WO2022019699A1 - 핵산 검출용 미세 유동 장치 - Google Patents

핵산 검출용 미세 유동 장치 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device for detecting nucleic acids, and more particularly, to a microfluidic device for detecting nucleic acids capable of detecting nucleic acids such as RNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • SSR self-sustained sequence replication
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • RCA rolling circle amplification
  • a denaturation process in which DNA is separated into single strands by increasing the temperature to a high temperature, and a primer complementary to each isolated DNA single strand by lowering the temperature It consists of an annealing process that binds to the template, and the process of polymerizing a new strand by a polymerization reaction by a polymerase by raising the temperature again.
  • the DNA chain increases exponentially.
  • the apparatus for PCR since the PCR process goes through the above steps, it inevitably accompanies a change in temperature, and therefore, the apparatus for PCR must be equipped with a temperature controller and a heating means.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • the RCA method has been proposed.
  • the RCA method has the advantage that the amplification of the target nucleic acid is possible in an isothermal state by not requiring a temperature change required for PCR amplification. Therefore, in a process requiring amplification, amplification is possible without the need for a separate temperature control device, and the complexity and cost of the device can be reduced.
  • a complex is formed by hybridizing a target DNA sequence and an open circular probe, followed by ligation to make an amplification target circle, and then a primer sequence and a DNA polymerase put in The amplification target circle then forms a template on which new DNA is formed, and extends from the primers to a continuous sequence of repeats complementary to the amplification target circle, producing thousands of copies of the nucleic acid per hour.
  • a further improved method is the ERCA (exponential RCA) method.
  • ERCA utilizes additional primer sequences that bind to the cloned sequence complementary to the amplification target circle to provide a new center of amplification, thereby providing exponentially increasing amplification.
  • the ERCA method uses a continuous form of the strand displacment method, but uses individual single-stranded linear primers attached to the product without additional RCA to convert the initial single-stranded RCA product as a template for another DNA synthesis. limited to use.
  • Another method is a method using molecular padlock probe (MPP) and rolling circle amplification (RCA) (C. Larsson et al,, Nat. Methods 2004, 1, 227).
  • MPP molecular padlock probe
  • RCA rolling circle amplification
  • This method has several advantages, and it has the characteristic of amplifying a complementary nucleic acid in the circular MPP through a process of distinguishing the target nucleic acid sequence with high specificity.
  • the direct coupling of the RCA product provides improved sensing sensitivity without a separate purification process.
  • RCA reaction can be initiated on the surface by immobilizing target nucleic acid probes on the surface of a material such as gold or quartz through simple chemical surface treatment.
  • the test time is 2 hours because the RCA reaction surface is formed on the bottom surface of the microchannel and the reaction must be waited until the entire microchannel is blocked by amplification from the RAC reaction surface. There is a problem that it takes more than that.
  • the applicant of the present application has proposed a 'microfluidic device for target gene detection' disclosed in Korean Patent Registration No. 10-1799192.
  • the microfluidic device disclosed in the Korean Patent Registration provides a microbead packing part in which the microbeads are packed, and forms a probe linker complementary to the target gene of the microbead to bind the target gene to the probe linker.
  • the target gene is detected using a phenomenon in which the pores between the microbeads are blocked by amplification of the target gene bound to the probe linker.
  • the microfluidic device disclosed in the Korean Patent Registration has the advantage of shortening the inspection time by about 15 minutes compared to the conventional RCA method, but the demand for faster inspection is increasing day by day. This is because a faster test speed is required in a situation where an infectious disease caused by a virus spreads to the extent of a pandemic.
  • microbeads disclosed in the Korea Patent Registration are inconvenient in that they cannot be stored dry because they are produced based on Hydrogel, and there is a risk of performance degradation due to long-term storage.
  • the present invention has been devised to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide a microfluidic device for detecting a nucleic acid that can be stored in a dry state while reducing the test time in detecting a target nucleic acid.
  • a chip body in a microfluidic device for detecting nucleic acids, a chip body, a sample chamber formed inside the chip body and into which a sample is injected, and a sample chamber spaced apart from the sample chamber and formed inside the chip body a waste chamber, formed inside the chip body, connecting the sample chamber and the waste chamber to form a flow path of the sample in the sample chamber, and an inlet connected to the sample chamber and an outlet connected to the waste chamber; a connection conduit having;
  • the probe linker is amplified through complementary binding with the target nucleic acid in the sample to detect the target nucleic acid.
  • the micropore of the nucleic acid detection membrane is blocked or the size of the micropore is reduced by amplification through complementary binding between the probe linker and the target nucleic acid, so that the final distance of the sample to the connection conduit, the final At least one of the arrival time to the arrival distance and the flow rate of the sample is changed, and the target nucleic acid may be detected by at least one of the final arrival distance, the arrival time, and the flow velocity.
  • the probe linker of the nucleic acid detection membrane and the target nucleic acid in the sample may complementarily bind.
  • sample in the sample chamber may be stirred for a preset stirring time by the stirrer, and then may flow along the connection conduit.
  • the sample in the sample chamber may be heated to a preset temperature range.
  • the temperature range is set within the range of 30 ⁇ 37 °C
  • the stirring time may be set within the range of 5 ⁇ 30 minutes.
  • the flow force for flowing the sample in the sample chamber along the connection conduit includes negative pressure from the disposal chamber, gravity according to the inclination of the chip body, the sample chamber in which the sample is accommodated, and the empty waste disposal. It may include at least one of a head difference between chambers.
  • oil that does not mix with the sample is injected into the sample chamber after the sample is injected;
  • the oil may isolate the sample from the outside at the top of the sample and increase the gravity or head difference for the flow of the sample into the connecting conduit.
  • the probe linker comprises a coating portion coated on the surface of the nucleic acid detection mesh, a primer coupled to the coating portion, and a template complementary to binding to the primer;
  • the template comprises a first binding site with the target nucleic acid, a second binding site complementary to the primer, and a third complementary binding site in the template for forming a dumbbell shape;
  • the first binding sites are formed separately at both ends of the template, and the second binding sites are formed between the separated and formed third binding sites;
  • a ligase enzyme that promotes complementary binding to the target nucleic acid may be formed at the first binding site.
  • a sample detection unit for detecting the sample flowing along the connection conduit, based on the detection result of the sample detection unit, at least one of the final arrival distance, the arrival time, and the flow rate to be measured can
  • a plurality of connection conduits are formed in the chip body to independently connect the sample chamber and the waste chamber, respectively, and the nucleic acid detection film is installed at an inlet of each connection conduit;
  • the probe linkers formed on the surface of each of the nucleic acid detection films may be made of a material that binds to different target nucleic acids.
  • nucleic acid detection membrane installed in any one of the plurality of connection conduits may be applied as a negative reference channel to which a probe linker is not attached.
  • the probe linker formed on the nucleic acid detection membrane installed in any one of the plurality of connection conduits may be formed so that nucleic acid amplification occurs regardless of the presence of the target nucleic acid and applied as a positive reference channel.
  • the nucleic acid detection membrane may include a membrane or mesh in which the micropores are formed.
  • the nucleic acid detection membrane is installed at the inlet of the connection conduit so that when it flows from the sample chamber to the connection conduit, it flows directly through the micropores of the nucleic acid detection membrane, thereby eliminating the bubble generation phenomenon.
  • the reproducibility of detection can be increased.
  • the existing microbead packing part was produced in the form of a hydrogel, so there was a difficulty in dry storage, but the nucleic acid detection membrane according to the present invention is made of a nylon material, etc.
