WO2019110101A1 - Mikroorganismen-stamm und verfahren zur fermentativen herstellung von methylanthranilat - Google Patents

Mikroorganismen-stamm und verfahren zur fermentativen herstellung von methylanthranilat Download PDF

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    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03027—Anthranilate synthase (4.1.3.27)

Definitions

  • the invention relates to a microorganism strain and procedural ren for the fermentative production of methyl anthranilate.
  • Methylanthranilate is a flavoring agent, which is also known as ethyl anthranilate or methyl 2-aminobenzoate and has the CAS number 134-20-3. Synthetically prepared methyl anthranilate is already used as a flavoring agent. The substance is found, for example, in cocoa, coffee, grapes, grapefruit, jasmine, lemons, limes, strawberries and tangerines, and is therefore used to flavor foods. A good overview of the amounts of methylanthranilate used in various flavor compositions can be found in a review by John Wright (Perfumer & Flavorist 2016, Volume 41, pages 24-27).
  • Methylanthranilat is for example via the N-demethylation of methyl-N-methylanthranilate (MNMA, CAS number 85-91-6) in Biotransforma tion possible.
  • MNMA methyl-N-methylanthranilate
  • EP0322448B1 describes the conversion of MNMA with lignin-degrading fungi. Implementation, however, is inefficient, bearing in mind that implementation will take place in the space of one to two weeks.
  • Bacillus megaterium can also be used in a whole-cell biotransformation process (Taupp et al., J. Agric. Food Chem. 2005, Vol. 53, 9586-9589).
  • the object of the present invention is to provide a microorganism strain which makes it possible to efficiently produce natural methylanthranilate.
  • microorganism strain which comprises and expresses at least one AAMT gene, an RLSS gene and a trpE gene.
  • the microorganism strain according to the invention makes it possible to prepare natural methyl anthranilate in a fermentation process without supplementation of direct precursors of methyl anthranilate.
  • the AAMT gene is characterized by a DNA sequence encoding a protein which has the function of an anthranilic acid methyltransferase.
  • genes are known.
  • it is a gene with SEQ ID NO 1 and Va variants of this sequence, which are caused by the degenerate genetic code's.
  • the RLSS gene is characterized by a DNA sequence encoding a protein which has the function of an S-adenosylmethionine synthetase.
  • genes are known.
  • it is a gene with SEQ ID NO 2 and variants of this sequence, which are caused by the degenerate genetic code.
  • the trpE gene is characterized by a DNA sequence which codes for a protein which has the function of an anthranilate synthase.
  • Such genes are known.
  • it is a gene with SEQ ID NO 3 and variants of this sequence, which are caused by the degenerate genetic code.
  • variants of this sequence which have a reduced feedback regulation compared to L-tryptophan ge.
  • it is a variant with the amino acid substitutions P21S and K50E.
  • the function of the proteins in a microorganism strain according to the invention can be indirectly characterized by the product methylanthranilate, since microorganisms themselves do not produce methyl anthranilate.
  • the HPLC method described in Example 7 can be used.
  • the microorganism strain preferably comprises one or more functional copies of the three named genes. It preferably comprises one to 700 copies of the three named genes. It particularly preferably comprises one to 20 copies of the three named genes.
  • the genes may be integrated into the chromosome, but they may also be present on one or more plasmids.
  • the expression of the AAMT gene, the RLSS gene and the trpE gene on a plasmid in a microorganism strain is preferably, for the production of methyl anthranilate.
  • the invention therefore also comprises a plasmid containing an AAMT gene, an RLSS gene, and a trpE gene under the control of a functional promoter.
  • a production plasmid allows the production of methyl anthranilate in a microorganism strain.
  • heterologous refers to the genes characterized by SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2, since these genes, in contrast to SEQ ID NO 3, do not come from Escherichia coli.
  • Corresponding heterologous promoters are, for example, the promoter of the gapA gene from Escherichia coli, the promoter of the catB gene from Escherichia coli, the promoter of the tufB gene from Escherichia coli, the promoter of the mppA gene from Escherichia coli, the promoter of the lpp Escherichia coli gene and the promoter of the proC gene from Escherichia coli.
  • the heterologous lac, tac, trc, lambda, ara or tet promoters are known to the person skilled in the art and can be used for heterologous expression of the genes who the.
  • the expression of the AAMT gene, the RLSS gene, and the trpE gene on a plasmid in a microorganism strain by the promoter of the gapA gene, by the promoter of the catB gene, by the promoter of the tufB gene , by the promoter of the mppA gene, by the promoter of the Escherichia coli Ipp gene, or by the promoter of the proC gene from Fscherichia coli.
  • the expression of the AAMT gene, the RLSS gene and the trpE gene on a plasmid in Escherichia coli is achieved by the promoter of the catB gene or by the promoter of the gapA gene from Escherichia coli.
  • a plasmid of the invention preferably comprises the above-mentioned promoters, wherein the promoters are located on the plasmid so as to control the expression of the AAMT gene, the RLSS gene and the trpE gene.
  • the plasmid particularly preferably contains an operon construct in which the AAMT gene, the RLSS gene and the trpE gene are under the control of the gapA promoter from Escherichia coli.
  • the RLSS gene and the trpE gene can also serve the natural (homologous) promoter regions of these genes.
  • plasmids in which the AAMT gene, the RLSS gene and the trpE gene are introduced all available and genetically accessible DNA molecules can be used, which are extra chromosomally replicated in microorganisms and include a selection marker.
  • plasmids in which the AAMT gene, the RLSS gene and the trpE gene are introduced preferably all available and genetically accessible DNA molecules can be used, which are extrachromosomally replicated in Escherichia coli and the include a selection marker.
  • plasmids with a high cellular copy number in Escherichia coli eg, pUC series plasmids, pQE series plasmids, pBluescript series plasmids
  • medium copy number plasmids in Escherichia coli eg, plasmids the pBR series, plasmids of the pACYC series
  • low copy plasmids in Escherichia coli eg pSClOl or pBeloBACII.
