WO2017196140A2 - 면역 조절 t 세포를 유도하는 락토코커스 락티스 bfe920 균주를 포함하는 수산양식 기능성 사료 첨가제 - Google Patents

면역 조절 t 세포를 유도하는 락토코커스 락티스 bfe920 균주를 포함하는 수산양식 기능성 사료 첨가제 Download PDF

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lactis bfe920
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Immunus Co Ltd
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    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses

Definitions

  • the present invention relates to aquaculture functional feed additive comprising a Lactococcus lactis BFE920 strain for inducing immune regulatory T cells, and specifically, an anti-inflammatory or immuno-promoting composition comprising a Lactococcus lactis BFE920 strain as an active ingredient. And uses thereof.
  • Flounder is the most important fish species in Korean aquaculture.
  • Edward's infectious disease is Edwardsiella tarda
  • the Edwardsiella tarda can be used as a source of epithelium through water from infectious sources (dung, water, mud) under unfavorable environmental conditions such as high water temperature, water deterioration and eutrophication in freshwater or marine fish.
  • Infection through wounds or intestines is known to cause severe systemic bacterial diseases.
  • probiotics have an etymological meaning that is opposed to antibiotics (antibotics), which means antibiotics, and is defined as a microbial agent or microbial component that helps balance microorganisms in the intestine, and is typically a lactobacillus such as Lactobacillus bacteria and bifidus bacteria. This corresponds to this.
  • probiotics are classified as GRAS (generally recognized as safe) because they do not possess toxic genes for humans and animals and do not produce pathogenic substances. Therefore, the development of feed additives using probiotics proved stability has been actively made.
  • Korean Patent Publication No. 10-2011-035554 discloses a novel mixed strain of Bacillus CMB L1 and Lactobacillus CMB201 and antimicrobial and antimicrobial food composition and antimicrobial activity using the same
  • Korean Patent No. 10-0977407 discloses a lytic extract of Zygosaccharomyces bailii which increases various activities of neutrophils, which are the main phagocytic cells of animals, and enhances the nonspecific defense against the challenge of pathogenic bacteria.
  • an animal immunopotentiator and feed additive Disclosed is an animal immunopotentiator and feed additive.
  • the actual immune activity of the feed additives using probiotics is inadequate, and there is still a need for research on feed additives using probiotics having excellent immunological activity.
  • Lactococcus lactis BFE920 has increased anti-inflammatory or regulatory immune T cell activity and intestinal tight junction activity.
  • the present invention was completed by reducing the intestinal permeability and increasing the survival rate of the flounder following infection with the pathogen Edward Siella tarda.
  • One object of the present invention is Lactococcus lactis ) to provide an anti-inflammatory or immune enhancing composition comprising the strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Edward infectious disease of fish comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method of preventing or treating Edward's infection, comprising administering the composition to fish.
  • It is another object of the present invention to provide a feed composition for preventing or improving Edward's infectious disease of fish comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a feed additive composition for preventing or improving Edward infectious disease of fish comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • Lactococcus lactis BFE920 While conducting various studies to find useful probiotics showing anti-inflammatory and immuno-promoting effects, dieted Lactococcus lactis BFE920 on the flounder, anti-inflammatory or regulatory immune T cell activity, intestinal adhesion It was confirmed that synaptic activity increased and intestinal permeability decreased. In addition, as a result of dieting Lactococcus lactis BFE920 in the flounder infected with the pathogen Edwardsiella tarda (Lactococcus lactis BFE920 strain), the intestinal permeability decreased and accordingly increased the survival rate of the flounder. It was found that can be used for anti-inflammatory or immuno-stimulation of fish. Lactococcus lactis BFE920 strain is not known at all until the anti-inflammatory or immuno-promoting effect, it is very significant in that it was first developed by the present inventors.
  • the present invention provides a composition for anti-inflammatory or immune enhancement comprising a lactococcus lactis strain as an active ingredient.
  • Lactococcus is a strain of the lactic acid (lactic acid) bacteria included in the genus Streptococcus Group N1 called a lactic acid bacterium. It is known as a homofermentor which produces the main or sole product of glucose fermentation, specifically lactic acid. These strains are widely used in the dairy industry for producing fermented dairy products such as cheese and yogurt.
  • Lactococcus Lactococcus lactis
  • lactic acid (lactic acid) bacteria belonging to the Lactococcus species, and can be used for the production of industrial dairy products, such as cheese, fermented milk, or lactic casein, and can be used as probiotics.
  • the Lactococcus lactis may be a Lactococcus lactis BFE920 strain deposited with accession number KCCM11383P.
  • Lactococcus lactis BFE920 ( Lactococcus) lactis BFE920) is a Gram-positive bacterium, which means a lactococcus lactis strain isolated from soybean sprouts, and is known to have a strong antibacterial activity against streptococci.
  • the Lactococcus lactis BFE920 strain can increase the relative mRNA expression of IL-10 , CD4-1 , FOXP3 , TGF- ⁇ gene.
  • the Lactococcus lactis BFE920 strain may increase the tight junction activity. Specifically, the Lactococcus lactis BFE920 strain may increase the relative mRNA expression of the occludin gene.
  • the tight junction refers to a cell junction that is responsible for the sealing function.
  • the tight junction activity is increased, neighboring cells adhere to and close the plasma membrane, thereby exhibiting an effect that water-soluble molecules do not leak between cell gaps.
  • the close junction may be connected by sealing the cells between the claudin and the occludin proteins in a chain form.
  • the expression level is increased compared to the control group without lactococcus lactis BFE920 It was confirmed that the Lactococcus lactis BFE920 increased the intestinal tight junction activity (Fig. 3).
  • the Lactococcus lactis BFE920 strain may reduce intestinal permeability.
  • the Lactococcus lactis BFE920 strain may reduce the increased intestinal permeability during pathogen infection.
  • the pathogen may be specifically Edwardsiella tarda , but is not limited thereto, and may be a general pathogen that increases intestinal permeability.
  • anti-inflammatory refers to the action of inhibiting inflammation
  • immune promotion used in the present invention refers to all the phenomena that reinforce the body's defense mechanism against various diseases such as cancer and inflammation in vivo. it means.
  • the immune enhancement may be induced by increased immunoregulatory T cell activity.
  • the immune enhancement can be confirmed by an increase in the relative mRNA expression of IL-10 , CD4-1 , FOXP3 or TGF - ⁇ gene.
  • the immunoregulatory T cells can be largely divided into natrual regulatory T cells and adaptive regulatory T cells according to their origin. Natural regulatory T cells are derived from thymus and express high levels of CD25 and co-signals such as cytotoxic T lymophocyte (CTLA4) or glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein (GITR) and foxp3. In the case of adaptive regulatory T cells, it is known to secrete cytokines such as IL-10 and TGF- ⁇ . In addition, since CD4 and CD25 are expressed in immunoregulatory T cells, the IL-10 , CD4-1 , and FOXP3. Alternatively, the immune enhancing activity can be confirmed by increasing the relative mRNA expression of the TGF- ⁇ gene.
