WO2024257847A1 - Ｒｐｓ２５遺伝子の発現及び／又はその機能を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Ｒｐｓ２５遺伝子の発現及び／又はその機能を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド Download PDF

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峻哲 川野邊
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to antisense oligonucleotides that regulate the expression and/or function of the RPS25 gene, and to agents that regulate the expression and/or function of the RPS25 gene, including the same.
  • the Ribosomal Protein S25 (RPS25) gene is a gene that encodes one of the constituent proteins of the ribosomal 40S subunit.
  • the three-dimensional structure of the constituent protein (RPS25 protein) encoded by the RPS25 gene in the ribosomal 40S subunit has also been elucidated.
  • the RPS25 protein binds to an RNA element that enables the initiation of cap-independent translation as part of the protein synthesis process, and controls translation.
  • the RNA element to which the RPS25 protein binds is called an internal ribosome entry site (IRES). IRES is one of the cap-independent translation mechanisms that is commonly found, especially in viruses. (Non-Patent Document 2)
  • Non-Patent Document 3 Repeat associated non-ATG translation (RAN translation) was first identified in patients with spinocerebellar ataxia type 8 in 2011 (Non-Patent Document 3).
  • RAN translation refers to a mechanism in which a specific sequence is repeated to be translated into a protein (dipeptide repeat (DPR) etc.) in an ATG-independent manner. Subsequently, the involvement of RAN translation has been reported in several repeat diseases (diseases caused by the repetition of a specific gene sequence) such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with a mutation in the C9orf72 gene (hereinafter sometimes referred to as "C9orf72 ALS”), Huntington's disease, and myotonic dystrophy. Research has been conducted on the relationship between DPR produced by RAN translation and pathology, and it has been reported that removal of DPR is effective in improving pathology. (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5)
  • the RPS25 protein was reported as a molecule that contributes greatly to the production of dipeptide repeats by RAN translation. Knocking down the RPS25 gene suppressed the production of DPRs derived from GGGGCC repeat sequences or DPRs derived from CAG repeat sequences that are RAN translation-dependent.
  • the GGGGCC repeat sequence is known as an abnormal elongation mutation of the C9orf72 gene, which is one of the familial mutations in amyotrophic lateral sclerosis.
  • the CAG repeat sequence is known as an abnormal elongation mutation of the huntingtin gene and the ATXN2 gene.
  • Non-Patent Document 6 It was revealed that knocking down the RPS25 gene suppressed the production of DPRs derived from GGGGCC repeat sequences and also suppressed motor neuron cell death in motor neuron cells derived from induced purulipotent stem cells (iPSCs) established from patients with C9orf72 gene mutations.
  • iPSCs induced purulipotent stem cells
  • the antisense oligonucleotide against the RPS25 gene disclosed in Non-Patent Document 6 is a gapmer in which the wing portions are modified with 2'-O-methylated RNA (2'-OMe nucleic acid) and the internucleoside space is phosphorothioated.
  • the base sequence of the antisense oligonucleotide contains a portion of the base sequence of the sense strand of the RPS25 gene.
  • Patent Document 7 a single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that binds to the RPS25 gene and effectively regulates the expression of the RPS25 gene.
  • Antisense oligonucleotides are compounds that have a gap region made of deoxyribose and modified nucleic acids in the wing region that have been developed to improve nuclease resistance and improve binding affinity and specificity to target RNA. They act by hybridizing to the target RNA sequence and suppressing gene expression.
  • modified nucleic acids have been developed for clinical application of gapmers, and many compounds (gapmers) that use these have been developed and marketed. Due to their nature, nucleic acid drugs, including gapmers, are known to accumulate in specific organs such as the liver when exposed to the whole body.
  • toxicity of antisense oligonucleotides can be categorized into "toxicity caused by hybridization with non-target RNA (off-target toxicity in the narrow sense)” and “toxicity not caused by hybridization with RNA (off-target toxicity in the broad sense),” and various approaches have been adopted to avoid these toxicities.
  • toxicity caused by hybridization with non-target RNA off-target toxicity in the narrow sense
  • toxicity not caused by hybridization with RNA off-target toxicity in the broad sense
  • Non-Patent Document 8 a document evaluating central toxicity due to phosphorothioate modifications in antisense oligonucleotides discloses that central toxicity is reduced in phosphorothioate-modified gapmers by replacing phosphorothioate bonds in the wing portions with phosphodiester bonds.
  • delayed central toxicity In addition to acute central toxicity, it is also known that there is central toxicity that appears a certain time after administration (hereinafter sometimes referred to as “delayed central toxicity”; also referred to as “in vivo delayed neuroTox” in this specification), and from the day after exposure to the central nervous system, symptoms such as decreased spontaneous movement, abnormal gait and abnormal function of the hind limbs, tremors, weakness of the hind limbs or tail, loss of hind limb reflexes, and weight loss are observed. As far as the inventor knows, no specific solution to this delayed central toxicity has been reported.
  • Patent Document 1 reports that inhibiting the RPS25 gene suppresses the production of DPR, it is unclear whether a similar effect can be achieved by an approach using nucleic acids such as antisense.
  • the antisense oligonucleotide described in Non-Patent Document 5 suppresses the expression of the RPS25 gene, but the inhibitory effect is partial.
  • Patent Document 7 we have reported a single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that effectively regulates the expression of the RPS25 gene, but there is a need to create an antisense oligonucleotide against the RPS25 gene that has reduced toxicity (e.g., delayed central nervous toxicity) for use as a pharmaceutical.
  • toxicity e.g., delayed central nervous toxicity
  • the present invention has been made in consideration of the above circumstances, and the problem that the present invention aims to solve is to provide a single-stranded antisense oligonucleotide that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene with reduced delayed central nervous system toxicity, and an agent for regulating the expression and/or function of the RPS25 gene that contains the same.
  • the present invention is as follows.
  • the antisense oligonucleotide according to the first aspect of the present invention comprises: A single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the 3' wing region and the 5' wing region are modified nucleic acids having a substitution at
  • the antisense oligonucleotide according to the second aspect of the present invention comprises: A single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the 3' wing region and the 5' wing region are modified nucleic acids having a substitution at
  • the antisense oligonucleotide according to the third aspect of the present invention comprises: A single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the 3' wing region and the 5' wing region are modified nucleic acids having a substitution at
  • modified nucleic acids are located in the gap region, the 5' wing region and the 3' wing region.
  • the gap region contains at least one 5'-CP nucleic acid (5'-cyclopropyl nucleic acid).
  • Modified nucleic acids having a substituent at the 2'-position located in the 5'-wing region and the 3'-wing region include, as non-bridged modified nucleic acids, 2'-MOE nucleic acid (2'-O-methoxyethyl nucleic acid), 2'-OMe nucleic acid (2'-O-methyl nucleic acid), and MCE (2'-O-(2-N-methylcarbamoyl)ethyl nucleic acid), and as bridged modified nucleic acids, 2',4'-BNA/LNA (2',4'-Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid, hereinafter sometimes referred to as "LNA"), AmNA (amide-bridged modified nucleic acid, Amido-bridged
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is preferably selected from the group consisting of 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is expected to have high binding affinity to RPS25 mRNA or pre-mRNA while reducing delayed central nervous system toxicity.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is a so-called gapmer type single-stranded antisense oligonucleotide, it functions as a catalyst in the decomposition reaction of the RPS25 gene by RNase, which will be described later, and is therefore considered to have a sustained desired effect even when administered in a small amount.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide has a sequence identity of 95% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the base sequence having the same base length as the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence complementary to at least one target region in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the target region having the same base length as the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the number of bases in the gap region is 5 to 20 mer; the 3' wing region is a 3-5 mer modified nucleic acid having a substituent at the 2' position, The 5' wing region is a 3-5 mer modified nucleic acid having a substituent at the 2' position.
  • the 5'-CP nucleic acid is positioned at least at the second position counting from the 5' side of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in a ninth or more position relative to the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in a position that is one-fifth or more of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in a continuous 2-4 mer sequence at least at one location in the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is located on the 5' end side of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged on the 5'-end side and the 3'-end side of the gap region.
  • the base length of the single-stranded antisense oligonucleotide is 15 to 20 mer.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has a base length of 18 to 20 mer.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 3'-wing region comprises at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA;
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region comprises at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 3'-wing region is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA;
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 5' wing region is comprised of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 3'-wing region is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA;
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 5' wing region is comprised of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • At least one internucleoside bond in the single-stranded antisense oligonucleotide is a phosphorothioate bond.
  • At least one internucleoside bond in the single-stranded antisense oligonucleotide is a phosphodiester bond.
  • the ratio of phosphorothioate bonds in the internucleoside bonds constituting the single-stranded antisense oligonucleotide is 50% to 80%.
  • the proportion of phosphorothioate bonds in the internucleoside bonds constituting the single-stranded antisense oligonucleotide is 50% to 70%.
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the nucleoside adjacent to the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is a phosphorothioate bond (excluding the case where the 5'-CP nucleic acid is located at the 3' end of the gap region).
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the nucleoside adjacent to the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is a phosphorothioate bond (excluding the case where the 5'-CP nucleic acid is located at the 3' end of the gap region and the case where the nucleoside adjacent to the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is a 5'-CP nucleic acid).
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the adjacent nucleoside on the 5' side of the 5'-CP nucleic acid is a phosphodiester bond.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 14-22 mer from bases located at positions 123, 124, 185, 186, 263, 264, 324, 325, 442, 443, or 447 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or It is a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 14-22mer from the bases located at positions 324, 325, or 448 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or It is a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide has a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 18-22mer from the bases located at positions 448 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the 3' wing region is a 3-5 mer, The 5' wing region is a 3-5 mer.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence that has 90% to 100% sequence identity with respect to a base sequence complementary to a target region consisting of 18 to 20 consecutive bases from the 450th to 451st or 453rd bases counting from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 5 to 47 and 49 to 56.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 6, 9, 12, 15 to 18, 22, 24, 27 to 29, 31 to 36, 38, 40 to 42, 47, and 49 to 54.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 41, 47, 50, and 53 to 55.
