WO2020091464A1 - 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법 및 이를 이용한 초음파 조사 장치 - Google Patents

초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법 및 이를 이용한 초음파 조사 장치 Download PDF

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ultrasonic
cells
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Inventor
김철우
박동희
원종호
오해리
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Bioinfra Life Science Inc
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Bioinfra Life Science Inc
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N7/00—Ultrasound therapy

Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound and an ultrasound irradiation apparatus using the same.
  • Minoxidil is a formulation applied to the scalp and was developed as a treatment for hypertension due to the effect of expanding blood vessels at Pfizer in the past, but was sold as a treatment for hair loss after studying side effects of hair on the forehead and hands.
  • the mechanism of action of minoxidil has not been clarified, it is known that it theoretically expands the blood vessels of the scalp, opens the potassium channel of the cell membrane, supplies oxygen and nutrients to the hair follicle, suppresses hair loss, promotes hair growth, and thickens hair.
  • side effects such as erythema, scalp dryness, chest palpitations, tachycardia, and arrhythmia may occur.
  • the ingredient of Propecia sold by Merck is finasteride, which was originally developed to treat prostatic hyperplasia, but has been used as a hair loss treatment agent because it promotes hair growth.
  • 5 ⁇ -reductase converts the male hormone testosterone to dihydrotestosterone (DHT), which is a major component of hair loss.
  • Finasteride inhibits this 5 ⁇ -reductase enzyme and lowers the concentration of DHT that causes hair loss.
  • Typical side effects include erectile dysfunction, decreased libido, sexual dysfunction, and sexual dysfunction, dizziness, headache, edema, and skin rash. Men with low infertility or sperm count should be cautious about taking medication. In addition, there is a fear of birth defects, so women of childbearing age should not take or contact with medications, and there are restrictions on prescribing.
  • avodot is a component of the dutasteride family, and was developed as a treatment for prostate hyperplasia, like finasteride, but has been found to be used as a treatment for hair loss because of its anti-hair loss effect.
  • dutasteride has a slightly stronger hair loss suppression effect than finasteride.
  • it is known to have strong side effects such as decreased libido and decreased kidney function, so it is used in a limited way compared to finasteride, and has not been approved by the FDA as a treatment for hair loss in the United States.
  • reddensyl Although there are various raw materials included in the functional cosmetics for preventing hair loss, such as reddensyl, these are mostly peptides and growth factors, and most of them have high molecular weight (e.g., 0.5 to 10 kDa), so skin absorption rate when used directly It is difficult to transfer raw materials through the skin, which is difficult.
  • Iontophoresis is a technique that promotes the absorption of drugs by using a potential difference by generating a micro-current through a device such as a patch on an application site. It has the advantage of being available for a wide range of applications, non-invasive and painless, but if the polarity of the drug is not sufficient, the application may be limited, and the size or depth of application may be limited. In addition, erythema may occur when an excessively strong current is applied, and there may be side effects such as itching.
  • the microneedle creates a hole hundreds of micrometers deep in the skin and delivers it.
  • the laser system laser system
  • the stomach system may cause pain, It can irritate the skin and cause erythema.
  • the present invention aims to solve all of the above-mentioned problems.
  • Another object of the present invention is to increase the survival rate of cells without pain, non-invasively by irradiating ultrasound.
  • Another object of the present invention is to increase the survival rate of cells by irradiating only ultrasonic waves without using expensive drugs.
  • the ultrasound generating unit is a critical range from the epidermis of the subject.
  • the ultrasound parameters are irradiated to the epidermis of the object by positioning within, but the ultrasound parameters include at least the pressure of the ultrasound and the duty percentage of the ultrasound, the pressure of the ultrasound is 0.5 MPa to 1 MPa, and the duty percentage of the ultrasound is 1%.
  • a method characterized by being between 5% and 5% is disclosed.
  • the ultrasonic parameters further include an intensity of ultrasonic waves, and the intensity of the ultrasonic waves is 166.7 mW / cm 2 to 416.7 mW / cm 2 .
  • the ultrasound parameters further include a frequency of ultrasound, and the frequency of the ultrasound is 0.5 MHz to 4.6 MHz.
  • the ultrasonic parameters further include a total irradiation time of ultrasonic waves, and a method characterized in that the total irradiation time of ultrasonic waves is within 10 minutes.
  • a method characterized by a method characterized in that the cell is an outer root sheath cell is disclosed.
  • an ultrasonic irradiation apparatus for increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound, comprising: an ultrasonic generator; And a controller configured to position the ultrasound generating unit within a critical range from the epidermis of an object to cause the ultrasound generating unit to irradiate ultrasound to the epidermis of the object, while each of the ultrasound parameters is preset to a predetermined range.
  • the ultrasonic parameters include at least the pressure of the ultrasonic wave and the duty percentage of the ultrasonic wave, the pressure of the ultrasonic wave is 0.5 MPa to 1 MPa, and the ultrasonic irradiation device is characterized in that the duty percentage of the ultrasonic wave is 1% to 5%. .
  • the ultrasonic parameters further include the intensity of ultrasonic waves, and the ultrasonic intensity of the ultrasonic waves is 166.7 mW / cm 2 to 416.7 mW / cm 2 .
  • the ultrasonic parameters further include a frequency of ultrasonic waves, and the ultrasonic wave frequency is 0.5 MHz to 4.6 MHz.
  • the ultrasonic parameters further include a total irradiation time of the ultrasound, and the total irradiation time of the ultrasound is disclosed within 10 minutes.
  • the ultrasonic irradiation device is characterized in that the cells are outer root sheath (outer root sheath) cells.
  • the present invention has an effect of increasing the survival rate of cells without pain non-invasively by irradiating ultrasound.
  • the present invention has an effect of increasing the survival rate of cells by irradiating only ultrasound without using expensive drugs.
  • FIGS. 1A and 1B are schematic views for explaining the concept of parameters of ultrasound in a method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 schematically shows the skin stability test results for a method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention
  • 3A and 3B schematically illustrate the survival rate of human lateral myocardial cell according to the concentration of the existing drug when only the existing drug is applied
  • FIG. 4 schematically shows the experimental results of the survival rate of human lateral root sheath cells by the method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention together with the experimental results by other drugs,
  • Figure 5 schematically shows the experimental results of human outer root cell viability for the control group
  • Figure 6 schematically shows the results of the experiment immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 1%) to human lateral root sheath cells;
  • Figure 7 schematically shows the results of the experiment 12 hours after the ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 1%) was irradiated to human lateral root sheath cells
  • Figure 9 schematically shows the results of the experiment 12 hours after the irradiation of ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 2%) to human lateral root sheath cells
  • FIG. 11 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral root sheath cells;
  • FIG. 12 schematically shows the experimental results immediately after irradiating ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 1%) to human lateral root sheath cells;
  • Figure 13 schematically shows the results of the experiment 12 hours after the ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 1%) was irradiated to human lateral root hair cells.