  • CTL4 cytotoxic T lymophocyte
  • GITR glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein
  • the relative mRNA of the gene of IL-10 in the intestine As a result of measuring the expression, it was confirmed that the relative amount of mRNA expression was significantly increased compared to the control group Lactococcus lactis BFE920, it can be seen that the Lactococcus lactis BFE920 has anti-inflammatory activity (Fig. 1 And FIG. 2).
  • the anti-inflammatory or immune enhancement may be characterized in that it is induced in the intestine.
  • the composition may be a feed composition or a feed additive composition.
  • feed means any natural or artificial diet, one meal, or the like or any ingredient of the one meal for the subject organism to eat, ingest, and digest.
  • feed additive refers to a substance added to feed to improve productivity or health of a target organism.
  • a feed composition or a feed additive composition including Lactococcus lactis BFE920 may be used to exhibit anti-inflammatory activity or immunostimulating activity of a target organism.
  • the lactococcus lactis BFE920 of the present invention or its culture may be prepared in the form of powder or granules or 20 to 90 wt% high concentrate.
  • the feed additives include organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate and polyphosphate (polyphosphate), polyphenols, catechins, alpha-tocopherols and rosemary Extracts, vitamin C, green tea extracts, licorice extracts, chitosan, tannic acid, phytic acid, such as any one or more may be further included.
  • the composition When used as a feed, the composition may be formulated in a conventional feed form and may include common feed ingredients.
  • the feed additives and feeds are cereals, for example milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feed, such as feed consisting mainly of rapeseed, soybean, and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Sugar and dairy products, for example, may further include a dry ingredient consisting of various powdered milk and whey powder, and may further include a nutritional supplement, digestion and absorption enhancer, growth promoter and the like.
  • the feed additive may be administered alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additive may be easily administered to the animal as a top dressing or directly mixed into the animal feed or in an oral formulation separate from the feed.
  • the feed additive can be prepared in immediate release or sustained release formulation, in combination with a pharmaceutically acceptable edible carrier, as is well known in the art.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier may be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet or top dressing in microdisperse form.
  • the feed additive may be a gelatin soft capsule or a formulation of syrup or suspension, emulsion, or solution.
  • the feed may comprise any protein-containing organic flour commonly used to meet the dietary needs of the animal.
  • protein-containing flours typically consist primarily of corn, soy flour, or corn / bean flour mixtures.
  • the feed additives and feed may contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifiers, solution promoters and the like.
  • the feed additive may be used by adding to animal feed by infiltration, spraying or mixing.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Edward infectious disease of fish comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • the fish may be one or more fish selected from the group consisting of eel, flounder (flatfish), skinfish rock, rockfish, black sea bream, red sea bream, trout, mullet, sea bass, roe, mackerel, horse mackerel or fish.
  • Edwardsiella tarda is Edwardsiella tarda belonging to the intestinal bacterial family.
  • tarda refers to a fish disease caused by the fungus, which usually occurs from early summer to autumn, which is a high temperature, and does not cause mass mortality in a short period of time, but can cause mortality over a long period of time.
  • Edward infectious disease can cause a great economic loss to the flounder farming industry, the most important fish species in Korean aquaculture.
  • the flounder infected with Edward's disease is characterized by abdominal bloating and hernia, characterized by bloody or venous fluids in the ascites, pus in the liver, thickening of the liver, and enlargement of the liver and kidneys, accompanied by meningitis. have.
  • the Edward Siela tarda is a Gram-negative bacterium, has a wide survival range such as temperature 14 ° C. to 45 ° C., pH 4.0 to pH 10.0, and sodium chloride 0 to 4%, and is a conditional pathogen so that it is completely eliminated or thoroughly infected. It is difficult to prevent.
  • Edward Siela Tarda is a serious systemic bacterial disease caused by infection of epithelial wounds or intestines through water from infectious agents (feces, water, mud) under inadequate environmental conditions such as high water temperature, water deterioration and eutrophication in freshwater or marine fish worldwide. It is known to cause.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays Edward infectious disease by administration of a composition comprising the Lactococcus lactis BFE920.
  • treatment refers to any action in which Edward infection is improved or cured by administration of a composition comprising the Lactococcus lactis BFE920.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable in the present invention means to exhibit properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.
  • the carrier can be used without limitation so long as it is known in the art such as buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants.
  • compositions of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • it may be used in the form of an external preparation for skin in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel or gel.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, and the like in the Lactococcus lactis BFE920 strain. , Sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and that does not cause side effects.
  • the severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including the drug being used in combination or co-administration, and other factors well known in the medical art can be determined.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered in single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or type of substance used as an active ingredient of the patient.
  • a pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 100 mg / kg, specifically 1 ng to about 10 mg / kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention Is not particularly limited thereto, but may be administered once a day or several times by dividing the dose.
  • the dosage may vary depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention by any method.
  • the present invention provides a feed composition for preventing or improving Edward infectious disease of fish comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • Lactococcus lactis BFE920 fish, Edward infectious disease, prevention or feed is as described above.
  • the term “improvement” refers to any action in which administration of a composition comprising the Lactococcus lactis BFE920 improves or benefits the suspected and infectious individual of Edward's infection.
  • the present invention provides a method for preventing or treating Edward's infection, comprising administering to a fish a composition comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • Edward infectious disease, fish, prevention or treatment is as described above.
  • the term "administration" refers to the introduction of certain substances into fish in any suitable manner, and the route of administration of the composition may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • Intraperitoneal administration intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration, rectal administration, but is not limited thereto. Specifically, oral administration.
  • the present invention provides a feed additive composition for preventing or improving Edward's infectious disease of fish comprising Lactococcus lactis BFE920 strain (Accession Number: KCCM11383P) as an active ingredient.
  • Lactococcus lactis BFE920 fish, Edward infectious disease, prevention, improvement or feed additives is as described above.
  • the composition comprising Lactococcus lactis BFE920 has an anti-inflammatory or immunostimulating effect
  • the composition may be used as a feed composition or a feed additive capable of enhancing anti-inflammatory or immunity of an individual.
  • Lactococcus lactis BFE920 Lactococcus on the flounder When lactis BFE920
  • the expression after the elapse of 48 hours and 72 hours the intestines CD4-1, IL-10, TGF - ⁇ 1 And FOXP3 It is a graph confirming the mRNA expression relative to the gene.