  • FIG. 1 is a view showing a microfluidic device for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a cross-section of a microfluidic device for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a view showing an example of a nucleic acid detection membrane of a microfluidic device for nucleic acid detection according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 4 is a view showing an example of a probe linker of a microfluidic device for nucleic acid detection according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a diagram for explaining examples of applying a flow force to a sample in a microfluidic device for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 6 is a diagram for explaining examples of a sample detection unit of a microfluidic device for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 7 is a view showing a microfluidic device for detecting nucleic acids according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a view showing a microfluidic device 100 for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of a microfluidic device 100 for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention. It is a drawing.
  • the microfluidic device 100 for detecting nucleic acids includes a chip body 110 , a sample chamber 120 , a disposal chamber 150 , and a connection conduit 140 . ), a nucleic acid detection membrane 130 and a probe linker 200 .
  • the chip body 110 is provided in the form of a microfluidic chip in which the sample chamber 120, the disposal chamber 150, and the connection conduit 140 are formed, and the sample chamber ( 120), a waste chamber 150, a connection conduit 140, etc. may have a structure in which it is formed.
  • the sample chamber 120 is formed inside the chip body 110 , and the sample S is injected.
  • the sample chamber 120 is provided on one edge region of the chip body 110 , and as shown in FIG. 2 , it is exemplified that the sample chamber 120 is formed relatively higher than the connection conduit 140 .
  • the waste chamber 150 is spaced apart from the sample chamber 120 and is formed inside the chip body 110 at the other edge region of the chip body 110 .
  • connection conduit 140 is formed inside the chip body 110 to connect the sample chamber 120 and the disposal chamber 150 .
  • connection conduit 140 forms a flow path through which the sample S received and injected into the sample chamber 120 flows in the direction of the waste chamber 150 .
  • connection conduit 140 is formed in the form of a microchannel for communicating the sample chamber 120 and the waste chamber 150 .
  • an inlet connected to the sample chamber 120 and the waste chamber 150 are connected to each other. For example, having an exit that becomes
  • the nucleic acid detection membrane 130 is installed at the inlet of the connection conduit 140 .
  • the nucleic acid detection film 130 is formed in at least one or more micropores 131 penetrating in the flow direction of the sample S. Through this, the nucleic acid detection film 130 blocks the entrance of the connection conduit 140 . Even if it is installed in the form, the flow of the sample S is possible toward the connection conduit 140 through the micro-hole 131 .
  • FIG. 3 is a view showing an example of the nucleic acid detection membrane 130 of the microfluidic device 100 for nucleic acid detection according to an embodiment of the present invention.
  • the embodiment shown in FIG. 3 exemplifies that the nucleic acid detection film 130 is provided in the form of a mesh.
  • a plurality of micro-holes 131 are provided in a square-shaped film, and a plurality of micro-pores 131 are provided in a square-shaped nylon film.
  • the nucleic acid detection film 130 may be manufactured by punching the hole 131 .
  • a membrane in which a plurality of micropores 131 are formed can be applied as the nucleic acid detection membrane 130 according to the present invention.
  • the micropores 131 of the nucleic acid detection film 130 may be formed in various sizes depending on the target nucleic acid, and elements other than the target nucleic acid are provided to pass through, and the micropores 131 are blocked by other elements. can be removed. In the present invention, it is assumed that the diameter of the micropores 131 is determined in the range of 50 nm to 50 ⁇ m.
  • the probe linker 200 is formed on the surface of the nucleic acid detection film 130 .
  • the probe linker 200 may also be formed on the inner surface of the micropore 131 formed in the nucleic acid detection film 130 .
  • the hydrogel formed by amplification through complementary binding between the probe linker 200 formed on the surface of the nucleic acid detection film 130 and the target nucleic acid blocks the micropores 131 formed in the nucleic acid detection film 130 or
  • the probe linker 200 includes a coating unit 210 , a primer 220 , and a template 230 .
  • the coating unit 210 is coated on the surface of the nucleic acid detection film 130 , and is made of a material to which the primer 220 can be attached and fixed, for example, a carbolsyl group or an amine group is coated.
  • the coating unit 210 may include 5-hydroxydopamine hydrochloride, norepinephrine, epinephrine, pyrrogallolamine, DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanine), catechin, tannins, pyrogallol, pyrocatechol, heparin- Catechol, chitosan-catechol, polyethylene glycol-catechol, polyethyleneimine-catechol, polymethylmethacrylate-catechol, hyaluronic acid-catechol, polylysine-catechol, and polylysine ( For example, including one or more selected from the group consisting of polylysine).
  • the primer 220 is fixed to the coating portion 210
  • the template 230 is complementary to the primer 220
  • the template 230 includes a first binding site complementary to the target nucleic acid, a second binding site complementary to the primer 220, and the template 230 for forming a template form. and a third binding site.
  • the first binding site is formed separately at both ends of the template 230
  • the second binding site is formed between the separated and formed third binding sites.
  • the primer 220 is thiol, amine, hydroxyl, carboxyl, isothiocyanate, NHS ester, aldehyde, epoxide , Carbonate, HOBt ester, Glutaraldehyde, carbamate, imidazole carbamate, maleimide, aziridine, sulfone, vinyl sulfone (vinylsulfone), hydrazine (hydrazine), phenyl azide (phenyl azide), benzophenone (benzophenone), anthraquinone (anthraquinone), and one or more selected from the group consisting of a diene (Diene) group is an example in which the tip is modified.
  • a diene (Diene) group is an example in which the tip is modified.
  • the target nucleic acid is coupled to the probe linker 200 according to the present invention and amplified, and the amplified target nucleic acid is agglomerated to form a large-sized hydrogel, the nucleic acid detection membrane 130 The micro-holes 131 formed in the are blocked.
  • the probe linker 200 in the above example is a thesis 'DhITACT: DNA Hydrogel Formation by Isothermal Amplification of Complementary Target in Fluidic Channels (June 17, 2015, Advanced Materials, Volume 27, Issue) published in 2015 by Ho Yeon Lee et al. 23, Pages 3513-3517) as an example, and the detailed description is the same as described in the above paper.
  • the nucleic acid detection membrane 130 is installed at the entrance of the connection conduit 140 .
  • the sample S accommodated in the sample chamber 120 flows to the connection conduit 140 through the micro-holes 131 of the nucleic acid detection membrane 130 installed at the inlet of the connection conduit 140 . It is possible to prevent the bubble phenomenon of the sample S occurring in the process of passing through the micropores 131 in the process of flowing in the conduit 140 .
  • the nucleic acid detection membrane 130 is installed at the inlet of the connection conduit 140 , and flows from the sample chamber 120 to the connection conduit 140 .
  • the nucleic acid detection membrane 130 By allowing the nucleic acid to flow through the micropores 131 of the nucleic acid detection film 130 when doing so, the bubble generation phenomenon can be eliminated and the reproducibility of detection can be increased.
  • the microfluidic device 100 for detecting nucleic acids may further include a stirrer 121 installed inside the sample chamber 120 as shown in FIGS. 1 and 2 . .
  • the stirrer 121 stirs the sample S injected into the sample chamber 120 while rotating inside the sample chamber 120 . Through this, the sample S in the sample chamber 120 is uniformly in contact with the nucleic acid detection membrane 130 installed at the inlet of the connection conduit 140 while being stirred by the stirrer 121, and through this, the stirring process The probability that the target nucleic acid in the sample (S) is complementary to the probe linker 200 formed on the nucleic acid detection film 130 increases.
  • the connection conduit 140 For example, flowing along
  • the stirring time is set within the range of 5 to 30 minutes as an example, and the setting of the stirring time is set in consideration of the time required for complementary binding between the probe linker 200 and the target nucleic acid, the test time, etc. it is preferable
  • the sample S in the sample chamber 120 may be heated to a preset temperature range.
  • the temperature range is set as the optimum reaction temperature for the amplification process by the complementary binding between the probe linker 200 and the target nucleic acid, that is, the PCA reaction.
