WO2021200911A1

WO2021200911A1 - フローサイトメーター

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Publication number: WO2021200911A1
Application number: PCT/JP2021/013478
Authority: WO
Inventors: 亨今井; 圭亮戸田; 禎生太田
Original assignee: Thinkcyte Inc; University of Tokyo NUC
Current assignee: Thinkcyte Inc; University of Tokyo NUC
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2022-10-01
Also published as: CN115349083B; EP4130714A1; JP7656837B2; US20230090631A1; EP4130714A4; US12339217B2; CN115349083A; CN121476024A; JPWO2021200911A1

Abstract

フローサイトメーターは、観察対象物が流体と共に流れ得る流路と、空間光変調デバイスと、第１の光学素子とを備える照明光学系と、第１の光検出器を備える検出光学系と、を備え、照明光学系は、光源と第１の光学素子によって結像される光の流路内の結像位置との間の第１の光路に設置されて、光源から発せられた光が観察対象物の方へ進行することを妨げる第１の領域を有する第１の空間フィルターをさらに備え、検出光学系は、第１の光検出器と結像位置との間の第２の光路に設置されて、観察対象物によって変調された光を第１の光検出器の方へ進行させる第２の領域を有する第２の空間フィルターをさらに備え、第１の領域の位置と第２の領域の位置とは略光学的に共役な関係にある。

Description

フローサイトメーター

　本発明は、フローサイトメーターに関する。
　本願は、２０２０年４月１日に、日本に出願された特願２０２０－０６５９４０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　近年のｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）などの幹細胞を用いた再生医療や、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔ　ｃｅｌｌによる免疫療法などの新しい治療法の実用化に向けた動きが活発化しており、細胞群に含まれる個々の細胞を細胞単位で解析を行うことに対する強い需要が生じてきている。
　このような一細胞（シングルセル）による解析を行う場合における細胞計測技術として、フローサイトメトリー法が提案されている。このフローサイトメトリー法は、個々の細胞を流体中に分散させ、その流体を微細に流下させて光学的に分析する技術であり、この技術を用いた装置をフローサイトメーターと呼ぶ（特許文献１）。このフローサイトメトリー法では、流路中に観察対象となる細胞等の微粒子を高速に流下しながら励起光を照射し、個々の細胞から発せられる蛍光輝度や散乱光の総量を取得することよって、観察対象物を評価することができる。

　しかしながら、こうした蛍光輝度や散乱光の総量など限定的な情報に基づく測定法では、細胞の形態情報や細胞内の分子局在等の二次元空間的な測定対象の特徴を捉え評価することが難しく、より詳細に細胞の形態を描写できる解像度の高い情報が取得できるフローサイトメトリー手段として、構造化（符号化）された照明である構造化照明を細胞等の観察対象物に照射し、観察対象物が発する蛍光やその他の光特性の変調信号を検出する方法が提案されている。この方法を用いることで、従来の蛍光輝度や散乱光の総量を取得するフローサイトメトリーに比べて、より豊富で詳細な細胞の形態情報を取得することができる。この方法の一例として、例えば、ゴーストサイトメトリー技術が知られている（特許文献２）。

　変調信号の中でも、特に光照射を受けた細胞から発せられる散乱光は、細胞の形や内部構造などの形態情報と関連し、散乱光が散乱される方向によってそれらの形態情報のうちいずれかを取得できることが知られている。そのため、フローサイトメトリーにおいても、細胞を蛍光と組み合わせて散乱光を測定し、その測定結果に基づいてサンプルに含まれる所望の細胞を識別して分取する手法が知られている（特許文献３）。

特開２０１１－９９８４８号公報国際公開第２０１７／０７３７３７号特開２０１６－７３２１０号公報

　本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、構造化照明を用いたフローサイトメトリーにおいて従来に比べて簡便な機構で散乱光等の測定対象物による変調光を検出できる手段を提供する。上記のような構造化照明を用いたフローサイトメトリーでは、測定対象物に構造化した照明を照射する必要があるため、検出器に直接光あるいは反射光が入射することを回避しながら各方向に散乱される散乱光を検出することが難しい。そのため、十分高いシグナル・ノイズ比を実現する散乱光の検出手段を構造化照明を用いたフローサイトメトリーにおいて簡便な機構で提供する方法はこれまで提案されていなかった。

　本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、本発明の一態様は、観察対象物が流体と共に流れ得る流路と、光源と、前記光源から発せられた光を変調する空間光変調デバイスと、前記空間光変調デバイスによって変調された光を前記流路内に結像する第１の光学素子とを備える照明光学系と、前記第１の光学素子によって結像された光が前記流路内を流れる前記観察対象物によって変調された光を検出する第１の光検出器を備える検出光学系と、を備えるフローサイトメーターであって、前記照明光学系は、前記光源と前記第１の光学素子によって結像される光の前記流路内の結像位置との間の第１の光路に設置されて、前記光源から発せられた光が前記観察対象物の方へ進行することを妨げる第１の領域を有する第１の空間フィルターをさらに備え、前記検出光学系は、前記第１の光検出器と前記流路内の前記結像位置との間の第２の光路に設置されて、前記観察対象物によって変調された光を前記第１の光検出器の方へ進行させる第２の領域を有する第２の空間フィルターをさらに備え、前記第１の領域の位置と前記第２の領域の位置とが略光学的に共役な関係に設置されているフローサイトメーターである。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の空間フィルターが備えられない場合に前記空間光変調デバイスによって変調された光が前記観察対象物を透過して前記第２の空間フィルターを照射する領域と前記第２の領域とが重なる領域は、前記空間光変調デバイスによって変調された光によって前記第１の空間フィルターが照射される領域と前記第１の領域とが重なる領域が前記第２の空間フィルターに結像された像が前記第２の空間フィルターにおいて占める領域と略同一か、または当該領域に包含される。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の光検出器によって検出される前記流路内を流れる前記観察対象物によって変調された光が散乱光あるいは回折光である。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の領域は、前記光源から発せられた光が前記観察対象物の方へ進行することを、当該光の透過、遮断、回折、または反射のいずれかによって妨げる。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の空間フィルターの面のうち、前記結像位置に面する側に位置する面において、前記第１の領域と対向する領域のすべてまたは一部の領域が、前記光源から発せられた光が前記観察対象物によって散乱された散乱光を反射する部材によって構成されており、前記検出光学系は、前記部材によって反射された前記散乱光を検出する第２の光検出器をさらに備える。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の空間フィルターの面のうち、前記結像位置に面する側に位置する面において、前記第１の領域と対向する領域のすべてまたは一部の領域が、前記光源から発せられた光が前記観察対象物によって散乱された散乱光を透過させる部材によって構成されており、前記検出光学系は、前記部材によって透過させられた前記散乱光を検出する第２の光検出器をさらに備える。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の空間フィルターと前記空間光変調デバイスとが一体となって備えられる。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第２の空間フィルターは、前記第１の空間フィルターによって兼ねられている。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第１の光検出器は、前記観察対象物を透過した光のうち前記第２の空間フィルターにおける前記第２の領域以外の領域の全てあるいはその一部を通過する光の強度あるいは位相を変調し、前記第２の領域以外の領域を通過して位相を変調された光と、前記観察対象物によって変調された光のうち前記第２の領域を通過した光との位相差を検出する。

　また、本発明の一態様は、上記のフローサイトメーターにおいて、前記第２の光路に配置されて、前記観察対象物によって変調された光の一部を取り出すビームスプリッターと、前記ビームスプリッターによって取り出された前記変調された光を透過させる第３の領域を有する第３の空間フィルターと、前記第３の領域を透過した前記変調された光を検出する第２の光検出器をさらに備える。

　本発明によれば、構造化照明を用いたフローサイトメトリーにおいて、従来に比べて簡便な機構で観察対象物による変調光を検出できる。本発明によれば、照明照射により観察対象物から発せられる散乱光などの変調された光を高いシグナル・ノイズ比で検出でき、観察対象物の詳細な形態情報を従来に比べて高い解像度で取得できる。それにより、目的細胞などの観察対象物を蛍光標識等によりラベル付けすることなく（以下、ラベルフリーとも表記する）非侵襲で形態情報に基づいて高速で分離することが可能になる。

本発明の第１の実施形態に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の第１の実施形態に係るフローサイトメーターに含まれる第１の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の第１の実施形態に係るフローサイトメーターに含まれる第２の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の第１の実施形態の変形例に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の第１の実施形態の変形例に係るフローサイトメーターに含まれる第１の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の第１の実施形態の変形例に係るフローサイトメーターに含まれる第２の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の第２の実施形態に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の第２の実施形態に係るフローサイトメーターに含まれる第１の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の第２の実施形態の変形例に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の第３の実施形態に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の第３の実施形態の変形例に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の各実施形態の変形例に係る空間光変調デバイスと一体である第１の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の各実施形態の変形例に係る空間光変調デバイスと一体である第１の空間フィルターによって空間的に分離された光の光路の一例を示す図である。本発明の各実施形態の変形例に係るミラーを備える第１の空間フィルターの構成の一例を示す図である。本発明の各実施形態の変形例に係るミラーを備える第１の空間フィルターによって空間的に分離された光の光路の一例を示す図である。本発明の第４の実施形態に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。本発明の第４の実施形態の変形例に係るフローサイトメーターの構成の一例を示す図である。

（第１の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳しく説明する。
　図１は、本実施形態に係るフローサイトメーター１の構成の一例を示す図である。フローサイトメーター１は、流路（不図示）と、照明光学系２と、検出光学系３とを備える。流路には、観察対象物５が流体と共に流れ得る。観察対象物５とは、形態情報を取得する対象であり、一例として、細胞である。観察対象物５は、細菌等の微粒子であってもよい。

　ここで図１には、３次元直交座標系として、ｘｙｚ座標系を示す。ｘ軸方向は、流路の長さ方向である。また、ｙ軸方向は、流路の幅方向である。また、ｚ軸方向は、流路と直交する方向であって、流路の高さ方向である。

　照明光学系２は、構造化照明４によって観察対象物５を流路内で照射するための光学系である。フローサイトメーター１では、構造化照明４が観察対象物５によって散乱された前方散乱光を検出光学系３によって検出する。前方散乱光とは、観察対象物５による散乱光のうちｚ軸の正の方向に散乱される光である。フローサイトメーター１では、いわゆる暗視野観察の原理に基づいて散乱光を検出する。

　照明光学系２の照明光の光路を第１の光路２４という。第１の光路２４は、ｚ軸に平行である。図１では、第１の光路２４の例として、第１の光路２４－１と、第１の光路２４－２とが示されている。照明光学系２は、光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２と、第１対物レンズ２３とを備える。光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２と、第１対物レンズ２３とは、この順に、照明光が流路を流れる観察対象物５に向かう方向に第１の光路２４上に備えられる。