  • FIG. 14 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 2%) to human lateral root sheath cells;
  • FIG. 15 schematically shows the results of the experiment 12 hours after the irradiation of ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 2%) to human lateral root sheath cells;
  • FIG. 16 schematically shows the experimental results immediately after irradiation of ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral root sheath cells;
  • Figure 17 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral root sheath cells
  • Figure 18 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 5%) to human lateral root sheath cells;
  • Figure 19 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 5%) to human lateral root sheath cells
  • Figure 20 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 10%) to human lateral root sheath cells
  • Figure 21 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 10%) to human lateral root sheath cells,
  • 22 is a diagram schematically showing the results of experiments on the survival rate of human outer root sheath cells by the method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention with the pressure and duty percentage of ultrasound as variables;
  • 23 and 24 schematically show the results of experiments on the survival rate of human lateral root sheath cells by the method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention with the intensity of ultrasound as a variable Did,
  • FIG. 25 is an ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 2%, intensity: 166.7 mW / cm 2 ) irradiated to human lateral root sheath cells, schematically showing experimental results according to various frequencies of ultrasound,
  • FIG. 26 schematically shows experimental results according to various frequencies of ultrasound while irradiating ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 1%, intensity: 333.3 mW / cm 2 ) to human lateral root sheath cells,
  • FIG. 27 is an ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 5%, intensity: 416.7 mW / cm 2 ) irradiated to human lateral root sheath cells, schematically showing experimental results according to various frequencies of ultrasound,
  • FIGS. 1A and 1B are diagrams for explaining the concept of parameters of ultrasound in a method of increasing the viability of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention.
  • the ultrasonic parameters are as follows.
  • Duty percentage The percentage value divided by one cycle of the actual irradiation time at which the ultrasound is irradiated
  • PRF pulse repetition frequency
  • the duty percentage in FIG. 1B has a value of Ton / (Ton + Toff) * 100 as a value for a time (Ton) at which ultrasonic waves are actually irradiated among one cycle (Ton + Toff) in which ultrasonic waves are irradiated.
  • Table 1 shows intensity values according to pressure and duty percentage of each ultrasonic wave.
  • Figure 2 schematically shows the results of a skin stability test for a method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention.
  • the skin temperature increased by about 1.2 degrees Celsius for 30 minutes, and only an average temperature change of 0.05 degrees Celsius per minute was observed. . That is, it can be confirmed that the degree of temperature change due to irradiation with ultrasonic waves does not reach the extent to damage the skin.
  • Table 2 below shows cell seeding density.
  • Table 3 shows the required amount of cells according to the number of conditions.
  • cell culture is human hair outer root sheath cells (HHORSC), mesenchymal stem cell medium (MSCM), FBS 0.25% trypsin / EDTA solution, trypsin neutralization solution, dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), It consists of poly-L-lysine, T75 flask.
  • HHORSC human hair outer root sheath cells
  • MSCM mesenchymal stem cell medium
  • FBS 0.25% trypsin / EDTA solution trypsin neutralization solution
  • DPBS dulbecco's phosphate-buffered saline
  • WST-1 cell proliferation assay system is used for WST-1 assay, and Trizol, sensiFAST probe Hi-ROX one step kit, PrimeTime qPCR assay is used for PCR.
  • MSCM 500ml basal medium, 25ml FBS, 5ml Mesenchymal stem cells are used to make whole medium.
  • the frozen cell vial is dissolved in a 37 degree water bath, the dissolved cell is placed in 3 ml of a medium, and centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes to cell down. Then, after washing with DPBS, centrifugation is performed at 3000 rpm for 3 minutes, and the cell is down. This process is repeated twice. Then, 8 ml of the medium is added to a T75 flask coated with Poly-L-lysine, the cell pellet is released, seeded, and cultured in a 37 ° C 5% CO2 incubator.
  • poly-L-lysine coating is added according to Table 4 for each plate, and then the culture dish coating method is performed.
  • the cells seeded in a 6 well plate are cultured for 12 to 18 hours and then checked under a microscope. Then, after removing the media, wash it twice with DPBS, switch to growth factor free media, and irradiate the cells for 10 minutes. Then, incubated for 24 hours in a 37% 5% CO2 incubator, the medium was removed, washed with DPBS, treated with 0.2 ml of WST-1 drug, and incubated for 3 hours, and then, in a 6 well plate, 3 wells of 96 well plates per well The solution is transferred and the 96 well plate is measured at 450 nm with an absorbance meter.
  • the cells seeded in a 96 well plate are cultured for 12 to 18 hours, and then confirmed whether they are well seeded. And after removing the media, wash it twice with DPBS, change it to growth factor free media, and apply the drug to the cells. Then, incubated for 24 hours in a 37% 5% CO2 incubator, the medium was removed, washed with DPBS, treated with 0.2 ml of WST-1 drug, incubated for 3 hours, and measured at 450 nm with a 96 well plate absorbance meter.
  • FIGS. 3A and 3B schematically illustrate the survival rate of human lateral myocardial cell according to the concentration of the existing drug when only the existing drug is applied.
  • FIG. 3a shows the cell survival rate according to the concentration of lidensil when the hair loss treatment drug lidensil is applied
  • FIG. 3b shows the cell survival rate according to the concentration of minoxidil when the hair loss treatment drug minoxidil is applied.
  • Table 5 shows the experimental conditions for the case where only the drug is applied. At this time, the solubility of minoxidil is 0.2% dissolved in PBS, and the condition is measured 24 hours after application of the drug.
  • Figure 4 shows the results of experiments with the survival rate of human lateral root sheath cells by the method of increasing the survival rate of cells by irradiating ultrasound according to an embodiment of the present invention together with the results of experiments with other drugs.
  • a media comparison experiment was performed.
  • complete media was treated with Redensyl and observed for 24 hours.
  • the time is not limited to 24 hours, and the time may be changed depending on the cell state.
  • redensyl treatment was performed on media that did not contain growth factors and observed for 24 hours. As in the first experiment, the second experiment may be able to change the time according to the cell state.
  • Tables 6 to 9 show the conditions of ultrasonic irradiation experiments to evaluate the physical effects of ultrasound on cells.
  • Tables 6 and 7 show the conditions observed by redensyl treatment on serum free media, overnight, and complete media during the stabilization process after seeding.
  • Table 8 and Table 9 show the conditions observed by stabilization by seeding and then treated with Redensyl in serum free media.
  • Table 10 shows experimental conditions for irradiating ultrasonic waves while varying the pressure and duty percentage of ultrasonic waves.
  • ultrasonic waves were irradiated with a pressure of 0.5 MPa or 1 MPa and a duty percentage of ultrasonic waves of 1% to 3%.
  • FIG. 5 schematically shows the survival rate at a specific time point and the survival rate after 12 hours from a specific time point for human lateral root sheath cells that have not been irradiated with ultrasound, and a control group for comparison with the group irradiated with ultrasound is shown. it means.
  • FIG. 6 schematically shows the results of the experiment immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 1%) to human lateral hair root sheath cells.
  • FIG. 7 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 1%) to human lateral root sheath cells.
  • FIG. 8 schematically shows the experimental results immediately after irradiating ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 2%) to human lateral capillary cells.
  • Figure 9 schematically shows the results of the experiment 12 hours after the irradiation of ultrasound (pressure: 0.5MPa, duty percentage: 2%) to human lateral root root cells.
  • FIG. 10 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral hairy root cells.
  • FIG. 11 schematically shows the results of an experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral root sheath cells.
  • FIG. 12 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasonic waves (pressure: 1 MPa, duty percentage: 1%) to human lateral capillary cells.
  • FIG. 13 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 1%) to human lateral hair root cells.
  • FIG. 14 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 2%) to human lateral hair root cells.
  • FIG. 15 schematically shows the results of the experiment 12 hours after the irradiation of ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 2%) to human lateral root sheath cells.
  • FIG. 16 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral hairy root cells.
  • FIG. 17 schematically shows the results of an experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 1 MPa, duty percentage: 3%) to human lateral hairy root cells.
