WO2017191420A1 - Composé utile pour le traitement d'un déficit du catabolisme des acides gras a très longue chaîne et composition pharmaceutique comprenant ledit composé - Google Patents

Composé utile pour le traitement d'un déficit du catabolisme des acides gras a très longue chaîne et composition pharmaceutique comprenant ledit composé Download PDF

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chain fatty
catabolism
long
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Terence Beghyn
Benoît Deprez
Camille MOREAU
Abdallah JEOUAL
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Definitions

  • the present invention relates to a compound for its use in the treatment, prevention or diagnosis of genetic diseases causing a catabolism deficiency. by oxidation of very long chain fatty acids (VLCFA) in all the cells of the body and consequently an accumulation of these fatty acids, such as behenic acid (docosanoic acid, C22: 0), lignoceric acid (tetracosanoic acid, C24 : 0) and cerotic (hexacosanoic acid, C26: 0).
  • VLCFA very long chain fatty acids
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising said compound.
  • Fatty acids containing more than 22 carbon atoms (C24: 0 and C26: 0) have two sources: a food source and an endogenous synthesis.
  • the synthesis of fatty acids larger than 16 carbohydrates is due to an elongation system present in both mitochondria and microsomes.
  • the catabolism of VLCFA is ensured by the peroxisome, cell organelle in which one finds all the enzymes ensuring the beta-oxidation of AGTLC.
  • Zellweger syndrome is caused by a mutation in one of the peroxisome proteins (peroxins): PEX1, PEX2, PEX3, PEX5, PEX6, PEX10, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, or PEX26. Phenotypic variants such as neonatal adrenoleukodystrophy and infantile Refsum syndrome are sometimes distinguished in this family. These pathologies are characterized and diagnosed by an accumulation of VLCFA in the body.
  • VLCFA The accumulation of VLCFA involves all cells of all tissues.
  • the VLCFAs are found at levels too high in the bloodstream and their plasma determination is part of the diagnosis of these pathologies.
  • the accumulation of VLCFA in certain organs such as the brain, spinal cord, peripheral nerves has a significant clinical impact.
  • the symptoms are notably neurodegenerative.
  • the aim of the present invention is to propose a compound which makes it possible to restore the catabolic function of VLCFAs (C22, C24 and C26 fatty acids), thereby reducing their accumulation by increasing the amounts of palmitic and stearic acids and to restore normal amounts of behenic, lignoceric and cerotic acids in the cells of the body.
  • This compound is likely to be used for the treatment or prevention of diseases caused by VLCLC accumulation.
  • the present invention therefore proposes a compound for its use in the treatment or prevention of a disease caused by a defect in the catabolic function of the peroxisome VLCFA, itself caused, exclusively or otherwise, by a mutation on the genes coding for peroxins and more particularly on the genes coding for PEX1, PEX2-PXMP3, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11A, PEX11B, PEX11G, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, PEX28, PEX30 or PEX31, or genes encoding an enzyme involved in catabolism or transport of VLCLC whose loss of function results in accumulation of VLCFA, and more particularly the ABCD1, ACOX1 genes or the gene coding for the peroxysomal bi-functional protein HSD17B4 (enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase), said compound being of formula (I) below:
  • the invention also provides a pharmaceutically acceptable salt, solvate, clathrate, hydrate or polymorph of the compound of formula (I) for the above-mentioned use, as well as a compound capable of being metabolized by a living organism into a compound of formula ( I) or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, clathrate, hydrate or polymorph of said compound of formula (I), again for the above-mentioned use.
  • the compound according to the present invention makes it possible to treat or prevent a disease caused partially or totally by a defect of the VLCLC catabolism of the peroxisome, itself caused, exclusively or otherwise, by a mutation on the genes coding for peroxins and more particularly on genes coding for PEX1, PEX2-PXMP3, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11A, PEX11B, PEX11G, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, PEX28, PEX30 or PEX31, or on the genes encoding an enzyme involved in the catabolism or transport of VLCLC whose loss of function causes an accumulation of VLCFA, and more particularly the genes ABCD1, ACOX1 or the gene coding for the peroxisomal bi-functional protein (enoyl-CoA hydratase and 3 hydroxyacyl-CoA dehydrogenase).
  • the compound according to the invention makes it possible to eliminate or attenuate
  • the compound according to the invention can be administered to any patient suffering from a disease as defined above.