  • Figure 2 is a graph confirming the relative mRNA expression of CD4-1 , IL-10 , TGF- ⁇ 1 and FOXP3 gene in the intestine after 30 days of lactococcus lactis BFE920 on the flounder.
  • 3 is a graph confirming the relative mRNA expression of the occludin gene in the intestine after dieting Lactococcus lactis BFE920 for 30 days.
  • Figure 4 is a graph confirming the intestinal permeability after dieting Lactococcus lactis BFE920 for 30 days on the flounder.
  • 5 is a graph confirming the intestinal permeability after 72 hours after oral infection with Edwardsiella tarda the day after dieting Lactococcus lactis BFE920 on the flounder for 30 days.
  • Figure 6 is a graph confirming the survival rate for 20 days after oral infection with Edward Siela tarda the day after the diet of Lactococcus lactis BFE920 for 30 days.
  • flounder (42.7 ⁇ 1.61 g) was maintained in a fish tank containing 300 L of seawater and adapted at 18 ° C for 7 days before the experiment.
  • Lactococcus lactis BFE920 Lactococcus lactis BFE920 was divided into an undietized flounder group (control group) and a lactococcus lactis BFE920 dieted flounder group (dietary group), and the lactococcus lactis BFE920 was fed twice a day in an ad libitum .
  • a commercial blend EP, Flounder Bluechip; WOOSUNGFEED Co. Ltd., Daejeon, Korea
  • the diet group was fed a compound feed coated with Lactococcus lactis BFE920 of 10 7 CFU / g.
  • RNA and synthesize cDNA in the intestine of the dietary group and the control group of Example 1 After RNA extraction from the posterior tissue of the flounder, cDNA was synthesized using the RNA as a template.
  • RNAlater ® Life technology, USA
  • homogenized using a T10 basic handheld homogenizer IKA®, China
  • the homogenized solution was isolated from RNA using AllPrep DNA / RNA / Protein Mini KiT, and cDNA was synthesized using SuperScript® III reverse transcriptase (Invitrogen, USA) as the RNA template.
  • qRT-PCR was performed using the cDNA synthesized according to Example 3.1 as a template.
  • PCR cycle was carried out in the following process. First, 10 cycles of denaturation at 94 ° C., denaturation for 15 seconds at 94 ° C., annealing and extension for 42 seconds at 62 ° C. were repeated 40 times. It was. The qRT-PCR results of the second control using the ⁇ -actin ⁇ CT - shows the relative mRNA expression in ⁇ CT method.
  • primers used in the qRT-PCR are as follows.
  • Example 2.3 Lactococcus Lactis BFE920 Dietary Anti-inflammatory and Immune Regulatory T Cell Activity Induced at Early Stage
  • Lactococcus lactis BFE920 To determine the effect of Lactococcus lactis BFE920 on anti-inflammatory and immunoregulatory T-cell activity in the early stages after dieting Lactococcus lactis BFE920 on the flounder, every 48 and 72 hours after Lactococcus lactis BFE92 diet.
  • CD4-1 , IL-10 , TGF - ⁇ 1 in the Intestine of the Diet And relative mRNA expression of the FOXP3 gene was confirmed and compared to Lactococcus lactis BFE920 compared to the control diet.
  • cDNA was synthesized using RNA obtained by extracting the posterior tissue by the method of Example 2.1 and Example 2.2, and as a template, qRT-PCR was performed to confirm relative mRNA expression for each gene.
  • the relative mRNA expression of the CD4-1 gene was about 2 times compared to the control group, IL-10 , TGF - ⁇ 1 And it was confirmed that the relative mRNA expression of the FOXP3 gene is increased by about three times or more compared to the control (Fig. 1).
  • Lactococcus lactis BFE920 in the flounder by feeding the CD4-1, IL-10, TGF - ⁇ 1 in the intestine And FOXP3 It was confirmed that relative mRNA expression of the gene was increased compared to the control group, and it was found that the anti-inflammatory and immunoregulatory T cell activity was induced by the diet of Lactococcus lactis BFE920 in the flounder.
  • Example 2.4 Lactococcus Lactis BFE920 For 30 days Dietary Post-induced Anti-inflammatory and Immune Regulatory T Cell Activity
  • lactococcus lactis BFE920 was fed on the flounder for 30 days, the effects of lactococcus lactis BFE920 on anti-inflammatory and immune regulatory T cells were confirmed.
  • Lactococcus lactis BFE920 induces anti-inflammatory activity and activity of immune regulatory T cells.
  • Example 3.1 Lactococcus Lactis BFE920 For 30 days Dietary Close contact activity
  • lactococcus lactis BFE920 was fed on the flounder for 30 days, the effect of lactococcus lactis BFE920 on the intimate splicing activity in the intestinal lining was confirmed.
  • OF-OCLN-RT-F (5'-TCTTTGCTCTAGAGACCCGC-3 ', SEQ ID NO: 11) and OF-OCLN-RT-R (5) as a primer for the occludin gene shows the relative mRNA expression in ⁇ CT method - were used for '-ATTGTTCACCCATGCCTCCA-3', SEQ ID NO: 12), using a second control group of ⁇ -actin ⁇ CT.
  • Lactococcus lactis BFE920 increased the intestinal tight junction activity in the flounder.
  • Example 3.2 Lactococcus Lactis BFE920 For 30 days Dietary Intestinal transmittance after
  • lactococcus lactis BFE920 was fed on the flounder for 30 days, it was confirmed that the intimate splicing activity was increased in the intestinal lining. Thus, it was confirmed whether the lactococcus lactis BFE920 had an effect on the intestinal permeability.
  • FITC-dex 4 kDa fluorescein isothiocyanate-dextran 4,000 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
  • the enteric permeability experiment was performed as follows. After lactococcus lactis BFE920 was fed for 30 days and then starved for 6 hours, 500 mg / kg of FITC-dex 4 kDa was injected into the control and diet groups by oral gavage. After one hour, 600 uL of blood sample was collected from the flounder into 1.5 mL microtubes. Plasma samples were obtained by centrifuging the blood samples at 13000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes and diluted with phosphate buffered saline (PBS) in a 1: 1 ratio. 100 uL of the diluted plasma sample was placed in a Corning TM Costar TM 96-well black solid plate (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). The fluorescence intensity of each sample was measured using a VICTOR 2 D fluorometer in the range of 485 nm / 535 nm.
  • VICTOR 2 D fluorometer in the range of 485 nm / 535 nm
  • the intestinal permeability was 2.30 ⁇ 0.02 ug / mL after lactococcus lactis BFE920 was fed on the flounder for 30 days, which was significantly lower than the control group showing 4.16 ⁇ 0.23 ug / mL (Fig. 4).