　光源２０は、一例として、レーザー光源である。光源２０は、一例として、コヒーレント光である照明光を発する。なお、光源２０は、インコヒーレント光を発する光源であってもよい。光源２０の他の例は、半導体レーザー光源、ＬＥＤ（ＬＩＧＨＴＥＭＩＴＴＩＮＧＤＩＯＤＥ）光源である。

　空間光変調デバイス２１は、光源２０から発せられた光を変調する。空間光変調デバイス２１は、光特性が互いに異なる複数の領域を有する。空間光変調デバイス２１は、入射光の光特性に対して、光特性が互いに異なる複数の領域のうち二つ以上の領域で、互いに異なる変調を行う。入射光の光特性とは、例えば、強度、波長、位相、及び偏光状態のいずれか１つ以上に関する特性である。なお、光特性は、これらに限定されない。また、変調とは上述した光特性を変化させることである。空間光変調デバイス２１は、例えば、回折光学素子（ＤＯＥ：Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）、空間光変調器（ＳＬＭ：Ｓｐａｔｉａｌ　Ｌｉｇｈｔ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ：Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ　Ｄｅｖｉｃｅ）や、光特性が異なる複数の領域が表面に印刷されるフィルムなどが含まれる。なお、光源２０が発する照明光がインコヒーレント光である場合、空間光変調デバイス２１は、ＤＭＤである。

　第１の空間フィルター２２は、光源２０から発せられた光を遮断する遮断領域と、光源２０から発せられた光を透過させる透過領域とを有する。第１の空間フィルター２２は、光源２０と流路内の結像位置２５との間の光路である第１の光路２４上に設置される。ここで結像位置２５とは、第１対物レンズ２３によって流路内に結像される光の像の位置である。第１対物レンズ２３によって結像される光の像の位置とは、構造化照明４が結像される位置である。観察対象物に照射される構造化された照明光の照明パターンは１つの観察対象物を測定する期間においては一定で変化しない。構造化照明４は、空間光変調デバイス２１により変調された照明光が、第１対物レンズ２３により結像された構造化された照明パターンである。
　本実施形態では、第１の空間フィルター２２は、一例として、第１の光路２４のうち空間光変調デバイス２１と結像位置２５との間に備えられる。第１の空間フィルター２２は、一例として、第１の光路２４（つまりｚ軸方向）に対して略垂直に設置される。

　なお、第１の空間フィルター２２は、第１の光路２４において空間光変調デバイス２１と結像位置２５との間であって、結像位置２５以外の位置であればいずれの位置に備えられてもよい。第１の空間フィルター２２が結像位置２５に備えられる場合、構造化照明４自体が欠落してしまうため、好ましくない。

　ここで図２を参照し、第１の空間フィルター２２の構成について説明する。図２は、本実施形態に係る第１の空間フィルター２２の構成の一例を示す図である。第１の空間フィルター２２の形状は、一例として、四角形であって板状である。図２では、板状である第１の空間フィルター２２を、ｚ軸方向において光源２０の側からみた場合の平面２２２が示されている。第１の空間フィルター２２の光源２０の側の面は、平面２２２上に位置する。
　照射領域Ｒ１は、光源２０からの光が空間光変調デバイス２１によって変調された光である構造化照明光が平面２２２において照射される領域を示す。

　平面２２２上に位置する第１の空間フィルター２２の面は、透過領域２２０と遮断領域２２１とに分けられる。図２では、第１の空間フィルター２２の透過領域２２０は、遮断領域２２１に隔てられて、透過領域２２０－１と透過領域２２０－２との連結していない２つの領域からなる。
　透過領域２２０は、一例として、第１の空間フィルター２２に間隙が設けられて構成される。透過領域２２０は光源２０から発せられた光を透過する領域である。

　遮断領域２２１は、光源２０から発せられた光を遮断するマスクである。遮断領域２２１の形状は、本実施形態では一例として長方形である。遮断領域２２１の形状は、照射領域Ｒ１のうち一部を占めてさえすれば、長方形に限らず任意の形状であってよい。即ち、第１の空間フィルター２２における遮断領域２２１の形状、及び配置は、図２に記載されるような、透過領域２２０を２つ以上の領域に分けるような形状、及び配置でなくてもよい。例えば、遮断領域２２１の形状は、直径が照射領域Ｒ１の直径よりも短い円であって、第１の空間フィルター２２の中央に配置されてもよい。また他の例として、遮断領域２２１が照射領域Ｒ１の端部に配置されて、照射領域Ｒ１に照射される光のうち端部に照射される一部が遮断領域２２１によって遮断されるように配置されていてもよい。また他の例として、遮断領域２２１が照射領域Ｒ１の端部に同心円状に配置されており、透過領域２２０の形状が照射領域Ｒ１の直径よりも短い直径の円であって透過領域２２０が中心部分に設置される構造になっていてもよい。
　遮断領域２２１は、光源２０から発せられた光が観察対象物５の方へ進行することを妨げる第１の領域の一例である。したがって、第１の空間フィルター２２は、光源２０から発せられた光が観察対象物５の方へ進行することを妨げる第１の領域を有する。

　第１の空間フィルター２２が遮断領域２２１を有することによって、構造化照明４として照射される光の一部の周波数は欠落してしまう場合がある。一方、照射領域Ｒ１のうち照射された光が遮断領域２２１によって遮断される領域面積は大きい方が、シグナル・ノイズ比は一定に保ったまま、観察対象物５の形態情報としてより豊富な情報が取得できる可能性がある。照射領域Ｒ１のうち照射された光が遮断領域２２１によって遮断される領域とは、換言すれば、照射領域Ｒ１と遮断領域２２１とが重なる領域である。

　しかしながら、照射領域Ｒ１と遮断領域２２１とが重なる領域の面積が大きすぎると、構造化照明４として照射される光まで遮断してしまう場合がある。一方、照射領域Ｒ１と遮断領域２２１とが重なる領域の面積が小さすぎると、暗視野観察として観察対象物５による散乱光を検出できる量が十分でなく、観察対象物５の形態情報が十分な精度において取得できない場合がある。これらの理由によって、照射領域Ｒ１と遮断領域２２１とが重なる領域の面積は、観察対象物の構造や構造化照明光の構造等を勘案して決定されるが、照射領域Ｒ１に対する遮断領域の割合が５％から７０％の範囲であることが好ましい。

　図１に戻ってフローサイトメーター１の構成の説明を続ける。
　第１対物レンズ２３は、空間光変調デバイス２１によって変調された光を結像する。第１対物レンズ２３は、空間光変調デバイス２１によって変調された光を流路の結像位置２５に結像する。第１対物レンズ２３によって結像された光は、構造化照明４として流路を流れる観察対象物５に照射される。第１対物レンズ２３は、空間光変調デバイス２１によって変調された光を流路内に結像する第１の光学素子の一例である。

　続いて、検出光学系３の構成について説明する。検出光学系３は、流路内を流れる観察対象物５によって変調された光を検出する光学系である。検出光学系３は、第２対物レンズ３０と、第２の空間フィルター３１と、結像レンズ３２と、第１の光検出器３３とを備える。検出光学系３において、散乱光の光路を第２の光路３４という。フローサイトメーター１では、第１の光検出器３３により、対象物５によって変調された光である前方散乱光を検出する。

　第２の空間フィルター３１は、観察対象物５を透過した光を遮断する遮断領域と、観察対象物５によって変調された光を透過させる透過領域とを有する。観察対象物５を透過した光とは、光源２０から発せられた光が観察対象物５を透過した直接光である。つまり、第２の空間フィルター３１は、観察対象物５を透過した直接光を遮断する。一方、観察対象物５によって変調された光とは、光源２０から発せられた光が観察対象物５によって散乱された散乱光である。つまり、第２の空間フィルター３１は、観察対象物５によって散乱された散乱光を透過させる。
　第２の空間フィルター３１は、第２の光路３４に設置される。

　第２の空間フィルター３１が設置される位置と、第１の空間フィルター２２が設置される位置とは、略光学的に共役な関係にある。ここで設置される位置が略光学的に共役な関係にあるとは、光学的に略共役な位置に設置されることである。また、本実施形態では、第１の空間フィルター２２と第２の空間フィルター３１とは、略平行に配置される。

　ここで図３を参照し、第２の空間フィルター３１の構成について説明する。図３は、本実施形態に係る第２の空間フィルター３１の構成の一例を示す図である。第２の空間フィルター３１の形状は、一例として、四角形であって板状である。図３では、板状である第２の空間フィルター３１を、ｚ軸方向において光源２０の側からみた場合の平面３１２が示されている。第２の空間フィルター３１の光源２０の側の面は、平面３１２上に位置する。照射領域Ｒ２は、第１の空間フィルター２２がフローサイトメーター１に備えられていない場合に、観察対象物５に構造化照明４として照射された光が第２対物レンズ３０を通して平面３１２において照射される領域を示す。

　平面３１２上に位置する第２の空間フィルター３１の面は、遮断領域３１０と透過領域３１１とに分けられる。図３では、第２の空間フィルター３１の遮断領域３１０は透過領域３１１に隔てられて、遮断領域３１０－１と遮断領域３１０－２との連結していない２つの領域からなる。

　遮断領域３１０は、観察対象物５を透過した光を遮断するマスクである。観察対象物５を透過した光とは、第１の空間フィルター２２が有する透過領域２２０を透過した直接光である。

　透過領域３１１は、一例として、第２の空間フィルター３１に間隙が設けられて構成される。平面３１２において透過領域３１１と照射領域Ｒ２とが重なる領域は、第１の空間フィルターにおける遮断領域２２１と照射領域Ｒ１とが重なる領域の像が第２の空間フィルター３１に結像され平面３１２において占める領域と略同一である。ここで上述したように、本実施形態では遮断領域２２１の形状は長方形であるため、透過領域３１１の形状もまた長方形である。透過領域３１１は観察対象物５によって散乱された散乱光を透過する領域である。

　第２の空間フィルター３１の平面３１２において照射領域Ｒ２と透過領域３１１とが重なる領域と、第１の空間フィルター２２の平面２２２において照射領域Ｒ１と遮断領域２２１とが重なる領域とは、互いに結像関係にある。
　なお、照射領域Ｒ２と透過領域３１１とが重なる領域の形状及び配置は、照射領域Ｒ１と遮断領域２２１とが重なる領域が平面３１２において結像された像に包含される形状及び配置であってもよい。