  • patient encompasses, within the meaning of the present invention, any living being, animal, in particular a mammal and in particular a human being.
  • the compound of formula (I) is chemically named 5-chloro-N- (2-chloro-4-nitrophenyl) -2-hydroxybenzamide (CAS No. 50-65-7), and its international nonproprietary name is niclosamide.
  • the preparation of this compound is described in US Patent 3,079,297.
  • the compound of formula (I) may be used in the form of salts with in particular a non-toxic inorganic or organic base, which is preferably pharmaceutically acceptable.
  • a non-toxic inorganic or organic base which is preferably pharmaceutically acceptable.
  • the mineral bases it is possible to use, for example, hydroxides of sodium, potassium, magnesium or calcium.
  • the organic bases it is possible to use, for example, amines, amino alcohols, basic amino acids such as lysine or arginine or compounds carrying a quaternary ammonium function such as, for example, betaine or choline.
  • the salts of the compound of formula (I) with a mineral or organic base can be obtained in a conventional manner, using methods that are well known to those skilled in the art, for example by mixing stoichiometric quantities of compound of formula (I) and of the base in a solvent, such as for example water or a hydroalcoholic mixture, and then lyophilizing the solution obtained.
  • a solvent such as for example water or a hydroalcoholic mixture
  • the compound of formula (I) is in the form of a salt with ethanolamine.
  • the preparation of this salt is described, for example, in US Pat. No. 3,113,067.
  • polymorph means, according to the present invention, any form or mixture of amorphous or crystalline forms of the active molecule.
  • the compound according to the invention is generally administered in the form of a pharmaceutical composition in combination or mixture with one or more pharmaceutically acceptable excipients in order to obtain forms that can be administered, for example parenterally or orally.
  • the compound of formula (I) will advantageously be used in the form of a soluble salt in an aqueous medium.
  • the salt is preferably formed between a compound of formula (I) and a non-toxic pharmaceutically acceptable base.
  • the composition can be either a solution of the compound in an isotonic aqueous medium in the presence of soluble excipients, or a lyophilizate of the compound to which the dilution solvent is added extemporaneously. These compositions may be injected in the form of an infusion or a bolus depending on the needs of the patient.
  • the orally administrable forms will preferably be presented in the form of a capsule or a tablet containing the compound of the invention milled finely or better, micronized, and mixed with excipients known to those skilled in the art, such as for example, lactose, pregelatinized starch and magnesium stearate.
  • excipients known to those skilled in the art, such as for example, lactose, pregelatinized starch and magnesium stearate.
  • the compound of formula (I) will be used in the form of a soluble salt in an aqueous medium.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for its use for the treatment or prevention of a disease caused by an accumulation of very long chain fatty acids in the body, said composition comprising, as a active molecule, a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, clathrate, hydrate, or polymorph of said compound, and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the invention further relates to a method of treating or preventing a disease caused by a very long chain fatty acid accumulation which comprises administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, clathrate, hydrate, or polymorph of said compound.
  • FIG. 1 illustrates the intracellular quantities, relative to the number of cells, of fatty acids of length C16 to C24 labeled with 4 deuterium atoms and originating from the beta-oxidation of the exotic deuterium-labeled exotic cerotic acid and added in the medium. of culture at a concentration of 20 ⁇ .
  • the black bars correspond to the amounts of fatty acids in healthy fibroblasts having no defect of peroxisome function.
  • the gray bars correspond to the amounts of fatty acids in cells of a patient with peroxisomal Acyl-CoA oxidase 1 dysfunction caused by a genetic mutation. In dark gray, the cells were treated with DMSO (vehicle), in light gray, the cells were treated with niclosamide at a concentration greater than ⁇ .
  • FIG. 2 illustrates the dose-dependent effect of niclosamide on the intracellular quantities of C16 to C24 fatty acids from beta-oxidation of deuterium-labeled cerotic acid (triangles) and the effect of niclosamide on the intracellular amount of naturally occurring cerotic acid (round).
  • FIG. 3 illustrates the measured ratios of the intracellular quantities of C24 / C16, C24 / C18 and C24 / C22 fatty acids, which reflect the peroxisomal beta-oxidation function allowing the catabolism of VLCFAs to shorter fatty acids (C16). and C18).
  • the black bars correspond to the ratios measured in healthy fibroblasts
  • the dark gray and light gray bars correspond to the ratios measured in cells of a patient with a peroxisomal acid-induced Acyl-CoA oxidase 1 dysfunction, treated respectively. by DMSO (vehicle) or niclosamide at a concentration greater than ⁇ .