  • Example 3.3 Lactococcus Lactis BFE920 For 30 days Dietary after Edward Ciel La tarda ( Edwardsiella tarda Intestinal Permeability Following Oral Infection of
  • Edward Ciella Tarda is a Gram-negative pathogen with lipopolisaccahride (LPS) and has the ability to induce inflammation in the intestine, so it was selected as a pathogen and the effect of Lactococcus lactis BFE920 on the intestinal permeability following infection of the pathogen. It was confirmed.
  • LPS lipopolisaccahride
  • Lactococcus lactis BFE920 was infected with the pathogen the day after the diet for 30 days, and then enteric permeability was measured using FITC-dex 4 kDa at 72 hours. On the other hand, lactococcus lactis BFE920 was used as a control for flounder infected with the pathogen the next day without dieting for 30 days.
  • Infection of the pathogen Edward Siela tarda was performed as follows. First, Edward Ciella tar was incubated overnight at 30 °C, 200 rpm in brain heart infusion (BHI) medium (Beckton, Dickinson and Company, Sparks, USA). After 31 days of diet, 72 hours of randomly selected flounder in each group were inoculated with Edward Siella tarda (1-2 X 10 5 CFU / g fish) overnight, followed by infection for 72 hours. Intestinal permeability experiment was carried out by the method of Example 3.2.
  • BHI brain heart infusion
  • the intestinal permeability of the diet group was 72.35 hours after oral infection of Lactococcus lactis BFE920 and oral infection of Edwardsielella tarda the next day.
  • the plasma FITC-dex 4 kDa value was 2.35 ⁇ 0.04.
  • Intestinal permeability of the control group after 72 hours of oral infection of Lactococcus lactis BFE920 at ug / mL for 30 days without oral infection with Edwardsielella tarda the next day (value of plasma FITC-dex 4 kDa: 14.98 ⁇ 3.95 ug / mL) was confirmed to decrease (FIG. 5).
  • Lactococcus lactis BFE920 showed an intestinal membrane function improvement effect by restoring the increase of intestinal permeability induced by pathogens through the diet of Lactococcus lactis BFE920.
  • Lactococcus lactis BFE920 on disease resistance caused by the pathogen Edward Siela tarda infection was confirmed.
  • the survival rate for 20 days after oral infection of the pathogen was measured the day after 30 days of lactococcus lactis BFE920 on the flounder.
  • the lactococcus lactis BFE920 without diet for 30 days was used as a control flounder infected with pathogens.
  • the infection of Edwardsielella tarda was infected by feeding Lactococcus lactis BFE920 for 30 days and orally administering 20 flounder randomly selected for each group on day 31.
  • Two-way ANOVA with Bonferroni's posttest was used to evaluate the qRT-PCR using early flounder after lactococcus lactis BFE920.
  • the survival rate according to oral infection of Edward Siela tarda was represented by a survival curve, and the evaluation of the effectiveness of the survival curve was performed by a Log-rank (Mantel-Cox) test.

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Abstract

본 발명은 면역 조절 T 세포를 유도하는 락토코커스 락티스 BFE920 균주를 포함하는 수산양식 기능성 사료첨가제에 관한 것으로, 구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920 균주를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 면역 증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 락토코커스 락티스 BFE920를 포함하는 조성물이 항염증 또는 면역증진효과를 가지므로, 상기 조성물을 이용하면 개체의 항염증 또는 면역을 증진시킬 수 있는 사료 조성물 또는 사료 첨가제로써 이용될 수 있다.

Description

면역 조절 T 세포를 유도하는 락토코커스 락티스 BFE920 균주를 포함하는 수산양식 기능성 사료 첨가제
본 발명은 면역 조절 T 세포를 유도하는 락토코커스 락티스 BFE920 균주를 포함하는 수산양식 기능성 사료첨가제에 관한 것으로, 구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920 균주를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 면역증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
넙치는 한국 수산양식에서 가장 중요한 어종이다. 다만, 수산양식의 경우 제한된 공간에서 양식이 이루어지는 바, 집단 폐사 등의 우려가 존재한다. 특히, 에드워드 감염증은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 균에 의해 유도되는 질병으로, 상기 에드워드시엘라 타르다는 세계적으로 담수어나 해산어에서 고수온, 수질악화, 부영양화와 같은 부적합한 환경 조건 아래에서 감염원(배설물, 물, 진흙)으로부터 물을 통하여 상피의 상처 또는 장을 통해 감염되어 심각한 전신성 세균성 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다.
한편, 프로바이오틱스는 항생물질을 의미하는 항생제(antibotics)와는 대립되는 어원적 의미를 가지는 것으로 장내의 미생물 균형에 도움을 주는 미생물 제제 또는 미생물 성분으로 정의되며, 대표적으로 락토바실러스균과 비피더스균 등의 유산균이 이에 해당한다. 또한, 프로바이오틱스는 사람과 동물에 대한 독성유전자를 보유하지 않고, 병원성 물질 또한 생산하지 않아 GRAS(generally recognized as safe)로 분류된다. 따라서, 안정성이 입증된 프로바이오틱스를 이용한 사료 첨가제의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
일 예로, 국내공개특허 제10-2011-035554호는 신규한 바실러스 속 CMB L1 및 락토바실러스 속 CMB201의 혼합균주 및 이를 이용한 항암 및 면역증강용 식품 조성물 및 항균활성이 있는 미생물 제제를 개시하고 있으며, 국내등록특허 제10-0977407호는 동물의 주요 탐식세포인 호중구의 각종 활성을 증가시키고 병원성 세균의 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 자이고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii)의 용균 추출물을 함유하는 동물용 면역증강제 및 사료첨가제를 개시하고 있다. 그러나, 프로바이오틱스를 이용한 사료첨가제의 실제 면역활성은 미비하여, 여전히 면역활성이 우수한 프로바이오틱스를 이용한 사료첨가제에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항염증 및 면역증진 효과를 갖는 사료 첨가제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920(Lactococcus lactis BFE920)가 항염증 또는 조절 면역 T 세포활성, 장내 밀착 연접 활성이 증가시키고, 장내 투과율을 감소시키며, 병원균인 에드워드시엘라 타르다의 감염에 따른 넙치의 생존율을 증가시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 에드워드 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 항염증 및 면역증진 효과를 나타내는 유용한 프로바이오틱스를 찾고자 다양한 연구를 수행하던 중, 락토코커스 락티스 BFE920(Lactococcus lactis BFE920)를 넙치에 식이한 결과, 항염증 또는 조절 면역 T 세포활성, 장내 밀착 연접 활성이 증가하고, 장내 투과율이 감소함을 확인하였다. 또한, 병원균인 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)이 감염된 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920를 식이한 결과, 장내 투과율이 감소하고 이에 따라 넙치의 생존율을 증가함을 확인하여, 락토코커스 락티스 BFE920 균주가 어류의 항염증 또는 면역증진을 위하여 사용될 수 있음을 규명하였다. 락토코커스 락티스 BFE920 균주가 항염증 또는 면역증진 효과를 나타내는 것은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 최초로 개발되었다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 하나의 양태로서, 본 발명은 락토코커스 락티스 균주를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "락토코커스(Lactococcus)"는 일명 젖산균이라 불리는 스트렙토코커스 그룹 N1 속(genus Streptococcus Group N1)에 포함되는 락트산(젖산) 박테리아 속 균주이다. 글루코스 발효의 주된 또는 유일한 생산물, 구체적으로 락트산을 생산하는 호모퍼멘터(homofermentor)로 알려져 있다. 이들 균주는 치즈, 요구르트 등의 발효 유제품을 생산하는 낙농산업에 널리 사용되고 있다.
