WO2020153619A1 - Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법 - Google Patents

Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법 Download PDF

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WO2020153619A1
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virus
cells
production method
days
bhk
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French (fr)
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조진아
김윤정
Man-Bok KIM (김만복)
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Virocure Inc
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Virocure Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing various types of viruses in large quantities using BHK-21 cells.
  • Viruses are infectious particles of several hundred ⁇ m or less that parasitize on living cells such as animals, plants, bacteria, and radioactive bacteria and can only grow within cells. It has the characteristics of a creature that replicates things like itself, but it is also determined to be a nuclear protein outside the cell. It is classified into DNA virus and RNA virus according to the type of nucleic acid, and animal virus, plant virus and bacteriophage according to the host. Since a virus does not have its own metabolic system, it uses virus nucleic acid as a template to synthesize the necessary enzyme protein through the host cell's metabolic system, replicates the viral nucleic acid, and at the same time makes an antigen protein, and aggregates them to complete a new virus and release it out of the cell do. At this time, the virus contains sugar fat, killing cells and showing pathogenicity.
  • oncolytic virus is a replicative therapeutic agent designed or selected to specifically grow and kill tumor cells.
  • OV oncolytic virus
  • Several groups are in the early stages of commercialization based on pre-clinical animal models and early clinical data in humans.
  • a challenge still faced in the art is the large-scale manufacture of pharmaceutically available viruses for delivery to patients. Viruses are actually living organisms rather than synthesized drugs, so the manufacturing process should include the process of removing contaminating cell debris while maintaining the production and infectious effects of the virus in the cell.
  • contaminating cell proteins can actually act as adjuvants to increase the immunogenicity of the agent.
  • the required dose of virus is up to 1 million times larger than the dose for vaccine application and can be administered by intravenous, intracranial, intraperitoneal or direct tumor injection. Therefore, in the case of OV, it is important to be able to produce a large amount of virus in which contaminant non-human cell debris has been removed, but relevant studies on an improved method for producing large-scale oncolytic viruses are insufficient.
  • the present inventors repeatedly researched a method for mass production of viruses, and selected BHK-21 cells as an optimal virus-producing cell line, and established optimal conditions (MOI, infection period, etc.) for economically producing viruses.
  • the present invention was completed.
  • the present invention provides a virus production method comprising the following steps:
  • step (b) culturing the BHK-21 cells infected in step (a) in a medium
  • step (c) isolating the virus from the culture of step (b).
  • the present invention provides a virus produced by the virus production method.
  • the virus of step (a) may be a mammalian lyovirus, but is not limited thereto.
  • the mammalian lyovirus may be a human lyovirus, but is not limited thereto.
  • the human lyovirus may be serotype 3 lyovirus, but is not limited thereto.
  • the serotype 3 lyovirus may be a dearing strain (reovirus type 3 dearing), but is not limited thereto.
  • the step (a) may be to infect BHK-21 cells with a virus of 0.001 to 0.5 MOI, but is not limited thereto.
  • the step (a) may be to infect BHK-21 cells with a virus of 0.005 to 0.5 MOI, but is not limited thereto.
  • the step (a) may be to infect BHK-21 cells with a virus of 0.005 to 0.1 MOI, but is not limited thereto.
  • step (a) may be to infect BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.5 MOI, but is not limited thereto.
  • the step (a) may be to infect BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.1 MOI, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 1 to 10 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 2 to 8 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 3 to 8 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 4 to 7 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 5 to 7 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 5 to 6 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • step (a) infects BHK-21 cells with a virus of 0.001 to 0.1 MOI, and step (b) can be cultured for 5 to 6 days after virus infection, , But is not limited thereto.
  • step (a) infects BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.1 MOI, and step (b) can be cultured for 5 to 6 days after virus infection, , But is not limited thereto.
  • the medium in step (b) may be selected from the group consisting of DMEM, MEM, EMEM, RPMI-1640, F-12 and DMEM/F12 medium, but is not limited thereto. .
  • the virus in step (c) is obtained by centrifuging the medium of step (b) during or after cultivation, and (ii) of the medium. After mixing the infected cells remaining in the culture obtained in step (b) with the pellets produced after centrifugation, cells in the mixture may be crushed and separated from the supernatant obtained by centrifugation, but is not limited thereto. .
  • the cell crushing may be performed by performing sonication, but is not limited thereto.
  • the step (c), crushing the cells in the culture of step (b); And CsCl gradient centrifuge of the cell crushing product is not limited thereto.
  • the CsCl gradient centrifugation may be performed two or more times, but is not limited thereto.
  • the virus production method of the present invention can be mass-produced using a cell factory system using BHK-21 cells, and the production yield is high as it recovers not only the medium but also the residual virus present in the cells.
  • the present invention has established optimal conditions for effectively producing a large amount of viruses, and can be applied to various types of virus production, and thus is expected to be usefully used in related medicine fields such as viral drug production.
  • FIG. 1A shows BHK-21 cells infected with lyovirus with various MOIs (0.01, 0.1, 1, 10, 30, 100 MOI) and cultured for 3 or 5 days, and then collected and centrifuged by collecting the cultured medium. It is a diagram showing the production rate (TCID 50 ) and the yield of lyovirus present in the supernatant (Sup only).
  • FIG. 1b shows BHK-21 cells infected with lyovirus with various MOIs (0.01, 0.1, 1, 10, 30, 100 MOI) and cultured for 3 or 5 days, and then collected and centrifuged by collecting the cultured medium. It is a diagram showing the production rate (TCID 50 ) and the yield of lyovirus present in pellets and infected cells (Pellet only).