  • FIG. 4 illustrates the effect of niclosamide as a function of the dose on the ratios of C24 / C16, C24 / C18 and C24 / C22 fatty acids.
  • FIG. 5 illustrates the effect of niclosamide on the ratios of C24 / C16 and C24 / C18 fatty acids in cells having lost their peroxisomal function (triangles) or in healthy cells (round).
  • FIG. 6 illustrates the plasmatic assay of the ⁇ 022, C24 and C26 ⁇ CLCFAs as well as the C24 / C22 and C26 / C22 ratios in a patient with an ACOX1 enzyme deficiency, before and after being treated with niclosamide. The level of these acids and their ratios reflect the function of peroxisomal beta-oxidation.
  • FIG. 7 illustrates the plasma dosage of phytanic branched fatty acids
  • PHY PHY
  • PRI pristanics
  • the left bar (A) represents the average of 5 assays performed in the two years preceding the initiation of treatment with niclosamide
  • the right bar (B) represents the average of 3 assays performed. between the 3rd and 6th month of treatment. Plasma levels are expressed in nmol / mL. The limits above which the concentrations are considered pathological are indicated by red horizontal lines.
  • fibroblasts of patient skin were cultured in culture medium containing DMEM / HAM F10 50/50, 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% antibiotics.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • niclosamide in the form of a solution in 10 mM DMSO (or DMSO for the controls) was added a first time to the culture medium at the desired concentrations. Healthy cells have not been treated.
  • the culture medium was changed again and supplemented with deuterium-labeled cerotic acid at a concentration of 20 ⁇ and alpha-cyclodextrin aiding the solubilization of the concentration of the cerotic acid. 0.3mg / mL.
  • Niclosamide was added a second time at the desired concentrations.
  • the cells were incubated 48h. After the incubation period, the cells were washed with PBS, counted by imaging after labeling the nuclei and lysed by freeze-thaw cycles.
  • the samples were derivatized with dimethylaminoethanol and taken up in acetonitrile before being analyzed by LC-MS / MS.
  • the transitions M RM (acronym for "Multiple Reaction Monitoring") specific fatty acids derivatized by dimethylaminoethanol allow their detection and quantification by mass spectrometry.
  • niclosamide is able to restore normal amounts of the longest fatty acids (C24 and C22) and increase the amounts of fatty acids to 16 and 18 carbon atoms, evidence that VLCFA does not accumulate more in the cells.
  • the non-return to normal levels of C16 and C18 can be explained by the decoupling effect of mitochondria resulting in an increase in oxidation of long-chain fatty acids (C16 and C18) in cells.
  • Figure 2 shows that the effect observed in Figure 1 is dependent on the dose of niclosamide.
  • Figure 2 shows indeed that niclosamide is capable of decreasing the amount of unlabeled C26 cerotic acid and restore a normal amount measured on healthy cells (0.2 on the scale).
  • Figure 3 shows that in the case of loss of peroxisomal function, the ratios C24 / C16, C24 / C18 and C24 / C22 are increased compared to those from healthy cells.
  • Niclosamide capable of correcting the peroxisomal function, significantly decreases these 3 ratios.
  • Figure 4 shows that niclosamide restores the peroxisomal function of affected cells with a dose-dependent effect.
  • the cells were amplified for 3 days.
  • the culture medium was first renewed and niclosamide as a 10 mM DMSO solution (or DMSO for controls) was added at the desired concentrations.
  • the cells were incubated for 48 hours, then the culture medium was renewed a second time with a new addition of niclosamide to the desired concentrations. The cells were incubated 48h.
  • the cells were washed with PBS, counted by imaging after labeling the nuclei and lysed by freeze-thaw cycles.
  • the samples were derivatized with dimethylaminoethanol, taken up in acetonitrile before being analyzed by LC-MS-MS.
  • the specific MRM transitions of dimethylaminoethanol-derivatized fatty acids allow their detection and quantification by mass spectrometry.
  • Figure 5 shows that the effect of niclosamide is specific for cells having lost their peroxisomal function. Cells with normal peroxisomal function are not sensitive to niclosamide. Nicolosamide can restore fatty acid ratios close to those of healthy cells.
  • a patient suffering from an ACOX1 enzyme deficiency was treated long-term with twice-daily dosing (morning and evening) of 500 mg of niclosamide.