  • cell viability such as cells bursting or deforming when 12 hours elapsed immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1 MPa, duty: 3%) and after irradiation You can see that it has decreased.
  • FIG. 18 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 5%) to human lateral hairy root cells.
  • Figure 19 schematically shows the results of the experiment 12 hours after irradiation of human lateral root root cells with ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 5%).
  • FIG. 20 schematically shows the experimental results immediately after irradiation with ultrasonic waves (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 10%) to human lateral capillary cells.
  • FIG. 21 schematically shows the results of an experiment 12 hours after irradiation of ultrasound (pressure: 1.5 MPa, duty percentage: 10%) to human lateral root sheath cells.
  • the ultrasound irradiation apparatus positions the ultrasound generator within a critical range from the epidermis of the subject, Irradiating ultrasound to the epidermis, the ultrasound parameters include at least the pressure of the ultrasound and the duty percentage of the ultrasound, the pressure of the ultrasound is 0.5 MPa to 1 MPa, and the duty percentage of the ultrasound may be 1% to 5%.
  • the parameters of the ultrasound may further include the intensity of the ultrasound, and the intensity of the ultrasound may be 166.7 mW / cm 2 to 416.7 mW / cm 2 .
  • the parameters of the ultrasound may further include the total irradiation time of the ultrasound, and the total irradiation time of the ultrasound may be 10 minutes, but is not limited thereto, and may be an irradiation time within 10 minutes or more than 10 minutes. have.
  • the ultrasound generating unit may irradiate ultrasound to the epidermis of the subject in a state in contact with the epidermis of the subject or spaced apart from the epidermis of the subject.
  • the ultrasonic generator may have a shape surrounding the epidermis of the object in the form of a helmet or head gear.
  • the cells may be outer root sheath cells.
  • FIG. 22 schematically shows the survival rate test results of human lateral myocardial cell derived by irradiating ultrasound according to pressure and duty percentage of various ultrasounds
  • FIGS. 23 and 24 show ultrasounds according to the intensity of various ultrasounds. It is a schematic illustration of the survival rate test results of human lateral root sheath cells derived by examining.
  • the pressure of the ultrasonic wave is 0.5MPa to 1MPa
  • the duty percentage of the ultrasonic wave is 1% to 5%
  • the intensity of the ultrasonic wave is 166.7 mW / cm
  • Table 11 shows the cell viability measured for each pressure and duty percentage of ultrasonic waves irradiated to the cells.
  • the parameters of the ultrasound may further include the frequency of the ultrasound, the frequency of the ultrasound may be 0.5MHz to 4.6MHz.
  • 25 to 27 are diagrams schematically showing experimental results obtained by varying the frequency of ultrasonic waves while irradiating ultrasonic waves to human lateral root sheath cells while maintaining the pressure and the duty percentage of ultrasonic waves.
  • FIG. 25 shows ultrasonic waves (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 2%, intensity: 166.7 mW / cm 2 ) to human lateral root sheath cells, but the frequencies of ultrasonic waves are 0.2 MHz, 0.5 MHz, 1 MHz, and 4.6. The experimental results obtained by changing to MHz and 10 MHz are shown.
  • the cell survival rate in the section where the frequency of the ultrasound is 0.5 MHz to 4.6 MHz is significantly higher than the cell survival rate in the other section.
  • FIG. 26 irradiates ultrasonic waves (pressure: 1 MPa, duty percentage: 1%, intensity: 333.3 mW / cm 2 ) to human outer root sheath cells, but the frequencies of ultrasonic waves are 0.2 MHz, 0.5 MHz, 1 MHz, The experimental results obtained by changing to 4.6 MHz and 10 MHz are shown.
  • the cell survival rate in the section where the frequency of the ultrasound is 0.5 MHz to 4.6 MHz is significantly higher than the cell survival rate in the other section.
  • FIG. 27 irradiates ultrasonic waves (pressure: 0.5 MPa, duty percentage: 5%, intensity: 416.7 mW / cm 2 ) to human outer root sheath cells, but the frequencies of ultrasonic waves are 0.2 MHz, 0.5 MHz, 1 MHz, The experimental results obtained by changing to 4.6 MHz and 10 MHz are shown.
  • the cell survival rate in the section where the frequency of the ultrasound is 0.5 MHz to 4.6 MHz is significantly higher than the cell survival rate in the other section.
  • FIG. 28 schematically shows the results of WNT10B and Beta Catenin-related gene expression when ultrasonic waves having a frequency of 1 MHz were irradiated to human lateral root sheath cells while changing pressure and duty percentage.
  • the intensity of the ultrasound was set to 166.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW / cm 2 (1MPa, 1%) and 416.7 mW / cm 2 (0.5MPa, 5%) to human lateral root sheath cells.
  • the ultrasound was examined, it was confirmed that the observed WNT10B and Beta Catenin-related gene expression levels were significantly higher than those in the Control group.
  • FIG. 29 schematically shows the results of Keratin 15 and VDR-related gene expression when ultrasonic waves having a frequency of 1 MHz are irradiated to human lateral root sheath cells while changing pressure and duty percentage.
  • the intensity of ultrasonic waves was set to 166.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW / cm 2 (1 MPa, 1%) and 416.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 5%).
  • FIG. 30 schematically shows the results of gene expression related to PCNA and Ki67 when irradiated to human lateral root sheath cells while changing the pressure and duty percentage of ultrasonic waves having a frequency of 1 MHz.
  • the intensity of ultrasonic waves was set to 166.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW / cm 2 (1 MPa, 1%) and 416.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 5%).
  • FIG. 31 schematically shows the results of BCL2-related gene expression when ultrasonic waves having a frequency of 1 MHz are irradiated to human lateral root sheath cells while changing pressure and duty percentage.
  • the intensity of ultrasonic waves was set to 166.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW / cm 2 (1 MPa, 1%) and 416.7 mW / cm 2 (0.5 MPa, 5%).
  • the ultrasonic parameters may further include PRF or PRP, PRF may be 1 Hz to 100 Hz, and PRP may be 0.01 to 1 second.

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Abstract

초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 있어서, 초음파 파라미터들 각각이 소정의 범위로 기설정된 상태에서, 초음파 조사 장치가, 초음파 발생부를 대상체의 표피로부터 임계 범위 내에 위치시킴으로써 상기 대상체의 표피에 초음파를 조사하되, 상기 초음파 파라미터들에는 적어도 초음파의 압력 및 초음파의 duty percentage가 포함되고, 상기 초음파의 압력은 0.5MPa 내지 1MPa이고, 상기 초음파의 duty percentage는 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 방법 및 이를 이용한 초음파 조사 장치가 개시된다.

Description

초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법 및 이를 이용한 초음파 조사 장치
본 발명은 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법 및 이를 이용한 초음파 조사 장치에 관한 것이다.
발모제로 사용되고 있는 대표적인 물질은 미녹시딜(Minoxidil)과 프로페시아(Propecia)이다. 미녹시딜은 두피에 바르는 제형으로 과거 화이자(Pfizer)사에서 혈관을 확장시키는 효과로 인해 고혈압 치료제로 개발되었으나, 이마나 손등에 털이 나는 부작용의 연구 끝에, 탈모 치료제로 판매되었다. 미녹시딜의 작용 기전은 명확히 밝혀지지 않았으나 이론적으로 두피의 혈관을 확장시키고, 세포막의 칼륨 채널을 열어 산소 및 영양분을 모낭으로 공급해 탈모를 억제하고, 모발 성장을 촉진하며, 모발을 두껍게 한다고 알려져 있다. 하지만 홍반, 두피건조, 가슴 두근거림, 빈맥, 부정맥 등의 부작용이 발생할 수 있다.