  • Figure 1c is a diagram showing the sum of the production of lyovirus (TCID 50 ) and the production yield of Sup alone and Pellet alone (Sup+Pellet).
  • Figure 2a is BHK-21 cells of various MOIs (0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 MOI) infected with lyovirus and cultured for 1 to 10 days to produce lyovirus present in Sup + Pellet by culture day
  • This diagram shows the production amount (TCID 50 ).
  • FIG. 2b shows BHK-21 cells infected with lyovirus with various MOIs (0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 MOI), and cultured for 1 to 10 days, followed by cultivation of lyovirus present in Sup + Pellet It is a diagram showing production yield. The graphs corresponding to 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 MOI are shown from the top with reference to the far right.
  • the present invention provides a virus production method comprising the following steps:
  • step (b) culturing the BHK-21 cells infected in step (a) in a medium
  • step (c) isolating the virus from the culture of step (b).
  • the present invention provides a virus produced by the virus production method.
  • Example 2 Compared and evaluated the virus productivity according to the separation place when producing viruses using BHK-21 cells (see Example 1), further experiments based on the results of Example 1 Through this, optimal virus production conditions (viral MOI, number of days of infection) were established (see Example 2).
  • BHK-21 cell BHK stands for B aby H amster K idney, and BHK cells were originally isolated by polyoma transformation of hamster cells. , As a substrate for virus propagation and virus mediated expression for vaccines.
  • BHK cells are useful as host cell lines for stable expression of various recombinant proteins.
  • the BHK-21 (BHK Strain 21) cell line was derived from the baby hamster kidney of 5 unsexed, 1-day-old hamsters in March 1961 by IA Macpherson and MGP Stoker. The hamster was used to generate BHK-21 cells and is generally known as the Syrian golden hamster (Mesocricetus auratus).
  • virus refers to a virus capable of infecting the BHK-21 cells and replicating within the cells, and is not limited to a specific virus.
  • the virus may be a mammalian lyovirus, but is not limited thereto.
  • the term “riovirus” is a virus having a double-stranded segmented RNA genome, and refers to any virus classified into the Reoviridae family.
  • the virion of the lyovirus is 60-80 nm in diameter and has two concentric capsid shells. This genome consists of 10 to 12 discontinuous double-stranded RNAs, has a total genomic size of 16 to 27 kbp, and each RNA segment has a different size.
  • the lyovirus includes not only a naturally occurring lyovirus, but also a modified or recombinant lyovirus.
  • Said lyovirus can be isolated from nature and is said to be "naturally occurring” when no artificial changes have been made by humans.
  • the lyovirus can be derived from a “field source”, ie, a person infected with this lyovirus.
  • the lyovirus can be modified, but can lytically infect mammalian cells with an activated ras pathway.
  • the lyovirus can be pretreated chemically or biochemically (e.g., by treatment with a protease such as chymotrypsin or trypsin) prior to administration to proliferating cells.
  • the outer membrane or capsid of the virus can be removed by pre-treatment using a protease to increase the infectivity of the virus.
  • the lyovirus may be coated with liposomes or micelles, and for example, virions may be treated with chymotrypsin in the presence of an alkyl sulfate detergent having a micelle-forming concentration to generate new infectious subviral particles. have.
  • the mammalian lyovirus may be a human lyovirus, but is not limited thereto.
  • Human lyovirus can consist of three serotypes: type 1 (Lang or T1L), type 2 (Jones, T2J) and type 3 (Dearing, T3D or Abney, T3A).
  • type 1 Long or T1L
  • type 2 Jaks, T2J
  • type 3 Dearing, T3D or Abney, T3A.
  • the three serotypes can be easily identified based on neutralization reactions and hemagglutination inhibition assays.
  • the human lyovirus may be serotype 3 lyovirus, but is not limited thereto.
  • the human lyovirus may be a lyovirus serotype 3 Dearing strain (Reovirus type 3 Dearing, T3D), but is not limited thereto.
  • infectious BHK-21 cells refers to a state in which a virus invades BHK-21 cells and then the virus replicates in the cells.
  • MOI multiplicity of infection, which is the ratio of the amount of virus inoculated to the number of cells inoculated with virus (inoculated virus/cell count), and when infected It indicates how many infectious viruses can be obtained per one. In practice, MOI does not indicate the number of virus particles that have infiltrated into the cell as they remain in the inoculum in an unadsorbed state, or there are many virus particles that do not invade even if adsorbed.
  • step (a) can infect BHK-21 cells with a virus of 0.001 to 0.5 MOI.
  • the step (a) is 0.001 to 0.4, 0.001 to 0.3, 0.001 to 0.2 or 0.001 to 0.1 MOI; 0.002 to 0.5, 0.002 to 0.4, 0.002 to 0.3, 0.002 to 0.2 or 0.002 to 0.1 MOI; 0.003 to 0.5, 0.003 to 0.4, 0.003 to 0.3, 0.003 to 0.2 or 0.003 to 0.1 MOI;
  • BHK-21 cells can be infected with viruses of 0.004 to 0.5, 0.004 to 0.4, 0.004 to 0.3, 0.004 to 0.2 or 0.004 to 0.1 MOI.
  • step (a) can infect BHK-21 cells with a virus of 0.005 to 0.5 MOI.
  • step (a) can infect BHK-21 cells with a virus of 0.005 to 0.1 MOI.
  • step (a) can infect BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.5 MOI.
  • step (a) can infect BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.1 MOI.