  • Plasma assay was performed at regular intervals and evidenced a plasma concentration of niclosamide of the order of 400 nM.
  • Plasma measurements of very long-chain fatty acids (C22, C24, C26), and phytanic (PHY) and pristanic (PRIST) acids were made before and during treatment: 5 assays in the two years preceding initiation treatment, and 3 dosages between 3 rd and 6 th month of treatment. The results are shown in FIGS. 6 and 7.
  • C22, C24, C26 phytanic
  • PHY phytanic
  • PRIST pristanic

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Abstract

L'invention concerne un composé de formule (I): ou un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé, pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une maladie causée par un défaut du catabolisme des acides gras à très longue chaîne du peroxysome.

Description

Composé utile pour le traitement d'un déficit du catabolisme des acides gras à très longue chaîne et composition pharmaceutique comprenant ledit composé La présente invention concerne un composé pour son utilisation dans le traitement, la prévention ou le diagnostic des maladies génétiques provoquant un déficit de catabolisme par oxydation des acides gras à très longue chaîne (AGTLC) dans toutes les cellules de l'organisme et par conséquent une accumulation de ces acides gras, tels que les acides béhénique (acide docosanoïque, C22:0), lignocérique (acide tétracosanoïque, C24:0) et cérotique (acide hexacosanoïque, C26:0). La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant ledit composé.
Les acides gras contenant plus de 22 atomes de carbone (C24:0 et C26:0) ont deux sources : une origine alimentaire et une synthèse endogène. La synthèse des acides gras de taille supérieure à 16 hydrates de carbone est due à un système d'élongation présent à la fois dans les mitochondries et dans les microsomes. Le catabolisme des AGTLC est assuré par le peroxysome, organelle cellulaire dans lequel on retrouve toutes les enzymes assurant la bêta-oxydation des AGTLC.
Il existe des pathologies provoquées par une mauvaise biogénèse du peroxysome empêchant le catabolisme des AGTLC. On les regroupe sous le terme de syndrome de Zellweger (Steinberg et al. 2003). Le syndrome de Zellweger est provoqué par une mutation dans l'une des protéines du peroxysome (peroxines) : PEX1, PEX2, PEX3, PEX5, PEX6, PEX10, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, ou PEX26. On distingue parfois dans cette famille des variants phénotypiques comme l'adrénoleucodystrophie néonatale et le syndrome de Refsum infantile. Ces pathologies se caractérisent et sont diagnostiquées par une accumulation d'AGTLC dans l'organisme.
D'autres pathologies sont provoquées par la perte de fonction d'une seule enzyme peroxysomale. C'est le cas par exemple pour l'adrénoleucodystrophie liée à l'X (Steinberg et al. 1999), provoquée par la perte de fonction du transporteur ABC peroxysomal codé par le gène ABCD1 ; la déficience en ACOX1 (Vanderver et al. 2014) est provoquée par une mutation dans le gène codant pour l'Acyl-CoA oxidase de type 1 ; la déficience en protéine bi-fonctionnelle peroxysomale (HSD17B4) est provoquée par une mutation dans l'enzyme peroxysomale portant les activités énoyl- CoA hydratase et 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase (Vanderver, op. cit.). La perte de fonction d'une de ces enzymes du peroxysome provoque l'accumulation d'AGTLC dans l'organisme.
L'accumulation des AGTLC porte sur toutes les cellules de tous les tissus. On retrouve alors les AGTLC à des niveaux trop élevés dans la circulation sanguine et leur dosage plasmatique fait d'ailleurs partie du diagnostic de ces pathologies. L'accumulation des AGTLC dans certains organes comme par exemple le cerveau, la moelle épinière, les nerfs périphériques ont un impact clinique important. Les symptômes sont notamment neurodégénératifs.
Il n'existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Les seuls traitements disponibles sont symptomatiques. Une étude, menée chez des garçons atteints d'adrénoleucodystrophie liée à l'X présymptomatique, a montré que l'administration d'huile de Lorenzo provoque une réduction de l'acide hexacosanoïque (C26:0) et réduit le risque de développer des anomalies cérébrales décelables à l'IRM (Kaplan et al. 1993). Des essais de traitement par thérapie génique sont également en cours d'expérimentation chez l'homme (Cartier et al. 2012).