상기 "락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)"는 상기 락토코커스 종에 속하는 락트산(젖산) 박테리아 속 균주의 하나로, 산업적 유제품 즉, 치즈, 발효우유, 또는 유산 카제인의 생산에 이용될 수 있고, 프로바이오틱스로써 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 락토코커스 락티스는 기탁번호 KCCM11383P로 기탁된 락토코커스 락티스 BFE920 균주일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "락토코커스 락티스 BFE920(Lactococcus lactis BFE920)"은 그램-양성균으로, 콩나물에서 분리된 락토코커스 락티스 균주를 의미하며, 연쇄상구균류에 대해 강한 항균활성을 가짐이 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 IL-10, CD4-1, FOXP3, TGF-β 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후 48시간 및 72시간 경과시 장내 CD4-1, IL-10, FOXP3 또는 TGF -β 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 측정한 결과, 48시간 및 72시간 경과시 CD4-1, IL-10, FOXP3 또는 TGF-β 유전자의 상대적인 mRNA 발현이 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군에 비해 상기의 상대적인 mRNA 발현량이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 1). 또한, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이 한 후, 장내 IL-10, CD4-1, FOXP3, TGF -β의 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군에 비해 상기의 상대적인 mRNA 발현량이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 2). 따라서, 상기 락토코커스 락티스 BFE920이 면역 조절 T 세포의 활성을 증가시켜 면역 증진 활성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 밀착연접 활성을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 occludin 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 밀착연접은 밀봉 기능을 담당하는 세포 연접을 의미하는 것으로, 밀착연접 활성이 증가되는 경우, 이웃하는 세포끼리 원형질막이 밀착, 폐쇄되어 수용성 분자들이 세포 틈 사이로 누출되지 않는 효과를 나타낸다. 상기 밀착연접은 클라우딘(claudin)과 오클루딘(occludin) 단백질이 사슬 형태로 배열되어 두 세포 사이를 밀봉함으로써 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 장내 occludin 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군에 비해 발현량이 증가함을 확인하여 상기 락토코커스 락티스 BFE920이 장내 밀착 연접 활성을 증가시킴을 알 수 있었다(도 3).
본 발명에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 장 내 투과율을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 장내 투과율을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군에 비해 투과율이 감소함을 확인하여 락토코커스 락티스 BFE920이 장내 투과율을 감소시킴을 알 수 있었다(도 4). 또한, occludin 유전자의 상대적인 mRNA 발현의 증가에 따른 밀착연접 활성이 증가함을 확인하였으므로, 락토코커스 락티스 BFE920이 밀착연접을 증가시켜 장내 투과율이 감소됨을 알 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 병원균 감염시 증가된 장내 투과율을 감소시킬 수 있다.
상기 병원균은 구체적으로 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 장내 투과율을 증가시키는 일반적인 병원균일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 에드워드시엘라 타르다를 경구감염시켜 장내 투과율을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하지 않고, 에드워드시엘라 타르다만을 경구감염시킨 대조군에 비해 장내 투과율이 감소함을 확인하여, 락토코커스 락티스 BFE920이 장내막 기능 개선효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 5).
본 발명에서 사용된 용어 "항염증"은 염증을 억제하는 작용을 의미하고, 본발명에서 사용된 용어 "면역증진"은 생체 내 암, 염증 등 다양한 질환에 대한 신체 방어기전을 보강하는 모든 현상을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 증진은 면역조절 T 세포 활성 증가로 유도되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 면역 증진은 IL-10, CD4-1, FOXP3 또는 TGF -β 유전자의 상대적인 mRNA 발현의 증가로 확인할 수 있다.
상기 면역조절 T 세포는 크게 기원에 따라 natrual regulatory T 세포와 adaptive regulatory T 세포로 구분될 수 있다. natural regulatory T 세포의 경우, thymus로부터 유도되어 높은 수준의 CD25와 cytotoxic T lymophocyte(CTLA4)나 glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein(GITR)과 같은 공동-신호전달 물질 및 foxp3를 발현하고 있다. adaptive regulatory T 세포의 경우, IL-10 및 TGF-β와 같은 사이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있다. 또한, 면역조절 T 세포는 CD4 및 CD25이 발현되어 있으므로, 상기 IL-10, CD4-1, FOXP3 또는 TGF-β 유전자의 상대적인 mRNA 발현의 증가를 통해 면역 증진활성을 확인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하고 48시간 및 72시간 경과시 또는 락토코커스르 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후, 장 내 IL-10의 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군과 비교하여 상대적인 mRNA 발현량이 유의하게 증가함을 확인하여, 상기 락토코커스 락티스 BFE920이 항염증 활성을 가짐을 알 수 있었다(도 1 및 도 2).
본 발명의 일 실시예에서, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후 48시간 및 72시간 경과시 장내 CD4-1, IL-10, FOXP3 또는 TGF-β 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 측정한 결과, 48시간 및 72시간 경과시 CD4-1, IL-10, FOXP3 또는 TGF-β 유전자의 상대적인 mRNA 발현이 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군에 비해 상기의 상대적인 mRNA 발현량이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 1). 또한, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이 한 후, 장내 IL-10, CD4-1, FOXP3, TGF-β의 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군에 비해 상기의 상대적인 mRNA 발현량이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 2). 따라서, 상기 락토코커스 락티스 BFE920이 면역 조절 T 세포의 활성을 증가시켜 면역 증진 활성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항염증 또는 면역 증진은 장 내에서 유도되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "사료"는 대상생물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "사료첨가제"는 대상생물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해서 사료에 첨가되는 물질을 의미한다.
본 발명에서는 락토코커스 락티스 BFE920을 포함하는 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 사용하여 대상생물의 항염증 활성 또는 면역증진 활성을 나타낼 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 본 발명의 락토코커스 락티스 BFE920 또는 이의 배양물은 20 내지 90wt% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.
