WO2020196749A1 - エイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物の製造方法 - Google Patents

エイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物の製造方法 Download PDF

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silver salt
alkyl ester
material oil
mass
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裕之 池本
純一 野出
健二 竹本
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Nisshin Pharma Inc
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Nisshin Pharma Inc
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    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
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    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/02—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/007—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids using organic solvents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an eicosapentaenoic acid alkyl ester-containing composition.
  • Eicosapentaenoic acid which is a kind of polyunsaturated fatty acid (PUFA)
  • PUFA polyunsaturated fatty acid
  • EPAs used as raw materials for pharmaceuticals and foods are required to have as little impurities as possible and high purity.
  • PUFAs such as EPA have a plurality of double bonds, it is not easy to obtain them by chemical synthesis.
  • Most of the industrially used EPAs are produced by extracting or refining from marine organism-derived raw materials rich in EPA, such as fish oil.
  • the biological fat and oil raw material is a mixture of various fatty acids having different carbon numbers, number and positions of double bonds, and stereoisomer composition ratio
  • the target EPA content is not necessarily high. Absent.
  • EPA purified from marine organism-derived raw materials emits a strong fishy odor when it contains impurities even in a small amount, and therefore causes discomfort when ingested unless the odor is suppressed by encapsulation in capsules or addition of a masking agent. Therefore, conventionally, it has been required to selectively purify EPA from biological fat and oil raw materials.
  • PUFAs there are cis and trans isomers in PUFA.
  • Most PUFAs in a living body are cis-forms, but they may be converted from cis-forms to trans-forms by heating or the like at the stage of purification from biological raw materials. Therefore, conventionally, PUFAs having a thermal history industrially purified from biological raw materials contain a certain amount of trans isomers.
  • trans fatty acids have been reported to increase health risks, especially LDL cholesterol levels, and increase the risk of cardiovascular disease. In EPA used as a raw material for pharmaceuticals and foods, it is required to reduce the content of trans fatty acids as much as possible.
  • Patent Documents 1 to 4 an aqueous solution containing a silver salt is mixed with a raw material containing PUFA such as EPA to form a complex of PUFA and silver salt, and then an aqueous layer containing the complex is extracted with an organic solvent.
  • Patent Document 1 dissociation of complex by heating (Patent Document 2), permeation into liquid film (Patent Document 3), or dilution, or addition of complex dissociation agent or silver ion reducing agent (Patent Document 4). This describes a method for obtaining the PUFA, an ester thereof, and the like.
  • Patent Document 5 a mixed solution of a raw material containing PUFA such as EPA and / or DHA and an aqueous solution containing a silver salt is brought into contact with an organic solvent while maintaining a specific temperature, and then the aqueous phase is recovered, and then the aqueous phase is recovered. It is described that EPA and / or DHA can be selectively purified by recovering the organic solvent phase after adding the organic solvent to the aqueous phase.
  • PUFAs other than EPA also form a complex with silver salt when treated with an aqueous solution containing silver salt, so that EPA cannot be selectively purified. difficult.
  • Patent Document 6 a raw material containing PUFA such as EPA and / or DHA is mixed with an aqueous solution containing a silver salt, an organic solvent is added to the obtained aqueous phase, and the obtained organic solvent phase is vacuum distilled. To produce a composition containing EPA with a high concentration and a low trans-form content.
  • Patent Document 7 a raw material containing PUFA such as EPA and / or DHA is subjected to vacuum precision distillation treatment, and the content of EPA or its lower alcohol ester is 50% by weight or more, and PUFA other than EPA or its lower alcohol is described.
  • a distillate having an ester content of 10% by weight or less was collected, and then the distillate was mixed with an aqueous solution of silver nitrate to remove impurity components in the upper layer, mixed with an organic solvent, and organic from the obtained organic solvent phase.
  • a method for purifying a high-purity EPA or a lower alcohol ester thereof by removing the solvent is described.
  • the present inventors have a fat and oil raw material having a specific fatty acid composition in the raw material oil to be treated with an aqueous solution containing silver salt. It has been found that a composition containing EPA with high concentration and high purity can be obtained by using.
  • the present invention provides: [1] A method for producing an eicosapentaenoic acid alkyl ester-containing composition, wherein the following (1) to (5): (1) Preparing a raw material oil containing 50 to 92% by mass of eicosapentaenoic acid alkyl ester in all fatty acids, and the mass ratio of docosahexaenoic acid alkyl ester to eicosapentaenoic acid alkyl ester contained in the raw material oil is 3.
  • the ratio of trans isomers in the eicosapentaenoic acid alkyl ester contained in the raw material oil is 3% by mass or less and is 2% by mass or less; (2) Contacting the raw material oil with an aqueous solution containing a silver salt; (3) To recover the aqueous solution containing the silver salt in contact with the raw material oil; The eicosapentaenoic acid alkyl ester is obtained by contacting the organic solvent with the aqueous solution containing the recovered silver salt; and (5) recovering the organic solvent contacted with the aqueous solution containing the silver salt.
  • the total content of the arachidonic acid alkyl ester and the eicosatetraenoic acid alkyl ester in the raw material oil is 26% by mass or less with respect to 100% by mass of the eicosapentaenoic acid alkyl ester, [1] to The method according to any one of [3].
  • [5] (3') The raw material oil after the aqueous solution containing the silver salt was recovered in the above (3) was brought into contact with the newly prepared aqueous solution containing the silver salt, and then brought into contact with the raw material oil.
  • the present invention provides a method for producing an EPA alkyl ester-containing composition.
  • the method of the present invention is: (1) preparing a raw material oil containing an EPA alkyl ester; (2) bringing the raw material oil into contact with an aqueous solution containing a silver salt; (3) with the raw material oil. Recovering the aqueous solution containing the contacted silver salt; (4) contacting the recovered aqueous solution containing the silver salt with an organic solvent; and (5) contacting the aqueous solution containing the silver salt. Includes recovery of the organic solvent.
  • the raw material oil used in the method for producing an EPA alkyl ester-containing composition of the present invention is an oil / fat composition containing mainly EPA in the contained fatty acids.
  • the feedstock can be prepared from biologically derived fats and oils containing EPA.
  • the biological fats and oils include marine animals such as fish, plankton-derived fats and oils, and microorganism-derived fats and oils such as algae.
  • fish-derived fats and oils such as sardines, mackerel, and tuna, and algae-derived fats and oils. Is a preferable example.
  • These biological fats and oils mainly contain fatty acids in the form of triglycerides in which three molecules of fatty acids are bound to one molecule of glycerin. It may also contain diglycerides, monoglycerides and free fatty acids, albeit in small amounts.
  • Examples of the method for preparing the above-mentioned EPA-containing organism-derived raw material oil include a method of heating and squeezing the EPA-containing organism to extract the fat and oil, and further urea treatment, chromatogram treatment, and distillation of the squeezed fat and oil. Examples thereof include a method of separating oils and fats through treatment, supercritical treatment, and the like.
  • PUFA in the raw material oil is alkyl esterified.
  • the target EPA can be efficiently separated from other PUFAs other than EPA in the production method of the present invention.
  • the alkyl group constituting the alkyl ester of the PUFA include a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably a methyl group or an ethyl group, and more preferably an ethyl group. ..
  • the alkyl ester of PUFA can be produced by subjecting a fat or oil containing PUFA and an alcohol having a desired alkyl group to an esterification reaction by a known method.
  • an alkyl ester of PUFA can be obtained by reacting a PUFA triglyceride contained in an oil or fat with a lower alcohol in the presence of a catalyst or an enzyme to form an alkyl ester.
  • the content of the EPA alkyl ester in the raw material oil is 50 to 92% by mass, preferably 50 to 85% by mass, more preferably 50 to 75% by mass, and further preferably 60 to 85% by mass in the total fatty acids of the raw material oil. %, More preferably 70 to 85% by mass, still more preferably 75 to 85% by mass.
  • the content of the EPA alkyl ester in the raw material oil may be 92% by mass or less. , 85% by mass or less is more preferable.
  • the raw material oil mainly contains EPA, but may also contain PUFAs other than EPA.
  • the other PUFA include docosahexaenoic acid (DHA), arachidonic acid (AA), and eicosatetraenoic acid (ETA).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • AA arachidonic acid
  • ETA eicosatetraenoic acid
  • the content of the alkyl ester of PUFA other than EPA, such as DHA, AA, and ETA, in the raw material oil is low. More specifically, the mass ratio of the DHA alkyl ester to the EPA alkyl ester in the raw material oil may be 3.3% by mass or less with respect to 100% by mass of the EPA alkyl ester, but is preferably 2.7% by mass.