Le but de la présente invention est de proposer un composé qui permet de rétablir la fonction catabolique des AGTLC (acides gras en C22, C24 et C26), de réduire ainsi leur accumulation en augmentant les quantités d'acides palmitique et stéarique et de rétablir des quantités normales des acides béhénique, lignocérique et cérotique dans les cellules de l'organisme. Ce composé est susceptible d'être utilisé pour le traitement ou la prévention des maladies causées par l'accumulation d'AGTLC. La présente invention propose donc un composé pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie causée par un défaut de la fonction catabolique des AGTLC du peroxysome, lui-même causé, exclusivement ou non, par une mutation sur les gènes codant pour les peroxines et plus particulièrement sur les gènes codant pour PEX1, PEX2 - PXMP3, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11A, PEX11B, PEX11G, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, PEX28, PEX30 ou PEX31, ou sur les gènes codant une enzyme impliquée dans le catabolisme ou le transport d'AGTLC dont la perte de fonction entraîne une accumulation d'AGTLC, et plus particulièrement les gènes ABCD1, AC0X1 ou le gène codant pour la protéine bi- fonctionnelle peroxysomale HSD17B4 (énoyl-CoA hydratase et 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase), ledit composé étant de formule (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
L'invention propose également un sel, solvate, clathrate, hydrate ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable du composé de formule (I) pour l'utilisation susmentionnée, ainsi qu'un composé susceptible d'être métabolisé par un organisme vivant en un composé de formule (I) ou en sel, solvate, clathrate, hydrate ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé de formule (I), toujours pour l'utilisation susmentionnée.
Le composé selon la présente invention permet de traiter ou de prévenir une maladie causée partiellement ou totalement par un défaut du catabolisme des AGTLC du peroxysome, lui-même causé, exclusivement ou non, par une mutation sur les gènes codant pour les peroxines et plus particulièrement sur les gènes codant pour PEX1, PEX2 - PXMP3, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11A, PEX11B, PEX11G, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, PEX28, PEX30 ou PEX31, ou sur les gènes codant une enzyme impliquée dans le catabolisme ou le transport d'AGTLC dont la perte de fonction entraîne une accumulation d'AGTLC, et plus particulièrement les gènes ABCD1, ACOX1 ou le gène codant pour la protéine bi- fonctionnelle peroxysomale (énoyl-CoA hydratase et 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase). Le composé selon l'invention permet de supprimer ou d'atténuer un ou plusieurs symptômes de cette maladie.
Le composé selon l'invention peut être administré à tout patient atteint d'une maladie telle que définie ci-dessus. Le terme « patient » englobe, au sens de la présente invention, tout être vivant, animal, notamment un mammifère et en particulier un être humain.
Le composé de formule (I) répond au nom chimique de 5-chloro-N-(2-chloro-4- nitrophényl)-2-hydroxybenzamide (CAS n° 50-65-7), et sa dénomination commune internationale est niclosamide. La préparation de ce composé est décrite dans le brevet US 3 079 297.
Le composé de formule (I) peut être utilisé sous la forme de sels avec notamment une base minérale ou organique non toxique, de préférence pharmaceutiquement acceptable. Parmi les bases minérales, on peut utiliser par exemple les hydroxydes de sodium, de potassium, de magnésium ou de calcium. Parmi les bases organiques, on peut utiliser par exemple les aminés, les aminoalcools, des acides aminés basiques tels que la lysine ou l'arginine ou encore des composés porteurs d'une fonction ammonium quaternaire tels que par exemple la bétaïne ou la choline. Les sels du composé de formule (I) avec une base minérale ou organique peuvent être obtenus de façon classique, en utilisant les méthodes bien connues de l'homme de métier, par exemple en mélangeant des quantités stœchiométriques de composé de formule (I) et de la base dans un solvant, tel que par exemple l'eau ou un mélange hydroalcoolique, et en lyophilisant ensuite la solution obtenue.
De manière avantageuse, le composé de formule (I) se présente sous la forme d'un sel avec l'éthanolamine. La préparation de ce sel est décrite par exemple dans le brevet US 3 113 067.
Le terme « polymorphe » désigne, selon la présente invention, toute forme ou mélange de formes amorphe ou cristalline de la molécule active.
Le composé selon l'invention est généralement administré sous la forme d'une composition pharmaceutique en association ou mélange avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables afin d'obtenir des formes administrables par exemple par voie parentérale ou par voie orale.