  • the target nucleic acid in the sample (S) is sufficiently bound to the probe linker 200 formed on the surface of the nucleic acid detection film 130 during the stirring process, and the sample (S) is transferred to the nucleic acid by the flow force to be described later.
  • the connection conduit 140 When flowing along the connection conduit 140 through the micropores 131 of the detection film 130, the micropores 131 are blocked within a faster time, or the time to reach a preset distance is shortened, etc. The detection time can be reduced.
  • the target sample (S) and the probe linker 200 are in a combined state, and bubbles according to the flow of the sample (S) through the micropores 131 It is possible to reduce the possibility of occurrence of the phenomenon.
  • FIG 5 is a view for explaining examples of applying a flow force to the sample S in the microfluidic device 100 for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention.
  • the stirrer 121 stirs the sample S in the sample chamber 120 for a stirring time. After piercing with an object such as the injection needle 171 to form an exhaust hole, a water head difference between the empty waste chamber 150 and the sample chamber 120 occurs, and the sample (S) in the sample chamber 120 It flows to the connection conduit 140 through the micropores 131 of the nucleic acid detection membrane 130 .
  • FIG. 5 ( b ) it is a view showing an example of providing a negative pressure to the flow of the sample (S) to the waste chamber 150 using the up pressure device 172, for example, a syringe pump.
  • the chip body 110 itself is tilted toward the disposal chamber 150, and the sample S of the sample chamber 120 is connected to the connection conduit 140 by gravity.
  • An example of providing a flow force that can flow in a direction is shown.
  • an oil (O) that does not mix with the sample (S), for example, mineral oil (O) may be injected.
  • the oil (O) blocks the sample (S) from the outside at the top of the sample (S). That is, it not only blocks the inflow of foreign substances from the outside, but also blocks the external air and the sample S so that the sample S is not evaporated into the air during the stirring process.
  • the oil O provides the effect of increasing the flow force due to gravity or head difference for the flow of the sample S to the connection conduit 140 .
  • (162) is taken as an example.
  • the LED module 161 irradiates light from one side of the connection conduit 140 toward the inside of the connection conduit 140
  • the photodiode 162 is the light irradiated from the LED module 161 on the opposite side of the connection conduit 140 .
  • the LED module 161 and the photodiode 162 may be arranged in a state in which they are arranged along the flow path direction of the connection conduit 140 , through which the sample S flows along the connection conduit 140 .
  • the sample (S) blocks the light irradiated from the LED module 161, so that the sample (S) is able to detect the maximum travel distance or arrival time that flows along the connection conduit (140).
  • FIG. 6 is a view for explaining examples of the sample detection unit 160 of the microfluidic device 100 for detecting nucleic acids according to an embodiment of the present invention.
  • a sample sensing member 181 such as a stick bar or a litmus test paper made of a porous material is installed inside the connection conduit 140, and the sample sensing member 181 is the sample (S). ) and is a diagram showing an example of the sample sensing unit 160 using a characteristic that changes color.
  • the sample detection unit 160 may include a camera, and may be provided to detect a flow distance of the sample S from an image captured by the camera.
  • the time for the sample S to reach the disposal chamber 150 is shown as an example of the sample sensing unit 160 that can be identified through the discoloration of the color-changing material 182 .
  • FIG. 7 is a view showing a microfluidic device 300 for detecting nucleic acids according to another embodiment of the present invention.
  • connection conduit 340 in the microfluidic device 300 for detecting nucleic acids is connected to the chip body 310 to independently connect the sample chambers 320a and 320b and the waste chamber 350, respectively. For example, a plurality is formed.
  • the sample chambers 320a and 320b may include an injection chamber 320a and a plurality of stirring chambers 320b, and each of the stirring chambers 320b is a waste chamber through one connection conduit 340 .
  • connection conduit 340 For example, connected to (350). That is, the inlet of each connection conduit 340 is configured to be connected to the corresponding stirring chamber 320b, and the nucleic acid detection membrane 330 may be installed at the inlet of each connection conduit 340 .
  • the probe linker 200 provided with a material binding to different target nucleic acids is formed on the surface of the nucleic acid detection membrane 330 installed at the inlet of each connection conduit 340 , so that a single nucleic acid detection microfluidic flow A plurality of target nucleic acids can be simultaneously detected using the device 300 .
  • a plurality of waste chambers 350 are also formed to be connected to each connection conduit 340 .
  • One waste chamber 350 may be configured to be connected to each connection conduit 340 . have.
  • the nucleic acid detection membrane 330 installed in any one of the plurality of connection conduits 340 may be applied as a negative reference channel to which a probe linker is not attached. That is, the amplification reaction of the nucleic acid does not occur in the nucleic acid detection membrane 330 to which the probe linker is not attached, and the sample S flows smoothly so that it can be compared with the flow caused by the clogging of other nucleic acid detection membranes 330 . will do
  • the probe linker formed on the nucleic acid detection film 330 installed in any one of the plurality of connection conduits 340 is formed so that nucleic acid amplification occurs regardless of the presence of the target nucleic acid, and can be applied as a positive reference channel. . That is, in contrast to the negative reference channel, in the case of the positive reference channel, blockage occurs from the beginning of the flow of the sample S, and the flow of the sample S through the other connection conduit 340 is comparable based on this. do.
  • microfluidic device 110,310 chip body
  • sample chamber 320a injection chamber
  • nucleic acid detection membrane 131 micropores
  • sample detection unit 161 LED module
  • coating unit 220 primer

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Abstract

본 발명은 핵산 검출용 미세 유동 장치에 관한 것으로, 칩 본체와, 상기 칩 본체 내부에 형성되고, 샘플이 주입되는 샘플 챔버와, 상기 샘플 챔버와 이격되어 상기 칩 본체 내부에 형성되는 폐기 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 샘플 챔버와 상기 폐기 챔버를 연결하여 상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플의 유동 경로를 형성하고, 상기 샘플 챔버와 연결되는 입구와 상기 폐기 챔버와 연결되는 출구를 갖는 연결 도관과, 상기 연결 도관의 상기 입구에 설치되고, 상기 샘플의 유동 방향으로 관통된 적어도 하나 이상의 미세 구멍이 형성된 핵산 검출 막과, 상기 핵산 검출 막의 표면에 형성되는 프로브 링커를 포함하며; 상기 프로브 링커는 상기 샘플 내의 타겟 핵산과의 상보적 결합을 통해 증폭되어 상기 타겟 핵산을 검출하는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 핵산 검출 막을 연결 도관의 입구에 설치하여, 샘플 챔버에서 연결 도관으로 유동할 때 바로 핵산 검출 막의 미세 구멍을 통해 유동하도록 함으로써, 버블 발생 현상을 제거하여 검출의 재현 가능성을 높일 수 있다.

Description

핵산 검출용 미세 유동 장치
본 발명은 핵산 검출용 미세 유동 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 RNA와 같은 핵산을 검출할 수 있는 핵산 검출용 미세 유동 장치에 관한 것이다.
바이러스와 같은 타겟 핵산의 효율적인 증폭은 핵산의 검출 뿐만 아니라, DNA 시퀀싱, 클로닝 등에 있어서도 매우 중요한 요소이다. 핵산을 증폭하기 위한 여러 가지 방법이 제안되고 있으며, 그 예로는, PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), SSR(self-sustained sequence replication), NASBA(nucleic acid sequence based amplification), 및 SDA(strand displacement amplification) 등이 있다.
이러한 방법들 중 다수는 정량적인 측정에 있어서 정확도가 다소 떨어졌으며, 고가의 장비를 요구하며, 특히 동시에 한 가지 이상의 타겟 핵산을 분석하고자 하는 경우에는 그 정도가 더 심하였다.
