WO2022234855A1 - 中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドの設計方法 - Google Patents

中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドの設計方法 Download PDF

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峻哲 川野邊
正輝 山上
忠士 梅本
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    • C12N2320/53—Methods for regulating/modulating their activity reducing unwanted side-effects

Definitions

  • the present invention relates to a method for designing oligonucleotides with reduced central toxicity, oligonucleotides synthesized based on the design results, therapeutic agents containing the oligonucleotides, and the like.
  • Antisense oligonucleotides exert their effects by hybridizing to target nucleic acid sequences and suppressing gene expression itself.
  • Various artificial nucleic acids have been developed and introduced for the purpose of improving the nuclease resistance of antisense oligonucleotides and improving the binding affinity and specificity for target nucleic acids, and various formulations have been marketed.
  • a new problem that has recently emerged is how to avoid the potential toxicity of artificial nucleic acids.
  • Toxicity of antisense oligonucleotides is classified into so-called “toxicity caused by hybridization with RNA (off-target toxicity)" and "toxicity caused by binding to intracellular and extracellular proteins and metal ions, etc., independent of hybridization with RNA. can be categorized as toxic (non-off-target toxicity). And various approaches have been taken to avoid these toxicities.
  • Patent Document 1 discloses that non-off-target toxicity can be avoided by appropriately chemically modifying the base and sugar moieties of nucleic acids.
  • Patent Document 2 non-Watson-Crick It is disclosed that the formation of type base pairs can be suppressed and avoided.
  • phosphorothioate modification between nucleosides is the cause of hepatotoxicity (for example, Non-Patent Document 1). It is disclosed that hepatotoxicity can be reduced while maintaining the activity by substituting an artificial nucleic acid having a structure.
  • toxicity evaluation related to antisense oligonucleotide toxicity reduction techniques so far has mainly been performed using hepatotoxicity as the main indicator, and no deep knowledge has been obtained about toxicity evaluation in other tissues.
  • central toxicity is an important endpoint in drug safety testing, but little is known about central toxicity of antisense oligonucleotides.
  • Non-Patent Document 2 The relationship between antisense oligonucleotides and central toxicity, especially the reduction of central toxicity, is found in Patent Document 4. Correlation between antisense oligonucleotide sequence and central toxicity (oscillation of intracellular free calcium concentration in nerve cells) is disclosed. In addition, as far as the present inventors know, there is only one document that evaluates central toxicity due to phosphorothioate modification in antisense oligonucleotides (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 discloses that central toxicity can be reduced by replacing the phosphorothioate bond of the wing portion with a phosphodiester bond in a gapmer-type oligonucleotide having a phosphorothioate modification.
  • Non-Patent Document 2 the phosphorothioate modification is removed in an antisense oligonucleotide (ASO) in which a part of the phosphorothioate modification is removed and the 2'-position of the sugar moiety is modified to contribute to stability.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • antisense activity can be reduced compared to ASOs without the antisense activity. The reduction in antisense activity is believed to be due to the reduction in ASO stability resulting from the removal of the phosphorothioate modification.
  • an object of the present invention is to modify a site other than the 2'-position of the sugar moiety of ASO, preferably by further removing a part of the phosphorothioate modification of ASO, thereby reducing the central
  • An object of the present invention is to provide a method of designing ASOs capable of reducing toxicity, preferably further maintaining or enhancing antisense activity, and ASOs synthesized based on the design results.
  • Non-Patent Document 2 the modification at the 5'-position of the sugar moiety, not the modification at the 2'-position or the 4'-position of the sugar moiety, which is widely used in nucleic acid modification (for example, Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 3 by introducing a specific structure such as a cyclopropane structure at the 5'-position of the sugar moiety of a phosphorothioate-modified nucleoside, non-specific We got the idea that it might be possible to reduce central toxicity through suppression of binding to proteins.
  • Patent Document 3 discloses that hepatotoxicity is reduced in ASOs in which a modification is introduced at the 5′ position of the sugar moiety of a nucleoside and a phosphorothioate bond near the modification is replaced with a phosphodiester bond.
  • ASOs in which a modification is introduced at the 5′ position of the sugar moiety of a nucleoside and a phosphorothioate bond near the modification is replaced with a phosphodiester bond.
  • the mechanism of occurrence of hepatotoxicity by ASO and central toxicity by ASO is considered to be largely different. Based on this idea, the present inventors have made further intensive studies and completed the present invention.
  • a method of designing oligonucleotides with reduced central toxicity comprising: (1) The carbon atom at the 5′-position of the sugar portion of at least one nucleoside constituting an oligonucleotide having a phosphorothioate modification is represented by the following formula I
  • R6 and R7 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, or a methyl group) or the following formula I'
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group (except when both R 4 and R 5 are hydrogen atoms)) and optionally (2) replacing at least one phosphorothioate bond of said oligonucleotide with a phosphodiester bond.
  • the oligonucleotide is a gapmer-type oligonucleotide.
  • at least one of the nucleosides substituted in step (1) is located in the gap region.
  • a method for evaluating the degree of central toxicity reduction of oligonucleotides having phosphorothioate modifications comprising the following steps (1)-(3): (1) providing an oligonucleotide having a phosphorothioate modification; (2) a step of preparing an oligonucleotide designed by the method according to any one of [1] to [5]; and (3) central toxicity of the oligonucleotide prepared in step (2); ) to compare the central toxicity of the oligonucleotides prepared in ).
  • An oligonucleotide having a phosphorothioate linkage with reduced central toxicity, wherein the 5′-position carbon atom of the sugar moiety of at least one nucleoside constituting the oligonucleotide is represented by the following formula I
  • R6 and R7 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, or a methyl group) or the following formula I'
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group (except when both R 4 and R 5 are hydrogen atoms)) optionally at least one internucleoside bond is a phosphodiester bond.
  • the oligonucleotide of [8] wherein at least one of the nucleosides having the structure represented by formula I or I' above is located in the gap region.
  • a reagent for controlling gene expression comprising the oligonucleotide of any one of [7] to [11].
  • a therapeutic agent for diseases comprising the oligonucleotide according to any one of [7] to [11].
  • a method for controlling gene expression comprising administering the oligonucleotide of any one of [7] to [11].
  • a method for treating a disease in a mammal which comprises administering to the mammal an effective amount of the oligonucleotide according to any one of [7] to [11].
  • FIG. 1 shows the measurement results of behavioral scores when antisense oligonucleotide (LX-A4285) was intracerebroventricularly administered to mice.
  • Figure 2 shows the evaluation results of the antisense effect when antisense oligonucleotides (LX-A0070, LX-A4285, LX-A5106, LX-A5108 and LX-A5113) were administered to mice to human neuroblasts.
  • FIG. 3 shows the measurement results of behavioral scores when antisense oligonucleotides (LX-A4285, LX-A5108 and LX-A5113) were intracerebroventricularly administered to mice.
  • oligonucleotides with reduced central toxicity can be designed by using a nucleoside having a 5'-cyclopropane structure as a modified nucleotide instead of a phosphorothioate-modified nucleotide. It is an invention completed based on
  • a method for designing oligonucleotides with reduced central toxicity comprising: (1) The 5′-position carbon atom of the sugar portion of at least one nucleoside constituting an oligonucleotide having a phosphorothioate modification (hereinafter sometimes referred to as “PS modified nucleotide”) is represented by the following formula I
  • R6 and R7 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, or a methyl group) or the following formula I'
  • oligonucleotides shall also include pharmacologically acceptable salts of oligonucleotides.
  • the design method of the present invention may include (2) a step of substituting at least one phosphorothioate bond of the oligonucleotide with a phosphodiester bond.
  • a method for reducing central toxicity of oligonucleotides comprising: (1′) The 5′-position carbon atom of the sugar portion of at least one nucleoside constituting the PS-modified nucleotide is represented by the following formula I
  • R6 and R7 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, or a methyl group) or the following formula I'
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group (except when both R 4 and R 5 are hydrogen atoms)
  • a method (hereinafter sometimes referred to as "the toxicity reduction method of the present invention") is provided, comprising the step of substituting a structure represented by: In one aspect, both R6 and R7 are hydrogen atoms.
  • the toxicity reduction method of the present invention includes: (2') A step of replacing at least one phosphorothioate bond of the oligonucleotide with a phosphodiester bond may be included.
  • the "oligonucleotide having a phosphorothioate modification” means that the bond between at least one nucleoside of the oligonucleotide is a phosphorothioate bond (i.e., the oxygen atom of the phosphate group between the nucleosides is substituted with a sulfur atom. ) means an oligonucleotide.
  • Phosphorothioate modification is generally used to enhance the in vivo stability of natural oligonucleotides such as DNA and RNA, especially enzyme resistance.
  • these phosphorothioate-modified oligonucleotides have a common problem of toxicity. The method of the present invention was completed as a result of research aimed at reducing central toxicity among the toxicity of phosphorothioate-modified oligonucleotides.
  • Central toxicity in the present invention is also referred to as "central nervous system toxicity", and toxicity findings derived from the central nervous system identified by general condition changes and brain histopathological changes in rodents, non-human primates and humans point to For example, in rodents, general condition changes including reversible minor symptoms of irritability, hypolocomotion, bradypnea and blepharoptosis to severe symptoms such as convulsions and death.
  • central toxicity in the present invention can be evaluated by behavioral scores obtained by a modified method of Irwin (Irwin S., Psychopharmacologia. 1968; 13(3): 222-257).