머크(Merck)사에서 판매하는 프로페시아(Propecia)의 성분은 피나스테리드(finasteride)로 원래는 전립선비대증을 치료하기 위해 개발되었으나 모발의 성장을 촉진한다는 점을 이용하여 탈모치료제로 사용되고 있다. 5α-리덕타제(5α-reductase)는 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosterone, DHT)으로 전환하는데, DHT는 탈모를 일으키는 주요한 성분이다. 피나스테리드는 이러한 5α-리덕타제 효소를 억제하여 탈모를 유발하는 DHT의 농도를 저하시킨다. 대표적인 부작용으로는 발기부전, 성욕 감퇴, 성적흥분 장애 등의 성기능 저하와 어지럼증, 두통, 부종 및 피부 발진 등이 있다. 불임이나 정자수가 적은 남성의 경우 약물 복용에 주의를 기울여야 한다. 또한 기형아 출산의 우려가 있어 가임기 여성은 약물 복용 및 접촉을 하면 안 되고, 처방하는 데 제한이 있다.
또한 아보다트는 두타스테리드(dutasteride) 계열의 성분으로, 피나스테리드와 마찬가지로 전립선비대증 치료제로 개발되었으나, 탈모 방지라는 효과가 발견되어 탈모 치료제로 사용되고 있다. 일반적으로 피나스테리드 계열보다 두타스테리드가 조금 더 강력한 탈모 억제 효과를 내는 것으로 알려졌다. 하지만 성욕감퇴, 신장 기능 저하 등의 부작용 또한 강한 것으로 알려져 있어 피나스테리드에 비해서 제한적으로 사용되고 있고, 미국에서는 탈모 치료제로서 FDA 승인을 받지 못한 바 있다.
탈모 방지 기능성 화장품에 포함되는 원료 물질은 리덴실(Redensyl) 등 여러 가지가 있지만, 이들은 펩타이드, 성장인자 등으로 대부분이 분자량(예를 들어, 0.5~10kDa)이 높기 때문에, 직접 사용할 경우 피부 흡수율이 낮아 피부를 통한 원료 전달이 어려운 한계가 있다.
기존의 약물 전달 시스템(Drug Delivery System, DDS)을 이용하더라도 이 또한 피부 흡수율이 낮아, 저분자(<500Da) 원료만이 일부 흡수되는 한계가 있고, 원료 특성(친수성, 소수성, 난용성 등)에 따른 흡수 편차가 크다는 단점이 있다.
이온도입치료(iontophoresis)는 적용 부위에 패치 등의 기구를 통해 미세 전류를 발생시켜 전위차를 이용하여 약물의 흡수를 촉진시키는 기술이다. 광범위한 적용이 가능하고 비 침습적이고 통증이 없다는 장점이 있지만, 약물의 극성이 충분하지 않은 경우 적용에 제한이 있고, 약물의 크기나 적용 깊이에 제한이 있을 수 있다. 또한 너무 강한 전류를 적용할 경우 홍반이 생길 수 있고, 가려움증 등의 부작용이 있을 수 있다.
미세바늘(microneedle)은 피부에 수백 마이크로미터 깊이의 구멍을 생성하여 약물전달을 한다. 또한, 레이저 시스템(laser system)은 레이저 조사를 통해 표면에 약 5-10 마이크로미터 깊이로 피부를 깎아 탈모 방지 물질을 환자의 피부에 적용할 수 있지만, 위 시스템의 경우 통증이 유발될 수 있고, 피부에 자극을 주어서 홍반 등이 유발될 수 있다. 또한 반복 적용이 힘들고, 넓은 부위의 적용이 어렵다는 단점이 있다.
이와 같은 약물 전달 시스템의 한계를 감안했을 때, 비침습적이고 통증없이, 짧은 적용시간에 부작용없이 세포의 생존율을 증가시키는 방법이 요구되는 상황이다.
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 초음파를 조사하여 비침습적으로 통증없이 세포의 생존율을 증가시키는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 값비싼 약물을 사용하지 않고 초음파만을 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하고, 후술하는 본 발명의 특징적인 효과를 실현하기 위한 본 발명의 특징적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 있어서, 초음파 파라미터들 각각이 소정의 범위로 기설정된 상태에서, 초음파 조사 장치가, 초음파 발생부를 대상체의 표피로부터 임계 범위 내에 위치시킴으로써 상기 대상체의 표피에 초음파를 조사하되, 상기 초음파 파라미터들에는 적어도 초음파의 압력 및 초음파의 duty percentage가 포함되고, 상기 초음파의 압력은 0.5MPa 내지 1MPa이고, 상기 초음파의 duty percentage는 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 방법이 개시된다.
일례로서, 상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 강도(intensity)가 더 포함되고, 상기 초음파의 강도는 166.7 mW/cm 2 내지 416.7 mW/cm 2인 것을 특징으로 하는 방법이 개시된다.
일례로서, 상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 주파수가 더 포함되고, 상기 초음파의 주파수는 0.5MHz 내지 4.6MHz인 것을 특징으로 하는 방법이 개시된다.
일례로서, 상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 전체 조사 시간이 더 포함되고, 상기 초음파의 전체 조사 시간은 10분 이내인 것을 특징으로 하는 방법이 개시된다.
일례로서, 상기 세포는 외측모근초(outer root sheath) 세포인 것을 특징으로 하는 방법 특징으로 하는 방법이 개시된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 초음파 조사 장치에 있어서, 초음파 발생부; 및 초음파 파라미터들 각각이 소정의 범위로 기설정된 상태에서, 대상체의 표피로부터 임계 범위 내에 상기 초음파 발생부를 위치시킴으로써 상기 초음파 발생부로 하여금 상기 대상체의 표피에 초음파를 조사하도록 하는 제어부;를 포함하되, 상기 초음파 파라미터들에는 적어도 초음파의 압력 및 초음파의 duty percentage가 포함되고, 상기 초음파의 압력은 0.5MPa 내지 1MPa이고, 상기 초음파의 duty percentage는 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치가 개시된다.
일례로서, 상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 강도(intensity)가 더 포함되고, 상기 초음파의 강도는 166.7 mW/cm 2 내지 416.7 mW/cm 2인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치가 개시된다.
일례로서, 상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 주파수가 더 포함되고, 상기 초음파의 주파수는 0.5MHz 내지 4.6MHz인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치가 개시된다.
일례로서, 상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 전체 조사 시간이 더 포함되고, 상기 초음파의 전체 조사 시간은 10분 이내인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치가 개시된다.
일례로서, 상기 세포는 외측모근초(outer root sheath) 세포인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치가 개시된다.
본 발명에 의하면, 다음과 같은 효과가 있다.
본 발명은, 초음파를 조사하여 비침습적으로 통증없이 세포의 생존율을 증가시키는 효과가 있다.