  • the antisense oligonucleotide complex according to the present invention comprises a single-stranded antisense oligonucleotide according to any one of [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, and an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof,
  • the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains, nucleic acids, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains.
  • the pharmaceutical product according to the present invention contains, as an active ingredient, any one of the single-stranded antisense oligonucleotides [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, is administered so as to be exposed to the central nervous system.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof is administered to a subject susceptible to delayed central nervous system toxicity.
  • the expression and/or function regulator of the RPS25 gene according to the present invention contains, as an active ingredient, any one of the single-stranded antisense oligonucleotides [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the inhibitor of dipeptide repeat production by RNA translation of the present invention contains, as an active ingredient, any one of the single-stranded antisense oligonucleotides [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the therapeutic agent for repeat disease according to the present invention contains, as an active ingredient, any one of the single-stranded antisense oligonucleotides [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the preventive agent for repeat disease according to the present invention contains, as an active ingredient, any one of the single-stranded antisense oligonucleotides [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the repeat disease is at least one selected from the group consisting of C9orf72 ALS, C9orf72 FTLD, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, dentatorubral-pallidoluysian atrophy, spinal-bulbar muscular atrophy, Friedreich ataxia, fragile X-associated tremor ataxia syndrome, and myotonic dystrophy.
  • the method for treating or preventing a repeat disease comprises administering to an individual the single-stranded antisense oligonucleotide of any one of [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex of [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the repeat disease is at least one selected from the group consisting of C9orf72 ALS, C9orf72 FTLD, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, dentatorubral-pallidoluysian atrophy, spinal-bulbar muscular atrophy, Friedreich ataxia, fragile X-associated tremor ataxia syndrome, and myotonic dystrophy.
  • the present invention provides a single-stranded antisense oligonucleotide according to any one of [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or an antisense oligonucleotide conjugate according to [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, for use in the treatment or prevention of C9orf72 ALS.
  • the present invention provides a single-stranded antisense oligonucleotide according to any one of [1] to [33] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or an antisense oligonucleotide complex according to [34] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, for use in producing a therapeutic or prophylactic agent for C9orf72 ALS.
  • the present invention makes it possible to provide a single-stranded antisense oligonucleotide that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene and has reduced delayed central nervous system toxicity, as well as an agent for regulating the expression and/or function of the RPS25 gene that contains the same.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the configuration of a single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the mechanism by which the expression of the RPS25 gene is suppressed when the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment is used.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of this embodiment is a single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the "RPS25 gene” can be defined by Mol. Gen. Genet. (1979) 169: 1-6 (Non-Patent Document 9) and Curr. Opin. Struct. Biol. (2014) 24: 165-169 (Non-Patent Document 10). Synonyms of "RPS25” include 40S ribosomal protein S25, ribosomal protein S25, small ribosomal subunit protein eS25, Rps25, 2810009D21Rik, ribosomal protein s25, ribosomal protein S25, S25, eS25, and ribosomal protein.
  • single-stranded antisense oligonucleotide or “antisense oligonucleotide” (hereinafter, sometimes referred to as "ASO") means an oligonucleotide complementary to the mRNA, pre-mRNA, or ncRNA (non-coding RNA) of a target gene (hereinafter, these three may be collectively referred to as "target RNA”), or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • ASO antisense oligonucleotides
  • Antisense oligonucleotides form a double strand with the target mRNA, pre-mRNA, or ncRNA, thereby suppressing the action of the target mRNA, pre-mRNA, or ncRNA.
  • Antisense oligonucleotides include those having a completely complementary base sequence to the base sequence of the target mRNA, pre-mRNA, or ncRNA, those having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted, or added in the complementary base sequence, and those containing a base that forms a wobble base pair in the base sequence.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention may further contain modified nucleotides known in the art other than the "modified nucleic acid whose sugar moiety is a modified sugar" (sugar-modified modified nucleotides) described below.
  • modified nucleotides known in the art include phosphate-modified modified nucleotides and nucleic acid base-modified modified nucleotides described below.
  • both ends of the antisense oligonucleotide in this embodiment is not particularly limited, and may be, for example, -OH or -OR (wherein R represents an alkyl chain, a phosphate ester, or an additional substance described later).
  • the single-stranded antisense oligonucleotide in this embodiment may be in the form of a single strand, or may hybridize with a second strand oligonucleotide described later to form a double strand.
  • the double-stranded oligonucleotide consisting of the single-stranded antisense oligonucleotide and the second strand oligonucleotide hybridized to the single-stranded antisense oligonucleotide may be referred to as a "double-stranded antisense oligonucleotide".
  • oligonucleotide refers to a polymer of nucleosides in which 2 to 30 identical or different nucleosides are linked together by phosphodiester bonds or other bonds.
  • the oligonucleotide can also be understood to be composed of a nucleic acid base portion, a phosphate portion, and a sugar portion, as shown in the following structural formula:
  • oligonucleotides are broadly classified into natural oligonucleotides and non-natural oligonucleotides.
  • Natural oligonucleotides refers to oligonucleotides made of naturally occurring nucleotides.
  • Non-natural oligonucleotides refers to oligonucleotides containing at least one modified nucleotide as a constituent unit, as described below.
  • Non-natural oligonucleotides preferably include modified sugar derivatives in which the sugar portion is modified; phosphorothioate derivatives in which one non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom; phosphorodithioate derivatives in which two non-bridging oxygen atoms of the phosphodiester bond are replaced with sulfur atoms; ester derivatives in which the phosphodiester bond is tri-esterified; phosphoamide derivatives in which the phosphodiester bond is amidated; boranophosphate derivatives in which the phosphodiester bond is boronated; alkylphosphonate (e.g., methylphosphonate, methoxypropylphosphonate, etc.) derivatives in which the non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with an alkyl group; amide derivatives in which the phosphodiester bond is replaced with an amide bond; and modified base derivatives in which the nucleic acid base is modified.
  • the above-mentioned non-natural oligonucleotide includes a cross-linked modified sugar derivative in which the sugar portion is modified; a phosphorothioate derivative in which one non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom; an ester derivative in which the phosphodiester bond is esterified; and an alkylphosphonate derivative in which the sugar portion is modified with a modified sugar (e.g., a cross-linked sugar) described below and one non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom or the non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with an alkyl group.
  • a modified sugar e.g., a cross-linked sugar
  • nucleoside refers to a compound in which a purine base or a pyrimidine base is bound to a sugar.
  • a naturally occurring nucleoside may be referred to as a "natural nucleoside”.
  • a modified nucleoside that does not exist in nature may be referred to as a "modified nucleoside”.
  • a modified nucleoside in which the sugar moiety is particularly modified may be referred to as a "modified sugar nucleoside”.
  • nucleotide refers to a compound in which a phosphate group is bound to the sugar of the nucleoside.
  • a naturally occurring nucleotide may be referred to as a "natural nucleotide”.
  • a modified nucleotide that does not exist in nature may be referred to as a "modified nucleotide” or "modified nucleic acid”.
  • modified nucleotide or “modified nucleic acid” include a compound in which a phosphate group is bound to the sugar moiety of the modified nucleoside, a compound in which a modified phosphate group described below is bound to the sugar moiety of the modified nucleoside, and a compound in which a modified phosphate group described below is bound to the sugar moiety of a natural nucleoside.
  • sugar modification means that the sugar moiety of the nucleotide is modified.
  • the modified sugar moiety may be particularly referred to as a "modified sugar”.
  • Modified nucleotides that have been sugar modified can be used as modified nucleic acids, and examples of such modified nucleotides include LNA, AmNA, GuNA, scpBNA, 2'-O-alkyl (e.g., 2'-O-methyl nucleic acid, 2'-MOE nucleic acid, etc.), 2'-F, 5'-methyl-DNA, ENA (2'-O,4'-C-Ethylene-Bridged Nucleic Acid), S-cEt (2',4'-constrained Ethyl Nucleic Acid), 5'-CP nucleic acid (5'-cyclopropyl Nucleic Acid), and the like.
  • LNA examples include those containing structures represented by the symbols “A(L)”, “5(L)”, “G(L)”, and “T(L)” as described below.
  • AmNA examples include those containing structures represented by the symbols “A(Y)”, “5(Y)”, “G(Y)”, and “T(Y)” as described below.
  • GuNA examples include those containing structures represented by the symbols “A(Gx)”, “5(Gx)”, “G(Gx)”, and “T(Gx)” as described below.
  • scpBNA examples include those containing structures represented by the symbols “A(S)”, “5(S)”, “G(S)”, and “T(S)” as described below.
  • Examples of 2'-MOE nucleic acids include those containing structures represented by the symbols “A(m)”, “5(m)”, “G(m)”, and “T(m)” as described below.
  • Examples of 5'-CP nucleic acids include those containing structures represented by the symbols “A(5'-CP)”, “5(5'-CP)”, “G(5'-CP)”, and “T(5'-CP)” as described below.
  • Examples of 2'-OMe nucleic acids include those containing structures represented by the symbols “A(M)”, “5(M)”, “G(M)”, “U(M)", and “T(M)” as described below.
  • Examples of MCE nucleic acids include those containing structures represented by the symbols “A(Mx)”, “5(Mx)”, “G(Mx)”, and "U(Mx)” as described below.
  • modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position refers to a modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position of the sugar moiety of the above nucleotide.
  • non-bridged modified nucleic acids include 2'-O-alkyl (e.g., 2'-O-methyl nucleic acid, 2'-MOE nucleic acid, MCE nucleic acid, etc.) and 2'-F, while bridged modified nucleic acids include LNA, AmNA, GuNA, scpBNA, ENA, S-cEt, etc.
  • Nucleotide modifications known in the art other than sugar modifications can be used as modified nucleic acids for producing single-stranded antisense oligonucleotides of the present invention.
  • nucleotide modifications phosphate group modifications and nucleic acid base modifications described below are known. Examples of such nucleotide modifications include nucleotide modifications described in W. Brad Wan et. Al. J. Med. Chem. (2016) 59: 9645-9667. (Non-Patent Document 11) and the like. These nucleotide modifications can be carried out based on methods known in the art described in the documents cited in the above documents.