  • the content of DHA alkyl ester in the raw material oil is 2% by mass or less, more preferably 1.5% by mass or less, based on the total fatty acids of the raw material oil.
  • the ratio of the total content of the AA alkyl ester and the ETA alkyl ester to the content of the EPA alkyl ester in the raw material oil is 26% by mass or less, more preferably 26% by mass or less, based on 100% by mass of the EPA alkyl ester. It is 15% by mass or less, more preferably 11% by mass or less.
  • the above-mentioned raw material oil containing a high amount of EPA is obtained by heating and squeezing an organism containing the above-mentioned EPA, for example, a marine animal such as a fish, and then treating the obtained product containing fats and oils with urea treatment or chromatogram treatment. It can be prepared by further separating fats and oils by distillation treatment, supercritical treatment or the like.
  • the raw material oil used in the present invention is a raw material oil prepared by using a method including heat treatment such as distillation.
  • the heat treatment in the raw material oil preparation process as described above may generate an unfavorable trans isomer in the obtained raw material oil.
  • the method of the present invention is useful for removing trans isomers produced in the process of preparing such feedstocks.
  • the feedstock oil used in the method of the present invention may contain a trans isomer of an EPA alkyl ester.
  • the ratio of trans isomers in the EPA alkyl ester contained in the feedstock oil is 2% by mass or less, more preferably 1.5% by mass or less, still more preferably 1.0% by mass or less.
  • the ratio of trans isomers in EPA containing a high concentration of EPA (96% by mass or more in the total fatty acid content) is used. Is less than that of the raw material oil, and a composition having an amount of 1.5% by mass or less can be efficiently obtained.
  • the raw material oil used in the production method of the present invention includes commercially available fats and oils as long as the content of the EPA alkyl ester, the content of other PUFA alkyl esters, and the content of trans isomers are within the above ranges. You may use it. From the viewpoint of cost and stabilization of the target yield of EPA, it is preferable to use commercially available fish oil-derived fats and oils in which the type and amount of PUFA contained are standardized.
  • the raw material oil used in the production method of the present invention preferably has a low oxidation index.
  • the lipid oxidation index can be expressed by a peroxide value (POV), an acid value (AV), or the like.
  • POV peroxide value
  • AV acid value
  • the raw material oil used in the present invention has a POV (mEq / kg) of preferably 10 or less, more preferably 5 or less, or an AV (mg / g) of preferably 0.3 or less, more preferably 0. .2 or less.
  • the raw material oil has a POV of 10 or less and an AV of 0.3 or less, and more preferably a POV of 5 or less and an AV of 0.2 or less.
  • POV can be measured by the iodine titration method (ISO 3960: 2007) or the like.
  • AV can be measured by the potassium hydroxide titration method (ISO 660: 2009) or the like.
  • the mass of each constituent fatty acid in all fatty acids in fats and oils can be measured by gas chromatography (for example, the method described in Reference Example 1 described later).
  • the above-mentioned raw material oil is preferably applied in the form of a liquid.
  • the raw material oil is in the form of a liquid at the reaction temperature in each step, it can be directly applied to each step of the method of the present invention.
  • the raw material oil can be appropriately dissolved or diluted in an organic solvent or other oil and applied.
  • organic solvent an organic solvent separable from water is used in order to carry out the following steps (2) to (3), for example, ethyl acetate, chloroform, carbon tetrachloride, diethyl ether, hexane, cyclohexane and the like. Can be mentioned.
  • a raw material oil containing an EPA alkyl ester and other PUFA alkyl ester in a specific amount described above is prepared.
  • the raw material oil having such a composition is a raw material oil having a thermal history prepared by using a method including heat treatment as described above.
  • steps (2) and (3) are performed on the raw material oil prepared in (1): (2) Contacting the raw material oil with an aqueous solution containing a silver salt (hereinafter, also referred to as a silver salt solution); (3) To recover the silver salt solution in contact with the raw material oil.
  • a silver salt solution hereinafter, also referred to as a silver salt solution
  • the steps (2) and (3) utilize the fact that the solubility of the PUFA alkyl ester containing EPA in the extraction solvent changes due to the formation of a complex of silver salts at the carbon-carbon double bond portion of PUFA. Then, it is a step of separating the EPA alkyl ester from the raw material oil.
  • the step can be performed according to, for example, the methods described in Patent Documents 1 to 6 and the like.
  • the silver salt is not particularly limited as long as it can form a complex with the unsaturated bond of PUFA, and examples thereof include silver nitrate, silver perchlorate, silver tetrafluoride, and silver acetate. Of these, silver nitrate is preferable.
  • the solvent for the silver salt solution include water or a mixed medium of water and a compound having a hydroxyl group such as glycerin or ethylene glycol, and water is preferably used.
  • the silver salt concentration in the silver salt solution may be 0.1 mol / L or more, but is preferably about 1 to 20 mol / L.
  • the molar ratio of PUFA to silver salt in the raw material oil is preferably about 1: 100 to 100: 1, preferably about 1: 5 to 1: 1.
  • the number of moles of PUFA in the feedstock oil can be calculated by dividing the total mass of PUFAs in the feedstock oil by the average molecular weight of PUFAs.
  • the average molecular weight of PUFAs can be calculated from the molecular weight of each PUFA and the composition ratio in the raw material oil.
  • the total mass and composition ratio of PUFA in the feedstock oil can be calculated using gas chromatography (for example, under the conditions described in Reference Example 1 described later).
  • the means for bringing the raw material oil into contact with the silver salt solution is not particularly limited.
  • the raw material oil and the silver salt solution may be charged into the reaction tank and brought into contact with each other in the reaction tank, or the raw material oil and the silver salt solution mixed in advance may be charged into the reaction tank. They may be brought into contact with each other in the reaction vessel.
  • the raw material oil and the silver salt solution may be brought into contact with each other by passing droplets of the silver salt solution through the raw material oil filled in the reaction vessel according to the method described in WO2017 / 191821.
  • the temperature of the silver salt solution at the time of contact with the raw material oil is preferably about 80 ° C. or lower and 5 ° C. or higher. It is better, more preferably 5 to 30 ° C, still more preferably 15 to 30 ° C.
  • a method for maintaining the reaction temperature in the above range a method of heating or cooling the raw material oil and / or the silver salt solution to the above range and then bringing them into contact with each other, the raw material oil and the silver salt solution are used. Examples thereof include a method of maintaining the temperature of the reaction vessel for contact in the above range, and a combination of these methods.
  • the contact time between the raw material oil and the silver salt solution is preferably 5 minutes to 4 hours, more preferably 10 minutes to 2 hours.
  • PUFA-silver complex in the present specification
  • the formed complex is transferred to an aqueous layer, that is, a silver salt solution.
  • the liquid containing the PUFA-silver complex can be obtained by recovering the silver salt solution in contact with the raw material oil.
  • the contact between the raw material oil and the silver salt solution in the above (2) and (3) and the recovery of the silver salt solution after the contact may be carried out by a batch method or a continuous method.
  • a silver salt solution is added to a raw material oil containing an EPA alkyl ester, the raw material oil and the silver salt solution are brought into contact with each other with stirring, and then the mixed solution is allowed to stand to separate the aqueous layer. This should be collected.
  • the continuous method for example, when the droplets of the silver salt solution are passed through the raw material oil filled in the reaction tank, the silver salt solution is continuously charged into the reaction tank, while the silver salt solution after passing is continuously passed. It may be collected in the or accumulated and collected.
  • a flow path type stirrer is used as the reaction tank.
  • the raw material oil and the silver salt solution may be charged from one port of the stirrer, transferred to the other port while stirring, and sent out to the separation tank, and the aqueous layer may be separated and recovered in the separation tank.
  • the production method of the present invention follows the above (3) and follows the following steps: (3')
  • the raw material oil after the silver salt solution is recovered in the (3) is brought into contact with a new silver salt solution, and then the silver salt solution contacted with the raw material oil is recovered. Including further.
  • the feedstock oil separated from the silver salt solution in (3) may still contain uncomplexed EPA. Therefore, by contacting the separated raw material oil with a new silver salt solution, the PUFA remaining in the raw material oil can be converted into a PUFA-silver complex, so that the recovery rate of EPA (the amount of EPA in the raw material oil) can be converted. (Ratio of the amount of recovered EPA to) is improved.
  • the new silver salt solution to be brought into contact with the raw material oil a newly prepared silver salt solution may be used, or the silver salt from which PUFA has been recovered in the step (5) described later may be used.
  • the solution may be washed if necessary and then reused.
  • the conditions (temperature, etc.) at the time of contact between the raw material oil and the silver salt solution can be appropriately set within the range of the conditions described in (2) above.
  • the step (3') may be repeated twice or more. In that case, the raw material oil separated from the silver salt solution in the first (3') is subjected to the second (3'), and this is repeated as necessary.