  • plasmids with an average copy number in Escherichia coli eg plasmids of the pBR series, plasmids of the pACYC series
  • Escherichia coli eg plasmids of the pBR series, plasmids of the pACYC series
  • plasmid of the pACYC series verwen det is particularly preferred.
  • One possibility for producing a microorganism strain according to the invention is the introduction of a plasmid according to the invention into a starting strain.
  • Suitable starting strains are in principle all microorganism strains which are accessible to recombinant processes and can be cultivated by fermentation.
  • Such microorganisms may be fungi, yeasts or bacteria.
  • they are bacteria of the phylogenetic group of Eubacteria.
  • Particularly preferred are microorganism strains of the family Enterobacteriaceae and in particular of the species Escherichia coli.
  • Escherichia coli strains which have at least one increased by a factor of 2 compared to a wild-type strain metabolic flux in the direction of chorismate.
  • Chorismate is the starting point or branch point for the biosynthesis of L-tyrosine, L-phenylalanine and L-tryptophan.
  • Escherichia coli strains which have at least one increased by a factor of 2 compared to a wild-type strain metabolic flux in the direction of chorismate.
  • Chorismate is the starting point or branch point for the biosynthesis of L-tyrosine, L-phenylalanine and L-tryptophan.
  • Escherichia coli strains which have at least one increased by a factor of 2 compared to a wild-type strain metabolic flux in the direction of chorismate.
  • Chorismate is the starting point or branch point for the biosynthesis of L-tyrosine, L-phenylalanine and L-tryptophan.
  • strain SV164 ⁇ trpD The construction of the strain SV164 is in
  • Selective markers known to those skilled in the art are, for example, the chloramphenicol acetyltransferase gene which confers resistance to chloramphenicol, the neomycin phospholipase gene conferring resistance to kanamycin, the tetracycline efflux gene conferring resistance to tetracycline or the like ß-lactamase gene that mediates resistance to ampicillin and carbenicillin.
  • the AAMT gene, the RLSS gene, the BAS gene and the trpE gene can also be integrated into the chromosome of a microorganism strain in addition to a plasmid according to the invention or alone.
  • the systems known to those skilled in the art are preferably used with temperate bacteriophages, integrative plasmids or integration via homologous recombination.
  • Another object of the present invention is to provide a method which enables production of natural methyl anthranilate.
  • This object is achieved by a method in which a microorganism strain according to the invention is cultured in a fermentation medium and methyl anthranilate is secreted into the fermentation medium.
  • the cultivation of a microorganism strain according to the invention in the fermenter is carried out as a continuous culture, as a batch culture or preferably as a fed-batch culture.
  • the carbon source is preferably sugar, sugar alcohols or organic acids. Particular preference is given in the inventive method used as carbon sources glucose, lactose, sucrose or glycerol.
  • the dosage of the carbon source is in a form which ensures that the content of carbon source in the fermenter is maintained within the range of 0.1 g / L to 50 g / L during the fermentation. Particularly preferred is a range of 0.1 g / L to 10 g / L.
  • the nitrogen source used in the process according to the invention is preferably ammonia, ammonium salts or protein hydrolyzates. When using ammonia as a correction agent for pH control during regular fermentation this nitrogen source is replenished.
  • salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, iron and in traces (ie in mM concentrations) salts of the elements molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc, copper and nickel can be added ,
  • organic acids e.g., acetate, citrate
  • amino acids e.g., L-isoleucine, L-methionine, L-phenylalanine, L-tryptophan
  • vitamins e.g., vitamin B1, vitamin B6, vitamin B12
  • Yeast extract e.g. Yeast extract, tryp- ton, corn steep liquor, soy flour or malt extract are used.
  • the incubation temperature for growing a strain of the invention from the family of Enterobacteriaceae is preferably before 28 - 37 ° C, particularly preferably an incubation temperature of 30 - 32 ° C.
  • the pH of the fermentation medium during the fermentation is preferably in the pH range from 5.0 to 8.5, particularly preferably a pH of 7.0.
  • a microorganism strain according to the invention preferably of a strain of the family Enterobacteriaceae particularly preferably an Escherichia coli Sta it under aerobic, anaerobic or microaerobic cultivation conditions over a period of 6 h to 150 h and in the region of the respective strain optimal growth temperature. Cultivation times between 6 h and 48 h are particularly preferred.
  • the fermentation is preferably carried out under aerobic or microbial growth conditions.
  • the separation of methyl anthranilate from the culture can be carried out by methods known to the person skilled in the art, such as centrifuging the medium to separate off the cells with subsequent extraction or distillation of the methyl anthranilate from the fermentation supernatant with subsequent purification, concentration and optionally formulation or complexing of the product ,
  • the detection and quantification of the methyl anthranilate produced in the process according to the invention takes place, for example, by means of an HPLC method.
  • Fig. 1 shows schematically a nilat suitable for the preparation of Methylanthra plasmid pStS49 from Example 1.
  • FIG. 2 shows schematically a plasmid pStS58 from Example 2 which is suitable for the preparation of methylanthrail.
  • the starting plasmid for the construction of a methyl anthranilate production plasmid was the plasmid pMSRLSSk.
  • the preparation of this plasmid is described in US2004175805AA.
  • the plasmid contains the RLSS gene (encoded for the SAM synthetase the rat liver) under the control of the constitutive GAPDH promoter of the gapA gene from Escherichia coli. a) Amplification of the AAMT gene:
  • the AAMT gene from Zea mays was using the polymerase chain reaction (PCR) using the home fusion ® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer amplified.
  • the template used was DNA which was prepared synthetically and which is characterized by SEQ ID NO 1.
  • the oligonucleotides IFC-AAMT-for (SEQ ID NO 4) and IFC-AAMT-rev (SEQ ID NO 5) were used as primers.