　透過領域３１１は、観察対象物５により変調された光を透過する第２の領域の一例である。上述したように、第１の空間フィルター２２がフローサイトメーター１に備えられていない場合に、観察対象物５に構造化照明４として照射された光が第２対物レンズ３０を通して平面３１２において照射される照射領域Ｒ２と透過領域３１１とが重なる領域は、第１の空間フィルター２２において光源２０から発せられた光が照射される領域と第１の領域とが重なる領域が第２の空間フィルター３１に結像された像が第２の空間フィルター３１において占める領域と略同一か、または当該領域に包含される。

　上述したように第２の空間フィルター３１が設置される位置と、第１の空間フィルター２２が設置される位置とは、略光学的に共役な関係にある。したがって、第１の空間フィルター２２が有する遮断領域２２１、及び第２の空間フィルター３１が有する透過領域３１１の位置関係について、遮断領域２２１の位置と透過領域３１１の位置とは略光学的に共役な関係にある。

　なお、本実施形態では、一例として、第１の空間フィルター２２が有する透過領域２２０や、第２の空間フィルター３１が有する透過領域３１１は、間隙によって形成される場合について説明したが、これに限らない。透過領域２２０や透過領域３１１は、所定の値以上である透過率を有する物質によって構成されてもよい。

　図１に戻ってフローサイトメーター１の構成の説明を続ける。
　第２対物レンズ３０は、観察対象物５によって変調された光を平行光にする。ここで第２の光路３４は、散乱光の光路であって、第１の光検出器３３と結像位置２５との間の光路である。なお、上述したように第２の空間フィルター３１が設置される位置と、第１の空間フィルター２２が設置される位置とは、略光学的に共役な関係にあり、第２対物レンズ３０が設置される位置は、それら第１の空間フィルター２２と第２の空間フィルター３１との略光学的に共役な関係を妨げさえしなければ、第２の光路３４において構造化照明４が流路内に結像される結像位置２５と第２の空間フィルター３１との間のいずれの位置に配置されてもよい。

　結像レンズ３２は、第２の光路３４において第２の空間フィルター３１と第１の光検出器３３との間の位置に配置される。なお、本実施形態では、結像レンズ３２が、第１の光検出器３３の検出面において、第２対物レンズ３０を通過した観察対象物５によって変調された光が結像レンズ３２によって結像される位置に配置されている。

　第１の光検出器３３は、結像レンズ３２により結像した散乱光を検出する。ここで結像レンズ３２が結像した散乱光とは、観察対象物５による前方散乱光であって、第１対物レンズ２３によって流路内に結像された構造化照明が、流路内を流れる観察対象物５によって変調され、さらにその後第２対物レンズ３０によって平行化されて第２の空間フィルター３１を透過した光である。第１の光検出器３３は、光学素子によって結像された光が流路内を流れる観察対象物５によって変調された光を検出する第１の光検出器の一例である。第１の光検出器３３は、例えば、光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ　ｔｕｂｅ；ＰＭＴ）、ライン型ＰＭＴ素子、フォトダイオード、ＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ　Ｐｈｏｔｏ－ｄｉｏｄｅ）又は半導体光センサ等の光センサを有している。

　なお、本実施形態では、第１の光検出器３３が検出する散乱光は、第２対物レンズ３０及び結像レンズ３２を介して第１の光検出器３３の検出面において結像される場合の一例について説明したが、これに限らない。第１の光検出器３３が検出する散乱光は、第１の光検出器３３の検出面において結像されているのが好適であるが、第１の光検出器３３の検出面において所定の光量以上が集光されていれば、第１の光検出器３３の検出面において結像されていなくてもよい。他の実施形態においても同様に、光検出器が検出する散乱光は、光検出器の検出面において所定の光量以上が集光されていれば、検出面において結像されていなくてもよい。

　第１の光検出器３３は、検出した散乱光を電信号パルスに変換し、ＤＡＱ（Ｄａｔａ　Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）デバイス（不図示）などに出力する。ＤＡＱデバイスは、電気信号パルスを、パルス毎に電子データに変換する。ＤＡＱデバイスは、電子データを解析装置（不図示）などに出力する。電子データは、解析装置において解析されて、観察対象物５の形態情報が取得される。

　以上に説明したように、本実施形態に係るフローサイトメーター１は、照明光学系２と、観察対象物５が流体と共に流れ得る流路と、検出光学系３とを備える。
　照明光学系２は、光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の光学素子（本実施形態において第１対物レンズ２３）とを備える。空間光変調デバイス２１は、光源２０から発せられた光を変調する。第１の光学素子（本実施形態において第１対物レンズ２３）は、空間光変調デバイス２１によって変調された光を流路内に結像する。
　検出光学系３は、第１の光学素子（本実施形態において第１対物レンズ２３）によって結像された光が流路内を流れる観察対象物５によって変調された光を検出する第１の光検出器３３を備える。
　照明光学系２は、第１の空間フィルター２２をさらに備える。第１の空間フィルター２２は、光源２０と第１の光学素子（本実施形態において第１対物レンズ２３）によって結像される流路内の結像位置２５との間の第１の光路２４に設置されて、光源２０から発せられた光が観察対象物５の方へ進行することを妨げる第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１）を有する。
　検出光学系３は、第２の空間フィルター３１をさらに備える。第２の空間フィルター３１は、第１の光検出器３３と流路内の結像位置２５との間の第２の光路３４に設置されて、観察対象物５によって変調された光（本実施例において前方散乱光）を透過する第２の領域（本実施形態において透過領域３１１）を有する。
　第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１）の位置と第２の領域（本実施形態において透過領域３１１）の位置とは略光学的に共役な関係にある。

　この構成により、本実施形態に係るフローサイトメーター１では、構造化照明光を用いたフローサイトメトリーにおいて、第１の空間フィルター２２、及び第２の空間フィルター３１を光路上に備えるという簡便な構成によって、従来のフローサイトメーターに比べて簡便な機構で観察対象物による変調光を検出できる。ここで従来のフローサイトメーターとは、例えば、ライン状の照明光を用い細胞の特徴を蛍光輝度総量や散乱光総量により評価するフローサイトメーターである。上述したように観察対象物による変調光には、散乱光や回折光が含まれる。

　また、本実施形態に係るフローサイトメーター１では、第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１）の位置と略光学的に共役な関係にある位置に配置された第２の領域（本実施形態において透過領域３１１）を透過する観察対象物５による散乱光を検出できるため、従来に比べて高いシグナル・ノイズ比を実現する散乱光を検出できる。シグナル・ノイズ比とは、第１の光検出器３３が検出する光のうち、散乱光と、散乱光以外の光との比である。散乱光以外の光とは、例えば、直接光である。

　本実施形態に係るフローサイトメーター１では、従来に比べて高いシグナル・ノイズ比において検出された散乱光を解析することができる。本実施形態に係るフローサイトメーター１では、照明光を変調デバイスにより変調し、構造化した照明を測定対象物に照射してより解像度の高い形態情報を散乱光に基づいて取り出すことができるため、蛍光物質による標識化を行うことなく（ラベルフリーで）観察対象物５に関する詳細な形態情報を取得でき、観察対象物５を非侵襲で計測し分類できる。

（第１の実施形態の変形例）
　ここで本実施形態の変形例について説明する。図４は、本実施形態の変形例に係るフローサイトメーター１ａの一例を示す図である。フローサイトメーター１ａは、流路（不図示）と、照明光学系２ａと、検出光学系３ａとを備える。
　なお、上述した第１の実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　照明光学系２ａは、光源２０ａと、空間光変調デバイス２１ａと、第１の空間フィルター２２ａと、第１対物レンズ２３とを備える。照明光学系２ａの照明光の光路を第１の光路２４ａという。図４では、第１の光路２４ａの例として、第１の光路２４ａ－１と、第１の光路２４ａ－２と、第１の光路２４ａ－３とが示されている。第１の光路２４ａは、光源２０ａから第１の空間フィルター２２ａまでの区間においてｘ軸に平行である。第１の光路２４ａのうち第１の光路２４ａ－１と、第１の光路２４ａ－３とは、照明光が第１の空間フィルター２２ａによって反射されることによって第１の空間フィルター２２ａの位置において略直角に曲がる。その結果、第１の光路２４ａ－１と、第１の光路２４ａ－３とは、第１の空間フィルター２２ａから観察対象物５までの区間においてｚ軸に平行となる。光源２０ａと、空間光変調デバイス２１ａと、第１の空間フィルター２２ａと、第１対物レンズ２３とは、この順に、照明光が流路を流れる観察対象物５に向かう方向に第１の光路２４ａ上に備えられる。

　光源２０ａ及び空間光変調デバイス２１ａの構成は、これらが備えられる第１の光路２４ａの向きがｘ軸に平行である点以外は、第１の実施形態の光源２０及び空間光変調デバイス２１の構成とそれぞれ同様である。

　第１の空間フィルター２２ａは、光源２０ａから発せられた光を反射する反射領域と、光源２０ａから発せられた光を透過させる透過領域とを有する。第１の空間フィルター２２ａは、一例として、第１の光路２４ａ（つまりｘ軸方向）に対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される。ここで所定の角度とは、一例として－ｙ方向にみたときに時計回りに４５度である。

　ここで図５を参照し、第１の空間フィルター２２ａの構成について説明する。図５は、本変形例に係る第１の空間フィルター２２ａの構成の一例を示す図である。図５では、板状である第１の空間フィルター２２ａの光源２０ａ側の平面、即ち図４で第１の空間フィルター２２ａを光源２０ａの側からｘ軸方向にみた場合の平面である平面２２２ａが示されている。第１の空間フィルター２２ａの光源２０の側の面は、平面２２２ａ上に位置する。

　平面２２２ａ上に位置する第１の空間フィルター２２ａの面は、反射領域２２０ａと透過領域２２１ａとに分けられる。図５では、第１の空間フィルター２２ａの反射領域２２０ａは透過領域２２１ａに隔てられて、反射領域２２０ａ－１と反射領域２２０ａ－２との連結していない２つの領域からなる。反射領域２２０ａは、光源２０ａからの照明光を反射するミラーである。透過領域２２１ａは、光源２０ａからの照明光を透過させる。

　ここで、光源２０ａから発せられた光のうち透過領域２２１ａを透過した光は、観察対象物５には照射されない。この意味において、透過領域２２１ａは、光源２０ａから発せられた光が観察対象物５の方へ進行することを妨げる第１の領域の一例である。