  • the step (a) is 0.005 to 0.4, 0.005 to 0.3, 0.005 to 0.2 or 0.005 to 0.1; 0.006 to 0.5, 0.006 to 0.4, 0.006 to 0.3, 0.006 to 0.2 or 0.006 to 0.1; 0.007 to 0.5, 0.007 to 0.4, 0.007 to 0.3, 0.007 to 0.2 or 0.007 to 0.1; 0.008 to 0.5, 0.008 to 0.4, 0.008 to 0.3, 0.008 to 0.2 or 0.008 to 0.1; 0.009 to 0.5, 0.009 to 0.4, 0.009 to 0.3, 0.009 to 0.2 or 0.009 to 0.1;
  • BHK-21 cells can be infected with a virus of 0.01 to 0.5, 0.01 to 0.4, 0.01 to 0.3, 0.01 to 0.2 or 0.01 to 0.1 MOI.
  • cultivation refers to all actions performed to propagate a virus while growing in an environment condition in which artificially regulated cells infected with the virus are appropriate.
  • cell cultivation may use a cell factory system. According to the above method, there is an advantage in that mass production is possible by scaling up during virus production.
  • any medium or culture medium commonly used for cell culture can be used for virus propagation or production in the art.
  • the medium in step (b) may be a medium selected from the group consisting of DMEM, MEM, EMEM, RPMI-1640, F-12 and DMEM/F12 medium, but is not limited thereto.
  • the present invention can use DMEM/F12 medium in step (b) above.
  • the step (b) can be cultured for 1 to 10 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) is 1 to 9 days, 1 to 8 days, 1 to 7 days, 1 to 6 days or 1 to 5 days after virus infection; 2 to 10, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7, 2 to 6 or 2 to 5; 3 days to 10 days, 3 days to 9 days, 3 days to 8 days, 3 days to 7 days, 3 days to 6 days, or 3 days to 5 days; 4 days to 10 days, 4 days to 9 days, 4 days to 8 days, 4 days to 7 days, 4 days to 6 days, or 4 days to 5 days; 5 days to 10 days, 5 days to 9 days, 5 days to 8 days, 5 days to 7 days, or 5 days to 6 days; Or it can be cultured for 6 days to 10 days, 6 days to 9 days, 6 days to 8 days, or 6 days to 7 days.
  • the step (b) may be cultured for 2 to 8 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) can be cultured for 3 to 8 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) can be cultured for 4 to 7 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 5 to 7 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be cultured for 5 to 6 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • step (a) BHK-21 cells are infected with a virus of MOI selected from the above-described numerical range, and in step (b), after virus infection, culture can be performed for a culture day selected from the above-described number of culture days.
  • the present invention can be implemented as follows.
  • step (a) infects BHK-21 cells with a virus of 0.001 to 0.1 MOI
  • step (b) can be cultured for 4 to 7 days after virus infection, but is not limited thereto. no.
  • step (a) infects BHK-21 cells with a virus of 0.001 to 0.1 MOI
  • step (b) can be cultured for 5 to 6 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • step (a) infects BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.1 MOI
  • step (b) can be cultured for 4 to 7 days after virus infection, but is not limited thereto.
  • step (a) infects BHK-21 cells with a virus of 0.01 to 0.1 MOI
  • step (b) can be cultured for 5 to 6 days after viral infection, but is not limited thereto.
  • the method of isolating the virus from the culture in step (c) of the present invention can be used without limitation through methods known in the art that can separate and purify the virus.
  • the virus can be isolated in the middle of culturing, or after a desired number of culture days is completed.
  • the virus in step (c) is produced after or after completion of culture (i) the supernatant obtained by centrifuging the medium of step (b) and (ii) after centrifugation of the medium After mixing the infected cells remaining in the culture obtained in step (b) with pellets, cells in the mixture can be crushed and separated from the supernatant obtained by centrifugation, but is not limited thereto.
  • the virus isolation in step (c) comprises: crushing cells in the culture of step (b); And CsCl gradient centrifuge of the cell crushing product, but is not limited thereto.
  • the virus separation in step (c), after incubation or after completion of the culture the supernatant ((i) supernatant) obtained by centrifuging the medium of step (b) and after the centrifugation of the medium Mixing the infected pellets remaining in the culture obtained in step (b) with the resulting pellets, then crushing the cells in the mixture, followed by centrifugation to obtain a supernatant ((ii) supernatant); And the (i) and (ii) CsCl can be centrifuged to separate the supernatant, but is not limited thereto.
  • the cell crushing may be performed by performing sonication, but is not limited thereto.
  • the ultrasonic treatment has a high virus yield since the cells are not discarded to discard the cells by ultrasonic treatment rather than the traditional cell freeze-thawing method or surfactant method, so that the remaining virus in the cells is recovered.
  • the CsCl gradient centrifugation can be performed two or more times. Higher purity virus can be obtained through two or more CsCl gradient centrifugation.
  • BHK (Baby Hamster Kidney)-21 cells (1 x 10 6 cells/dish) infected with 0.01, 0.1, 1, 10, 30 and 100 MOI (multiplicity of infection, based on PFU) reovirus (Reovirus type 3 Dearing)
  • MOI multiplicity of infection, based on PFU
  • reovirus Reovirus type 3 Dearing
  • CPE cytopathic effect
  • PBS phosphate buffered saline
  • the lyovirus is placed in Dialysis tubing, sealed well with a closure, and then placed in a 2.4 L Dialysis Reservoir containing 2 L PBS and a magnetic bar. PBS was exchanged three times (PBS was exchanged every 3 hours from the first 16 hours and from the second). After dialysis, it was stored at 4°C.