  • reduced central toxicity refers to the central toxicity of the PS-modified nucleotide (hereinafter sometimes referred to as "target oligonucleotide”) that is the target (design source) of the method of the present invention.
  • target oligonucleotide the oligonucleotide after performing step (1) or (1′) of the method of the present invention (i.e., the designed oligonucleotide or the oligonucleotide with reduced toxicity)
  • the present invention hereinafter, “after performing the present invention (sometimes referred to as "oligonucleotide”
  • oligonucleotide has low central toxicity, or is expected to have low central toxicity.
  • the median behavioral score in the group administered with the subject oligonucleotide and the oligonucleotide after administration of the present invention were calculated using the modified Irwin method. If the difference from the median behavior score in the group tested is 1 or more (e.g., 1, 5, 10, 20 or more), it can be evaluated that central toxicity has been reduced, and such a value indicates central The degree of toxicity can also be assessed.
  • step (1) of the design method of the present invention it is not necessary to actually synthesize oligonucleotides, and it is sufficient to imagine them in your head.
  • the imaged oligonucleotides are embodied in a program that operates on a computer (eg, oligonucleotide design software, graphic design tools, office software, etc.) or on paper. Therefore, as described in Example 1 below, for example, the act of designing oligonucleotides that are expected to reduce central toxicity and compiling the oligonucleotides in a tabular format is also a practice of the designing method of the present invention. correspond to
  • the target oligonucleotide contains a sequence complementary to the sequence of the oligonucleotide (in this specification, mRNA shall also include pre-mRNA.) function (post-transcriptional modification, translation, etc.) (hereinafter sometimes referred to as “inhibitory ASO”), or enhance the function (hereinafter sometimes referred to as "enhancing ASO”) good.
  • Inhibitory ASOs typically form a double-stranded region with a target mRNA, and the double-stranded region is cleaved by ribonuclease H (RNase H), thereby suppressing the function of the target mRNA. .
  • enhanced ASO typically forms a double-stranded region with a pre-mRNA splicing-promoting sequence, masks the sequence, and skips splicing, thereby enhancing (recovering) the function of mRNA. (which results in increased cellular abundance of functional proteins).
  • the function of the mRNA can be enhanced by forming a double-stranded region with the binding sequence of the enzyme that degrades the mRNA contained in the target mRNA, thereby masking the sequence and suppressing the degradation of the mRNA. can.
  • the inhibitory ASO is preferably a gapmer-type oligonucleotide.
  • the term "gapmer-type oligonucleotide” means a plurality of (eg, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or more) nucleotides recognized by RNase H.
  • ap region is at least one modified to confer resistance to ribonucleases (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more) nucleotides (herein, the 3′ external region is referred to as the “3′ wing region” and the 5′ external region as the “5′ (sometimes referred to as "wing regions”).
  • ribonucleases e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more
  • the 3′ external region is referred to as the “3′ wing region” and the 5′ external region as the “5′ (sometimes referred to as "wing regions”).
  • At least one nucleoside constituting each of the 3' wing region and the 5' wing region is preferably a bridging nucleoside.
  • the enhanced ASO preferably has at least one nucleoside modified to impart resistance to RNase.
  • Such ASOs may be those in which all nucleoside residues are modified, or those in which some nucleoside residues are modified (ie, Mixmer-type oligonucleotides).
  • a bridged nucleoside is preferred as such a modified nucleoside.
  • nucleosides that make up the target oligonucleotides include nucleosides represented by the following formula II.
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more substituents selected from the ⁇ group, wherein
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • a mercapto group a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group, a linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, and a halogen atom
  • R 8 is a hydrogen atom
  • R 9 is a hydrogen atom, a halogen atom, or a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 8 and R 9 together have the following formula:
  • R 21 is selected from a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and the above ⁇ group an aryl group having 3 to 10 carbon atoms which may have one or more optional substituents and may contain a heteroatom, and one or more optional substituents selected from the ⁇ group an aralkyl group having an aryl moiety of 3 to 12 carbon atoms which may optionally contain a heteroatom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis;
  • R 22 and R 23 are each independently a hydrogen atom; optionally substituted with an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom, and optionally branched or forming a ring; an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; or an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms
  • examples of the crosslinked nucleoside include nucleosides having the following structural formula.
  • R is a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, a hetero atom an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain , an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group, more preferably R is a hydrogen atom or a methyl group.
  • the definition of Base is: Same definition as in Formula II above.)
  • the nucleosides constituting the subject oligonucleotides may be natural nucleosides, and examples of such natural nucleosides include adenosine, N6-methyladenosine, guanosine, uridine, 5-methyluridine, cytidine, deoxyadenosine, N6- methyl-2'-deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, deoxyuridine, deoxycytidine, 5-methyl-2'-deoxycytidine and the like.
  • the length of the target oligonucleotide is not particularly limited as long as it has antisense activity, but is typically 10 to 50 nucleotides long, preferably 10 to 30 nucleotides long, more preferably 13 to 30 nucleotides long. Yes, more preferably 15-20 nucleotides in length.
  • At least one nucleoside constituting an oligonucleotide after implementing the present invention can be represented by the following formula III or III'.
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and Base are the same as in Formula I and Formula II above.
  • both R 6 and R 7 are hydrogen atoms.
  • the nucleoside having the structure represented by formula I or formula I' may be present at any position of the target PS-modified nucleotide. It is preferred, however, that at least one (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more) nucleosides are located in the gap region.
  • the phosphorothioate linkage to be replaced as a result of step (2) or (2') of the method of the invention may be present between any of the nucleosides of the PS modified nucleotide of interest, but at least one (e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more) internucleoside phosphorothioate linkages are preferably located in the gap region.
  • the phosphorothioate linkage to be substituted as a result of step (2) or (2′) of the method of the invention is 5′ of the nucleoside substituted in step (1) or (1′) of the method of the invention. It may be a laterally or 3′ adjacent bond, or it may be a non-adjacent bond. That is, the target nucleotide residues in step (1) or (1') and step (2) or (2') of the present invention can be arbitrarily selected.
  • modifications may be made in addition to substitution of the 5'-position carbon atom of the sugar portion of the nucleoside and substitution of the phosphorothioate bond.
  • modifications include, for example, 2′-O-methoxyethyl modification of the sugar moiety, 2′-O-methyl modification of the sugar moiety, 2′-fluoro modification of the sugar moiety, and modification of the 2′-position and 4′-position of the sugar moiety.
  • examples include, but are not limited to, bridging (substitution to a bridging nucleoside), substitution of a bridging nucleoside to another bridging nucleotide, methylation or acetylation of Base (base portion), substitution of Base, and the like.
  • the base pair may be not only a Watson-Crick base pair but also a Hoogsteen base pair or a Wobble base pair.
  • Examples of the crosslinked nucleosides include nucleosides having the following structural formulas.
  • R is a hydrogen atom, an optionally branched or ring-forming alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, an optionally branched or ring-forming alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms, a hetero atom an aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain , an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom, or an amino group-protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group, more preferably R is a hydrogen atom or a methyl group.
  • the definition of Base is: Same definition as in Formula II above.)
  • oligonucleotides with reduced central toxicity compared to PS-modified nucleotides are designed, or The central toxicity of PS modified nucleotides is reduced.
  • the reduction in central neurotoxicity of oligonucleotides following the practice of the present invention may actually be confirmed, and the degree of reduction in central neurotoxicity of oligonucleotides following the practice of the present invention may be assessed.
  • a method of assessing the degree of central toxicity reduction of a PS-modified nucleoside comprising the following steps (I)-(III): (I) preparing a PS-modified nucleotide; (II) a step of preparing an oligonucleotide designed by the design method of the present invention, and (III) comparing the central toxicity of the oligonucleotide prepared in step (II) and the central toxicity of the oligonucleotide prepared in step (I) A method (hereinafter sometimes referred to as the "evaluation method of the present invention") is provided.
  • the PS-modified nucleotide prepared in step (I) of the evaluation method of the present invention can be obtained by purchasing a commercially available product, producing it by a known synthesis method, or having it produced by a third party outsourced synthesis. can.
  • the oligonucleotides prepared in step (II) of the evaluation method of the present invention are prepared by a known synthesis method described below based on the structure of the oligonucleotide designed by the design method of the present invention, or the synthesis is commissioned. It can be obtained by having someone else produce it.
  • step (II) of the evaluation method of the present invention can be performed using the method of calculating the score by the modified Irwin method described above or other known methods.
  • Step (III) of the evaluation method of the present invention can be carried out by comparing the scores and the like.
  • Oligonucleotides designed by the method of the present invention not only have reduced central toxicity, but can also maintain antisense activity.
  • "maintenance of antisense activity” means that the antisense activity of the oligonucleotide after carrying out the present invention is maintained or increased compared to the antisense activity of the target oligonucleotide.
  • SH-SY5Y cells are contacted with the same amount of each antisense oligonucleotide, and after 24 hours or more, It can be performed by recovering mRNA and comparing the amount of said mRNA.
  • the oligonucleotide after carrying out the present invention if there is no statistically significant difference in the amount of target mRNA compared to the group contacted with the target oligonucleotide, or if it is reduced, anti- It can be evaluated that the sense activity is maintained.