　図４に戻ってフローサイトメーター１ａの構成の説明を続ける。
　検出光学系３ａは、第２対物レンズ３０と、第２の空間フィルター３１ａと、結像レンズ３２ａと、第１の光検出器３３ａとを備える。検出光学系３ａにおいて、前方散乱光の光路を第２の光路３４ａという。第２の光路３４ａは、観察対象物５から第２の空間フィルター３１ａまでの区間においてｚ軸に平行である。第２の光路３４ａは、前方散乱光が第２の空間フィルター３１ａによって反射されることによって第２の空間フィルター３１ａの位置において略直角に曲がる。その結果、第２の光路３４ａは、第２の空間フィルター３１ａから第１の光検出器３３ａまでの区間においてｘ軸に平行となる。第２対物レンズ３０と、第２の空間フィルター３１ａと、結像レンズ３２ａと、第１の光検出器３３ａとは、この順に流路を流れる観察対象物５から第１の光検出器３３ａへ前方散乱光が向かう向きに第２の光路３４ａ上に備えられる。

　第２の空間フィルター３１ａは、観察対象物５によって変調された光を反射する反射領域と、観察対象物５を透過した光を遮断する遮断領域とを有する。本変形例では観察対象物５によって変調された光は上述した通り前方散乱光である。第２の空間フィルター３１ａは、第２の光路３４ａ（つまりｚ軸方向）に対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される。ここで所定の角度とは、一例として－ｙ方向にみたときに反時計回りに４５度である。また、第２の空間フィルター３１ａが設置される位置と、第１の空間フィルター２２ａが設置される位置とは、略光学的に共役な関係にある。

　ここで図６を参照し第２の空間フィルター３１ａの構成について説明する。図６は、本変形例に係る第２の空間フィルター３１ａの構成の一例を示す図である。図６では、板状である第２の空間フィルター３１ａの観察対象物側の面、即ち図４で第２の空間フィルター３１ａを観察対象物５の側からｚ軸方向にみた場合の平面３１２ａが示されている。第２の空間フィルター３１ａの観察対象物５の側（光源２０側）の面は、平面３１２ａ上に位置する。

　平面３１２ａ上に位置する第２の空間フィルター３１ａの面は、遮断領域３１０ａと反射領域３１１ａとに分けられる。図６では、第２の空間フィルター３１ａの遮断領域３１０ａは反射領域３１１ａに隔てられて、遮断領域３１０ａ－１と遮断領域３１０ａ－２との連結していない２つの領域からなる。反射領域３１１ａは、例えば、ミラーである。

　図４に戻ってフローサイトメーター１ａの構成の説明を続ける。
　結像レンズ３２ａ及び第１の光検出器３３ａの構成は、これらが備えられる第２の光路３４ａの向きがｘ軸に平行である点以外は、図１に示した結像レンズ３２及び第１の光検出器３３の構成とそれぞれ同様である。

　なお、フローサイトメーター１ａにおいて、検出光学系３ａの代わりに、図１に示した検出光学系３が備えられてもよい。また、第１の実施形態のフローサイトメーター１において、検出光学系３の代わりに、図４に示した検出光学系３ａが備えられてもよい。

（第２の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第２の実施形態について詳しく説明する。
　上記第１の実施形態では、フローサイトメーターは、観察対象物による前方散乱光を検出する場合について説明をした。本実施形態では、フローサイトメーターが、観察対象物による後方散乱光を検出する場合について説明をする。

　図７は、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｂの構成の一例を示す図である。フローサイトメーター１ｂは、流路（不図示）と、照明光学系２ｂと、検出光学系３ｂとを備える。
　なお、上述した第１の実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。
　本実施形態に係るフローサイトメーターをフローサイトメーター１ｂという。

　フローサイトメーター１ｂでは、観察対象物により変調された光として後方散乱光を検出する。フローサイトメーター１ｂでは、構造化照明４が観察対象物５によって散乱された後方散乱光を検出光学系３ｂによって検出する。後方散乱光とは、観察対象物５による散乱光のうちｚ軸の負の方向に散乱される光である。

　照明光学系２ｂは、光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２ｂと、第１対物レンズ２３とを備える。照明光学系２ｂの照明光の光路を第１の光路２４ｂという。図７では、第１の光路２４ｂの例として、第１の光路２４ｂ－１と、第１の光路２４ｂ－２と、第１の光路２４ｂ－３とが示されている。
　第１の空間フィルター２２ｂは、光源２０から発せられた光を遮断する遮断領域と、光源２０から発せられた光を透過させる透過領域とを有する。また、第１の空間フィルター２２ｂは、遮断領域の裏側に、観察対象物５による後方散乱光を反射する反射領域を有する。第１の光路２４ｂ－１及び第１の光路２４ｂ－３は、照明光のうち第１の空間フィルター２２ｂの透過領域を透過する光の光路である。第１の光路２４ｂ－２は、照明光のうち第１の空間フィルター２２ｂの遮断領域によって遮断される光の光路である。

　第１の空間フィルター２２ｂは、一例として、第１の光路２４ｂ（つまりｚ軸方向）に対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される。ここで所定の角度とは、一例として－ｙ方向にみたときに時計回りに４５度である。

　ここで図８を参照し、第１の空間フィルター２２ｂの構成について説明する。図８は、本実施形態に係る第１の空間フィルター２２ｂの構成の一例を示す図である。図８では、板状である第１の空間フィルター２２ｂの光源２０側の平面、即ち図７で第１の空間フィルターを光源２０の側からｚ軸方向にみた場合の平面である平面２２２ｂが示されている。第１の空間フィルター２２ｂの光源２０側の面は、平面２２２ｂ上に位置する。

　平面２２２ｂ上に位置する第１の空間フィルター２２ｂの面は、透過領域２２０ｂと遮断領域２２１ｂとに分けられる。図８では、第１の空間フィルター２２ｂにおいて透過領域２２０ｂは遮断領域２２１ｂに隔てられて、透過領域２２０ｂ－１と透過領域２２０ｂ－２との連結していない２つの領域からなる。
　第１の空間フィルター２２ｂは、第１の空間フィルター２２ｂの裏側の面（第１の空間フィルター２２ｂの結像位置２５側の面）において遮断領域２２１ｂと対向する領域に反射領域２２３ｂを有する。反射領域２２３ｂは、観察対象物５からの後方散乱光を反射するミラーである。このミラーは、観察対象物５から発せられた散乱光を反射する部材の一例である。つまり、光源２０から発せられた光が前記観察対象物５へ進行することを妨げる第１の領域のすべてまたは一部は、第１の空間フィルター２２ｂを構成する面のうち結像位置２５に面する側（光源２０とは逆に面する側）において、光源２０から発せられた光が観察対象物５によって後方に散乱された散乱光を反射する部材によって構成される。

　上述したように、第１の空間フィルター２２ｂは、光源２０側の面において光源２０から発せられた光を遮断する遮断領域２２１ｂを有し、光源２０とは反対の側の面において観察対象物５から発せられた光の散乱光を反射する反射領域２２３ｂを有する。

　図７に戻ってフローサイトメーター１ｂの構成の説明を続ける。
　検出光学系３ｂは、結像レンズ３２ａと、第１の光検出器３３ａとを備える。結像レンズ３２ａ及び第１の光検出器３３ａの構成は、図４に示した結像レンズ３２ａ及び第１の光検出器３３ａの構成とそれぞれ同様である。なお、図７では一例として、第２の空間フィルターは、第１の空間フィルター２２ｂによって兼ねられている。第１の空間フィルター２２ｂは、光源２０側の面に光源光が観察対象物５に照射されるのを妨げる第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１ｂ）を有し、光源２０とは反対の面に観察対象物５による後方散乱光を反射する部材（本実施形態において反射領域２２３ｂ）を有する構造となっており、第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１ｂ）と、第２の領域（本実施形態において反射領域２２３ｂ）とは、略光学的に共役な位置に配置される。

　検出光学系３ｂにおいて、後方散乱光の光路を第２の光路３４ｂという。第２の光路３４ｂは、観察対象物５から第１の空間フィルター２２ｂまでの区間においてｚ軸に平行である。第２の光路３４ｂは、後方散乱光が第１の空間フィルター２２ｂ（第１の空間フィルターの結像位置２５に面する側）によって反射されることによって第１の空間フィルター２２ｂの位置において略直角に曲がる。その結果、第２の光路３４ｂは、第１の空間フィルター２２ｂから第１の光検出器３３ａまでの区間においてｘ軸に平行となる。

　なお、本実施形態では一例として、第２の空間フィルターは、第１の空間フィルター２２ｂによって兼ねられている場合について説明したがこれに限らない。第２の空間フィルターは、第１の空間フィルター２２ｂによって兼ねられていなくてもよい。その場合、第２の光路３４ｂにおいて第１の空間フィルター２２ｂが設置される位置とは別の位置であって、かつ第１の領域の位置と第２の領域の位置とが略光学的に共役な関係になる位置に、第１の空間フィルター２２ｂとは別の空間フィルターが第２の空間フィルターとして設置される。

（第２の実施形態の変形例）
　ここで本実施形態の変形例について説明する。図９は、本実施形態の変形例に係るフローサイトメーター１ｃの一例を示す図である。フローサイトメーター１ｃは、流路（不図示）と、照明光学系２ｃと、検出光学系３ｃとを備える。
　なお、上述した第２の実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　照明光学系２ｃは、光源２０ｃと、空間光変調デバイス２１ｃと、第１の空間フィルター２２ｃと、第１対物レンズ２３とを備える。照明光学系２ｃの照明光の光路を第１の光路２４ｃという。図９では、第１の光路２４ｃの例として、第１の光路２４ｃ－１と、第１の光路２４ｃ－２とが示されている。第１の光路２４ｃは、光源２０ｃから第１の空間フィルターまでの区間においてｘ軸に平行である。第１の光路２４ｃ－１と、第１の光路２４ｃ－２とは、照明光が第１の空間フィルター２２ｃによって反射されることによって第１の空間フィルター２２ｃの位置において略直角に曲がる。その結果、第１の光路２４ｃ－１と、第１の光路２４ｃ－２とは、第１の空間フィルター２２ｃから観察対象物５までの区間においてｚ軸に平行となる。光源２０ｃと、空間光変調デバイス２１ｃと、第１の空間フィルター２２ｃと、第１対物レンズ２３とは、この順に、流路を流れる観察対象物５に照明光が向かう方向に第１の光路２４ｃ上に備えられる。

　光源２０ｃ及び空間光変調デバイス２１ｃの構成は、これらが備えられる第１の光路２４ｃの向きがｘ軸に平行である点以外は、第１の実施形態の光源２０及び空間光変調デバイス２１の構成とそれぞれ同様である。第１の空間フィルター２２ｃの構成は、図４に示した第１の空間フィルター２２ａの構成と同様である。