  • the raw material oil used in (3') preferably contains EPA alkyl ester in an amount of 5% by mass or more in all fatty acids.
  • the number of times (3') can be appropriately determined according to the content of the EPA alkyl ester in the feedstock oil.
  • the silver salt solution recovered in (3') is combined with the separately recovered silver salt solution containing the PUFA-silver complex, and the PUFA alkyl ester extraction steps described later ((4) and (5) below). ), Or it can be used alone in the extraction step.
  • the silver salt solution containing the PUFA-silver complex recovered above is used in the PUFA alkyl ester extraction steps ((4) and (5) below). If necessary, the silver salt solution containing the recovered PUFA-silver complex may be washed with an organic solvent before being used in the extraction step. In the washing, the recovered silver salt solution may be brought into contact with an organic solvent, preferably stirred, and then the aqueous layer may be separated and recovered.
  • the organic solvent used for the cleaning may be any organic solvent that can be used for dissolving the above-mentioned raw material oil.
  • the cleaning conditions (temperature, etc.) can be appropriately set within the range of the conditions described in (2) above.
  • an organic solvent is added to the silver salt solution containing the PUFA-silver complex recovered in (3) above, and the EPA alkyl ester in the solution is extracted into the organic solvent.
  • Examples of the organic solvent used in (4) above include solvents such as hexane, ether, ethyl acetate, butyl acetate, chloroform, cyclohexane, benzene, toluene, and xylene, which are highly soluble in PUFA and separable from water. Be done. Of these, hexane or cyclohexane is preferable.
  • the volume ratio of the silver salt solution and the organic solvent is preferably 100: 3 to 300, more preferably 100: 3 to 200.
  • the means for bringing the organic solvent into contact with the silver salt solution is not particularly limited.
  • the silver salt solution recovered from the reaction vessel is transferred to an extraction tank for contact between the silver salt solution and the organic solvent, where it comes into contact with the organic solvent.
  • Contact between the organic solvent and the silver salt solution transfers the PUFA alkyl ester in the silver salt solution to the organic solvent.
  • the organic solvent containing the target EPA alkyl ester can be obtained by recovering the organic solvent in contact with the silver salt solution.
  • the temperature of the silver salt solution at the time of contact with the organic solvent is the reaction temperature in (2) above, that is, the PUFA-silver complex.
  • the temperature should be higher than the production temperature. More preferably, the reaction temperature in (2) above, that is, a temperature higher than the formation temperature of the complex by 20 ° C. or more.
  • the reaction temperature in step (4) is preferably 30 to 80 ° C, more preferably 50 to 70 ° C.
  • Examples of the method for maintaining the reaction temperature in the above range include a method in which a silver salt solution and / or an organic solvent is heated in the above range and then brought into contact with each other, and a method in which the temperature of the extraction tank is maintained in the above range. And a combination of these methods.
  • the contact time between the organic solvent and the silver salt solution is preferably 5 minutes to 4 hours, more preferably 10 minutes to 2 hours, still more preferably 30 minutes to 2 hours.
  • the contact between the organic solvent and the silver salt solution in the above (4) and (5) and the recovery of the organic solvent after the contact may be carried out by a batch method or a continuous method.
  • a silver salt solution is added to an organic solvent, the organic solvent and the silver salt solution are brought into contact with each other with stirring, and then the mixed solution is allowed to stand to separate the organic solvent layer and then recovered.
  • a flow path type stirrer is used as the extraction tank.
  • the organic solvent and the silver salt solution may be charged from one port of the stirrer, transferred to the other port while stirring, and sent out to the separation tank, and the organic solvent layer may be separated and recovered in the separation tank.
  • the silver salt solution separated from the organic solvent in the above step may be brought into contact with the organic solvent again.
  • the silver salt solution separated from the organic solvent in the above step is added to the organic solvent together with the additional silver salt solution recovered in (3) above, which was separately performed as needed.
  • the organic solvent used here the one recovered in the above step may be reused, or a new organic solvent may be used in part or in whole.
  • the conditions (temperature, etc.) at the time of contact may be the same as in (4) above. This operation may be repeated further. Since the PUFA alkyl ester is further extracted by the recontacting of the organic solvent with the silver salt solution, more of the desired EPA alkyl ester can be recovered.
  • the residual silver ions may be further removed by passing the recovered organic solvent through an adsorbent such as silica gel, activated carbon, or silicon dioxide.
  • an adsorbent such as silica gel, activated carbon, or silicon dioxide.
  • the silver salt solution separated from the organic solvent in the above step may be brought into contact with the raw material oil again.
  • the raw material oil used here was separated from the silver salt solution in the above step as long as the content of the EPA alkyl ester, the content of other PUFA alkyl esters, and the content of the trans isomer were within the above ranges. Those may be reused, or new feedstock may be used in part or in whole.
  • the conditions (temperature, etc.) at the time of the contact may be the same as in (2) above. This operation may be repeated further.
  • a silver salt solution containing a large amount of PUFA-silver complex can be recovered by recontacting the raw material oil with the silver salt solution.
  • Hypoxic conditions include, for example, making the system of the method of the present invention (for example, a reaction tank, an extraction tank, a separation tank, their connecting paths, etc.) a closed system that is shielded from the outside air, and keeping the inside of the system in a nitrogen atmosphere. , It can be achieved by filling the inside of the system with a liquid (raw material oil, silver salt solution, or organic solvent).
  • the system is a closed system that is shielded from the outside air, and this is filled with a raw material oil or a silver salt solution.
  • the hypoxic condition in the present specification means a condition having an oxygen concentration of less than 0.4%, more preferably 0.1% or less.
  • the method of the present invention is carried out under light shielding. By performing the method of the present invention under low oxygen conditions and shading, the pH of the silver salt solution is lowered, the oxidation of fats and oils in the raw material oil, the silver salt solution and the organic solvent is suppressed, and the silver salt solution is deteriorated and purified. It is possible to prevent deterioration of the PUFA-containing composition.
  • the organic solvent recovered in (5) above contains an EPA alkyl ester separated from the raw material oil. Therefore, the recovered organic solvent can be obtained as an EPA alkyl ester-containing composition. Further, if necessary, the recovered organic solvent may be purified by concentration, chromatography, distillation or the like to prepare a composition containing a higher concentration of EPA alkyl ester. The organic solvent after separating the EPA alkyl ester by purification can be reused for the extraction of the EPA alkyl ester in (4) above.
  • the EPA alkyl ester-containing composition obtained by the production method of the present invention contains 96% by mass or more of the EPA alkyl ester in the total fatty acids contained therein, and the ratio of the trans isomer in the EPA alkyl ester is It is 1.5% by mass or less, preferably 1% by mass or less. Further, according to the production method of the present invention, it is possible to achieve an EPA recovery rate of 90% or more, preferably 95% or more. Therefore, according to the production method of the present invention, a composition containing a high-purity EPA having a trans isomer ratio of 1.5% by mass or less at a high concentration of 96% by mass or more can be produced with a high yield. ..
  • EPA-E eicosapentaenoic acid ethyl ester
  • DHA-E docosahexaenoic acid ethyl ester
  • AA-E arachidonic acid ethyl ester
  • ETA-E eicosatetraenoic acid ethyl ester. ..
  • EPA-E recovery rate (mass (%) of EPA-E in product x amount of product) / (mass of EPA-E in raw material oil (%) x raw material mass) x 100
  • Example 1 30 g of the raw material oil 1 was thoroughly stirred and mixed with 14 mL of cyclohexane to dissolve it. 41 g of the obtained solution and 150 g of a silver salt solution (50 mass% silver nitrate aqueous solution) were added to the flask, and the mixture was stirred under a nitrogen atmosphere (oxygen concentration 0.4%) at 20 ° C. for 20 minutes at a speed of 300 rpm. The stirred liquid was allowed to stand at 20 ° C. for 15 minutes, and the separated organic layer and aqueous layer (silver salt solution containing PUFA-silver complex) were recovered.
  • a silver salt solution 50 mass% silver nitrate aqueous solution
  • the two obtained aqueous layers were mixed, 280 mL of cyclohexane was added, and the mixture was stirred at a speed of 300 rpm for 20 minutes under the condition of 60 ° C. to extract the PUFA ethyl ester in the aqueous layer into cyclohexane.
  • the liquid after stirring was allowed to stand, and the separated organic layer was recovered and then concentrated to obtain a PUFA ethyl ester-containing composition.
  • Example 2 A PUFA ethyl ester-containing composition was obtained in the same procedure as in Example 1 except that the raw material oil 2 was used.