  • enhanced ASO the same amount of each antisense oligonucleotide is brought into contact with SH-SY5Y cells, and after 24 hours or more, proteins encoded by target mRNAs are collected from the cells, and functional proteins among the proteins are collected. can be done by comparing the amounts of
  • the method of the present invention may further comprise a step of evaluating the antisense activity of the oligonucleotide after carrying out the present invention.
  • a step can be performed using the method for measuring the amount of the target mRNA or the protein encoded by the mRNA, or other known methods.
  • a step of designing an oligonucleotide by the design method of the present invention and (2) a method for producing a low central toxicity oligonucleotide (hereinafter referred to as "the present invention may be referred to as the "method of manufacturing”.) is provided.
  • low toxicity oligonucleotide means an oligonucleotide that has low central toxicity or is expected to have low central toxicity compared to the target oligonucleotide.
  • the median behavioral score in the group administered with the subject oligonucleotide and the oligonucleotide after administration of the present invention were calculated using the modified Irwin method.
  • a low central toxicity oligonucleotide can be evaluated if the difference from the median behavior score in the group tested is 1 or more (e.g., 1, 5, 10, 20 or more), and such a value can also be used to assess the degree of central toxicity.
  • the method for synthesizing oligonucleotides in step (2) of the production method of the present invention is not particularly limited, and known methods can be adopted. Examples of such known methods include chemical synthesis methods such as the phosphoramidite method and the H-phosphonate method. In the chemical synthesis method, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used. In addition, the chemical synthesis method generally uses amidite.
  • the amidite is not particularly limited, and may be produced by a known method (eg, the method described in Patent Document 3 and International Publication No. 2020/166551), or a commercially available amidite may be used.
  • the central toxicity may be actually evaluated by performing the same step as step (III) of the evaluation method of the present invention for the oligonucleotide produced by the production method of the present invention.
  • an oligonucleotide having phosphorothioate linkages with reduced central toxicity comprising: The carbon atom at the 5′-position of the sugar portion of at least one nucleoside constituting the oligonucleotide has the following formula I
  • an oligonucleotide having a phosphorothioate modification (hereinafter sometimes referred to as "the ASO of the present invention") is provided, which is characterized by forming a structure represented by:
  • both R6 and R7 are hydrogen atoms.
  • at least one internucleoside bond is preferably a phosphodiester bond from the viewpoint of further reducing central toxicity.
  • At least one nucleoside that constitutes the ASO of the present invention can be represented by the following formula III or III'.
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and Base are the same as the definitions in Formula I and Formula II of 1.
  • both R 6 and R 7 are hydrogen atoms; be.
  • the ASO of the present invention may be an inhibitory ASO or an enhancing ASO.
  • an inhibitory ASO it is preferably a gapmer oligonucleotide, but is not limited to this.
  • an enhanced ASO it is preferably a mixmer-type oligonucleotide, but is not limited to this.
  • a nucleoside having a structure represented by Formula I or Formula I′ above may be present at any position in the ASO of the present invention, but at least one (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 or more) are preferably located in the gap region.
  • the phosphodiester linkages may be present between any of the nucleosides of the ASOs of the invention, but at least one (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more) internucleoside phosphodiester linkages are preferably located in the gap region.
  • the phosphodiester bond is adjacent to the 5' side or 3' side of the nucleoside having the structure represented by Formula I or Formula I' above. They may be in the same position or may not be adjacent to each other.
  • At least one nucleoside constituting each of the 3' wing region and the 5' wing region is preferably a bridging nucleoside.
  • Examples of such crosslinked nucleosides include the above 1. The same as the bridged nucleoside described in .
  • the ASO of the present invention can suppress or enhance the function of target mRNA, thereby controlling gene expression. Therefore, the ASO of the present invention can be used as a reagent for regulating gene expression (hereinafter sometimes referred to as "reagent of the present invention").
  • reagent of the present invention includes both the terms “reagent for suppressing gene expression” and “reagent for enhancing gene expression”.
  • the reagent of the present invention contains two or more ASOs or other reagents
  • the reagent can be provided as a reagent kit containing each ASO and reagents in separate reagents.
  • the term "gene expression” includes at least "production of a functional protein encoded by target mRNA", but also includes “production of target mRNA". used in the sense Therefore, the suppression of gene expression means not only the reduction in the amount of functional protein encoded by the gene in cells, but also the reduction of mRNA transcribed from the gene by administration of the ASO of the present invention. It may also include decreasing its abundance in a cell.
  • the enhancement of gene expression means not only that the administration of the ASO of the present invention increases the abundance in cells of the functional protein encoded by the gene, but also that the mRNA transcribed from the gene may also include increasing the abundance of in cells.
  • the ASO can be administered to a subject alone or together with a pharmacologically acceptable carrier.
  • the introduction target include cells, tissues, organs, etc. of mammals including humans. Accordingly, a method for regulating gene expression in a subject, which comprises administering the ASO of the present invention to the subject, is also provided.
  • the reagent of the present invention may further contain a reagent for nucleic acid introduction.
  • the reagent for nucleic acid introduction includes calcium chloride, calcium enrichment reagent, atelocollagen; liposome; nanoparticle; Cationic lipids such as ethyleneimine (PEI) and the like can be used.
  • the ASO of the present invention is particularly suitable for use as a pharmaceutical because it has reduced central toxicity. Therefore, therapeutic agents for diseases (hereinafter sometimes referred to as “therapeutic agents of the present invention") containing the ASO of the present invention are provided.
  • treatment includes alleviation or improvement of symptoms, prevention, delay or cessation of progression of disease or symptoms, or manifestation of symptoms.
  • diseases include diseases caused by overexpression or overaccumulation of the protein encoded by the ASO target mRNA of the present invention, or by deletion or reduction of the protein encoded by the ASO target mRNA of the present invention. mentioned.
  • diseases include neurological diseases (eg, neurodegenerative diseases such as tauopathy).
  • an effective amount of the ASO of the present invention may be used alone, or may be formulated as a pharmaceutical composition together with any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier (formulated are also referred to as therapeutic agents).
  • a pharmaceutically acceptable carrier formulated are also referred to as therapeutic agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrance agents such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium hydrogen sulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspending agents such as methyl cellulose and polyvinyl pyrrolid, dispersing agents such as surfactants, water, Examples include, but are not limited to, diluents such as physiological saline, base waxes, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention may further contain a reagent for nucleic acid introduction.
  • a reagent for nucleic acid introduction the same reagents as described above can be used.
  • the therapeutic agent of the present invention may also be a pharmaceutical composition in which the ASO of the present invention is encapsulated in liposomes.
  • Liposomes are closed microscopic vesicles having an internal phase surrounded by one or more lipid bilayers, and can typically hold water-soluble substances in the internal phase and fat-soluble substances within the lipid bilayers.
  • the ASOs of the present invention may be retained within the liposome internal phase or within the lipid bilayer.
  • the liposomes used in the present invention may be monolayered or multilayered, and the particle size can be appropriately selected, for example, in the range of 10 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm. Considering deliverability to the target tissue, the particle size is, for example, 200 nm or less, preferably 100 nm or less.
  • Methods for encapsulating water-soluble compounds such as oligonucleotides in liposomes include lipid film method (vortex method), reverse phase evaporation method, surfactant removal method, freeze-thaw method, remote loading method and the like. is not limited to, and any known method can be selected as appropriate.
  • the medicament of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals (e.g. humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, dogs, cats, monkeys). is possible, but parenteral administration is preferred. Also provided, therefore, is a method of treating a disease in a mammal comprising administering to the mammal an effective amount of an ASO of the present invention.
  • mammals e.g. humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, dogs, cats, monkeys.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injectable solutions, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, tonicity agents, and the like. Also included are aqueous and non-aqueous sterile suspensions, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives, and the like.
  • the formulation can be enclosed in a container such as an ampoule or a vial in units of unit doses or multiple doses.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in such a manner that they can be dissolved or suspended in an appropriate sterile vehicle just prior to use.
  • Other formulations suitable for parenteral administration can include sprays and the like.
  • the content of the ASO of the present invention in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.1 to 100% by weight of the entire pharmaceutical composition.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the purpose of administration, administration method, type of target disease, severity, and conditions of administration target (sex, age, body weight, etc.).
  • a single dose of the ASO of the present invention is generally 0.01 mg/kg or more and 1000 mg/kg or less. It is desirable to administer such doses 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.
  • the therapeutic agent of the present invention can also be used, for example, in combination with therapeutic agents for diseases already on the market.
  • These concomitant drugs can be formulated together with the medicament of the present invention and administered as a single formulation, or can be formulated separately from the medicament of the present invention and administered via the same or different route as the medicament of the present invention. , can be administered simultaneously or staggered.
  • the dose of these concomitant drugs may be the amount usually used when the drug is administered alone, or the dose can be reduced from the amount usually used.
  • LX-A4285 has a phosphorothioate bond as an internucleoside bond and is a sequence known to exhibit central toxicity according to WO 2016/127000 A1.
  • 5 is 5-methylcytosine
  • Ln is LNA
  • ⁇ is a phosphorothioate bond
  • Cp is DNA introduced with a cyclopropane structure at the 5' position of the sugar moiety (herein referred to as "5'-cyclopropane DNA ) are shown respectively.
  • Oligonucleotides related to the present invention were synthesized by the method described in Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981), International Publication No. 2011/052436, etc.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • 5'-cyclopropane DNA 5'-CP-DNA
  • Base is 5-methylcytosin-1-yl group, thymin-1-yl group, adenin-9-yl group or guanin-9-yl group.