  • the cloning vector pMSRLSSk was linearized with the restriction endonuclease KpnI (New England Biolabs, Frankfurt am Main). Subsequently, the linearized 4659 base pair fragment was ® on an agarose gel using the QIAquick Gel
  • the cloning of the DNA fragments of a) and b) was performed using the In-Fusion ® HD Cloning Kit (Clontech Laborato factories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer 'manufacturer. The success of the cloning was confirmed by DNA sequence analysis.
  • a vector map of the methyl anthranilate production plasmid pStS49 is shown schematically in FIG.
  • the starting plasmid for the construction of the methyl anthranilate production plasmid pStS58 was the plasmid pStS49 from Example 1. a) Amplification of the trpE8 gene:
  • the trpE8 gene from Escherichia coli using the polymer A se chain reaction (PCR) using the In-Fusion ® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California nien, USA) following the manufacturer's instructions.
  • the matrix used was DNA which was prepared synthetically and which is characterized by SEQ ID NO 6.
  • the primers used were the oligonucleotides IFC-trpE8-for (SEQ ID NO 7) and IFC-trpE8 -rev (SEQ ID NO 8).
  • the cloning vector pStS49 was linearized with the restriction endonuclease Sal (New England Biolabs, Frankfurt am Main). Subsequently, the linearized 5824 base pair fragment was ® on an agarose gel using the QIAquick Gel
  • the cloning of the DNA fragments of a) and b) was performed using the In-Fusion ® HD Cloning Kit (Clontech Laborato factories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer 'manufacturer. The success of the cloning was confirmed by DNA sequence analysis.
  • a vector map of the methyl anthranilate production plasmid pStS58 is shown schematically in FIG.
  • strain SV164 As a parent strain for the chromosomal deletion of the trpD gene served the strain SV164, the preparation of which is described in the patent US6180373 BA.
  • the chromosomal deletion of the trpD gene in strain SV164 was carried out using the Quick & Easy E, coli Gene Deletion Kit from Gene Bridges (Heidelberg, Germany).
  • trpD-del-for SEQ ID NO 9
  • trpD-del-rev SEQ ID NO 10
  • FRT-PGK-gb2- neo-PRT DNA template FRT-PGK-gb2- neo-PRT DNA template performed according to the manufacturer.
  • the oligonucleotides trpD-del-test-for SEQ ID NO 11
  • trpD-del-test-rev SEQ ID NO 12
  • Example 5 Preculture of a methyl anthranilate production strain for fermentation
  • methyl anthranilate was carried out in a 2 L fermenter using a DASGIP device from Eppendorf (Hamburg, Germany).
  • 100 mL LB preculture from Example 5 were used to inoculate the 900 mL production medium consisting of 5 g / LD (+) glucose monohydrate, 0.03 g / L pyridoxine ⁇ HCl, 0.005 g / L thiamine ⁇ HCl, 0, 01 g / L tetracycline ⁇ HCl, 5 g / L (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.5 g / L NaCl, 0.9 g / L L-isoleucine, 0.75 g / L L-tryptophan, 3 g / LD / L-methionine, 0.5 g / L L-phenylalanine, 7.5 g / L yeast extract, 7.5 g / L tryptone, 0.225 g / L CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O, 0.6 g / L MgS0 4 x 7 H 2 O, 0.15 g / L Na 2 M0 4
  • the speed was increased via the control unit of the fermenter up to a value of 1450 rpm to obtain 30% oxygen saturation.
  • Oxygen saturation was determined with a pO 2 probe calibrated at 450 rpm to 100% saturation.
  • the glucose feeding was carried out at a flow rate of 4-6 mL / h while the glucose concentration in the fermenter between 0.1 g / L and 10 g / L was kept constant.
  • the glucose determination was carried out with the YSI 7100 MBS analyzer (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA).
  • a D / L-methionine feed was performed.
  • the feeding he followed 2 h after starting the cultivation at a rate of 7 mL / h, wherein the feed solution had a concentration of 30 g / LD / L-methionine.
  • the determination of methyl anthranilate and the precursor anthra-nilklare was carried out by means of an HPLC method.
  • the analysis was carried out on an HPLC system 1100 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany).
  • the separation column used was a Poroshell column 120 SB-C18, 2.7 mth (100 mm ⁇ 2.1 mm) from Agilent Technologies.
  • the samples were eluted in a gradient mode (mobile phase A: water with 0.1% (v / v) formic acid, mobile phase B: acetonitrile) at 40 ° C. and a flow rate of 0.4 ml / min.
  • the analytes were detected with a UV detector at a wavelength of 320 nm.
  • Table 2 shows the achieved levels of methyl anthranilate and precursors in the culture supernatant with the strain

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismen-Stamm der ein AAMT-Gen, ein RLSS-Gen und ein trpE-Gen exprimiert und ein Verfahren, bei dem dieser Mikroorganismen-Stamm in einem Fermentationsmedium fermentiert wird und dabei Methylanthranilat im Kulturüberstand angehäuft wird.

Description

Mikroorganismen- Stamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Methylanthranilat
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismen- Stamm und Verfah ren zur fermentativen Herstellung von Methylanthranilat.
Methylanthranilat ist ein Aromastoff, der auch als Anthranil- säure ethylester oder 2 -Aminobenzoesäuremethylester bezeichnet wird und die CAS-Nummer 134-20-3 besitzt. Synthetisch herge stelltes Methylanthranilat wird bereits als Geschmacksstoff eingesetzt. Die Substanz kommt beispielsweise in Kakao, Kaffee, Trauben, Grapefruit, Jasmin, Zitronen, Limetten, Erdbee ren und Mandarinen vor und wird daher zur Aromatisierung von Lebensmitteln eingesetzt. Einen guten Überblick über die Ein satzmengen von Methylanthranilat in verschiedenen Aromen- Kompositionen erhält man in einem Review von John Wright (Per- fumer & Flavorist 2016, Volume 41, Seiten 24-27) .