　検出光学系３ｃは、結像レンズ３２ｃと、第１の光検出器３３ｃとを備える。検出光学系３ｃにおいて、後方散乱光の光路を第２の光路３４ｃという。第２の光路３４ｃは、ｚ軸に平行である。第２の光路３４ｃは、後方散乱光のうち第１の空間フィルター２２ｃを透過する光の光路である。結像レンズ３２ｃと、第１の光検出器３３ｃとは、この順に流路を流れる観察対象物５から第１の光検出器３３ｃへ散乱光が向かう向きに第２の光路３４ｃ上に備えられる。
　結像レンズ３２ｃ及び第１の光検出器３３ｃの構成は、これらが図中に記載されている第２の光路３４ｃの向きとｚ軸の向きとが反対である点以外は、図１に示した結像レンズ３２及び第１の光検出器３３の構成とそれぞれ同様である。

　図９では本実施形態の変形例として、第２の空間フィルターが第１の空間フィルター２２ｃによって兼ねられている例が記載されているが、それに限られない。本実施形態と同様に、第１の空間フィルター２２ｃが第２の空間フィルターを兼ねない場合には、第２の光路３４ｃにおいて第１の空間フィルター２２ｃが設置される位置とは別の位置であって、かつ第１の領域の位置と第２の領域の位置とが略光学的に共役な関係になる位置に、第１の空間フィルター２２ｃとは別の空間フィルターを第２の空間フィルターとして設置することができる。

（第３の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の第３の実施形態について詳しく説明する。
　上記第１の実施形態及び第２の実施形態では、フローサイトメーターは、観察対象物による前方散乱光または後方散乱光をそれぞれ検出する場合について説明をした。本実施形態では、フローサイトメーターが、観察対象物による前方散乱光及び後方散乱光を同時に検出する場合について説明をする。
　本実施形態に係るフローサイトメーターをフローサイトメーター１ｄという。

　図１０は、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｄの構成の一例を示す図である。
フローサイトメーター１ｄは、流路（不図示）と、照明光学系２ｄと、検出光学系３ｄとを備える。
　なお、上述した第１の実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　フローサイトメーター１ｄでは、構造化照明４が観察対象物５によって散乱された前方散乱光及び後方散乱光を検出光学系３ｄによって検出する。なお、図１０では一例として、後方散乱光の検出に際して、第２の空間フィルターが第１の空間フィルター２２ｄによって兼ねられている場合が記載されているが、それに限られない。先の例と同様に、第１の空間フィルター２２ｄが後方散乱光の検出に際して第２の空間フィルターを兼ねない場合には、第３の光路３７ｄにおいて第１の空間フィルター２２ｄが設置される位置とは別の位置であって、かつ第１の領域の位置と第２の領域の位置とが略光学的に共役な関係になる位置に、第１の空間フィルター２２ｄとは別の空間フィルターが第２の空間フィルターとして設置される。

　照明光学系２ｄは、光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２ｄと、第１対物レンズ２３とを備える。照明光学系２ｄの照明光の光路を第１の光路２４ｄという。図１０では、第１の光路２４ｄの例として、第１の光路２４ｄ－１と、第１の光路２４ｂ－２とが示されている。

　図１０に示す第１の空間フィルター２２ｄの構成は、図８に示した第１の空間フィルター２２ｂの構成と同様である。つまり、第１の空間フィルター２２ｄは、光源２０側の面において光源２０から発せられた光を遮断する遮断領域２２１ｄ（図８の遮断領域２２１ｂに相当）を有し、光源２０とは反対の側の面において観察対象物５から発せられた光の散乱光を反射する反射領域２２３ｄ（図８の反射領域２２３ｂに相当）を有する。第１の光路２４ｄ－１及び第１の光路２４ｄ－２は、照明光のうち第１の空間フィルター２２ｄの透過領域２２０ｄを透過する光の光路である。

　第１の空間フィルター２２ｄは、一例として、第１の光路２４ｄ（つまりｚ軸方向）に対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される。ここで所定の角度とは、一例として－ｙ方向にみたときに時計回りに４５度である。

　前方散乱光の検出に関しては、第２の空間フィルターとして３１ｄが設置される。第２の空間フィルター３１ｄの構成は、図３に示した第２の空間フィルター３１の構成と同様である。つまり、第２の空間フィルター３１ｄは、光源２０側の面において観察対象物５から発せられた散乱光を透過する透過領域３１１ｄ（図３の透過領域３１１に相当）と光源２０から発せられた直接光を遮断する遮断領域３１０ｄ（図３の遮断領域３１０に相当）とを有する。第１の空間フィルター２２ｄは、第１の光路２４ｄに対して略垂直な方向（つまり光源２０から照射される光の向きと略垂直の方向）から所定の角度だけ傾けて設置されるため、その遮断領域２２１ｄに含まれる各点の像は、光軸の方向について互いに異なる場所に位置することになる。これに応じて、第２の空間フィルター３１ｄを傾け、第１の空間フィルター２２ｄにおいて照射領域Ｒ１と遮断領域２２１ｄとが重なる領域の像を、第２の空間フィルター３１ｄの光軸の方向について互いに異なる場所に結像させる。そのため、第１の空間フィルター２２ｄの照射領域Ｒ１とその遮断領域２２１ｄとが重なる領域と、第２の空間フィルター３１ｄの照射領域Ｒ２と透過領域３１１ｄとが重なる領域とは、互いに光学的に略共役な位置に配置される。

　第１対物レンズ２３は、空間光変調デバイス２１によって変調された光を流路上の結像位置２５に結像する。また、第１対物レンズ２３は、観察対象物５からの後方散乱光を平行光にする。ここで観察対象物５による後方散乱光は、第１の空間フィルター２２ｄが有する反射領域２２３ｄによって反射されて－Ｘ方向に進行して、第２結像レンズ３５ｄを通過した後、第２の光検出器３６ｄの検出面に集光する。

　続いて、検出光学系３ｄの構成について説明する。検出光学系３ｄは、第２対物レンズ３０と、第２の空間フィルター３１ｄと、結像レンズ３２と、第１の光検出器３３と、第２結像レンズ３５ｄと、第２の光検出器３６ｄとを備える。

　検出光学系３ｄにおいて、前方散乱光の光路を第２の光路３４ｄという。第２の光路３４ｄは、図１に示した第２の光路３４と同様にｚ軸に平行である。
　また、検出光学系３ｄにおいて、後方散乱光の光路を第３の光路３７ｄという。第３の光路３７ｄは、観察対象物５から第１の空間フィルター２２ｄまでの区間においてｚ軸に平行である。第３の光路３７ｄは、後方散乱光が第１の空間フィルター２２ｄによって反射されることによって第１の空間フィルター２２ｄの位置において略直角に曲がる。その結果、第３の光路３７ｄは、第１の空間フィルター２２ｄから第２の光検出器３６ｄまでの区間においてｘ軸に平行となる。

　第２の空間フィルター３１ｄは、観察対象物５を透過した直接光を遮断する遮断領域３１０ｄと、観察対象物５による前方散乱光を透過させる透過領域３１１ｄとを有する。第２の空間フィルター３１ｄは、第２の光路３４ｄ（つまりｚ軸方向）に対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される。ここで所定の角度とは、一例として－ｙ方向にみたときに反時計回りに４５度である。第２の空間フィルター３１ｄの構成は、第２の光路３４ｄに対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される点以外は、第２の空間フィルター３１の構成（図３）と同様である。

　なお、上述したように、第１の空間フィルター２２ｄと、第２の空間フィルター３１ｄとは、第１の光路２４ｄ（つまりｚ軸方向）に対して略垂直な方向からそれぞれ所定の角度だけ傾けて設置されている。第２の空間フィルター３１ｄが設置される位置は、第１の空間フィルター２２ｄと互いに共役な位置に配置されており、第１の空間フィルター２２ｄの遮断領域２２１により生成された影の領域（照射領域Ｒ１のうち遮断領域２２１によって遮断された領域）の像は、第２の空間フィルター３１ｄの平面上において照射領域Ｒ２と透過領域３１１ｄとが重なる領域と略同一にある。

　第２結像レンズ３５ｄは、第１の空間フィルター２２ｄによって反射された後方散乱光を結像する。ここで第１の空間フィルター２２ｄは、後方散乱光検出に関して第２の空間フィルターを兼ねる。本実施形態では、第１の空間フィルター２２ｄは、第１の領域（光源側の面の遮断領域２２１ｄ）と、第２の領域（結像位置２５側の面の反射領域２２３ｄ）を有する。
　第２の光検出器３６ｄは、第２結像レンズ３５ｄが結像した後方散乱光を検出する。ここで第２結像レンズ３５ｄが結像した後方散乱光は、観察対象物５から発せられた散乱光を第１の空間フィルター２２ｄの反射する部材によって構成される反射領域２２３ｄによって反射された光である。したがって、第２の光検出器３６ｄは、観察対象物５から発せられた散乱光を、反射する部材によって反射して検出する。

　なお、フローサイトメーター１ｄにおいて後方散乱光のみを検出してもよい。その場合、検出光学系３ｄから第２対物レンズ３０、第２の空間フィルター３１ｄ、結像レンズ３２、及び第１の光検出器３３は省略される。

　以上に説明したように、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｄでは、第１の空間フィルター２２ｄを構成する面のうち結像位置２５に面する側（光源２０とは反対の側）において、第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１ｄ）のすべてまたは一部は、光源２０から発せられた光が観察対象物５によって散乱された散乱光を反射する部材（本実施形態において反射領域２２３ｄを構成するミラー）によって構成されている。フローサイトメーター１ｄでは、検出光学系３ｄの一部として、光源２０から発せられた光の観察対象物５による散乱光を反射する部材（本実施形態において反射領域２２３ｄを構成するミラー）によって反射された散乱光を検出する第２の光検出器３６ｄを備える。

　この構成により、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｄでは、第１の空間フィルター２２ｄが、光源２０側の面において光源光が観察対象物５に照射されるのを妨げる第１の領域（本実施形態において遮断領域２２１ｄ）を有し、光源２０とは反対側の面において観察対象物５による後方散乱光を反射する部材（本実施形態において反射領域２２３ｄを構成するミラー）を有する構造となっている。また、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｄでは、光源光が観察対象物５に照射されるのを妨げる第１の領域（本実施形態では第１の空間フィルター２２ｄの遮断領域２２１ｄ）が、観察対象物５による前方散乱光を透過する第２の領域（本実施形態において第２の空間フィルター３１ｄの透過領域３１１ｄ）と、略光学的に共役な関係になる位置に設置されている。そのため、従来に比べて高いシグナル・ノイズ比を実現する散乱光として、前方散乱光に加えて後方散乱光を検出できる。本実施形態に係るフローサイトメーター１ｄでは、照明光を変調デバイスにより変調し、構造化した照明を測定対象物に照射して前方および後方への散乱光として同時に取得できる。そのため、蛍光物質による標識化を行うことなく（ラベルフリー）観察対象物５に関するより解像度の高い形態情報を取得でき、観察対象物５を非侵襲で計測し分類できる。