  • Oligonucleotides containing 5'-cyclopropane DNA were synthesized with reference to the method described in WO2020/158910.
  • Oligonucleotides containing Locked Nucleic Acid (LNA) or 5'-cyclopropane DNA (5'-CP-DNA) were synthesized using an automatic nucleic acid synthesizer (nS-8 type, manufactured by Gene Design, Inc.). Chain length extension was performed using standard phosphoramidite protocols (solid support: CPG, iodine for oxidation to form phosphorodiester (PO) backbone, DDTT for sulfurization to form phosphorothioate (PS) backbone (( (dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione), etc.).
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • 5'-CP-DNA 5'-cyclopropane DNA
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • 5'-CP 5'-cyclopropane DNA
  • Example 2 Construction of Method for Evaluating Toxicity of Antisense Nucleotide in Mouse Central Nervous System BALB/cCrSlc (male, 7 weeks old, Japan SLC Co., Ltd.) was used to evaluate central toxicity of antisense oligonucleotides in mice.
  • the animals were kept in open racks under an environment of temperature: 18-28°C, humidity: 30-80%, lighting time: 12 hours/day, and all animals were given feed and water ad libitum.
  • Antisense oligonucleotides were administered to mice intracerebroventricularly to evaluate central toxicity.
  • Mice were placed in a stereotaxic apparatus under deep anesthesia by intraperitoneal administration of a triple anesthetic (butorphanol tartrate 5 mg/kg, midazolam 4 mg/kg, medetomidine hydrochloride 0.3 mg/kg) at a volume of 10 mL/kg. Fixed. The skull was exposed, and a hole was drilled at the administration site (brain coordinates: -0.2 mm caudally from bregma, -1.0 mm to the right, and -2.5 mm deep) using a dental drill. A single dose was administered intracerebroventricularly using a syringe and polyethylene tube. LX-A4285 shown in Table 1 was used as the antisense oligonucleotide.
  • mice 1 to 24 hours after a single intracerebroventricular administration of LX-A4285, behavioral analysis of mice was performed by Irwin's modified method.
  • evaluation items items such as locomotor activity, standing behavior, hyperactivity, walking, grooming, blepharoptosis, vocalization, tremor, and convulsion were scored.
  • Example 3 In Vitro Suppression of mRNA Expression by Antisense Nucleotides in Human Neuroblasts Using the antisense oligonucleotides used in Example 1 above, MAPT mRNA expression suppression effects in human neuroblasts were evaluated. A control without addition of oligonucleotide was used. Also, for comparison, a negative control oligonucleotide (also referred to as Negative Control; NC): 5(Y) ⁇ A(Y) ⁇ T(Y) ⁇ t ⁇ t ⁇ a ⁇ g ⁇ a ⁇ a ⁇ g ⁇ t ⁇ c ⁇ 5(Y) ⁇ T(Y) ⁇ c (LX-A0070; SEQ ID NO: 6) was used. In the above sequences, 5 represents 5-methylcytosine and Y represents AmNA.
  • NC Negative Control
  • SH-SY5Y cells (ECACC, EC94030304-F0) were used as human neuroblasts.
  • Each antisense oligonucleotide (LX-A0070, LX-A4285, LX-A5106, LX-A5108 and LX-A5113) was transfected into SH-SY5Y cells using a commercially available transfection reagent (ThermoFisher Scientific, Lipofectamine 3000). After incorporation, the mRNA expression level was measured by qRT-PCR to examine knockdown activity (mRNA expression suppression). The procedure is shown below.
  • RNA extraction reagent (MACHEREY-NAGEL, Nucleo ZOL).
  • a reverse transcription reaction and a PCR amplification reaction were performed using a reagent for nucleic acid amplification reaction (QIAGEN, QuantiFast Probe RT-PCR kit).
  • the nucleic acid amplification reaction was carried out by temperature cycling of 50°C 10 minutes ⁇ 95°C 5 minutes ⁇ [(95°C 10 seconds ⁇ 60°C 30 seconds) x 40 cycles].
  • the amount of mRNA by each antisense oligonucleotide is shown as a relative value when the amount of mRNA in the oligonucleotide-free cells is set to 1.
  • the primer sets used are as follows: (Primer set for MAPT detection) TaqMan Gene Expression Assay Hs00902194_m1_4331182 (ThermoFisher Scientific) (Primer set for GAPDH detection) TaqMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1_4331182 (ThermoFisher Scientific)
  • Example 4 Acute Toxicity of Antisense Nucleotides in Mouse Central Nervous System From among the antisense nucleotides listed in Tables 1 and 2, representative ones with low cytotoxicity while maintaining knockdown activity (data not shown) were selected. Two (LX-A5108 and LX-A5113) were selected and evaluated for acute toxicity in the central nervous system of mice. The evaluation method followed the method described in Example 2. The results are shown in FIG. Figure 3 confirms that sequences with a 5'-CP and an increased proportion of phosphodiester linkages have reduced central toxicity compared to antisense nucleotides with only phosphorothioate linkages.
  • antisense nucleotides having 5'-modified nucleosides retain mRNA expression-suppressing activity while reducing central toxicity.
  • oligonucleotides with reduced central toxicity can be designed. Oligonucleotides synthesized based on the results of the design can be used as therapeutic agents for diseases, because administration to cells or individuals enables regulation of gene expression while suppressing side effects.

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Abstract

本発明は、中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、　ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５'位炭素原子を、下記式Ｉ（式中、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である） または下記式I'（式中、　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））で表される構造に置換する工程を含むことを特徴とする、方法を提供する。

Description

中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドの設計方法
　本発明は、中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドの設計方法、該設計結果に基づき合成されたオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む治療薬などに関する。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となる核酸配列にハイブリダイズして遺伝子発現自体を抑制することで作用を発現する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の向上や、標的核酸への結合親和性、特異性などの改善を目的として様々な人工核酸が開発・導入され、様々な製剤が上市されるようになったが、昨今新たな問題として浮上したのが、人工核酸が潜在的に有する毒性をどう回避するかという問題である。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性は、いわゆる「RNAとのハイブリダイゼーションに起因する毒性（オフターゲット毒性）」と「RNAとのハイブリダイゼーションに依存せず、細胞内外のタンパク質や金属イオン等との結合に起因する毒性（非オフターゲット毒性）」にカテゴライズすることができる。そしてこれらの毒性を回避するために様々なアプローチが採用されている。
　例えば非オフターゲット毒性については、特許文献１において、核酸の塩基部や糖部に適切な化学修飾を行うことで回避できることが開示されている。またオフターゲット毒性については、特許文献２において、塩基部（チミン）の2’位カルボニル基の修飾と糖部2’位-4’位を架橋することで、ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにおける非ワトソンクリック型塩基対の形成を抑制し回避できることが開示されている。さらに、一般的にヌクレオシド間のホスホロチオエート修飾が肝毒性発現の原因であることが知られているところ（例えば、非特許文献１）、特許文献３には、ホスホロチオエート型核酸を５’位にシクロプロパン構造を有する人工核酸に置換することで、活性を維持したまま肝毒性を低減できることが開示されている。