Obwohl Methylanthranilat in einer chemischen Synthese einfach hergestellt werden kann, ist bisher kein natürlich hergestelltes Methylanthranilat am Markt erhältlich. Der Begriff „natür lich" bezieht sich auf die EU-Verordnung 1334/2008, in Kraft getreten am 20. Januar 2011, über Aromen und bestimmte Lebens mittelzutaten mit Aromaeigenschaften zur Verwendung in und auf Lebensmitteln. In dieser Verordnung wird ein „natürlicher Aro mastoff" definiert, wobei hohe Anforderungen bzgl . Herkunft und Herstellung gestellt werden. Die vorliegende Anmeldung verwendet den Begriff „natürliches Methylanthranilat" wie für einen „natürlichen Aromastoff" in der EU-Verordnung 1334/2008, in Kraft getreten am 20. Januar 2011, definiert. Um dem stei genden Bewusstsein der Verbraucher und Wunsch nach Natürlich keit Rechnung zu tragen, werden in der Aromaindustrie immer häufiger synthetisch hergestellte Aromastoffe durch natürliche Aromastoffe ersetzt. Dies setzt allerdings voraus, dass der entsprechende Aromastoff, entsprechend der oben zitierten De finition, auch natürlich am Markt verfügbar ist. Am konkreten Beispiel des Methylanthranilats ist dies nicht der Fall. Eine Darstellung von natürlichem Methylanthranilat ist bei spielsweise über die N-Demethylierung von Methyl -N- methylanthranilat (MNMA; CAS-Nummer 85-91-6) in Biotransforma tionsverfahren möglich. Dabei muss MNMA natürlich extraktiv aus natürlichen Quellen gewonnen werden. In EP0322448B1 ist die Umwandlung von MNMA mit Lignin-abbauenden Pilzen beschrie ben. Die Umsetzung ist jedoch ineffizient, wenn man bedenkt, dass die Umsetzung im Zeitraum von ein bis zwei Wochen er folgt. Neben holzverrottenden Pilzen kann auch das Bakterium Bacillus megaterium in einem Ganzzell-Biotransformations verfahren eingesetzt werden (Taupp et al . , J. Agric . Food Chem. 2005, Vol . 53, 9586-9589).
Eine weitere Möglichkeit zur Umsetzung von MNMA zu Methylanth ranilat ist die Verwendung einer gereinigten Peroxidase aus Soja (Van Haandel et al., J. Agric. Food Chem. 2000, Vol. 48, 1949-1954) Dieses Verfahren ist insofern aufwendig, da erst das Enzym hergestellt werden muss um anschließend in einem weiteren Ansatz das Produkt zu generieren.
Eine Umsetzung der Vorstufe Anthranilsäure zu Methylanthrani lat ist in der Patentschrift US5437991 beschrieben. Hier wird in einem Biotransformationsverfahren eine Candida-Lipase für die Umsetzung verwendet. Auch diese Biotransformation ist mit einer Umsetzung von 10 % des Substrats nach 80 h ineffizient. Weiterhin muss mit Methanol ein sehr giftiger Stoff als weite res Edukt im Prozess eingesetzt werden.
Einzig die Arbeit von Gross et al. (Appl . Microbiol . Biotech- nol . 1990, Vol. 34, 387-391) beschreibt die direkte de novo Herstellung von Methylanthranilat. Auch bei diesem Verfahren wird ein pilzlicher Organismus eingesetzt. Allerdings sind die Ausbeuten mit 19 mg/L nach 5 Tagen Kultivierung zu gering, um natürliches Methylanthranilat effizient hersteilen zu können.
Keines der beschriebenen Verfahren ist effizient genug um die Herstellung von natürlichem Methylanthranilat wirtschaftlich zu ermöglichen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung ei nes Mikroorganismen-Stammes welcher die Herstellung von natür lichem Methylanthranilat effizient ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Mikroorganismen-Stamm, der mindestens ein AAMT-Gen, ein RLSS-Gen und ein trpE-Gen um fasst und exprimiert .
Der erfindungsgemäße Mikroorganismen-Stamm ermöglicht die Her stellung von natürlichem Methylanthranilat in einem Fermenta tionsprozess ohne Supplementierung von direkten Vorstufen des Methylanthranilats .
Das AAMT-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer Anthranil- säure-Methyltransferase besitzt. Derartige Gene sind bekannt. Bevorzugt handelt es sich um ein Gen mit SEQ ID NO 1 sowie Va rianten dieser Sequenz, die durch den degenerierten geneti schen Code bedingt sind.
Das RLSS-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer S- Adenosylmethionin-Synthetase besitzt. Derartige Gene sind be kannt. Bevorzugt handelt es sich um ein Gen mit SEQ ID NO 2 sowie Varianten dieser Sequenz, die durch den degenerierten genetischen Code bedingt sind.
Das trpE-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer Anthrani- latsynthase besitzt. Derartige Gene sind bekannt. Bevorzugt handelt es sich um ein Gen mit SEQ ID NO 3 sowie Varianten dieser Sequenz, die durch den degenerierten genetischen Code bedingt sind. Besonders bevorzugt handelt es sich um Varianten dieser Sequenz, die eine verminderte Feedback-Regulation ge genüber L-Tryptophan aufweisen. Ganz besonders bevorzugt han delt es sich um eine Variante mit den Aminosäureaustauschen P21S und K50E . Die Funktion der Proteine in einem erfindungsgemäßen Mikroor- ganismen-Stamm kann indirekt über das Produkt Methylanthrani- lat charakterisiert werden, da Mikroorganismen selbst kein Me- thylanthranilat produzieren. Als Nachweismethode kann die in Beispiel 7 beschriebene HPLC-Methode verwendet werden.
Der Mikroorganismen-Stamm umfasst vorzugsweise eine oder meh rere funktionelle Kopien der drei benannten Gene. Bevorzugt umfasst er je eine bis 700 Kopien der drei benannten Gene. Be sonders bevorzugt umfasst er je eine bis 20 Kopien der drei benannten Gene. Die Gene können in das Chromosom integriert sein, sie können jedoch auch auf einem oder mehreren Plasmiden vorliegen .