（第３の実施形態の変形例）
　ここで本実施形態の変形例について説明する。図１１は、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｅの構成の一例を示す図である。フローサイトメーター１ｅは、流路（不図示）と、照明光学系２ｅと、検出光学系３ｅとを備える。
　なお、上述した各実施形態及びそれらの変形例と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　照明光学系２ｅは、光源２０ｃと、空間光変調デバイス２１ｃと、第１の空間フィルター２２ｃと、第１対物レンズ２３とを備える。照明光学系２ｅの照明光の光路を第１の光路２４ｅという。図１１では、第１の光路２４ｅの例として、第１の光路２４ｅ－１と、第１の光路２４ｅ－２と、第１の光路２４ｅ－３とが示されている。第１の光路２４ｅは、光源２０ｃから第１の空間フィルター２２ｃまでの区間においてｘ軸に平行である。第１の光路２４ｅ－１と、第１の光路２４ｅ－３とは、照明光が第１の空間フィルター２２ｃによって反射されることによって第１の空間フィルター２２ｃの位置において略直角に曲がる。その結果、第１の光路２４ｅ－１と、第１の光路２４ｅ－３とは、第１の空間フィルター２２ｃから観察対象物５までの区間においてｚ軸に平行となる。一方、第１の光路２４ｅ－２は、照明光が第１の空間フィルター２２ｃを透過する。光源２０ｃと、空間光変調デバイス２１ｃと、第１の空間フィルター２２ｃとは、この順に＋ｘ方向に第１の光路２４ｅ上に備えられる。

　第１の空間フィルター２２ｃは、光源２０ｃから発せられた光を反射する反射領域と、光源２０ｃから発せられた光、及び観察対象物５による後方散乱光を透過させる透過領域とを有する。第１の空間フィルター２２ｃは、第２の実施形態の変形例に係る第１の空間フィルター２２ｃ（図９）と同様に、ｚ軸方向に対して略垂直な方向から所定の角度だけ傾けて設置される。第１の空間フィルター２２ｃの構成は、図４に示した第１の空間フィルター２２ａの構成と同様であり、中央部に透過領域として透過領域２２１ｃを、両端部に反射領域として反射領域２２０ｃを備える。

　変調された照明光は第１の空間フィルター２２ｃが有する反射領域２２０ｃによって反射され、その構造化照明光のパターンが流路内の結像位置２５に結像される。また、第１対物レンズ２３は、観察対象物５による後方散乱光を平行化し、第１の空間フィルター２２ｃに照射される。第１の空間フィルター２２ｃに照射された後方散乱光は、第１の空間フィルター２２ｂが有する透過領域２２１ｃを透過し、－ｚ方向に進行する。

　続いて、検出光学系３ｅの構成について説明する。検出光学系３ｅは、第２対物レンズ３０と、第２の空間フィルター３１ａと、結像レンズ３２ａと、第１の光検出器３３ａと、第２結像レンズ３５ｃと、第２の光検出器３６ｃとを備える。

　検出光学系３ｅにおいて、前方散乱光の光路を第２の光路３４ｅという。第２の光路３４ｅは、観察対象物５から第２の空間フィルター３１ａまでの区間においてｚ軸に平行である。第２の光路３４ｅは、前方散乱光が第２の空間フィルター３１ａによって反射されることによって第２の空間フィルター３１ａの位置において略直角に曲がる。その結果、第２の光路３４ｅは、第２の空間フィルター３１ａから第１の光検出器３３ａまでの区間においてｘ軸に平行となる。
　また、検出光学系３ｅにおいて、後方散乱光の光路を第３の光路３７ｅという。第３の光路３７ｅは、観察対象物５から第１の空間フィルター２２ｃを経て第２の光検出器３６ｃまでの区間においてｚ軸に平行となる。

　第２の空間フィルター３１ａ、結像レンズ３２ａ、及び第１の光検出器３３ａの構成は、図４に示した第２の空間フィルター３１ａ、結像レンズ３２ａ、及び第１の光検出器３３ａの構成とそれぞれ同様である。
　第２結像レンズ３５ｃ、及び第２の光検出器３６ｃの構成は、図９に示した結像レンズ３２ｃ、及び第１の光検出器３３ｃの構成とそれぞれ同様である。

　なお、フローサイトメーター１ｅにおいて、検出光学系３ｅのうち前方散乱光を検出するための構成は、図１０に示した検出光学系３ｄのうち前方散乱光を検出するための構成によって置き換えられてもよい。つまり、検出光学系３ｅのうち第２の空間フィルター３１ａ、結像レンズ３２ａ、及び第１の光検出器３３ａは、図１０に示した検出光学系３ｄのうち第２の空間フィルター３１ｄ、結像レンズ３２、及び第１の光検出器３３によって置き換えられてもよい。

　また、第３の実施形態のフローサイトメーター１ｄにおいて、検出光学系３ｄのうち前方散乱光を検出するための構成は、図１１に示した検出光学系３ｅのうち前方散乱光を検出するための構成によって置き換えられてもよい。つまり、検出光学系３ｄのうち第２の空間フィルター３１ｄ、結像レンズ３２、及び第１の光検出器３３は、図１１に示した検出光学系３ｅのうち第２の空間フィルター３１ａ、結像レンズ３２ａ、及び第１の光検出器３３ａによって置き換えられてもよい。

　さらに、図１１では第３の実施形態の変形例として、後方散乱光の検出に際して、第２の空間フィルターが第１の空間フィルター２２ｄによって兼ねられている例が記載されているが、それに限られない。先の例と同様に、第１の空間フィルター２２ｃが後方散乱光の検出に際して第２の空間フィルターを兼ねない場合には、第３の光路３７ｅにおいて第１の空間フィルター２２ｃが設置される位置とは別の位置であって、かつ第１の領域の位置と第２の領域の位置とが略光学的に共役な関係になる位置に、第１の空間フィルター２２ｃとは別の空間フィルターが第２の空間フィルターとして設置される。

　以上に説明したように、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｅでは、第１対物レンズ２３は構造化照明光のパターンを流路内の結像位置２５に結像させ、構造化照明４を観察対象物５に照射する。第１の空間フィルター２２ｃを第１の光路２４ｅ内に配置させ、光源２０ｃから発せられた光の一部を第１の空間フィルター２２ｃを透過させて観察対象物５の方へ進行することを妨げる第１の領域（本実施形態において透過領域２２１ｃ）として機能させると共に、第１の空間フィルター２２ｃの透過領域２２１ｃの全てまたは一部において観察対象物５からの後方散乱光を透過させ第２の光検出器３６ｃにおいて検出している。フローサイトメーター１ｅでは、第１の空間フィルター２２ｃの流路内の結像位置２５に面する側に配置される透過領域２２１ｃは、光を透過させる部材（本実施形態において透過領域２２１ｃを構成する間隙）によって構成され、光源２０ｃから発せられた照明光の一部を透過させて観察対象物５の方へ進行することを妨げる。フローサイトメーター１ｅでは、観察対象物５からの後方散乱光が、再度第１の空間フィルター２２ｃの流路内の結像位置２５に面する側に配置される透過領域２２１ｃを透過して、その後第２の光検出器３６ｃにより検出される。フローサイトメーター１ｅでは、観察対象物５からの後方散乱光の検出に関連する検出光学系３ｅとして、第２結像レンズ３５ｃと第２の光検出器３６ｃを備える。

　この構成により、本実施形態に係るフローサイトメーター１ｅでは、観察対象物５による後方散乱光を第２の光検出器３６ｃにより検出する際に光源２０ｃから発せられる直接光の影響を少なくすることができる。また本実施形態に係るフローサイトメーター１ｅでは、観察対象物５による後方散乱光は、第１対物レンズ２３を介して平行化され、第１の空間フィルター２２ｃの透過領域２２１ｃを透過した後方散乱光のみが第２の光検出器３６ｃにより検出される。それにより本実施形態に係るフローサイトメーター１ｅでは、従来に比べて高いシグナル・ノイズ比を実現する散乱光として、前方散乱光に加えて後方散乱光を検出できる。本実施形態に係るフローサイトメーター１ｅでは、照明光を変調デバイスにより変調し、構造化された照明光を測定対象物に照射して前方および後方への散乱光を同時に取得できる。そのため、蛍光物質による標識化を行うことなく（ラベルフリー）観察対象物５に関する解像度の高い形態情報を取得でき、観察対象物５を非侵襲で計測し分類できる。

　なお、上記の各実施形態においては、第１の空間フィルターの有する第１の領域の光源から発せられた光が観察対象物の方へ進行することを妨げる方法として、光の透過または遮断を利用する場合の一例について説明したが、これに限らない。

　第１の空間フィルターが第１の領域として遮断領域を備える場合、遮断領域は、観察対象物に照射される光として利用しない光の伝搬を遮断する。この場合に、遮断領域は、光の吸収または偏光を利用して光の伝搬を遮断してもよい。第１の空間フィルターにおいて、遮断領域以外の領域は、入射した光をそのまま透過させる透過領域によって構成される。

　第１の空間フィルターは、観察対象物に照射される光として利用する光と利用しない光とにおいて伝搬方向を変えることによって、照明光として利用する光と利用しない光とを空間的に分離し、利用する光のみを観察対象物の方へ伝搬させてもよい。例えば、第１の空間フィルターは、第１の領域とそれ以外の領域とで、異なる光特性を有する単一の光学素子（光学フィルター）を備える。第１の空間フィルターは、この光学素子によって、第１の領域とそれ以外の領域にそれぞれを入射した入射光を互いに異なる方向に伝搬させる。ここでの異なる光特性には、反射についての特性、回折についての特性、または屈折についての特性などが含まれる。
　第１の空間フィルターは、回折を利用して光源から発せられた照明光が観察対象物の方へ進行することを妨げてもよい。また、第１の空間フィルターは、反射を利用して光源から発せられた照明光が観察対象物の方へ進行することを妨げてもよい。以下に、上記の各実施形態とは異なる形態であるこれら第１の空間フィルターを使用する例について説明する。