  • Example 3 30 g of the raw material oil 3 was dissolved by stirring and mixing well with 35 mL of cyclohexane. 57 g of the obtained solution and 380 g of a silver salt solution (50 mass% silver nitrate aqueous solution) were added to a flask, and the mixture was stirred under a nitrogen atmosphere (oxygen concentration 0.4%) at 20 ° C. for 20 minutes at a speed of 300 rpm. The stirred liquid was allowed to stand at 20 ° C. for 15 minutes. The separated aqueous layer was collected, 15 mL of cyclohexane was added thereto, and the mixture was stirred at 20 ° C.
  • a silver salt solution 50 mass% silver nitrate aqueous solution
  • PUFA- aqueous layer
  • a silver salt solution containing a silver complex was recovered.
  • the obtained aqueous layer was heated to 60 ° C., 350 mL of cyclohexane was added, and the mixture was stirred under the condition of 60 ° C. for 20 minutes at a speed of 300 rpm to extract the PUFA ethyl ester in the aqueous layer into cyclohexane.
  • the liquid after stirring was allowed to stand, and the separated organic layer was recovered and then concentrated to obtain a PUFA ethyl ester-containing composition.
  • Example 4 A PUFA ethyl ester-containing composition was obtained in the same procedure as in Example 1 except that the raw material oil 4 was used.
  • Example 5 30 g of the raw material oil 11 was well stirred and mixed with 14 mL of cyclohexane to dissolve it. 41 g of the obtained solution and 120 g of a silver salt solution (50 mass% silver nitrate aqueous solution) were added to the flask, and the mixture was stirred under a nitrogen atmosphere (oxygen concentration 0.4%) at 20 ° C. for 20 minutes at a speed of 300 rpm. The stirred liquid was allowed to stand at 20 ° C. for 15 minutes, and the separated organic layer and aqueous layer (silver salt solution containing PUFA-silver complex) were recovered.
  • a silver salt solution 50 mass% silver nitrate aqueous solution
  • the two obtained aqueous layers were mixed, 450 mL of cyclohexane was added, and the mixture was stirred at a speed of 300 rpm for 20 minutes under the condition of 60 ° C. to extract the PUFA ethyl ester in the aqueous layer into cyclohexane.
  • the liquid after stirring was allowed to stand, and the separated organic layer was recovered and then concentrated to obtain a PUFA ethyl ester-containing composition.
  • Example 6 A PUFA ethyl ester-containing composition was obtained in the same procedure as in Example 5 except that the raw material oil 12 was used.
  • Example 7 A PUFA ethyl ester-containing composition was obtained in the same procedure as in Example 1 except that the raw material oil 13 was used.
  • PUFA- aqueous layer
  • a silver salt solution containing a silver complex was recovered.
  • the obtained aqueous layer was heated to 60 ° C., 350 mL of cyclohexane was added, and the mixture was stirred under the condition of 60 ° C. for 20 minutes at a speed of 300 rpm to extract the PUFA ethyl ester in the aqueous layer into cyclohexane.
  • the liquid after stirring was allowed to stand, and the separated organic layer was recovered and then concentrated to obtain a PUFA ethyl ester-containing composition.
  • Test 1 The fatty acid composition of the compositions obtained in Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1 to 6 was measured by the procedure of Reference Example 1. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, when the content of EPA-E in the raw material oil is high and the DHA-E / EPA-E ratio and the amount of EPA-E trans isomers are both low, EPA-E is added to the total fatty acids. A composition containing 96% by mass or more and having a trans isomer ratio in EPA-E of 1.5% by mass or less could be obtained. If the amount of EPA-E in the feedstock oil was too low, a product with a sufficiently high amount of EPA-E could not be obtained. Further, when the DHA-E / EPA-E ratio or the amount of EPA-E trans isomers increased, the EPA-E recovery rate tended to decrease.

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Abstract

高純度なＥＰＡを製造する方法の提供。ＥＰＡアルキルエステルを全脂肪酸中に９６質量％以上含有し、且つＥＰＡアルキルエステル中のトランス異性体の比率が１．５質量％以下であるＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法。本方法は、（１）ＥＰＡアルキルエステルを全脂肪酸中に５０～９２質量％含有する原料油を準備すること、該原料油に含有されるＥＰＡアルキルエステルに対するＤＨＡ酸アルキルエステルの質量比は３．３質量％以下であり、かつ該原料油に含有されるＥＰＡアルキルエステル中のトランス異性体の比率は２質量％以下である；（２）該原料油と、銀塩を含む水性溶液とを接触させること；（３）該原料油と接触させた銀塩を含む水性溶液を回収すること；（４）回収した銀塩を含む水性溶液と、有機溶媒とを接触させること；及び、（５）該銀塩を含む水性溶液と接触させた有機溶媒を回収することを含む。

Description

エイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物の製造方法
　本発明は、エイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物の製造方法に関する。