Vorzugsweise erfolgt zur Herstellung von Methylanthranilat die Expression des AAMT-Gens, des RLSS-Gens und des trpE-Gens auf einem Plasmid in einem Mikroorganismen-Stamm .
Die Erfindung umfasst daher ebenfalls ein Plasmid enthaltend ein AAMT-Gen, ein RLSS-Gen, und ein trpE-Gen unter der Kon trolle eines funktionellen Promotors. Ein derartiges Produk tionsplasmid ermöglicht die Herstellung von Methylanthranilat in einem Mikroorganismen-Stamm .
Die Expression dieser Gene wird durch homologe oder heterologe Promotoren erreicht. Der Begriff heterolog bezieht sich hier bei auf die Gene charakterisiert durch SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 , da diese Gene, im Gegensatz zu SEQ ID NO 3, nicht aus Escherichia coli kommen. Entsprechende heterologe Promotoren sind beispielsweise der Promotor des gapA-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des catB-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des tufB-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des mppA-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des lpp-Gens aus Escherichia coli und der Promotor des proC-Gens aus E- scherichia coli. Weiterhin sind die heterologen lac-, tac-, trc-, lambda- , ara- oder tet-Promotoren dem Fachmann bekannt und können zur heterologen Expression der Gene verwendet wer den .
Bevorzugt wird die Expression des AAMT-Gens, des RLSS-Gens, und des trpE-Gens auf einem Plasmid in einem Mikroorganismen- Stamm durch den Promotor des gapA-Gens, durch den Promotor des catB-Gens, durch den Promotor des tufB-Gens, durch den Promo tor des mppA-Gens, durch den Promotor des Ipp-Gens aus E- scherichia coli oder durch den Promotor des proC-Gens aus fi scherichia coli erreicht.
Besonders bevorzugt wird die Expression des AAMT-Gens, des RLSS-Gens und des trpE-Gens auf einem Plasmid in Escherichia coli durch den Promotor des catB-Gens oder durch den Promotor des gapA-Gens aus Escherichia coli erreicht.
Ein erfindungsgemäßes Plasmid umfasst daher vorzugsweise die oben genannten Promotoren, wobei die Promotoren sich derart auf dem Plasmid befinden, dass sie die Expression des AAMT- Gens, des RLSS-Gens und des trpE-Gens steuern.
Besonders bevorzugt enthält das Plasmid eine Operon-Konstruk tion bei der das AAMT-Gen, das RLSS-Gen und das trpE-Gen unter Kontrolle des gapA-Promotors aus Escherichia coli stehen.
Als Promotorregion zur Expression des AAMT-Gens, des RLSS-Gens und des trpE-Gens können jedoch auch die natürlichen (homolo gen) Promotorregionen dieser Gene dienen.
Als Plasmide in die das AAMT-Gen, das RLSS-Gen und das trpE- Gen eingebracht werden, können alle verfügbaren und gentech nisch zugänglichen DNS-Moleküle verwendet werden, die extra chromosomal in Mikroorganismen repliziert werden und die einen Selektionsmarker umfassen.
Als Plasmide in die das AAMT-Gen, das RLSS-Gen und das trpE- Gen eingebracht werden, können bevorzugt alle verfügbaren und gentechnisch zugänglichen DNS-Moleküle verwendet werden, die extrachromosomal in Escherichia coli repliziert werden und die einen Selektionsmarker umfassen. So können beispielsweise Plasmide mit einer hohen zellulären Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pQE-Serie, Plasmide der pBluescript-Serie) , Plasmide mit einer mittleren Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. Plasmide der pBR-Serie, Plasmide der pACYC-Serie) oder Plasmide mit einer niedrigen Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. pSClOl oder pBeloBACll) eingesetzt werden.
Bevorzugt werden Plasmide mit einer mittleren Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. Plasmide der pBR-Serie, Plasmide der pACYC-Serie) verwendet.
Besonders bevorzugt wird ein Plasmid der pACYC-Serie verwen det .
Eine Möglichkeit zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mik roorganismen- Stammes ist das Einbringen eines erfindungsgemäßen Plasmids in einen Ausgangsstamm.
Als AusgangsStämme sind prinzipiell alle Mikroorganismen stämme geeignet, die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und durch Fermentation kultivierbar sind. Solche Mikroorganis men- Stämme können Pilze, Hefen oder Bakterien sein. Bevorzugt handelt es sich um Bakterien der phylogenetischen Gruppe der Eubacteria. Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen- Stämme der Familie Enterobacteriaceae und insbesondere der Art E- scherichia coli.
Besonders bevorzugt sind Escherichia coli- Stämme, die mindes tens einen im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm um den Faktor 2 erhöhten metabolischen Fluss in Richtung Chorismat aufweisen. Chorismat ist der Ausgangs- bzw. Verzweigungspunkt für die Biosynthese von L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan . Ganz besonders bevorzugt ist der Escherichia coli-Stamm
SV164ÄtrpD. Die Konstruktion des Stammes SV164 ist in
US6180373 BA beschrieben. Die chromosomale Deletion des trpD- Gens im Stamm SV164 ist in Beispiel 3 beschrieben. Das Einbringen eines erfindungsgemäßen Plasmids geschieht bei spielsweise durch eine gängige Transformationsmethode wie z.B. Elektroporation oder CaCl2-Methode . Plasmid-tragende Klone werden anschließend über eine Antibiotika-Resistenz selek tiert. Dem Fachmann bekannte Selektionsmarker sind beispiels weise das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen, das Resistenz gegenüber Chloramphenicol vermittelt, das Neomycin-Phospho- transferase-Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin vermittelt, das Tetracyclin-Efflux-Gen, das Resistenz gegenüber Tetracyc lin vermittelt oder das ß-Lactamase-Gen, das Resistenz gegen über Ampicillin und Carbenicillin vermittelt.