　しかしながら、これまでのアンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性低減技術に係る毒性評価は肝毒性を主な指標になされ、それ以外の組織における毒性評価について深い知見は得られていない。例えば、中枢毒性は医薬品の安全性試験において重要な評価項目であるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性に関してはほとんど知見がない。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドと中枢毒性の関係、特に中枢毒性の低減に着目した知見としては、特許文献４にアンチセンスオリゴ核酸の配列と中枢毒性（神経細胞における細胞内遊離カルシウム濃度の振動）の相関関係が開示されている。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート修飾による中枢毒性を評価した文献は、本発明者らが知る限りにおいて、１件しか存在しない（非特許文献２）。非特許文献２において、ホスホロチオエート修飾を有するギャップマー型オリゴヌクレオチドにおいて、ウイング部分のホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換することで、中枢毒性を低減できることが開示されている。
国際公開第２０１８／１５５４５０号 国際公開第２０１８／１５５４５１号 国際公開第２０２０／１５８９１０号 国際公開第２０１６／１２７０００号
Migawa M.T. et al., Nucleic Acids Res, 20;47(11):5465-5479 (2019) Moazami M.P. et al., bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2021.02.14.431096 (2021)
　しかしながら、非特許文献２には、一部のホスホロチオエート修飾を除去し、かつ糖部の２’位に安定性に関与する修飾を付したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）では、ホスホロチオエート修飾が除去されていないＡＳＯと比較して、アンチセンス活性が低下し得ることが開示されている。前記アンチセンス活性の低下は、ホスホロチオエート修飾の除去に起因するＡＳＯの安定性の低下によるものと考えられる。
　したがって、本発明の課題は、ＡＳＯの糖部の２’位以外の部位に修飾を付すことで、好ましくはさらにＡＳＯの一部のホスホロチオエート修飾を除去することで、元のＡＳＯと比較して中枢毒性が低減され得る、好ましくはさらにアンチセンス活性が維持または増強され得るＡＳＯを設計する方法及び該設計結果に基づき合成されたＡＳＯなどを提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた。その結果、核酸修飾で広く用いられる糖部の２’位や４’位のおける修飾（例えば、非特許文献２）ではなく、糖部の５’位における修飾に着目した。具体的には、特許文献３に開示されたように、ホスホロチオエート修飾ヌクレオシドの糖部５’位にシクロプロパン構造などの特定の構造を導入することで、アンチセンス活性を維持しながら非特異的なタンパク質との結合抑制を介した中枢毒性を低減させることができるのではないかとの着想を得た。特許文献３において、ヌクレオシドの糖部の５’位に修飾を導入し、かつ該修飾の近傍のホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換したＡＳＯでは、肝毒性が低減されることが開示されている。しかしながら、ＡＳＯによる肝毒性と中枢毒性とではその発生メカニズムが大きく異なると考えられるため、上記着想は特許文献３や先行技術文献には記載も示唆もない全く独創的なものであった。かかる着想に基づき本発明者らはさらに鋭意検討し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は以下の通りである。
［１］
　中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、
　（１）ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子を、下記式Ｉ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　（式中、
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である）
または下記式I’
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　（式中、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））
で表される構造に置換する工程、および任意により
　（２）該オリゴヌクレオチドが有する少なくとも一つのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換する工程
を含むことを特徴とする、方法。
［２］
　オリゴヌクレオチドがギャップマー型オリゴヌクレオチドである、［１］に記載の方法。
［３］
　上記工程（１）で置換されるヌクレオシドの少なくとも一つがギャップ領域に位置する、［２］に記載の方法。
［４］
　上記工程（２）で置換されるホスホロチオエート結合の少なくとも一つがギャップ領域に位置する、［２］または［３］に記載の方法。
［５］
　３’ウイング領域および５’ウイング領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドが架橋型ヌクレオシドである、［２］～［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］
　ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドの中枢毒性の低減の程度を評価する方法であって、以下の工程（１）～（３）：
（１）ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドを準備する工程、
（２）［１］～［５］のいずれか一つに記載の方法により設計したオリゴヌクレオチドを準備する工程、および
（３）工程（２）で準備したオリゴヌクレオチドの中枢毒性と、工程（１）で準備したオリゴヌクレオチドの中枢毒性とを比較する工程
を含む、方法。
［７］
　中枢毒性が低減したホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子が、下記式Ｉ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　（式中、
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である）
または下記式I’
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　（式中、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））
で表される構造を形成しており、任意により少なくとも一つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である、オリゴヌクレオチド。
［８］
　ギャップマー型オリゴヌクレオチドである、［７］に記載のオリゴヌクレオチド。
［９］
　上記式ＩまたはI’で表される構造を有するヌクレオシドの少なくとも一つがギャップ領域に位置する、［８］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１０］
　前記ホスホジエステル結合の少なくとも一つがギャップ領域に位置する、［８］または［９］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１１］
　３’ウイング領域および５’ウイング領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドが架橋型ヌクレオシドである、［８］～［１０］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。
［１２］
　［７］～［１１］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドを含む、遺伝子の発現制御用試薬。
［１３］
　［７］～［１１］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドを含む、疾患の治療薬。
［１４］
　（１）［１］～［５］のいずれか一つに記載の方法によりオリゴヌクレオチドを設計する工程、および
　（２）工程（１）で設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程
を含む、低中枢毒性オリゴヌクレオチドの製造方法。
［１５］
　［７］～［１１］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドを投与することを含む、遺伝子の発現制御方法。
［１６］
　哺乳動物に対し、［７］～［１１］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における疾患の治療方法。
［１７］
　疾患の治療における使用のための［７］～［１１］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド。
［１８］
　疾患の治療薬を製造するための［７］～［１１］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドの使用。
　本発明により、数多くのアンチセンス開発品で用いられているホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを糖部５’位修飾ヌクレオチドにより置換することなどで、中枢毒性が低減した安全性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および製造が可能になる。
図１は、マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＸ－Ａ４２８５）を脳室内投与した場合における、行動スコアの測定結果を示す。 図２は、ヒト神経芽細胞にマウスにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＸ－Ａ００７０、ＬＸ－Ａ４２８５、ＬＸ－Ａ５１０６、ＬＸ－Ａ５１０８及びＬＸ－Ａ５１１３）を投与した場合における、アンチセンス効果の評価結果を示す。 図３は、マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＸ－Ａ４２８５、ＬＸ－Ａ５１０８及びＬＸ－Ａ５１１３）を脳室内投与した場合における、行動スコアの測定結果を示す。
１．中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドの設計方法
　本発明は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドに代わる修飾ヌクレオチドとして５’－シクロプロパン構造を有するヌクレオシドを用いることで、中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計できることを発見したことに基づいて完成した発明である。
　具体的には、本発明により、中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、
　（１）ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチド（以下、「ＰＳ修飾ヌクレオチド」と称することがある。）を構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子を、下記式Ｉ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（式中、
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である）
または下記式I’
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（式中、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））
で表される構造に置換する工程を含むことを特徴とする、方法（以下、「本発明の設計方法」と称することがある。）が提供される。一態様において、Ｒ６およびＲ７は共に水素原子である。本明細書において、オリゴヌクレオチドには、薬理学上許容されるオリゴヌクレオチドの塩も含まれるものとする。
　中枢毒性をさらに低減させる観点から、本発明の設計方法には、（２）上記オリゴヌクレオチドが有する少なくとも一つのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換する工程が含まれていてもよい。
　また、別の態様において、本発明により、オリゴヌクレオチドの中枢毒性を低減させる方法であって、
　（１’）ＰＳ修飾ヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子を、下記式Ｉ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　（式中、
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である）
または下記式I’
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（式中、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））
で表される構造に置換する工程を含むことを特徴とする、方法（以下、「本発明の毒性低減方法」と称することがある。）が提供される。一態様において、Ｒ６およびＲ７は共に水素原子である。
　本発明の毒性低減方法には、
　（２’）上記オリゴヌクレオチドが有する少なくとも一つのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換する工程、が含まれていてもよい。
　以下では、本発明の設計方法と本発明の毒性低減方法の両方に適用する事項については、これらの方法をまとめて単に「本発明の方法」と称することがある。
　本発明において、「ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合である（すなわち、ヌクレオシド間のリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されている）オリゴヌクレオチドを意味する。天然型のオリゴヌクレオチドであるＤＮＡやＲＮＡにおける生体内での安定性、とりわけ酵素耐性を高めるためにホスホロチオエート修飾が一般的に用いられている。一方これらのホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドは共通して毒性を有する点で問題を内包している。