  • phosphate group refers to a nucleotide in which the bond at the phosphate moiety is a naturally occurring phosphodiester bond (a bond indicated by the symbol "-" as described below).
  • phosphate group modification means that the phosphate moiety of the nucleotide is modified.
  • the modified phosphate moiety may be specifically referred to as a "modified phosphate group.”
  • nucleobase modification means that the nucleobase portion of the nucleotide is modified.
  • the modified nucleobase portion may be specifically referred to as a "modified nucleobase.”
  • modified nucleobases include 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, and 5-propynylcytosine.
  • DNA or RNA analogues refer to molecules having a structure similar to that of DNA or RNA, such as peptide nucleic acid (pNA) and morpholino nucleic acid.
  • pNA peptide nucleic acid
  • morpholino nucleic acid morpholino nucleic acid
  • ncRNA refers to a general term for RNA that is not involved in protein translation.
  • examples of the ncRNA include ribosomal RNA, transfer RNA, miRNA, and Natural Antisense Transcript (NAT).
  • nucleic acid base moiety of the oligonucleotide examples include thyminyl, cytosinyl, adeninyl, guaninyl, 5-methylcytosinyl, uracilyl, 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl, 4-amino-5-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl, and 2-oxo-4-hydroxy-1,2-dihydropyrimidin-1-yl groups.
  • examples of the nucleic acid base moiety include thyminyl, cytosinyl, adeninyl, guaninyl, 5-methylcytosinyl, and uracilyl groups.
  • uracil (U) and thymine (T) are interchangeable. Both uracil (U) and thymine (T) can form base pairs with adenine (A) in a complementary strand.
  • Cytosine (C) and 5-methylcytosine (5(x)) are interchangeable and can both form base pairs with guanine (G) in a complementary strand. The same is true for the nucleobase portion of antisense oligonucleotides.
  • target RNA refers to an RNA whose function is inhibited by the binding of the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • target RNA refers to the mRNA and pre-mRNA of RPS25.
  • Examples of the target RNA include human RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (hereinafter, sometimes referred to as "hRPS25”), monkey RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (hereinafter, sometimes referred to as “cRPS25”), mouse RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (hereinafter, sometimes referred to as "mRPS25”), rat RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (hereinafter, sometimes referred to as "rRPS25”), etc.
  • hRPS25 human RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • cRPS25 monkey RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
  • mRPS25 mouse RPS25 mRNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3
  • rRPS25 rat RPS25 mRNA
  • binding to a target RNA means that the nucleic acid base of the single-stranded antisense oligonucleotide forms a double-stranded nucleic acid together with the nucleic acid base of the target RNA due to complementarity with the target RNA.
  • the double-stranded nucleic acid may be formed in at least a part of the target RNA.
  • the strength of the binding to the target RNA can be measured, for example, by an index of thermal stability.
  • An example of the index of thermal stability is the melting temperature (Tm value) of the double-stranded nucleic acid.
  • the Tm value is preferably 40 to 90°C, more preferably 50 to 70°C.
  • the target region refers to a region in the mRNA and pre-mRNA of RPS25 to which the single-stranded antisense oligonucleotide binds, including the target region consisting of the indicated nucleotide sequence and a region on the pre-mRNA of RPS25.
  • the pre-mRNA refers to a primary transcript of RNA transcribed from DNA. That is, the pre-mRNA is an RNA including an exon region, an intron region, and an untranslated region (UTR).
  • the pre-mRNA can also be understood as an RNA before splicing after transcription. When the pre-mRNA is spliced, it becomes an mRNA.
  • the binding to the target region means that the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention forms a double strand with the target region.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention does not necessarily need to form a double strand with the entire target region, but can form a double strand with a part of the target region. That is, the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is preferably one that has complete complementarity with the target region, but can be complementary to at least a part of the target region as long as it binds to the target RNA of RPS25.
  • the part of the target region means a region of the target region having a length of 10 to 15 nucleotide bases.
  • “Complementary to at least a portion of the target region” means complementary to the bases of at least a portion of the target region on the target RNA, including complementary to the bases of a region on an mRNA or pre-mRNA corresponding to the at least a portion of the region.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment is: (A) a base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 14-22 mer from bases located at positions 123, 124, 185, 186, 263, 264, 324, 325, 442, 443, or 447 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (B) a base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or (C) A base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region is preferable.
  • each base sequence shown in the sequence listing is used to indicate only the sequence information of the nucleic acid base portion.
  • the structural information of the oligonucleotide including the sugar portion and the phosphate portion in addition to the nucleic acid base portion is shown in the format shown in Tables 2-1 to 2-4, 3-1, 3-2, and 4 described below.
  • sequence identity refers to the percentage of identical bases in the total overlapping base sequence in the optimal alignment when two base sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm can take into account the introduction of gaps into one or both of the sequences for optimal alignment).
  • sequence identity of base sequences can be easily confirmed by those skilled in the art. For example, NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) can be used.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment preferably has a sequence identity of 95% to 100% with the base sequence complementary to the above-mentioned specified target region in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1, more preferably has a sequence identity of 98% to 100%, and even more preferably has a sequence identity of 100%.
  • a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted or added can be, for example, a base sequence that has 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity due to the deletion, substitution, insertion or addition to the base sequence before the deletion, substitution, insertion or addition.
  • the specific number of "one or several bases” may be one, two, three, four or five of the above-mentioned deletions, substitutions, insertions or additions, each independently, or a combination of multiple bases.
  • stringent conditions refers to conditions in which the sample is incubated for 12 hours at room temperature in a solution containing 6xSSC (1xSSC composition: 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5x Denhardt's solution, 100 ⁇ g/mL denatured salmon sperm DNA, and 50% (v/v) formamide, followed by washing with 0.5xSSC at a temperature of 50°C or higher.
  • more stringent conditions such as incubation for 12 hours at 45°C or 60°C, washing with 0.2xSSC or 0.1xSSC, and washing at a temperature of 60°C or 65°C or higher, are also included.
  • the target region is preferably a 14-22mer base sequence consisting of consecutive bases located at positions 123, 124, 185, 186, 263, 264, 324, 325, 442, 443, or 447-453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • the target region is preferably a base sequence consisting of a contiguous 14-22 mer starting from bases located at positions 324, 325, or 448 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • the target region is preferably a base sequence consisting of a continuous 18-22 mer starting from bases 448 to 453 counting from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • the target region is preferably a base sequence consisting of 18 to 20 consecutive bases from the 450th to 451st or 453rd base counting from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • binding to the target region of RPS25 includes direct binding of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention to the mRNA of RPS25 and direct binding to the mRNA precursor of RPS25.
  • One embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded oligonucleotide that regulates the expression of the RPS25 gene, which has any of the base sequences shown in Table 1, and which is complementary to the target region in the mRNA of human RPS25 shown in Table 1.
  • the single-stranded oligonucleotide may extend 1 to 5 bases on the 3' side and/or 5' side, respectively, as long as it contains the base sequence shown in Table 1.
  • the target region can be said to be a region in the mRNA of human RPS25 that is particularly related to the regulation of the expression of the human RPS25 gene (for example, a region having a secondary structure of the mRNA to which antisense nucleotides are easily bound) in the mRNA of human RPS25.
  • the 5'-end position is "451" and the 3'-end position is "465" in Table 1
  • the base sequence from the 451st to the 465th bases counting from the 5'-end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the target region in the mRNA of human RPS25 targeted by the corresponding single-stranded antisense oligonucleotide (sequence name "h451-465").
  • the symbols "A'", “C'”, “G'” and “T'” are each selected from natural nucleosides (a, A, c, C, g, G, t, and U, as described below) or modified nucleosides (including modified sugar nucleosides).
  • the symbol “A'” is selected from A(M), A(m), A(L), A(Y), A(Gx), A(5'-CP), A(Mx) or A(S) described below
  • the symbol “C'” is selected from 5(x), C(M), 5(m), 5(L), 5(Y), 5(Gx), 5(5'-CP), C(Mx) or 5(S) described below
  • the symbol “G'” is selected from G(M), G(m), G(L), G(Y), G(Gx), G(5'-CP), G(Mx) or G(S) described below
  • the symbol “T'” is selected from U(M), T(m), T(L), T(Y), T(Gx), T(5'-CP), U(Mx) or T(S) described below.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably one base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 5 to 47 and 49 to 56.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 9, 12, 15-18, 22, 24, 27-29, 31-36, 38, 40-42, 47, and 49-54.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 6, 9, 12, 15-18, 22, 24, 27-29, 31-32, 34-36, 38, 40-42, 47, and 49-54.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 41, 47, 50, and 53 to 55.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment may be in the form of a pharmacologically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to the salt of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, which is the physiologically acceptable salt of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, that is, the salt that retains the desired biological activity of the single-stranded antisense oligonucleotide and does not retain undesired toxicological effects.
  • the double-stranded antisense oligonucleotide and antisense oligonucleotide complex described below.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide may be in the form of a pharma- ceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt that is the above-mentioned pharmacologically acceptable salt and is an acid addition salt or a base addition salt.
  • acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, and phosphate, and organic acid salts such as citrate, oxalate, phthalate, fumarate, maleate, succinate, malate, acetate, formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, methanesulfonate, benzenesulfonate, para-toluenesulfonate, and camphorsulfonate.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, and phosphate
  • organic acid salts such as citrate, oxalate, phthalate, fumarate, maleate, succinate, malate, acetate, formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, methanesulfonate, benzenesulf
  • base addition salts include inorganic base salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, barium salts, and aluminum salts, as well as organic base salts such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine [tris(hydroxymethyl)methylamine], tert-butylamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, and N,N-dibenzylethylamine.
  • inorganic base salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, barium salts, and aluminum salts
  • organic base salts such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine [tris(hydroxymethyl)methylamine], tert-butylamine, cyclohexy
  • salts with basic or acidic amino acids such as arginine, lysine, ornithine, aspartic acid, or glutamic acid (amino acid salts).
  • basic or acidic amino acids such as arginine, lysine, ornithine, aspartic acid, or glutamic acid (amino acid salts).