또한, 상기 사료 첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침투,분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
다른 하나의 양태로, 본 발명은 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 어류는 뱀장어, 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이 또는 쥐치로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 어류일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "에드워드 감염증"는 장내 세균과에 속하는 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 균에 의해서 발병하는 어류질환을 의미하는 것으로, 주로 고수온기인 초여름에서 가을까지 발생하고, 단기간에 대량폐사를 유발하지는 않지만, 장기간에 걸쳐 폐사를 가져올 수 있다. 상기 에드워드 감염증은 한국 수산양식에서 가장 중요한 어종인 넙치의 양식 산업에 큰 경제적 손실을 가져올 수 있다. 에드워드 감염증에 감염된 넙치는 복부팽만과 탈장이 특징적인 증상으로 나타나며, 복수에 혈액이 섞여있거나 유상으로 농이 관찰되고, 간은 갈색으로 고름집이 형성되며, 간, 신장은 비대하고 수막염을 수반할 수 있다.
상기 에드워드시엘라 타르다는 그람음성 세균이고, 온도 14 ℃ 내지 45 ℃, pH 4.0 내지 pH 10.0, 및 염화나트륨 0 내지 4 % 와 같이 넓은 생존 범위를 갖으며, 조건성 병원체이므로 완전히 제거하거나 감염을 철저하게 예방하기 어려운 특징을 갖는다. 에드워드시엘라 타르다는 세계적으로 담수어나 해산어에서 고수온, 수질악화, 부영양화와 같은 부적합한 환경 조건 아래에서 감염원 (배설물, 물, 진흙)으로부터 물을 통하여 상피의 상처 또는 장을 통해 감염되어 심각한 전신성 세균성 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 일 실시예에서 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 에드워드시엘라 타르다를 감염시켜 생존율을 측정한 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하지 않고, 에드워드시엘라 타르다만을 감염시킨 대조군에 비해 생존율이 유의하게 증가됨을 확인하였다. 따라서, 락토코커스 락티스 BFE920이 에드워드시엘라 타르다로 유도되는 증상 및 폐사를 지연시키고 에드워드 감염증에 치료에 효과적임을 알 수 있었다(도 6).
본 발명에서 사용된 용어 "예방"은 상기 락토코커스 락티스 BFE920을 포함하는 조성물의 투여로 에드워드 감염증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 상기 락토코커스 락티스 BFE920을 포함하는 조성물의 투여로 에드워드 감염증이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 구체적으로 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 달라질 수 있으므로, 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로, 본 발명은 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 락토코커스 락티스 BFE920, 어류, 에드워드 감염증, 예방 또는 사료에 대한 정의는 상기한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "개선"은 상기 락토코커스 락티스 BFE920을 포함하는 조성물의 투여로 에드워드 감염증 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
다른 하나의 양태로, 본 발명은 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 에드워드 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 에드워드 감염증, 어류, 예방 또는 치료에 대한 정의는 상기한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 어류에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로 경구투여일 수 있다.
다른 하나의 양태로, 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
상기 락토코커스 락티스 BFE920, 어류, 에드워드 감염증, 예방, 개선 또는 사료 첨가제에 대한 정의는 상기한 바와 같다.
본 발명은 락토코커스 락티스 BFE920를 포함하는 조성물이 항염증 또는 면역증진효과를 가지므로, 상기 조성물을 이용하면 개체의 항염증 또는 면역을 증진시킬 수 있는 사료 조성물 또는 사료 첨가제로써 이용될 수 있다.
도 1은 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920(Lactococcus lactis BFE920)을 식이 후 48시간 및 72시간 경과시 장내 CD4-1, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자에 대한 상대적인 mRNA 발현을 확인한 그래프이다.
도 2은 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이 후 장 내 CD4-1, IL-10, TGF-β1 및 FOXP3 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 확인한 그래프이다.
도 3는 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이 후 장 내 occludin 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 확인한 그래프이다.
도 4는 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이 후 장 내 투과율을 확인한 그래프이다.
도 5은 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 다음날 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)를 경구감염시킨 후 72시간 경과시 장 내 투과율을 확인한 그래프이다.
도 6은 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 다음날 에드워드시엘라 타르다를 경구감염시킨 후 20일 동안 생존율을 확인한 그래프이다.
이하, 하기 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험동물의 사육 및 식이
본 발명에 사용될 실험동물은 다음과 같이 사육시켰다.
구체적으로, 넙치 (42.7 ± 1.61 g)는 300L의 해수가 담긴 어항에서 유지시켰고, 실험 진행 전, 7일 동안 18 ℃에서 적응시켰다.
또한, 락토코커스 락티스 BFE920(Lactococcus lactis BFE920)을 식이하지 않은 넙치군(대조군)과 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 넙치군(식이군)으로 나누어 상기 락토코커스 락티스 BFE920을 임의량(ad libitum)으로 하루에 두 번씩 식이하였다. 대조군의 경우, 상업적인 배합사료(EP, Flounder Bluechip; WOOSUNGFEED Co. Ltd., Daejeon, Korea)를 식이하였고, 식이군은 107 CFU/g의 락토코커스 락티스 BFE920이 코팅된 배합사료를 식이하였다.
실시예 2. 락토코커스 락티스 BFE920의 식이에 따라 유도되는 항염증 및 면역조절 T 세포의 활성
실시예 2.1: RNA 추출 및 cDNA 합성
실시예 1의 식이군 및 대조군의 장에서 RNA 추출 및 cDNA를 합성하기 위하여, 넙치의 후장조직으로부터 RNA 추출한 후, 상기 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하였다.
구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 넙치의 초기단계에서 항염증 활성 및 면역조절 T 세포의 활성을 확인하기 위하여, 락토코커스 락티스 BFE920을 넙치에 식이한 후, 48시간 및 72시간 경과시에 해당하는 식이군 및 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군을 4마리씩 희생시켰다. 또한, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 넙치의 항염증 활성 및 면역조절 T 세포의 활성을 확인하기 위하여는, 락토코커스 락티스 BFE920를 30일 동안 식이한 식이군 및 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군을 3마리씩 희생시켰다.