  • BHK-21 cells (1 x 10 6 cells/dish) were infected with lyovirus of 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 MOI (based on PFU), followed by daily medium (DMEM:F) during incubation for 10 days -12, Ham's nutrient mixture F-12 and Dulbecco's modified Eagle's essential medium, ThermoFisher) were collected in equal volumes in a 15 ml centrifuge bottle and centrifuged (3,270 ⁇ 20 g, 10 ⁇ 0.5 min) for supernatant. Only collected (Sup, 8 ml).
  • Example 1 After the centrifugation, the remaining pellets are combined with infected cells and subjected to sonication (10 minutes for sonication), collected in equal volumes in a 500 ml bottle for centrifugation, and centrifuged (3,270 ⁇ 20 g, 10 ⁇ 0.5 minutes). Collected (Pellet, about 4.5 ml). Thereafter, cesium chloride decantation centrifugation and virus dialysis were carried out as in Example 1.
  • the present invention is an improved virus production method, which is improved over the existing virus production method, capable of replicating a large amount of viruses and recovering the residual virus in the cell, thus having a high yield.
  • the maximum amount of lyovirus that can be produced by 1 x 10 6 BHK-21 cells was about +10 10 CID 50 /ml level, and when cultured for 4 days (4 days post infection) or more
  • the lyovirus titer tended to decrease.
  • the lyovirus was treated at a high concentration (1 or 10 MOI)
  • the production of lyovirus was high until the initial (3 days), but thereafter tended to decrease rather than the production of the low MOI treated group.
  • the virus production method of the present invention can be mass-produced using a cell factory system using BHK-21 cells, and the production yield is high as it recovers not only the medium but also the residual virus present in the cells.
  • the present invention has established optimal conditions for effectively producing a large amount of viruses, and can be applied to various types of virus production, and thus is expected to be usefully used in related medicine fields such as viral drug production.

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Abstract

본 발명은 BHK-21 세포를 이용하여 다양한 종류의 바이러스를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 효과적으로 대량의 바이러스를 생산할 수 있는 최적의 조건을 확립하였고, 다양한 종류의 바이러스 생산에 적용될 수 있으므로, 바이러스 의약품 생산 등 관련 의약 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

BHK-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법
본 발명은 BHK-21 세포를 이용하여 다양한 종류의 바이러스를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2019년 1월 25일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0009762호 및 2019년 11월 1일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0138342호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
바이러스란, 동물, 식물, 세균 및 방사균 등 살아있는 세포에 기생하며 세포 내에서만 증식할 수 있는 수백 μm 이하의 감염성 입자이다. 자신과 같은 것을 복제하는 생물의 특성을 가졌으나, 세포 밖에서는 핵단백질로 결정하는 것도 있다. 핵산의 종류에 따라 DNA바이러스와 RNA바이러스로, 숙주에 따라 동물바이러스와 식물바이러스 및 박테리오파지로 분류된다. 바이러스는 자신의 대사계가 없기 때문에 바이러스 핵산을 주형으로 하여 숙주 세포의 대사계를 통해 필요한 효소 단백을 합성하고, 바이러스 핵산을 복제하는 동시에 항원 단백을 만들며, 이들이 집합되어 새로운 바이러스를 완성해서 세포 밖으로 방출한다. 이때 바이러스는 당 지방질을 포함하며, 세포를 죽이고 병원성을 나타낸다.
한편, 종양 분해성 바이러스(oncolytic virus: OV)는 종양 세포에서 특이적으로 성장하여 이들을 사멸시키도록 설계되거나 선택된, 복제성 치료제이다. 몇몇의 그룹은 전-임상 동물 모델 및 사람에서의 조기 임상 데이터를 기준으로 한 상업화의 초기 단계에 있다. 그러나, 당해 분야에서 여전히 직면하고 있는 과제는 환자들에게 전달하기 위하여 약제학적으로 이용 가능한 바이러스를 대규모로 제조하는 것이다. 바이러스들은 합성된 약물이라기보다는 오히려 실질적인 생물이므로, 제조 공정은 세포 내에서 바이러스의 생산 및 감염 효력을 유지하면서 오염성 세포 잔해를 제거하는 과정이 포함되어야 한다.