　ここで図１２及び図１３を参照し、第１の空間フィルターが第１の領域とそれ以外の領域とで互いに異なる光特性を有する単一の光学素子を備える場合について説明する。図１２は、各実施形態の変形例に係る第１の空間フィルター２２ｆの一例を示す図である。図１２に示す例では、第１の空間フィルター２２ｆと空間光変調デバイスとが一体となって備えられており、第１の空間フィルター２２ｆは、上述した各実施形態の空間光変調デバイスが有していた構造化照明光を生成するための機能を有する。すなわち、第１の空間フィルター２２ｆは、非変調領域とそれ以外の領域とで異なる光特性を有する単一の光学素子であり、この構成により空間光変調デバイスと同様の変調素子としての機能も同時に備える。

　図１２では、板状である第１の空間フィルター２２ｆを、ｚ軸方向において光源の側からみた場合の平面２２２ｆが示されている。平面２２２ｆ上に、空間光変調デバイスの変調素子のｚ軸方向において光源の側からみた面が位置する。
　平面２２２ｆ上に位置する第１の空間フィルター２２ｆの面は、構造化照明領域２２０ｆと非変調領域２２１ｆとに分けられる。図１２では、第１の空間フィルター２２ｆの構造化照明領域２２０ｆは非変調領域２２１ｆに隔てられて、構造化照明領域２２０ｆ－１と構造化照明領域２２０ｆ－２との連結していない２つの領域からなる。

　構造化照明領域２２０ｆと非変調領域２２１ｆとは、変調素子によって実現され、互いに異なる光特性を有する。構造化照明領域２２０ｆは、例えば、構造化照明を生成するための回折パターンが変調素子の表面にデザインされることによって実現される。図１３に示すように、第１の空間フィルター２２ｆは、構造化照明領域２２０ｆを経た変調光を回折させることによって光の伝搬方向を変化させる。構造化照明領域２２０ｆを経て伝搬方向を変化させられた光は、例えば、第１対物レンズ２３ｆによって集光されて構造化照明として利用され、観察対象物に照射される。
　一方、第１の空間フィルター２２ｆの非変調領域２２１ｆを経た光は、変調されずに光源から直進（つまり、透過）する。非変調領域２２１ｆと照射領域Ｒ１とが重なる領域の像は、後段に備えられる第２の空間フィルターにおいて影を作る。

　第１の空間フィルター２２ｆによれば、観察対象物への照射に利用する光と利用しない光を空間的に分離可能である。同時に、第１の空間フィルター２２ｆは、上述した各実施形態の空間光変調デバイスが有していた構造化照明を生成するための機能を有する。図１３に示すように、第１の空間フィルター２２ｆによれば、利用する光のみを観察対象物への照射光として後段に伝搬させることができる。光路２４ｆ－１は、観察対象物への照射光の光路である。第１の光路２４ｆ－２は、観察対象物への照射に利用しない光の光路である。

　第１の空間フィルターが第１の領域とそれ以外の領域とで互いに異なる光特性を有する単一の光学素子を備える場合において、第１の空間フィルターと空間光変調デバイスとは、別体として備えられてもよい。その場合であっても、回折素子を第１の空間フィルターとして使用することで、観察対象物への照射に利用する光と利用しない光を空間的に分離可能である。
　回折素子を第１の空間フィルターとして使用し、且つ第１の空間フィルターが空間光変調デバイスとは別体として備えられる場合、第１の空間フィルターは、光源と空間光変調器との間に備えられることが好ましい。つまり、第１の空間フィルターが光源から発せられた光が観察対象物の方へ進行することを妨げる方法として光の透過、遮断、または反射を利用する場合の各実施形態においては、第１の空間フィルターが、第１の光路のうち空間光変調デバイスと構造化照明光が照射される流路内の結像位置との間に備えられることが望ましく、それらの場合を例に説明した。但しそのような光の進行を妨げる方法として光の透過、遮断、または反射を利用する実施形態であっても、第１の空間フィルターを光源と空間光変調デバイスとの間に備える構成であってもよく、その場合は空間光変調デバイスからの距離が近い方が望ましい。一方、第１の空間フィルターが光源の照明光が観察対象物の方へ進行することを妨げる別の方法として、回折素子を第１の空間フィルターとして使用することも可能である。その場合で、かつ第１の空間フィルターと空間光変調デバイスとが別体として備えられる場合には、第１の空間フィルターが第１の光路のうち光源と空間光変調デバイスとの間に備えられる構成が好ましく、さらに空間光変調デバイスからの距離が近い方がより望ましい。

　続いて図１４及び図１５を参照して、第１の空間フィルターが、上記の各実施形態とは異なる方法で光が観察対象物の方に進行すること妨げる実施形態の変形例について説明する。本実施形態の変形例では、第１の空間フィルターは反射領域を有する。図１４は、各実施形態の変形例に係る第１の空間フィルター２２ｇの一例を示す図である。図１４では、板状である第１の空間フィルター２２ｇを、ｚ軸方向において光源からみた場合の平面２２２ｇが示されている。第１の空間フィルター２２ｇの光源側の面は、平面２２２ｇ上に位置する。

　平面２２２ｇ上の第１の空間フィルター２２ｇの面は、透過領域２２０ｇと反射領域２２１ｇとに分けられる。図１４では、第１の空間フィルター２２ｇの透過領域２２０ｇは反射領域２２１ｇに隔てられて、透過領域２２０ｇ－１と透過領域２２０ｇ－２との連結していない２つの領域からなる。反射領域２２１ｇは、図１５に示すように、突起部２２３ｇを備える。この突起部２２３ｇは、平面２２２ｇに対して所定の角度だけ傾いた面にミラーを有し、入射する光を反射することによって、入射する光を後段の光学系に入らない方向に伝搬させる。図１５中の第１の光路２４ｇ－２は、観察対象物への照射に利用しない光の光路である。
　図１５の例では、後段の光学系のうち第１対物レンズ２３ｇが示されている。透過領域２２０ｇは、光源２０ａからの照明光の一部を透過させる。（光路２４ｇ－１は、観察対象物への照射光の光路である。）
　このように、第１の空間フィルター２２ｇでは、第１の領域に入射した光の伝搬を遮断する代わりに、入射した光を反射するミラーを設置し、入射した光を後段の光学系に入らない方向に伝搬させる。

　なお、上記の各実施形態においては、照明光学系２が第１の光学素子（第１対物レンズ２３）を備える場合の一例について説明したが、これに限らない。照明光学系２は、第１の光学素子に加えて、第２の光学素子を１以上さらに備えてもよい。第２の光学素子は、空間光変調デバイスによって変調された光を第１の光路において結像させる。その場合、第１の空間フィルターは、第１の光路において、第１の光学素子による構造化照明パターンの結像位置と、１以上の第２の光学素子による１以上の結像位置との複数の結像位置以外の位置に備えられる。

（第４の実施形態）
　上記の各実施形態においては、光源から発せられた照明光が観察対象物により変調される光の一例として、観察対象物による前方あるいは後方への散乱光を光検出器により検出する場合について説明したが、これに限らない。照明光が観察対象物により変調される光を光検出器で検出する別の例としては、位相変化を与える構造によって生じる回折光を光検出器により検出する場合もある。以下の例ではさらに、流路内の結像位置と光検出器との間に設置された第２の空間フィルターにおける第２の領域において観察対象物により回折あるいは散乱された光を光検出器の方へ進行させると共に、第２の空間フィルターの照射領域Ｒ２のうち第２の領域を除いた領域の全てあるいはその一部において観察対象物を透過した光の強度及びまたは位相を変調して通過させ、それら両方の光を光検出器上において干渉させて位相差情報を取得する例について説明する。

　図１６は、本実施形態係るフローサイトメーター１ｈの一例を示す図である。フローサイトメーター１ｈは、流路（不図示）と、照明光学系２ｈと、検出光学系３ｈとを備える。
　なお、上述した各実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　照明光学系２ｈの照明光の光路を第１の光路２４ｈという。第１の光路２４ｈは、ｚ軸に平行である。図１６では、第１の光路２４ｈの例として、第１の光路２４ｈ－１と、第１の光路２４ｈ－２とが示されている。照明光学系２ｈは、光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２と、第１対物レンズ２３とを備える。光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２と、第１対物レンズ２３とは、この順に、流路を流れる観察対象物５に照明光が向かう方向に第１の光路２４ｈ上に備えられる。第１の光路２４ｈは、第１の空間フィルター２２と観察対象物５との間の区間において第１の空間フィルター２２の透過領域を透過した光の光路である。

　検出光学系３ｈは、第２対物レンズ３０と、第２の空間フィルター３１ｈと、結像レンズ３２と、第１の光検出器３３ｈとを備える。検出光学系３において、前方散乱光あるいは回折光の光路を第２の光路３４ｈという。第２の光路３４ｈは、ｚ軸に平行である。

　第２の空間フィルター３１ｈは、観察対象物５によって変調された光を透過させる透過領域と、観察対象物５を透過した光の強度及びまたは位相を変調する変調領域とを有する。観察対象物５を透過した光とは直接光である。透過領域が透過させる観察対象物５によって変調された光とは、一例として観察対象物５によって散乱された前方散乱光であるが、位相変化を与える構造によって生じる回折光であってもよい。以下の説明では、第２の空間フィルター３１ｈが透過領域によって透過させた前方散乱光あるいは回折光を第１の光といい、第２の空間フィルター３１ｈが変調領域によって変調させて透過させた光を第２の光ともいう。第２の空間フィルター３１ｈが有する透過領域は、第２の領域の一例である。上述した第１の光と第２の光は、第１の光検出器３３ｈによって検出される。

　結像レンズ３２は、第１の光と、第２の光とを第１の光検出器３３ｈの検出面に結像させる。なお、結像レンズ３２は、第１の光と、第２の光とを第１の光検出器３３ｈの検出面に集光させればよく、厳密に結像させなくてもよい。
　第１の光検出器３３ｈは、結像レンズ３２によって検出面において結像された第１の光と第２の光とが、相互に干渉して得られる第１の光と第２の光との位相差の情報を検出する。ここで観察対象物５に照射される光は、空間光変調デバイス２１によって構造化された光である。そのため、第１の光検出器３３ｈは、構造化された光について、直接光と前方散乱光（あるいは回折光）との位相差の情報を検出することになる。つまり、検出光学系３ｈでは、構造化された光について光の位相差を検出する。上述したように、第１の光検出器３３ｈは、観察対象物５を透過した光のうち第２の空間フィルター３１ｈにおける第２の領域（本実施形態において透過領域）以外の領域（本実施形態において変調領域）の全てあるいはその一部を通過する光の強度あるいは位相を変調しその位相を変調された光と、観察対象物５によって変調された光のうち第２の領域（本実施形態において透過領域）を通過した光との位相差を検出する。
　フローサイトメーター１ｈによれば、構造化された光について光の位相差を検出できる。