이러한 단점들을 보완하고자 개발된 것이 등온 핵산 증폭(isothermal amplification) 반응이며, 특히 등온 반응 중, RCA(rolling circle amplification) 방법이 많은 관심을 받고 있다. 즉, 종래, 원형 DNA를 증폭하기 위하여 PCR과 같은 몇몇 기술들이 채용되었으나, 이러한 방법들은 다소 시간이 오래 걸리고 효율이 떨어지며, 고가의 비용과 인력이 소모된다는 단점이 있었다.
PCR 방법은, 프라이머 쌍, 주형, 중합효소, 및 dNTP를 포함하는 반응 용액 중에서, 온도를 고온으로 높여서 DNA를 단일 가닥으로 분리하는 변성 과정, 온도를 낮추어서 상기 분리된 각 DNA 단일사슬에 상보적인 프라이머를 주형에 결합시키는 어닐링 과정, 다시 온도를 높여서 중합효소에 의한 중합반응에 의해 새로운 가닥을 중합하는 과정으로 이루어지며, 이 증폭을 통하여 DNA 사슬은 지수함수적으로 증가한다. 그러나, PCR 과정은 상기와 같은 단계를 거치기 때문에 온도의 변화를 필연적으로 수반하고, 따라서, PCR을 위한 장치에는 온도 컨트롤러 및 히팅 수단을 구비해야 한다. 그러나 랩온어칩 (lab-on-a-chip, LOC) 등에서 표적 핵산의 증폭을 위해 PCR을 이용하는 경우, LOC를 위한 검출 장치 등의 장치 외에 PCR 반응을 위한 온도 콘트롤러 및 히터를 별도로 요구하기 때문에, 장비가 복잡해지고, 장비 단가가 높아진다는 단점이 있다.
이러한 단점을 개선할 수 있는 방법으로서, 여러 가지 등온 증폭 방법이 제안되었다. LAMP(loop-mediated isothermal amplification) 방법은 이러한 등온 증폭 방법 중 하나로서, 6개의 증폭 프라이머를 이용하여 가지가 달린 다중 루프의 생성물을 생성시킨다. 이러한 LAMP 방법은 조기 진단이나 바이오 센서로서 사용하기에 다소 제한점이 있는데 이는 타겟 RNA를 검출하기 위해 초기의 reverse transcriptase(RT)를 사용하기 때문이다.
또 다른 등온 증폭 방법 중 하나로서 RCA 방법이 제안되었다. RCA 방법은 상기한 바와 같이 PCR 증폭에서 요구되는 온도 변화를 요구하지 않음으로써, 등온 상태에서 타겟 핵산의 증폭이 가능하다는 장점을 갖는다. 따라서, 증폭이 요구되는 공정에서 별도의 온도 조절 장치의 요구없이 증폭이 가능하고, 장치의 복잡성과 비용을 줄일 수 있다.
LRCA(linear rolling circle amplification) 방법은, 표적 DNA 서열과 개방 원형 프로브를 하이브리다이징(Hybridizing)시켜 복합체를 형성한 후, 라이게이션(Ligation)하여 증폭 표적 서클을 만든 후, 프라이머 서열과 DNA 중합효소를 넣어준다. 그리고 나서 증폭 표적 서클은 새로운 DNA가 형성된 주형을 형성하고, 프라이머로부터 신장시켜서 증폭 표적 서클에 상보적인 반복 서열의 계속된 서열로 연장함으로써, 한 시간에 수천 카피의 핵산을 만들어낸다.
이것을 더욱 개선한 방법이, ERCA(exponential RCA) 방법이다. ERCA는, 증폭 표적 서클에 상보적인 복제된 서열에 결합하는 추가적인 프라이머 서열을 이용하여 새로운 증폭 중심을 제공하고, 그로 인하여 기하 급수적으로 증가하는 증폭을 제공한다. ERCA 방법은 가닥 이동(strand displacment) 방법이 연속되는 형태를 이용하지만, 부가적인 RCA 없이 상기생성물에 부착되는 개별적인 단일 가닥의 선형 프라이머를 이용하여 초기의 단일 가닥 RCA 생성물을 또 다른 DNA 합성의 주형으로 이용하는 것에 한정된다.
또 다른 방법으로는, molecular padlock probe(MPP) and rolling circle amplification (RCA)를 이용한 방법이다(C. Larsson et al,, Nat. Methods 2004, 1, 227). 이 방법은 여러 가지 장점을 갖고 있는데, 높은 specificity 와 타겟 핵산 시퀀스를 구별하는 과정을 거쳐 환형 MPP에서 상보적인 핵산이 증폭되는 특성을 지니고 있다. 특별히, RCA 생성물의 직접적인 커플링으로 인해 별도의 정제과정 없이 향상된 센싱 감도를 제공하게 된다. 간단한 화학적 표면처리를 통해 금이나 석영과 같은 물질의 표면에 타겟 핵산 probes를 고정화 함으로 RCA 반응을 표면에서 시작시킬 수 있다.
한편, 2015년에 공개된 Ho Yeon Lee 등의 논문 'DhITACT: DNA Hydrogel Formation by Isothermal Amplification of Complementary Target in Fluidic Channels (June 17, 2015, Advanced Materials, Volume 27, Issue 23, Pages 3513-3517)에서는 미세채널 바닥면에 RCA 반응면을 준비하고 시료 용액와의 반응 시간을 두 시간 정도 기다려 단일 가닥의 DNA를 길게 생성시키면서 다중의 덤벨 모양으로 자기 조립되는 특성을 이용하여 DNA가 하이드로젤(hydrogel)처럼 형성되는 특성을 이용하여 해당 채널로는 유동이 배제되는 현상을 이용한 기술을 공시하였다.
그러나, Ho Yeon Lee의 논문에 개시된 기술의 경우, 미세 채널의 바닥면에 RCA 반응면을 형성하고 RAC 반응면으로부터의 증폭에 의해 전체 미세 채널이 막힐 때까지 반응을 기대려야 하므로 검사시간이 2시간 이상 정도 소요되는 문제점이 있다.
이에 본원 출원인은 한국등록특허 제10-1799192호에 개시된 '표적 유전자 검출을 위한 미세 유동 장치'를 제안한 바 있다. 상기 한국등록특허에 개시된 미세 유동 장치는 미세구슬을 패킹한 미세구슬 패킹부에 마련하고, 미세구슬의 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 프로브 링커를 형성하여 프로브 링커에 타겟 유전자가 결합되도록 형성한다. 프로브 링커에 결합된 타겟 유전자의 증폭에 의해 미세구슬 사이의 공극이 막히는 현상을 이용하여, 타겟 유전자를 검출하게 된다.
상기 한국등록특허에 개시된 미세 유동 장치는 기존의 RCA 방법에 비해 검사 시간을 15분 정도까지 단축시키는 장점이 있으나, 좀 더 빠른 검사에 대한 수요는 날로 증가하고 있다. 이는 바이러스에 의한 전염병이 팬데믹(Pandemic)에 이를 정도로 퍼지는 상황에서는 더 빠른 검사 속도가 요구되고 있기 때문이다.
또한, 상기 한국등록특허에 개시된 미세 구슬이 실제 적용에 있어서는 Hydrogel 기반으로 제작되는 점에서 건조 보관할 수 없는 불편함이 있고, 장기 보관에 따른 성능 저하의 우려가 존재한다.
