WO2017209651A1 - Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение - Google Patents

Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение Download PDF

Info

Publication number
WO2017209651A1
WO2017209651A1 PCT/RU2017/000326 RU2017000326W WO2017209651A1 WO 2017209651 A1 WO2017209651 A1 WO 2017209651A1 RU 2017000326 W RU2017000326 W RU 2017000326W WO 2017209651 A1 WO2017209651 A1 WO 2017209651A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
gramicidin
aneurinibacillus
migulanus
aneurinibacillus migulanus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2017/000326
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Викторович НЕСТЕРУК
Кирилл Константинович Сыров
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Valenta Pharmaceuticals JSC
Original Assignee
Valenta Pharmaceuticals JSC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Valenta Pharmaceuticals JSC filed Critical Valenta Pharmaceuticals JSC
Priority to KR1020197034175A priority Critical patent/KR102197825B1/ko
Priority to KR1020187037709A priority patent/KR102106479B1/ko
Priority to EP19218434.9A priority patent/EP3660141A1/en
Priority to EP17807096.7A priority patent/EP3467098A4/en
Priority to CN201780033122.2A priority patent/CN109312298B/zh
Priority to CN201911258242.XA priority patent/CN111172225B/zh
Publication of WO2017209651A1 publication Critical patent/WO2017209651A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/28—Gramicidins A, B, D; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/66—Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B, C; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/08—Bacillus brevis