　本発明の方法は、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドが有する毒性のうち、中枢毒性に注目しそれを低減する目的で研究を進めた結果完成したものである。
　本発明における「中枢毒性」は、「中枢神経毒性」ともいい、げっ歯類から非ヒト霊長類やヒトにおける一般状態変化や脳病理組織学的変化により同定される中枢神経系に由来する毒性所見を指す。例えば、げっ歯類においては、易刺激性・自発運動減少・呼吸緩徐及び眼瞼下垂の可逆的で軽微な症状から痙攣や死亡等の重篤な症状を含む一般状態変化が挙げられる。具体的には、本発明における「中枢毒性」は、Ｉｒｗｉｎの変法（Irwin S., Psychopharmacologia. 1968; 13(3): 222-257）により行う行動スコアにより評価することができる。
　本発明において、「中枢毒性が低減した」とは、本発明の方法の対象（設計元）となるＰＳ修飾ヌクレオチド（以下、「対象オリゴヌクレオチド」と称することがある。）が有する中枢毒性と比較して、本発明の方法の工程（１）または（１’）を実施した後のオリゴヌクレオチド（すなわち、設計されたオリゴヌクレオチド、あるいは毒性が低減したオリゴヌクレオチド）（以下、「本発明実施後のオリゴヌクレオチド」と称することがある。）が有する中枢毒性が低いこと、あるいは低いと予想されることを意味する。具体的には、後述の実施例に記載されるように、上記Ｉｒｗｉｎの変法を用いて、対象オリゴヌクレオチドが投与された群における行動スコアの中央値と、本発明実施後のオリゴヌクレオチドが投与された群における行動スコアの中央値との差が１以上（例：１、５、１０、２０またはそれ以上）である場合に、中枢毒性が低減したと評価することができ、かかる値により中枢毒性の程度を評価することもできる。
　本発明の設計方法の工程（１）では、オリゴヌクレオチドを実際に合成することまでは要さず、頭の中でイメージすることで十分である。しかしながら、典型的には、該イメージされたオリゴヌクレオチドは、電子計算機上で機能するプログラム（例：オリゴヌクレオチド設計用ソフトフェア、グラフィックデザインツール、オフィスソフト等）上や紙面上で具体化される。したがって、例えば後述の実施例１に記載されるように、中枢毒性が低減されると予想されるオリゴヌクレオチドを設計し、該オリゴヌクレオチドを表の形式でまとめる行為も、本発明の設計方法の実施に該当する。
　対象オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を含む標的ｍＲＮＡ（本明細書において、ｍＲＮＡには、ｐｒｅ－ｍＲＮＡも含まれるものとする。）の機能（転写後修飾、翻訳など）を抑制するもの（以下、「抑制型ＡＳＯ」と称することがある。）であってもよく、該機能を亢進するもの（以下、「亢進型ＡＳＯ」と称することがある。）であってもよい。抑制型ＡＳＯは、典型的には、標的ｍＲＮＡと二本鎖領域を形成し、該二本鎖領域がリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により切断されることで、標的ｍＲＮＡの機能を抑制することができる。一方で亢進型ＡＳＯは、典型的には、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシング促進配列と二本鎖領域を形成して該配列をマスキングし、スプライシングをスキップさせることで、ｍＲＮＡの機能を亢進（回復）することができる（これにより、機能的なタンパク質の細胞中での存在量が上昇することとなる）。あるいは、標的ｍＲＮＡに含まれる、該ｍＲＮＡを分解する酵素の結合配列と二本鎖領域を形成して該配列をマスキングし、該ｍＲＮＡの分解を抑制することで、ｍＲＮＡの機能を亢進することができる。
　抑制型ＡＳＯは、生体内での安定性および効率的なｍＲＮＡの切断の観点から、ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型オリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明において「ギャップマー型オリゴヌクレオチド」とは、ＲＮａｓｅ Ｈにより認識される複数(例：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上）のヌクレオチドを有する内部領域（本明細書において、「ギャップ領域」と称することがある。）が、リボヌクレアーゼに対する耐性を付与するように修飾された少なくとも一つ（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオチドを有する外部領域（本明細書において、３’側の外部領域を「３’ウイング領域」と、５’側の外部領域を「５’ウイング領域」と称することがある。）間に配置されるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。３’ウイング領域と５’ウイング領域の各領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドは、架橋型ヌクレオシドであることが好ましい。
　亢進型ＡＳＯは、生体内での安定性の観点から、ＲＮａｓｅに対する耐性を付与するように修飾されたヌクレオシドを少なくとも一つ有するものがよい。かかるＡＳＯは、すべてのヌクレオシド残基が修飾されたものであってもよく、一部のヌクレオシド残基が修飾されたもの（すなわち、ミックスマー（Ｍｉｘｍｅｒ）型オリゴヌクレオチド）であってもよい。かかる修飾されたヌクレオシドとしては、架橋型ヌクレオシドが好ましい。
　対象オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシドとしては、例えば、下記式IIで表されるヌクレオシドなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、そして
　Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子、または炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基である。）
　また、Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　（式中、
　Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、前記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
　Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
　Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、－（ＣＨ２）ｑ－［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
　Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
　Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
　Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
　Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
　Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
　ｍは０から２の整数であり；
　ｎは０から１の整数であり；
　ｐは０から１の整数であり；
　Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
　Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す。）を構成してもよく、かかる構成を有するヌクレオシドを架橋型ヌクレオシドと称することがある。
　より具体的には、上記架橋型ヌクレオシドとして、例えば、下記構造式を有するヌクレオシドなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（式中、Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。好ましくは、Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、より好ましくは、Ｒは、水素原子またはメチル基である。Ｂａｓｅの定義は、上記式ＩＩにおける定義と同一である。）
　対象オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシドは、天然型のヌクレオシドであってもよく、かかる天然型のヌクレオシドとしては、アデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、グアノシン、ウリジン、５－メチルウリジン、シチジン、デオキシアデノシン、Ｎ６－メチル－２’－デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。
　対象オリゴヌクレオチドの長さは、アンチセンス活性を有する限り特に限定されないが、典型的には１０～５０ヌクレオチド長であり、好ましくは１０～３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１３～３０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは１５～２０ヌクレオチド長である。
　本発明実施後のオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドは、下記式IIIまたはIII’で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｂａｓｅの定義は、上記式Ｉ及び式ＩＩにおける定義と同一である。一態様において、Ｒ６およびＲ７は共に水素原子である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｂａｓｅの定義は、上記式Ｉ’及び式ＩＩにおける定義と同一である。）
　本発明の方法の工程（１）または（１’）の結果、上記式Iまたは式I’で表される構造を有することとなるヌクレオシドは、対象ＰＳ修飾ヌクレオチドのいずれの位置に存在してもよいが、少なくとも一つ（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオシドは、ギャップ領域に位置することが好ましい。
　本発明の方法の工程（２）または（２’）の結果、置換されることとなるホスホロチオエート結合は、対象ＰＳ修飾ヌクレオチドのいずれのヌクレオシド間に存在してもよいが、少なくとも一つ（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオシド間のホスホロチオエート結合は、ギャップ領域に位置することが好ましい。換言すれば、本発明の方法の工程（２）または（２’）において、対象ＰＳ修飾ヌクレオチドのギャップ領域に位置するホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換することが好ましい。
　また、本発明の方法の工程（２）または（２’）の結果、置換されることとなるホスホロチオエート結合は、本発明の方法の工程（１）または（１’）で置換したヌクレオシドの５’側または３’側に隣接する結合であってもよく、隣接していない結合であってもよい。すなわち、本発明の工程（１）または（１’）と工程（２）または（２’）の対象となるヌクレオチド残基は、それぞれ任意に選択することができる。
　本発明の方法において、ヌクレオシドの糖部５’位炭素原子の置換や、ホスホロチオエート結合の置換以外に、さらに修飾を施してもよい。かかる修飾としては、例えば、糖部の２’－Ｏ－メトキシエチル修飾、糖部の２’－Ｏ－メチル修飾、糖部の２’フルオロ修飾、糖部の２’位と４’位との架橋（架橋型ヌクレオシドへの置換）、架橋型ヌクレオシドから別の架橋型ヌクレオチドへの置換、Ｂａｓｅ（塩基部）のメチル化またはアセチル化、Ｂａｓｅの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂａｓｅを置換する場合には、置換する前のＢａｓｅの標的の（すなわち、該Ｂａｓｅと塩基対を形成する）塩基と、塩基対を形成できるものに置換することが好ましい。前記塩基対は、ワトソンクリック型塩基対だけでなく、フーグスティーン型塩基対やゆらぎ塩基対（Wobble base pair）であってもよい。前記架橋型ヌクレオシドとしては、例えば、下記構造式を有するヌクレオシドなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　（式中、Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。好ましくは、Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、より好ましくは、Ｒは、水素原子またはメチル基である。Ｂａｓｅの定義は、上記式ＩＩにおける定義と同一である。）
　ＰＳ修飾ヌクレオチドに対して本発明の方法の工程（１）または（１’）を実施することで、理論上は、ＰＳ修飾ヌクレオチドと比較して中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドが設計される、あるいはＰＳ修飾ヌクレオチドの中枢毒性が低減される。しかしながら、本発明実施後のオリゴヌクレオチドの中枢毒性が低減されていることを実際に確認してもよく、また本発明実施後のオリゴヌクレオチドの中神経毒性の低減の程度を評価してもよい。
　したがって、本発明のさらに別の態様において、ＰＳ修飾ヌクレオシドの中枢毒性の低減の程度を評価する方法であって、以下の工程（Ｉ）～（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＰＳ修飾ヌクレオチドを準備する工程、
（ＩＩ）本発明の設計方法により設計したオリゴヌクレオチドを準備する工程、および
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で準備したオリゴヌクレオチドの中枢毒性と、工程（Ｉ）で準備したオリゴヌクレオチドの中枢毒性を比較する工程
を含む、方法（以下、「本発明の評価方法」と称する場合がある。）が提供される。
　本発明の評価方法の工程（Ｉ）で準備するＰＳ修飾ヌクレオチドは、市販品を購入すること、公知の合成方法により作製すること、あるいは合成委託により他者により作製させることなどにより入手することができる。また、本発明の評価方法の工程（ＩＩ）で準備するオリゴヌクレオチドは、本発明の設計方法により設計したオリゴヌクレオドの構造を元に、後述の公知の合成方法により作製すること、あるいは合成委託により他者により作製させることなどにより入手することができる。
　本発明の評価方法の工程（ＩＩ）は、上記のＩｒｗｉｎの変法によりスコアを算出する方法や、その他公知の方法を用いて行うことができる。上記スコア等を比較することなどにより、本発明の評価方法の工程（ＩＩＩ）を実施することができる。