또한, 본 발명은, 값비싼 약물을 사용하지 않고 초음파만을 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 효과가 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 있어서 초음파의 파라미터들의 개념을 설명하기 위해 개략적으로 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 대한 피부 안정성 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 3a 및 도 3b는 기존의 약물만을 적용한 경우, 기존의 약물의 적용 농도에 따른 인간 외측모근초 세포 생존율을 개략적으로 도시한 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 의한 인간 외측모근초 세포의 생존율 실험결과를 다른 약물에 의한 실험결과와 함께 개략적으로 도시한 것이고,
도 5는 대조군에 대한 인간 외측모근초 세포 생존율 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 6은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 7은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 8은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 9는 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 10은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 11은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 12는 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 13은 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 14는 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 15는 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 16은 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 17은 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 18은 초음파(압력: 1.5 MPa, duty percentage: 5%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 19는 초음파(압력: 1.5 MPa, duty percentage: 5%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 20은 초음파(압력: 1.5 MPa, duty percentage: 10%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 21은 초음파(압력: 1.5 MPa, duty percentage: 10%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 의한 인간 외측모근초 세포의 생존율 실험결과를 초음파의 압력 및 duty percentage를 변수로 하여 개략적으로 도시한 것이고,
도 23 및 도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 의한 인간 외측모근초 세포의 생존율 실험결과를 초음파의 강도(intensity)를 변수로 하여 개략적으로 도시한 것이고,
도 25는 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 2%, intensity: 166.7 mW/cm 2)를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 다양한 주파수에 따른 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 26은 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 1%, intensity: 333.3 mW/cm 2)를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 다양한 주파수에 따른 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 27은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 5%, intensity: 416.7 mW/cm 2)를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 다양한 주파수에 따른 실험결과를 개략적으로 도시한 것이고,
도 28 내지 도 31은 초음파를 인간 외측모근초 세포에 조사하였을 때의 유전자 발현에 관한 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율(viability)을 증가시키는 방법에 있어서 초음파의 파라미터들의 개념을 설명하기 위한 도면이다.
초음파 파라미터들은 아래와 같다.
Frequency: 초음파 자체의 주파수
Duty percentage: 초음파가 조사되는 실제 조사 시간을 한 주기로 나눈 백분율 값
PRF(pulse repetition frequency): 초음파 구형파(square wave)가 1초동안 조사되는 횟수
PRP(pulse repetition period): 1/PRF
Pressure: 초음파의 압력
Intensity=duty*pressure 2/(2*c*rho): 단위 조사면적 당 조사되는 초음파의 에너지 (c: 물속에서의 음속=1500m/s, rho: 물의 밀도=1000kg/m 3)
일례로, 도 1a에서 주파수가 1MHz인 초음파의 구형파는 1초동안 3회 반복되므로 PRF값은 3Hz가 되고, PRP값은 1/PRF이므로 0.3333초가 된다. 또한, 도 1b에서 duty percentage는 초음파가 조사되는 한 주기(Ton+Toff) 중에서 실제로 초음파가 조사된 시간(Ton)에 대한 값으로서 Ton/(Ton+Toff)*100의 값을 가진다.
참고로, 아래 표 1은 각각의 초음파의 압력 및 duty percentage에 따른 intensity 값을 나타낸다.
Pressure(MPa) Intensity(W/m 2) Intensity with 100% duty(W/㎠) Intensity with 1% duty (mW/㎠) Intensity with 2% duty (mW/㎠) Intensity with 3% duty (mW/㎠) Intensity with 5% duty (mW/㎠)
0.5 83333.3 8.3 83.3 166.7 250.0 416.7
0.7 163333.3 16.3 163.3 326.7 490.0 816.7
1 333333.3 33.3 333.3 666.7 1000.0 1666.7
다음으로, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 대한 피부 안정성 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
구체적으로 설명하면, 8주령 수컷 래트(rat) 피부에 초음파를 조사하는 동안의 온도 변화 모니터링을 진행한 결과, 30분 동안 피부 온도는 섭씨 약 1.2도 증가하였고, 분당 평균 섭씨 0.05도의 온도 변화량만 나타났다. 즉, 초음파를 조사함으로 인한 온도 변화의 정도가 피부를 손상시킬 정도에 도달하지 않는 것을 확인할 수 있다.
다음으로, 초음파 조사에 따른 세포 생존율 관찰을 위한 실험 조건에 대해 설명하겠다.
참고로, 아래 표 2는 cell seeding density를 나타낸다.
권장 seeding density 5*10^3 cells/cm 2
Dish Surface area(cm 2) Seeding density
60mm 21 1.05*10^5 cells
100mm 55 2.75*10^5 cells
T75 75 3.75*10^5 cells
또한, 아래 표 3은 조건 수에 따른 세포 필요량을 나타낸다.
Passage 9
초음파 1well당 10min Well 수 Cell seeding 수(총 양) T75 flask
Cell viability assay 96well plate(3*10^3 cell/well) 조건 22 6.6*10^4 8.4*10^6
3well 66 1.98*10^5
6well plate(8*10^4 cell/well) 조건 20 1.6*10^6
3well 60 4.8*10^6
PCR 6well plate 약물처리조건 22 1.76*10^6
초음파처리조건 20 1.6*10^6
3well 126 1*10^7
먼저, Material에 대해 설명하면, cell culture는 human hair outer root sheath cells(HHORSC), mesenchymal stem cell medium(MSCM), FBS 0.25% trypsin/EDTA solution, trypsin neutralization solution, dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS), poly-L-lysine, T75 flask로 구성된다.
그리고 WST-1 assay에 있어 WST-1 cell proliferation assay system이 이용되며, PCR에 있어 Trizol, sensiFAST probe Hi-ROX one step kit, PrimeTime qPCR assay가 이용된다.
우선, culture dish coating(T75 flask 기준)에 있어, Flask에 10ml의 D.W.를 넣은 뒤 15ul의 poly-L-lysine (10mg/ml)을 넣어준다. 그리고, 37도 배양기에 넣어 1시간 동안 coating한다. 그리고 D.W.로 두 번 washing한다.
그리고, MSCM 500ml basal medium, 25ml FBS, 5ml의 Mesenchymal stem cell을 이용하여 whole medium을 만든다.
그리고, 얼어 있는 cell vial을 37도의 water bath에서 녹이고, 녹인 cell을 배지 3ml에 넣고, 3000rpm에 3분 동안 원심분리하여 cell down 시킨다. 그리고, DPBS를 넣어 washing 후 3000rpm에 3분 원심분리하여 cell down 시켜주며 이 과정을 2번 반복한다. 그리고, Poly-L-lysine으로 coating 된 T75 flask에 배지 8ml을 넣고, cell 펠렛을 풀어준 뒤 seeding하고, 섭씨 37도 5% CO2 배양기에 넣어 배양한다.
그리고, cell subculture에 있어, cell이 90%이상 자란 것이 현미경으로 확인되면, DBPS를 3ml 넣어 washing 하고, trypsin/EDTA solution을 3ml 넣은 뒤 37도 배양기에 3분간 배양하고, 세포가 cell flask에서 떨어진 것을 확인한 뒤 배지와 trypsin neutralization solution을 각각 3ml씩 넣어 trypsin/EDTA solution을 중화시키고, 중화된 세포액을 conical tube에 옮긴 뒤 3000rpm에 3분간 원심분리하여 cell down시켜주고, poly-L-lysine으로 coating된 T75 flask에 배지 8ml를 넣고, Cell 펠렛을 풀어준 뒤 seeding하고, 37도 5% CO2 배양기에 넣어 배양한다.
그리고, 6 well plate/96 well plate cell seeding에 있어서, poly-L-lysine coating은 plate별로 아래 표 4에 따라 넣은 뒤, culture dish coating 방법대로 진행한다.