Dans le cas de formes injectables, on utilisera avantageusement le composé de formule (I) sous forme de sel soluble dans un milieu aqueux. Comme indiqué précédemment, le sel est préférentiellement formé entre un composé de formule (I) et une base non toxique pharmaceutiquement acceptable. La composition peut être soit une solution du composé dans un milieu aqueux isotonique en présence d'excipients solubles, soit un lyophilisât du composé auquel le solvant de dilution est ajouté de façon extemporanée. Ces compositions pourront être injectées sous forme de perfusion ou en bolus en fonction des besoins du patient.
Les formes administrables par voie orale seront de préférence présentées sous forme d'une gélule ou d'un comprimé contenant le composé de l'invention broyé finement ou mieux, micronisé, et mélangé avec des excipients connus de l'homme du métier, tels que par exemple du lactose, de l'amidon prégélatinisé et du stéarate de magnésium. Dans un mode de réalisation avantageux de forme administrable par voie orale, on utilisera le composé de formule (I) sous forme de sel soluble dans un milieu aqueux.
Ainsi, selon un second aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une maladie causée par une accumulation d'acides gras à très longue chaîne dans l'organisme, ladite composition comprenant, en tant que molécule active, un composé de formule (I) ou un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
L'homme du métier est à même de déterminer si une maladie est causée par un défaut de catabolisme des acides gras à très longue chaîne (et donc une accumulation de ces acides gras dans l'organisme). Il est en effet possible d'étudier le catabolisme des acides gras à très longue chaîne par un dosage sanguin des AGTLC et sur une culture de cellules primaires provenant d'une biopsie réalisée chez le patient. Ces tests sont largement décrits dans la littérature et réalisés dans le cadre du diagnostic de telles maladies.
L'invention concerne en outre une méthode de traitement ou de prévention d'une maladie causée par une accumulation d'acides gras à très longue chaîne qui comprend l'administration, à un sujet en ayant besoin, d'une quantité thérapeutiquement efficace, d'un composé de formule (I) ou d'un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé. La présente invention, ses caractéristiques et les divers avantages qu'elle procure sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent et des figures annexées dans lesquelles :
- la Figure 1 illustre les quantités intracellulaires, rapportées au nombre de cellules, des acides gras de longueur C16 à C24 marqués par 4 atomes de deutérium et provenant de la bêta-oxydation de l'acide cérotique exogène marqué au deutérium et ajouté dans le milieu de culture à une concentration de 20 μΜ. Les barres noires correspondent aux quantités d'acides gras dans des fibroblastes sains n'ayant aucun défaut de fonction du peroxysome. Les barres grises correspondent aux quantités d'acides gras dans des cellules d'un patient possédant une dysfonction de l'Acyl-CoA oxydase 1 peroxysomale provoquée par une mutation génétique. En gris foncé, les cellules ont été traitées par le DMSO (véhicule), en gris clair, les cellules ont été traitées par le niclosamide à une concentration supérieure à ΙΟμΜ.
- la Figure 2 illustre l'effet dose-dépendant du niclosamide sur les quantités intracellulaires des acides gras de longueur C16 à C24 provenant de la bêta- oxydation de l'acide cérotique marqué au deutérium (triangles) ainsi que l'effet du niclosamide sur la quantité intracellulaire d'acide cérotique naturellement présent (ronds).
- la Figure 3 illustre les ratios mesurés des quantités intracellulaires d'acides gras C24/C16, C24/C18 et C24/C22 qui sont le reflet de la fonction de bêta-oxydation peroxysomale permettant le catabolisme des AGTLC en acides gras plus courts (C16 et C18). Les barres noires correspondent aux ratios mesurés dans des fibroblastes sains, les barres gris foncé et gris clair correspondent aux ratios mesurés dans des cellules d'un patient possédant une dysfonction de l'Acyl-CoA oxydase 1 peroxysomale provoquée par une mutation génétique, traitées respectivement par du DMSO (véhicule) ou du niclosamide à une concentration supérieure à ΙΟμΜ.
- la Figure 4 illustre l'effet du niclosamide en fonction de la dose sur les ratios d'acides gras C24/C16, C24/C18 et C24/C22.
- la Figure 5 illustre l'effet du niclosamide sur les ratios d'acides gras C24/C16 et C24/C18 dans des cellules ayant perdu leur fonction peroxysomale (triangles) ou dans des cellules saines (ronds). - la Figure 6 illustre le dosage plasmatique des AGTLC {022, C24 et C26) ainsi que les ratios C24/C22 et C26/C22 chez un patient ayant une déficience en enzyme ACOX1, avant et après avoir été traité par le niclosamide. Le niveau de ces acides et leurs ratios reflètent la fonction de beta-oxydation peroxysomale.