Definitions

  • the invention relates to biotechnology and can be used to obtain the active substance gramicidin C using a producer strain Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212.
  • the resulting mutant strain allows the production of gramicidin in high yield.
  • the basis of the invention is the task to create a more effective method for the production of gramicidin with a high, from an industrial point of view, yield and offer microorganisms that can be used in this method.
  • the problem is solved by obtaining a new strain of Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212.
  • the invention relates to a strain of bacteria Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212.
  • the invention relates to a strain of bacteria Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212, a producer of gramicidin.
  • the invention relates to the use of the bacterial strain Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212 for the production of gramicidin.
  • the generic and species name of the culture is Aneurinibacillus migulanus.
  • the number obtained upon registration is VKPMV-10212.
  • a method of obtaining a strain - obtained as a mutant is a method of obtaining a strain - obtained as a mutant.
  • Scope of the strain industrial production of antibiotics.
  • the product synthesized by the strain gramicidin C hydrochloride (crystalline).
  • the specific production of gramicidin C can be up to 0.4 Gramycidin s / gbiomass-
  • the average productivity of lines maintained in an active state on agarized media as of January 27, 2009 is 2.073 g / l of gramicidin FROM; the content of closely related impurities is 15.3%.
  • a method for determining the activity of a strain indicating the method is the extraction of gramicidin C from the culture fluid with ethyl alcohol, followed by determination of the concentration of gramicidin C by high performance liquid chromatography.
  • the method, conditions and composition of the media for long-term storage of the strain is the storage of spores on millet, the storage of vegetative cells and spores in a freeze-dried state (in milk 10-20%).
  • the method, conditions and composition of the media for the propagation of the strain - growing on an agar medium Gauze-Brazhnikova yeast water 50% by volume or 28 mg% by amine nitrogen; peptone 1%; NaCl 0.5%; agar-agar 3%; pH 7 , 0) for 48-72 hours at 40 ° C.
  • the optimal conditions and composition of the medium for fermentation are “fermentation regulatory” medium (glycerol - 30 ml, lactic acid 40% - 24.6 ml, K 2 ⁇ 0 4 - 2 g, NaCl - 5 g; MgS0 4 -7H 2 0 - 0 , 2 g; ammonium oxalate - 12 g; yeast autolysate - up to 10 mg%; casein hydrolyzate - up to 20 mg%; laprol - 2 ml; pH
  • the strain DNA contains the Hindlll restoration site.
  • the strain is not zoopathogenic, phytopathogenic.
  • FIG. 1 Restriction analysis of a DNA fragment encoding the 16S RNA gene of the studied strain 101.
  • Marker 1 kb DNA Ladder (10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 bp, from bottom to top)
  • Example 1 Identification of strain 101 to a species using analysis of 16S RNA Stages of work
  • Sequencing is performed on an automatic sequencer AE3000.
  • sequences were aligned with the corresponding sequences of the nearest bacterial species available from the GenBank database.
  • results of processing sequences using a computer program located on the RDB II website (Ribosomal Database Project II), designed to determine the affinity of microorganisms and build phylogenetic trees, are presented in graphical form.
  • Oxl.oxali2 Oxalophagus oxalicus str. Alt Oxl DSM 5503 (T)
  • the criterion for classifying a microorganism to a particular species is considered to be at least 97% homology. According to this criterion, the studied strain can be attributed to the species Aneurinibacillus migulanus and Aneurinibacillus aneurinilyticus.
  • restriction analysis methods of a DNA fragment encoding the 16S RNA gene were used.
  • this DNA fragment of Aneurinibacillus migulanus contains the Hindlll restriction site, while Aneurinibacillus aneurinilyticus does not have this restriction site.
  • Example 2 The method of producing gramicidin C
  • Gramicidin C is produced by fermentation. The process consists of four stages: processing the productive strain Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212 in the laboratory, preparing the vaccine material, cultivating the vaccine material in the laboratory fermenter, biosynthesis of gramicidin C in the main fermenter.
  • the main parameters of the fermentation were selected taking into account the morphology and stability of the productive strain Aneurinibacillus migulanus VKPMV-10212.
  • the time of growing a productive strain on agar medium in a thermostat varies from 48 to 120 hours and allows a seed volume in a larger volume than when cultured on Petri dishes.
  • the bacterial suspension is stored in a 15% protective solution of glycerol at a temperature of from -20 ° C to -80 ° C.
  • Preliminary preparation of seed is carried out in a laboratory fermenter in an agar medium and in the absence of other microorganisms.
  • the inoculum is transferred to the next fermenter in an amount of 1-2.5% of the volume of the fermentation medium consisting of sodium citrate, ammonium chloride, potassium dihydrogen phosphate, D- and L-lactic acid in a ratio of 1: 1, yeast extract powder, casein powder, defoamer Struktol J 647.
  • Optimum parameters of the fermentation process optical density from 10 to 20, pH from 5.5 to 7.5, the absence of other microorganisms. The fermentation process lasts from 48 to 120 hours.
  • the next stage of production is the fermentation of seed in the main fermenter.
  • the seed volume is 8-17% of the fermentation medium, consisting of sodium citrate, ammonium chloride, potassium dihydrogen phosphate, D- and L-lactic acid in a ratio of 1: 1, yeast extract powder, casein powder, antifoam Struktol J 647.
  • Optimum value A pH in the range of 6.5 to 7.0 is controlled by the addition of an ammonia solution.
  • the optimal concentration of nutrients is supported by the addition of solutions of glycerol, ammonium sulfate and corn starch.
  • the fermentation process lasts from 48 to 120 hours.
  • the resulting biomass is filtered on a ceramic filter module by ultrafiltration, washing the biomass with deionized water to remove impurities from the biomass.
  • the concentrated biomass is dried in a spray dryer at a temperature of 180 ° C.
  • the dried biomass is washed with acetone at a temperature of 40 ° C to remove colored impurities.
  • Acetone is removed by purging with nitrogen, then re-washed with acetone and dried in vacuum at 45 ° C.
  • the extraction is carried out several times, removing the extracts using compressed nitrogen.
  • the biomass is dried in vacuum at a temperature of about 47 ° C.
  • the dried biomass is dissolved in water and decolorized with activated carbon, then filtered on a filter press, washing with ethanol to reduce product losses due to sorption on charcoal.
  • the extract obtained is transferred to a crystallizer, diluted with deionized water, a concentrated sodium chloride solution is added, and heated to a temperature of 55-65 ° C. After clarification, the solution is cooled to a temperature not exceeding 5 ° C.
  • the resulting crystals are separated in a centrifuge and dried in vacuum at a temperature of no more than 65 ° C, then crushed in a pin mill, sieved through sieves with a mesh diameter of 400 and 200 ⁇ m and packaged in plastic bags placed in aluminum containers.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения действующего вещества грамицидина С с помощью штамма продуцента Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212. Полученный мутантный штамм позволяет продуцировать вещество грамицидин с высоким выходом.