　高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の１種であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、近年その薬理効果が明らかとなり、医薬品や健康食品の原料として利用されている。医薬品や食品の原料として用いるＥＰＡには、極力不純物がなく高純度であることが求められている。とはいえ、ＥＰＡ等のＰＵＦＡは、二重結合を複数有するため、化学合成によって得ることは容易ではない。工業利用されるＥＰＡのほとんどは、ＥＰＡを豊富に含む海洋生物由来原料、例えば魚油などから抽出又は精製することによって製造されている。しかしながら、生物由来の油脂原料は、炭素数、二重結合の数や位置、さらには立体異性体の構成比などが異なる多種の脂肪酸の混合物であるため、目的とするＥＰＡの含有量は必ずしも高くない。また、海洋生物由来原料から精製したＥＰＡは、微量でも不純物を含有すると強い魚臭を発するため、カプセルへの封入やマスキング剤の添加などにより臭いを抑えなければ摂取時に不快感をもたらす。そのため、従来、生物由来の油脂原料からＥＰＡを選択的に精製することが求められている。
　ＰＵＦＡには、シス及びトランス型の異性体が存在する。生体内のＰＵＦＡはほとんどがシス体であるが、生物由来原料からの精製の段階で、加熱などによりシス体からトランス体に変換されることがある。したがって従来、生物由来原料から工業的に精製された熱履歴を有するＰＵＦＡは、ある程度の量のトランス異性体を含有する。しかしながら、トランス脂肪酸は、健康へのリスク、特にＬＤＬコレステロール値を上昇させ、心血管疾患のリスクを高めることが報告されている。医薬品や食品の原料として用いるＥＰＡにおいては、トランス脂肪酸の含有量を可能な限り低くすることが求められている。
　特許文献１～４には、ＥＰＡ等のＰＵＦＡを含む原料に銀塩を含む水溶液を混合してＰＵＦＡと銀塩との錯体を形成させた後、該錯体を含む水層を、有機溶媒による抽出（特許文献１）、加温による錯体の解離（特許文献２）、液膜への透過（特許文献３）、又は希釈、もしくは錯体解離剤や銀イオン還元剤の添加（特許文献４）に供することにより、該ＰＵＦＡやそのエステル等を取得する方法が記載されている。特許文献５には、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ等のＰＵＦＡを含む原料と銀塩を含む水性溶液の混合液を、特定温度に維持しながら有機溶媒と接触させた後、水相を回収し、次いで該水相に有機溶媒を添加した後、有機溶媒相を回収することによって、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡを選択的に精製することができることができることが記載されている。しかし、特許文献１～５に記載の方法では、銀塩を含む水溶液での処理の際にＥＰＡ以外のＰＵＦＡも銀塩との錯体を形成してしまうため、ＥＰＡを選択的に精製することは難しい。
　特許文献６には、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ等ＰＵＦＡを含む原料を銀塩を含む水性溶液と混合し、得られた水相に有機溶媒を添加し、得られた有機溶媒相を真空蒸留することにより、高濃度かつトランス体含量の低いＥＰＡを含む組成物を製造することが記載されている。特許文献７には、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ等のＰＵＦＡを含む原料を真空精密蒸留処理して、ＥＰＡ又はその低級アルコールエステルの含有量が５０重量％以上で、かつＥＰＡ以外のＰＵＦＡ又はその低級アルコールエステルの含有量が１０重量％以下の留分を採取し、次いで該留分を硝酸銀水溶液と混合し、上層の不純物成分を除去した後、有機溶媒と混合し、得られた有機溶媒相から有機溶媒を除去することにより、高純度ＥＰＡ又はその低級アルコールエステルを精製する方法が記載されている。
特許第３００１９５４号公報 特許第２７８６７４８号公報 特許第２９３５５５５号公報 特許第２８９５２５８号公報 特許第６２３４９０８号公報 国際公開公報第２０１４／０５４４３５号 特開平７－２４２８９５号公報
　従来、特許文献１～５に記載されるようなＰＵＦＡと銀塩との錯体形成を利用したＰＵＦＡ精製方法（いわゆる銀塩法）では、原料油と銀塩を含む水溶液との混合の際に、原料油中のＥＰＡ以外のＰＵＦＡも同時に錯体を形成してしまうため、純度の高いＥＰＡを得ることが難しかった。また、特許文献６～７に記載されるような蒸留と銀塩法とを組み合わせて用いるＰＵＦＡ精製方法は、より高濃度なＥＰＡ含有組成物の製造を可能にするが、真空蒸留のための設備を要するためコストがかかる。さらに、特許文献６～７に記載の方法においてもなお、ＥＰＡと、それに物性が似ているアラキドン酸（ＡＡ）やエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）等の他のＰＵＦＡとの分離は困難であり、高濃度かつ高純度でＥＰＡを含有する組成物を得ることは容易ではなかった。より簡便かつ低コストに、医薬品や健康食品の原料として使用できる高濃度かつ高純度でＥＰＡを含有する組成物を製造する方法が求められている。
　本発明者らは、特許文献１に記載されるようなＰＵＦＡと銀塩の錯体形成に基づくＰＵＦＡの精製方法において、銀塩を含む水性溶液で処理する原料油に特定の脂肪酸組成を有する油脂原料を用いることによって、高濃度かつ高純度にＥＰＡを含有する組成物を得ることができることを見出した。
　本発明は、以下を提供する。
〔１〕エイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物の製造方法であって、下記（１）～（５）：
（１）エイコサペンタエン酸アルキルエステルを全脂肪酸中に５０～９２質量％含有する原料油を準備すること、該原料油に含有されるエイコサペンタエン酸アルキルエステルに対するドコサヘキサエン酸アルキルエステルの質量比は３．３質量％以下であり、かつ該原料油に含有されるエイコサペンタエン酸アルキルエステル中のトランス異性体の比率は２質量％以下である；
（２）該原料油と、銀塩を含む水性溶液とを接触させること；
（３）該原料油と接触させた銀塩を含む水性溶液を回収すること；
（４）回収した銀塩を含む水性溶液と、有機溶媒とを接触させること；及び
（５）該銀塩を含む水性溶液と接触させた有機溶媒を回収することにより、エイコサペンタエン酸アルキルエステルを全脂肪酸中に９６質量％以上含有し、且つ該エイコサペンタエン酸アルキルエステル中のトランス異性体の比率が１．５質量％以下であるエイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物を製造すること、
を含む、方法。
〔２〕前記原料油中のエイコサペンタエン酸アルキルエステルの含有量が全脂肪酸中６０～８５質量％である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記原料油中におけるドコサヘキサエン酸アルキルエステルの含有量が全脂肪酸中２質量％以下である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記原料油中における、アラキドン酸アルキルエステルとエイコサテトラエン酸アルキルエステルとの合計含有量が、エイコサペンタエン酸アルキルエステル１００質量％に対して２６質量％以下である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕（３’）前記（３）において銀塩を含む水性溶液が回収された後の原料油を、新たに調製した銀塩を含む水性溶液と接触させ、次いで該原料油と接触させた銀塩を含む水性溶液を回収することをさらに含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記（４）が、前記（３）及び（３’）で回収した銀塩を含む水性溶液と有機溶媒とを接触させることを含む、〔５〕記載の方法。
〔７〕前記原料油と接触するときの前記銀塩を含む水性溶液の温度が５～３０℃である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記有機溶媒と接触するときの前記銀塩を含む水性溶液の温度が３０～８０℃である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
　本発明の方法によれば、ＥＰＡ以外のＰＵＦＡ含量が少なく、かつトランス異性体の比率が低い、高濃度かつ高純度でＥＰＡを含有する組成物を得ることができる。
発明の詳細な説明
　本発明は、ＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法を提供する。当該本発明の方法は：（１）ＥＰＡアルキルエステルを含有する原料油を準備すること；（２）該原料油と、銀塩を含む水性溶液とを接触させること；（３）該原料油と接触させた銀塩を含む水性溶液を回収すること；（４）回収した銀塩を含む水性溶液と、有機溶媒とを接触させること；及び、（５）該銀塩を含む水性溶液と接触させた有機溶媒を回収すること、を含む。
　本発明のＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法で用いられる原料油は、含有する脂肪酸中に主にＥＰＡを含む油脂組成物である。該原料油は、ＥＰＡを含有する生物由来の油脂から調製され得る。当該生物由来油脂の例としては、魚類等の海産動物やプランクトン由来の油脂、藻類等の微生物由来の油脂などが挙げられ、中でもイワシ、サバ、マグロ等の魚類由来の油脂、及び藻類由来の油脂が好ましい例として挙げられる。これらの生物由来油脂は、主に、１分子のグリセリンに３分子の脂肪酸が結合したトリグリセリドの形態で脂肪酸を含有する。また少量ではあるが、ジグリセリドやモノグリセリド、遊離脂肪酸を含有し得る。
　上述したＥＰＡを含有する生物由来の原料油を調製する方法としては、該ＥＰＡを含有する生物を加熱及び圧搾して油脂を取りだす方法、搾油された油脂を、さらに尿素処理、クロマトグラム処理、蒸留処理、超臨界処理等にかけて油脂分を分離する方法、などを挙げることができる。
　該原料油中のＰＵＦＡは、アルキルエステル化されている。原料油中のＰＵＦＡをアルキルエステル化することにより、本発明の製造方法において、目的とするＥＰＡを、ＥＰＡ以外の他のＰＵＦＡから効率よく分離することができる。当該ＰＵＦＡのアルキルエステルを構成するアルキル基としては、炭素数１～６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基又はエチル基であり、より好ましくはエチル基である。当該ＰＵＦＡのアルキルエステルは、ＰＵＦＡを含有する油脂と所望のアルキル基を有するアルコールとを公知の方法によりエステル化反応させることにより製造することができる。例えば、油脂中に含まれるＰＵＦＡトリグリセリドを、触媒又は酵素の存在下で低級アルコールと反応させてアルキルエステル化することにより、ＰＵＦＡのアルキルエステルを得ることができる。