　本発明の方法により設計したオリゴヌクレオチドは、中枢毒性が低減されるだけでなく、アンチセンス活性も維持し得る。本発明において「アンチセンス活性の維持」とは、対象オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性と比較して、本発明実施後のオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が維持されること、または高いことを意味する。かかるアンチセンス活性の評価は、抑制型ＡＳＯにおいては、例えば、後述の実施例に記載されるように、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に各アンチセンスオリゴヌクレオチドを同量接触させ、２４時間以上後に該細胞からｍＲＮＡを回収し、該ｍＲＮＡの量の比較により行うことができる。本発明実施後のオリゴヌクレオチドを接触させた群において、対象オリゴヌクレオチドを接触させた群と比較して標的ｍＲＮＡの量に統計学的な有意差がない場合あるいは低下している場合には、アンチセンス活性が維持されていると評価することができる。一方で亢進型ＡＳＯにおいては、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に各アンチセンスオリゴヌクレオチドを同量接触させ、２４時間以上後に該細胞から標的ｍＲＮＡにコードされるタンパク質を回収し、該タンパク質のうち機能的なタンパク質の量の比較により行うことができる。
　したがって、本発明の方法は、さらに本発明実施後のオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を評価する工程を含んでいてもよい。かかる工程は、上記の標的ｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡにコードされるタンパク質量を測定する方法や、その他公知の方法を用いて行うことができる。
２．低中枢毒性オリゴヌクレオチドの製造方法
　別の態様において、本発明により、
　（１）本発明の設計方法によりオリゴヌクレオチドを設計する工程、および
　（２）工程（１）で設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程
を含む、低中枢毒性オリゴヌクレオチドの製造方法（以下、「本発明の製法」と称することがある。）が提供される。
　本発明において、「低中毒性オリゴヌクレオチド」とは、対象オリゴヌクレオチドと比較して、中枢毒性が低いこと、あるいは低いと予想されるオリゴヌクレオチドを意味する。具体的には、後述の実施例に記載されるように、上記Ｉｒｗｉｎの変法を用いて、対象オリゴヌクレオチドが投与された群における行動スコアの中央値と、本発明実施後のオリゴヌクレオチドが投与された群における行動スコアの中央値との差が１以上（例：１、５、１０、２０またはそれ以上）である場合に、低中枢毒性オリゴヌクレオチドであると評価することができ、かかる値により中枢毒性の程度を評価することもできる。
　本発明の製法の工程（２）におけるオリゴヌクレオチドの合成方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。かかる公知の方法として、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法などの化学合成法が挙げられる。前記化学合成法において、市販の自動核酸合成機を使用することができる。また、前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、公知の方法（例えば、特許文献３、国際公開第２０２０／１６６５５１号に記載の方法）により作製してもよく、市販のアミダイトを用いてもよい。
　本発明の製法により製造したオリゴヌクレオチドに対して、本発明の評価方法の工程（ＩＩＩ）と同様の工程を実施することにより、実際に中枢毒性を評価してもよい。
３．中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチド
　前述のとおり、本発明により、中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計または製造することができる。したがって、別の態様において、中枢毒性が低減したホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドであって、
　オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子が、下記式Ｉ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　（式中、Ｒ６およびＲ７の定義は、上記１．の式Iにおける定義と同一である）
または下記式I’
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（式中、Ｒ４およびＲ５の定義は、上記１．の式I’における定義と同一である）
で表される構造を形成していることを特徴とする、ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチド（以下、「本発明のＡＳＯ」と称することがある）が提供される。一態様において、Ｒ６およびＲ７は共に水素原子である。本発明のＡＳＯは、中枢毒性をさらに低減させる観点からは、少なくとも一つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であることが好ましい。
　したがって、本発明のＡＳＯを構成する少なくとも一つのヌクレオシドは、下記式IIIまたはIII’で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｂａｓｅの定義は、１．の式Ｉ及び式ＩＩにおける定義と同一である。一態様において、Ｒ６およびＲ７は共に水素原子である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｂａｓｅの定義は、１．の式Ｉ’及び式ＩＩにおける定義と同一である。）
　本発明のＡＳＯは、抑制型ＡＳＯであってもよく、亢進型ＡＳＯであってもよい。抑制型ＡＳＯの場合には、ギャップマー型オリゴヌクレオチドであることが好ましいが、これに限定されない。亢進型ＡＳＯの場合には、ミックスマー型オリゴヌクレオチドであることが好ましいが、これに限定されない。
　上記式Iまたは式I’で表される構造を有するヌクレオシドは、本発明のＡＳＯのいずれの位置に存在してもよいが、少なくとも一つ（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオシドは、ギャップ領域に位置することが好ましい。
　本発明のＡＳＯのヌクレオシド間結合にホスホジエステル結合が存在する場合、該ホスホジエステル結合は、本発明のＡＳＯのいずれのヌクレオシド間に存在してもよいが、少なくとも一つ（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオシド間のホスホジエステル結合は、ギャップ領域に位置することが好ましい。また、本発明のＡＳＯのヌクレオシド間結合にホスホジエステル結合が位置する場合、該ホスホジエステル結合は、上記式Iまたは式I’で表される構造を有するヌクレオシドの５’側または３’側に隣接していてもよく、隣接していなくともよい。
　本発明のＡＳＯにおいて、３’ウイング領域と５’ウイング領域の各領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドは、架橋型ヌクレオシドであることが好ましい。かかる架橋型ヌクレオシドとしては、上記１．で記載の架橋型ヌクレオシドと同一のものを挙げることができる。
　本発明のＡＳＯは、標的ｍＲＮＡの機能を抑制または亢進することができ、それにより遺伝子の発現を制御することができる。したがって、本発明のＡＳＯは、遺伝子の発現制御用試薬（以下、「本発明の試薬」と称する場合がある。）として用いることができる。「遺伝子の発現制御用試薬」との用語には、「遺伝子の発現抑制用試薬」および「遺伝子の発現亢進用試薬」の両方の用語が包含されるものとする。
　本発明の試薬が２種以上のＡＳＯを含む場合や、その他の試薬類を含む場合、該試薬は、各ＡＳＯ、試薬類を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明において「遺伝子の発現」とは、特にことわらない限り、少なくとも「標的ｍＲＮＡにコードされた機能的なタンパク質の産生」を含む意味で用いられるが、さらに「標的ｍＲＮＡの産生」をも含む意味で用いられる。したがって、遺伝子の発現抑制とは、本発明のＡＳＯの投与により、該遺伝子にコードされる機能的なタンパク質の細胞中での存在量が減少することだけでなく、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が減少することも含んでいてもよい。同様に、遺伝子の発現亢進とは、本発明のＡＳＯの投与により、該遺伝子にコードされる機能的なタンパク質の細胞中での存在量が増加することだけでなく、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が増加することも含んでいてもよい。
　本発明の試薬は、例えば、対象に、前記ＡＳＯを単独で、あるいは薬理学上許容される担体とともに投与することができる。前記導入対象は、例えば、ヒトを含む哺乳類動物の細胞、組織、器官などが挙げられる。よって、本発明のＡＳＯを対象に投与することを含む、該対象における遺伝子の発現制御方法も提供される。
　本発明のＡＳＯの標的細胞内への導入を促進するために、本発明の試薬は、更に核酸導入用試薬を含んでいてもよい。該核酸導入用試薬として、塩化カルシウム、Calcium enrichment試薬、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リプフェクタミン（lipofectamine）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることができる。
　前述のとおり、本発明のＡＳＯは、中枢毒性が低減されているため、医薬として用いることに特に適している。したがって、本発明のＡＳＯを含む、疾患の治療薬（以下、「本発明の治療薬」と称することがある。）が提供される。本発明において、「治療」には、症状の軽減や改善、病気や症状の進行、あるいは症状の顕在化の予防、遅延や停止も包含される。このような疾患として、例えば、本発明のＡＳＯの標的ｍＲＮＡにコードされるタンパク質の過剰発現または過剰蓄積、あるいは本発明のＡＳＯの標的ｍＲＮＡにコードされるタンパク質の欠失または減少に起因する疾患が挙げられる。かかる疾患としては、例えば、神経疾患（例：タウオパチーなどの神経変性疾患）などが挙げられる。
　本発明の治療薬として、有効量の本発明のＡＳＯを単独で用いてもよいし、任意の担体、例えば医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化してもよい（製剤化したものを治療剤とも称する）。
　医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　本発明のＡＳＯの標的細胞内への導入を促進するために、本発明の治療薬は更に核酸導入用試薬を含んでいてもよい。該核酸導入用試薬としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
　また、本発明の治療薬は、本発明のＡＳＯがリポソームに封入されてなる医薬組成物であってもよい。リポソームは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明のＡＳＯはリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば10～1000nm、好ましくは50～300nmの範囲で適宜選択できる。標的組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば200nm以下、好ましくは100nm以下である。
　オリゴヌクレオチドのような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
　本発明の医薬は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物（例：ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、サル）に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。よって、哺乳動物に対し、本発明のＡＳＯの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における疾患の治療方法も提供される。
　非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈内注入、局所注入（局所外用、局所塗布）、脳室内投与、髄腔内投与、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることができる。
　医薬組成物中の本発明のＡＳＯの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1ないし100重量%である。
　本発明の治療薬の投与量は、投与の目的、投与方法、対象疾患の種類、重篤度、投与対象の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、例えば、成人に全身投与する場合、通常、本発明のＡＳＯの一回投与量として0.01 mg/kg以上1000 mg/kg以下、局所投与する場合、0.001 mg/body以上100 mg/body以下が望ましい。かかる投与量を1～10回、より好ましくは5～10回投与することが望ましい。
　本発明の治療薬は、例えば既に上市されている疾患に対する治療薬と組み合わせて用いることもできる。これらの併用薬剤は、本発明の医薬とともに製剤化して単一の製剤として投与することもできるし、あるいは、本発明の医薬とは別個に製剤化して、本発明の医薬と同一もしくは別ルートで、同時もしくは時間差をおいて投与することもできる。また、これらの併用薬剤の投与量は、該薬剤を単独投与する場合に通常用いられる量であってよく、あるいは通常用いられる量より減量することもできる。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：アンチセンスヌクレオチドの設計および合成
　アンチセンスオリゴヌクレオチドによる中枢毒性を評価するために、以下のオリゴヌクレオチドを設計および合成した。LX-A4285はヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、WO 2016/127000 A1により中枢毒性を示すことが知られている配列である。表中、5は5-メチルシトシンを、LnはLNAを、^はホスホロチオエート結合を、Cpは糖部5’位にシクロプロパン構造を導入したDNA（本明細書中では「5’-シクロプロパンDNA」と表記する）をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、Tetrahedron Letters 22, 1859-1862（1981）、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に記載される方法によって合成した。