Description

Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения действующего вещества грамицидина С с помощью штамма продуцента Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212. Полученный мутантный штамм позволяет продуцировать грамицидин с высоким выходом.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известны способы получения грамицидина С при глубинном выращивании продуцента Bacillus brevis на синтетических средах [Коршунов В. В. Физиология обмена веществ Bacillus brevis subsp. G.-B. в связи с биосинтезом грамицидина С. - Канд. лиса, 1962, М., МГУ, Коршунов В. В., Егоров Н.С. Синтетическая среда для развития Bacillus brevis и образование граммидина. Микробиология, 1962; 31 :3, 515- 519, . Шапошников В.Н., Работнова И.Л., Силаев А.Б. и др. Способ получения кристаллического грамицидина С. - Авторское свидетельство на изобретение No 187243, 1963, Куплетская М.Б. Влияние аэрации на развитие и образование граммидина культурой Bacillus brevis var. G.-B. Микробиология, 1965; 34:5, 905-909, Жарикова Г.Г. Естественная изменчивость споровых бактерий и биосинтез полипептидных антибиотиков. - Докт. дисс, 1972, М., МГУ, Березовская А. И., Выпияч А.Н., Егоров Н.С. и др. Штамм Bacillus brevis 101 - продуцент грамицидина С. - Авторское свидетельство на изобретение N°686463, 1978, Способ глубинного культивирования Bacillus brevis штамм 101 для получения грамицидина С, - РФ2447143, 24.11.2008].
Известен периодический процесс получения грамицидина С при выращивании наиболее продуктивных штаммов Bacillus brevis. [Удалова Т.П. Особенности роста и развития Bacillus brevis var. G.-B в связи с биосинтезом грамицидина S. - Канд. дисс, 1979, М., МГУ], который использовали для синтеза продукта при выращивании Bacillus brevis штамма 101 [Юдина Т.П. Физиолого-биохимические особенности продуцентов граммидина Bacillus brevis subsp. G.-B. и их вариантов. - Канд. дисс, 2002, М., МГУ.], характеризуется тем, что производится одноразовая загрузка питательной среды в ферментер, инокуляция посевным материалом, культивирование при аэрации и перемешивании в течение 27 часов до достижения величины рН 6,0 и ниже.
В основу изобретения поставлена задача, создать более эффективный способ продукции грамицидина с высоким, с промышленной точки зрения, выходом и предложить микроорганизмы, которые могут быть использованы в этом способе. Поставленная задача решается путем получения нового штамма Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте изобретение относится к штамму бактерий Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212.
В предпочтительном варианте изобретение относится к штамму бактерий Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212, продуценту грамицидина.
В другом варианте изобретение относится к применению штамма бактерий Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212 для получения грамицидина.
Родовое и видовое название культуры - Aneurinibacillus migulanus.
Номер, полученный при регистрации - ВКПМВ-10212.
Способ получения штамма - получен как мутант.
Идентифицирована культура ВКПМ ФГУП «ГосНИИГенетика» (г.Москва), отчет об идентификации штамма N°101 методом анализа 16S РНК от 16 марта 2009 г. Справка о депонировании прилагается. Дата депонирования - 03.03.2009 г.
Культурально-морфологические особенности штамма - палочки длиной 4-8 мкм, шириной 0,6-0,7 мкм, образует споры с овальными краями размером 0,8-1,0 мкм. Аэроб. Не разжижает желатину. Не гидролизует крахмал. Потребляет азот в аминной и аммонийной форме. На агаризованной питательной среде Гаузе-Бражниковой при культивировании в течение 40-48 часов при температуре 40±1°С образует колонии округлой формы, приподнятые над поверхностью агара, с отчетливо выраженным кратерообразным или точечным центром. Цвет колоний - бежевый, колонии непрозрачные, пастообразной консистенции. Легко снимаются с поверхности агара петлей. Форма и размер колоний сильно варьируют в зависимости от состава среды, густоты посева и других факторов. В процессе культивирования может расщепляться на варианты с отличающейся морфологией и сниженной продукцией антибиотика.