  • the single-stranded antisense oligonucleotide includes a gap region, a 3' wing region bound to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region bound to the 5' end of the gap region (see, for example, FIG. 1).
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably in a single-stranded form.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide may hybridize with a second-stranded oligonucleotide described below to take a double-stranded form (double-stranded antisense oligonucleotide).
  • the base sequence of the second-stranded oligonucleotide is preferably a base sequence having a sequence identity of 90% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is a so-called gapmer type single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the gapmer type single-stranded antisense oligonucleotide inhibits the function of the target RNA by the following mechanism. First, the single-stranded antisense oligonucleotide binds to the target region of the target RNA (top to center of FIG. 2). Next, RNase H, an RNA degrading enzyme, recognizes and binds to the complex of the single-stranded antisense oligonucleotide and the target RNA (center of FIG. 2).
  • the target RNA is then cleaved and degraded by an enzymatic degradation reaction by RNase H.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is not affected by the enzymatic degradation by RNase H (lower part of FIG. 2). Therefore, the single-stranded antisense oligonucleotide can bind to another target RNA and cleave and degrade the RNA.
  • the gapmer type single-stranded antisense oligonucleotide functions as a catalyst in the enzymatic degradation reaction by RNase H described above, and is therefore considered to have a predetermined effect even when administered in small amounts.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide can be suitably used to regulate the expression of the RPS25 gene by the mechanism described above (including the case where it acts through regulating the maturation of RPS25 mRNA precursors). Furthermore, according to this embodiment, the effect of regulating the expression of the RPS25 gene by the single-stranded antisense oligonucleotide can be exerted even by intrathecal administration, which is an administration route commonly used in clinical applications.
  • regulating the expression of the RPS25 gene means at least suppressing the expression of the RPS25 gene, and as a result, at least suppressing the function of the RPS25 protein (such as RNA translation).
  • the gap region includes at least one 5'-CP nucleic acid.
  • the gap region is preferably a 5-20 mer nucleic acid composed of deoxyribose which may include a nucleic acid whose sugar portion is modified.
  • the gap region can also be understood as a 5-20 mer nucleic acid containing deoxyribose which may include a nucleic acid whose sugar portion is modified.
  • the gap region can also be understood as being composed of 5-20 mer natural nucleotides, non-natural nucleotides, or both, whose sugar portion is deoxyribose.
  • the gap region can form a complex recognizable by RNase H together with the target RNA, such as the mRNA of RPS25, by having the sugar portion be deoxyribose or modified deoxyribose.
  • the target RNA such as the mRNA of RPS25
  • the sugar portion be deoxyribose or modified deoxyribose.
  • an example of a nucleic acid containing modified deoxyribose is 5'-CP nucleic acid.
  • the number of bases in the gap region is preferably 5-20 mer, more preferably 6-17 mer, even more preferably 7-13 mer, and even more preferably 9-13 mer.
  • Examples of natural nucleotides in which the sugar moiety is deoxyribose include deoxyadenosine monophosphate, deoxyguanosine monophosphate, thymidine monophosphate, deoxycytidine monophosphate, and deoxy-5-methylcytidine monophosphate (also called 5-methyldeoxycytidine).
  • examples of natural nucleotides that make up the gap region include those that contain structural formulas corresponding to the symbols a, g, t, and c, which will be described later.
  • non-natural nucleotides in which the sugar moiety is deoxyribose or modified deoxyribose include 5'-CP nucleic acid, 2-thio-thymidine monophosphate, 2-aminoadenosine monophosphate, and 7-deazaguanosine monophosphate.
  • the above gap region may be a nucleic acid in which some of the sugar moieties of a natural nucleotide, the sugar moiety of which is deoxyribose, are modified sugars, as long as the effects of the present invention are achieved. That is, in one aspect of this embodiment, the above gap region may be a nucleic acid in which some of the sugar moieties are deoxyribose and other sugar moieties are modified sugars (e.g., modified deoxyribose).
  • the 5'-CP nucleic acid is located at least at the second position counting from the 5' side of the gap region.
  • two or more of the 5'-CP nucleic acid are arranged in the gap region, and it is more preferable that two to five of the 5'-CP nucleic acid are arranged.
  • "two or more are arranged” is a concept that includes an embodiment in which two or more of the target 5'-CP nucleic acid are arranged consecutively, and an embodiment in which two or more are arranged dispersedly in the cap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in a continuous 2-4 mer sequence at least at one location in the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is preferably located on the 5'-end side of the gap region. Also, the 5'-CP nucleic acid is preferably located on the 5'-end side and the 3'-end side of the gap region.
  • located on the 5'-end side of the gap region means located on the 5'-end side of the center of the gap region.
  • located on the 3'-end side of the gap region means located on the 3'-end side of the center of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is preferably arranged in a ninth or more portion of the gap region, and more preferably in a fifth or more portion of the gap region.
  • the upper limit may be, for example, half or less.
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the nucleoside adjacent to the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is preferably a phosphorothioate bond (excluding the case where the 5'-CP nucleic acid is disposed at the 3' end of the gap region).
  • the 5'-CP nucleic acid is disposed at the 3' end of the gap region
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the adjacent nucleoside on the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is preferably a phosphorothioate bond (excluding the cases where the 5'-CP nucleic acid is positioned at the 3' end of the gap region and where the adjacent nucleoside on the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is a 5'-CP nucleic acid).
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the adjacent nucleoside on the 5' side of the 5'-CP nucleic acid is preferably a phosphodiester bond.
  • the 3' wing region is a modified nucleic acid having a substituent at the 2' position.
  • the 3' wing region can be understood to be composed of modified nucleotides having a substituent at the 2' position.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region preferably includes at least one selected from the group consisting of 2'-O-methyl nucleic acid, 2'-MOE nucleic acid, and MCE nucleic acid as non-bridged 2'-position modified nucleic acids, and LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA as bridged modified nucleic acids.
  • the 3' wing region and the 5' wing region described below being composed of the predetermined modified nucleotides, high binding affinity to the target RNA can be expected, and the function of the target RNA can be effectively suppressed.
  • the 3' wing region may be a modified nucleic acid in which the sugar moiety is a modified sugar.
  • modified nucleic acids in which the sugar moiety is a modified sugar include those listed above (sugar modification, modified sugar).
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 3'-wing region may be composed of only 2'-MOE nucleic acid. Note that, the modified nucleic acid in the 3'-wing region may be of multiple types contained in one single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region preferably includes at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA, and more preferably is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region preferably is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the number of bases in the 3' wing region is preferably 3-5 mer, and more preferably 3-4 mer.
  • the 5' wing region is a modified nucleic acid having a substituent at the 2' position.
  • the 5' wing region can be understood to be composed of modified nucleotides having a substituent at the 2' position.
  • the modified nucleic acid in the 5' wing region preferably includes, as a non-bridged 2'-position modified nucleic acid, 2'-O-methyl nucleic acid, 2'-MOE nucleic acid, and MCE nucleic acid, and as a bridged modified nucleic acid, at least one selected from the group consisting of LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the 5' wing region may be a modified nucleic acid in which the sugar moiety is a modified sugar.
  • modified nucleic acids in which the sugar moiety is a modified sugar include those listed above (sugar modification, modified sugar).
  • the modified nucleic acid in the 5' wing region having a substituent at the 2' position may be composed only of 2'-MOE nucleic acid. Note that multiple types of modified nucleic acids in the 5' wing region may be included in one single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the modified nucleic acids in the 3' wing region and the 5' wing region may consist solely of 2'-MOE nucleic acids, or may consist solely of cross-linked modified nucleic acids.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 5' wing region preferably includes at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA, and more preferably is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 5' wing region preferably is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region comprises at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA;
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region preferably comprises at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 3'-wing region is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA, More preferably, the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region is comprised of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region is comprised of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA; More preferably, the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region is comprised of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the number of bases in the 5' wing region is preferably 3-5mer, and more preferably 3-4mer.
  • the number of bases in the gap region is 5-20 mer
  • the number of bases in the 3' wing region is 3-5 mer
  • the number of bases in the 5' wing region is 3-5 mer.
  • the number of bases in the gap region is 7-13 mer
  • the number of bases in the 3' wing region is 3-5 mer
  • the number of bases in the 5' wing region is 3-5 mer.
  • the number of bases in the gap region is 9-13 mer
  • the number of bases in the 3' wing region is 3-4 mer
  • the number of bases in the 5' wing region is 3-4 mer.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is a gapmer type.
  • the notation method of "X-Y-Z” may be used. In the above notation method, "X” indicates the number of bases in the 5' wing region, “Y” indicates the number of bases in the gap region, and “Z” indicates the number of bases in the 3' wing region.
  • X-Y-Z is 2-8-4, 2-8-3, 2-8-5, 2-9-2, 2-9-3, 2-9-4, 2-9-5, 2-10-3, 2-10-4, 2-10-5, 2-11-3, 2-11-4, 2-11-5, 2-12-3, 2-12-4, 2-12-5, 3-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 3-8-5, 3-9-3, 3-9-4, 3-9-5, 3-10-3, 3-10-4, 3-10-5, 3-11-3, 3-11-4, 3-11-5, 3-12-3, 3-12-4, 3-12-5, 3-1 Examples include 3-3, 3-13-4, 4-8-2, 4-8-3, 4-8-4, 4-8-5, 4-9-3, 4-9-4, 4-9-5, 4-10-3, 4-10-4, 4-10-5, 4-11-2, 4-11-3, 4-11-4, 4-11-5, 4-12-4, 4-13-3, 5-8-2, 5-8-3, 5-8-4, 5-8-5, 5-9-2, 5-9-3, 5-9-4, 5-9-5, 5-10-2, 5-10-3, 5-10-4,
  • “2-8-4" means that the 5' wing region is a 2-mer oligonucleotide, the gap region is an 8-mer oligonucleotide, and the 3' wing region is a 4-mer oligonucleotide.
  • the base length of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is 12-30 mer, preferably 15-20 mer, and more preferably 18-20 mer.