일반적으로, 백신 적용을 위해, 환자들은, 오염성 세포 단백질이 실제로 항원보강제(adjuvant)로 작용하여 제제의 면역원성을 증가시킬 수 있는 국소부위(흔히 근육 내) 내에 저용량의 바이러스들을 제공받는다. 이와 대조적으로, 종양 분해성 바이러스 치료제의 경우, 필요한 바이러스의 용량이 백신 적용을 위한 용량보다 백만배까지 더 크고, 정맥 내, 두개 내, 복강 내 또는 직접 종양 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, OV의 경우 오염성 비-인간 세포 잔해가 제거된 다량의 바이러스를 제조할 수 있는 것이 중요하나, 대규모의 종양 분해성 바이러스 생산을 위한 개선된 방법에 대한 관련 연구는 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 바이러스의 대량 생산방법에 대한 연구를 거듭한 결과, 최적의 바이러스 생산 세포주로 BHK-21 세포를 선정하고, 경제적으로 바이러스를 생산할 수 있는 최적의 조건(MOI, 감염기간 등)을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바이러스 생산방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 바이러스 생산방법을 제공한다:
(a) BHK(Baby Hamster Kidney)-21 세포를 0.0001 내지 0.5 MOI(multiplicity of infection)로 바이러스와 접촉시켜 감염된 BHK-21 세포를 생성하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 감염된 BHK-21 세포를 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 배양물로부터 바이러스를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 바이러스 생산방법에 의하여 생산된 바이러스를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 바이러스는 포유동물 리오바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 포유동물 리오바이러스는 인간 리오바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 인간 리오바이러스는 혈청형 3의 리오바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 혈청형 3의 리오바이러스는 Dearing 주(reovirus type 3 Dearing)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 1일 내지 10일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 2일 내지 8일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 3일 내지 8일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 4일 내지 7일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 7일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)에서 배지는 DMEM, MEM, EMEM, RPMI-1640, F-12 및 DMEM/F12 배지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 바이러스는, 배양 중 또는 배양 완료 후 (i) 단계 (b)의 배지를 원심분리하여 수득한 상층액 및 (ii) 상기 배지의 원심분리 후 생성된 펠렛에 단계 (b)에서 수득한 배양물에 남아 있는 감염된 세포를 혼합한 후 혼합물 내 세포를 파쇄한 다음 원심분리하여 수득한 상층액으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 세포 파쇄는 초음파 처리(sonication)를 실시하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (c)는, 단계 (b)의 배양물 내 세포를 파쇄하는 단계; 및 상기 세포 파쇄 결과물을 CsCl 경사원심분리(gradient centrifuge)하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 CsCl 경사원심분리는 2회 이상 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이러스 생산방법은 BHK-21 세포를 이용하는 세포 공장 시스템(cell factory system)을 사용하여 대량생산이 가능하고, 배지뿐만 아니라 세포 안에 존재하는 잔여 바이러스까지 회수함에 따라 생산수율이 높다. 본 발명은 효과적으로 대량의 바이러스를 생산할 수 있는 최적의 조건을 확립하였고, 다양한 종류의 바이러스 생산에 적용될 수 있으므로, 바이러스 의약품 생산 등 관련 의약 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 BHK-21 세포를 다양한 MOI(0.01, 0.1, 1, 10, 30, 100 MOI)로 리오바이러스에 감염시킨 후 3일 또는 5일간 배양한 다음, 배양된 배지를 모아 원심분리하여 수득한 상층액에 존재하는 리오바이러스의 생산량(TCID 50) 및 생산수율을 보여주는 도이다(Sup 단독).
도 1b는 BHK-21 세포를 다양한 MOI(0.01, 0.1, 1, 10, 30, 100 MOI)로 리오바이러스에 감염시킨 후 3일 또는 5일간 배양한 다음, 배양된 배지를 모아 원심분리하여 수득한 pellet 및 감염된 세포에 존재하는 리오바이러스의 생산량(TCID 50) 및 생산수율을 보여주는 도이다(Pellet 단독).
도 1c는 Sup 단독과 Pellet 단독에 존재하는 리오바이러스 생산량의 합(TCID 50) 및 생산수율을 보여주는 도이다(Sup+Pellet).
도 2a는 BHK-21 세포를 다양한 MOI(0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 MOI)로 리오바이러스에 감염시킨 후 1 내지 10일간 배양하여 생산된 Sup + Pellet에 존재하는 리오바이러스의 배양일별 생산량(TCID 50)을 보여주는 도이다.
도 2b는 BHK-21 세포를 다양한 MOI(0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 MOI)로 리오바이러스에 감염시킨 후 1 내지 10일간 배양하여 생산된 Sup + Pellet에 존재하는 리오바이러스의 배양일별 생산수율을 보여주는 도이다. 제일 오른쪽을 기준으로 위에서부터 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 MOI에 해당하는 그래프를 나타낸다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 바이러스 생산방법을 제공한다:
(a) BHK(Baby Hamster Kidney)-21 세포를 0.0001 내지 0.5 MOI(multiplicity of infection)로 바이러스와 접촉시켜 감염된 BHK-21 세포를 생성하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 감염된 BHK-21 세포를 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 배양물로부터 바이러스를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 바이러스 생산방법에 의하여 생산된 바이러스를 제공한다.
구체적으로, 본 발명자들은 실시예를 통하여, BHK-21 세포를 이용하여 바이러스를 생산하는 경우 분리장소에 따른 바이러스 생산성을 비교 평가하였고(실시예 1 참조), 실시예 1의 결과를 바탕으로 추가적인 실험을 통하여 최적의 바이러스 생산 조건(바이러스 MOI, 감염일수)을 확립하였다(실시예 2 참조).
본 명세서에서 사용된 용어, “BHK-21 세포”에서 BHK란 베이비 햄스터 키드니( Baby Hamster Kidney)의 약자로, BHK 세포는 원래 햄스터 세포의 폴리오마 변환(polyoma transformation)에 의해 분리되었으며, 백신에 대한 바이러스 전파 및 바이러스 매개된 발현을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 또한, BHK 세포는 다양한 재조합 단백질의 안정된 발현을 위한 숙주 세포주로서 유용하다. BHK-21(BHK Strain 21) 세포주는 IA Macpherson과 MGP Stoker에 의해 1961년 3월에 5마리의 unsexed, 1일된 햄스터의 아기 햄스터 신장으로부터 유래되었다. 상기 햄스터는 BHK-21 세포를 생성하는데 사용되었으며, 일반적으로 시리아 황금 햄스터(Mesocricetus auratus)로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “바이러스”는 상기 BHK-21 세포를 감염시켜 세포 내에서 복제할 수 있는 바이러스를 의미하며, 특정한 바이러스로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 포유동물 리오바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, “리오바이러스”는 이중가닥의 세그먼트화된 RNA 게놈을 가지는 바이러스로서, 리오바이러스 과(Reoviridae)로 분류되는 임의의 바이러스를 의미한다. 상기 리오바이러스의 비리온(virion)은 직경이 60~80 nm이며, 2개의 동심성 캡시드 껍질을 보유하고 있다. 이 게놈은 10~12개의 불연속의 세그먼트(segment)인 이중가닥 RNA로 구성되고, 16~27 kbp의 총 게놈 사이즈를 가지며, 각각의 RNA 세그먼트는 크기가 다르다.
