [UFC/ml] de Gluconobacter spp.
8. Un producto biológico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO porque comprende al menos 1 x104 [UFC/ml] de Hanseniaspora spp.
9. Un producto biológico de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque comprende 1 x104 [UFC/ml] a 1 x106 [UFC/ml] de Hanseniaspora spp.
10. Un método para preparar un producto biológico de las reivindicaciones 1 a 9, CARACTERIZADO porque se mezclan al menos 1 x106 [UFC/ml] de Gluconobacter spp. y al menos 1 x104 [UFC/ml] de Hanseniaspora spp.
1 1 . Un método para el control de enfermedades fúngicas vegetales CARACTERIZADO porque comprende administrar un producto biológico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 9 a un organismo vegetal.
12. Uso de un producto biológico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 9 CARACTERIZADO porque sirve para tratar, prevenir, controlar o curar enfermedades fúngicas en plantas.
13. Uso de acuerdo a la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque las enfermedades fúngicas son producidas por Deuteromycota.
14. Uso de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque el Deuteromycota es Aspergillus spp. l
15. Uso de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque el Deuteromycota es Penicillium spp.
16. Uso de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque el Deuteromycota es Botrytis spp.
17. Uso de acuerdo a la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque las enfermedades fúngicas son producidas por Zygomycota.
18. Uso de acuerdo a la reivindicación 17, CARACTERIZADO porque el Zygomycota es Rhizopus spp.
19. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 12 a 18, CARACTERIZADO porque las plantas son frutales.
20. Uso de acuerdo a la reivindicación 19, CARACTERIZADO porque las plantas frutales son vides, pomáceas, prunus, cítricos o bayas.
21 . Uso de acuerdo a las reivindicaciones 12 a 18, CARACTERIZADO porque las plantas son hortalizas de fruto.
22. Uso de acuerdo a la reivindicación 21 , CARACTERIZADO porque las hortalizas de fruto son tomate, pimentón, berenjena o zapallo italiano.
23. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 12 a 18, CARACTERIZADO porque las plantas son hortalizas de hojas.
24. Uso de acuerdo a la reivindicación 23, CARACTERIZADO porque las hortalizas de hojas son lechugas, acelgas, espinacas.
25. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 12 a 24, CARACTERIZADO porque la enfermedad fúngica que se puede tratar, prevenir, controlar o curar es la pudrición ácida o pudrición de racimo.
26. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 12 a 24, CARACTERIZADO porque la enfermedad fúngica que se puede tratar, prevenir, controlar o curar es pudrición gris.
2
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