  • the base length of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is 15-20 mer or 18-20 mer, the binding to the mRNA of RPS25 is particularly strong, and the expression of the RPS25 gene can be regulated more effectively.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked via a phosphate group and/or a modified phosphate group, and is preferably linked via a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
  • At least one internucleoside bond in the single-stranded antisense oligonucleotide is a phosphorothioate bond. In another aspect of this embodiment, it is preferred that at least one internucleoside bond in the single-stranded antisense oligonucleotide is a phosphodiester bond.
  • the proportion of phosphorothioate bonds in the internucleoside bonds constituting the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably 50% to 80%, and more preferably 50% to 70%.
  • One embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is a gapmer-type single-stranded antisense oligonucleotide having a gap region consisting of 5 to 20 mer, a 5' wing region consisting of 3 to 5 mer, and a 3' wing region consisting of 3 to 5 mer.
  • the gap region is positioned between the 5' wing region and the 3' wing region.
  • the gap region contains at least one 5'-CP nucleic acid. It is preferable that the 5' wing region and the 3' wing region each contain at least one 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, or scpBNA.
  • the 5' wing region and the 3' wing region may contain 2'-O-alkylated or 2'-F-substituted nucleotides.
  • a 2'-O-alkylated nucleotide e.g., 2'-O-methylated, etc.
  • the above-mentioned gapmer-type single-stranded antisense oligonucleotide may form a double strand by hybridizing with a second strand oligonucleotide.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably at least one selected from the group consisting of Example 2, Example 5, Example 8, Example 11 to Example 14, Example 18, Example 20, Example 23 to Example 25, Example 27 to Example 32, Example 34, Example 36 to Example 38, Example 43, and Example 45 to Example 50 in Tables 2-1 to 2-4 described below.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide is more preferably at least one selected from the group consisting of Example 37, Example 43, Example 46, and Examples 49 to 51 in Tables 2-1 to 2-4 described below.
  • the double-stranded antisense oligonucleotide comprises the single-stranded antisense oligonucleotide and and a second strand oligonucleotide hybridized to the single-stranded antisense oligonucleotide, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof.
  • the base sequence of the second strand oligonucleotide is preferably a base sequence having 90% to 100% sequence identity with respect to a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the double-stranded antisense oligonucleotide can be dissociated in solution and separated into the single-stranded antisense oligonucleotide and the second-stranded oligonucleotide.
  • the separated single-stranded antisense oligonucleotide can bind to the target RNA.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide can also be understood as a "first-stranded oligonucleotide" in relation to the second-stranded oligonucleotide.
  • the first-stranded oligonucleotide has an antisense strand to the target RNA, but for convenience, the double-stranded oligonucleotide consisting of the first-stranded oligonucleotide and the second-stranded oligonucleotide will be referred to as a "double-stranded antisense oligonucleotide.”
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by solid-phase synthesis using the phosphoramidite method. For example, a single-stranded oligonucleotide having a predetermined base sequence is first synthesized on a solid-phase support using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer. Next, the synthesized single-stranded oligonucleotide is cut out from the solid-phase support using a basic substance or the like, and deprotected to obtain a crude single-stranded oligonucleotide.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by appropriately changing the base sequence, modification site, etc. of the nucleic acid according to a method known to those skilled in the art.
  • AmNA, GuNA, and scpBNA can be produced by the methods described in WO 2011/052436 (Patent Document 2), WO 2014/046212 (Patent Document 3), and WO 2015/125783 (Patent Document 4), respectively.
  • 2'-MOE nucleic acids can be produced by using amidites that are commercially available as reagents.
  • 5'-CP nucleic acids can be produced by the method described in International Publication No. 2020/158910 (Patent Document 5).
  • LNA can be produced by the method described in International Publication No. 99/14226 (Patent Document 6).
  • the double-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by first producing an oligonucleotide (second strand oligonucleotide) having a predetermined sequence identity based on the base sequence complementary to the single-stranded antisense oligonucleotide using the same production method as the single-stranded antisense oligonucleotide, and then hybridizing the single-stranded antisense oligonucleotide and the second strand oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide complex comprises: the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof; an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide;
  • the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains (e.g., saturated aliphatic hydrocarbons, etc.), nucleic acids, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains (e.g., carbohydrates, polysaccharides, etc.).
  • the antisense oligonucleotide conjugate comprises: The single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof; and an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide, the additional substance being selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains (e.g., saturated aliphatic hydrocarbons, etc.), nucleic acids, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains (e.g., carbohydrates, polysaccharides, etc.).
  • the antisense oligonucleotide conjugate comprises: The double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof; and an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second strand oligonucleotide, the additional substance being selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains (e.g., saturated aliphatic hydrocarbons, etc.), nucleic acids, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains (e.g., carbohydrates, polysaccharides, etc.).
  • additive substance refers to a substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide, and used to impart a predetermined action.
  • the additive substance may be bound to the 5' end, the 3' end, or both the 5' end and the 3' end of the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the additive substance may be bound to the 5' end, the 3' end, or both the 5' end and the 3' end of the second-stranded oligonucleotide.
  • the additive substance is preferably bound to either the 5' end or the 3' end of the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide.
  • the additive substance may be directly bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide by a covalent bond.
  • the additive substance may be bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide via a linker substance.
  • linker substance examples include linkers composed of alkyl, polyethylene glycol, peptide, disulfide, nucleic acid, etc., and/or combinations thereof.
  • the method for binding the additional substance to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide can be, for example, the method described in the Examples below.
  • Peptides used as the above-mentioned additional substances include, but are not limited to, the following: CPPs (Cell Penetrating Peptides), nuclear transport peptides, TAT (Trans-Activator of Transcription protein), polyarginine, glucagon-like peptide-1 analogue peptides, synthetic cyclic RGD peptides, and brain transport peptides.
  • ligand compounds used as the above-mentioned additional substances include, but are not limited to, the following: N-acetylgalactosamine (GalNAc), sugars (glucose, mannose, etc.), lipids (cholesterol, palmitic acid, docosahexaenoic acid, etc.), vitamins (folic acid, vitamin A, vitamin E (tocopherol), etc.), amino acids, monoamine receptor ligands (indatraline, etc.)
  • antibodies that can be used as the additional substance include, but are not limited to, the following: anti-insulin receptor antibody, anti-transferrin receptor antibody, anti-LDL receptor-related protein antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, anti-HER2 antibody
  • Proteins that can be used as the above-mentioned additional substances include, but are not limited to, the following: Albumin
  • nucleic acids used as the additional substance include, but are not limited to, the following: natural nucleotides, aptamers.
  • the nucleic acids used as the additional substance are not counted in the base length of the antisense oligonucleotide.
  • the expression regulator of the RPS25 gene according to this embodiment contains the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, the double-stranded antisense oligonucleotide, or the antisense oligonucleotide complex as an active ingredient.
  • the expression regulator can also be understood as an expression inhibitor for the RPS25 gene.
  • the expression regulator can also be understood as an inhibitor for RNA translation.
  • the expression regulator can also be understood as an expression inhibitor for dipeptide repeats via inhibition of RNA translation.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of the RPS25 gene by binding to the mRNA or pre-mRNA of RPS25, and inhibits the translation of RNA by the translation product.
  • the administration method and formulation of the expression regulator of the RPS25 gene according to the present invention can be any administration method and formulation known in the art.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment contains the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the above-mentioned double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the administration method and formulation of the pharmaceutical composition according to this embodiment can be any administration method and formulation known in the art.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition may be referred to as "pharmaceutical composition of antisense oligonucleotide, etc.”
  • the pharmaceutical composition is used for treating or preventing diseases related to the RPS25 gene, i.e., diseases that can be caused by dipeptide repeats produced by RNA translation.
  • diseases related to the RPS25 gene i.e., diseases that can be caused by dipeptide repeats produced by RNA translation.
  • the pharmaceutical composition can be used for treating or preventing diseases whose symptoms can be expected to improve by suppressing the expression of the RPS25 gene.
  • repeat diseases include various psychiatric and neurological diseases and muscular diseases, including C9orf72 ALS, C9orf72 FTLD, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia (types 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, and 17), dentatorubral-pallidoluysian atrophy, spinal-bulbar muscular atrophy, Friedreich ataxia, fragile X-associated tremor ataxia syndrome, and myotonic dystrophy.
  • C9orf72 ALS C9orf72 FTLD
  • Huntington's disease Huntington's disease
  • spinocerebellar ataxia types 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, and 17
  • dentatorubral-pallidoluysian atrophy spinal-bulbar muscular atrophy
  • Friedreich ataxia fragile X-associated tremor ataxia syndrome
  • myotonic dystrophy myotonic dystrophy.
  • the therapeutic agent for repeat disease contains the above single-stranded antisense oligonucleotide or its pharma- ceutical acceptable salt, the above double-stranded antisense oligonucleotide or its pharma-ceutical acceptable salt, or the above antisense oligonucleotide complex or its pharma-ceutical acceptable salt as an active ingredient.
  • the prophylactic agent for repeat disease contains the above single-stranded antisense oligonucleotide or its pharma-ceutical acceptable salt, the above double-stranded antisense oligonucleotide or its pharma-ceutical acceptable salt, or the above antisense oligonucleotide complex or its pharma-ceutical acceptable salt as an active ingredient.
  • the above repeat disease is preferably at least one selected from the group consisting of C9orf72 ALS, C9orf72 FTLD, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, dentatorubral-pallidoluysian atrophy, spinal-bulbar muscular atrophy, Friedreich ataxia, fragile X-associated tremor ataxia syndrome, and myotonic dystrophy.
  • the C9orf72 ALS refers to ALS having a mutation in which the GGGGCC sequence present in the intron region between the exon 1a and exon 1b regions of the C9orf72 gene is abnormally repeated and expanded.
  • the C9orf72 gene is a causative gene for ALS.
  • ALS is the most common type, accounting for approximately 6% of sporadic ALS cases and approximately 40% of familial ALS cases.
  • ALS is a neurodegenerative disease in which motor neurons selectively die, causing muscle atrophy. It is diagnosed by combining clinical and/or electrophysiologic features of upper and lower motor neuropathy.