면적당 poly L lysine 필요량(ug/cm 2) 2
Dish Surface area (cm 2) Poly L lysine 필요량 (ug) 10mg/mlPoly L lysine (ul)
T75 75 150 15
100mm 55 110 11
6well 4.8 9.6 2
12well 3.9 7.8 0.78 (1/10 희석하여 7.8ul)
96well 0.3 0.6 0.06 (1/100 희석하여 6ul)
이때, cell subculture에서 cell이 90%이상 자란 것이 현미경으로 확인되면, DBPS를 3ml 넣어 washing 하고, trypsin/EDTA solution을 3ml 넣은 뒤 37도 배양기에 3분간 배양하고, 세포가 cell flask에서 떨어진 것을 확인한 뒤 배지와 trypsin neutralization solution을 각각 3ml씩 넣어 trypsin/EDTA solution을 중화시키고, 중화된 세포액을 conical tube에 옮긴 뒤 3000rpm에 3분간 원심분리하여 cell down시킨 후 트립판 블루와 hemocytometer를 이용하여 cell을 counting 해준다. 그리고 6 well plate에는 8*10^4만큼, 96 well plate에는 4*10^4만큼 cell을 seeding해준다.
WST assay에 있어, 초음파만을 조사하는 실험의 경우, 6 well plate에 seeding된 cell을 12시간 내지 18시간 배양한 후 현미경으로 확인한다. 그리고 media를 제거한 후 DPBS로 2번 washing해주고, growth factor free media로 바꿔준 뒤 초음파를 cell에 10분간 조사한다. 그리고 37도 5% CO2 배양기에 넣어 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 DPBS로 washing하고 WST-1 약물 0.2ml 처리 후 3시간 incubation하고, 6 well plate에서 1 well 당 96 well plate의 3 well로 상층액을 옮기고, 96 well plate를 흡광도 측정기로 450nm에서 측정한다.
WST assay에 있어, 약물만을 적용하는 실험의 경우, 96 well plate에 seeding된 cell을 12시간 내지 18시간 배양한 후 잘 seeding 되었는지 확인한다. 그리고 media를 제거한 후 DPBS로 2번 washing해주고, growth factor free media로 바꿔준 뒤 약물을 cell에 적용한다. 그리고 37도 5% CO2 배양기에 넣어 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 DPBS로 washing하고 WST-1 약물 0.2ml 처리 후 3시간 incubation하고, 96 well plate 흡광도 측정기로 450nm에서 측정한다.
한편, 도 3a 및 도 3b는 기존의 약물만을 적용한 경우, 기존의 약물의 적용 농도에 따른 인간 외측모근초 세포 생존율을 개략적으로 도시한 것이다.
구체적으로는, 도 3a에서는 탈모 치료 약물인 리덴실을 적용한 경우에 리덴실의 농도에 따른 세포 생존율을 도시하고 있으며, 도 3b에서는 탈모 치료 약물인 미녹시딜을 적용한 경우에 미녹시딜의 농도에 따른 세포 생존율을 도시하고 있다.
참고로, 아래 표 5는 약물만을 적용할 경우에 대한 실험 조건을 나타낸다. 이때, 미녹시딜의 용해도는 PBS에 0.2% 녹으며, 약물을 적용 후 24시간 후에 측정하는 것을 조건으로 한다.
96 well plate
Control Positive control(EGF) 미녹시딜 리덴실
medium 50ng/100ul 0.00002% 0.01%
0.0002% 0.02%
0.002% 0.04%
0.05% 0.1%
0.01% 0.2%
0.02% 0.5%
0.05% 1%
0.15% 2%
0.2% 3%
4%
5%
10%
다음으로, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 의한 인간 외측모근초 세포의 생존율 실험결과를 다른 약물에 의한 실험결과와 함께 도시한 것이다.
도 4를 참조하면, (i) EGF를 50ng 투여한 경우 및 (ii) 0.5%의 농도를 가지는 리덴실을 적용한 경우와 비교할 때, 약물의 적용 없이 초음파(압력: 0.5MPa, duty: 5%)만 조사한 경우에 세포 생존율이 더 높은 것을 알 수 있다.
한편, 세포 실험에 있어, MTT와 WST-1 비교 실험을 수행하였으며, MTT의 경우 Redensyl의 흡광도 범위와 MTT의 흡광도 범위가 서로 겹쳐서 데이터의 정확도가 떨어지는 문제가 있었다. 반면에, WST-1의 경우 Redensyl의 흡광도 범위와 WST-1의 흡광도 범위가 겹치치 않았기에, WST-1을 사용하여 실험을 진행하였다.
또한, Media 비교 실험을 수행하였는데, 제1 실험에서는 seeding 안정화 후 complete media에 Redensyl 처리하여 24시간 관찰하였다. 다만, 시간은 24시간에 한정되는 것은 아니며 세포 상태에 따라 시간 변경이 가능할 수 있다. 또한 제2 실험에서는 seeding 안정화 후 growth factor를 포함하지 않은 media에 Redensyl 처리하여 24시간 관찰하였다. 제2 실험도 제1 실험과 마찬가지로, 세포 상태에 따라 시간 변경이 가능할 수 있다.
제1 실험 및 제2 실험을 한 결과, growth factor를 포함하지 않은 media로 진행하였을 때 초음파의 효과를 더 잘 관찰할 수 있었다. 따라서, growth factor를 포함하지 않은 media에 Redensyl 처리하여 실험을 진행하였다.
이후 초음파 조사 실험을 진행하였는데, 초음파 처리를 전후하여 Assay를 통해 정량 분석하였다.
표 6 내지 표 9는 세포에 대한 초음파의 물리적 영향을 평가하기 위한 초음파 조사 실험 조건을 나타낸다.
구체적으로, 표 6 및 표 7은 seeding후 안정화 과정 중 serum free media, overnight, complete media에 Redensyl 처리하여 관찰하는 조건을 나타낸다.
96Well-1 A B C D E F G H
1 M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT
2 P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT
3 R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT
4 R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT
5 R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT
6 R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT
7 M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST
8 P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST
9 R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST
10 R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST
11 R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST
12 R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST
96Well-2 A B C D E F G H
1 M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT
2 P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT
3 R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT
4 R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT
5 R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT
6 R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT
7 M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST
8 P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST
9 R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST
10 R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST
11 R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST
12 R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST
또한, 표 8 및 표 9는 seeding하여 안정화한 후 serum free media에 Redensyl 처리하여 관찰하는 조건을 나타낸다.
96Well-3 A B C D E F G H
1 M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT M-24-XTT
2 P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT P-24-XTT
3 R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT R0.01-24-XTT
4 R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT R0.04-24-XTT
5 R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT R0.2-24-XTT
6 R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT R1-24-XTT
7 M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST M-24-WST
8 P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST P-24-WST
9 R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST R0.01-24-WST
10 R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST R0.04-24-WST
11 R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST R0.2-24-WST
12 R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST R1-24-WST
96Well-4 A B C D E F G H
1 M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT M-48-XTT
2 P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT P-48-XTT
3 R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT R0.01-48-XTT
4 R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT R0.04-48-XTT
5 R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT R0.2-48-XTT
6 R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT R1-48-XTT
7 M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST M-48-WST
8 P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST P-48-WST
9 R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST R0.01-48-WST
10 R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST R0.04-48-WST
11 R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST R0.2-48-WST
12 R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST R1-48-WST
또한, 표 10은 초음파의 압력 및 duty percentage를 달리하며 초음파를 조사하는 실험 조건을 나타낸다.