이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, 타겟 핵산을 검출하는데 있어, 검사 시간을 줄이면서도 건조한 상태에서 보관이 가능한 핵산 검출용 미세 유동 장치를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적은 본 발명에 따라, 핵산 검출용 미세 유동 장치에 있어서, 칩 본체와, 상기 칩 본체 내부에 형성되고, 샘플이 주입되는 샘플 챔버와, 상기 샘플 챔버와 이격되어 상기 칩 본체 내부에 형성되는 폐기 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 샘플 챔버와 상기 폐기 챔버를 연결하여 상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플의 유동 경로를 형성하고, 상기 샘플 챔버와 연결되는 입구와 상기 폐기 챔버와 연결되는 출구를 갖는 연결 도관과, 상기 연결 도관의 상기 입구에 설치되고, 상기 샘플의 유동 방향으로 관통된 적어도 하나 이상의 미세 구멍이 형성된 핵산 검출 막과, 상기 핵산 검출 막의 표면에 형성되는 프로브 링커를 포함하며; 상기 프로브 링커는 상기 샘플 내의 타겟 핵산과의 상보적 결합을 통해 증폭되어 상기 타겟 핵산을 검출하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 프로브 링커와 상기 타겟 핵산 간의 상보적 결합을 통한 증폭에 의해 상기 핵산 검출 막의 상기 미세 구멍이 막히거나 상기 미세 구멍의 사이즈가 감소되어 상기 샘플의 상기 연결 도관으로의 최종 도달 거리, 상기 최종 도달 거리까지의 도달 시간, 및 상기 샘플의 유동 속도 중 적어도 하나가 변하고, 상기 최종 도달 거리, 상기 도달 시간 및 상기 유동 속도 중 적어도 하나에 의해 상기 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
또한, 상기 샘플 챔버 내부에 설치되어, 상기 샘플 챔버 내부에 주입된 상기 샘플을 교반하는 교반기를 더 포함하며; 상기 샘플 챔버 내부의 상기 샘플은 상기 교반기에 의해 교반되는 과정에서 상기 핵산 검출 막의 상기 프로브 링커와 상기 샘플 내의 상기 타겟 핵산이 상보적으로 결합할 수 있다.
그리고, 상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플은 상기 교반기에 의해 기 설정된 교반 시간동안 교반된 후, 상기 연결 도관을 따라 유동할 수 있다.
그리고, 상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플을 기 설정된 온도 범위로 가열될 수 있다.
그리고, 상기 온도 범위는 30 ~ 37 ℃ 범위 내에서 설정되고, 상기 교반 시간은 5 ~ 30분 사이의 범위 내에서 설정될 수 있다.
그리고, 상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플을 상기 연결 도관을 따라 유동시키기 위한 유동력은, 상기 폐기 챔버로부터의 음압, 상기 칩 본체의 기울기에 따른 중력, 상기 샘플이 수용된 상기 샘플 챔버와 빈 상태의 상기 폐기 챔버 간의 수두차 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
그리고, 상기 샘플 챔버에는 상기 샘플 주입 후 상기 샘플과 섞이지 않는 오일이 주입되며; 상기 오일은 상기 샘플의 상부에서 상기 샘플을 외부와 차단시키고, 상기 샘플의 상기 연결 도관으로의 유동을 위한 중력 또는 수두차를 증가시킬 수 있다.
그리고, 상기 프로브 링커는 상기 핵산 검출용 메쉬의 표면에 코팅되는 코팅부와, 상기 코팅부에 결합되는 프라이머와, 상기 프라이머와 상보적으로 결합하는 템플레이트를 포함하며; 상기 템플레이트는 상기 타겟 핵산과 제1 결합 부위와, 상기 프라이머와 상보적으로 결합하는 제2 결합 부위와, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 제3 결합 부위를 포함하며; 상기 제1 결합 부위는 상기 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 제2 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 제3 결합 부위 사이에 형성되며; 상기 제1 결합 부위에는 상기 타겟 핵산과의 상보적 결합을 촉진하는 리가아제 효소가 형성될 수 있다.
그리고, 상기 연결 도관을 따라 유동하는 상기 샘플을 감지하기 위한 샘플 감지부를 더 포함하며, 상기 샘플 감지부의 감지 결과에 기초하여, 상기 최종 도달 거리, 상기 도달 시간 및 상기 유동 속도 중 적어도 하나가 측정될 수 있다.
그리고, 상기 연결 도관은 상기 샘플 챔버와 상기 폐기 챔버를 각각 독립적으로 연결하도록 상기 칩 본체에 복수개가 형성되고, 각각의 상기 연결 도관의 입구에 상기 핵산 검출 막이 설치되며; 각각의 상기 핵산 검출 막의 표면에 형성되는 상기 프로브 링커는 서로 다른 타겟 핵산과 결합하는 물질로 마련될 수 있다.
그리고, 복수의 상기 연결 도관 중 어느 하나에 설치되는 핵산 검출 막에는 프로브 링커가 부착되지 않은 네거티브 기준 채널로 적용될 수 있다.
또는, 복수의 상기 연결 도관 중 어느 하나에 설치되는 핵산 검출 막에 형성된 프로브 링커는 상기 타겟 핵산의 존재 여부와 무관하게 핵산 증폭이 발생하도록 형성되어 포지티브 기준 채널로 적용될 수 있다.
그리고, 상기 핵산 검출 막은 상기 미세 구멍이 형성된 멤브레인 또는 메쉬를 포함할 수 있다.
상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따르면, 핵산 검출 막을 연결 도관의 입구에 설치하여, 샘플 챔버에서 연결 도관으로 유동할 때 바로 핵산 검출 막의 미세 구멍을 통해 유동하도록 함으로써, 버블 발생 현상을 제거하여 검출의 재현 가능성을 높일 수 있다.
또한, 버블 발생 현상을 제거함에 따라, 유동 압력 제어의 제약을 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 단일의 핵산 검출 막을 이용함으로써, 미세구슬 패킹부를 적용할 때보다도 낮은 압력으로 제어가 가능하게 된다.
그리고, 기존의 미세구슬 패킹부가 하이드로겔 형태로 제작되어 건식 보관의 어려움이 있었으나, 본 발명에 따른 핵산 검출 막은 나일론 재질 등으로의 제작을 통해 건식 보관이 가능하게 된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치를 나타낸 도면이고,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치의 단면을 개략적으로 도시한 도면이고,
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치의 핵산 검출 막의 예를 나타낸 도면이고,
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치의 프로브 링커의 예를 나타낸 도면이고,
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치에서 샘플에 유동력을 인가하기 위한 예들을 설명하기 위한 도면이고,
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치의 샘플 감지부의 예들을 설명하기 위한 도면이고,
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치를 나타낸 도면이다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들을 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)를 나타낸 도면이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)의 단면을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하여 설명하면, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)는 칩 본체(110), 샘플 챔버(120), 폐기 챔버(150), 연결 도관(140), 핵산 검출 막(130) 및 프로브 링커(200)를 포함한다.
칩 본체(110)는 내부에 샘플 챔버(120), 폐기 챔버(150), 연결 도관(140)이 형성되는 미세 유동 칩 형태로 마련되는데, 상부 본체 및 하부 본체 간의 결합을 통해 내부에 샘플 챔버(120), 폐기 챔버(150), 연결 도관(140) 등이 형성되는 구조를 가질 수 있다.
샘플 챔버(120)는 칩 본체(110) 내부에 형성되고, 샘플(S)이 주입된다. 본 발명에서는 샘플 챔버(120)가 칩 본체(110)의 일측 가장자리 영역에 마련되는 것을 예로 하며, 도 2에 도시된 바와 같이, 연결 도관(140)보다는 상대적으로 높게 형성되는 것을 예로 한다.
폐기 챔버(150)는 샘플 챔버(120)와 이격되어 칩 본체(110) 내부에 칩 본체(110)의 타측 가장자리 영역에 형성된다.