  • a laboratory-based diagnosis is made. If it is in the second area, it is diagnosed as supported probable, if it is in the third area, it is diagnosed as probable, and if it is in the third area, it is diagnosed as definite.
  • the C9orf72 FTLD refers to FTLD having a mutation in which the GGGGCC sequence present in the intron region between the exon 1a and exon 1b regions of the C9orf72 gene is abnormally repeated and expanded.
  • the FTLD is characterized by progressive abnormal behavior.
  • patients are observed to have three or more symptoms, such as disinhibited behavior, apathy, lethargy, fixation, stereotypy, or lip-smacking, and changes in eating habits.
  • FTLD neurodegenerative disease
  • the Huntington's disease refers to a hereditary neurodegenerative disease that is inherited in an autosomal dominant manner and is caused by the abnormal repetitive expansion of the CAG sequence present in the exon 1 region of the Huntington's gene.
  • the Huntington's disease presents movement disorders characterized by involuntary movements, psychiatric symptoms, and cognitive symptoms. Huntington's disease is diagnosed when specific neurological findings are observed and abnormal expansion mutations of the CAG sequence are observed in genetic diagnosis, or when a progressive course is observed, a family history of autosomal dominant inheritance, specific neurological findings, and clinical test findings are observed, and similar diseases are denied in differential diagnosis.
  • spinocerebellar ataxia types 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, and 17
  • dentatorubral-pallidoluysian atrophy refers to hereditary neurodegenerative diseases that are inherited in an autosomal dominant manner and are caused by the abnormal repetition and expansion of a specific three-base sequence (CAG or CTG) present on the responsible gene in each disease.
  • CAG or CTG three-base sequence
  • spinocerebellar ataxia type 8 a repeat sequence of CTG is observed.
  • the above-mentioned spinocerebellar ataxia and dentatorubral-pallidoluysian atrophy are diagnosed by combining genetic diagnosis, neuropathological diagnosis, etc., with cerebellar or posterior column ataxia or spastic paraplegia as the main symptoms and being slowly progressive.
  • the above-mentioned spinal and bulbar muscular atrophy refers to a hereditary disease caused by abnormal repeated expansion of the CAG sequence present in the exon region of the androgen receptor gene.
  • the above-mentioned spinal and bulbar muscular atrophy is diagnosed by combining neurological findings (bulbar symptoms, lower motor nerve symptoms, finger tremor, decreased tendon reflexes), clinical findings, laboratory findings, genetic diagnosis, etc.
  • the Friedreich ataxia refers to a hereditary neurodegenerative disease that is autosomal recessive and occurs due to a mutation in the frataxin gene. In most cases of Friedreich ataxia, the GAA sequence in the first intron is abnormally repeated and expanded. By doing so.
  • the fragile X-associated tremor and ataxia syndrome refers to a hereditary neurodegenerative disease caused by abnormal repeated expansion of the CGG sequence present in the 5'UTR of the FMP1 gene.
  • the fragile X-associated tremor and ataxia syndrome is diagnosed by combining clinical symptoms (cerebellar ataxia, motor tremor, Parkinsonism, dementia, intellectual disability), middle cerebellar peduncle signs by MRI examination, genetic diagnosis, etc.
  • the myotonic dystrophy refers to a hereditary muscle disease that is inherited in an autosomal dominant manner and is caused by an abnormal repeated expansion of the CUG sequence present in the 3'UTR of the DMPK gene.
  • the above-mentioned individual means a mammal.
  • the above-mentioned individual is preferably a human, a monkey, a marmoset, a dog, a pig, a rabbit, a guinea pig, a rat, or a mouse.
  • the above-mentioned individual is more preferably a human.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide or pharmaceutical composition thereof may be administered to a subject (individual) sensitive to delayed central toxicity by a suitable administration route.
  • delayed central toxicity refers to central toxicity that appears after a period during which acute central toxicity may appear has passed and recovery has occurred. Examples of symptoms observed due to delayed central toxicity include decreased spontaneous movement, abnormal gait and abnormal function of the hind limbs, tremors, weakness of the hind limbs or tail, loss of hind limb reflexes, weight loss, etc. This toxicity is scored based on the general condition findings observed on the observation day according to the following criteria, and the Clinical sign score is calculated by adding up the scores throughout the observation period.
  • the score is added depending on the intensity of the toxicity findings, a single-stranded antisense oligonucleotide with a low Clinical sign score can be judged to be highly safe.
  • the Pathological score is calculated by scoring the cases where abnormal findings were observed and those where they were not observed in the pathological examination of the brain. The average score for each group will be used.
  • subjects (individuals) sensitive to delayed central nervous system toxicity refers to subjects selected using biomarkers, etc.
  • Clinical sign score 0 points: no abnormality 1 point: abnormal hind leg function, tremor, decreased spontaneous movement 2 points: dragging of hind legs, weakness of tail or hind legs 3 points: complete hind leg dysfunction, paralysis of hind legs, recumbency, prone position 4 points: euthanasia Pathological score; 0 points: no abnormality 1 point: abnormality (single cell necrosis, vacuolation, etc.)
  • nucleic acid drugs may hybridize to RNA (off-target candidate gene or off-target candidate RNA) having the same or similar base sequence as the target RNA, and may manifest toxicity due to affecting the off-target candidate gene (sometimes referred to as "narrow-sense off-target toxicity").
  • RNA off-target candidate gene or off-target candidate RNA
  • a search for similar base sequences using "high-speed base sequence search: GGGenome (https://gggenome.dbcls.jp/ja/)" or the like can be performed to estimate the narrow-sense off-target candidate gene.
  • GGGenome https://gggenome.dbcls.jp/ja/
  • the administration method and dosage form are not particularly limited.
  • any administration method and formulation known in the art can be used as the administration method and formulation of the antisense oligonucleotide of the present invention.
  • the administration method include oral administration and parenteral administration.
  • parenteral administration include eye drop administration, intravaginal administration, intrarectal administration, intranasal administration, transdermal administration, intravenous injection, drip infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, pulmonary administration by aspiration or inhalation, intrathecal administration, and intraventricular administration.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide or pharmaceutical composition thereof is preferably administered so as to be exposed to the central nervous system.
  • the administration method that exposes the central nervous system include intrathecal administration and intraventricular administration.
  • the antisense oligonucleotides and other formulations of the present invention may be mixed with various pharmaceutical additives, such as excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, diluents, flavoring agents, fragrances, solubilizing agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and isotonicity agents, as necessary.
  • various pharmaceutical additives such as excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, diluents, flavoring agents, fragrances, solubilizing agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and isotonicity agents, as necessary.
  • formulations such as transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids, powders, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention such as the antisense oligonucleotide
  • it can be in the form of, for example, a powder, granules, a suspension or solution dissolved in water or a non-aqueous medium, capsules, powders, tablets, or other formulations.
  • compositions such as the antisense oligonucleotides of the present invention parenterally, intrathecally, or intraventricularly
  • formulations such as sterile aqueous solutions can be used.
  • the effective dosage of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be determined arbitrarily depending on the sex, age, weight, symptoms, etc. of the individual to be administered. Furthermore, it can also be determined arbitrarily depending on the method, route, frequency, etc. of administration. For example, the dosage can be 0.01 to 100 mg/kg, etc. Preferably, it is 0.1 to 50 mg/kg, and more preferably, it is 0.1 to 10 mg/kg.
  • the method for regulating expression of the RPS25 gene comprises the step of administering, as an active ingredient, the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof to a cell, tissue, or individual expressing the RPS25 gene.
  • the method of administering the single-stranded antisense oligonucleotide or the like to a cell, tissue, or individual may be performed in vitro or in vivo.
  • the administration route is the administration route described above.
  • examples of "cells expressing the RPS25 gene” include nerve cells that make up the central nervous system, nerve cells that make up the peripheral nervous system, and other cells that make up skin tissue.
  • the method for treating or preventing a repeat disease in this embodiment includes a step of administering the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, as an active ingredient, to an individual suffering from the repeat disease.
  • the above-mentioned individual is preferably a subject (individual) sensitive to delayed central nervous system toxicity.
  • the repeat disease may be the above-mentioned psychiatric and neurological disorders, muscular disorders, etc.
  • the dosage form, administration route, and dosage when administered to an individual may be appropriately selected from those described above.
  • the above describes the antisense oligonucleotide according to this embodiment.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide having the above-mentioned configuration can regulate the expression of the RPS25 gene.
  • the inhibitory activity (knockdown activity) against the expression of the RPS25 gene can be measured by a known method. Examples of the method for measuring the knockdown activity include the methods described in Nature (2015) 518 (7539): 409-12 (Non-Patent Document 12) and WO 2022/097727 (Patent Document 7).
  • the knockdown activity can also be measured by transfection of the antisense oligonucleotide into HEK293T cells, which will be described later.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide contains at least one 5'-CP nucleic acid in the gap region, thereby reducing delayed central nervous toxicity.
  • the "cells expressing the RPS25 gene” are treated with the antisense oligonucleotide for 6 hours to 3 days using a method such as lipofection, electroporation, or introduction by direct addition.
  • the cells used may be any cells expressing the RPS25 gene, such as HEK293T cells, more preferably nerve cells, and even more preferably human-derived nerve cells.
  • the cells treated with the antisense oligonucleotide may be collected immediately after treatment, or the antisense oligonucleotide may be removed and the cells may be continuously cultured.
  • RNA extracted from the collected cells is subjected to a reverse transcription reaction, and the amount of RPS25 mRNA is measured by carrying out real-time PCR or the like on the obtained complementary DNA using an RPS25 gene-specific probe.
  • An example of a probe used in real-time PCR is a Taqman probe.
  • reaction methods include a method in which the three steps of "(cDNA denaturation)-(annealing)-(extension reaction)" or the two steps of "(cDNA denaturation)-(annealing and extension reaction)" are repeated any number of times. The number of times the two or three steps are repeated is, for example, 25 to 45 times, preferably 35 to 40 times.
  • the (cDNA denaturation) temperature is, for example, 90°C to 98°C, preferably 92°C to 95°C.