Область применения штамма: промышленное производство антибиотиков. Продукт, синтезируемый штаммом: грамицидина С гидрохлорид (кристаллический) .
Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели - при культивировании в качалочных колбах на «лабораторной регламентной» жидкой питательной среде в течение 72 часов продуцирует 2±0,3 г/л грамицидина С, что соответствует 0,2±0,02 грамицидина с/гбиомассы- При выращивании в ферментерах при оптимальных условиях удельная продукция грамицидина С может составлять до 0,4 Гграмицидина с/гбиомассы- Средняя продуктивность линий, поддерживаемых в активном состоянии на агаризованных средах на 27.01.2009 г., составляет 2,073 г/л грамицидина С; содержание близкородственных примесей - 15,3%.
Способ определения активности штамма с указанием метода - экстракция грамицидина С из культуральной жидкости этиловым спиртом с последующим определение концентрации грамицидина С методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма - хранение спор на пшене, хранение вегетативных клеток и спор в лиофильно высушенном состоянии (на молоке 10-20%).
Способ, условия и состав сред для размножения штамма - выращивание на агаризованной среде Гаузе-Бражниковой (дрожжевая вода 50% по объему или 28 мг% по аминному азоту; пептон 1%; NaCl 0,5%; агар-агар 3%; рН 7,0) в течение 48-72 часов при 40°С. Выращивание на жидкой полусинтетической среде «лабораторная регламентная» (на 1 л среды: глицерин дистиллированный - 20 мл, молочная кислота пищевая 40% - 8 мл; К2НР04 - 9,9 г, NaCl - 5 г; MgS04-7H20 - 0,2 г; аммоний щавелевокислый - 8,12 г; дрожжевой автолизат - до 5 мг%) в качалочных колбах вместимостью 0,75 л (0,1 л среды) на круговой качалке (частота вращения 220 об/мин, амплитуда 1 м) при 40 °С в течение 48-72 часов.
Оптимальные условия и состав среды для ферментации - среда «ферментационная регламентная» (глицерин - 30 мл, молочная кислота 40% - 24,6 мл, К2НР04 - 2 г, NaCl - 5 г; MgS04-7H20 - 0,2 г; аммоний щавелевокислый - 12 г; дрожжевой автолизат - до 10 мг%; гидролизат казеина - до 20 мг%; лапрол - 2 мл; рН
3 3
после стерилизации 7,02-7,2). Аэрация 1,25 м 02/ м среды час, давление - 0,5 ати, интенсивность перемешивания должна обеспечивать массобмен по кислороду на уровне от 0,2-0,3 ммоль 02/л мин в начале ферментации до 0,4-1,0 ммоль 02/л мин в конце ферментации в зависимости от достигнутой биомассы (0,035-0,045 ммоль 02/гбиомассы 'МИн). Хемостатирование на уровне рН 6,4-7,2. Культивирование в течение 16-48 часов в зависимости от способа ведения ферментации.
ДНК штамма содержит рестракционный сайт Hindlll.
Штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным.
Фиг. 1. Рестрикционный анализ фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S РНК исследуемого штамма 101.
1. Фрагмент ДНК, кодирующий ген 16S РНК исследуемого штамма 101, обработанный рестриктазой Hindlll
2. Маркер 1 kb DNA Ladder (10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н., снизу вверх)
3. Фрагмент ДНК, кодирующий ген 16S РНК исследуемого штамма 101, не обработанный рестриктазой Hindlll.
Пример 1. Идентификация штамма 101 до вида с помощью анализа 16S РНК Этапы работ
I. Рассев культуры до отдельной колонии и получение биомассы для анализа 16S РНК
II. Выделение ДНК
III. Выбор праймеров и режимы ПЦР
Консервативные праймеры для наработки 16S rDNA - 8f - aga gtt tga tec tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
с режимами реакции:
1. 95°С - Змин.
2. 35 циклов
95°С - 30 сек.
57°С - 30 сек.
72°С - 1 мин. 30 сек.
3. 72°С - 5 мин. IV. Секвенирование 16S rDNA, сравнение секвенсов и построение деревьев родства
Секвенирование проводится на автоматическом секвенаторе АЕ3000.
Для анализа секвенсов используются специализированные филогенетические компьютерные программы.
Стабильность воспроизведения результатов. Проводится не менее трех повторов ПЦР-реакций.
Условия электрофореза ПЦР исследуемых образцов.
1,0% агарозный гель, электрофорез при напряженности электрического поля 5 В/см.
V. Рестрикционный анализ фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S РНК а) Секвенирование вариабельных участков 16S rDNA.
