WO2017204209A1 - 複合粒子、被覆粒子、複合粒子の製造方法、リガンド含有固相担体および試料中の標的物質を検出または分離する方法 - Google Patents

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    • G01N2446/40—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being dispersed in the monomer composition prior to polymerisation

Definitions

  • the present invention relates to composite particles, coated particles, a method for producing composite particles, a ligand-containing solid phase carrier, and a method for detecting or separating a target substance in a sample.
  • magnetic particles and the like can provide an excellent reaction field in an immune reaction between an antigen and an antibody, hybridization between DNAs or DNA and RNA, etc. It has become.
  • magnetic particles having a small particle diameter When magnetic particles having a small particle diameter are used for such applications, the magnetic particles have a feature that the surface area per unit mass is large and the amount of biochemical substances bound is large, but the magnetic separation time is long. , There was a drawback of poor magnetic separation.
  • magnetic particles having a large particle size should be used. The larger the particle size, the smaller the amount of biochemical substance that can be bound per unit mass. That is, it has been difficult to achieve both an increased amount of biochemical substance binding and excellent magnetic separation.
  • conventional magnetic particles have a low magnetic substance content, for example, when magnetic particles are reduced in size, magnetic collection is low or magnetic separation cannot be performed while being dispersed in a liquid. was there.
  • One embodiment of the present invention provides composite particles containing a high content of inorganic nanoparticles such as magnetic materials.
  • an embodiment of the present invention provides a method capable of easily producing composite particles having a desired shape, which have excellent magnetic separation performance even with a small particle size, with high production efficiency.
  • a configuration example of the present invention is as follows.
  • a to B representing a numerical range or the like means A or more and B or less, and A and B are included in the numerical range.
  • Composite particles containing organic polymer and inorganic nanoparticles The content of the inorganic nanoparticles in the composite particles is more than 80% by mass, Composite particles having a volume average particle size of 10 to 1000 nm.
  • ⁇ 4> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the inorganic nanoparticles have a volume average particle diameter of 5 to 25 nm.
  • the composite particles include at least one selected from the group consisting of a surfactant, an acid group-containing compound, an amino group-containing compound, a silane group-containing compound, and a titanium atom-containing compound, ⁇ 1> to ⁇ 4>
  • the composite particle according to any one of the above.
  • ⁇ 6> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the inorganic nanoparticle is a magnetizable particle.
  • the inorganic nanoparticles are selected from the group consisting of iron, titanium, cobalt, zinc, copper, manganese, nickel or gadolinium, oxides thereof, or alloys thereof; and ferrites or The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, comprising two or more kinds of inorganic materials.
  • ⁇ 8> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the inorganic nanoparticle is a metal oxide particle.
  • ⁇ 9> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, which is a magnetic particle.
  • ⁇ 10> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, which has a surface capable of physically adsorbing at least one ligand.
  • ⁇ 11> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, which has a surface capable of chemically bonding with at least one ligand.
  • Coated particles having the composite particles according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11> and a polymer layer covering the particles.
  • Step (1) Step of preparing a monomer mixture by mixing magnetic fluid, monomer and polymerization initiator
  • Step (2) Step of preparing an emulsion by dispersing the monomer mixture
  • Step (3) In the emulsion Of polymerizing monomers
  • a ligand-containing solid phase carrier wherein the solid phase carrier selected from the composite particles according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11> and the coated particles according to ⁇ 12> has a ligand.
  • the ligand is at least one selected from the group consisting of antibodies, antigens, nucleic acids, nucleotides, nucleosides, proteins, peptides, amino acids, polysaccharides, sugars, lipids, vitamins, drugs, substrates, hormones and neurotransmitters.
  • the ligand-containing solid phase carrier according to ⁇ 14> The ligand-containing solid phase carrier according to ⁇ 14>.
  • ⁇ 16> The composite particle according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, the coated particle according to ⁇ 12>, or the ligand-containing solid according to ⁇ 14> or ⁇ 15>, which is used for immunoassay or nucleic acid detection Phase carrier.
  • ⁇ 17> A method for detecting or separating a target substance in a sample using the ligand-containing solid phase carrier according to ⁇ 14> or ⁇ 15>.
  • a composite particle containing a high content of inorganic nanoparticles such as a magnetic material
  • a composite particle containing a high content of inorganic nanoparticles such as a magnetic material
  • Such composite particles can be suitably used as a carrier, solid phase carrier or medium in the fields of bioengineering, diagnostics, pharmaceuticals and the like where particles containing a high content of inorganic nanoparticles are required.
  • composite particles having excellent magnetic separation performance and having a desired shape eg, agglomerates are suppressed and substantially spherical
  • FIG. 1 shows the particle size distribution of the composite particles obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows the particle size distribution of the composite particles obtained in Comparative Example 1.
  • the composite particle according to an embodiment of the present invention is a composite particle including an organic polymer and inorganic nanoparticles, the content of the inorganic nanoparticles is more than 80% by mass, and the volume average particle size is 10 to 1000 nm. Is a particle.
  • the “composite particle” is not particularly limited as long as it is a particle containing an organic polymer and inorganic nanoparticles, but is preferably a particle containing inorganic nanoparticles in the organic polymer. It is more preferable that the inorganic nanoparticles are dispersed in the matrix, and magnetic particles are particularly preferable.
  • Content of the inorganic nanoparticle in the composite particle which is one Embodiment of this invention is more than 80 mass%.
  • the lower limit of the content is preferably 82% by mass, more preferably 85% by mass, and the upper limit is preferably 95% by mass, more preferably 92% by mass.
  • the content of the inorganic nanoparticles is within the above range, it becomes a composite particle that can be more suitably used as a support, a solid phase carrier or a medium in the fields of bioengineering, diagnosis and pharmaceuticals, and the inorganic nanoparticle is a magnetic substance.
  • magnetic particles it is preferable because composite particles having excellent magnetic separation performance and physical strength can be obtained.
  • the volume average particle size (hereinafter also simply referred to as “particle size”) of the composite particles according to an embodiment of the present invention is 10 to 1000 nm, preferably 50 to 700 nm, more preferably 80 to 600 nm.
  • particle size of the composite particles is in the above range, it is possible to easily obtain composite particles that are excellent in handleability and hardly contain particles while containing a high content of inorganic nanoparticles.
  • the particle size is less than 10 nm, the magnetic responsiveness of the resulting composite particles is inferior, and when it exceeds 1000 nm, the surface area per mass of the composite particles is reduced, resulting in poor reactivity or the amount of biochemical substances bound. Less.
  • the composite particles according to an embodiment of the present invention have a particle size in the above-described range, for example, when the composite particles according to an embodiment of the present invention are used for diagnostics or pharmaceutical research, the composite particles
  • the binding amount of a ligand preferably a biochemical substance (eg, antibody, antibody fragment, protein, polypeptide, polynucleotide, nucleic acid, nucleic acid fragment, enzyme) that can be bound per unit mass of the particle can be increased.
  • a biochemical substance eg, antibody, antibody fragment, protein, polypeptide, polynucleotide, nucleic acid, nucleic acid fragment, enzyme
  • the inorganic nanoparticle is a magnetic substance, even if it is a composite particle having the above-mentioned particle size, it becomes a composite particle having excellent magnetic separation performance, so that the amount of biochemical substance binding, which has been difficult in the past, is increased. And excellent magnetic separation can be achieved at the same time.
  • the composite particles according to an embodiment of the present invention preferably have a particle size variation coefficient (CV value) of 20% or less.
  • CV value particle size variation coefficient
  • the particle size and CV value can be measured using, for example, a dynamic light scattering type particle size distribution measuring apparatus (manufactured by Nikkiso Co., Ltd., Nanotrac UPA-EX150). Can be calculated by the following equation.
  • CV (%) [particle diameter standard deviation ( ⁇ ) / number average particle diameter (D n )] ⁇ 100
  • the composite particle according to an embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it includes an organic polymer and an inorganic nanoparticle.
  • Other components other than these, for example, a magnetic fluid is used in manufacturing the composite particle.
  • a conventionally known component contained in the magnetic fluid may be contained.
  • Organic polymer serves as a matrix for composite particles according to an embodiment of the present invention.
  • a known polymer can be used as the organic polymer and is not particularly limited.
  • a polymer obtained by polymerizing a monomer having an ethylenically unsaturated bond is preferable.
  • the monomer include styrene monomers, vinyl chloride, vinyl esters, unsaturated nitriles, (meth) acrylic acid esters and derivatives thereof.
  • examples of the monomer include styrene monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, and chloromethylstyrene; vinyl chloride; vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate; Unsaturated nitriles such as acrylonitrile; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, ethylene glycol (meth) (Meth) acrylic acid esters such as acrylate, trifluoroethyl (meth) acrylate, pentafluoropropyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, tetrahydrofurfuryl (meth) acrylate, and derivativest
  • the organic polymer may have a structural unit derived from a crosslinkable monomer, and may be crosslinked by this structural unit.
  • the crosslinkable monomer include divinylbenzene, ethylene glycol di (meth) acrylate, 1,6-hexanediol di (meth) acrylate, neopentyl glycol di (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, Examples include, but are not limited to, tetramethylol methane tri (meth) acrylate, tetramethylolpropane tetra (meth) acrylate, diallyl phthalate and its isomer, triallyl isocyanurate, and derivatives thereof. These crosslinkable monomers may be used alone or in combination of two or more.
  • the organic polymer is preferably a polymer containing a structural unit derived from a styrene monomer from the viewpoint of obtaining composite particles excellent in dispersibility in an aqueous medium.
  • the content of the structural unit derived from the styrenic monomer is preferably 100% by mass based on the total amount of the organic polymer contained in the composite particle from the viewpoint of obtaining composite particles that are superior in dispersibility in an aqueous medium. It is 60 to 100% by mass, more preferably 70 to 95% by mass, and still more preferably 80 to 90% by mass.
  • the organic polymer can easily obtain a composite particle having a surface capable of chemically binding at least one ligand, specifically, a composite particle capable of binding an antigen or an antibody via a reactive functional group.
  • a composite particle having a surface capable of chemically binding at least one ligand, specifically, a composite particle capable of binding an antigen or an antibody via a reactive functional group.
  • it in addition to the structural unit derived from the monomer, it may have a structural unit derived from a vinyl monomer containing a reactive functional group.
  • the reactive functional group is preferably a group capable of covalently binding an antigen, an antibody, or the like, and may be appropriately selected according to a desired use. For example, a carboxy group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group Group, triethylammonium group, dimethylamino group, sulfonic acid group.
  • vinyl monomer containing such a reactive functional group examples include (meth) acrylic acid, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, triethylammonium (meth) acrylate, dimethylamino ( Although (meth) acrylate is mentioned, it is not limited to these illustrations.
  • the vinyl monomer containing these reactive functional groups may be used independently and may use 2 or more types.
  • the content of the organic polymer in the composite particles according to an embodiment of the present invention is such that the inorganic nanoparticles are firmly held, and composite particles having excellent physical strength can be easily obtained.
  • the inorganic nanoparticles are magnetic, the content of the inorganic nanoparticles is within the above range and the inorganic nanoparticles are retained from the standpoint of obtaining composite particles having further excellent magnetic separation performance.
  • it is not particularly limited as long as it can be done, it is preferably less than 20% by mass, the upper limit is more preferably 18% by mass, particularly preferably 15% by mass, and the lower limit is preferably 5% by mass, More preferably, it is 8 mass%, Most preferably, it is 10 mass%.
  • the material of the inorganic nanoparticles is not particularly limited, but a magnetizable material is preferable, and a magnetic material is more preferable, specifically, a simple substance such as iron, titanium, cobalt, zinc, copper, manganese, nickel, or gadolinium, One or two or more inorganic materials selected from the group consisting of those oxides or their alloys; and ferrites are preferred.
  • metal oxides such as hematite that are iron oxides; ferrites such as magnetite, manganese ferrite, nickel ferrite, or manganese zinc ferrite; cobalt alloys; It is preferable to select from nickel alloys.
  • the magnetizable material a material having superparamagnetism without residual magnetism is preferable from the viewpoint of obtaining composite particles having excellent magnetic separation performance.
  • the material having superparamagnetism is not particularly limited, and examples thereof include various ferrites such as triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ) and ⁇ -iron sesquioxide ( ⁇ -Fe 2 O 3 ).
  • ferrites such as triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ) and ⁇ -iron sesquioxide ( ⁇ -Fe 2 O 3 ).
  • metal oxides are preferable, magnetizable metal oxides are more preferable, and triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ) is particularly preferable.
  • Fe 3 O 4 or the like obtained by dropping a mixed solution containing Fe 2+ and Fe 3+ at a ratio of 1: 2 into a basic solution and performing a coprecipitation reaction may be used. it can.
  • a commercially available product such as a magnetic substance contained in a magnetic fluid such as EMG2001 (manufactured by Ferrotec) or ferricolloid HC-50 (manufactured by Taiho Kosai Co., Ltd.) can be used.
  • the particle size of the inorganic nanoparticles in the composite particles is preferably 5 in view of obtaining composite particles capable of sufficiently exhibiting the properties of the inorganic nanoparticles, and particularly obtaining composite particles excellent in magnetic separation performance. It is ⁇ 25 nm, more preferably 5 to 20 nm, and further preferably 8 to 15 nm.
  • the lower limit of the dispersion diameter of the inorganic nanoparticles in the organic polymer is preferably 1 nm, and the upper limit is preferably 30 nm.
  • the dispersion diameter is less than 1 nm, in addition to the difficulty in producing inorganic nanoparticles, the magnetic response characteristics when the inorganic nanoparticles are a magnetic material are lowered, and the magnetic separation performance tends to be lowered.
  • the dispersion diameter exceeds 30 nm, when the inorganic nanoparticles are magnetic, residual magnetism tends to occur, and in addition to being easy to self-aggregate, the magnetic substance is likely to be exposed on the surface of the composite particles.