  • the (annealing) temperature is, for example, 40°C to 70°C, preferably 50°C to 60°C.
  • the (extension reaction) temperature is, for example, 65°C to 75°C, preferably the optimal temperature for the polymerase used in the reaction.
  • the temperature (annealing and extension reaction) is, for example, 55°C to 70°C.
  • the collected cells are lysed to obtain an extract.
  • the amount of RPS25 protein contained in the extract is evaluated using immunochemical techniques such as Western blotting and ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
  • Western blotting any device can be used for each step of electrophoresis, transfer, and detection.
  • the reaction time and reaction temperature of the membrane with the primary or secondary antibody can be set arbitrarily, for example, overnight at 4°C or 1 to 3 hours at room temperature.
  • the present invention is not limited to the above-mentioned embodiments.
  • the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide includes the following embodiments.
  • the antisense oligonucleotide according to the first aspect of the present invention comprises: A single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the 3' wing region and the 5' wing region are modified nucleic acids having a substitution at
  • the antisense oligonucleotide according to the second aspect of the present invention is A single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the 3' wing region and the 5' wing region are modified nucleic acids having a substitution at the
  • the antisense oligonucleotide according to the third aspect of the present invention is A single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that regulates the expression and/or function of the RPS25 gene,
  • the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleoside linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
  • the single-stranded antisense oligonucleotide comprises a gap region, a 3' wing region attached to the 3' end of the gap region, and a 5' wing region attached to the 5' end of the gap region;
  • the gap region is a nucleic acid composed of deoxyribose which may contain a nucleic acid whose sugar moiety is modified, the gap region comprises at least one 5'-CP nucleic acid;
  • the 3' wing region and the 5' wing region are modified nucleic acids having a substitution at the
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide has a sequence identity of 95% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the base sequence being composed of the same base length as the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence complementary to at least one target region in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the target region having the same base length as the single-stranded antisense oligonucleotide.
  • the number of bases in the gap region is 5 to 20 mer
  • the 3' wing region is a 3-5 mer modified nucleic acid having a substituent at the 2' position
  • the 5' wing region is preferably a 3- to 5-mer modified nucleic acid having a substituent at the 2' position.
  • the 5'-CP nucleic acid is located at least at the second position counting from the 5' side of the gap region.
  • two or more of the 5'-CP nucleic acid are arranged in the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acids it is preferable that 2 to 5 of the 5'-CP nucleic acids are arranged in the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in an amount of at least 1/9 of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in a position that is at least one-fifth of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is arranged in a continuous 2-4 mer sequence at least at one location in the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is located on the 5' end side of the gap region.
  • the 5'-CP nucleic acid is preferably located at the 5' end and 3' end of the gap region.
  • the base length of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably 15 to 20 mer.
  • the base length of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably 18 to 20 mer.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 3'-wing region comprises at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA;
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region preferably comprises at least one selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region is preferably comprised of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, LNA, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2' position in the 3' wing region is composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA
  • the modified nucleic acid having a substituent at the 2'-position in the 5'-wing region is preferably composed of a modified nucleic acid selected from the group consisting of 2'-MOE nucleic acid, AmNA, GuNA, and scpBNA.
  • At least one internucleoside bond of the single-stranded antisense oligonucleotide is a phosphorothioate bond.
  • At least one internucleoside bond in the single-stranded antisense oligonucleotide is a phosphodiester bond.
  • the ratio of phosphorothioate bonds in the internucleoside bonds constituting the single-stranded antisense oligonucleotide is 50% to 80%.
  • the ratio of phosphorothioate bonds in the internucleoside bonds constituting the single-stranded antisense oligonucleotide is 50% to 70%.
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the nucleoside adjacent to the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is preferably a phosphorothioate bond (except when the 5'-CP nucleic acid is located at the 3' end of the gap region).
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the adjacent nucleoside on the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is preferably a phosphorothioate bond (excluding cases where the 5'-CP nucleic acid is located at the 3' end of the gap region and where the adjacent nucleoside on the 3' side of the 5'-CP nucleic acid is a 5'-CP nucleic acid).
  • the bond between the 5'-CP nucleic acid and the adjacent nucleoside on the 5' side of the 5'-CP nucleic acid is preferably a phosphodiester bond.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 14-22 mer from bases located at positions 123, 124, 185, 186, 263, 264, 324, 325, 442, 443, or 447 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or It is preferable that the base sequence hybridizes under stringent conditions to the oligonucleotide having the above-mentioned target region.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 14-22mer from the bases located at positions 324, 325, or 448 to 453 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or It is preferable that the base sequence hybridizes under stringent conditions to the oligonucleotide having the above-mentioned target region.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide has a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 18-22mer from bases 448 to 453 counting from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the 3' wing region is a 3-5 mer, The 5' wing region is preferably a 3-5 mer.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably a base sequence that has 90% to 100% sequence identity with respect to a base sequence complementary to a target region consisting of 18 to 20 consecutive bases from the 450th to 451st or 453rd bases counting from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 5 to 47 and 49 to 56.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 6, 9, 12, 15-18, 22, 24, 27-29, 31-36, 38, 40-42, 47, and 49-54.
  • the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 41, 47, 50, and 53 to 55.
  • An antisense oligonucleotide complex according to one embodiment of the present invention comprises the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, and an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof,
  • the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains, nucleic acids, ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains.
  • a pharmaceutical product according to one aspect of the present invention contains the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof is preferably administered so as to be exposed to the central nervous system.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof is preferably administered to a subject susceptible to delayed central nervous system toxicity.
  • an agent for regulating the expression and/or function of the RPS25 gene contains the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • An inhibitor of dipeptide repeat production by RNA translation contains the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for repeat disease contains the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • a preventive agent for repeat disease contains the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • the repeat disease is preferably at least one selected from the group consisting of C9orf72 ALS, C9orf72 FTLD, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, dentatorubral-pallidoluysian atrophy, spinal-bulbar muscular atrophy, Friedreich ataxia, fragile X-associated tremor ataxia syndrome, and myotonic dystrophy.
  • a method for treating or preventing a repeat disease comprises administering to an individual the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • the repeat disease is preferably at least one selected from the group consisting of C9orf72 ALS, C9orf72 FTLD, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, dentatorubral-pallidoluysian atrophy, spinal-bulbar muscular atrophy, Friedreich ataxia, fragile X-associated tremor ataxia syndrome, and myotonic dystrophy.
  • One aspect of the present invention provides the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, for use in the treatment or prevention of C9orf72 ALS.
  • One aspect of the present invention provides the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, for use in producing a therapeutic or preventive agent for C9orf72 ALS.
  • Single-stranded antisense oligonucleotides containing modified nucleic acids such as 2'-O-methyl nucleic acid, 2'-MOE nucleic acid, AmNA, scpBNA, 5'-CP nucleic acid, and/or GuNA, and/or nucleic acid whose nucleic acid base is 5-methylcytosine, were synthesized on a 0.2 ⁇ mol scale using an automatic nucleic acid synthesizer (nS-8 type, manufactured by Gene Design Co., Ltd.). Chain length was extended using a standard phosphoramidite protocol.
  • modified nucleic acids such as 2'-O-methyl nucleic acid, 2'-MOE nucleic acid, AmNA, scpBNA, 5'-CP nucleic acid, and/or GuNA
  • nS-8 type automatic nucleic acid synthesizer
  • the solid support was deprotected by treating it with 0.5 M hydrazine hydrate in pyridine-acetic acid (1:1 v/v) at room temperature for 1 hour outside the synthesizer, and then the solid support was attached to the synthesizer and synthesis was resumed.
  • CPG resin was used as the solid support.
  • DDTT ((Dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione) or the like was used.
  • Single-stranded antisense oligonucleotides containing 2'-MOE nucleic acid, AmNA and/or scpBNA were obtained in which the hydroxyl group at the terminal 5' position was not protected with a DMTr (4,4'-dimethoxytrityl) group and the 3' position was supported on a solid phase.
  • the single-stranded antisense oligonucleotide was subsequently cut out from the solid phase support by alkali treatment and recovered in the form of a solution. Thereafter, the solvent was distilled off from the recovered solution to obtain a crude product.
  • the crude product obtained was purified by reverse phase HPLC to obtain a purified single-stranded antisense oligonucleotide. The purity and structure of each single-stranded antisense oligonucleotide obtained were confirmed by LC-MS (Waters).
  • Tables 2-1 to 2-4, 3-1, and 3-2 below list the single-stranded antisense oligonucleotides produced by the above-mentioned method.
  • the single-stranded antisense oligonucleotides shown in Tables 2-1 to 2-4, 3-1, and 3-2 are single-stranded antisense oligonucleotides against human RPS25 mRNA (SEQ ID NO: 1).
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 3 , R 4 , and R 5 each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms.
  • R 3 and R 5 in the GuNA shown by “Gx” above are both hydrogen atoms and R 4 is a methyl group, it is represented as “Gm”
  • R 3 is a hydrogen atom and R 4 and R 5 are both methyl groups
  • Gdm when R 3 and R 5 are hydrogen atoms and R 4 is a tert-butyl group, it is represented as "GtB”.
  • the expression evaluation of the RPS25 gene was performed by expression evaluation using human fetal kidney cells according to the single-stranded antisense oligonucleotide produced.
  • the expression evaluation of the RPS25 gene can also be performed using human iPS cell-derived nerve cells.
  • gene expression evaluation means evaluating the amount of mRNA by measuring the amount of complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription reaction. The specific procedures for each expression evaluation are described below.
  • Human embryonic kidney cells HEK293T (ATCC® CRL-3216TM) were cultured in a culture medium at 37° C. and 5% CO 2.
  • the culture medium for HEK293T cells had the following composition:
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • S1820 100-fold diluted penicillin-streptomycin mixed solution: Nacalai Tesque Cat#09367-34 (penicillin 10,000 units/ml, streptomycin 10,000 ⁇ g/ml, stabilizer included)
  • HEK293T cells (12,000 cells/well) were seeded in a 96-well plate and cultured overnight at 37°C and 5% CO2 . Then, each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration 0.5 nM, 5 nM, 15 nM, or 50 nM) diluted with phosphate-buffered saline (PBS) was transfected into the above-mentioned cells by lipofection. As a negative control, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide was not dissolved were used.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the transfected cells were cultured in growth medium at 37°C and 5% CO2 for 48 hours.