다음으로, 각 군의 후장조직을 750 mL RNAlater® (Life technology, USA) 용액이 포함된 1.5 mL 마이크로튜브에 넣어 후장조직 샘플을 제조한 후, 10 mg의 후장조직 샘플을 350 uL의 RLT buffer(AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit, Qiagen, USA)에 넣고, T10 basic handheld homogenizer (IKA®, 중국)을 사용하여 균질화시켰다. 상기 균질화된 용액은 AllPrep DNA/RNA/Protein Mini KiT를 사용하여 RNA를 분리한 후, 상기 RNA를 주형으로 SuperScript® III reverse transcriptase (Invitrogen, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
실시예 2.2: 합성된 cDNA를 이용한 정량적 실시간 PCR 분석
상기 식이군 및 대조군의 장에서 상대적인 mRNA 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3.1에 따라 합성된 cDNA를 주형으로 qRT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 각 군의 넙치 조직으로부터 합성된 20 ng의 cDNA을 주형으로 프라이머를 사용하여 최종 반응량을 20 uL로 하여 증폭시켰고, 이때 사용한 기기는 Applied Biosystems 7500 PCR System (Life Technology, USA)를 사용하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 과정으로 수행하였다. 먼저, 94 ℃에서 10분 동안 변성(denaturation)시키고, 94 ℃에서 15초 동안의 변성(denaturation), 62 ℃에서 42초 동안의 결합(annealing) 및 연장(extension)을 포함하는 사이클을 40번 반복하였다. 이에 따른 qRT-PCR 결과는 대조군인 β-actin ΔCT를 이용한 2-△CT 방법으로 상대적인 mRNA 발현으로 나타내었다.
또한, 상기 qRT-PCR에 사용된 프라이머는 하기와 같다.
Figure PCTKR2017004974-appb-T000001
실시예 2.3: 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후 초기단계에서 유도되는 항염증 및 면역 조절 T 세포의 활성
넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후 초기단계에서 락토코커스 락티스 BFE920이 항염증 및 면역 조절 T 세포의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 락토코커스 락티스 BFE92 식이 후 48시간 및 72시간마다 식이군의 장에서 CD4-1, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 확인하고, 이를 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군과 비교하였다.
구체적으로, 실시예 2.1 및 실시예 2.2의 방법으로 후장조직을 추출하여 얻어진 RNA로 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로, qRT-PCR을 수행하여, 각 유전자에 대한 상대적인 mRNA 발현을 확인하였다.
실험결과, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후 48시간 경과시 상기 CD4-1, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자에 대한 상대적인 mRNA 발현이 대조군과 비교하여 증가됨을 확인하였고, 특히 IL-10 유전자에 대한 상대적인 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 약 6배 이상 증가됨을 확인하였다(도 1).
또한, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후, 72시간 경과시 CD4-1 유전자의 상대적인 mRNA 발현이 대조군과 비교하여 약 2배, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자의 상대적인 mRNA 발현이 대조군과 비교하여 약 3배 이상 증가됨을 확인하였다(도 1).
따라서, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하여 장 내 상기 CD4-1, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자의 상대적인 mRNA 발현이 대조군에 비해 증가됨을 확인하여, 넙치에서 락토코커스 락티스 BFE920의 식이에 따라 항염증 및 면역 조절 T 세포의 활성 증가가 유도됨을 알 수 있었다.
실시예 2.4: 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후의 유도되는 항염증 및 면역조절 T 세포의 활성
넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 락토코커스 락티스 BFE920이 항염증 및 면역 조절 T 세포의 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후, 실시예 2.3의 방법으로 장 내 CD4-1, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 확인하고, 이를 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군과 비교하였다.
실험결과, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 장내 CD4-1, IL-10, TGF -β1 및 FOXP3 유전자에 대한 상대적인 mRNA 발현이 대조군과 비교하여 유의하게 증가함을 확인하였다(도 2).
따라서, 상기 결과를 통해, 락토코커스 락티스 BFE920가 항염증 활성 및 면역 조절 T 세포의 활성을 유도함을 알 수 있었다.
실시예 3. 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후의 장내막 기능 개선
실시예 3.1: 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후의 밀착연접 활성
넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 락토코커스 락티스 BFE920이 장 내막에서 밀착연접 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후, 실시예 2.3의 방법으로 장 내 occludin 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 확인하고, 이를 락토코커스 락티스를 식이하지 않은 대조군과 비교하였다. 이때, 상기 occludin 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 확인하기 위하여, occludin 유전자에 대한 프라이머로 OF-OCLN-RT-F(5'-TCTTTGCTCTGAAGACCCGC-3', 서열번호 11) 및 OF-OCLN-RT-R(5'-ATTGTTCACCCATGCCTCCA-3', 서열번호 12)를 이용하였고, 대조군인 β-actin ΔCT를 이용한 2-△CT 방법으로 상대적인 mRNA 발현으로 나타내었다.
실험 결과, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 장내 occludin 유전자에 대한 상대적인 mRNA 발현이 대조군과 비교하여 유의하게 증가함을 확인하였다(도 3).
따라서, 상기 결과를 통해, 넙치에서 락토코커스 락티스 BFE920가 장내 밀착 연접 활성을 증가시킴을 알 수 있었다.
실시예 3.2: 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 장내 투과율
넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후, 장 내막에서 밀착 연접 활성이 증가함을 확인하였으므로, 상기 활성을 통해 락토코커스 락티스 BFE920이 장내 투과율에 영향을 미치는지 확인하였다.
구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 FITC-dex 4 kDa(fluorescein isothiocyanate-dextran 4,000 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 장내 투과율을 확인하고, 이를 락토코커스 락티스 BFE920을 식이하지 않은 대조군과 비교하였다.
상기 장내 투과율 실험은 다음과 같이 수행하였다. 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 6시간 동안 굶기고 나서, 위관영양법(oral gavage)을 통해 500 mg/kg의 FITC- dex 4 kDa를 대조군 및 식이군의 4마리에 주입하였다. 한 시간 경과 후, 상기 넙치로부터 600 uL의 혈액 샘플을 1.5 mL 마이크로튜브에 수집하였다. 13000 rpm, 4 ℃에서 10분 동안 상기 혈액샘플을 원심분리하여 혈장 샘플을 얻었고, 1:1 비율로 인산 완충 용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 희석시켰다. 100 uL의 상기 희석된 혈장 샘플은 Corning™ Costar™ 96-well black solid plate (Thermo Fisher Scientific Inc., USA)에 두었다. 각 샘플의 형광강도는 485 nm/535 nm 범위에서 VICTOR2 D fluorometer를 사용하여 측정하였다.
실험 결과, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 장내 투과율은 2.30±0.02 ug/mL로, 4.16±0.23 ug/mL의 투과율을 나타내는 대조군과 비교하여 유의하게 낮음을 확인하였다(도 4).
따라서, 상기 결과를 통해서, 락토코커스 락티스 BFE920의 식이에 따라 장 내막에서 밀착 연접 활성이 증가하고 이에 의해 장내 투과율이 감소됨을 알 수 있었다.
실시예 3.3: 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이한 후 에드워드시엘 라 타르다( Edwardsiella tarda )의 경구 감염에 따른 장내 투과율
에드워드시엘라 타르다는 lipopolisaccahride (LPS)를 가지는 그람음성 병원균이고, 장내에서 염증을 유발할 수 있는 능력을 가지고 있으므로, 병원균으로 선택하였고 상기 병원균의 감염에 따른 장내 투과율에 있어 락토코커스 락티스 BFE920이 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일동안 식이한 다음날 상기 병원균을 감염시킨 후, 72시간 경과시에 FITC-dex 4 kDa을 사용하여 장내 투과율을 측정하였다. 한편, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하지 않고 다음날 상기 병원균을 감염시킨 넙치를 대조군으로 사용하였다.