  • a more preferable lower limit of the dispersion diameter is 5 nm, and a more preferable upper limit is 20 nm.
  • the dispersion diameter can be measured using a transmission electron microscope (TEM).
  • the composite particles according to an embodiment of the present invention include conventionally known components contained in the magnetic fluid and surface activity used when producing the composite particles.
  • a conventionally known component such as an agent may be included.
  • examples of such conventionally known components include surfactants, stabilizers such as acid group-containing compounds, amino group-containing compounds, silane group-containing compounds, and titanium atom-containing compounds other than the surfactants. It is not limited to these examples. These stabilizers may be used alone or in combination of two or more.
  • the surfactant is not particularly limited, and a conventionally used compound can be appropriately used.
  • a conventionally used compound can be appropriately used.
  • Anionic surfactants cationic surfactants such as amino acid salts and quaternary ammonium salts
  • ester types such as glycerin fatty acid esters, ether types such as polyoxyethylene alkyl ethers and polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, fatty acid polyethylene glycols
  • Nonionic surfactants such as ester / ether type, etc .
  • amphoteric surfactants such as alkylbetaines.
  • Examples of the acid group-containing compound include compounds having a carboxy group or a sulfo group described in JP-A-2008-258564 and inorganic acids, but are not limited to these examples.
  • Examples of the amino group-containing compound include, but are not limited to, fluorine-containing amines described in JP-A-7-94315.
  • Examples of the silane group-containing compound include a silane group-containing surface treatment agent. Examples of the surface treatment agent include alkoxysilanes described in JP-A-10-4006 and JP-A-2004-205481. Although the silane compound of description is mentioned, it is not limited to these illustrations.
  • Examples of the titanium atom-containing compound include a titanium coupling agent.
  • Examples of the coupling agent include titanium triisostearoyl isopropoxide, (2-n-butoxycarbonylbenzoyloxy) tributoxy titanium, titanium acetylacetate.
  • Non-limiting examples include, but are not limited to, nate, iso-butoxy titanium ethyl acetoacetate, tetraisopropyl titanate, and tetra n-butyl titanate.
  • the composite particle according to an embodiment of the present invention can easily provide an excellent reaction field in an immune reaction between an antigen and an antibody, hybridization between DNAs or between DNA and RNA, and the like.
  • Composite particles having a surface capable of physically adsorbing at least one ligand preferably composite particles having a hydrophobic surface capable of adsorbing by hydrophobic interaction, or the like, It is preferred that the composite particle has a surface capable of chemically binding at least one ligand, preferably a composite particle having a reactive functional group capable of reacting with the ligand.
  • the composite particle having a surface capable of physically adsorbing the ligand can be obtained, for example, by using a monomer such that the organic polymer becomes a hydrophobic polymer, and the composite particle capable of chemically binding the ligand is For example, it can be obtained by using a monomer having a reactive functional group when the organic polymer is synthesized.
  • the type of the ligand is not particularly limited as long as it has an appropriate affinity for the target substance.
  • Specific examples of ligands include antibodies; antigens; nucleic acids such as DNA and RNA; nucleotides; nucleosides; protein A, protein G, protein L, Fc-binding protein, avidin, streptavidin, enzyme, lectin, and functional variants thereof. And the like; peptides such as insulin; amino acids; saccharides or polysaccharides such as heparin, Lewis X, ganglioside; lipids; vitamins such as biotin; drugs; substrates; hormones; These ligands may be used as they are, but fragments obtained by enzymatic treatment of these compounds may also be used.
  • the ligand may be an artificially synthesized peptide, peptide derivative, or recombinant.
  • a ligand suitable for immunoglobulin separation or purification includes a protein containing an immunoglobulin binding domain, and may have a plurality of the same or different types of immunoglobulin binding domains.
  • the immunoglobulin binding domain is preferably one or two or more immunoglobulin binding domains selected from protein A immunoglobulin binding domain, protein G immunoglobulin binding domain and protein L immunoglobulin binding domain.
  • an antibody or an antigen is preferable from the viewpoint that a ligand-containing solid phase carrier suitable for use in a diagnostic agent can be easily obtained.
  • the antibody and the antigen are not particularly limited as long as they bind to the target substance.
  • Serum protein-related testing antibodies such as apolipoprotein antibodies, anti- ⁇ 2-microglobulin antibodies, anti- ⁇ 1-microglobulin antibodies, anti-immunoglobulin antibodies, anti-CRP antibodies, or antigens thereto; endocrine function testing antibodies such as anti-HCG antibodies or Antigen for this; antibody for drug analysis such as anti-digoxin antibody, anti-lidocaine antibody or the like
  • Antigens for infectious diseases such as HBs antigen, HCV antigen, HIV-1 antigen, HIV-2 antigen, HTLV-1 antigen, mycoplasma antigen, toxoplasma antigen, streptolysin O antigen, or antibodies thereto; Examples include autoimmune related test antigens such as heat-denatured human IgG or antibodies thereto.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the method for producing the composite particles according to an embodiment of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method using a suspension polymerization method, a micro suspension polymerization method, a miniemulsion polymerization method, a dispersion polymerization method, and the like. Among these, since a particle having a small particle diameter can be easily produced, a method using the miniemulsion polymerization method is preferable.
  • Step (1) Step of preparing a fluid mixture (hereinafter referred to as “monomer mixture”) by mixing magnetic fluid, monomer and polymerization initiator Step (2): Dispersing the monomer mixture and emulsion Step (3): A step of polymerizing monomers in the emulsion
  • the step (1) is a step of preparing a monomer mixture by mixing a magnetic fluid, a monomer, and a polymerization initiator.
  • a monomer mixed solution is prepared, and composite particles are produced through the subsequent steps using this mixed solution. Therefore, the content of the magnetic substance (inorganic nanoparticles) is high, particularly in the above range.
  • the contained composite particles can be easily produced with high production efficiency.
  • a magnetic fluid is used in the step (1), composite particles can be produced in a state where the magnetic material contained in the fluid is uniformly dispersed, and the magnetic material (inorganic nanoparticles) in the organic polymer can be produced.
  • the composite particles having a dispersion diameter in the above range can be easily produced, and desired composite particles in which aggregation of the magnetic material is suppressed can be easily produced.
  • the step (1) since a mixed liquid containing a monomer and a polymerization initiator is prepared, the magnetic substance is uniformly dispersed in a matrix made of an organic polymer, and aggregation of the magnetic substance is difficult to occur.
  • it is difficult for the magnetic aggregates to be generated it is easy to control the particle size and shape of the composite particles, and the particle size distribution can be narrowed.
  • a magnetic substance dispersion liquid in which a magnetic substance is dispersed in an organic solvent is prepared.
  • a magnetic dispersion is prepared by removing water or an organic solvent, which is a liquid medium, from a magnetic fluid to separate the magnetic material, and adding another solvent to the separated magnetic material.
  • a monomer mixture was prepared by adding a monomer, a polymerization initiator and a co-surfactant thereto.
  • a monomer and a polymerization initiator are added to an emulsion containing a magnetic material.
  • the monomer when the monomer is polymerized, it becomes a shape other than a substantially spherical shape or aggregates are generated, resulting in a high content of magnetic material. It has been found that composite particles having a desired shape contained in can not be easily produced with high production efficiency.
  • the magnetic fluid is used as it is without passing through the step of processing the magnetic fluid, for example, removing the liquid medium from the magnetic fluid, and the fluid is mixed with the monomer and the polymerization initiator to mix the monomers. It is preferable to prepare a liquid.
  • the magnetic fluid used in the step (1) includes inorganic nanoparticles.
  • the magnetic fluid comprises (a) a magnetic material having a diameter of several nanometers to several tens of nanometers as inorganic nanoparticles, (b) a liquid (dispersion medium) such as water, an organic solvent or oil, and (c) a magnetic material. And a stabilizer for stably dispersing in the dispersion medium.
  • a stabilizer layer such as a surfactant is usually present on the surface of the magnetic material, so that repulsive force works between the magnetic materials, and aggregation and settling do not occur, and the magnetic material is stable in the fluid. Keep the state of dispersion.
  • ferrofluid behaves as a normal liquid when no magnetic field is generated, but the viscosity of the liquid changes when a magnetic field is applied, and it behaves as if the entire liquid has ferromagnetism. have.
  • external force such as magnetic field, gravity, centrifugal force, etc. is applied from the outside, the dispersed state of inorganic nanoparticles in the fluid, specifically the magnetic material, is maintained.
  • the magnetic material having a diameter of several nm to several tens of nm As the magnetic material having a diameter of several nm to several tens of nm, the magnetic material having a diameter of several nm to several tens of nm, preferably having a particle size of 5 to 25 nm can be used.
  • the diameter and the like) are the same as those mentioned in the column of inorganic nanoparticles. These magnetic materials may be used alone or in combination of two or more.
  • the liquid (dispersion medium) such as water, organic solvent or oil is excellent in dispersibility of the magnetic material, does not dissolve the magnetic material, and can be mixed with the monomer.
  • an organic solvent is preferable, and the organic solvent preferably contains an aliphatic hydrocarbon solvent.
  • the aliphatic hydrocarbon solvent a linear or branched compound having 5 to 20 carbon atoms is preferable because it is particularly excellent in dispersibility of a magnetic material, and a linear or branched compound having 5 to 7 carbon atoms. Is more preferred. Specific examples include pentane, hexane, heptane, isobutane, and isopentane, but are not limited to these examples.
  • the said dispersion medium may be used independently and may use 2 or more types.
  • the content of the aliphatic hydrocarbon solvent in the organic solvent is preferably 80% by mass or more.
  • the content is 80% by mass or more, the dispersibility of the magnetic material is excellent, and aggregation of the magnetic material in the composite particle according to an embodiment of the present invention can be suppressed.
  • the content of the magnetic material in the composite particle according to an embodiment of the present invention Can also be suppressed.
  • the content of the organic solvent in the magnetic fluid is preferably 20 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the magnetic substance, and preferably 500 parts by mass with respect to 100 parts by mass.
  • the content of the organic solvent is less than 20 parts by mass, the magnetic material may not be sufficiently dispersed.
  • the content exceeds 500 parts by mass, it is necessary to remove the residual solvent after the following step (3).
  • the operation may be complicated.
  • the minimum with more preferable content of the said organic solvent is 30 mass parts, and a more preferable upper limit is 300 mass parts.
  • the magnetic fluid includes a surfactant, an acid group-containing compound, an amino group-containing compound, a silane group-containing compound, and titanium. It is preferable to include at least one selected from the group consisting of atom-containing compounds.
  • Examples of the monomer used in the step (1) include the same monomers as those used when the organic polymer is synthesized, and preferred monomers are also the same. These monomers may be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the monomer used is not particularly limited, but it is preferable that the content of the inorganic nanoparticles (magnetic material) in the obtained composite particles is in the above range, and specifically, the magnetic material 100 in the magnetic fluid.
  • the amount is preferably 1 to 100 parts by mass, more preferably 3 to 50 parts by mass, still more preferably 5 parts by mass or more, particularly preferably 10 parts by mass or more, and further preferably less than 20 parts by mass with respect to parts by mass.
  • the content of the inorganic nanoparticles (magnetic material) is within the above range, and composite particles having excellent magnetic separation performance and physical strength can be easily obtained.
  • the polymerization initiator used in step (1) is preferably a heat-polymerizable radical polymerization initiator, such as 2,2′-azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis- (2-methylpropanenitrile).
  • Azo initiators such as benzoyl peroxide, cumene hydroperoxide, hydrogen peroxide, acetyl peroxide, lauroyl peroxide, persulfate (eg ammonium persulfate), peroxide esters (eg t- butyl peroxide octoate, alpha-cumyl peroxypivalate) radical polymerization initiator of peroxide type, such as, can be mentioned, but are not limited to these examples.
  • These polymerization initiators may benzoyl peroxide, cumene hydroperoxide, hydrogen peroxide, acetyl peroxide, lauroyl peroxide, persulfate (eg ammonium persulfate), peroxide esters (eg t- butyl peroxide octoate, alpha-cumyl peroxypivalate) radical polymerization initiator of peroxide type, such as, can be mentioned, but are not limited to these examples.
  • the amount of the polymerization initiator used is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 30 parts by mass, more preferably 0.5 to 20 parts by mass, and further preferably 1 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monomer. Part.
  • the order of mixing when mixing the magnetic fluid, the monomer, and the polymerization initiator is not particularly limited, and a surfactant may be used as necessary when mixing.
  • the step (2) is a step of preparing an emulsion by dispersing the monomer mixture.
  • the monomer mixture is dispersed in an aqueous medium in which a surfactant is dissolved.
  • aqueous medium water, such as distilled water and ion-exchange water, is used.
  • the aqueous medium refers to a medium in which water occupies at least 50% by mass or more.
  • the surfactant is not particularly limited, and any of an anionic surfactant, a cationic surfactant, and a nonionic surfactant can be used. Of these, anionic surfactants are preferred.
  • the said surfactant may be used independently and may use 2 or more types.
  • the anionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include sodium, potassium or ammonium salts such as dodecyl sulfate, dodecyl benzene sulfate, decyl benzene sulfate, undecyl benzene sulfate, tridecyl benzene sulfate, and nonyl benzene sulfate.
  • the cationic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include cetyltrimethylammonium bromide, hexadecylpyridinium chloride, and hexadecyltrimethylammonium chloride.
  • the nonionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include polyvinyl alcohol.
  • Nonionic surfactants include, for example, Triton X-100, X-114, X-305, N-101 (above, Union Carbide), Tween 20, 40, 60, 80, 85 (above, Manufactured by ICI), Brij 35, 58, 76, 98 (above, manufactured by ICI), Nonidet P-40 (manufactured by Shell), Igepol CO530, CO630, CO720, CO730 (Rhone Commercially available products such as those made by Pulan Co., Ltd. can be used.