Alternativ zur Expression von einem erfindungsgemäßen Plasmid können das AAMT-Gen, das RLSS-Gen, das BAS-Gen und das trpE- Gen auch in das Chromosom eines Mikroorganismen-Stammes zu sätzlich zu einem erfindungsgemäßen Plasmid oder alleine integriert werden. Als Integrationsverfahren werden vorzugsweise die dem Fachmann bekannten Systeme mit temperenten Bakterio phagen, integrativen Plasmiden oder die Integration über homo loge Rekombination genutzt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Be reitstellung eines Verfahrens, welches die Herstellung von na türlichem Methylanthranilat ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, bei dem ein erfindungsgemäßer Mikroorganismen-Stamm in einem Fermentations- medium kultiviert wird und Methylanthranilat in das Fermenta tionsmedium sezerniert wird.
Die Anzucht eines erfindungsgemäßen Mikroorganismen-Stammes im Fermenter erfolgt als kontinuierliche Kultur, als Batch-Kultur oder vorzugsweise als Fed-Batch-Kultur .
Als Kohlenstoff-Quelle dienen vorzugsweise Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren. Besonders bevorzugt werden im er- findungsgemäßen Verfahren als Kohlenstoff-Quellen Glucose, Lactose, Saccharose oder Glycerin eingesetzt.
Bevorzugt ist die Dosierung der Kohlenstoff-Quelle in einer Form, die gewährleistet, dass der Gehalt an Kohlenstoff-Quelle im Fermenter während der Fermentation in einem Bereich von 0,1 g/L bis 50 g/L gehalten wird. Besonders bevorzugt ist ein Bereich von 0,1 g/L bis 10 g/L.
Als Stickstoff-Quelle werden im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Ammoniak, Ammoniumsalze oder Proteinhydrolysate verwendet. Bei Verwendung von Ammoniak als Korrekturmittel zur pH-Kontrolle wird während der Fermentation regelmäßig diese Stickstoff-Quelle nachdosiert.
Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d.h. in mM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zuge setzt werden.
Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat), Aminosäuren (z.B. L-Isoleucin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L- Tryptophan) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6, Vitamin B12) dem Medium zugesetzt werden.
Als komplexe Nährstoffquellen können z.B. Hefeextrakt, Tryp- ton, Maisquellwasser, Sojamehl oder Malzextrakt zum Einsatz kommen .
Die Inkubationstemperatur zur Anzucht eines erfindungsgemäßen Stammes aus der Familie der Enterobacteriaceae beträgt vor zugsweise 28 - 37 °C, besonders bevorzugt ist eine Inkubati onstemperatur von 30 - 32 °C.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums liegt während der Fermen tation bevorzugt im pH-Bereich von 5,0 bis 8,5, besonders be vorzugt ist ein pH-Wert von 7,0. Bevorzugt erfolgt die Inkubation eines erfindungsgemäßen Mik roorganismen-Stammes bevorzugt eines Stammes aus der Familie der Enterobacteriaceae besonders bevorzugt eines Escherichia coli-Sta es unter aeroben, anaeroben oder mikroaeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 6 h bis 150 h und im Bereich der für den jeweiligen Stamm optimalen Wachstums- temperatur. Besonders bevorzugt sind Kultivierungszeiten zwi schen 6 h und 48 h.
Die Fermentation wird vorzugsweise unter aeroben oder mikroae roben Wachstumsbedingungen durchgeführt.
Die Abtrennung von Methylanthranilat aus der Kultur kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie Zentrifugation des Medi ums zur Abtrennung der Zellen mit anschließender Extraktion oder Destillation des Methylanthranilats aus dem Fermentati- onsüberstand mit anschließender Reinigung, Konzentrierung und ggf. Formulierung oder Komplexierung des Produktes, erfolgen.
Der Nachweis und die Quantifizierung des im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten Methylanthranilats erfolgt beispiels weise mittels einer HPLC-Methode .
Fig. 1 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Methylanthra nilat geeignetes Plasmid pStS49 aus Beispiel 1.
Fig. 2 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Methylanthra nilat geeignetes Plasmid pStS58 aus Beispiel 2.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung .
Beispiel 1: Konstruktion des Produktionsplasmids pStS49
Ausgangsplasmid zur Konstruktion eines Methylanthranilat- Produktionsplasmid war das Plasmid pMSRLSSk. Die Herstellung dieses Plasmids ist in US2004175805AA beschrieben. Das Plasmid enthält ein das RLSS-Gen (codiert für die SAM-Synthetase aus der Rattenleber) unter Kontrolle des konstitutiven GAPDH- Promotor des gapA-Gens aus Escherichia coli. a) Amplifizierung des AAMT-Gens:
Das AAMT-Gen aus Zea mays wurde mittels der Polymerase-Ketten- Reaktion (PCR) unter Verwendung des In- Fusion® HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert . Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und die durch SEQ ID NO 1 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-AAMT- for (SEQ ID NO 4) und IFC-AAMT-rev (SEQ ID NO 5) ver wendet .
Das bei der PCR erhaltene DNS -Fragment mit einer Länge von 1199 Basenpaaren wurde anschließend mittels einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep® Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hil den) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Vorbereitung des Plasmids pMSRLSSk für das In- Fusion® HD Cloning
Der Klonierungsvektor pMSRLSSk wurde mit der Restriktionsen- donuclease Kpnl (New England Biolabs, Frankfurt am Main) line- arisiert. Anschließend wurde das linearisierte 4659 Basenpaar- Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick® Gel
Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt . d) Klonierung mittels In-Fusion® HD Cloning
Die Klonierung der DNS -Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion® HD Cloning Kits (Clontech Laborato ries, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Her stellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Methylanthrani- lat- Produktionsplasmids pStS49 ist schematisch in Fig. 1 dar gestellt .
Beispiel 2: Konstruktion des Produktionsplasmids pStS58
Ausgangsplasmid zur Konstruktion des Methylanthranilat- Pro duktionsplasmids pStS58 war das Plasmid pStS49 aus Beispiel 1. a) Amplifizierung des trpE8-Gens:
Das trpE8-Gen aus Escherichia coli wurde mittels der Polymera se-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion® HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifor nien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert . Als Mat rize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und die durch SEQ ID NO 6 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-trpE8 - for (SEQ ID NO 7) und IFC-trpE8 -rev (SEQ ID NO 8) verwendet.