6Well-1 1 2 3
A 1MPa, 3% 1MPa, 2% 1MPa, 1%
B 0.5MPa, 3% 0.5MPa, 2% 0.5MPa, 1%
6Well-2 1 2 3
A 1MPa, 3% 1MPa, 2% 1MPa, 1%
B 0.5MPa, 3% 0.5MPa, 2% 0.5MPa, 1%
6Well-3 1 2 3
A 1MPa, 3% 1MPa, 2% 1MPa, 1%
B 0.5MPa, 3% 0.5MPa, 2% 0.5MPa, 1%
6Well-4 1 2 3
A Control Control control
B 1.5MPa, 10% 1.5MPa, 5%
6Well-5 1 2 3
A
B
6Well-6 1 2 3
A
B
표 10을 참조하면, 초음파의 압력(0.5MPa, 1MPa, 1.5 MPa) 및 duty percentage(1%, 2%, 3%)를 달리하면서, 초음파를 세포에 10분 동안 조사하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, well 1번 내지 3번에서는, 초음파의 압력을 0.5MPa 또는 1MPa, 초음파의 duty percentage를 1% 내지 3%로 하여 초음파를 조사하였다.
다만 well 4번에서는 다른 압력 및 다른 duty percentage에 의한 결과와 비교를 위해 압력(1.5MPa) 및 duty percentage(5%, 10%)를 높게 하여 세포의 사멸을 유도하였다.
이에 따른 결과들은 도 5 내지 도 21과 같다.
우선, 도 5는 초음파가 조사되지 않은 인간 외측모근초 세포에 대해 특정 시점의 생존율 및 특정 시점으로부터 12시간 이후의 생존율 결과를 개략적으로 도시한 것으로서, 초음파가 조사된 군과의 비교를 위한 대조군을 의미한다.
도 5를 참조하면, 초음파가 조사되지 않은 경우, 왼쪽 도면이 나타내는 특정 시점의 생존율과 비교하여 오른쪽 도면이 나타내는 특정 시점으로부터 12시간 이후의 세포 생존율에 별다른 변화는 관찰되지 않는다.
도 6은 초음파(압력: 0.5MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 초음파(압력: 0.5MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 12시간 후의 control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 0.5MPa, duty: 1%)를 조사 후 12시간이 경과한 경우 세포 생존율이 어느 정도 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 8은 초음파(압력: 0.5MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 9는 초음파(압력: 0.5MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 12시간 후의 control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 0.5MPa, duty: 2%)를 조사 후 12시간이 경과한 경우 세포 생존율이 월등하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 10은 초음파(압력: 0.5MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 11은 초음파(압력: 0.5MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 10 및 도 11을 참조하면, 12시간 후의 control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 0.5MPa, duty: 3%)를 조사 후 12시간이 경과한 경우 세포 생존율이 월등하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 12는 초음파(압력: 1MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 13은 초음파(압력: 1MPa, duty percentage: 1%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 12 및 도 13을 참조하면, 12시간 후의 control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 1MPa, duty: 1%)를 조사 후 12시간이 경과한 경우 세포 생존율이 월등하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 14는 초음파(압력: 1MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 15는 초음파(압력: 1MPa, duty percentage: 2%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 14 및 도 15를 참조하면, control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 1MPa, duty: 2%)를 조사 후 12시간이 경과한 경우 세포가 터져 나가거나 변형이 오는 등 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 16은 초음파(압력: 1MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 17은 초음파(압력: 1MPa, duty percentage: 3%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 16 및 도 17을 참조하면, control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 1MPa, duty: 3%)를 조사한 직후 및 조사 후 12시간이 경과한 경우 세포가 터져 나가거나 변형이 오는 등 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 18은 초음파(압력: 1.5MPa, duty percentage: 5%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 19는 초음파(압력: 1.5MPa, duty percentage: 5%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 18 및 도 19를 참조하면, control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 1.5MPa, duty: 5%)를 조사한 직후 및 조사 후 12시간이 경과한 경우 높은 비율로 세포가 터져 나가거나 변형이 오는 등 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 20은 초음파(압력: 1.5MPa, duty percentage: 10%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한 직후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 21은 초음파(압력: 1.5MPa, duty percentage: 10%)를 인간 외측모근초 세포에 조사한지 12시간 후의 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 20 및 도 21을 참조하면, control군 결과와 비교할 때 초음파(압력: 1.5MPa, duty: 10%)를 조사한 직후 및 조사 후 12시간이 경과한 경우 대부분의 세포가 터져 나가거나 변형이 오는 등 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있다.
이처럼 도 5 내지 도 21을 통해, 압력 1MPa 이하, duty 5%이하, intensity 416.7 mW/cm 2 이하의 에너지는 세포에 안전한 것으로 확인되었다. 또한, 압력을 1.5MPa 이상으로 설정하였을 때 세포가 터져 나가거나 변형이 오는 것이 관찰되었다. 또한, 안전한 에너지 범위대의 초음파를 조사할 경우 대조군에 비해 세포의 growth가 증가되는 것이 관찰되었다.
일례로, 초음파를 조사하여 세포의 생존율을 증가시키는 방법에 있어서, 초음파 파라미터들 각각이 소정의 범위로 기설정된 상태에서, 초음파 조사 장치가, 초음파 발생부를 대상체의 표피로부터 임계 범위 내에 위치시킴으로써 대상체의 표피에 초음파를 조사하되, 초음파 파라미터들에는 적어도 초음파의 압력 및 초음파의 duty percentage가 포함되고, 초음파의 압력은 0.5MPa 내지 1MPa이고, 초음파의 duty percentage는 1% 내지 5%일 수 있다.
또한, 초음파의 파라미터들에는 초음파의 강도가 더 포함될 수 있으며, 초음파의 강도는 166.7 mW/cm 2 내지 416.7 mW/cm 2일 수 있다.
또한, 초음파의 파라미터들에는 초음파의 전체 조사 시간이 더 포함될 수 있으며, 초음파의 전체 조사 시간은 10분일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 10분 이내의 조사 시간일 수도 있으며, 10분을 초과할 수도 있다.
또한, 초음파 발생부는 대상체의 표피에 접촉한 상태이거나, 대상체의 표피로부터 소정의 거리를 두고 이격된 상태에서 대상체의 표피에 초음파를 조사할 수 있다. 또한, 초음파 발생부는 헬멧 또는 헤드 기어 형태로 대상체의 표피를 감싸는 형상일 수 있다.
또한, 세포는 외측모근초(outer root sheath) 세포일 수 있다.
도 22는 다양한 초음파의 압력 및 duty percentage에 따라 초음파를 조사함으로써 도출된 인간 외측모근초 세포의 생존율 실험결과를 개략적으로 도시한 것이며, 도 23 및 도 24는 다양한 초음파의 강도(intensity)에 따라 초음파를 조사함으로써 도출된 인간 외측모근초 세포의 생존율 실험결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 22 내지 도 24에서 확인할 수 있듯이, 초음파 파라미터 중 (i) 초음파의 압력이 0.5MPa 내지 1MPa, (ii) 초음파의 duty percentage가 1% 내지 5%, (iii) 초음파의 강도가 166.7 mW/cm 2 내지 416.7 mW/cm 2일 때의 세포의 생존율이 그 외의 초음파 범위에서의 세포의 생존율에 비해 월등하게 높은 것을 확인할 수 있다.