  • a reactive surfactant having a reactive group polymerizable with the monomer can also be used.
  • the reactive group for example, an ethylenically unsaturated group such as a vinyl group, an allyl group, or a (meth) acryloyl group is preferable.
  • the amount of the surfactant used is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 100 parts by mass, more preferably 100 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monomer mixture from the viewpoint that an emulsion can be easily prepared. Is 0.1 to 5 parts by mass.
  • Examples of the method for dispersing the monomer mixture include a method in which the monomer mixture is added to an aqueous medium containing a surfactant and emulsified by a shear mixer that generates a high shear force.
  • the shear mixing device is not particularly limited.
  • a homogenizer manufactured by IKA
  • a histocolon manufactured by Microtech / Nichion
  • a polytron manufactured by Kinematica
  • a TK auto homomixer manufactured by Tokushu Kika Kogyo Co., Ltd.
  • Etc Etc .
  • Ebara Milder manufactured by Taiheiyo Kiko Co., Ltd.
  • TK Fillmix TK Pipeline Homomixer (manufactured by Special Machine Industries Co., Ltd.), Colloid Mill (Shinko Environmental Solution Co., Ltd.) ), Claremix (M Technique Co., Ltd.), Thrasher, Trigonal Wet Pulverizer (Nihon Coke Kogyo Co., Ltd.), Captron (Eurotech Co., Ltd.), Fine Flow Mill (Pacific Kiko Co., Ltd.), etc.
  • Continuous emulsifier Microfluidizer (manufactured by Mizuho Industry Co., Ltd.), Nanomizer (Nanomizer Inc.) ) And APV Gaurin (manufactured by Gaurin Co., Ltd.), etc .; membrane emulsifiers such as membrane emulsifiers (manufactured by Chilling Industries Co., Ltd.); An ultrasonic emulsifier such as an ultrasonic homogenizer (manufactured by Branson), among which a probe type ultrasonic disperser is preferably used.
  • step (2) from the viewpoint of the same effect as described above, the monomer mixed solution is dispersed so that the particle size of the droplets in the obtained emulsion is approximately the same as the particle size of the desired composite particles. Specifically, it is preferable to disperse the monomer mixture so that an emulsion containing droplets having a particle size similar to the particle size of the composite particles (preferably in the same range) is obtained.
  • a preferable lower limit of ultrasonic output is 5 W, and a preferable upper limit is 200 W.
  • the ultrasonic output is less than 5 W, large droplets are generated due to insufficient dispersion force, and the polymerization reaction in step (3) may be difficult.
  • it exceeds 200 W desired composite particles may not be obtained.
  • the ultrasonic irradiation time is preferably in the range of 10 seconds to 10 minutes, more preferably in the range of 30 seconds to 5 minutes, although it depends on the ultrasonic output. The range of 1 minute to 3 minutes is more preferable.
  • the ultrasonic irradiation may be performed once or a plurality of times.
  • the step (3) is a step of polymerizing the monomers in the emulsion. By this step, composite particles can be obtained.
  • the polymerization conditions may be appropriately selected depending on the monomers used, but are usually performed by heating at 50 to 95 ° C. for about 5 to 24 hours.
  • This method may include other steps than the steps (1) to (3) as necessary.
  • Examples of the other step include a step of washing the composite particle dispersion obtained in the step (3) with water or the like by a magnetic separation method.
  • the coated particle which is one embodiment of the present invention has the composite particle which is one embodiment of the present invention and a polymer layer which coats the composite particle.
  • the composite particles according to one embodiment of the present invention can be used for various applications as they are, but it is preferable to coat the composite particles with a polymer layer in order to obtain a particle surface according to a desired application.
  • the polymer layer is formed, for example, in the presence of composite particles, in the presence of a (co) polymerizable monomer, if necessary, in the presence of a polymerization initiator, an emulsifier, a dispersant, a surfactant, an electrolyte, a crosslinking agent, a molecular weight regulator, and the like.
  • a polymerization initiator an emulsifier, a dispersant, a surfactant, an electrolyte, a crosslinking agent, a molecular weight regulator, and the like.
  • the polymer layer after forming the polymer layer, it is also possible to modify functional groups that may be present on the surface of the coated particles by methods such as alkali hydrolysis of ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester and alkali saponification of vinyl ester. Furthermore, the polymer layer may be formed twice or more. That is, the coated particles may have two or more polymer layers.
  • the method for bringing the composite particles and the (co) polymerizable monomer into contact with each other when the polymer layer is formed in this way is not particularly limited.
  • the (co) polymerizable monomer may be combined into a batch method or a divided method.
  • the method of adding to a composite particle or a composite particle dispersion liquid by either of the continuous addition system is mentioned.
  • the polymerization conditions may be appropriately selected depending on the monomers used, the polymerization initiator, and the like.
  • the polymerization temperature is usually 10 to 90 ° C., preferably 30 to 85 ° C., and the polymerization time is usually about 1 to 30 hours. It is.
  • the coated particles become coated particles that can be more suitably used as a support, a solid phase carrier or a medium in the fields of bioengineering, diagnosis and pharmaceuticals, depending on the content of inorganic nanoparticles in the particles.
  • the content of the inorganic nanoparticles in the coated particles is preferably 1 to 95% by mass, more preferably 35 from the viewpoint of obtaining coated particles having excellent magnetic separation performance. To 95% by mass, more preferably 45 to 95% by mass.
  • the component of the polymer layer is not particularly limited, but vinyl polymers are preferable, and vinyl monomers used for the synthesis thereof are aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, halogenated styrene, divinylbenzene and the like.
  • Vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate; unsaturated nitriles such as acrylonitrile; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, lauryl (meth) ), Ethylenic unsaturated carboxylic acid esters such as ethylene glycol di (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate; acrolein; and the like, but not limited to these examples.
  • the vinyl polymer may be a homopolymer or a copolymer of two or more monomers.
  • the polymer layer may include the vinyl monomer and a conjugated diolefin such as butadiene or isoprene; a mono- or dicarboxylic acid compound such as (meth) acrylic acid, itaconic acid, maleic anhydride, or crotonic acid, or an acid anhydride thereof; (Meth) acrylamide, glycidyl (meth) acrylate, N-methylol (meth) acrylamide, N-isopropyl (meth) acrylamide, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol mono (meth) acrylate, polyethylene having 2 to 40 chains (Meth) acrylate having a glycol or polypropylene glycol side chain, diallyl phthalate, allyl (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, styrenesulfonic acid and its sodium salt, 2- Acrylamide-2-methylpropanesulfonic acid and its sodium
  • the polymer layer may have a structural unit derived from a vinyl monomer containing a reactive functional group in addition to the structural unit derived from the monomer.
  • the reactive functional group is preferably a group capable of covalently binding an antigen or an antibody, and may be appropriately selected according to the desired use. For example, a carboxy group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group Group, triethylammonium group, dimethylamino group, sulfonic acid group.
  • vinyl monomer containing such a reactive functional group examples include (meth) acrylic acid, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, triethylammonium (meth) acrylate, dimethylamino ( Although (meth) acrylate is mentioned, it is not limited to these illustrations.
  • the vinyl monomer containing these reactive functional groups may be used independently and may use 2 or more types.
  • the content (thickness) of the polymer layer is not particularly limited, and is preferably an amount such that the content of the inorganic nanoparticles in the obtained coated particles falls within the above range.
  • the polymerization initiator is preferably an oil-soluble polymerization initiator from the viewpoint of solubility in water.
  • a water-soluble polymerization initiator there is a tendency that not a polymerization on the surface of the composite particles but a large amount of new particles consisting only of a polymer layer not containing the composite particles are generated.
  • oil-soluble polymerization initiator examples include peroxides such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, t-butylperoxy 2-ethylhexanate, di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide, azobisisobutyronitrile, etc. Products, azo compounds and the like, but are not limited to these examples.
  • the said polymerization initiator may be used independently and may use 2 or more types.
  • the amount of the polymerization initiator used is preferably 0.01 to 8 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monomer.
  • emulsifier a commonly used anionic surfactant or nonionic surfactant can be used.
  • the said emulsifier may be used independently and may use 2 or more types.
  • anionic surfactant examples include alkali metal salts of higher alcohol sulfates, alkali metal salts of alkylbenzene sulfonic acids, alkali metal salts of succinic acid dialkyl ester sulfonic acids, alkali metal salts of alkyl diphenyl ether disulfonic acids, and polyoxyethylene alkyls.
  • Nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene alkylphenyl ether, Aqualon RS-20 (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Adekari Soap NE-20 (Co., Ltd.) ADEKA) and the like.
  • the coated particle can easily provide an excellent reaction field in an immune reaction between an antigen and an antibody, hybridization between DNAs or between DNA and RNA, etc., and particularly, it can be easily used for diagnostic drugs and pharmaceutical research.
  • a coated particle having a surface capable of physisorbing at least one ligand preferably a coated particle having a hydrophobic surface capable of adsorbing by hydrophobic interaction, or chemistry of at least one ligand.
  • a coated particle having a bondable surface preferably a coated particle having a reactive functional group capable of reacting with a ligand, and contains a reactive functional group in addition to the structural unit derived from the monomer. You may have the structural unit derived from a vinyl monomer.
  • the ligand-containing solid phase carrier is the composite particle having a ligand or the coated particle having a ligand, and the ligand is bound to the solid phase carrier selected from the composite particle and the coated particle. It is a carrier.
  • the ligand include the same ligands as those described in the composite particle column. Among these, an antibody and an antigen are preferable from the viewpoint that a ligand-containing solid phase carrier suitable for a diagnostic agent can be easily obtained.
  • the ligand may be one type or two or more types.
  • Ligand binding may be performed according to a conventional method, but is preferably performed by a covalent bonding method.
  • the reactive functional group is a carboxy group and the ligand has an amino group, it may be bonded using a dehydrating condensing agent.
  • the composite particle, the coated particle and the ligand-containing solid phase carrier according to an embodiment of the present invention can be widely used for in vitro diagnosis, research in the biochemical field, and the like, for example, in the fields of bioengineering, diagnosis and pharmaceuticals. It can be suitably used as a phase carrier or medium, specifically, it can be suitably used as a means for separating and / or detecting a specimen such as an antigen, antibody, biomolecule, nucleic acid, etc., and in particular, an immunoassay and a nucleic acid Especially suitable for detection.
  • the composite particles or coated particles according to an embodiment of the present invention may be used as they are, or the ligand-containing solid particles obtained by binding the ligand to the composite particles or coated particles according to an embodiment of the present invention.
  • a phase carrier may be used.
  • an antigen or antibody such as a protein is bound to the composite particle or coated particle according to an embodiment of the present invention, and the measurement target is quantified / qualified by an antigen-antibody reaction with the measurement target antibody or antigen.
  • the antibody is bound to the composite particle and the coated particle according to one embodiment of the present invention, and the antigen, such as a chemical substance such as virus, bacteria, cell, hormone, dioxin, etc., is collected and concentrated.
  • chemical substances such as dyes may be collected and detected; avidin or biotin is bound to the composite particles and coated particles according to an embodiment of the present invention to bind biotin or Gin-containing molecules may be recovered and detected; antibodies and antigens are bound to the composite particles and coated particles according to an embodiment of the present invention, and enzyme immunoassay is performed using a colorimetric method or chemiluminescence. May be.
  • Substances to be diagnosed include biological proteins, hormones such as luteinizing hormone, thyroid stimulating hormone, various cancer cells, proteins that serve as cancer markers such as prostate-specific markers and bladder cancer markers, hepatitis B virus, Viruses such as hepatitis C virus and herpes simplex virus; bacteria such as Neisseria gonorrhoeae and MRSA; fungi such as Candida and cryptocox; protozoa and parasites such as Toxoplasma; components such as these viruses, bacteria, fungi, protozoa and parasites Proteins and nucleic acids that are: environmental pollutants such as dioxins; chemical substances such as pharmaceuticals such as antibiotics and antiepileptics;
  • a method for detecting or separating a target substance in a sample according to an embodiment of the present invention uses the ligand-containing solid phase carrier.
  • the target substance is a substance that binds to a ligand.
  • antigens antibodies such as monoclonal antibodies and polyclonal antibodies; cells (cancer cells such as normal cells, colon cancer cells, circulating cancer cells in the blood)
  • a nucleic acid such as DNA or RNA
  • biologically related substances such as proteins, peptides, amino acids, sugars, polysaccharides, lipids, vitamins, etc., and drugs that are drug targets, and small molecule compounds such as biotin.
  • the target substance may be labeled with a fluorescent substance or the like.
  • the sample may be a sample containing the target substance or a sample that may contain the target substance.
  • Specific examples include blood, plasma, serum, and a buffer solution containing the target substance.
  • the method for detecting or separating the target substance may be performed according to a conventional method except that the ligand-containing solid phase carrier is used.
  • the ligand-containing solid phase carrier and the sample containing the target substance are brought into contact with each other by mixing, etc. (contact process), and the ligand-containing solid phase carrier capturing the target substance is separated from the sample using a magnet or the like.
  • the method including the process (separation process) to perform is mentioned.
  • the separation step may include a step of detecting the target substance or a step of dissociating the ligand and the target substance.
  • the volume average particle diameters of the dispersoids or particles in the solutions in the following Examples and Comparative Examples were measured using a dynamic light scattering type particle size distribution measuring apparatus (Nanotrack UPA-EX150, manufactured by Nikkiso Co., Ltd.). As an example of the measurement results, the particle size distribution of the composite particles obtained in Example 1 is shown in FIG. 1, and the particle size distribution of the composite particles obtained in Comparative Example 1 is shown in FIG.
  • the particle size values in FIGS. 1 and 2 are both volume average particle sizes.