При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для штамма 101: atgaaggttttcgatcgtaaagttctgttgttagggaagaaccgccggggatgacctccc
cggtctgacggttncctaaacgagaaagcccccggctaatctacggtgcccagcagccgc
ggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcgg
cttcttaagtcaggtgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggccacttgaaactggga
agcttgagtgcaggagaggagagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatg
tggaggaacacccgtggcgaaggcggctctctggcctgtaactgacgctgaggcgcgaaa
gcgtggggagcgaacaggattagatacccctggtagtccacgccgtaaacgttgagtgct
aggtgttggggactccaatcctcagtgctcgcagctaacgcaat
aagcactccgcctggg б) Анализ результатов секвенирования и построение дерева родства
Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Paenibacillaceae; Aneurinibacillus group; Aneurinibacillus, причем гомология с видами Aneurinibacillus migulanus и Aneurinibacillus aneurinilyticus составляет 98%.
Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде.
Таблица 1. Матрица расстояний
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
101.txt 1 — 0,980 0,987 0,958 0,991 0,892 0,907 0,989 0,958 0,989
Ab.anurly3 2 0,020 — 0,985 0,955 0,989 0,895 0,909 0,991 0,955 0,991
Ab.migulan 3 0,013 0,015 — 0,962 0,996 0,902 0,912 0,994 0,962 0,994
Ab.thaerph 4 0,042 0,045 0,038 — 0,967 0,903 0,912 0,965 1 0,965
Ab.migula2 5 0,009 0,01 1 0,004 0,033 — 0,902 0,917 0,998 0,967 0,998
B.badius2 6 0,108 0,105 0,098 0,097 0,098 — 0,889 0,905 0,903 0,905
Oxl.oxali2 7 0,093 0,091 0,088 0,088 0,083 0,11 1 — 0,919 0,912 0,919
Ab.anurly2 8 0,011 0,009 0,006 0,035 0,002 0,095 0,081 — 0,965 1
Ab.thaerp2 9 0,042 0,045 0,038 0,000 0,033 0,097 0,088 0,035 — 0,965
Ab.anurlyt 10 0,011 0,009 0,006 0,035 0,002 0,095 0,081 0,000 0,035 —
Таблица 2. Описание последовательностей
Ab.migula2 Aneurinibacillus migulanus DSM 2895 (T)
Ab.anurly2 Aneurinibacillus aneurinilyticus DSM 5562 (T)
Ab.migulan Aneurinibacillus migulanus ATCC 9999 (T)
Ab.anurlyt Aneurinibacillus aneurinilyticus NCIMB 10056
Ab.anurly3 Aneurinibacillus aneurinilyticus ATCC 12856 (T)
Aneurinibacillus thermoaerophilus str. L420-91
Ab.thaerph
DSM 10154 (T)
Ab.thaerp2 Aneurinibacillus thermoaerophilus DSM 10155
Oxl.oxali2 Oxalophagus oxalicus str. Alt Oxl DSM 5503 (T)
B.badius2 Bacillus badius ATCC 14574 (T)
101.txt Исследуемый штамм 101 Дальнейший анализ по RDP II 16S рРН базе данных показал гомологию с теми же видами бактерий, и наиболее близкими видами являются Aneurinibacillus migulanus и Aneurinibacillus aneurinilyticus .
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (Фиг. 2).
Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%. По этому критерию исследуемый штамм можно отнести к видам Aneurinibacillus migulanus и Aneurinibacillus aneurinilyticus.
Для более точной идентификации воспользовались методы рестрикционного анализа фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S РНК.
По литературным данным известно, что данный фрагмент ДНК Aneurinibacillus migulanus содержит рестрикционный сайт Hindlll, тогда как у Aneurinibacillus aneurinilyticus данный рестрикционный сайт отсутствует.
Проведен рестрикционный анализ фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S РНК исследуемого штамма 101. Результаты работы показаны на фиг. 1.
Наличие фрагментов 620 п.н. и 870 п.н. при обработке фрагмента ДНК рестриктазой Hindlll говорит о том, что сайт Hindlll присутствует в составе франмента ДНК исследуемого штамма 101. Этот критерий позволяет отнести исследуемый штамм 101 к виду Aneurinibacillus migulanus.
Пример 2. Способ получения грамицидина С
Грамицидин С получают методом ферментации. Процесс состоит из четырех этапов: обработка продуктивного штамма Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212 в лаборатории, подготовка прививочного материала, культивирование прививочного материала в лабораторном ферментере, биосинтез грамицидина С в основном ферментере.