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 1609 Basenpaaren wurde anschließend mittels einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep® Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hil den) nach Herstellerangaben gereinigt . b) Vorbereitung des Plasmids pStS49 für das In-Fusion® HD Clo ning
Der Klonierungsvektor pStS49 wurde mit der Restriktionsendonu- clease S al (New England Biolabs, Frankfurt am Main) lineari- siert. Anschließend wurde das linearisierte 5824 Basenpaar- Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick® Gel
Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt . c) Klonierung mittels In-Fusion® HD Cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion® HD Cloning Kits (Clontech Laborato ries, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Her stellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Methylanthrani- lat-Produktionsplasmids pStS58 ist schematisch in Fig. 2 dar gestellt .
Beispiel 3 : Herstellung des Stammes SV164AtrpD
Als Ausgangsstamm für die chromosomale Deletion des trpD-Gens diente der Stamm SV164, dessen Herstellung in der Patent schrift US6180373 BA beschrieben ist. Die chromosomale Deletion des trpD-Gens im Stamm SV164 erfolg te mit Hilfe des Quick & Easy E, coli Gene Deletion Kits der Firma Gene Bridges (Heidelberg, Deutschland) . Die Deletion des trpD-Gens wurde vom Startcodon ATG bis zum Stoppcodon ATT mit Hilfe der Oligonukleotide trpD-del-for (SEQ ID NO 9) und trpD- del-rev (SEQ ID NO 10) unter Verwendung der FRT-PGK-gb2-neo- PRT DNA-Matrize nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Zur finalen Kontrolle des trpD-Locus wurden die Oligonukleotide trpD-del-test-for (SEQ ID NO 11) und trpD-del-test-rev (SEQ ID NO 12) verwendet.
Beispiel 4: Herstellung von Methylanthranilat - ProduktionsStämmen
Die in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Methylanthrani - lat-Produktionsplasmide pStS49 und pStS58 wurden mittels
Elektroporations-Methode (Dower et al . , Nucleic Acids Res.
1988, 6: 6127-6145) zur Transformation des Escherichia coli- Stammes SV164ÄtrpD eingesetzt. Die Elektroporationen wurden mit einem Eporator® (Eppendorf, Hamburg) im Programm PI (1700 V) mit 1 mm Elektroporationsküvetten # 5510 (Molecular Biopro- ducts, San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt. Nach Selek tion auf LB-Agarplatten mit 20 mg/L Tetracyclin wurden die Plasmide aus einer der Transformanten reisoliert, mit Restrik- tionsendonucleasen gespalten und überprüft. Die Produktions stämme wurden mit SV164AtrpD/pStS49 und SV164AtrpD/pStS58 be zeichnet und sind für die Produktion von Methylanthranilat ge eignet .
Beispiel 5: Vorkultur eines Methylanthranilat - Produktions - Stammes für die Fermentation
100 mL LB-Medium mit Glucose (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 5 g/L D (+) -Glucose Monohydrat; autoklaviert) wurden in einem sterilen 500 mL Erlenmeyerkolben mit Tetracyclin x HCl versetzt (Endkonzentration von Tetracyclin x HCl: 0,01 g/L, sterilfiltriert).
Mit einer Impföse wurden so viele Zellen des Produktionsstam mes von der Agarplatte abgenommen bis maximal eine schwache Trübung erkennbar wurde. Die Vorkultur wurde für 5 h bei 30 °C und 130 rpm auf einem Inkubations-Schüttler CERTOMAT® IS (Sar torius Stedium Biotech, Göttingen, Deutschland) kultiviert.
Beispiel 6: Fermentative Herstellung von Methylanthranilat
Die Herstellung von Methylanthranilat erfolgte in einem 2 L- Fermenter mit Hilfe eines DASGIP-Geräts der Firma Eppendorf (Hamburg, Deutschland) .
100 mL LB-Vorkultur aus Beispiel 5 dienten zum Animpfen der 900 mL Produktionsmedium, bestehend aus 5 g/L D(+) -Glucose Mo nohydrat, 0,03 g/L Pyridoxin x HCl, 0,005 g/L Thiamin x HCl, 0,01 g/L Tetracyclin x HCl, 5 g/L (NH4)2S04, 0,5 g/L NaCl, 0,9 g/L L-Isoleucin, 0,75 g/L L-Tryptophan, 3 g/L D/L-Methionin, 0,5 g/L L-Phenylalanin, 7,5 g/L Hefeextrakt, 7,5 g/L Trypton, 0,225 g/L CaCl2 x 2 H20, 0,6 g/L MgS04 x 7 H20, 0,15 g/L Na2M04 x 2 H20, 0,3 g/L H3BO3 , 0,2 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuS04 x 5 H20, 1,6 g/L MnCl2 x 4 H20, 1,35 g/L ZnS04 x 7 H20, 0,075 g/L FeS04 x 7 H20, 1 g/L Na3-Citrat x 2 H20 und 1,71 g/L KH2P04. Die Medienbestandteile wurden steril in einem 2 L~ Fermenter vorge legt und mit sterilen Korrekturmitteln (25 % Ammoniak & 6 , 8 N H3P04 ) auf pH = 7,0 eingestellt. Während der Kultivierung für 67 h wurden die Temperatur auf 30 °C sowie der pH-Wert bei 7,0 durch das Korrekturmittel (25 % Ammoniak) konstant gehalten. Als Antischaummittel wurde Struktol J673 (Schill + Seilacher, Hamburg) in einer Verdünnung von 1:10 in sterilem Wasser ver wendet. Die Kultur wurde mit keimfreier Druckluft mit 100 L/h begast und mit einer Rührerdrehzahl von 450 rpm gerührt. Nach Absinken der SauerstoffSättigung auf einen Wert von 30 % wurde die Drehzahl über die Steuerungseinheit des Fermenters bis zu einem Wert von 1450 rpm erhöht um 30 % SauerstoffSättigung zu erhalten. Die SauerstoffSättigung wurde mit einer p02-Sonde bestimmt, die bei 450 rpm auf 100 % Sättigung kalibriert wur de. Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter auf ca. 1-2 g/L ab gesunken war, erfolgte die Zudosierung einer 56 % (w/v) Glu coselösung. Die Glucose-Fütterung erfolgte mit einer Flussrate von 4-6 mL/h wobei die Glucose-Konzentration im Fermenter zwi schen 0,1 g/L und 10 g/L konstant gehalten wurde. Die Glucose- Bestimmung wurde mit dem Analysator YSI 7100 MBS (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt. Für eine effiziente Bereitstellung von S-Adenosylmethionin wurde ein D/L-Methionin-Feed durchgeführt. Die Zufütterung er folgte 2 h nach Start der Kultivierung mit einer Rate von 7 mL/h, wobei die Feedlösung eine Konzentration von 30 g/L D/L-Methionin besaß.