  • the content of the magnetic substance in the composite particles obtained in the following Examples and Comparative Examples was measured at 500 ° C. using a differential type differential thermal balance (TG-8120, manufactured by Rigaku Corporation).
  • EMG2001 (14.3 g of a magnetic substance in 27.0 g of the magnetic fluid, heptane dispersion, manufactured by Ferrotech Co., Ltd.) was used as the magnetic fluid. Even when a magnetic field, gravity, or centrifugal force was applied to the magnetic fluid, the magnetic fluid was not unevenly concentrated in the magnetic fluid, and the dispersed state of the magnetic material in the magnetic fluid was maintained. Such a dispersion state can be judged by visually confirming that there is no precipitation and that there is no separation between the magnetic substance and the dispersion.
  • Example 1 To 27.0 g of magnetic fluid “EMG2001”, 1.35 g of styrene, 0.15 g of divinylbenzene and 0.06 g of 2,2′-azobisisobutyronitrile were added and mixed to obtain a monomer mixture. Next, 75 g of an aqueous solution in which 0.75 g of sodium dodecyl sulfate was dissolved was added to the obtained monomer mixture, and an ultrasonic wave was used with an ultrasonic homogenizer (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho, US300T) under ice-cooling.
  • the treatment (2 minutes of ultrasonic irradiation (ultrasonic output: 150 W) and the subsequent stop of ultrasonic irradiation for 2 minutes) was performed. This sonication was repeated 10 times to prepare an emulsion in which a monomer mixture containing a magnetic material was dispersed in water. The volume average particle diameter of the droplets in the obtained emulsion was 104 nm.
  • the obtained emulsion was polymerized at 70 ° C. for 7 hours, and washed with water by magnetic separation to obtain a dispersion of composite particles A.
  • the volume average particle size of the composite particles A in the particle dispersion thus obtained was 103 nm, and the magnetic substance content of the composite particles A was 90% by mass.
  • the value of the magnetic substance content agrees with the theoretical value, and it can be seen that composite particles (dispersion) were obtained with high production efficiency.
  • the theoretical value (% by mass) means a value when it is assumed that the charged magnetic substance, monomer, and initiator are all composite particles. “Magnetic substance amount ⁇ 100 / (magnetic substance amount + each monomer” Amount + initiator amount) ”.
  • the particle size distribution of the obtained composite particle became a group, it turns out that the composite particle of the desired shape was able to be obtained with high production efficiency.
  • Example 2 Example 1 except that the monomer used was changed from 1.35 g of styrene and 0.15 g of divinylbenzene to 1.35 g of methyl methacrylate and 0.15 g of trimethylolpropane trimethacrylate (hereinafter referred to as “TMP”).
  • TMP trimethylolpropane trimethacrylate
  • the volume average particle size of composite particle B was 107 nm
  • the magnetic substance content of composite particle B was 89% by mass. Since the difference between the magnetic substance content and the theoretical value is as small as 1% by mass, it can be seen that composite particles (dispersion) were obtained with high production efficiency.
  • Example 3 To a liquid in which 1.2 g of methyl methacrylate, 0.3 g of TMP, 0.3 g of methacrylic acid and 0.1 g of di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide (manufactured by NOF Corporation; Parroyl 355) were mixed. Then, 30 g of an aqueous solution in which 0.15 g of sodium dodecyl sulfate was dissolved was added, and an emulsion c was prepared with an ultrasonic homogenizer (US300T).
  • an ultrasonic homogenizer US300T
  • Example 2 In a separable flask, 73.5 g of the dispersion of composite particles A prepared in Example 1 (containing 3.0 g of composite particles A) was added, and the emulsion c was added over 2 hours while controlling the temperature at 60 ° C. with a water bath. It was dripped. After completion of the dropping, the temperature was maintained at 60 ° C., polymerization was performed over 1 hour, the temperature was raised to 80 ° C., and then the reaction was completed over 2 hours. The obtained dispersion was washed with water by magnetic separation to prepare a dispersion of coated particles C. The volume average particle size of the coated particles C in the obtained particle dispersion was 109 nm, and the magnetic substance content of the coated particles C was 59% by mass.
  • Example 4 A composite particle E (dispersion liquid) was produced in the same manner as in Example 1 except that the amount of sodium dodecyl sulfate was changed to 0.3 g and the ultrasonic treatment was repeated four times.
  • the volume average particle diameter of the composite particles E was 232 nm, and the magnetic substance content of the composite particles E was 86% by mass.
  • Example 5 Example except that the ultrasonic treatment was changed to ultrasonic irradiation for 1 minute (ultrasonic output: 150 W) and then stopping the ultrasonic irradiation for 1 minute, and this ultrasonic treatment was repeated three times.
  • the composite particle F (dispersion liquid) was produced in the same manner as in Example 1. As a result, the volume average particle size of the obtained composite particle F was 515 nm, and the magnetic substance content of the composite particle F was 88% by mass. .
  • Example 6 An emulsion was prepared in the same manner as in Example 1 except that the apparatus used was changed from an ultrasonic homogenizer (US300T) to a colloid mill (manufactured by IKA, magic LAB). In addition, the processing conditions at the time of using a colloid mill were 25000 rpm and 20 min. The volume average particle diameter of the droplets in the obtained emulsion was 110 nm. Subsequently, polymerization was performed in the same manner as in Example 1 to prepare composite particles G (dispersion liquid). As a result, the volume average particle size of the obtained composite particles G was 108 nm, and the magnetic substance content of the composite particles G was It was 89 mass%.
  • US300T ultrasonic homogenizer
  • IKA magic LAB
  • Example 7 10 mg of composite particles A are dispersed in a borate buffer having a pH of 9.5, 0.1 mL of a solution in which 0.2 mg of streptavidin is dissolved is added thereto, and the mixture is rotated and stirred at 37 ° C. for 16 hours, and then washed four times with Tris buffer.
  • streptavidin-binding particles in which streptavidin was immobilized on the surface of the composite particle A were prepared.
  • BCA bicinchoninic acid
  • Example 8 10 mg of the coated particles C was dispersed in 1 mL of 100 mM MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate) buffer having a pH of 5.0, and 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (WSC, manufactured by Dojindo Laboratories) 0.1 mL of WSC solution dissolved in 100 mM MES buffer of pH 5.0 so as to have a concentration of 10 mg / mL was added, and the mixture was rotationally stirred at room temperature for 2 hours.
  • MES 2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate buffer having a pH of 5.0
  • WSC 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride
  • Example 9 The methyl methacrylate 1.2 g, TMP 0.3 g, and methacrylic acid 0.3 g used in preparing the emulsion c were changed to glycidyl methacrylate 1.2 g and methacrylic acid 0.3 g.
  • a coated particle D (dispersion liquid) was produced in the same manner as in Example 3 except that the dispersion liquid was 73.5 g (containing 1.5 g of composite particles A) of the coated particle C produced in Example 3.
  • the volume average particle size of the coated particles D was 165 nm, and the magnetic substance content of the coated particles D was 41% by mass.
  • Streptavidin-binding particles were prepared in the same manner as in Example 8 except that the coated particles D were used instead of the coated particles C. When the amount of streptavidin bound was examined by BCA assay, it was 17 ⁇ g / mg composite particles.
  • Composite particles (dispersion liquid) were produced in the same manner as in Example 1 except that the obtained magnetic dispersion liquid was used instead of the magnetic fluid “EMG2001”. As shown in FIG. Composite particles having two groups of distributions were obtained, and when visually confirmed, aggregates of magnetic substances were present in the obtained dispersion of composite particles.