상기 병원균인 에드워드시엘라 타르다의 감염은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 에드워드시엘라 타르다는 brain heart infusion(BHI) 배지(Beckton, Dickinson and Company, Sparks, USA)에서 30 ℃, 200 rpm으로 교반하여 밤새도록 배양하였다. 식이 31일 경과시에 각 그룹마다 임의로 선택된 4마리의 넙치에 상기 밤새도록 배양시킨 에드워드시엘라 타르다(1 - 2 X 105 CFU/g fish)를 경구투여하여 감염시킨 후, 72시간 경과시에 상기 실시예 3.2의 방법으로 장내 투과율 실험을 수행하였다.
실험 결과, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하고, 다음날 에드워드시엘라 타르다를 경구로 감염시킨 후 72시간 경과시 식이군의 장내 투과율은 혈장 FITC-dex 4 kDa의 값이 2.35 ± 0.04 ug/mL로, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하지 않고, 다음날 에드워드시엘라 타르다를 경구로 감염시킨 후 72시간 경과시 대조군의 장내 투과율(혈장 FITC-dex 4 kDa의 값: 14.98 ± 3.95 ug/mL)과 비교하여 감소됨을 확인하였다(도 5).
따라서, 따라서, 상기 결과를 통해서, 병원균으로 유도되는 장내 투과율의 증가를 락토코커스 락티스 BFE920의 식이를 통해 회복시킴에 따라 락토코커스 락티스 BFE920이 장내막 기능 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4. 에드워드시엘라 타르다 감염에 대한 질병 저항성
락토코커스 락티스 BFE920이 병원균인 에드워드시엘라 타르다 감염에 따른 질병 저항성에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 넙치에 락토코커스 락티스 BFE920을 30일동안 식이한 다음날 상기 병원균을 경구감염시킨 후 20일 동안의 생존율을 측정하였다. 한편, 상기 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하지 않고, 병원균을 감염시시킨 넙치를 대조군으로 사용하였다.
에드워드시엘라 타르다의 감염은 락토코커스 락티스 BFE920을 30일 동안 식이하고, 31일째에 각 그룹마다 임의로 선택된 20마리씩의 넙치에 경구투여하여 감염시켰다.
실험 결과, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일동안 식이한 후 에드워드시엘라 타르다를 감염시킨 식이군의 20일 동안의 생존율은 70 %로, 락토코커스 락티스 BFE920을 30일동안 식이하지 않고, 에드워드시엘라 타르다를 감염시킨 대조군의 생존율인 10 %과 비교하여, 유의하게 증가하였다(도 6).
따라서, 상기 결과를 통해서 넙치에서 락토코커스 락티스 BFE920의 식이를 통해 에드워드시엘라 타르다로 유도되는 증상 및 폐사가 지연되는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 통계 분석
락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후 초기단계의 넙치를 이용한 qRT-PCR 결과는 two-way ANOVA with Bonferroni’s posttest를 사용하였다. 락토코커스 락티 BFE920을 30일 동안 식이한 넙치를 이용한 qRT-PCR 결과 및 장내 투과율 실험 결과의 유효성 평가는 Graph Pad Prism 5 software을 사용하여 Turkey’s multiple comparison test와 함께 two-tailed student’s T-test 및 ANOVA(one-way analysis of variance)로 확인하였다. 락토코커스 락티스 BFE920을 식이한 후, 에드워드시엘라 타르다의 경구 감염에 따른 생존률은 생존곡선으로 나타내었고, 상기 생존곡선에 대한 유효성 평가는 Log-rank (Mantel-Cox) test을 통해 수행하였다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11383P
수탁일자 : 20130221
Figure PCTKR2017004974-appb-I000001

Claims (15)

  1. 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주를 유효성분으로 포함하는, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스는 기탁번호 KCCM11383P로 기탁된 락토코커스 락티스 BFE920 균주인 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 IL-10, CD4-1, FOXP3, TGF -β 유전자의 mRNA 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 밀착연접 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 밀착연접 활성의 증가는 occludin 유전자의 mRNA 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 장 내 투과율을 감소시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스 BFE920 균주는 병원균 감염시 증가된 장 내 투과율을 감소시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 병원균은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)인 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 증진은 면역조절 T 세포 활성 증가로 유도되는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 항염증 또는 면역 증진은 장 내에서 유도되는 것을 특징으로 하는 것인, 항염증 또는 면역 증진용 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물인 것인, 항염증 및 면역 증진용 조성물.
  12. 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는, 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 포함하는 상기 약학 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는, 에드워드 감염증 예방 또는 치료 방법.
  14. 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는, 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  15. 락토코커스 락티스 BFE920 균주(기탁번호: KCCM11383P)를 유효성분으로 포함하는, 어류의 에드워드 감염증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4148119A4 (en) * 2020-04-29 2024-06-26 Green Cross Wellbeing Corporation NOVEL LACTIC ACID BACTERIA WITH EXCELLENT IMMUNE FUNCTION ENHANCING EFFECT AS WELL AS FOOD COMPOSITION, FOOD COMPOSITION WITH HEALTH FUNCTION AND PROBIOTICS THEREFOR

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102381353B1 (ko) * 2021-05-31 2022-04-04 한국식품연구원 항비만 및 면역증진 활성을 동시에 갖는 신규한 락토코커스 락티스 WiKim0124 및 이의 용도
KR102470357B1 (ko) 2022-02-15 2022-11-25 주식회사 큐옴바이오 락토코커스 락티스 q1 균주를 포함하는 면역증진용 조성물

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69914932T2 (de) * 1998-10-20 2004-12-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Verwendung eines zytokine-produzierenden lactococcus stammes zur behandlung von kolitis
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
KR101616530B1 (ko) * 2013-01-10 2016-04-28 한국생명공학연구원 항균활성을 갖는 신규한 락토코쿠스 락티스 kr-w.w-2 균주 및 이의 용도
KR20150019934A (ko) * 2013-08-16 2015-02-25 한동대학교 산학협력단 락토코커스 락티스를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4148119A4 (en) * 2020-04-29 2024-06-26 Green Cross Wellbeing Corporation NOVEL LACTIC ACID BACTERIA WITH EXCELLENT IMMUNE FUNCTION ENHANCING EFFECT AS WELL AS FOOD COMPOSITION, FOOD COMPOSITION WITH HEALTH FUNCTION AND PROBIOTICS THEREFOR

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