연결 도관(140)은 칩 본체(110) 내부에 형성되어 샘플 챔버(120)와 폐기 챔버(150)를 연결한다. 여기서, 연결 도관(140)은 샘플 챔버(120)에 주입되어 수용되는 샘플(S)이 폐기 챔버(150) 방향으로 유동하는 유동 경로를 형성하게 된다.
즉, 연결 도관(140)은 샘플 챔버(120)와 폐기 챔버(150)를 연통시키는 미세 채널 형태로 형성되는데, 본 발명에서는 샘플 챔버(120)와 연결되는 입구와, 폐기 챔버(150)와 연결되는 출구를 갖는 것을 예로 한다.
핵산 검출 막(130)은 연결 도관(140)의 입구에 설치된다. 여기서, 핵산 검출 막(130)에는 샘플(S)의 유동 방향으로 관통된 적어도 하나 이상의 미세 구멍(131)에 형성되는데, 이를 통해, 핵산 검출 막(130)이 연결 도관(140)의 입구를 막는 형태로 설치되더라도 미세 구멍(131)을 통해 연결 도관(140) 측으로 샘플(S)의 유동이 가능하게 된다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)의 핵산 검출 막(130)의 예를 나타낸 도면이다. 도 3에 도시된 실시예는 핵산 검출 막(130)을 메쉬 형태로 마련하는 것을 예로 하는데, 사각 형상의 막에 다수의 미세 구멍(131)이 마련되어 제작되는데, 사각 형상의 나일론 막에 다수의 미세 구멍(131)을 타공하여 핵산 검출 막(130)을 제작할 수 있다. 이외에도, 다수의 미세 구멍(131)이 형성된 멤브레인(Membrane)을 본 발명에 따른 핵산 검출 막(130)으로 적용 가능함은 물론이다.
여기서, 핵산 검출 막(130)의 미세 구멍(131)은 타겟 핵산에 따라 다양한 사이즈로 형성될 수 있는데, 타겟 핵산 이외의 요소들은 통과할 수 있도록 마련되어 다른 요소에 의한 미세 구멍(131)의 막힘 현상을 제거할 수 있다. 본 발명에서는 미세 구멍(131)의 직경이 50nm ~ 50um 사이의 범위에서 결정되는 것을 예로 한다.
한편, 프로브 링커(200)는 핵산 검출 막(130)의 표면에 형성된다. 바람직하게는 프로브 링커(200)는 핵산 검출 막(130)에 형성된 미세 구멍(131) 내측 표면에도 형성될 수 있다. 여기서, 핵산 검출 막(130)의 표면에 형성된 프로브 링커(200)와 타겟 핵산 간의 상보적 결합을 통한 증폭에 의해 형성되는 하이드로겔이 핵산 검출 막(130)에 형성된 미세 구멍(131)을 막거나 사이즈를 감소시켜 샘플 챔버(120)에 수용된 샘플(S)이 연결 도관(140)을 통해 유동할 때, 최종 도달 거리, 최종 도달 거리까지의 도달 시간, 그리고 샘플(S)의 유동 속도의 변화를 야기하게 된다. 그리고, 최종 도달 거리, 도달 시간 및 유동 속도 중 적어도 하나를 이용하게 되면 타겟 핵산의 검출이 가능하게 된다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)의 프로브 링커(200)의 예를 나타낸 도면이다. 도 4를 참조하여 설명하면, 본 발명에 따른 프로브 링커(200)는 코팅부(210), 프라이머(220) 및 템플레이트(230)를 포함하는 것을 예로 한다.
코팅부(210)는 핵산 검출 막(130)의 표면에 코팅되는데, 프라이머(220)가 부착되어 고정될 수 있는 재질로 마련되는데, 예를 들어, 카볼실기 또는 아민기가 코팅된다. 구체적인 예로 코팅부(210)는 5-히드록시도파민 염산, 노르에피네프린, 에피네프린, 파이로갈롤아민, DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨, 탄닌류, 파이로갈롤, 파이로카테콜, 헤파린-카테콜, 키토산-카테콜, 폴리에틸렌글리콜-카테콜, 폴리에틸렌이민-카테콜, 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜, 히알루론산-카테콜, 폴리라이신-카테콜 (polylysine-catechol), 및 폴리라이신 (polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함하는 것을 예로 한다.
프라이머(220)는 코팅부(210)에 고정되며, 템플레이트(230)는 프라이머(220)와 상보적으로 결합한다. 여기서, 템플레이트(230)는 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 제1 결합 부위와, 프라이머(220)와 상보적으로 결합하는 제2 결합 부위, 그리고 템벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트(230) 내 상보적인 제3 결합 부위를 포함하게 된다. 그리고, 제1 결합 부위는 템플레이트(230)의 양 말단에 분리되어 형성되고, 제2 결합 부위는 분리되어 형성된 제3 결합 부위 사이에 형성된다.
여기서, 프라이머(220)는 티올(thiol), 아민(amine), 하이드록실(hydroxyl), 키복실(carboxyl), 이소티오시아네이트 (isothiocyanate), NHS 에스테르, 알데히드(aldehyde), 에폭시드(epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 카바메이트(carbamate), 이미다졸 카바메이트(imidazole carbamate), 말레이미드(maleimide), 아지리딘(aziridine), 설폰(sulfone), 비닐설폰(vinylsulfone), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논 (anthraquinone), 및 디엔(Diene) 기로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 발단이 변형된 것을 예로 한다.
여기서, 상기와 같은 구성을 통해, 본 발명에 따른 프로브 링커(200)에 타겟 핵산과 결합되어 증폭되고, 증폭되는 타겟 핵산이 엉기어 큰 사이즈의 하이드로겔을 형성하게 되면서, 핵산 검출 막(130)에 형성된 미세 구멍(131)을 막게 된다.
전술한 예에서의 프로브 링커(200)는 2015년에 공개된 Ho Yeon Lee 등의 논문 'DhITACT: DNA Hydrogel Formation by Isothermal Amplification of Complementary Target in Fluidic Channels (June 17, 2015, Advanced Materials, Volume 27, Issue 23, Pages 3513-3517)에 개시된 구성을 예로 하고 있으며, 그 상세한 설명은 상기 논문에 기재된 바와 같다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출 막(130)은 연결 도관(140)의 입구에 설치된다. 이를 통해, 샘플 챔버(120)에 수용된 샘플(S)은 연결 도관(140)의 입구에 설치되는 핵산 검출 막(130)의 미세 구멍(131)을 통해 연결 도관(140)으로 유동하게 되는데, 연결 도관(140)에서 유동하는 과정에서 미세 구멍(131)을 통과하는 과정에서 발생하는 샘플(S)의 버블(Bubble) 현상을 방지할 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 상술한 한국등록특허 제10-1799192호에 개시된 '표적 유전자 검출을 위한 미세 유동 장치(100)'에서는 미세구슬 패킹부를 마이크로 채널의 중간 영역에 설치하는 것을 예로 하고 있다.
그러나, 미세구슬 패킹부에 형성된 공극을 샘플(S)이 통과할 때, 유동 속도가 빠를 경우 버블이 발생하게 되고, 이는 샘플(S)의 유동을 방해하는 원인으로 작용하게 된다. 따라서, 버블 발생을 방지하기 위해 유동 압력을 줄이게 되면, 핵산 검출에 있어 반복 재현성이 저하될 뿐만 아니라, 잦은 유동 압력에서의 제어가 필요하게 되어, 검출 과정의 제약으로 작용하게 된다.
반면, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)에서는 핵산 검출 막(130)을 연결 도관(140)의 입구에 설치하여, 샘플 챔버(120)에서 연결 도관(140)으로 유동할 때 바로 핵산 검출 막(130)의 미세 구멍(131)을 통해 유동하도록 함으로써, 버블 발생 현상을 제거하여 검출의 재현 가능성을 높일 수 있다.