  • the obtained composite particles had a volume average particle size of 177 nm, and the composite particles had a magnetic substance content of 68% by mass. The value of this magnetic substance content is greatly different from the theoretical value of 24% by mass, and as shown in FIG. 2, the particle size distribution of the obtained composite particles is divided into two groups. It can be seen that composite particles (dispersion) having a desired shape could not be obtained with high production efficiency.
  • the manufacturing method of the said composite particle of the comparative example 1 does not correspond to this method.
  • Example 10 The dispersion of the composite particles C was magnetically separated to remove the supernatant, and washed twice with 0.1 M MES buffer (pH 5.5). After washing, the supernatant was removed by magnetic separation, and 0.1 M MES buffer (pH 5.5) and anti-PSA (prostate specific antigen) antibody solution were added so that the concentration of antibody was 10 ⁇ g per 1 mg of the composite particles, and EDC (1 -Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (manufactured by Dojindo Laboratories Co., Ltd., 3 mg / mL) was added so as to be 100 ⁇ g per 1 mg of the composite particles C, and mixed by inverting for 2 hours at 25 ° C.
  • EDC Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride
  • Dispense 25 ⁇ L of the prepared antibody-bound particle dispersion and then dispense 25 ⁇ L of sample (human serum or standard solution (PSA antigen-containing solution: 0 to 1000 pg / mL)) into the dispensed antibody-bound particle dispersion.
  • sample human serum or standard solution (PSA antigen-containing solution: 0 to 1000 pg / mL)
  • ALP alkaline phosphatase
  • ALP alkaline phosphatase
  • Substrate solution (Lumipulse substrate solution: manufactured by Fujirebio Co., Ltd.) was added and reacted at 25 ° C. for 5 minutes, and the luminescence intensity was measured (ARVO X5 (manufactured by PerkinElmer)). The results are shown in Table 2. Depending on the antigen concentration, luminescence intensity with dilution linearity was obtained, so that it was confirmed that the composite particle C can be used as a solid phase carrier for immunoassay.

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Abstract

本発明は、複合粒子、被覆粒子、複合粒子の製造方法、リガンド含有固相担体および試料中の標的物質を検出または分離する方法に関し、該複合粒子は、有機高分子および無機ナノ粒子を含む複合粒子であって、該複合粒子中の前記無機ナノ粒子の含有量が８０質量％超であり、体積平均粒径が１０～１０００ｎｍである。

Description

複合粒子、被覆粒子、複合粒子の製造方法、リガンド含有固相担体および試料中の標的物質を検出または分離する方法
　本発明は、複合粒子、被覆粒子、複合粒子の製造方法、リガンド含有固相担体および試料中の標的物質を検出または分離する方法に関する。
　近年、磁性粒子等は、抗原と抗体との免疫反応、ＤＮＡ同士またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーション等において優れた反応場を提供できることから、特に診断薬や医薬品研究用などへの応用が活発になっている。
　このような用途に粒径の小さい磁性粒子を用いると、該磁性粒子には、単位質量あたりの表面積が大きく、生化学物質の結合量が多いという特長があるものの、磁気分離時間が長い、即ち、磁気分離性に劣るという欠点があった。一方、磁気分離時間を短縮したい場合、即ち、磁気分離性を重視する場合には、例えば、特許文献１に記載のように、粒径の大きな磁性粒子を用いるべきであるが、一般に、磁性粒子の粒径が大きいほど、単位質量あたりに結合できる生化学物質の結合量は減少する。即ち、生化学物質結合量を多くすることと、優れた磁気分離性とを両立するのは困難であった。
　特に、従来の磁性粒子は磁性体含有量が少ないため、例えば、磁性粒子を小粒径化した場合には集磁性が低い、または、液中に分散したまま磁気分離することができないなどの問題があった。
特開平６－１４８１８９号公報
　本発明の一実施形態は、磁性体などの無機ナノ粒子を高含量で含む複合粒子を提供する。
　また、本発明の一実施形態は、小粒径であっても磁気分離性能に優れる、所望形状の複合粒子を高生産効率で容易に製造することができる方法を提供する。
　本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記構成の複合粒子等によれば、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の構成例は以下の通りである。
　なお、本明細書において、数値範囲等を表す記載「Ａ～Ｂ」は、Ａ以上Ｂ以下を意味し、ＡおよびＢをその数値範囲に含む。
　＜１＞　有機高分子および無機ナノ粒子を含む複合粒子であって、
　前記複合粒子中の前記無機ナノ粒子の含有量が８０質量％超であり、
　体積平均粒径が１０～１０００ｎｍである、複合粒子。
　＜２＞　体積平均粒径の変動係数が２０％以下である、＜１＞に記載の複合粒子。
　＜３＞　前記無機ナノ粒子の含有量が８０質量％を超え、９５質量％以下である、＜１＞または＜２＞に記載の複合粒子。
　＜４＞　前記無機ナノ粒子の体積平均粒径が５～２５ｎｍである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜５＞　前記複合粒子が、界面活性剤、酸基含有化合物、アミノ基含有化合物、シラン基含有化合物およびチタン原子含有化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜６＞　前記無機ナノ粒子が磁化可能な粒子である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜７＞　前記無機ナノ粒子が、鉄、チタン、コバルト、亜鉛、銅、マンガン、ニッケルもしくはガドリニウムの単体、それらの酸化物、またはそれらの合金；およびフェライト類からなる群より選択される１種または２種以上の無機材料からなる、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜８＞　前記無機ナノ粒子が金属酸化物粒子である、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜９＞　磁性粒子である、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜１０＞　少なくとも１つのリガンドを物理吸着可能な表面を有する、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜１１＞　少なくとも１つのリガンドと化学結合可能な表面を有する、＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載の複合粒子。
　＜１２＞　＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の複合粒子と、前記粒子を被覆するポリマー層とを有する、被覆粒子。
　＜１３＞　下記工程（１）～（３）を含む、複合粒子の製造方法。
　工程（１）：磁性流体、モノマーおよび重合開始剤を混合してモノマー混合液を調製する工程
　工程（２）：前記モノマー混合液を分散させてエマルションを調製する工程
　工程（３）：前記エマルション中のモノマーを重合させる工程
　＜１４＞　＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の複合粒子および＜１２＞に記載の被覆粒子から選ばれる固相担体がリガンドを有する、リガンド含有固相担体。
　＜１５＞　前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモンおよび神経伝達物質からなる群より選ばれる少なくとも１種である、＜１４＞に記載のリガンド含有固相担体。
　＜１６＞　イムノアッセイ用または核酸検出用である、＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の複合粒子、＜１２＞に記載の被覆粒子または＜１４＞もしくは＜１５＞に記載のリガンド含有固相担体。
　＜１７＞　＜１４＞または＜１５＞に記載のリガンド含有固相担体を用いる、試料中の標的物質を検出または分離する方法。
　本発明の一実施形態では、磁性体などの無機ナノ粒子を高含量で含む複合粒子を提供することができる。特に、体積平均粒径が前記のように小さく、無機ナノ粒子を高含量で含むにもかかわらず、無機ナノ粒子同士の凝集が起こりにくい複合粒子を提供することができる。
　このような複合粒子は、特に、無機ナノ粒子を高含量で含む粒子が要求されるバイオ工学、診断および製薬等の分野における保持体、固相担体または媒体として好適に用いることができる。
　また、本発明の一実施形態では、磁気分離性能に優れ、所望形状の（例：凝集体の発生が抑制され、略球状である）複合粒子を高生産効率で容易に製造することができる。
図１は、実施例１で得られた複合粒子の粒径分布を示す。 図２は、比較例１で得られた複合粒子の粒径分布を示す。
≪複合粒子≫
　本発明の一実施形態に係る複合粒子は、有機高分子および無機ナノ粒子を含む複合粒子であって、該無機ナノ粒子の含有量が８０質量％超であり、体積平均粒径が１０～１０００ｎｍである粒子である。本明細書において「複合粒子」とは、有機高分子および無機ナノ粒子を含む粒子であれば特に限定されないが、有機高分子中に無機ナノ粒子を含む粒子であることが好ましく、有機高分子からなるマトリックス中に無機ナノ粒子が分散された粒子であることがより好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
　本発明の一実施形態である複合粒子中の無機ナノ粒子の含有量は８０質量％超である。該含有量の下限は、好ましくは８２質量％、より好ましくは８５質量％であり、上限は、好ましくは９５質量％、より好ましくは９２質量％である。
　無機ナノ粒子の含有量が前記範囲にあると、バイオ工学、診断および製薬等の分野における保持体、固相担体または媒体としてより好適に用いることができる複合粒子となり、該無機ナノ粒子が磁性体である磁性粒子の場合には、磁気分離性能および物理的強度に優れる複合粒子が得られるため好ましい。
　本発明の一実施形態である複合粒子の体積平均粒径（以下単に「粒径」ともいう。）は１０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～７００ｎｍであり、より好ましくは８０～６００ｎｍである。
　複合粒子の粒径が前記範囲にあると、取扱い性に優れ、無機ナノ粒子を高含量で含みながらも粒子同士の凝集が起こりにくい複合粒子を容易に得ることができる。
　前記粒径が１０ｎｍ未満であると、得られる複合粒子の磁気応答性が劣り、１０００ｎｍを超えると、複合粒子の質量当たりの表面積が小さくなるため、反応性に劣ったり、生化学物質の結合量が少なくなる。
　本発明の一実施形態である複合粒子は、粒径が前記範囲にあるため、例えば、診断薬や医薬品研究用などに本発明の一実施形態である複合粒子を使用する場合には、該複合粒子の単位質量あたりに結合できるリガンド、好ましくは生化学物質（例：抗体、抗体フラグメント、蛋白質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸、核酸フラグメント、酵素）の結合量を多くすることができる。特に、無機ナノ粒子が磁性体である場合には、前記粒径の複合粒子であっても、磁気分離性能に優れる複合粒子となるため、従来困難であった、生化学物質結合量を多くすることと、優れた磁気分離性とを両立することができる。
　本発明の一実施形態である複合粒子は、粒径の変動係数（ＣＶ値）が２０％以下であることが好ましい。
　ＣＶ値が前記範囲にあると、バラつきが少なく、所望の特性が容易に発揮されやすい複合粒子を容易に得ることができ、特に、磁性体を含む複合粒子である場合には、磁気分離の際に分離時間にバラつきが生じ難いため好ましい。
　前記粒径およびＣＶ値は、例えば、動的光散乱式粒径分布測定装置（日機装（株）製、ナノトラックＵＰＡ－ＥＸ１５０）を用いて測定することができ、ＣＶ値は、具体的には、下記式によって算出することができる。
　ＣＶ（％）＝〔粒径標準偏差（σ）／数平均粒径（Ｄn）〕×１００
　本発明の一実施形態である複合粒子は、有機高分子と無機ナノ粒子とを含めば特に制限されず、これら以外の他の成分、例えば、該複合粒子を製造する際に磁性流体を用いる場合、該磁性流体中に含まれる従来公知の成分を含んでいてもよい。
＜有機高分子＞
　前記有機高分子は本発明の一実施形態である複合粒子のマトリックスとしての役割を有する。
　前記有機高分子としては公知の高分子を用いることができ、特に限定されないが、例えばエチレン性不飽和結合を有するモノマーを重合した高分子が好ましい。該モノマーとしては、スチレン系モノマー、塩化ビニル、ビニルエステル類、不飽和ニトリル類、（メタ）アクリル酸エステルおよびそれらの誘導体等が挙げられる。
　前記モノマーとしてより具体的には、スチレン、α－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系モノマー；塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２－エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルおよびそれらの誘導体等が挙げられるが、これら例示に限定されない。
　これらのモノマーは単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記有機高分子は、架橋性モノマーに由来する構成単位を有していてもよく、この構成単位により架橋されていてもよい。該架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレートおよびその異性体、トリアリルイソシアヌレートおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これら例示に限定されない。
　これら架橋性モノマーは単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記有機高分子としては、水系媒体中における分散性などに優れる複合粒子が得られる等の点から、スチレン系モノマーに由来する構成単位を含む高分子が好ましい。
　スチレン系モノマーに由来する構成単位の含有量は、水系媒体中における分散性などにより優れる複合粒子が得られる等の点から、複合粒子に含まれる有機高分子の総量を１００質量％として、好ましくは６０～１００質量％であり、より好ましくは７０～９５質量％であり、さらに好ましくは８０～９０質量％である。
　前記有機高分子は、少なくとも１つのリガンドを化学結合可能な表面を有する複合粒子、具体的には、反応性官能基を介して抗原や抗体などを結合させることができる複合粒子を容易に得ることができる等の点から、前記モノマーに由来する構成単位のほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来する構成単位を有していてもよい。
　前記反応性官能基としては、抗原や抗体などを共有結合により結合可能な基であることが好ましく、所望の用途に応じて適宜選択すればよいが、例えば、カルボキシ基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基が挙げられる。このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸－２－ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレートが挙げられるが、これら例示に限定されない。
　これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　本発明の一実施形態である複合粒子中の有機高分子の含有量は、無機ナノ粒子をしっかりと保持し、物理的強度に優れる複合粒子を容易に得ることができる等の点から、また、無機ナノ粒子が磁性体である場合には、さらに磁気分離性能に優れる複合粒子を得ることができる等の点から、無機ナノ粒子の含有量が前記範囲にあり、かつ、該無機ナノ粒子を保持することができる量であれば特に制限されないが、好ましくは２０質量％未満であり、上限は、より好ましくは１８質量％、特に好ましくは１５質量％であり、下限は、好ましくは５質量％、より好ましくは８質量％、特に好ましくは１０質量％である。
＜無機ナノ粒子＞
　前記無機ナノ粒子の材質としては特に制限されないが、磁化可能な材料が好ましく、磁性体がより好ましく、具体的には、鉄、チタン、コバルト、亜鉛、銅、マンガン、ニッケルもしくはガドリニウム等の単体、それらの酸化物、またはそれらの合金；およびフェライト類からなる群より選択される１種または２種以上の無機材料等が好ましい。中でも、磁気分離性能により優れる複合粒子が得られる等の点から、鉄酸化物である赤鉄鉱等の金属酸化物；磁鉄鉱、マンガンフェライト、ニッケルフェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等のフェライト類；コバルト合金；およびニッケル合金から選択することが好ましい。
　前記磁化可能な材料としては、磁気分離性能により優れる複合粒子が得られる等の点から、残留磁気がない超常磁性を有する材料が好ましい。超常磁性を有する材料としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、γ－三二酸化鉄（γ－Ｆｅ2Ｏ3）等の各種フェライト類が挙げられる。特に、金属酸化物が好ましく、磁化可能な金属酸化物がより好ましく四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）が特に好ましい。
　前記磁性体としては、Ｆｅ2+とＦｅ3+とを１：２の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下し、共沈反応させることで得られるＦｅ3Ｏ4等を用いることができる。また、ＥＭＧ２００１（フェローテック社製）等の磁性流体に含まれる磁性体、フェリコロイドＨＣ－５０（（株）タイホーコーザイ製）等の市販品も用いることができる。
　複合粒子中の前記無機ナノ粒子の粒径は、無機ナノ粒子の有する特性を十分に発揮できる複合粒子が得られ、特に、磁気分離性能に優れる複合粒子が得られる等の点から、好ましくは５～２５ｎｍであり、より好ましくは５～２０ｎｍであり、さらに好ましくは８～１５ｎｍである。
　前記有機高分子中における無機ナノ粒子の分散径の下限は、好ましくは１ｎｍであり、上限は好ましくは３０ｎｍである。前記分散径が１ｎｍ未満であると、無機ナノ粒子の製造自体が困難であることに加え、無機ナノ粒子が磁性体である場合の磁気応答特性が低下し、磁気分離性能が低下する傾向にある。また、前記分散径が３０ｎｍを超えると、無機ナノ粒子が磁性体である場合、残留磁気を生じやすくなり、自己凝集しやすくなることに加え、該磁性体が複合粒子の表面に露出しやすくなる。
　前記分散径のより好ましい下限は５ｎｍであり、より好ましい上限は２０ｎｍである。
　前記分散径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて測定することができる。
＜他の成分＞
　本発明の一実施形態である複合粒子は、該複合粒子を製造する際に磁性流体を用いる場合、該磁性流体中に含まれる従来公知の成分や、該複合粒子を製造する際に用いる界面活性剤などの従来公知の成分を含んでいてもよい。このような従来公知の成分としては、界面活性剤、該界面活性剤以外の、酸基含有化合物、アミノ基含有化合物、シラン基含有化合物およびチタン原子含有化合物などの安定化剤が挙げられるが、これら例示に限定されない。
　これらの安定化剤は、それぞれ単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記界面活性剤としては、特に制限されず、従来使用されている化合物を適宜使用することができ、例えば、オレイン酸塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩などのアニオン性界面活性剤；アミノ酸塩、第４級アンモニウム塩などのカチオン性界面活性剤；グリセリン脂肪酸エステルなどのエステル型、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型、脂肪酸ポリエチレングリコールなどのエステル・エーテル型等のノニオン性界面活性剤；アルキルベタインなどの両性界面活性剤が挙げられる。
　前記酸基含有化合物としては、例えば、特開２００８－２５８５６４号公報に記載のカルボキシ基またはスルホ基を有する化合物や無機酸が挙げられるが、これら例示に限定されない。
　前記アミノ基含有化合物としては、例えば、特開平７－９４３１５号公報に記載の含フッ素アミンが挙げられるが、これら例示に限定されない。
　前記シラン基含有化合物としては、例えば、シラン基含有表面処理剤が挙げられ、該表面処理剤としては、例えば、特開平１０－４００６号公報に記載のアルコキシシラン、特開２００４－２０５４８１号公報に記載のシラン化合物が挙げられるが、これら例示に限定されない。
　前記チタン原子含有化合物としては、チタニウムカップリング剤が挙げられ、該カップリング剤としては、例えば、チタニウムトリイソステアロイルイソプロポキサイド、（２－ｎ－ブトキシカルボニルベンゾイルオキシ）トリブトキシチタン、チタニウムアセチルアセトネート、イソ－ブトキシチタニウムエチルアセトアセテート、テトライソプロピルチタネート、テトラｎ－ブチルチタネートが挙げられるが、これら例示に限定されない。
　本発明の一実施形態である複合粒子は、抗原と抗体との免疫反応、ＤＮＡ同士またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーション等において優れた反応場を容易に提供でき、特に、診断薬や医薬品研究用などに容易に用いることができる等の点から、少なくとも１つのリガンドを物理吸着可能な表面を有する複合粒子、好ましくは疎水性相互作用により吸着することができる疎水性表面を有する複合粒子、または、少なくとも１つのリガンドを化学結合可能な表面を有する複合粒子、好ましくはリガンドと反応することができる反応性官能基を有する複合粒子であることが好ましい。
　前記リガンドを物理吸着可能な表面を有する複合粒子は、例えば、前記有機高分子が疎水性の高分子となるようなモノマーを用いることで得ることができ、前記リガンドを化学結合可能な複合粒子は、例えば、前記有機高分子を合成する際に、反応性官能基を有するモノマーを用いることで得ることができる。
　前記リガンドとしては、標的物質に対して適度なアフィニティを有するものであれば、その種類は特に限定されない。リガンドの具体例としては、抗体；抗原；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ヌクレオチド；ヌクレオシド；プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、レクチン、これらの機能性変異体等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；アミノ酸；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖類または多糖類；脂質；ビオチン等のビタミン；薬物；基質；ホルモン；神経伝達物質等が挙げられる。これらのリガンドはその化合物のまま用いてもよいが、これらの化合物を酵素処理等することによって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、前記リガンドは、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体、リコンビナントであってもよい。
　例えば、イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、イムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質が挙げられ、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。イムノグロブリン結合ドメインとしては、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインおよびプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインから選ばれる１種または２種以上のイムノグロブリン結合ドメインが好ましい。
　前記リガンドとしては、診断薬用等に適したリガンド含有固相担体を容易に得ることができる等の点から、抗体、抗原が好ましい。
　抗体、抗原は、標的物質と結合すれば特に制限されないが、例えば、抗アンチプラスミン抗体、抗Ｄダイマー抗体、抗ＦＤＰ抗体、抗ｔＰＡ抗体、抗トロンビン・アンチトロンビン複合体抗体、抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗体またはこれに対する抗原；抗ＢＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＴＳＨ抗体、抗フェリチン抗体、抗ＣＡ１９－９抗体等の腫瘍関連検査用抗体またはこれに対する抗原；抗アポリポタンパク抗体、抗β２－ミクログロブリン抗体、抗α１－ミクログロブリン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗体またはこれに対する抗原；抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗体またはこれに対する抗原；抗ジゴキシン抗体、抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗体またはこれに対する抗原；ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ－１抗原、ＨＩＶ－２抗原、ＨＴＬＶ－１抗原、マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原またはこれに対する抗体；ＤＮＡ抗原、熱変成ヒトＩｇＧ等の自己免疫関連検査用抗原またはこれに対する抗体等が挙げられる。
　なお、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
＜複合粒子の製造方法＞
　本発明の一実施形態である複合粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、懸濁重合法、マイクロサスペンジョン重合法、ミニエマルション重合法、分散重合法等を応用した方法が挙げられる。なかでも、粒径の小さな粒子を容易に製造することができることから、ミニエマルション重合法を応用した方法が好適である。
　さらに、本発明の一実施形態である複合粒子の製造方法としては、磁気分離性能に優れ、所望形状の（凝集体の発生が抑制され、略球状である）複合粒子を高生産効率で容易に製造することができる等の点から、下記工程（１）～（３）を含む方法（以下「本方法」ともいう。）がより好ましい。
　工程（１）：磁性流体、モノマーおよび重合開始剤を混合して流体状の混合物（以下、「モノマー混合液」という。）を調製する工程
　工程（２）：前記モノマー混合液を分散させてエマルションを調製する工程
　工程（３）：前記エマルション中のモノマーを重合させる工程
〈工程（１）〉
　前記工程（１）は、磁性流体、モノマーおよび重合開始剤を混合してモノマー混合液を調製する工程である。
　前記工程（１）では、このようなモノマー混合液を調製し、この混合液を用いてその後の工程を経て複合粒子を製造するため、磁性体（無機ナノ粒子）が高含量、特に前記範囲で含まれる複合粒子を、容易に、高生産効率で製造することができる。特に、前記工程（１）において、磁性流体を用いるため、該流体中に含まれる磁性体が均一分散した状態で複合粒子を製造することができ、有機高分子中における磁性体（無機ナノ粒子）の分散径が前記範囲にある複合粒子を容易に製造することができ、磁性体の凝集が抑制された所望の複合粒子を容易に製造することができる。また、前記工程（１）において、モノマーおよび重合開始剤を含む混合液を調製するため、磁性体が有機高分子からなるマトリックス中に均一に分散し、かつ、磁性体の凝集が生じ難いために、磁性体含量が８０質量％超という高含量の複合粒子を得ることができる。また、磁性体の凝集体が発生し難いために、複合粒子の粒径の制御および形状の制御が容易であり、粒度分布を狭くすることができる。
　一方、従来の複合粒子の製造方法においては、磁性体を所定の分散径で有機高分子中に微分散させる等のために、まず、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液を調製し、具体的には、磁性流体から液状媒体である水または有機溶媒を除去して磁性体を分離し、分離した磁性体にさらに別の溶媒を添加することで磁性体分散液を調製し、そこに、モノマー、重合開始剤および共界面活性剤を加えることでモノマー混合液を調製していた。
　しかしながら、本発明者が鋭意検討した結果、このような従来の製造方法では、磁性流体から液状媒体を除去する際に磁性体同士が凝集し、分散状態が悪化するため、結果として磁性体を高含量で含む複合粒子を容易に、高生産効率で得ることができないことが分かった。
　また、別の従来の複合粒子の製造方法においては、磁性体を含むエマルションにモノマーおよび重合開始剤を添加していた。
　しかしながら、本発明者が鋭意検討した結果、このような従来の製造方法では、モノマーを重合する際に、略球状以外の形状になったり、凝集体が発生したりして、磁性体を高含量で含む所望形状の複合粒子を容易に、高生産効率で製造することができないことが分かった。
　従って、本方法では、磁性流体を処理、例えば、磁性流体から液状媒体を除去する工程を経ることなく、そのまま磁性流体を用い、かつ、該流体とモノマーおよび重合開始剤とを混合してモノマー混合液を調製することが好ましい。
（磁性流体）
　工程（１）で用いる磁性流体は、無機ナノ粒子を含む。
　通常、磁性流体は、（ａ）無機ナノ粒子である直径数ｎｍ～数十ｎｍの磁性体と、（ｂ）水、有機溶剤または油などの液体（分散媒）と、（ｃ）磁性体を分散媒に安定に分散させるための安定化剤とを含む。
　磁性流体中では、通常、磁性体表面に界面活性剤などの安定化剤層が存在するために、磁性体同士で反発力が働き、凝集や沈降が起こらず、磁性体は該流体中で安定な分散状態を保つ。また、磁性流体は、磁界の発生していない場合には通常の液体として振る舞うが、磁場をかけると液体の粘度が変わり、あたかも液体全体が強磁性を有しているかのように挙動する性質を持っている。また、外部から磁界、重力、遠心力などの外力が加えられても流体中の無機ナノ粒子、具体的には磁性体の分散状態が維持され、このため、液体にもかかわらず磁石に吸引されるという特徴がある。
　（ａ）直径数ｎｍ～数十ｎｍの磁性体としては、直径数ｎｍ～数十ｎｍの、好ましくは粒径が５～２５ｎｍの前記磁性体材料を用いることができ、好ましい粒子（材料、粒径等）も前記無機ナノ粒子の欄で挙げたのと同様である。
　該磁性体は、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　（ｂ）水、有機溶剤または油などの液体（分散媒）としては、磁性体の分散性に優れ、磁性体を溶解させず、かつ、モノマーと混合可能なものであることが好ましい。このような分散媒としては、有機溶剤が好ましく、該有機溶剤としては、脂肪族炭化水素系溶媒を含有することが好適である。前記脂肪族炭化水素系溶媒としては、磁性体の分散性に特に優れることから、炭素数５～２０の直鎖または分岐の化合物が好適であり、炭素数５～７の直鎖または分岐の化合物がより好適である。具体的には、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、イソブタン、イソペンタン等が挙げられるが、これら例示に限定されない。
　前記分散媒は、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記有機溶剤中における脂肪族炭化水素系溶媒の含有量としては、８０質量％以上であることが好ましい。８０質量％以上であると、磁性体の分散性に優れ、本発明の一実施形態である複合粒子中における磁性体の凝集を抑制でき、本発明の一実施形態である複合粒子における磁性体含量のバラツキも抑制できる。
　前記磁性流体中における有機溶剤の含有量としては、磁性体１００質量部に対して、好ましくは下限が２０質量部であり、好ましくは上限が５００質量部である。有機溶剤の含有量が２０質量部未満であると、充分に磁性体を分散できない場合があり、５００質量部を超えると、下記工程（３）の後に残存溶剤の除去が必要となり、複合粒子製造の操作が煩雑となることがある。前記有機溶剤の含有量のより好ましい下限は３０質量部であり、より好ましい上限は３００質量部である。
　（ｃ）磁性体を分散媒に安定に分散させるための安定化剤としては、磁性流体に従来使用されているものを適宜使用することができ、前記複合粒子の他の成分の欄で説明した安定化剤と同様の安定化剤等が挙げられる。
　該安定化剤は、それぞれ単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよく、例えば、磁性流体は、界面活性剤、酸基含有化合物、アミノ基含有化合物、シラン基含有化合物およびチタン原子含有化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましい。
（モノマー）
　工程（１）で用いるモノマーとしては、前記有機高分子を合成する際に用いるモノマーと同様のモノマーが挙げられ、好ましいモノマーも同様である。
　該モノマーは、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記モノマーの使用量としては特に限定されないが、得られる複合粒子中の無機ナノ粒子（磁性体）含量が前記範囲となる量であることが好ましく、具体的には、磁性流体中の磁性体１００質量部に対し、好ましくは１～１００質量部、より好ましくは３～５０質量部、さらに好ましくは５質量部以上、特に好ましくは１０質量部以上、さらに好ましくは２０質量部未満である。
　このような量でモノマーを用いると、無機ナノ粒子（磁性体）の含有量が前記範囲内にあり、磁気分離性能および物理的強度に優れる複合粒子を容易に得ることができる。
（重合開始剤）