Основные параметры ферментации подобраны с учетом морфологии и стабильности продуктивного штамма Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212. Время выращивания продуктивного штамма на среде агара в термостате варьирует в диапазоне от 48 до 120 часов и позволяет семенной объем в большем объеме, чем при культивировании на чашках Петри. Бактериальную суспензию хранят в 15% защитном растворе глицерина при температуре от -20°С до -80°С. Предварительную подготовку посевного материала проводят в лабораторном ферментере в среде агаре и отсутствии других микроорганизмов.
Затем инокулят перемещают в следующий ферментер в количестве 1-2,5% от объема среды ферментации, состоящей из цитрата натрия, хлорида аммония, калия дигидрофосфата, D- и L-молочной кислоты в соотношении 1 :1, порошка экстракта дрожжей, порошка казеина, пеногасителя Struktol J 647. Оптимальные параметры процесса ферментации: оптическая плотность от 10 до 20, рН от 5,5 до 7,5, отсутствие других микроорганизмов. Процесс ферментации продолжается от 48 до 120 часов.
Следующий этап производства заключается в брожении посевного материала в основном ферментере. Объем посевного материала составляет 8-17% от среды ферментации, состоящей из цитрата натрия, хлорида аммония, калия дигидрофосфата, D- и L-молочной кислоты в соотношении 1 : 1 , порошка экстракта дрожжей, порошка казеина, пеногасителя Struktol J 647. Оптимальное значение рН в диапазоне от 6,5 до 7,0 контролируется добавлением раствора аммиака. Оптимальную концентрацию питательных веществ поддерживают добавлением растворов глицерина, сульфата аммония и кукурузного крахмала. Процесс ферментации продолжается от 48 до 120 часов.
Полученную биомассу фильтруют на керамическом фильтрующем модуле способом ультрафильтрации, промывая биомассу деионизированной водой для удаления примесей из биомассы. Концентрированную биомассу сушат в распылительной сушилке при температуре 180°С. Высушенную биомассу промывают ацетоном при температуре 40°С для удаления окрашенных примесей. Ацетон удаляют при помощи продувки азотом, затем повторно промывают ацетоном и сушат в вакууме при температуре 45 °С
Далее грамицидин С экстрагируют этанолом, корректируя рН до 3,0-4,0 разбавленной хлористоводородной кислотой (НС1 : этанол = 1 : 2). Экстракцию проводят несколько раз, удаляя экстракты с помощью сжатого азота. После отделения этанола биомассу сушат в вакууме при температуре около 47°С.
Высушенную биомассу растворяют в воде и обесцвечивают активированным углем, затем фильтруют на фильтр-прессе, промывая этанолом для уменьшения потерь продукта из-за сорбции на угле.
Полученный экстракт перемещают в кристаллизатор, разбавляют деионизированной водой, добавляют концентрированный раствор хлорида натрия и нагревают до температуры 55-65°С. После осветления раствор охлаждают до температуры не выше 5 °С. Полученные кристаллы отделяют на центрифуге и сушат в вакууме при температуре не более 65 °С, затем измельчают на штырьковой мельнице, просеивают через сита с диаметром ячеек 400 и 200 мкм и упаковывают в полиэтиленовые мешки, помещенные в алюминиевые контейнеры.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм бактерий Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212, продуцент грамицидина.
Применение штамма бактерий Aneurinibacillus migulanus ВКПМВ-10212 для получения грамицидина.
PCT/RU2017/000326 2016-06-01 2017-05-19 Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение Ceased WO2017209651A1 (ru)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020197034175A KR102197825B1 (ko) 2016-06-01 2017-05-19 그라미시딘 s의 생산 및 정제방법
KR1020187037709A KR102106479B1 (ko) 2016-06-01 2017-05-19 아네우리니바실러스 미굴라너스(aneurinibacillus migulanus) 균주 및 이의 용도
EP19218434.9A EP3660141A1 (en) 2016-06-01 2017-05-19 Method for producing and purification of gramicidin s
EP17807096.7A EP3467098A4 (en) 2016-06-01 2017-05-19 ANEURINIBACILLUS MIGULANUS
CN201780033122.2A CN109312298B (zh) 2016-06-01 2017-05-19 米氏硫胺素芽孢杆菌菌株及其用途
CN201911258242.XA CN111172225B (zh) 2016-06-01 2017-05-19 用于生产和纯化生产短杆菌肽s的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016121667A RU2627182C1 (ru) 2016-06-01 2016-06-01 Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение для получения грамицидина С
RU2016121667 2016-06-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017209651A1 true WO2017209651A1 (ru) 2017-12-07