본 발명에 있어서, 상기 리오바이러스는 자연 발생적(naturally occurring)리오바이러스뿐만 아니라, 변형되거나 또는 재조합체인 리오바이러스도 포함한다. 상기 리오바이러스는 자연으로부터 분리될 수 있고, 인간에 의해 인위적인 변경이 행해지지 않은 경우에 “자연 발생적”이라고 한다. 예를 들어, 상기 리오바이러스는 “필드 공급원(field source)”, 즉 이 리오바이러스에 감염된 사람으로부터 유래할 수 있다.
상기 리오바이러스는 변형될 수 있지만, 활성화된 ras 경로를 가지는 포유동물 세포를 용해적(lytically)으로 감염시킬 수 있다. 또한, 상기 리오바이러스는 증식하는 세포에 투여하기 전에 화학적 또는 생화학적으로(예를 들면, 키모트립신 또는 트립신과 같은 프로테아제를 이용하여 처리함으로써) 전처리 될 수 있다. 프로테아제를 이용하는 전처리에 의해 바이러스의 외막 또는 캡시드가 제거되어 상기 바이러스의 감염성을 증대시킬 수 있다. 상기 리오바이러스는 리포좀 또는 마이셀로 피복될 수 있으며, 예를 들어, 새로운 전염성 서브 바이러스 입자를 생성하기 위하여 마이셀 형성 농도의 알킬 황산 세제(alkyl sulfate detergent)의 존재 하에서 비리온을 키모트립신으로 처리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포유동물 리오바이러스는 인간 리오바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인간 리오바이러스는 다음과 같이 3개의 혈청형으로 구성될 수 있다: 1형(Lang 주 또는 T1L), 2형(Jones 주, T2J) 및 3형(Dearing 주, T3D 또는 Abney 주, T3A). 상기 3종의 혈청형은 중화반응 및 혈구 응집소 저해 어세이(assay)에 기반하여 용이하게 동정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 리오바이러스는 혈청형 3의 리오바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 리오바이러스는 리오바이러스 혈청형 3 Dearing 주(Reovirus type 3 Dearing, T3D)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, “감염된 BHK-21 세포”는 BHK-21 세포로 바이러스가 침입하여 이후 세포 내에서 바이러스가 복제되는 상태를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “MOI”는 감염다중도(multiplicity of infection)의 약자로서, 바이러스를 접종시킨 세포수에 대한 접종 바이러스양의 비율(접종 바이러스양/세포수)로, 감염될 때 세포 1개당 몇 개의 감염성 바이러스를 얻을 수 있는가를 나타내는 것이다. 실제로는 흡착되지 않은 상태로 접종액 중에 남기거나, 흡착이 되더라도 침입하지 않는 바이러스 입자가 많이 남기 때문에 MOI는 그대로 세포 내에 침입한 바이러스 입자수를 나타내는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.4, 0.001 내지 0.3, 0.001 내지 0.2 또는 0.001 내지 0.1 MOI; 0.002 내지 0.5, 0.002 내지 0.4, 0.002 내지 0.3, 0.002 내지 0.2 또는 0.002 내지 0.1 MOI; 0.003 내지 0.5, 0.003 내지 0.4, 0.003 내지 0.3, 0.003 내지 0.2 또는 0.003 내지 0.1 MOI; 또는 0.004 내지 0.5, 0.004 내지 0.4, 0.004 내지 0.3, 0.004 내지 0.2 또는 0.004 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.4, 0.005 내지 0.3, 0.005 내지 0.2 또는 0.005 내지 0.1; 0.006 내지 0.5, 0.006 내지 0.4, 0.006 내지 0.3, 0.006 내지 0.2 또는 0.006 내지 0.1; 0.007 내지 0.5, 0.007 내지 0.4, 0.007 내지 0.3, 0.007 내지 0.2 또는 0.007 내지 0.1; 0.008 내지 0.5, 0.008 내지 0.4, 0.008 내지 0.3, 0.008 내지 0.2 또는 0.008 내지 0.1; 0.009 내지 0.5, 0.009 내지 0.4, 0.009 내지 0.3, 0.009 내지 0.2 또는 0.009 내지 0.1; 또는 0.01 내지 0.5, 0.01 내지 0.4, 0.01 내지 0.3, 0.01 내지 0.2 또는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “배양”은 바이러스에 감염된 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키면서 바이러스를 증식시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 세포의 배양은 세포 공장 시스템(cell factory system)을 이용할 수 있다. 상기 방법에 의하면 바이러스의 생산시 스케일 업(scale up)하여 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.