　工程（１）で用いる重合開始剤としては、熱重合性のラジカル重合開始剤が好ましく、例えば、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス－（２－メチルプロパンニトリル）、２，２’－アゾビス－（２，４－ジメチルペンタンニトリル）、２，２’－アゾビス－（２－メチルブタンニトリル）、１，１’－アゾビス－（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’－アゾビス－（２，４－ジメチル－４－メトキシバレロニトリル）、２，２’－アゾビス－（２，４－ジメチルバレロニトリル）、２，２’－アゾビス－（２－アミジノプロパン）塩酸塩等のアゾ系開始剤；過酸化ベンゾイル、クメンヒドロペルオキシド、過酸化水素、過酸化アセチル、過酸化ラウロイル、過硫酸塩（例：過硫酸アンモニウム）、過酸化エステル（例：ｔ－ブチルペルオクテート、α－クミルペルオキシピバレート）等の過酸化物タイプのラジカル系重合開始剤；が挙げられが、これら例示に限定されない。
　該重合開始剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記重合開始剤の使用量としては特に限定されないが、モノマー１００質量部に対して、好ましくは０．１～３０質量部、より好ましくは０．５～２０質量部、さらに好ましくは１～１０質量部である。
　磁性流体、モノマーおよび重合開始剤を混合する際の混合の順番は特に制限されず、また、この混合の際には、必要に応じて界面活性剤を用いてもよい。
〈工程（２）〉
　前記工程（２）は、前記モノマー混合液を分散させてエマルションを調製する工程である。この工程（２）では、好ましくは、前記モノマー混合液は、界面活性剤を溶解させた水系媒体に分散される。
　前記水系媒体としては特に限定されず、通常は蒸留水やイオン交換水等の水が用いられる。
　水系媒体とは、少なくとも５０質量％以上を水が占める媒体をいう。
　前記界面活性剤としては特に限定されず、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤のいずれも用いることができる。なかでも、アニオン性界面活性剤が好適である。
　前記界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　アニオン性界面活性剤としては特に限定されず、ドデシル硫酸、ドデシルベンゼン硫酸、デシルベンゼン硫酸、ウンデシルベンゼン硫酸、トリデシルベンゼン硫酸、ノニルベンゼン硫酸などのナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩等が挙げられる。
　カチオン性界面活性剤としては特に限定されず、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。
　ノニオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、ポリビニルアルコールが挙げられる。また、ノニオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｘ－１１４、Ｘ－３０５、Ｎ－１０１（以上、ユニオンカーバイド社製）、Ｔｗｅｅｎ　２０、４０、６０、８０、８５（以上、アイ・シー・アイ社製）、Ｂｒｉｊ　３５、５８、７６、９８（以上、アイ・シー・アイ社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（シェル社製）、Ｉｇｅｐｏｌ　ＣＯ５３０、ＣＯ６３０、ＣＯ７２０、ＣＯ７３０（ローヌ・プーラン社製）等の市販品を用いることができる。
　また、前記界面活性剤としては、前記モノマーと重合可能な反応基を有する反応性界面活性剤も用いることができる。該反応基としては、例えば、ビニル基、アリル基、（メタ）アクリロイル基等のエチレン性不飽和基が好適である。
　前記界面活性剤の使用量としては特に限定されないが、エマルションを容易に調製することができる等の点から、モノマー混合液１００質量部に対して、好ましくは０．０１～１００質量部、より好ましくは０．１～５質量部である。
　モノマー混合液を分散させる方法としては、例えば、界面活性剤を含む水系媒体中に前記モノマー混合液を加え、高い剪断力を発生させる剪断混合装置によって乳化させる方法が挙げられる。
　前記剪断混合装置としては特に限定されず、例えば、ホモジナイザー（ＩＫＡ社製）、ヒストコロン（マイクロテック・ニチオン社製）、ポリトロン（キネマティカ社製）およびＴＫオートホモミキサー（特殊機化工業（株）製）等のバッチ式乳化機；エバラマイルダー（大平洋機工（株）製）、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー（特殊機化工業（株）製）、コロイドミル（（株）神鋼環境ソリューション製）、クレアミックス（エム・テクニック社製）、スラッシャー、トリゴナル湿式微粉砕機（日本コークス工業（株）製）、キャピトロン（ユーロテック社製）およびファインフローミル（太平洋機工（株）製）等の連続式乳化機；マイクロフルイダイザー（みずほ工業（株）製）、ナノマイザー（ナノマイザー社製）およびＡＰＶガウリン（ガウリン社製）等の高圧乳化機；膜乳化機（冷化工業（株）製）等の膜乳化機；バイブロミキサー（冷化工業（株）製）等の振動式乳化機；超音波ホモジナイザー（ブランソン社製）等の超音波乳化機；が挙げられ、なかでも、プローブ式の超音波分散機が好適に用いられる。
　工程（２）では、前記と同様の効果の点から、得られるエマルション中の液滴の粒径が、所望の複合粒子の粒径と同程度になるように、前記モノマー混合液を分散させることが好ましく、具体的には、前記複合粒子の粒径と同様（好ましい範囲も同様）の粒径の液滴を含むエマルションが得られるように、前記モノマー混合液を分散させることが好ましい。
　このようなモノマー混合液の分散条件としては、例えば、前記モノマー混合液を分散させる際に、超音波分散機を用いる場合、超音波出力の好ましい下限は５Ｗであり、好ましい上限は２００Ｗである。超音波出力が５Ｗ未満の場合、分散力不足により大きな液滴が生じ、工程（３）における重合反応が困難になる場合があり、２００Ｗを超えると、所望の複合粒子が得られない場合がある。
　また、超音波の照射時間としては、超音波出力にもよるが、１回の超音波照射の時間が１０秒～１０分間の範囲で行うことが好ましく、３０秒～５分間の範囲がより好ましく、１分～３分間の範囲がさらに好ましい。
　なお、超音波の照射は１回でも複数回でもよい。
〈工程（３）〉
　前記工程（３）は、前記エマルション中のモノマーを重合させる工程である。この工程により、複合粒子を得ることができる。
　前記重合の条件は、用いるモノマー等により適宜選択すればよいが、通常、５０～９５℃で５～２４時間程度加熱することにより行う。
　なお、従来の複合粒子の製造方法では、磁性体含量の異なる複合粒子が製造されるため、モノマーを重合させた後に、所望の磁性体含量の複合粒子を分画し、回収する工程が必要であったが、本方法によれば、磁性体含量が略一定の複合粒子を得ることができるため、このような分画する工程を要することなく、磁性体を高含量で含む複合粒子を容易に調製することができる。このため、本方法は生産性に優れる方法であるといえる。
〈他の工程〉
　本方法は、必要により、前記工程（１）～（３）以外の他の工程を含んでもよい。
　該他の工程としては、例えば、前記工程（３）で得られた複合粒子分散液を、磁気分離法により水等により洗浄する工程が挙げられる。
≪被覆粒子≫
　本発明の一実施形態である被覆粒子は、前記本発明の一実施形態である複合粒子と、該複合粒子を被覆するポリマー層とを有する。前記本発明の一実施形態である複合粒子は、そのまま様々な用途に用いることができるが、所望の用途に応じた粒子表面とするために、該複合粒子をポリマー層で被覆することが好ましい。
　該ポリマー層は、例えば、複合粒子の存在下で、（共）重合性モノマーを、必要により、重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などの存在下で、液体中で（共）重合を行うことにより形成することができる。このようにポリマー層を形成することにより、当該ポリマー層の表面に所望の官能基を導入することができるなど、所望の表面特性を有する被覆粒子を容易に得ることができるため好ましい。また、前記ポリマー層を形成後、エチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルのアルカリ加水分解、ビニルエステルのアルカリけん化などの方法により被覆粒子表面に存在しうる官能基を改変することも可能である。
　さらに、前記ポリマー層の形成を２回以上行ってもよい。すなわち、前記被覆粒子は、２層以上のポリマー層を有していてもよい。
　なお、ポリマー層をこのように形成する場合の、複合粒子と（共）重合性モノマーとを接触させる方法としては特に制限されないが、例えば、前記（共）重合性モノマーを、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれかにより複合粒子または複合粒子分散液に添加する方法が挙げられる。
　前記重合の条件は、用いるモノマーや重合開始剤等により適宜選択すればよいが、重合温度は、通常１０～９０℃、好ましくは３０～８５℃であり、重合時間は、通常１～３０時間程度である。
　前記被覆粒子は、斯かる粒子中の無機ナノ粒子の含有量によって、バイオ工学、診断および製薬等の分野における保持体、固相担体または媒体としてより好適に用いることができる被覆粒子となり、該無機ナノ粒子が磁性体である場合には、磁気分離性能に優れる被覆粒子が得られる等の点から、被覆粒子中の無機ナノ粒子の含有量は、好ましくは１～９５質量％、より好ましくは３５～９５質量％、さらに好ましくは４５～９５質量％である。
　前記ポリマー層の成分としては特に制限されないが、ビニル系ポリマーが好ましく、その合成に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類；アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸エステル；アクロレイン；などが挙げられるが、これら例示に限定されない。
　前記ビニル系ポリマーは単独重合体であっても、２種以上のモノマーの共重合体であってもよい。
　また、前記ポリマー層は、前記ビニル系モノマーと、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン；（メタ）アクリル酸、イタコン酸、無水マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物またはその酸無水物；（メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、連鎖数２～４０のポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート、アリル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、スチレンスルホン酸およびそのナトリウム塩、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸およびそのナトリウム塩、イソプレンスルホン酸およびそのナトリウム塩などの、前記ビニル系モノマーと共重合可能なモノマーとの共重合体からなる層であってもよい。
　さらに、前記ポリマー層は、前記モノマーに由来する構成単位のほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来する構成単位を有していてもよい。
　該反応性官能基としては、抗原や抗体などを共有結合により結合可能な基であることが好ましく、所望の用途に応じて適宜選択すればよいが、例えば、カルボキシ基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基が挙げられる。
　このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸－２－ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレートが挙げられるが、これら例示に限定されない。
　これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記ポリマー層の含有量（厚み）は特に制限されず、得られる被覆粒子における無機ナノ粒子の含有量が前記範囲となるような量であることが好ましい。
　前記重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性の重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると複合粒子表面における重合ではなく、複合粒子を含まないポリマー層のみからなる新粒子が多量に生じる傾向がある。
　前記油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ｔ－ブチルペルオキシ２－エチルヘキサネート、ジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化物・アゾ化合物などを挙げることができるが、これら例示に限定されない。
　前記重合開始剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記重合開始剤の使用量は、モノマー１００質量部に対し、好ましくは０．０１～８質量部である。
　前記乳化剤としては、通常使用されるアニオン性界面活性剤またはノニオン性界面活性剤等を用いることができる。
　前記乳化剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　前記アニオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの他、ラテムルＳ－１８０Ａ（花王（株）製）、エレミノールＪＳ－２（三洋化成（株）製）、アクアロンＨＳ－１０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＳＥ－１０Ｎ（（株）ＡＤＥＫＡ製）などが挙げられるが、これら例示に限定されない。
　また、ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどの他、アクアロンＲＳ－２０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＮＥ－２０（（株）ＡＤＥＫＡ製）などが挙げられる。
　前記被覆粒子としては、抗原と抗体との免疫反応、ＤＮＡ同士またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーション等において優れた反応場を容易に提供でき、特に、診断薬や医薬品研究用などに容易に用いることができる等の点から、少なくとも１つのリガンドを物理吸着可能な表面を有する被覆粒子、好ましくは疎水性相互作用により吸着することができる疎水性表面を有する被覆粒子、または、少なくとも１つのリガンドを化学結合可能な表面を有する被覆粒子、好ましくはリガンドと反応することができる反応性官能基を有する被覆粒子であることが好ましく、前記モノマーに由来する構成単位のほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来する構成単位を有していてもよい。
≪リガンド含有固相担体≫
　本発明の一実施形態であるリガンド含有固相担体は、リガンドを有する前記複合粒子またはリガンドを有する前記被覆粒子であり、前記複合粒子および前記被覆粒子から選ばれる固相担体にリガンドを結合させた担体である。
　該リガンドとしては、前記複合粒子の欄で説明したリガンドと同様のリガンド等が挙げられる。これらの中でも、診断薬用等に適したリガンド含有固相担体を容易に得ることができる等の点から、抗体、抗原が好ましい。
　該リガンドは、１種でも２種以上でもよい。
　リガンドの結合は常法に従い行えばよいが、共有結合法で行うことが好ましい。例えば、反応性官能基がカルボキシ基であり、リガンドがアミノ基を有するものである場合は、脱水縮合剤を用いて結合させればよい。
＜用途＞
　本発明の一実施形態である複合粒子、被覆粒子およびリガンド含有固相担体は、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用でき、例えば、バイオ工学、診断および製薬の分野で保持体、固相担体または媒体として好適に用いることができ、具体的には、抗原、抗体、生体分子、核酸その他等の検体を分離および/または検知する手段として好適に用いることができ、特に、イムノアッセイおよび核酸検出に特に適する。
　このような用途では、本発明の一実施形態である複合粒子または被覆粒子をそのまま用いてもよいし、本発明の一実施形態である複合粒子または被覆粒子に前記リガンドを結合させたリガンド含有固相担体を用いてもよい。
　より具体的には、本発明の一実施形態である複合粒子または被覆粒子にタンパク質等の抗原または抗体を結合し、測定対象である抗体または抗原との抗原抗体反応により、測定対象を定量・定性してもよく；本発明の一実施形態である複合粒子および被覆粒子に抗体を結合し、抗原であるウイルス・細菌・細胞・ホルモン・ダイオキシン類等の化学物質、などを結合して回収・濃縮してもよく；本発明の一実施形態である複合粒子および被覆粒子にＤＮＡなどの核酸アナログを結合して、核酸のハイブリダイゼーションを利用した核酸の回収・検出をしたり、核酸に結合するタンパク質や色素等の化学物質を回収・検出してもよく；本発明の一実施形態である複合粒子および被覆粒子にアビジンまたはビオチンを結合してビオチンまたはアビジンを有する分子を回収して検出してもよく；本発明の一実施形態である複合粒子および被覆粒子に抗体や抗原を結合し、比色法や化学発光を利用して酵素免疫測定をしてもよい。
　また、従来の、９６穴プレート等を担体として用いていた診断項目については、本発明の一実施形態である複合粒子、被覆粒子またはリガンド含有固相担体を用いることによって、磁性を利用した自動分析機に置き換えて使用できる。診断の対象となる物質としては、生体由来のタンパク質、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモンなどのホルモン；各種ガン細胞；前立腺特異マーカー、膀胱ガンマーカーなどのガンのマーカーとなるタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどのウイルス；淋菌、ＭＲＳＡなどの細菌；カンジダ、クリプトコックス等の真菌；トキソプラズマ等の原虫・寄生虫；これらウイルス・細菌・真菌・原虫・寄生虫などの構成要素であるタンパク質や核酸；ダイオキシン類等の環境汚染物質；抗生物質や抗てんかん剤など医薬品等の化学物質；等が挙げられる。
＜標的物質を検出または分離する方法＞
　本発明の一実施形態に係る試料中の標的物質を検出または分離する方法は、前記リガンド含有固相担体を用いる。