이러한 버블 발생 현상을 제거함에 따라, 유동 압력 제어의 제약을 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 단일의 핵산 검출 막(130)을 이용함으로써, 미세구슬 패킹부를 적용할 때보다도 낮은 압력으로 제어가 가능하게 된다.
여기서, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)는, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 샘플 챔버(120) 내부에 설치되는 교반기(121)를 더 포함할 수 있다.
교반기(121)는 샘플 챔버(120) 내부에서 회전하면서 샘플 챔버(120) 내부에 주입된 샘플(S)을 교반한다. 이를 통해, 샘플 챔버(120) 내의 샘플(S)은 교반기(121)에 의해 교반되는 과정에서, 연결 도관(140)의 입구에 설치된 핵산 검출 막(130)에 골고루 접촉하게 되며, 이를 통해 교반 과정에서 샘플(S) 내의 타겟 핵산이 핵산 검출 막(130)에 형성된 프로브 링커(200)와 상보적 결합될 확률이 증가하게 된다.
이에, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)에서는 샘플 챔버(120) 내의 샘플(S)이 교반기(121)에 의해 기 설정된 교반 시간동안 교반된 후에, 연결 도관(140)을 따라 유동하는 것을 예로 한다. 여기서, 교반 시간은 5 ~30분 사이의 범위 내에서 설정되는 것을 예로 하는데, 교반 시간의 설정은 프로브 링커(200)와 타겟 핵산 간의 상보적 결합에 필요한 시간과, 검사 시간 등을 고려하여 설정되는 것이 바람직하다.
또한, 샘플 챔버(120) 내의 샘플(S)은 기 설정된 온도 범위로 가열될 수 있다. 여기서, 온도 범위는 프로브 링커(200)와 타겟 핵산 간의 상보적 결합에 의한 증폭 과정, 즉 PCA 반응에 최적 반응 온도로 설정되는데, 본 발명에서는 30 ~37 ℃ 범위 내에서 설정되는 것을 예로 한다.
이러한 구성에 따라, 교반 과정에서 샘플(S) 내의 타겟 핵산이 핵산 검출 막(130)의 표면에 형성된 프로브 링커(200)와 충분이 결합하게 되고, 후술할 유동력에 의해 샘플(S)이 핵산 검출 막(130)의 미세 구멍(131)을 통과하여 연결 도관(140)을 따라 유동할 때, 보다 빠른 시간 내에 미세 구멍(131)이 막히거나, 기 설정된 거리까지 도달하는 시간이 단축되는 등, 검출 시간을 줄일 수 있게 된다.
또한, 샘플(S)이 미세 구멍(131)을 통과하기 전이 미리 타겟 샘플(S)과 프로브 링커(200)가 결한 상태가 되어, 미세 구멍(131)을 통한 샘플(S)의 유동에 따른 버블 현상의 발생 가능성을 줄일 수 있게 된다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)에서 샘플(S)에 유동력을 인가하기 위한 예들을 설명하기 위한 도면이다.
도 5의 (a)에 도시된 실시예에서는 폐기 챔버(150)를 마개를 통해 막은 상태에서, 상술한 바와 같이, 교반기(121)가 샘플 챔버(120) 내의 샘플(S)을 교반 시간동안 교반시킨 후, 주사 바늘(171)과 같은 물체로 찔러 배기 구멍을 형성하게 되면, 빈 상태의 폐기 챔버(150)와 샘플 챔버(120) 간의 수두차가 발생하여, 샘플 챔버(120) 내의 샘플(S)이 핵산 검출 막(130)의 미세 구멍(131)을 통해 연결 도관(140)으로 유동하게 된다.
도 5의 (b)에 도시된 실시예에서는, 읍압 장치(172), 예컨대 시린지 펌프를 이용하여 폐기 챔버(150)로 샘플(S)의 유동을 음압을 제공하는 예를 나타낸 도면이다. 그리고, 도 5의 (c)에 도시된 실시예에서는, 칩 본체(110) 자체를 폐기 챔버(150) 방향으로 기울어, 중력에 의해 샘플 챔버(120)의 샘플(S)이 연결 도관(140) 방향으로 유동할 수 있는 유동력을 제공하는 예를 나타내고 있다.
여기서, 샘플 챔버(120)에는 샘플(S) 주입 후 샘플(S)과 섞이지 않는 오일(O), 예컨대 미네랄 오일(O)이 주입될 수 있다. 이를 통해, 오일(O)은 샘플(S)의 상부에서 샘플(S)을 외부와 차단하게 된다. 즉, 외부로부터의 이물질의 유입을 차단할 뿐만 아니라, 교반 과정 동안 샘플(S)이 공기 중으로 증발되지 않도록 외부 공기와 샘플(S)을 차단하게 된다. 또한, 오일(O)은 샘플(S)의 연결 도관(140)으로의 유동을 위한, 상술한 중력이나 수두차에 의한 유동력을 증가시키는 효과를 제공하게 된다.
다시, 도 1을 참조하여 설명하면, 도 1에 도시된 실시예에서는 샘플 감지부(160)가 광을 조사하는 LED 모듈(161)과, LED 모듈(161)에서 조사되는 광을 감지하는 포토 다이오드(162)로 구성되는 것을 예로 하고 있다. LED 모듈(161)은 연결 도관(140)의 일측에서 연결 도관(140) 내부를 향해 광을 조사하고, 포토 다이오드(162)는 연결 도관(140)의 반대측에서 LED 모듈(161)로부터 조사된 광을 감지하도록 구성된다. 여기서, LED 모듈(161) 및 포토 다이오드(162)는 연결 도관(140)의 유동 경로 방향을 따라 배열된 상태로 배치될 수 있는데, 이를 통해, 연결 도관(140)을 따라 샘플(S)이 유동하게 되면, 샘플(S)이 LED 모듈(161)로부터 조사된 광을 차단하게 되어, 샘플(S)이 연결 도관(140)을 따라 유동한 최대 이동 거리나 도달 시간 등의 검출이 가능하게 된다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(100)의 샘플 감지부(160)의 예들을 설명하기 위한 도면이다.
도 6의 (a)에 도시된 실시예에서는, 연결 도관(140) 내부에 다공성 재질의 스틱 바나 리트머스 시험지와 같은 샘플 감지 부재(181)를 설치하고, 해당 샘플 감지 부재(181)가 샘플(S)과 반응하여 색이 변하는 특성을 이용한 샘플 감지부(160)의 예를 나타낸 도면이다. 이 때, 샘플 감지부(160)는 카메라를 포함할 수 있으며, 카메라에 의해 촬영된 영상에서 샘플(S)의 유동 거리 등을 검출하도록 마련될 수 있다.
도 6의 (b)에 도시된 실시예에서는 폐기 챔버(150)에 샘플(S)과 반응하는 변색 물질(182)을 수용시킨 상태에서, 샘플(S)이 폐기 챔버(150)로 도달하는 시간을 변색 물질(182)의 변색을 통해 확인할 수 있는 샘플 감지부(160)의 예를 나타내고 있다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(300)를 나타낸 도면이다.
도 7에 도시된 실시예예 따른 핵산 검출용 미세 유동 장치(300)에서의 연결 도관(340)은 샘플 챔버(320a,320b)와 폐기 챔버(350)를 각각 독립적으로 연결하도록 칩 본체(310)에 복수개가 형성되는 것을 예로 한다.
이 때, 샘플 챔버(320a,320b)는 주입 챔버(320a)와, 복수의 교반 챔버(320b)를 포함할 수 있으며, 각각의 교반 챔버(320b)가 하나씩의 연결 도관(340)을 통해 폐기 챔버(350)와 연결되는 것을 예로 한다. 즉, 각각의 연결 도관(340)의 입구가 해당 교반 챔버(320b)와 연결되도록 구성되어, 각각의 연결 도관(340)의 입구에 핵산 검출 막(330)이 설치될 수 있다.