Die Ergebnisse der Methylanthranilat- Fermentationen mit den Produktionsstämmen aus Bsp. 4 sind in den Tabellen 1 und 2 zu sammengefasst .
Beispiel 7 : Nachweis von Methylanthranilat und Anthranilsäure
Die Bestimmung von Methylanthranilat und der Vorstufe Anthra nilsäure erfolgte mittels einer HPLC-Methode . Die Analyse er folgte an einer HPLC-Anlage 1100 der Firma Agilent Technolo gies (Waldbronn, Deutschland) . Als Trennsäule diente eine Po- roshell-Säule 120 SB-C18, 2,7 mth (100 mm x 2,1 mm) der Firma Agilent Technologies. Die Proben wurden in einer Gradienten fahrweise (mobile Phase A: Wasser mit 0,1 % (v/v) Ameisensäu re, mobile Phase B: Acetonitril) bei 40 °C und einem Fluss von 0,4 mL/min eluiert . Die Analyten wurden mit einem UV-Detektor bei einer Wellenlänge von 320 nm detektiert.
Beispiel 8; Nachweis von S-Adenosylmethionin und Chorisminsäu- re
Die Bestimmung von S-Adenosylmethionin und Chorisminsäure er folgte mittels einer HPLC-Methode. Die Analyse erfolgte an einer HPLC-Anlage 1100 der Firma Agilent Technologies (Waldbronn, Deutschland) . Als Trennsäule diente eine Gemini C18- Säule 3,0 mth (250 mm x 4,6 mm) der Firma Phenomenex (Aschaf fenburg, Deutschland) . Die Proben wurden in einer Gradientenfahrweise (mobile Phase A: Wasser mit 0,4 % (v/v) Phosphorsäu re und 0,03 % (v/v) Schwefelsäure, mobile Phase B: Aceto nitril) bei 25 °C und einem Fluss von 0,5 mL/min eluiert. Die Analyten wurden mit einem UV-Detektor bei einer Wellenlänge von 200 nm detektiert. Tabelle 1 zeigt die erzielten Gehalte an Methylanthranilat und Vorprodukten im Kulturüberstand, die mit dem Stamm
SV164AtrpD/pStS49 erhalten wurden. Tabelle 1 :
Figure imgf000017_0001
Tabelle 2 zeigt die erzielten Gehalte an Methylanthranilat und Vorprodukten im Kulturüberstand, die mit dem Stamm
SV164ÄtrpD/pStS58 erhalten wurden.
Tabelle 2 :
Figure imgf000017_0002

Claims

22 Patentansprüche
1. Mikroorganismen-Stamm, der eine Herstellung von natürli chem Methylanthranilat in einem Fermentationsprozess ohne Supplementierung von direkten Vorstufen des Methylanthra- nilats ermöglicht, dadurch gekennzeichnet, dass er min destens ein AAMT-Gen, ein RLSS-Gen und ein trpE-Gen um fasst und exprimiert .
2. Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, dass er j e eine bis 700 Kopien der drei benann ten Gene umfasst.
3. Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Mikroorganismen-Stamm der Fa milie der Enterobacteriaceae ist.
4. Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, dass er ein Escherichia coli-Stamm ist, der mindestens einen im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm um den Faktor 2 erhöhten metabolischen Fluss in Richtung Chorismat aufweist.
5. Plasmid enthaltend ein AAMT-Gen, ein RLSS-Gen, und ein trpE-Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promo tors .
6. Plasmid gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein Promotor des gapA-Gens, ein Promotor des catB-Gens, ein Promotor des tufB-Gens, ein Promotor des mppA-Gens, ein Promotor des lpp-Gens aus Escherichia coli oder der Promotor des proC-Gens aus Escherichia coli ist.
7. Verfahren zur Herstellung von natürlichem Methylanthrani lat bei dem ein Mikroorganismen-Stamm in einem Fermenta tionsmedium kultiviert wird und Methylanthranilat in das Fermentationsmedium sezerniert wird, dadurch gekennzeich- 23 net, dass ein Mikroorganismen- Stamm gemäß Anspruch 1 bis 4 fermentiert wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismen- Stamm ein Stamm aus der Familie der
Enterobacteriaceae ist, der unter aeroben, anaeroben oder mikroaeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 6 h bis 150 h und im Bereich einer für den Stamm op timalen Wachstumstemperatur von 28 - 37 °C fermentiert wird, wobei das Fermentationsmedium während der Fermenta tion einen pH-Wert im Bereich von pH 5,0 bis pH 8,5 auf- weist .
9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich- net, dass eine Abtrennung von Methylanthranilat aus der
Kultur mittels einer Zentrifugation des Mediums zur Ab trennung der Zellen mit anschließender Extraktion mit ei ner oder Destillation des Methylanthranilats aus dem Fer- mentationsüberstand mit anschließender Reinigung, Kon- Zentrierung und ggf . Formulierung oder Komplexierung des
Produktes, erfolgt.
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