　前記標的物質はリガンドと結合する物質であり、具体的には、抗原；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；細胞（正常細胞、大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞）；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質等が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の小分子化合物でもよい。なお、標的物質は、蛍光物質などにより標識化されたものでもよい。
　前記試料は、前記標的物質を含む試料または標的物質を含む可能性がある試料であればよく、具体的には、血液、血漿、血清、標的物質を含有するバッファー溶液等が挙げられる。
　本発明の一実施形態である、標的物質を検出または分離する方法は、前記リガンド含有固相担体を用いる以外は常法にしたがって行えばよい。例えば、前記リガンド含有固相担体と標的物質を含む試料を、混合するなどして接触させる工程（接触工程）、および標的物質を捕捉したリガンド含有固相担体を、磁石などを用いて試料から分離する工程（分離工程）を含む方法が挙げられる。なお、当該分離工程の後に、標的物質を検出する工程、またはリガンドと標的物質を解離させる工程を含んでもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
　下記実施例および比較例における溶液中の分散質または粒子の体積平均粒径は、動的光散乱式粒径分布測定装置（日機装（株）製、ナノトラックＵＰＡ－ＥＸ１５０）を用いて測定した。なお、測定結果の一例として、実施例１で得られた複合粒子の粒径分布を図１に示し、比較例１で得られた複合粒子の粒径分布を図２に示す。図１および図２の粒径値は、いずれも体積平均粒径である。
　また、下記実施例および比較例で得られた複合粒子中の磁性体含量は、差動型示差熱天秤（（株）リガク製、ＴＧ－８１２０）を用いて５００℃で測定した。
　下記実施例および比較例では、磁性流体として、「ＥＭＧ２００１」（該磁性流体２７．０ｇ中に磁性体を１４．３ｇ含有、ヘプタン分散液、フェローテック社製）を用いた。この磁性流体に磁界、重力または遠心力を加えても、該磁性流体中に磁性体の濃度ムラは生じず、該磁性流体中における磁性体の分散状態は維持されていた。このような分散状態は、沈殿がないことや、磁性体と分散液との分離がないことを目視で確認することで判断することができる。
　［実施例１］
　磁性流体「ＥＭＧ２００１」２７．０ｇに、スチレン１．３５ｇ、ジビニルベンゼン０．１５ｇおよび２，２’－アゾビスイソブチロニトリル０．０６ｇを加え、混合してモノマー混合液を得た。次いで、ドデシル硫酸ナトリウム０．７５ｇを溶解させた水溶液７５ｇを、得られたモノマー混合液に加え、超音波ホモジナイザー（（株）日本精機製作所製、ＵＳ３００Ｔ）を用いて、氷冷下で、超音波処理（２分間の超音波照射（超音波出力：１５０Ｗ）と、その後の２分間の超音波照射の停止）を行った。この超音波処理を１０回繰り返し、磁性体を含むモノマー混合液が水中に分散したエマルションを調製した。得られたエマルション中の液滴の体積平均粒径は１０４ｎｍであった。
　次いで、得られたエマルションを、７０℃で７時間重合し、磁気分離により水で洗浄することで、複合粒子Ａの分散液を得た。こうして得られた粒子分散液中の複合粒子Ａの体積平均粒径は１０３ｎｍであり、該複合粒子Ａの磁性体含量は９０質量％であった。この磁性体含量の値は、理論値と一致しており、生産効率よく、複合粒子（分散液）が得られたことが分かる。なお、理論値（質量％）とは、仕込んだ磁性体、モノマー、開始剤が全て複合粒子となったと仮定した時の値を意味し、「磁性体量×１００／（磁性体量＋各モノマー量＋開始剤量）」より求められる。また、図１に示すように、得られた複合粒子の粒径分布が一群となったことから、所望形状の複合粒子を高生産効率で得ることができたことが分かる。
　［実施例２］
　使用するモノマーを、スチレン１．３５ｇおよびジビニルベンゼン０．１５ｇから、メタクリル酸メチル１．３５ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（以下「ＴＭＰ」という。）０．１５ｇに変更した以外は、実施例１と同様にして、複合粒子Ｂ（の分散液）を作製したところ、該複合粒子Ｂの体積平均粒径は１０７ｎｍであり、該複合粒子Ｂの磁性体含量は８９質量％であった。この磁性体含量の値は、理論値との差が１質量％と微差であるため、生産効率よく、複合粒子（分散液）が得られたことが分かる。
　［実施例３］
　メタクリル酸メチル１．２ｇ、ＴＭＰ０．３ｇ、メタクリル酸０．３ｇおよびジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日油（株）製；パーロイル３５５）０．１ｇを混合した液に、ドデシル硫酸ナトリウム０．１５ｇを溶解した水溶液３０ｇを添加し、超音波ホモジナイザー（ＵＳ３００Ｔ）によりエマルションｃを作製した。
　セパラブルフラスコに、実施例１で作製した複合粒子Ａの分散液７３．５ｇ（複合粒子Ａ３．０ｇ含有）を入れ、水浴で温度を６０℃にコントロールしながら、前記エマルションｃを２時間かけて滴下した。滴下終了後、温度を６０℃に保持し、１時間かけて重合し、８０℃に昇温した後、２時間かけて反応を終了させた。得られた分散液を、磁気分離により水で洗浄することで、被覆粒子Ｃの分散液を作製した。得られた粒子分散液中の被覆粒子Ｃの体積平均粒径は１０９ｎｍであり、該被覆粒子Ｃの磁性体含量は５９質量％であった。
　［実施例４］
　ドデシル硫酸ナトリウムの使用量を０．３ｇに、超音波処理を４回繰り返すことに変更した以外は、実施例１と同様にして、複合粒子Ｅ（の分散液）を作製したところ、得られた複合粒子Ｅの体積平均粒径は２３２ｎｍであり、該複合粒子Ｅの磁性体含量は８６質量％であった。
　［実施例５］
　前記超音波処理を、１分間の超音波照射（超音波出力：１５０Ｗ）と、その後の１分間の超音波照射の停止に変更し、この超音波処理を３回繰り返したこと以外は、実施例１と同様にして、複合粒子Ｆ（の分散液）を作製したところ、得られた複合粒子Ｆの体積平均粒径は５１５ｎｍであり、該複合粒子Ｆの磁性体含量は８８質量％であった。
　［実施例６］
　使用する装置を、超音波ホモジナイザー（ＵＳ３００Ｔ）から、コロイドミル（ＩＫＡ社製、ｍａｇｉｃ ＬＡＢ）に変更した以外は、実施例１と同様にして、エマルションを調製した。なお、コロイドミルを用いた際の処理条件は、２５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎとした。得られたエマルション中の液滴の体積平均粒径は１１０ｎｍであった。
　続いて、実施例１と同様に重合し、複合粒子Ｇ（の分散液）を作製したところ、得られた複合粒子Ｇの体積平均粒径は１０８ｎｍであり、該複合粒子Ｇの磁性体含量は８９質量％であった。
　［実施例７］
　複合粒子Ａ１０ｍｇをｐＨ９．５のホウ酸バッファーに分散させ、これにストレプトアビジン０．２ｍｇを溶解させた溶液０．１ｍＬを添加し、３７℃で１６時間回転撹拌した後、トリスバッファーで４回洗浄して、複合粒子Ａの表面にストレプトアビジンを固定化したストレプトアビジン結合粒子を調製した。ビシンニコン酸（ＢＣＡ）アッセイにより、ストレプトアビジンの結合量を調べたところ、２０μｇ／ｍｇ複合粒子であった。
　［実施例８］
　被覆粒子Ｃ１０ｍｇをｐＨ５．０の１００ｍＭ　ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonicacid, monohydrate）バッファー１ｍＬに分散させ、そこに、１－エチル－３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ、（株）同仁化学研究所製）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにｐＨ５．０の１００ｍＭ　ＭＥＳバッファーに溶解させたＷＳＣ溶液０．１ｍＬを添加し、室温で２時間回転撹拌した。そこに、さらに、ストレプトアビジン０．２ｍｇを溶解させたｐＨ５．０の１００ｍＭ　ＭＥＳバッファー０．１ｍＬを添加し、室温で８時間回転撹拌した後、トリスバッファーで４回洗浄することにより、未反応のストレプトアビジンを除去し、被覆粒子Ｃの表面にストレプトアビジンを固定化したストレプトアビジン結合粒子を調製した。ＢＣＡアッセイにより、ストレプトアビジンの結合量を調べたところ、１８μｇ／ｍｇ複合粒子であった。
　［実施例９］
　エマルションｃを作製する際に使用した、メタクリル酸メチル１．２ｇ、ＴＭＰ０．３ｇおよびメタクリル酸０．３ｇを、グリシジルメタクリレート１．２ｇおよびメタクリル酸０．３ｇに変更し、複合粒子Ａの分散液を、実施例３で作製した被覆粒子Ｃの分散液７３．５ｇ（複合粒子Ａ１．５ｇ含有）に変更した以外は、実施例３と同様にして、被覆粒子Ｄ（の分散液）を作製したところ、該被覆粒子Ｄの体積平均粒径は１６５ｎｍであり、該被覆粒子Ｄの磁性体含量は４１質量％であった。
　被覆粒子Ｃの代わりに、被覆粒子Ｄを用いた以外は実施例８と同様にして、ストレプトアビジン結合粒子を調製した。ＢＣＡアッセイにより、ストレプトアビジンの結合量を調べたところ、１７μｇ／ｍｇ複合粒子であった。
　［比較例１］
　磁性流体「ＥＭＧ２００１」２７．０ｇを、インキュベーター中で、８０℃、１２時間乾燥させ、濃縮された磁性体１７ｇを得た。得られた磁性体にヘプタン１０ｇを加え、一晩撹拌することで、磁性体分散液を得た。得られた磁性体分散液に磁石を近づけることで磁界を印加したところ、磁性体分散液中の磁性体は、磁石に引き寄せられ、分散状態が維持されなかった。よって、前記磁性体分散液は磁性流体とは異なるものであった。
　磁性流体「ＥＭＧ２００１」の代わりに、得られた磁性体分散液を用いた以外は、実施例１と同様にして複合粒子（の分散液）を作製したところ、図２に示すように、粒径分布が二群となった複合粒子が得られ、また、目視で確認したところ、得られた複合粒子の分散液内には、磁性体の凝集体が存在していた。得られた複合粒子の体積平均粒径は１７７ｎｍであり、該複合粒子の磁性体含量は６８質量％であった。この磁性体含量の値は、理論値との差が２４質量％と大きくかけ離れており、また、図２に示すように、得られた複合粒子の粒径分布が二群となったことから、所望形状の複合粒子（分散液）を生産効率よく得ることができなかったことが分かる。
　なお、前記磁性体分散液は磁性流体とは異なるものであったため、比較例１の前記複合粒子の製造方法は、本方法には該当しない。
　［比較例２］
　磁性流体「ＥＭＧ２００１」２７．０ｇを、ドデシル硫酸ナトリウム０．７５ｇを溶解させた水溶液７５ｇに加えた混合液を、実施例１と同様に超音波処理することで、磁性流体が水中に分散したエマルションを調製した。得られたエマルション中の液滴の体積平均粒径は９８ｎｍであった。
　次いで、得られたエマルションに、スチレン１．３５ｇ、ジビニルベンゼン０．１５ｇおよび２，２’－アゾビスイソブチロニトリル０．０６ｇの混合液を添加した。その後７０℃に昇温し、７時間重合し、磁気分離により水で洗浄することで、複合粒子分散液を得た。こうして得られた複合粒子分散液中の複合粒子の体積平均粒径は１３１ｎｍであり、該複合粒子の磁性体含量は７７質量％であった。この磁性体含量の値は、理論値との差が１３質量％と大きくかけ離れており、生産効率よく、複合粒子（分散液）を得ることができなかったことが分かる。なお、得られた複合粒子分散液には、磁性体の凝集体が存在しており、さらに、球状ではない異形の複合粒子や該複合粒子の凝集物が混在していた。
　前記実施例および比較例で得られた複合粒子（の分散液）についての結果を下記表１に示す。なお、下記表１において、得られた複合粒子中の磁性体含量と理論値との差が、１０質量％以下の場合を、生産効率が「○」（生産効率に優れ、磁性体含量をコントロールできる）と判断し、１０質量％を超える場合を、生産効率が「×」（生産効率が劣る、磁性体含量をコントロールできない）と判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、実施例１、２および４～６では、磁性体含量の多い、体積平均粒径１００～５００ｎｍ程度の複合粒子を、生産性よく、容易に安定して作製することができた。
　一方、比較例１では、磁性流体を用いないため、磁性体の分散が不均一となり、磁性体の凝集体が生じ、比較例２では、磁性体の凝集体が生じ、かつ、エマルション中の液滴とモノマーとの接触が不均一となり、得られた複合粒子の一部は、球状ではない異形であったり、凝集物（塊）となっていた。また、比較例１および２では、磁性体含量の多い複合粒子を作製できず、生産効率が著しく低下した。
　[実施例１０]
　複合粒子Ｃの分散液を磁気分離して上清を除き、０．１Ｍ　ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５）で２回洗浄した。洗浄後、磁気分離して上清を除き、０．１Ｍ　ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５）および抗ＰＳＡ（前立腺特異抗原）抗体溶液を、複合粒子Ｃ１ｍｇあたり抗体１０μｇとなるように加え、さらにＥＤＣ（１－エチル－３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（（株）同仁化学研究所製、３ｍｇ／ｍＬ）を複合粒子Ｃ１ｍｇあたり１００μｇとなるように加えて２５℃で２時間転倒混和した。反応終了後、磁気分離して上清を除き、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で２回洗浄した。ついで、磁気分離して上清を除き、５０ｍＭのトリスバッファーにバッファーを置換し、さらに磁気分離して上清を除いた後、得られた粒子をＢＳＡ含有バッファー（１重量％ＢＳＡ含有５０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．５）に懸濁させることで、抗体結合粒子分散液（複合粒子濃度０．０５重量％）を得た。
　調製した抗体結合粒子分散液２５μＬを分注し、次いで、分注した抗体結合粒子分散液に、サンプル（ヒト血清または標準溶液（ＰＳＡ抗原含有液：０～１０００ｐｇ／ｍＬ））２５μＬを分注し、さらにＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗ＰＳＡ抗体液２５μＬを分注し、２５℃で２０分間反応させた。反応後、磁気分離にて粒子を分離した後、９６ｗｅｌｌプレート用ウォッシャー（テカンジャパン（株）製、Ｈｙｄｒｏ　Ｆｌｅｘ）を用い、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で洗浄を行った後、ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ（株）製）を添加し、２５℃で５分間反応させ、発光強度を測定（ＡＲＶＯ　Ｘ５　（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製））した。結果を表２に示す。
　抗原濃度に依存し、希釈直線性のある発光強度が得られたため、複合粒子Ｃは、免疫測定用の固相担体として使用できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (17)

  1. 　有機高分子および無機ナノ粒子を含む複合粒子であって、
    　前記複合粒子中の前記無機ナノ粒子の含有量が８０質量％超であり、
    　体積平均粒径が１０～１０００ｎｍである、複合粒子。
  2. 　体積平均粒径の変動係数が２０％以下である、請求項１に記載の複合粒子。
  3. 　前記無機ナノ粒子の含有量が８０質量％を超え、９５質量％以下である、請求項１または２に記載の複合粒子。
  4. 　前記無機ナノ粒子の体積平均粒径が５～２５ｎｍである、請求項１～３のいずれか１項に記載の複合粒子。
  5. 　前記複合粒子が、界面活性剤、酸基含有化合物、アミノ基含有化合物、シラン基含有化合物およびチタン原子含有化合物からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の複合粒子。
  6. 　前記無機ナノ粒子が磁化可能な粒子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の複合粒子。
  7. 　前記無機ナノ粒子が、鉄、チタン、コバルト、亜鉛、銅、マンガン、ニッケルもしくはガドリニウムの単体、それらの酸化物、またはそれらの合金；およびフェライト類からなる群より選択される１種または２種以上の無機材料からなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の複合粒子。
  8. 　前記無機ナノ粒子が金属酸化物粒子である、請求項１～７のいずれか１項に記載の複合粒子。
  9. 　磁性粒子である、請求項１～８のいずれか１項に記載の複合粒子。
  10. 　少なくとも１つのリガンドを物理吸着可能な表面を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の複合粒子。
  11. 　少なくとも１つのリガンドと化学結合可能な表面を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の複合粒子。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の複合粒子と、前記粒子を被覆するポリマー層とを有する、被覆粒子。
  13. 　下記工程（１）～（３）を含む、複合粒子の製造方法。
    　工程（１）：磁性流体、モノマーおよび重合開始剤を混合してモノマー混合液を調製する工程
    　工程（２）：前記モノマー混合液を分散させてエマルションを調製する工程
    　工程（３）：前記エマルション中のモノマーを重合させる工程
  14. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の複合粒子および請求項１２に記載の被覆粒子から選ばれる固相担体がリガンドを有する、リガンド含有固相担体。
  15. 　前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモンおよび神経伝達物質からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１４に記載のリガンド含有固相担体。
  16. 　イムノアッセイ用または核酸検出用である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の複合粒子、請求項１２に記載の被覆粒子または請求項１４もしくは１５に記載のリガンド含有固相担体。
  17. 　請求項１４または１５に記載のリガンド含有固相担体を用いる、試料中の標的物質を検出または分離する方法。
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