이 때, 각각의 연결 도관(340) 입구에 설치되는 핵산 검출 막(330)의 표면에는 서로 다른 타겟 핵산과 결합되는 물질로 마련되는 프로브 링커(200)가 형성됨으로써, 하나의 핵산 검출용 미세 유동 장치(300)를 이용하여 다수의 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있게 된다.
여기서, 본 발명에서는 폐기 챔버(350) 또한 각각의 연결 도관(340)에 각각 연결되도록 복수개로 형성되는 것을 예로 하는데 하나의 폐기 챔버(350)가 각각의 연결 도관(340)과 연결되도록 구성될 수 있다.
다른 예로, 복수의 연결 도관(340) 중 어느 하나에 설치되는 핵산 검출 막(330)에는 프로브 링커가 부착되지 않은 네거티브 기준 채널로 적용될 수 있다. 즉, 프로브 링커가 부착되지 않은 핵산 검출 막(330)에서는 핵산의 증폭 반응이 발생하지 않아, 샘플(S)이 유동이 원활하여 다른 핵산 검출 막(330)의 막힘 현상에 의한 유동과 비교가 가능하게 된다.
또 다른 예로, 복수의 연결 도관(340) 중 어느 하나에 설치되는 핵산 검출 막(330)에 형성된 프로브 링커는 타겟 핵산의 존재 여부와 무관하게 핵산 증폭이 발생하도록 형성되어 포지티브 기준 채널로 적용될 수 있다. 즉, 네거티브 기준 채널과는 반대로, 포지티브 기준 채널의 경우 샘플(S)의 유동 초기부터 막힘 현상이 발생하게 되어, 이를 기준으로 다른 연결 도관(340)을 통한 샘플(S)이 유동이 비교 가능하게 된다.
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.
[부호의 설명]
100,300 : 미세 유동 장치 110,310 : 칩 본체
120 : 샘플 챔버 320a : 주입 챔버
320b : 교반 챔버 121,321 : 교반기
130,330 : 핵산 검출 막 131 : 미세 구멍
140,340 : 연결 도관 150,350 : 폐기 챔버
160 : 샘플 감지부 161 : LED 모듈
162 : 포토 다이오드 171 : 주사 바늘
172 : 음압 장치 181 : 샘플 감지 부재
182 : 변색 물질 200 : 프로브 링커
210 : 코팅부 220 : 프라이머
230 : 템플레이트

Claims (14)

  1. 핵산 검출용 미세 유동 장치에 있어서,
    칩 본체와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되고, 샘플이 주입되는 샘플 챔버와,
    상기 샘플 챔버와 이격되어 상기 칩 본체 내부에 형성되는 폐기 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 샘플 챔버와 상기 폐기 챔버를 연결하여 상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플의 유동 경로를 형성하고, 상기 샘플 챔버와 연결되는 입구와 상기 폐기 챔버와 연결되는 출구를 갖는 연결 도관과,
    상기 연결 도관의 상기 입구에 설치되고, 상기 샘플의 유동 방향으로 관통된 적어도 하나 이상의 미세 구멍이 형성된 핵산 검출 막과,
    상기 핵산 검출 막의 표면에 형성되는 프로브 링커를 포함하며;
    상기 프로브 링커는 상기 샘플 내의 타겟 핵산과의 상보적 결합을 통해 증폭되어 상기 타겟 핵산을 검출하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프로브 링커와 상기 타겟 핵산 간의 상보적 결합을 통한 증폭에 의해 상기 핵산 검출 막의 상기 미세 구멍이 막히거나 상기 미세 구멍의 사이즈가 감소되어 상기 샘플의 상기 연결 도관으로의 최종 도달 거리, 상기 최종 도달 거리까지의 도달 시간, 및 상기 샘플의 유동 속도 중 적어도 하나가 변하고, 상기 최종 도달 거리, 상기 도달 시간 및 상기 유동 속도 중 적어도 하나에 의해 상기 타겟 핵산을 검출하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 챔버 내부에 설치되어, 상기 샘플 챔버 내부에 주입된 상기 샘플을 교반하는 교반기를 더 포함하며;
    상기 샘플 챔버 내부의 상기 샘플은 상기 교반기에 의해 교반되는 과정에서 상기 핵산 검출 막의 상기 프로브 링커와 상기 샘플 내의 상기 타겟 핵산이 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플은 상기 교반기에 의해 기 설정된 교반 시간동안 교반된 후, 상기 연결 도관을 따라 유동하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플을 기 설정된 온도 범위로 가열하는 샘플 가열부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 온도 범위는 30 ~ 37 ℃ 범위 내에서 설정되고, 상기 교반 시간은 5 ~ 30분 사이의 범위 내에서 설정되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 샘플 챔버 내의 상기 샘플을 상기 연결 도관을 따라 유동시키기 위한 유동력은,
    상기 폐기 챔버로부터의 음압,
    상기 칩 본체의 기울기에 따른 중력,
    상기 샘플이 수용된 상기 샘플 챔버와 빈 상태의 상기 폐기 챔버 간의 수두차 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 샘플 챔버에는 상기 샘플 주입 후 상기 샘플과 섞이지 않는 오일이 주입되며;
    상기 오일은 상기 샘플의 상부에서 상기 샘플을 외부와 차단시키고, 상기 샘플의 상기 연결 도관으로의 유동을 위한 중력 또는 수두차를 증가시키는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 프로브 링커는
    상기 핵산 검출용 메쉬의 표면에 코팅되는 코팅부와,
    상기 코팅부에 결합되는 프라이머와,
    상기 프라이머와 상보적으로 결합하는 템플레이트를 포함하며;
    상기 템플레이트는
    상기 타겟 핵산과 제1 결합 부위와,
    상기 프라이머와 상보적으로 결합하는 제2 결합 부위와,
    덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 제3 결합 부위를 포함하며;
    상기 제1 결합 부위는 상기 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 제2 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 제3 결합 부위 사이에 형성되며;
    상기 제1 결합 부위에는 상기 타겟 핵산과의 상보적 결합을 촉진하는 리가아제 효소가 형성되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 연결 도관을 따라 유동하는 상기 샘플을 감지하기 위한 샘플 감지부를 더 포함하며,
    상기 샘플 감지부의 감지 결과에 기초하여, 상기 최종 도달 거리, 상기 도달 시간 및 상기 유동 속도 중 적어도 하나가 측정되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 연결 도관은 상기 샘플 챔버와 상기 폐기 챔버를 각각 독립적으로 연결하도록 상기 칩 본체에 복수개가 형성되고,
    각각의 상기 연결 도관의 입구에 상기 핵산 검출 막이 설치되며;
    각각의 상기 핵산 검출 막의 표면에 형성되는 상기 프로브 링커는 서로 다른 타겟 핵산과 결합하는 물질로 마련되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    복수의 상기 연결 도관 중 어느 하나에 설치되는 핵산 검출 막에는 프로브 링커가 부착되지 않은 네거티브 기준 채널로 적용되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  13. 제11항에 있어서,
    복수의 상기 연결 도관 중 어느 하나에 설치되는 핵산 검출 막에 형성된 프로브 링커는 상기 타겟 핵산의 존재 여부와 무관하게 핵산 증폭이 발생하도록 형성되어 포지티브 기준 채널로 적용되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 검출 막은 상기 미세 구멍이 형성된 멤브레인 또는 메쉬를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 미세 유동 장치.
PCT/KR2021/009538 2020-07-24 2021-07-23 핵산 검출용 미세 유동 장치 Ceased WO2022019699A1 (ko)

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