본 발명에서는 당해 분야에서 바이러스 증식 또는 생산을 위하여 세포배양에 통상적으로 사용되는 배지 또는 배양액을 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)에서 배지는 DMEM, MEM, EMEM, RPMI-1640, F-12 및 DMEM/F12 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명은 상기 단계 (b)에서 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 1일 내지 10일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 1일 내지 9일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일 또는 1일 내지 5일; 2일 내지 10일, 2일 내지 9일, 2일 내지 8일, 2일 내지 7일, 2일 내지 6일 또는 2일 내지 5일; 3일 내지 10일, 3일 내지 9일, 3일 내지 8일, 3일 내지 7일, 3일 내지 6일 또는 3일 내지 5일; 4일 내지 10일, 4일 내지 9일, 4일 내지 8일, 4일 내지 7일, 4일 내지 6일 또는 4일 내지 5일; 5일 내지 10일, 5일 내지 9일, 5일 내지 8일, 5일 내지 7일 또는 5일 내지 6일; 또는 6일 내지 10일, 6일 내지 9일, 6일 내지 8일 또는 6일 내지 7일 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 2일 내지 8일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 3일 내지 8일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 4일 내지 7일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 7일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 단계 (a)에서는 상술한 수치범위로부터 선택된 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)에서는 바이러스 감염 후 상술한 배양일 수로부터 선택된 배양일 동안 배양할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하기와 같이 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 4일 내지 7일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 4일 내지 7일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단계 (c)에서 배양물로부터 바이러스를 분리하는 방법은 바이러스를 분리 정제할 수 있는 당해분야에 알려진 방법을 통하여 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 바이러스의 분리는, 배양 중간 중간 분리할 수도 있고, 목적하는 배양일수가 완료된 이후에 한 번에 분리할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 바이러스는, 배양 중 또는 배양 완료 후 (i) 단계 (b)의 배지를 원심분리하여 수득한 상층액 및 (ii) 상기 배지의 원심분리 후 생성된 펠렛에 단계 (b)에서 수득한 배양물에 남아 있는 감염된 세포를 혼합한 후 혼합물 내 세포를 파쇄한 다음 원심분리하여 수득한 상층액으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 바이러스 분리는, 단계 (b)의 배양물 내 세포를 파쇄하는 단계; 및 상기 세포 파쇄 결과물을 CsCl 경사원심분리(gradient centrifuge)하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 단계 (c)에서의 바이러스 분리는, 배양 중 또는 배양 완료 후, 단계 (b)의 배지를 원심분리하여 수득한 상층액((i) 상층액) 및 상기 배지의 원심분리 후 생성된 펠렛에 단계 (b)에서 수득한 배양물에 남아 있는 감염된 세포를 혼합한 후 혼합물 내 세포를 파쇄한 다음 원심분리하여 수득한 상층액((ii) 상층액)을 얻는 단계; 및 상기 (i) 및 (ii) 상층액을 CsCl 경사원심분리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 파쇄는 초음파 처리(sonication)를 실시하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 초음파 처리는 전통적인 세포 동결-융해(freeze-thawing) 방식 또는 계면활성제(detergent) 방식이 아닌 초음파처리로 세포를 깨어 세포를 버리지 않고 세포 안에 존재하는 잔여의 바이러스까지 회수하므로 높은 바이러스 수율을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 CsCl 경사원심분리는 2회 이상 수행할 수 있다. 2회 이상의 CsCl 경사원심분리를 통하여 더욱 순도 높은 바이러스를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 분리 장소( pellet vs sup )에 따른 리오바이러스 생산성 비교
BHK(Baby Hamster Kidney)-21 세포(1 x 10 6 cells/dish)에 0.01, 0.1, 1, 10, 30 및 100 MOI(multiplicity of infection, PFU 기준)의 리오바이러스(Reovirus type 3 Dearing)를 감염시킨 후 CPE(Cytopathic effect) 80% 이상 관찰되는 시점에서 세포가 배양된 배지(DMEM:F-12, Ham's nutrient mixture F-12 and Dulbecco's modified Eagle's essential medium, ThermoFisher)를 각각 15 ml 원심분리용 보틀(centrifuge bottle)에 동량으로 모아 원심분리(3,270±20 g, 10±0.5분)하였다. 원심분리 후 세포 펠렛(cell pellet)을 제외한 상층액만 분리하여 50 ml 병에 모았다(Sup, 약 8.5 ml).
또한, 남아 있는 세포 펠렛에 새 배지 2 ml을 더한 후 초음파 처리(sonication, 3분)를 실시하여 세포를 깬 후에 15 ml 원심분리용 보틀(centrifuge bottle)에 동량으로 모아 원심분리(3,270±20 g, 10±0.5분)하여 다시 상층액만 모아 두었다(Pellet, 약 4.5 ml).
세슘클로라이드(Cesium chloride, CsCl) 경사(gradient) 원심분리를 위하여 울트라 튜브(Ultra tube)에 Sol’A(1.40 CsCl, 62 g in 100 ml PBS) 9 ml, Sol’B(1.25 CsCl, 36 g in 100 ml PBS) 9 ml 및 상기 초음파처리를 3분간 수행한 시료 18 ml을 순서대로 넣고, 26,000 rpm에서 2시간 동안 1차 초원심분리(ultracentrifuge)를 수행하였다. 그 다음, 아래쪽 리오바이러스 밴드(band)만 남기고 석션(suction)하여 상층액을 제거한 후 리오바이러스만 취하여 새 50 ml 튜브로 옮긴 다음, 리오바이러스 부피와 동량의 PBS(phosphate buffered saline)를 가하여 잘 섞었다. 그리고, 울트라 튜브에 Sol’C(1.38 CsCl, 60 g in 100 ml PBS) 15 ml, 상기 리오바이러스에 PBS를 섞은 시료 20 ml을 순서대로 넣고, 26,000 rpm에서 2 시간 동안 2차 초원심분리를 수행한 뒤 리오바이러스 밴드만 남기고 석션하여 상층액을 제거한 후 리오바이러스만 취하여 새 50 ml 튜브로 옮겼다.
바이러스 투석을 위하여 상기 리오바이러스를 투석 튜빙(Dialysis tubing)에 넣고 클로져(closure)로 잘 봉한 후, 2 L PBS와 마그네틱 바(magnetic bar)가 들어있는 2.4 L 투석 리저버(Dialysis Reservoir)에 담아 투석을 수행하였으며, PBS는 총 3번 교환되었다(PBS는 최초 16시간, 2번째부터는 3시간 간격으로 교환). 투석이 끝나면 4℃에서 보관하였다.