　当該原料油におけるＥＰＡアルキルエステルの含有量は、該原料油の全脂肪酸中、５０～９２質量％、好ましくは５０～８５質量％、より好ましくは５０～７５質量％、さらに好ましくは６０～８５質量％、さらに好ましくは７０～８５質量％、さらに好ましくは７５～８５質量％である。全脂肪酸中におけるＥＰＡアルキルエステルの含量が５０質量％以上の原料油を用いることにより、最終的に、ＥＰＡを高濃度（全含有脂肪酸中９６質量％以上）で含む組成物を効率よく得ることができる。他方、原料油のコストの観点、及び後述するように原料油中のトランス異性体比率を低く保つ観点からは、該原料油におけるＥＰＡアルキルエステルの含有量は、９２質量％以下であればよいが、８５質量％以下がより好ましい。
　当該原料油は、ＥＰＡを主に含むが、ＥＰＡ以外の他のＰＵＦＡも含有し得る。当該他のＰＵＦＡとしては、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）などを挙げることができる。当該原料油におけるＤＨＡ、ＡＡ、ＥＴＡ等の、ＥＰＡ以外のＰＵＦＡのアルキルエステルの含有量は低いことが好ましい。より詳細には、該原料油におけるＥＰＡアルキルエステルに対するＤＨＡアルキルエステルの質量比は、ＥＰＡアルキルエステル１００質量％に対して、３．３質量％以下であればよいが、好ましくは２．７質量％以下、より好ましくは２．０質量％以下、さらに好ましくは１．０質量％以下である。好ましくは、該原料油におけるＤＨＡアルキルエステルの含有量は、該原料油の全脂肪酸中２質量％以下、より好ましくは１．５質量％以下である。また好ましくは、該原料油における、ＡＡアルキルエステルとＥＴＡアルキルエステルとの合計含有量の、ＥＰＡアルキルエステルの含有量に対する比率は、ＥＰＡアルキルエステル１００質量％に対して２６質量％以下、より好ましくは１５質量％以下、さらに好ましくは１１質量％以下である。
　上述したＥＰＡを高含有する原料油は、上述したＥＰＡを含有する生物、例えば魚類等の海産動物を加熱して圧搾し、次いで得られた油脂を含む生成物から、尿素処理、クロマトグラム処理、蒸留処理、超臨界処理等でさらに油脂分を分離することにより調製することができる。好適には、本発明で用いられる原料油は、蒸留等の熱処理を含む方法を用いて調製された原料油である。
　上述のような原料油調製過程での熱処理は、得られた原料油中に好ましくないトランス異性体を生成させることがある。そのような原料油の調製過程で生成されたトランス異性体を除去するために、本発明の方法は有用である。本発明の方法に用いられる原料油は、ＥＰＡアルキルエステルのトランス異性体を含有していてもよい。好ましくは、該原料油に含有されるＥＰＡアルキルエステル中のトランス異性体の比率は、２質量％以下、より好ましくは１．５質量％以下、さらに好ましくは１．０質量％以下である。ＥＰＡのトランス異性体比率が２質量％以下の原料油を用いることにより、最終的に、ＥＰＡを高濃度（全含有脂肪酸中９６質量％以上）で含有し、かつＥＰＡ中のトランス異性体の比率が原料油よりも低減しており、かつ１．５質量％以下である組成物を効率よく得ることができる。
　本発明の製造方法に用いられる原料油には、ＥＰＡアルキルエステルの含有量、及びその他のＰＵＦＡアルキルエステルの含有量やトランス異性体の含有量が上述した範囲にある限りにおいて、市販の油脂類を用いてもよい。コスト及び目的とするＥＰＡの収量の安定化の観点からは、含有するＰＵＦＡの種類や量が規格化された市販の魚油由来の油脂類を用いることが好ましい。
　製造されるＥＰＡアルキルエステル含有組成物の品質保持、及び銀塩を含む水性溶液の劣化防止の観点から、本発明の製造方法に用いられる原料油は、酸化指標が低いことが好ましい。脂質の酸化指標は、過酸化物価（ＰＯＶ）、酸価（ＡＶ）などで表すことができる。本発明で用いる原料油は、ＰＯＶ（ｍＥｑ／ｋｇ）が、好ましくは１０以下、より好ましくは５以下であるか、又はＡＶ（ｍｇ／ｇ）が、好ましくは０．３以下、より好ましくは０．２以下である。さらに好ましくは、該原料油は、ＰＯＶが１０以下かつＡＶが０．３以下であり、なお好ましくはＰＯＶが５以下かつＡＶが０．２以下である。ＰＯＶはヨウ素滴定法（ＩＳＯ　３９６０：２００７）などによって測定することができる。ＡＶは水酸化カリウム滴定法（ＩＳＯ　６６０：２００９）などによって測定することができる。
　油脂における全脂肪酸中の各構成脂肪酸の質量は、ガスクロマトグラフィー（例えば後述する参考例１に記載の方法）により測定することができる。
　本発明のＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法において、上述した原料油は、液体の形態で適用されることが好ましい。当該原料油は、各工程での反応温度において液体の形態である場合は、そのまま本発明の方法の各工程に適用され得る。各工程での反応温度において固体の形態である場合は、当該原料油は、適宜有機溶媒や他の油に溶解又は希釈して適用され得る。該有機溶媒としては、下記工程（２）～（３）を遂行するために、水と分離可能な有機溶媒が使用され、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン等が挙げられる。
　本発明のＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法においては、まず、（１）上述した特定量でＥＰＡアルキルエステル及びその他のＰＵＦＡアルキルエステルを含有する原料油を準備する。好ましくは、このような組成の原料油は、上述したように熱処理を含む方法を用いて調製された、熱履歴を有する原料油である。次いで、該（１）で準備された原料油に対して、下記（２）及び（３）の工程を行う：
（２）該原料油と、銀塩を含む水性溶液（以下、銀塩溶液ともいう）とを接触させること；
（３）該原料油と接触させた銀塩溶液を回収すること。
　当該（２）及び（３）の工程は、ＰＵＦＡの炭素－炭素二重結合部に銀塩が錯体を形成することにより、ＥＰＡを含むＰＵＦＡアルキルエステルの抽出溶媒への溶解性が変わることを利用して、原料油からＥＰＡアルキルエステルを分離する工程である。該工程は、例えば、特許文献１～６等に記載されている方法に従って行うことができる。
　当該銀塩としては、ＰＵＦＡの不飽和結合と錯体を形成し得るものであれば特に制限されず、例えば硝酸銀、過塩素酸銀、四フッ化ホウ素酸銀、酢酸銀等が挙げられる。このうち、硝酸銀が好ましい。該銀塩溶液の溶媒としては、水、又は水とグリセリンやエチレングリコール等の水酸基を有する化合物との混合媒体が挙げられるが、好ましくは水が用いられる。該銀塩溶液中の銀塩濃度は、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上であればよいが、好ましくは１～２０ｍｏｌ／Ｌ程度である。原料油中のＰＵＦＡと銀塩とのモル比は、１：１００～１００：１、好ましくは１：５～１：１程度であるとよい。原料油中のＰＵＦＡのモル数は、原料油中のＰＵＦＡの総質量をＰＵＦＡの平均分子量で除することで算出できる。ＰＵＦＡの平均分子量は、各ＰＵＦＡの分子量と原料油中での組成比から算出できる。原料油中のＰＵＦＡの総質量及び組成比は、ガスクロマトグラフィー（例えば後述する参考例１に記載の条件での）を用いて算出することができる。
　上記（２）において、原料油と銀塩溶液とを接触させる手段は特に限定されない。例えば、反応槽に原料油と銀塩溶液をそれぞれ投入して、該反応槽内でそれらを接触させてもよく、又は、予め混合した原料油と銀塩溶液を反応槽に投入することで、該反応槽内でそれらを接触させてもよい。あるいは、ＷＯ２０１７／１９１８２１に記載される方法に従って、銀塩溶液の液滴を、反応槽に満たした原料油中に通過させることで、該原料油と銀塩溶液とを接触させてもよい。
　上記（２）において、当該原料油と接触するときの銀塩溶液の温度（該原料油と銀塩溶液との接触の際の反応温度）は、好ましくは約８０℃以下、５℃以上であればよく、より好ましくは５～３０℃、さらに好ましくは１５～３０℃である。該反応温度を上記範囲に維持するための方法としては、該原料油及び／又は銀塩溶液を上記範囲に加温又は冷却した後、それらを接触させる方法、該原料油と銀塩溶液とを接触させるための反応槽の温度を上記範囲に維持する方法、及びそれらの方法の組み合わせが挙げられる。該（２）において、原料油と銀塩溶液との接触の時間は、好ましくは５分～４時間、より好ましくは１０分～２時間である。
　原料油と銀塩溶液との接触により、銀塩溶液中にＰＵＦＡと銀との錯体（本明細書においてＰＵＦＡ－銀錯体とも称する）が生成される。形成された錯体は、水層、すなわち銀塩溶液に移行する。次いで、上記（３）において、原料油と接触させた銀塩溶液を回収することによってＰＵＦＡ－銀錯体を含む液を取得することができる。
　上記（２）及び（３）における原料油と銀塩溶液との接触、及び該接触後の銀塩溶液の回収は、バッチ方式により行われてもよく、また連続方式により行われてもよい。例えば、バッチ方式では、ＥＰＡアルキルエステルを含む原料油に銀塩溶液を添加し、攪拌しながら原料油と銀塩溶液とを接触させた後、混合液を静置して水層を分離させ、これを回収すればよい。連続方式では、例えば、銀塩溶液の液滴を反応槽に満たした原料油中に通過させる際に、銀塩溶液を連続的に反応槽に投入する一方、通過後の銀塩溶液を連続的に回収するか、又は蓄積して回収すればよい。連続方式の別の例では、反応槽として流路型攪拌機を用いる。攪拌機の一方の口から原料油と銀塩溶液を投入し、これらを撹拌しながら他方の口へと移送して分離槽へと送り出し、分離槽で水層を分離して回収すればよい。
　好ましくは、本発明の製造方法は、上記（３）に続いて、以下の工程：
（３’）該（３）において銀塩溶液が回収された後の原料油を、新たな銀塩溶液と接触させ、次いで該原料油と接触させた銀塩溶液を回収すること、