- la Figure 7 illustre le dosage plasmatique des acides gras ramifiés phytanique
(PHY) et pristanique (PRI) ainsi que leur ratio chez un patient ayant une déficience en enzyme ACOX1, avant et après avoir été traité par le niclosamide. Le niveau de ces acides et leur ratio reflètent une autre fonction peroxysomale d'oxydation des acides branchés.
Dans les figures 6 et 7, la barre de gauche (A) représente la moyenne de 5 dosages réalisés dans les deux années précédant l'initiation du traitement par le niclosamide, et la barre de droite (B) représente la moyenne de 3 dosages réalisés entre le 3eme et le 6ème mois de traitement. Les niveaux plasmatiques sont exprimés en nmol/mL. Les limites aux dessus desquelles les concentrations sont considérées comme pathologiques sont indiquées par des traits horizontaux rouges.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, ont été mis en œuvre sur des cellules humaines non modifiées issues d'hommes sains (contrôles) d'une part, et d'hommes souffrant d'un défaut de fonction peroxysomale (noté MAP007) d'autre part.
Exemple 1
Des fïbroblastes primaires de peau de patient ont été cultivées dans un milieu de culture contenant du DMEM / HAM F10 50/50, 10% FBS (sérum fœtal bovin) et 1% d'antibiotiques. Lors du premier changement de milieu, le niclosamide, sous forme d'une solution dans le DMSO à lOmM (ou le DMSO pour les contrôles) a été ajouté une première fois au milieu de culture aux concentrations désirées. Les cellules saines n'ont pas été traitées. Après 48h d'incubation, le milieu de culture a été changé à nouveau et complété par de l'acide cérotique marqué au deutérium à la concentration de 20μΜ et de l'alpha-cyclodextrine aidant à la solubilisation de l'acide cérotique à la concentration de 0,3mg/mL. Le niclosamide a été ajouté une seconde fois aux concentrations désirées. Les cellules ont été incubées 48h. Après la période d'incubation, les cellules ont été lavées au PBS, comptées par imagerie après marquage des noyaux et lysées par des cycles de congélation-décongélation. Les échantillons ont été dérivatisés par du diméthylaminoéthanol et repris dans de l'acétonitrile avant d'être analysés par LC-MS/MS. Les transitions M RM (acronyme de l'anglais « Multiple Reaction Monitoring ») spécifiques des acides gras dérivatisés par le diméthylaminoéthanol permettent leur détection et leur quantification par spectrométrie de masse.
Comme le montre la figure 1, le niclosamide est capable de rétablir des quantités normales des acides gras les plus longs (C24 et C22) et d'augmenter les quantités d'acides gras à 16 et 18 atomes de carbone, preuve que les AGTLC ne s'accumulent plus dans les cellules. Le non-retour à la normale des taux de C16 et C18 peut être expliqué par l'effet découplant des mitochondries ayant pour effet une augmentation de l'oxydation des acides gras longs (C16 et C18) dans les cellules.
La figure 2 montre que l'effet observé sur la figure 1 est dépendant de la dose de niclosamide. La figure 2 montre en effet que le niclosamide est capable de diminuer la quantité d'acide cérotique C26 non marqué et d'en rétablir une quantité normale mesurée sur des cellules saines (0,2 sur l'échelle).
La figure 3 montre que dans le cas d'une perte de fonction peroxysomale, les rapports C24/C16, C24/C18 et C24/C22 sont augmentés par rapport à ceux issus de cellules saines. Le niclosamide, capable de corriger la fonction peroxysomale, diminue significativement ces 3 ratios. La figure 4 montre que le niclosamide rétablit la fonction peroxysomale des cellules atteintes avec un effet dépendant de la dose.