실험 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, BHK-21 세포를 이용하여 리오바이러스를 생산할 때 Sup 단독 및 Pellet 단독으로부터 바이러스를 분리하는 경우 최적의 생산조건은 각각 30 MOI, 5일의 배양기간이었다. 또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, Sup + Pellet으로부터 바이러스를 분리하는 경우에는 훨씬 낮은 MOI(10~100 MOI), 5일의 배양기간 일 때 가장 많은 양의 리오바이러스가 생산되었다. 이러한 결과는 Sup + Pellet으로부터 바이러스를 생산하는 것이 낮은 MOI에서 많은 양의 바이러스를 생산할 수 있어 경제성이 우수함을 보여준다.
실시예 2. 감염기간에 따른 리오바이러스 생산성 비교
BHK-21 세포(1 x 10 6 cells/dish)에 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 MOI(PFU 기준)의 리오바이러스를 감염시킨 후 10일 동안 배양하는 과정에서 매일 배지(DMEM:F-12, Ham's nutrient mixture F-12 and Dulbecco's modified Eagle's essential medium, ThermoFisher)를 각각 15 ml 원심분리용 보틀(centrifuge bottle)에 동량으로 모아 원심분리(3,270±20 g, 10±0.5분) 하여 상층액만 모았다(Sup, 8 ml). 원심분리 후 남은 펠렛은, 감염된 세포와 합쳐서 초음파분쇄(sonication 10분)를 실시하고, 500 ml 원심분리용 보틀에 동량으로 모아 원심분리(3,270±20 g, 10±0.5분)하여 다시 상층액만 모아 두었다(Pellet, 약 4.5 ml). 이후 세슘클로라이드 경사원심분리 및 바이러스 투석은 실시예 1과 같이 실시하였다.
실험 결과, 본 발명은 기존의 바이러스 생산방법보다 개선되어 대량의 바이러스 복제가 가능하고 세포 내의 잔여 바이러스까지 회수할 수 있어 높은 수율을 가지는 등 효과적인 바이러스 생산방법임을 확인하였다. 구체적으로, 도 2a에 나타난 바와 같이, 1 x 10 6 BHK-21 세포가 생산할 수 있는 최대 리오바이러스의 양은 약 +10 10 CID 50/ml 수준이었으며, 4일(4 days post infection) 이상 배양할 때 0.001 MOI 이상 처리하면 거의 유사한 양의 리오바이러스가 생산되었으며, 8일 이상 배양하면 오히려 리오바이러스 타이터(titer)가 낮아지는 경향을 보였다. 또한, 리오바이러스를 고농도(1 혹은 10 MOI)로 처리하였을 때 초기(3일)까지는 리오바이러스의 생산량이 높았으나, 그 이후에는 낮은 MOI 처리군의 생산량보다 오히려 감소하는 경향을 보였다.
종합하면, 생산량(도 2a)과 생산율(도 2b)을 모두 고려하는 경우, 바이러스를 0.001-0.1 MOI로 처리하고, 5~6일 동안 배양하는 것이 효율적으로 바이러스를 대량으로 생산할 수 있으며, 특히 바이러스를 0.01~0.1 MOI로 처리하고, 5~6일 배양하는 경우 더욱 효율적으로 바이러스를 생산할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 바이러스 생산방법은 BHK-21 세포를 이용하는 세포 공장 시스템(cell factory system)을 사용하여 대량생산이 가능하고, 배지뿐만 아니라 세포 안에 존재하는 잔여 바이러스까지 회수함에 따라 생산수율이 높다. 본 발명은 효과적으로 대량의 바이러스를 생산할 수 있는 최적의 조건을 확립하였고, 다양한 종류의 바이러스 생산에 적용될 수 있으므로, 바이러스 의약품 생산 등 관련 의약 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (23)

  1. 하기의 단계를 포함하는 바이러스 생산방법:
    (a) BHK(Baby Hamster Kidney)-21 세포를 0.0001 내지 0.5 MOI(multiplicity of infection)로 바이러스와 접촉시켜 감염된 BHK-21 세포를 생성하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 감염된 BHK-21 세포를 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 배양물로부터 바이러스를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 바이러스는 포유동물 리오바이러스인 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 포유동물 리오바이러스는 인간 리오바이러스인 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 인간 리오바이러스는 혈청형 3의 리오바이러스인 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 혈청형 3의 리오바이러스는 Dearing 주(reovirus type 3 Dearing)인 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.005 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.5 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 1일 내지 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 2일 내지 8일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 3일 내지 8일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 4일 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.001 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 0.01 내지 0.1 MOI의 바이러스로 BHK-21 세포를 감염시키고, 상기 단계 (b)는 바이러스 감염 후 5일 내지 6일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 배지는 DMEM, MEM, EMEM, RPMI-1640, F-12 및 DMEM/F12 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서의 바이러스는, 배양 중 또는 배양 완료 후 (i) 단계 (b)의 배지를 원심분리하여 수득한 상층액 및 (ii) 상기 배지의 원심분리 후 생성된 펠렛에 단계 (b)에서 수득한 배양물에 남아 있는 감염된 세포를 혼합한 후 혼합물 내 세포를 파쇄한 다음 원심분리하여 수득한 상층액으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는, 단계 (b)의 배양물 내 세포를 파쇄하는 단계; 및 상기 세포 파쇄 결과물을 CsCl 경사원심분리(gradient centrifuge)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 CsCl 경사원심분리는 2회 이상 수행하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 세포 파쇄는 초음파 처리(sonication)를 실시하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산방법.
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