をさらに含む。該（３）で銀塩溶液から分離された原料油には、錯体化されなかったＥＰＡがなお含まれていることがある。そのため、分離した原料油を、新たな銀塩溶液と接触させることで、該原料油中に残存するＰＵＦＡをＰＵＦＡ－銀錯体に変換することができるので、ＥＰＡの回収率（原料油中ＥＰＡ量に対する回収したＥＰＡ量の割合）が向上する。該（３’）において、該原料油と接触させる新たな銀塩溶液としては、新たに調製した銀塩溶液を用いてもよく、又は後述の（５）の工程でＰＵＦＡを回収された銀塩溶液を、必要に応じて洗浄した後、再使用してもよい。原料油と銀塩溶液との接触の際の条件（温度等）は、上記（２）について記載した条件の範囲内で適宜設定可能である。該（３’）の工程は、２回以上繰り返してもよい。その場合、１回目の該（３’）で銀塩溶液から分離された原料油を、２回目の該（３’）に供し、必要に応じてこれを繰り返す。該（３’）で用いる原料油は、ＥＰＡアルキルエステルを全脂肪酸中に５質量％以上含有していることが好ましい。原料油中のＥＰＡアルキルエステル含有量に応じて、該（３’）の回数を適宜決定することができる。該（３’）で回収された銀塩溶液は、別途回収されたＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液と合一して、後述するＰＵＦＡアルキルエステルの抽出工程（下記（４）及び（５））に供することもでき、又はそれ単独で該抽出工程に供することもできる。
　上記で回収したＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液は、ＰＵＦＡアルキルエステルの抽出工程（下記（４）及び（５））に用いられる。必要に応じて、回収したＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液を、該抽出工程に用いる前に、有機溶媒で洗浄してもよい。該洗浄では、該回収した銀塩溶液を有機溶媒と接触、好ましくは撹拌した後、水層を分離、回収すればよい。該洗浄に用いる有機溶媒は、上述した原料油の溶解に用いることができる有機溶媒であればよい。洗浄の条件（温度等）は、上記（２）について記載した条件の範囲内で適宜設定可能である。
　本発明のＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法においては、上述したＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液の回収に続いて、下記（４）及び（５）を行う：
（４）回収した銀塩溶液と、有機溶媒とを接触させること；
（５）該銀塩溶液と接触させた有機溶媒を回収すること。
　当該（４）及び（５）の工程は、上記（３）で回収したＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液に有機溶媒を添加し、該溶液中のＥＰＡアルキルエステルを有機溶媒に抽出させた後、該ＥＰＡアルキルエステルを含む有機溶媒を回収する工程である。該工程は、例えば、特許文献１、５等に記載されている方法に従って行うことができる。
　上記（４）で用いる有機溶媒としては、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の、ＰＵＦＡへの溶解性が高く、かつ水と分離可能な溶媒が挙げられる。このうち、ヘキサン又はシクロヘキサンが好ましい。銀塩溶液と有機溶媒の量としては、体積比として、好ましくは１００：３～３００、より好ましくは１００：３～２００である。
　有機溶媒と銀塩溶液とを接触させる手段は特に限定されない。例えば、反応槽から回収された銀塩溶液は、銀塩溶液と有機溶媒との接触のための抽出槽に移送され、そこで有機溶媒と接触する。該有機溶媒と銀塩溶液との接触により、該銀塩溶液中のＰＵＦＡアルキルエステルが有機溶媒に移行する。次いで、上記（５）において、銀塩溶液と接触させた有機溶媒を回収することによって目的のＥＰＡアルキルエステルを含有する有機溶媒を取得することができる。
　好ましくは、当該有機溶媒と接触するときの銀塩溶液の温度（該有機溶媒と銀塩溶液との接触の際の反応温度）は、上記（２）での反応温度、すなわちＰＵＦＡ－銀錯体の生成温度よりも高い温度になるようにする。より好ましくは上記（２）での反応温度、すなわち該錯体の生成温度よりも２０℃以上高い温度にする。例えば、工程（４）での反応温度は、好ましくは３０～８０℃、より好ましくは５０～７０℃である。該反応温度を上記範囲に維持するための方法としては、銀塩溶液及び／又は有機溶媒を上記範囲に加温した後、それらを接触させる方法、抽出槽の温度を上記範囲に維持する方法、及びそれらの方法の組み合わせが挙げられる。該（４）において、有機溶媒と銀塩溶液との接触の時間は、好ましくは５分～４時間、より好ましくは１０分～２時間、さらに好ましくは３０分～２時間である。
　上記（４）及び（５）における有機溶媒と銀塩溶液との接触、及び該接触後の有機溶媒の回収は、バッチ方式により行われてもよく、また連続方式により行われてもよい。例えば、バッチ方式では、有機溶媒に銀塩溶液を添加し、攪拌しながら有機溶媒と銀塩溶液とを接触させた後、混合液を静置して有機溶媒層を分離させ、これを回収すればよい。連続方式の例では、抽出槽として流路型攪拌機を用いる。攪拌機の一方の口から有機溶媒と銀塩溶液を投入し、これらを撹拌しながら他方の口へと移送して分離槽へと送り出し、分離槽で有機溶媒層を分離して回収すればよい。
　上記の工程で有機溶媒から分離された銀塩溶液は、必要に応じて、再度有機溶媒と接触させてもよい。例えば、上記の工程で有機溶媒から分離された銀塩溶液を、必要に応じて別途行われた上記（３）で回収した追加の銀塩溶液とともに、有機溶媒に添加する。ここで用いる有機溶媒には、上記の工程で回収したものを再使用してもよく、又は一部もしくは全部に新たな有機溶媒を用いてもよい。接触の際の条件（温度等）は、上記（４）と同様にすればよい。この操作をさらに繰り返してもよい。該有機溶媒と銀塩溶液との再度の接触によりＰＵＦＡアルキルエステルがさらに抽出されるので、目的のＥＰＡアルキルエステルをより多く回収することができる。
　さらに、回収した有機溶媒をシリカゲル、活性炭、二酸化ケイ素などの吸着剤に通液することにより、残留する銀イオンをさらに除去してもよい。
　なお、上記の工程で有機溶媒から分離された銀塩溶液は、再度原料油と接触させてもよい。ここで用いる原料油には、ＥＰＡアルキルエステルの含有量、及びその他のＰＵＦＡアルキルエステルの含有量やトランス異性体の含有量が上述した範囲にある限りにおいて、上記の工程で銀塩溶液から分離したものを再使用してもよく、又は一部もしくは全部に新たな原料油を用いてもよい。該接触の際の条件（温度等）は、上記（２）と同様にすればよい。この操作をさらに繰り返してもよい。該原料油と銀塩溶液との再度の接触により多くのＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液を回収することができる。
　好ましくは、以上の本発明の製造方法の手順は、低酸素条件下で行われる。低酸素条件は、例えば、本発明の方法の系（例えば反応槽、抽出槽、分離槽、それらの連絡路等）を外気から遮断した密閉系とすること、系内部を窒素雰囲気下におくこと、系内部に液体（原料油、銀塩溶液、又は有機溶媒）を満たすこと、などにより達成することができる。好ましくは、系を外気から遮断した密閉系とし、これに原料油又は銀塩溶液を満たす。反応槽及び抽出槽でのプロセスを連続方式で行う場合、一旦系に液体を満たしてしまえば、あとは低酸素状態を維持することができる。好ましくは、本明細書における低酸素条件とは、酸素濃度０．４％未満、より好ましくは０．１％以下の条件をいう。また好ましくは、本発明の方法は、遮光下で行われる。本発明の方法を低酸素条件及び遮光下で行うことにより、銀塩溶液のｐＨ低下や、原料油、銀塩溶液及び有機溶媒中の油脂の酸化を抑制し、銀塩溶液の劣化や精製されるＰＵＦＡ含有組成物の劣化を防止することができる。
　本発明のＥＰＡアルキルエステル含有組成物の製造方法において、上記（５）で回収された有機溶媒は、原料油から分離されたＥＰＡのアルキルエステルを含有する。したがって、該回収された有機溶媒は、ＥＰＡアルキルエステル含有組成物として取得され得る。さらに必要に応じて、該回収された有機溶媒を、濃縮、クロマトグラフィー、蒸留などにより精製して、ＥＰＡアルキルエステルをより高濃度で含む組成物を調製してもよい。なお、精製によりＥＰＡアルキルエステルを分離した後の有機溶媒は、上記（４）におけるＥＰＡアルキルエステルの抽出に再使用することができる。
　本発明の製造方法により得られたＥＰＡアルキルエステル含有組成物は、含有する全脂肪酸中に、ＥＰＡのアルキルエステルを、９６質量％以上含有し、かつ該ＥＰＡアルキルエステル中のトランス異性体の比率は１．５質量％以下、好ましくは１質量％以下である。また、本発明の製造方法によれば、９０％以上、好ましくは９５％以上のＥＰＡ回収率を達成することが可能である。したがって、本発明の製造方法によれば、９６質量％以上の高濃度で、トランス異性体比率が１．５質量％以下の高純度ＥＰＡを含有する組成物を、高収量で製造することができる。
　以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
（参考例１）脂肪酸組成比の分析
　測定試料１２．５ｍｇをｎ－ヘキサン１ｍＬに希釈し、ガスクロマトグラフィー分析装置（Type 7890 GC；Agilent Technologies製）を用いて、以下の条件にて全脂肪酸中における各脂肪酸の含有比を分析した。結果は、クロマトグラムの面積から換算した質量％として表した。
＜注入口条件＞
　注入口温度：250℃、スプリット比：10
＜カラム条件＞
　カラム：Ｊ＆Ｗ社製ＤＢ－ＷＡＸ　0.25mm×30m
　カラム温度：210℃
　Ｈｅ流量：1.0 mL/min、Ｈｅ圧力：20 PSI
＜検出条件＞
　Ｈ2流量：40 mL/min、Ａｉｒ流量：450 mL/min
　Ｈｅ流量：1.00 mL/min、ＤＥＴ温度：260℃
　分析した脂肪酸は、以下のとおりである：ＥＰＡ－Ｅ：エイコサペンタエン酸エチルエステル、ＤＨＡ－Ｅ：ドコサヘキサエン酸エチルエステル、ＡＡ－Ｅ：アラキドン酸エチルエステル、ＥＴＡ－Ｅ：エイコサテトラエン酸エチルエステル。
　ＥＰＡ－Ｅ回収率は、以下の式により計算した。
　　ＥＰＡ－Ｅ回収率（％）＝（生成物中におけるＥＰＡ－Ｅの質量（％）×生成物質量）／（原料油中におけるＥＰＡ－Ｅの質量（％）×原料質量）×１００
（原料油）
　蒸留精製によって表１に示す脂肪酸組成を有する原料油１～１３を準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例１）