（第４の実施形態の変形例）
　次に図１７を参照し、第４の実施形態の変形例の１例として、観察対象物により変調された光を位相差の情報としてだけではなく、変調光自体として同時に検出する場合について説明する。図１７では、観察対象物により変調された光として前方散乱光あるいは回折光が検出される場合について説明している。
　図１７は、本実施形態の変形例に係るフローサイトメーター１ｉの一例を示す図である。フローサイトメーター１ｉは、流路（不図示）と、照明光学系２ｉと、検出光学系３ｉとを備える。
　なお、上述した各実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　照明光学系２ｉの照明光の光路を第１の光路２４ｉという。第１の光路２４ｉは、ｚ軸に平行である。図１６では、第１の光路２４ｉの例として、第１の光路２４ｉ－１と、第１の光路２４ｉ－２とが示されている。照明光学系２ｉは、光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２と、第１対物レンズ２３とを備える。光源２０と、空間光変調デバイス２１と、第１の空間フィルター２２と、第１対物レンズ２３とは、この順に、照明光が流路を流れる観察対象物５に向かう方向に第１の光路２４ｉ上に備えられる。第１の光路２４ｉは、第１の空間フィルター２２と観察対象物５との間の区間において第１の空間フィルター２２の透過領域を透過した光の光路である。

　検出光学系３ｉは、第２対物レンズ３０と、ハーフミラー３８ｉと、第２の空間フィルター３１ｈと、結像レンズ３２と、第１の光検出器３３ｈと、第３の空間フィルター３９ｉと、第２結像レンズ３５ｄと、第２の光検出器３６ｉとを備える。

　検出光学系３ｉにおいて、前方散乱光あるいは回折光が位相差情報を検出するため第１の光検出器に向かう光路を第２の光路３４ｉという。第２の光路３４ｉは、ｚ軸に平行である。図１７では、第２の光路３４ｉの例として、第２の光路３４ｉ－１と、第２の光路３４ｉ－２と、第２の光路３４ｉ－３とが示されている。第２の光路３４ｉ－１と、第２の光路３４ｉ－３とは、観察対象物５を透過した光がハーフミラー３８ｉを透過した光の光路である。第２の光路３４ｉ－２は、観察対象物５によって散乱された前方散乱光あるいは回折光がハーフミラー３８ｉを透過した光の光路である。
　ハーフミラー３８ｉは、観察対象物５によって変調された光の一部を取り出す。ハーフミラー３８ｉが光の一部を取り出すとは、ハーフミラー３８ｉに入射する光の一部を透過させ、当該光の一部を反射させて、透過させた光または反射させた光のいずれか一方を所定の方向に伝搬させることである。ハーフミラー３８ｉは、第２の光路３４ｉに配置される。ハーフミラー３８ｉは、第２の光路に配置されて、観察対象物によって変調された光の一部を取り出す光学装置であるビームスプリッターの一例である。

　第２の空間フィルター３１ｈ、結像レンズ３２、及び第１の光検出器３３ｈの構成は、図１６に示した第２の空間フィルター３１ｈ、結像レンズ３２、第１の光検出器３３ｈの構成とそれぞれ同様である。

　また、検出光学系３ｉにおいて、前方散乱光あるいは回折光が第２の光検出器により検出される光路を第３の光路３７ｉという。第３の光路３７ｉは、観察対象物５によって散乱された前方散乱光あるいは回折光がハーフミラー３８ｉによって反射された光の光路である。第３の光路３７ｉは、ｘ軸に平行である。
　第３の空間フィルター３９ｉと、第２結像レンズ３５ｄと、第２の光検出器３６ｉとはこの順に観察対象物５によって散乱された前方散乱光あるいは回折光が進行する方向に第３の光路３７ｉ上に備えられる。

　第３の空間フィルター３９ｉは、観察対象物５によって散乱された前方散乱光あるいは回折光を透過させる透過領域と、観察対象物５を透過した光（つまり、直接光）を遮断する遮断領域とを備える。第３の空間フィルター３９ｉの遮断領域によって遮断される直接光とは、観察対象物５を透過した直接光のうちハーフミラー３８ｉによってｘ軸の方向へ反射された光である。第３の空間フィルター３９ｉが有する透過領域は、第３の領域の一例である。

　第２結像レンズ３５ｄは、第３の空間フィルター３９ｉを透過した前方散乱光あるいは回折光を第２結像レンズ３５ｄの結像面に結像させる。なお、第２結像レンズ３５ｄは、前方散乱光あるいは回折光を第２結像レンズ３５ｄの検出面に集光させればよく、結像させなくてもよい。
　第２の光検出器３６ｉは、第２結像レンズ３５ｄによって検出面において結像された前方散乱光あるいは回折光を検出する。第２結像レンズ３５ｄによって検出面において結像された前方散乱光あるいは回折光とは、上述したようにハーフミラー３８ｉによって取り出された変調された光が第３の空間フィルター３９ｉが有する透過領域を透過した光である。したがって、第２の光検出器３６ｉは、第３の領域を透過した観察対象物５によって変調された光を検出する。

　フローサイトメーター１ｉによれば、構造化された光について光の位相差に加えて、観察対象物５によって散乱された前方散乱光あるいは回折光を同時に検出できる。

　上述した各実施形態に係るフローサイトメーターでは、形態情報を含む情報を、細胞からの散乱光を従来のライン状の照明光を用いたフローサイトメーターに比べて高い解像度において取得できるため、観察対象物（例えば、目的となる細胞）を蛍光標識等によりラベル付けすることなく（つまり、ラベルフリーで）非侵襲で形態情報に基づいて高速で分離することが可能になる。

　以上、図面を参照してこの発明の一実施形態について詳しく説明してきたが、具体的な構成は上述のものに限られることはなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲内において様々な設計変更等をすることが可能である。

１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｈ、１ｉ…フローサイトメーター、２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｈ、２ｉ…照明光学系、３、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｈ、３ｉ…検出光学系、２０、２０ａ、２０ｃ…光源、２１、２１ａ、２１ｃ…空間光変調デバイス、２２、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ…第１の空間フィルター、２２１、２２１ｂ、３１０ａ…遮断領域、２２０ａ、２２３ａ、３１１ａ、２２１ｇ…反射領域、２２０、２２０ｂ、２２０ｇ、２２１ａ、３１１…透過領域、２２０ｆ…構造化照明領域、２２１ｆ…非変調領域、２３…第１対物レンズ、３１、３１ａ、３１ｄ、３１ｈ…第２の空間フィルター、３３，３３ａ、３３ｃ、３３ｈ…第１の光検出器、３６ｄ、３６ｃ、３６ｉ…第２の光検出器、３９ｉ…第３の空間フィルター、２４、２４ａ、２４ｂ、２４ｃ、２４ｄ、２４ｅ、２４ｈ、２４ｉ…第１の光路、３４、３４ａ、３４ｂ、３４ｃ、３４ｄ、３４ｅ、３４ｈ、３４ｉ…第２の光路、２５…結像位置、５…観察対象物

Claims

　観察対象物が流体と共に流れ得る流路と、
　光源と、
　前記光源から発せられた光を変調する空間光変調デバイスと、
　前記空間光変調デバイスによって変調された光を前記流路内に結像する第１の光学素子と、
　を備える照明光学系と、
　前記第１の光学素子によって結像された光が前記流路内を流れる前記観察対象物によって変調された光を検出する第１の光検出器を備える検出光学系と、
　を備えるフローサイトメーターであって、
　前記照明光学系は、前記光源と前記第１の光学素子によって結像される光の前記流路内の結像位置との間の第１の光路に設置されて、前記光源から発せられた光が前記観察対象物の方へ進行することを妨げる第１の領域を有する第１の空間フィルターをさらに備え、
　前記検出光学系は、前記第１の光検出器と前記結像位置との間の第２の光路に設置されて、前記観察対象物によって変調された光を前記第１の光検出器の方へ進行させる第２の領域を有する第２の空間フィルターをさらに備え、
　前記第１の領域の位置と前記第２の領域の位置とは略光学的に共役な関係にある
　フローサイトメーター。
　前記第１の空間フィルターが備えられない場合に前記空間光変調デバイスによって変調された光が前記観察対象物を透過して前記第２の空間フィルターを照射する領域と前記第２の領域とが重なる領域は、前記空間光変調デバイスによって変調された光によって前記第１の空間フィルターが照射される領域と前記第１の領域とが重なる領域が前記第２の空間フィルターに結像された像が前記第２の空間フィルターにおいて占める領域と略同一か、または当該領域に包含される
　請求項１に記載のフローサイトメーター。
　前記第１の光検出器によって検出される前記流路内を流れる前記観察対象物によって変調された光が散乱光あるいは回折光である
　請求項１または請求項２に記載のフローサイトメーター。
　前記第１の領域は、前記光源から発せられた光が前記観察対象物の方へ進行することを、当該光の透過、遮断、回折、または反射のいずれかによって妨げる
　請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のフローサイトメーター。
　前記第１の空間フィルターの面のうち、前記結像位置に面する側に位置する面において、前記第１の領域と対向する領域のすべてまたは一部の領域が、前記光源から発せられた光が前記観察対象物によって散乱された散乱光を反射する部材によって構成されており、
　前記検出光学系は、前記部材によって反射された前記散乱光を検出する第２の光検出器をさらに備える
　請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のフローサイトメーター。
　前記第１の空間フィルターの面のうち、前記結像位置に面する側に位置する面において、前記第１の領域と対向する領域のすべてまたは一部の領域が、前記光源から発せられた光が前記観察対象物によって散乱された散乱光を透過させる部材によって構成されており、
　前記検出光学系は、前記部材によって透過させられた前記散乱光を検出する第２の光検出器をさらに備える
　請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のフローサイトメーター。
　前記第１の空間フィルターと前記空間光変調デバイスとが一体となって備えられる
　請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のフローサイトメーター。
　前記第２の空間フィルターは、前記第１の空間フィルターによって兼ねられている
　請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のフローサイトメーター。
　前記第１の光検出器は、前記観察対象物を透過した光のうち前記第２の空間フィルターにおける前記第２の領域以外の領域の全てあるいはその一部を通過する光の強度あるいは位相を変調し、前記第２の領域以外の領域を通過して位相を変調された光と、前記観察対象物によって変調された光のうち前記第２の領域を通過した光との位相差を検出する
　請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のフローサイトメーター。
　前記第２の光路に配置されて、前記観察対象物によって変調された光の一部を取り出すビームスプリッターと、
　前記ビームスプリッターによって取り出された前記変調された光を透過させる第３の領域を有する第３の空間フィルターと、
　前記第３の領域を透過した前記変調された光を検出する第２の光検出器と
　をさらに備える請求項９に記載のフローサイトメーター。