　糖修飾ヌクレオシドとして、式(a)で示されるLocked Nucleic Acid(LNA)または式(b)で示される5’-シクロプロパンDNA(5’-CP-DNA)を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（式中、Baseは５－メチルシトシン-1-イル基、チミン-1-イル基、アデニン-9-イル基またはグアニン-9-イル基である。）
　5’-シクロプロパンDNA(5’-CP-DNA)を含むオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０２０／１５８９１０号に記載の方法を参照して合成した。
　Locked Nucleic Acid(LNA)または5’-シクロプロパンDNA(5’-CP-DNA)を含むオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（nS-8型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイトプロトコール（固相担体：CPG、ホスホロジエステル(PO)骨格形成のための酸化はヨウ素を、ホスホロチオエート化（PS）骨格形成のための硫化はDDTT（((dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione)等を使用）にて実施した。Locked Nucleic Acid(LNA)または5’-シクロプロパンDNA(5’-CP)を含むオリゴヌクレオチドとして、末端の5’位の水酸基がDMTr(4,4’-ジメトキシトリチル)基で保護されておらず、かつ3’位が固相に担持されたものを得た。続いて塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した後に溶媒を留去し、得られた粗生成物を逆相HPLCにて精製することにより目的物を得た。
　得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をLC-MS（Waters社製）により確認した。
実施例２：マウス中枢神経におけるアンチセンスヌクレオチドの毒性評価方法の構築
　アンチセンスオリゴヌクレオチドによるマウス中枢毒性の評価には、BALB/cCrSlc(オス、７週齢、日本エスエルシー株式会社)を用いた。動物は温度：１８～２８℃、湿度：３０～８０%、照明時間：１２時間/日の環境下のオープンラックにて飼育し、全ての動物は飼料および水分を自由摂取させた。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドのマウスへの投与は、中枢毒性を評価すべく脳室内投与とした。３種混合麻酔薬（酒石酸ブトルファノール５mg/kg、ミダゾラム４mg/kg、塩酸メデトミジン０．３mg/kg）を１０mL/kgの容量で腹腔内投与することによる深麻酔下で、マウスを脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出させ、歯科用ドリルを用いて投与部位（脳座標：bregmaから尾側へ －０．２mm、右側へ －１．０mm、深さ －２．５mm ）に穴を開け、３０Gニードル、マイクロシリンジ及びポリエチレンチューブを用いて脳室内に単回投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは表１に示されるLX-A4285を用いた。
　LX-A4285の脳室内単回投与後１～２４時間に、マウスの行動解析をIrwinの変法によって行った。評価項目としては、自発運動、立ち上がり行動、多動、歩行、グルーミング、眼瞼下垂、発声、振戦、痙攣等の項目をスコア化した。
　結果を図１に示す。LX-A4285によるスコアは、Irwinの変法における正常スコアからの乖離値から算出し、各群の中央値で示した。正常な行動を示す場合はおよそ０付近のスコアを示すことに対し、乖離値が認められたLX-A4285は、中枢毒性を生じることが示された。すなわち、マウス中枢神経におけるアンチセンスヌクレオチドの毒性評価方法が適切に構築されたといえる。
実施例３：ヒト神経芽細胞におけるアンチセンスヌクレオチドのインビトロでのmRNA発現抑制
　上記実施例１において使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト神経芽細胞におけるMAPT mRNA発現抑制効果を評価した。
　オリゴヌクレオチドを添加しないものをコントロールとした。また、比較のために、ネガティブコントロールのオリゴヌクレオチド（Negative Control; NCとも称する）：5(Y)^A(Y)^T(Y)^t^t^a^g^a^a^g^t^c^5(Y)^T(Y)^c（LX-A0070；配列番号６）を用いた。前記配列中、5は5-メチルシトシンを、YはAmNAをそれぞれ示す。
　ヒト神経芽細胞として、SH-SY5Y 細胞（ECACC社、EC94030304-F0）を用いた。各アンチセンスオリゴヌクレオチド（LX-A0070、LX-A4285、LX-A5106、LX-A5108及びLX-A5113）を市販のトランスフェクション試薬（ThermoFisher Scientific社、リポフェクトアミン3000）を用いてSH-SY5Y細胞に取り込ませ、qRT-PCR法にてmRNAの発現量を測定し、ノックダウン活性（mRNAの発現抑制）を調べた。以下に手順を示す。
　対数増殖期の SH-SY5Y 細胞を３．０×１０4個／ウェルにて、２４ウェルプレートのウェル（１０％ウシ胎児血清（FBS）を含むハムF12（Ham's F12）およびイーグル最小必須培地（E-MEM）の等比混合培地を含む）中に播いた。２４時間後、各アンチセンスオリゴヌクレオチドをウェル内に添加し（培地中でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度：１、３、１０、３０または１００ｎＭ）、２４時間以上インキュベートした。
　インキュベート後、細胞を回収し、RNA抽出試薬（MACHEREY-NAGEL社、Nucleo ZOL）を用いて、total RNAを抽出した。当該total RNAを鋳型として、核酸増幅反応用試薬（QIAGEN社、QuantiFast Probe RT-PCR kit）を用いて逆転写反応とPCR増幅反応を行った。核酸増幅反応は、５０℃　１０分→９５℃　５分→[（９５℃　１０秒→６０℃　３０秒）×４０サイクル]の温度サイクリングで行った。リアルタイムPCRでは、ハウスキーピング遺伝子のヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）のmRNA量も同時に定量し、GAPDHのmRNA量に対するMAPTのmRNA量を評価した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドによるmRNA量は、オリゴヌクレオチド無添加細胞のmRNA量を１とした場合の相対値にて示す。
　用いたプライマーセットは、下記のとおりである：
（MAPT検出用プライマーセット）
TaqMan Gene Expression Assay Hs00902194_m1_4331182（ThermoFisher Scientific社）
（GAPDH検出用プライマーセット）
TaqMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1_4331182（ThermoFisher Scientific社）
　結果を図２に示す。オリゴヌクレオチド無添加細胞（「コントロール」）およびNegative Control添加細胞と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチドは用量依存的なノックダウン活性（mRNAの発現抑制）を示すことが確認された。よって、５’位修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスヌクレオチドは、ｍＲＮＡの発現抑制活性が維持されていると評価することができた。
実施例４：マウス中枢神経におけるアンチセンスヌクレオチドの急性毒性
　表１及び表２に記載のアンチセンスヌクレオチドの中から、代表としてノックダウン活性を維持しつつ細胞毒性が低いもの（データは示さず）を２つ（LX-A5108及びLX-A5113）選択し、該ヌクレオチドについて、マウス中枢神経における急性毒性を評価した。評価方法は実施例２に記載の方法に従った。結果を図３に示す。図３から、ホスホロチオエート結合のみを有するアンチセンスヌクレオチドと比較して、5’-CPを有しホスホジエステル結合の割合が増加した配列では中枢毒性が低減することを確認した。
　上記実施例３および４の結果から、５’位修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスヌクレオチドは、中枢毒性を低減しつつmRNAの発現抑制活性を保持することを確認した。
　本発明により、中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計することができる。該設計結果に基づき合成されたオリゴヌクレオチドは、細胞あるいは個体への投与により、副作用を抑制しつつ遺伝子発現の制御が可能となるため、疾患の治療薬として用いることができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－０７８５０７（出願日：２０２１年５月６日）及び特願２０２１－１５１５４３（出願日：２０２１年９月１６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (14)

  1. 　中枢毒性が低減したオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、
    　（１）ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子を、下記式Ｉ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　（式中、
    　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である）
    または下記式I’
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　（式中、
    　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））
    で表される構造に置換する工程、および任意により
    　（２）該オリゴヌクレオチドが有する少なくとも一つのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換する工程
    を含むことを特徴とする、方法。
  2. 　オリゴヌクレオチドがギャップマー型オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 　上記工程（１）で置換されるヌクレオシドの少なくとも一つがギャップ領域に位置する、請求項２に記載の方法。
  4. 　上記工程（２）で置換されるホスホロチオエート結合の少なくとも一つがギャップ領域に位置する、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　３’ウイング領域および５’ウイング領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドが架橋型ヌクレオシドである、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドの中枢毒性の低減の程度を評価する方法であって、以下の工程（１）～（３）：
    （１）ホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドを準備する工程、
    （２）請求項１～５のいずれか１項に記載の方法により設計したオリゴヌクレオチドを準備する工程、および
    （３）工程（２）で準備したオリゴヌクレオチドの中枢毒性と、工程（１）で準備したオリゴヌクレオチドの中枢毒性とを比較する工程
    を含む、方法。
  7. 　中枢毒性が低減したホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも一つのヌクレオシドの糖部５’位炭素原子が、下記式Ｉ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（式中、
    　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基である）
    または下記式I’
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　（式中、
    　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基である（ただし、Ｒ４およびＲ５が共に水素原子である場合を除く））
    で表される構造を形成しており、任意により少なくとも一つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である、オリゴヌクレオチド。
  8. 　ギャップマー型オリゴヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 　上記式ＩまたはI’で表される構造を有するヌクレオシドの少なくとも一つがギャップ領域に位置する、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 　前記ホスホジエステル結合の少なくとも一つがギャップ領域に位置する、請求項８または９に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 　３’ウイング領域および５’ウイング領域を構成する少なくとも一つのヌクレオシドが架橋型ヌクレオシドである、請求項８～１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 　請求項７～１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、遺伝子の発現制御用試薬。
  13. 　請求項７～１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、疾患の治療薬。
  14. 　（１）請求項１～５のいずれか１項に記載の方法によりオリゴヌクレオチドを設計する工程、および
    　（２）工程（１）で設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程
    を含む、低中枢毒性オリゴヌクレオチドの製造方法。
     
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