　３０ｇの原料油１をシクロヘキサン１４ｍＬとよく攪拌混合して溶解させた。得られた溶液４１ｇと銀塩溶液（５０質量％硝酸銀水溶液）１５０ｇをフラスコに加え、窒素雰囲気（酸素濃度０．４％）下、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌した。攪拌後の液体を１５分間、２０℃で静置し、分離した有機層と水層（ＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液）をそれぞれ回収した。回収した有機層に新たに調製した銀塩溶液１５０ｇを加え、窒素雰囲気（酸素濃度０．４％）下、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌し、攪拌後の液体を１５分間、２０℃で静置した。分離した水層を回収し、これにシクロヘキサン１５ｍＬを加え、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、撹拌後の液体を１５分間、２０℃で静置し、分離した水層（ＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液）を回収した。得られた２つの水層を混合し、シクロヘキサン２８０ｍＬを加え、６０℃の条件下で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌して、水層中のＰＵＦＡエチルエステルをシクロヘキサン中に抽出した。攪拌後の液体を静置し、分離した有機層を回収した後、濃縮してＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（実施例２）
　原料油２を使用した以外は、実施例１と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（実施例３）
　３０ｇの原料油３をシクロヘキサン３５ｍＬとよく攪拌混合して溶解させた。得られた溶液５７ｇと銀塩溶液（５０質量％硝酸銀水溶液）３８０ｇとをフラスコに加え、窒素雰囲気（酸素濃度０．４％）下、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌した。攪拌後の液体を１５分間、２０℃で静置した。分離した水層を回収し、これにシクロヘキサン１５ｍＬを加え、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、撹拌後の液体を１５分間、２０℃で静置し、分離した水層（ＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液）を回収した。得られた水層を６０℃に加温し、シクロヘキサン３５０ｍＬを加え、６０℃の条件下で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌して、水層中のＰＵＦＡエチルエステルをシクロヘキサン中に抽出した。攪拌後の液体を静置し、分離した有機層を回収した後、濃縮してＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
(実施例４)
　原料油４を使用した以外は、実施例１と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（実施例５）
　３０ｇの原料油１１をシクロヘキサン１４ｍＬとよく攪拌混合して溶解させた。得られた溶液４１ｇと銀塩溶液（５０質量％硝酸銀水溶液）１２０ｇをフラスコに加え、窒素雰囲気（酸素濃度０．４％）下、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌した。攪拌後の液体を１５分間、２０℃で静置し、分離した有機層と水層（ＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液）をそれぞれ回収した。回収した有機層に新たに調製した銀塩溶液１２０ｇを加え、窒素雰囲気（酸素濃度０．４％）下、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌し、攪拌後の液体を１５分間、２０℃で静置した。分離した水層を回収し、これにシクロヘキサン６０ｍＬを加え、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、撹拌後の液体を１５分間、２０℃で静置し、分離した水層（ＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液）を回収した。得られた２つの水層を混合し、シクロヘキサン４５０ｍＬを加え、６０℃の条件下で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌して、水層中のＰＵＦＡエチルエステルをシクロヘキサン中に抽出した。攪拌後の液体を静置し、分離した有機層を回収した後、濃縮してＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（実施例６）
　原料油１２を使用した以外は、実施例５と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（実施例７）
　原料油１３を使用した以外は、実施例１と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（比較例１）
　原料油５を使用した以外は、実施例１と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（比較例２）
　原料油６を使用した以外は、実施例３と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（比較例３）
　原料油７を使用した以外は、実施例１と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（比較例４）
　３０ｇの原料油８をシクロヘキサン７０ｍＬとよく攪拌混合して溶解させた。得られた溶液８４ｇと銀塩溶液（５０質量％硝酸銀水溶液）３８０ｇとをフラスコに加え、窒素雰囲気（酸素濃度０．４％）下、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌した。攪拌後の液体を１５分間、２０℃で静置した。分離した水層を回収し、これにシクロヘキサン３８ｍＬを加え、２０℃で２０分間、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、撹拌後の液体を１５分間、２０℃で静置し、分離した水層（ＰＵＦＡ－銀錯体を含む銀塩溶液）を回収した。得られた水層を６０℃に加温し、シクロヘキサン３５０ｍＬを加え、６０℃の条件下で２０分間、３００ｒｐｍの速度にて攪拌して、水層中のＰＵＦＡエチルエステルをシクロヘキサン中に抽出した。攪拌後の液体を静置し、分離した有機層を回収した後、濃縮してＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（比較例５～６）
　原料油９～１０を使用した以外は、比較例４と同様の手順でＰＵＦＡエチルエステル含有組成物を得た。
（試験１）
　実施例１～７及び比較例１～６で得られた組成物の脂肪酸組成を参考例１の手順で測定した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、原料油におけるＥＰＡ－Ｅの含有量が高く、かつＤＨＡ－Ｅ／ＥＰＡ－Ｅ比、及びＥＰＡ－Ｅトランス異性体量がいずれも低い場合、全脂肪酸中にＥＰＡ－Ｅを９６質量％以上含有し、かつＥＰＡ－Ｅ中のトランス異性体の比率が１．５質量％以下である組成物を得ることができた。原料油中のＥＰＡ－Ｅ量が低すぎると、ＥＰＡ－Ｅ量が充分に高い生成物を得られなかった。またＤＨＡ－Ｅ／ＥＰＡ－Ｅ比又はＥＰＡ－Ｅトランス異性体量が高くなると、ＥＰＡ－Ｅ回収率が低下する傾向があった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (8)

  1. 　エイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物の製造方法であって、下記（１）～（５）：
    （１）エイコサペンタエン酸アルキルエステルを全脂肪酸中に５０～９２質量％含有する原料油を準備すること、該原料油に含有されるエイコサペンタエン酸アルキルエステルに対するドコサヘキサエン酸アルキルエステルの質量比は３．３質量％以下であり、かつ該原料油に含有されるエイコサペンタエン酸アルキルエステル中のトランス異性体の比率は２質量％以下である；
    （２）該原料油と、銀塩を含む水性溶液とを接触させること；
    （３）該原料油と接触させた銀塩を含む水性溶液を回収すること；
    （４）回収した銀塩を含む水性溶液と、有機溶媒とを接触させること；及び
    （５）該銀塩を含む水性溶液と接触させた有機溶媒を回収することにより、エイコサペンタエン酸アルキルエステルを全脂肪酸中に９６質量％以上含有し、且つ該エイコサペンタエン酸アルキルエステル中のトランス異性体の比率が１．５質量％以下であるエイコサペンタエン酸アルキルエステル含有組成物を製造すること、
    を含む、方法。
  2. 　前記原料油中のエイコサペンタエン酸アルキルエステルの含有量が全脂肪酸中６０～８５質量％である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記原料油中におけるドコサヘキサエン酸アルキルエステルの含有量が全脂肪酸中２質量％以下である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記原料油中における、アラキドン酸アルキルエステルとエイコサテトラエン酸アルキルエステルとの合計含有量が、エイコサペンタエン酸アルキルエステル１００質量％に対して２６質量％以下である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　（３’）前記（３）において銀塩を含む水性溶液が回収された後の原料油を、新たに調製した銀塩を含む水性溶液と接触させ、次いで該原料油と接触させた銀塩を含む水性溶液を回収することをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記（４）が、前記（３）及び（３’）で回収した銀塩を含む水性溶液と有機溶媒とを接触させることを含む、請求項５記載の方法。
  7. 　前記原料油と接触するときの前記銀塩を含む水性溶液の温度が５～３０℃である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記有機溶媒と接触するときの前記銀塩を含む水性溶液の温度が３０～８０℃である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
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