Exemple 2
Des fibroblastes primaires ont été cultivés dans un milieu DMEM-HAM F10 50/50, 10% FBS, 1% d'antibiotiques, 2μΜ d'acide cérotique marqué au deutérium et méthyl-bêta-cyclodextrine (6 équivalents par rapport à l'acide cérotique). Les cellules ont été amplifiées pendant 3 jours. Le milieu de culture a été renouvelé une première fois et le niclosamide, sous forme d'une solution dans le DMSO à lOmM (ou le DMSO pour les contrôles) a été ajouté aux concentrations désirées. Les cellules ont été incubées 48h, puis le milieu de culture a été renouvelé une seconde fois avec un nouvel ajout de niclosamide aux concentrations désirées. Les cellules ont été incubées 48h. Après la période d'incubation, les cellules ont été lavées au PBS, comptées par imagerie après marquage des noyaux et lysées par des cycles de congélation-décongélation. Les échantillons ont été dérivatisés par du diméthylaminoéthanol, repris dans l'acétonitrile avant d'être analysés par LC-MS-MS. Les transitions MRM spécifiques des acides gras dérivatisés par le diméthylaminoéthanol permettent leur détection et leur quantification par spectrométrie de masse.
La figure 5 montre que l'effet du niclosamide est spécifique des cellules ayant perdu leur fonction peroxysomale. Des cellules possédant une fonction peroxysomale normale ne sont pas sensibles au niclosamide. Le niclosamide permet de rétablir des ratios d'acides gras proches de ceux des cellules saines.
Exemple 3
Un patient souffrant d'une déficience en enzyme ACOX1 a été traité au long cours avec une prise biquotidienne (matin et soir) de 500mg de niclosamide. Un dosage plasmatique a été réalisé à des intervalles réguliers et a mis en évidence une concentration plasmatique en niclosamide de l'ordre de 400 nM.
Des dosages plasmatiques des acides gras à très longue chaîne (C22, C24, C26), et des acides phytanique (PHY) et pristanique (PRIST), ont été réalisés avant et durant le traitement : 5 dosages dans les deux années précédant l'initiation du traitement, et 3 dosages entre le 3eme et le 6eme mois de traitement. Les résultats sont représentés sur les figures 6 et 7. Chez un patient atteint d'une déficience en enzyme ACOX1, il y a une élévation des concentrations en AGTLC de longueurs C24 et C26 confirmée par des ratios C24/C22 et C26/C22 supérieurs aux limites. Les niveaux d'acides phytanique et pristanique chez ces patients ne dépassent pas les valeurs maximales physiologiques, leur ratio est également normal. Le traitement par le niclosamide chez le patient porteur d'une mutation dans le gène codant pour l'enzyme ACOX1, a permis de diminuer significativement les niveaux de C24 et C26 ainsi que leurs ratios, les ramenant à des valeurs normales (Fig. 6). Les valeurs des acides phytanique et pristanique ont également diminué et illustrent la correction globale de la fonction peroxysomale par le niclosamide.
BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
Composé de formule (I):
Figure imgf000014_0001
ou un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé ;
pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une maladie causée par un défaut du catabolisme des acides gras à très longue chaîne du peroxysome.
2. Composé pour l'utilisation selon la revendication 1, qui est sous la forme d'un sel avec l'éthanolamine.
3. Composé pour l'utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, où ladite maladie est choisie parmi les différents variants phénotypiques du syndrome de Zellweger, l'adrénoleucodystrophie liée à 1 la déficience en Acyl-CoA oxidase de type 1 et la déficience en protéine bifonctionnelle peroxysomale.
4. Composition pharmaceutique pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une maladie causée par un défaut du catabolisme des acides gras à très longue chaîne du peroxysome, ladite composition comprenant, en tant que molécule active, un composé de formule (I) ou un sel, solvate, clathrate, hydrate, ou polymorphe pharmaceutiquement acceptable dudit composé, tel que défini à la revendication 1 ou 2, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
5. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon la revendication 4, où ladite maladie est choisie parmi les différents variants phénotypiques du syndrome de Zellweger, l'adrénoleucodystrophie liée à \ la déficience en Acyl-CoA oxidase de type 1 et la déficience en protéine bifonctionnelle peroxysomale.
6. Composé ou composition pour l'utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, où le défaut du catabolisme des acides gras à très longue chaîne du peroxysome est causé, exclusivement ou non, par une mutation sur un gène codant pour une peroxine.
7. Composé ou composition pour l'utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, où le défaut de catabolisme des acides gras à très longue chaîne du peroxysome est causé, exclusivement ou non, par une mutation sur un gène codant pour une enzyme impliquée dans le catabolisme ou le transport des acides gras à très longue chaîne.
8. Composé ou composition pour l'utilisation selon la revendication 7, où l'enzyme impliquée dans le catabolisme ou le transport des acides gras à très longue chaîne est l'enzyme ACOX1.
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