Family

ID=59632658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000326 Ceased WO2017209651A1 (ru) 2016-06-01 2017-05-19 Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение

Country Status (5)

Country Link
EP (2) EP3467098A4 (ru)
KR (2) KR102197825B1 (ru)
CN (2) CN111172225B (ru)
RU (1) RU2627182C1 (ru)
WO (1) WO2017209651A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121294286A (zh) * 2025-12-10 2026-01-09 中科生物技术(山东)有限公司 一株米氏解硫胺素芽孢杆菌zksw002及其菌剂和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2447143C2 (ru) * 2008-11-24 2012-04-10 Виктор Викторович Дербышев СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU686463A1 (ru) * 1978-05-03 1987-04-30 МГУ им.М.В.Ломоносова Штамм @ @ 101-продуцент грамицидина @
US6117670A (en) * 1994-06-08 2000-09-12 Novartis Finance Corporation Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof
CN103897999B (zh) * 2012-12-25 2016-05-04 中国农业大学 一种短芽孢杆菌及其应用及发酵产生短杆菌素的方法
CN104277995B (zh) * 2014-07-14 2017-01-11 东华大学 一种米氏硫胺素芽孢杆菌dy3菌株及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2447143C2 (ru) * 2008-11-24 2012-04-10 Виктор Викторович Дербышев СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERDITSCH M. ET AL.: "The ability of Aneurinibacillus migulanus (Bacillus brevis) to produce the antibiotic gramicidin S is correlated with phenotype variation", APPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 73, no. 20, 2007, pages 6620 - 6628, XP055446118 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121294286A (zh) * 2025-12-10 2026-01-09 中科生物技术(山东)有限公司 一株米氏解硫胺素芽孢杆菌zksw002及其菌剂和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3660141A1 (en) 2020-06-03
EP3467098A1 (en) 2019-04-10
KR20190007070A (ko) 2019-01-21
RU2627182C1 (ru) 2017-08-03
KR102197825B1 (ko) 2021-01-05
CN109312298B (zh) 2022-05-27
KR20190132560A (ko) 2019-11-27
EP3467098A4 (en) 2019-11-27
KR102106479B1 (ko) 2020-06-03
CN111172225A (zh) 2020-05-19
EP3467098A9 (en) 2019-05-15
CN111172225B (zh) 2023-09-26
CN109312298A (zh) 2019-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110564580B (zh) 一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法
WO2023016387A1 (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
RU2001949C1 (ru) Штамм гриба TRICHODERMA REESEI - продуцент целлюлолитических ферментов
CN101078006B (zh) 一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌
CN108531404A (zh) 一株层出镰孢菌的培养方法及其应用
CN109266578A (zh) 大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用
RU2627182C1 (ru) Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение для получения грамицидина С
RU2716984C1 (ru) Штамм Sarocladium kiliense - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов и способ получения лонголитина
CN116218690B (zh) 一种产布雷非德菌素a的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法
CN115820440B (zh) 一株四乙酰植物鞘氨醇高产诱变菌株及其应用
CN109112171A (zh) 一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法
CN113337432B (zh) 一种产吡咯喹啉醌的食甲基菌及其应用
CN112342146B (zh) 一种利用l-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株
CN105385634B (zh) 一株橡胶树根际促生菌株hbrm-86及其应用
EA030630B1 (ru) Штамм aneurinibacillus migulanus и его применение
CN107641602A (zh) 一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用
CN107937479A (zh) 一种非无菌条件下测定生防细菌代谢产物拮抗活性的方法
HK40019555A (en) Method for producing and purification of gramicidin s
CN112961817A (zh) 一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法
RU2802575C1 (ru) Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis
HK40003763B (en) Aneurinibacillus migulanus strain and use thereof
HK40003763A (en) Aneurinibacillus migulanus strain and use thereof
CN119490942B (zh) 一株诺尔斯氏链霉菌及其应用
CN118530854B (zh) 一种瑞法木霉csq4、孢子悬浮液、发酵液及其制备方法和应用
CN113337433B (zh) 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17807096

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20187037709

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017807096

Country of ref document: EP

Effective date: 20190102