참고로, 아래 표 11은 세포에 조사된 초음파의 각각의 압력 및 duty percentage마다 측정된 세포 생존율을 나타낸다.
av sd
Control 100% 0.01
0.3MPa1% 95% 0.01
0.5MPa1% 117% 0.09
0.5MPa2% 124% 0.05
0.5MPa5% 125% 0.02
1MPa1% 118% 0.04
1MPa2% 68% 0.08
1MPa3% 32% 0.09
한편, 초음파의 파라미터들에는 초음파의 주파수가 더 포함될 수 있으며, 초음파의 주파수는 0.5MHz 내지 4.6MHz일 수 있다.
도 25 내지 도 27은 초음파를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 압력과 초음파의 duty percentage를 고정한 채로, 초음파의 주파수를 달리하며 얻은 실험결과를 개략적으로 도시한 도면들이다.
일례로, 도 25는 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 2%, intensity: 166.7 mW/cm 2)를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 주파수를 0.2MHz, 0.5MHz, 1MHz, 4.6MHz 및 10MHz로 변화시켜가며 얻은 실험 결과를 나타낸다.
도 25에서 확인할 수 있듯이, 초음파의 주파수가 0.5MHz 내지 4.6MHz인 구간에서의 세포 생존율이 다른 구간에서의 세포 생존율보다 월등히 높은 점을 알 수 있다.
또 다른 예로, 도 26은 초음파(압력: 1 MPa, duty percentage: 1%, intensity: 333.3 mW/cm 2)를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 주파수를 0.2MHz, 0.5MHz, 1MHz, 4.6MHz 및 10MHz로 변화시켜가며 얻은 실험 결과를 나타낸다.
도 26에서 확인할 수 있듯이, 초음파의 주파수가 0.5MHz 내지 4.6MHz인 구간에서의 세포 생존율이 다른 구간에서의 세포 생존율보다 월등히 높은 점을 알 수 있다.
또 다른 예로, 도 27은 초음파(압력: 0.5 MPa, duty percentage: 5%, intensity: 416.7 mW/cm 2)를 인간 외측모근초 세포에 조사하되, 초음파의 주파수를 0.2MHz, 0.5MHz, 1MHz, 4.6MHz 및 10MHz로 변화시켜가며 얻은 실험 결과를 나타낸다.
도 27에서 확인할 수 있듯이, 초음파의 주파수가 0.5MHz 내지 4.6MHz인 구간에서의 세포 생존율이 다른 구간에서의 세포 생존율보다 월등히 높은 점을 알 수 있다.
도 28 내지 도 31은 1MHz의 주파수를 가지는 초음파를 압력과 duty percentage를 변화시켜가며 인간 외측모근초 세포에 조사하였을 때의 유전자 발현 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
구체적으로, 도 28은 1MHz의 주파수를 가지는 초음파를 압력과 duty percentage를 변화시켜가며 인간 외측모근초 세포에 조사하였을 때 WNT10B 및 Beta Catenin 관련 유전자 발현 결과를 개략적으로 도시한 것이다. 초음파의 강도를 166.7 mW/cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW/cm 2 (1MPa, 1%) 및 416.7 mW/cm 2 (0.5MPa, 5%)로 설정하여 인간 외측모근초 세포에 초음파를 조사했을 때, 관찰되는 WNT10B 및 Beta Catenin 관련 유전자 발현 정도가 Control 군에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 29는 1MHz의 주파수를 가지는 초음파를 압력과 duty percentage를 변화시켜가며 인간 외측모근초 세포에 조사하였을 때 Keratin 15 및 VDR 관련 유전자 발현 결과를 개략적으로 도시한 것이다. 도 28에서와 마찬가지로, 초음파의 강도를 166.7 mW/cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW/cm 2 (1MPa, 1%) 및 416.7 mW/cm 2 (0.5MPa, 5%)로 설정하여 인간 외측모근초 세포에 초음파를 조사했을 때, 관찰되는 Keratin 15 및 VDR 관련 유전자 발현 정도가 Control 군에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 30은 1MHz의 주파수를 가지는 초음파를 압력과 duty percentage를 변화시켜가며 인간 외측모근초 세포에 조사하였을 때 PCNA 및 Ki67 관련 유전자 발현 결과를 개략적으로 도시한 것이다. 도 28에서와 마찬가지로, 초음파의 강도를 166.7 mW/cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW/cm 2 (1MPa, 1%) 및 416.7 mW/cm 2 (0.5MPa, 5%)로 설정하여 인간 외측모근초 세포에 초음파를 조사했을 때, 관찰되는 PCNA 및 Ki67 관련 유전자 발현 정도가 Control 군에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 31은 1MHz의 주파수를 가지는 초음파를 압력과 duty percentage를 변화시켜가며 인간 외측모근초 세포에 조사하였을 때 BCL2 관련 유전자 발현 결과를 개략적으로 도시한 것이다. 도 28에서와 마찬가지로, 초음파의 강도를 166.7 mW/cm 2 (0.5 MPa, 2%), 333.3 mW/cm 2 (1MPa, 1%) 및 416.7 mW/cm 2 (0.5MPa, 5%)로 설정하여 인간 외측모근초 세포에 초음파를 조사했을 때, 관찰되는 BCL2 관련 유전자 발현 정도가 Control 군에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있다.
한편, 초음파 파라미터들에는 PRF 또는 PRP가 더 포함될 수 있으며, PRF는 1Hz 내지 100Hz이고 PRP는 0.01초 내지 1초일 수 있다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 초음파를 조사하여 세포의 생존율(viability)을 증가시키는 방법에 있어서,
    초음파 파라미터들 각각이 소정의 범위로 기설정된 상태에서, 초음파 조사 장치가, 초음파 발생부를 대상체의 표피로부터 임계 범위 내에 위치시킴으로써 상기 대상체의 표피에 초음파를 조사하되,
    상기 초음파 파라미터들에는 적어도 초음파의 압력 및 초음파의 duty percentage가 포함되고, 상기 초음파의 압력은 0.5MPa 내지 1MPa이고, 상기 초음파의 duty percentage는 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 강도(intensity)가 더 포함되고,
    상기 초음파의 강도는 166.7 mW/cm 2 내지 416.7 mW/cm 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 주파수가 더 포함되고,
    상기 초음파의 주파수는 0.5MHz 내지 4.6MHz인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 전체 조사 시간이 더 포함되고,
    상기 초음파의 전체 조사 시간은 10분 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 외측모근초(outer root sheath) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 초음파를 조사하여 세포의 생존율(viability)을 증가시키는 초음파 조사 장치에 있어서,
    초음파 발생부; 및
    초음파 파라미터들 각각이 소정의 범위로 기설정된 상태에서, 대상체의 표피로부터 임계 범위 내에 상기 초음파 발생부를 위치시킴으로써 상기 초음파 발생부로 하여금 상기 대상체의 표피에 초음파를 조사하도록 하는 제어부;
    를 포함하되,
    상기 초음파 파라미터들에는 적어도 초음파의 압력 및 초음파의 duty percentage가 포함되고, 상기 초음파의 압력은 0.5MPa 내지 1MPa이고, 상기 초음파의 duty percentage는 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 강도(intensity)가 더 포함되고,
    상기 초음파의 강도는 166.7 mW/cm 2 내지 416.7 mW/cm 2인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 주파수가 더 포함되고,
    상기 초음파의 주파수는 0.5MHz 내지 4.6MHz인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 초음파 파라미터들에는 초음파의 전체 조사 시간이 더 포함되고,
    상기 초음파의 전체 조사 시간은 10분 이내인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 세포는 외측모근초(outer root sheath) 세포인 것을 특징으로 하는 초음파 조사 장치.
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