  • the growth medium was then removed, and the extracted total RNA was subjected to reverse transcription using the Taqman Fast Cells-to-CT Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat#4399003).
  • the complementary DNA (cDNA) obtained from this reverse transcription reaction was used to perform real-time PCR using pre-designed gene-specific probes (see below) in Taqman gene expression assays (Applied Biosystems) (40 cycles of 95°C for 3 seconds and 60°C for 30 seconds).
  • the expression ratio of human RPS25 mRNA in each single-stranded antisense oligonucleotide relative to human RPS25 mRNA, determined by the above-mentioned method, is shown in Tables 5-1 to 5-3 and Tables 6-1 to 6-2 (column "hRPS25 expression ratio"). At this time, the expression ratio of human RPS25 mRNA determined in the negative control group was set to 1.00. Those with an expression ratio of 0.80 or less were determined to be single-stranded antisense oligonucleotides capable of suppressing the expression of human RPS25 mRNA. In the tables, "-" indicates that no measurement was performed.
  • those with the above expression ratio of 0.80 or less can be determined to be single-stranded antisense oligonucleotides capable of regulating the function of the human RPS25 gene.
  • Mouse primary cultured nerve cells are cultured in a culture medium at 37° C. and 5% CO 2.
  • the culture medium for mouse primary cultured nerve cells has the following composition.
  • mouse primary cultured nerve cells (derived from mouse fetal cerebrum) are seeded in a 96-well plate with each cell (40,000 cells/well) and cultured for 5 days under conditions of 37 ° C and 5% CO 2. Then, each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, or 1 ⁇ M) diluted with phosphate-buffered saline (PBS) is added to the culture medium. As a negative control group, PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide is not dissolved is added to the culture medium. The cells are cultured in the culture medium for 48 hours under conditions of 37 ° C and 5% CO 2.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • RNA is subjected to reverse transcription reaction using Taqman Fast Cells-to-CT Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Cat # 4399003).
  • the complementary DNA (cDNA) obtained from this reverse transcription reaction is used to perform real-time PCR using predesigned gene-specific probes (see below) in Taqman gene expression assays (Applied Biosystems) (40 cycles of 95°C for 3 seconds and 60°C for 30 seconds).
  • Motor neuron cells are differentiated from human iPS cells and used for evaluation. Cell maintenance and differentiation induction are performed in the medium described below at 37°C and 5% CO2 .
  • Mitomycin treatment of feeder cells As feeder cells for seeding human iPS cells, mitomycin-treated SNL cells (Cell Bio Labs, Cat# CBA-316) are prepared. Mitomycin treatment of SNL cells is performed as follows. First, 0.1% gelatin (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Cat# 190-15805) is added to a 10 cm petri dish (Iwaki, Cat# 3020-100), and the petri dish is left to stand for 1 hour or more in an incubator under conditions of 37°C and 5% CO2 (hereinafter, this operation may be referred to as "gelatin treatment").
  • 0.1% gelatin (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Cat# 190-15805) is added to a 10 cm petri dish (Iwaki, Cat# 3020-100), and the petri dish is left to stand for 1 hour or more in an incubator under conditions of 37°C and 5% CO2 (hereinafter, this operation may be referred to as "gelatin treatment").
  • SNL cells are seeded using SNL cell medium so that 1 to 2 x 106 cells are seeded per petri dish.
  • the cells are diluted 8 to 16 times every 3 to 4 days and passaged to grow to the required number of cells.
  • 2-4 x 106 SNL cells are seeded per dish in a 15 cm dish (Iwaki, Cat#3030-150) that has been treated with 0.1% gelatin.
  • mitomycin C (Kyowa Kirin, YJ code 4231400D1031) diluted to 0.4 mg/mL with SNL cell medium is added to the dish to a final concentration of 6.2 ⁇ g/mL.
  • the dish is left to stand for 2 hours and 15 minutes in an incubator under conditions of 37°C and 5% CO2 . Thereafter, the medium is removed from the dish, and the SNL cells are washed once with PBS. 2.5% trypsin/EDTA (ThermoFisher Scientific, Cat#15090-046) was diluted with PBS (final concentration 0.25%) and added to the SNL cells and allowed to stand at room temperature for 1 minute.
  • the SNL cells were then collected in a tube and centrifuged, suspended in Cellbanker® (ZENOAQ Resources, Cat#CB011), and frozen for storage.
  • human iPS cells (201B7 strain, obtained from iPS Academia Japan, Inc., AJ-H1-01) suspended in iPS cell medium containing 1/1000 amount of Y-27632 (manufactured by Tocris, Cat#1254) are seeded in the petri dish. The medium is replaced every day from the day after seeding until differentiation induction begins.
  • ⁇ Induction of differentiation of human iPS cells into motor neurons The iPS cells are exposed to the Y-27632 for 1 hour or more by adding Y-27632 (final concentration 10 ⁇ M) to the cell culture solution of human iPS cells. After removing the culture supernatant and washing the cells with PBS, Cell dissociation solution (CTK solution) (REPROCELL, Cat# RCHETP002) is added and reacted at room temperature for 1 minute. After removing the CTK solution and washing the cells twice with PBS, 1 mL of iPS cell medium is added.
  • CTK solution Cell dissociation solution
  • the cells are detached with a cell scraper, and the cell clumps are dispersed through a cell strainer (Becton Dickinson, Cat# 352350) to obtain a cell suspension.
  • the obtained suspension is transferred to a 6-well plate (Corning, Cat# 3471).
  • Mixed medium A was replaced with a medium supplemented with LDN193189 (Stemgent, Cat#04-0074) (final concentration 0.3 ⁇ M), SB431542 (Tocris, Cat#1614) (final concentration 2 ⁇ M), CHIR-99021 (Stemgent, Cat#04-0004-10) (final concentration 3 ⁇ M), and Y-27632 (final concentration 10 ⁇ M), and the cells were cultured in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 (culture day 0).
  • the culture medium was removed with a pipette and replaced with fresh medium containing mixed medium A supplemented with LDN193189 (final concentration 0.3 ⁇ M), SB431542 (final concentration 2 ⁇ M), and CHIR-99021 (final concentration 3 ⁇ M).
  • the culture medium was removed with a pipette and replaced with fresh medium containing mixed medium A supplemented with LDN193189 (final concentration 0.3 ⁇ M), SB431542 (final concentration 2 ⁇ M), CHIR-99021 (final concentration 3 ⁇ M), Purmorphamine (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat#166-23991) (final concentration 0.5 ⁇ M), and Retinoic Acid (Sigma-Aldrich, Cat#R2625) (final concentration 0.1 ⁇ M).
  • the culture medium was removed with a pipette and replaced with a fresh medium containing mixed medium A supplemented with Purmorphamine (final concentration: 0.5 ⁇ M), Retinoic Acid (final concentration: 0.1 ⁇ M), Human BDNF (final concentration: 10 ng/mL), and Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich, Cat#A5960) (final concentration: 200 ⁇ M).
  • Purmorphamine final concentration: 0.5 ⁇ M
  • Retinoic Acid final concentration: 0.1 ⁇ M
  • Human BDNF final concentration: 10 ng/mL
  • Ascorbic Acid Sigma-Aldrich, Cat#A5960
  • mixed medium B was replaced with a fresh medium supplemented with Purmorphamine (final concentration 0.5 ⁇ M), Retinoic Acid (final concentration 0.1 ⁇ M), and Compound E (Calbiochem, Cat#565790) (final concentration 0.1 ⁇ M).
  • Purmorphamine final concentration 0.5 ⁇ M
  • Retinoic Acid final concentration 0.1 ⁇ M
  • Compound E Calbiochem, Cat#565790
  • the cell masses are washed with PBS, centrifuged, and the supernatant is removed.
  • Accutase Innovative Cell Technologies, Cat#AT104
  • Y27632 final concentration 10 ⁇ M
  • the human iPS cell-derived motor neurons frozen and stored in the previous section are thawed and suspended in a neuronal medium.
  • the supernatant is then removed by centrifugation, and the cells are resuspended in a neuronal medium containing 1/100 of the amount of Culture One Supplement (ThermoFisher Scientific, A3320201) and Compound E (final concentration 0.1 ⁇ M).
  • the cells are seeded on a coated 96-well plate at 30,000 cells/well and cultured for 28 days in an incubator at 37°C and 5% CO2 .
  • Half of the neuronal medium is replaced every 2 to 3 days. From the start of culture until the 7th day, a medium containing Culture One Supplement and Compound E is used as the neuronal medium.
  • each single-stranded antisense oligonucleotide diluted with PBS (final concentrations 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, and 1 ⁇ M) is added to the culture medium.
  • PBS final concentrations 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, and 1 ⁇ M
  • cells in which PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide is not dissolved is added to the culture medium are used. After culturing the cells in the culture medium at 37° C.
  • the medium containing the single-stranded antisense nucleotide is removed, and the cells are continuously cultured in a neuronal medium (half the medium is replaced once every 2 to 3 days). Thereafter, the culture medium is removed, and the extracted total RNA is subjected to a reverse transcription reaction using Taqman Fast Cells-to-CT Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat#4399003).
  • the complementary DNA (cDNA) obtained from this reverse transcription reaction is used to perform real-time PCR using a predesigned gene-specific probe (see below) in Taqman gene expression assays (Applied Biosystems) (95°C; 3 seconds, 60°C; 30 seconds, 40 cycles).
  • the expression evaluation of RPS25 protein is performed using human fetal kidney cells according to the single-stranded antisense oligonucleotide produced.
  • the protein expression level evaluation means evaluating the amount of protein translated from mRNA. The specific procedure for expression evaluation is described below.
  • Human embryonic kidney cells HEK293T (ATCC® CRL-3216TM) are cultured in a culture medium at 37° C. and 5% CO 2.
  • the culture medium for HEK293T cells has the following composition.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • S1820 100-fold diluted penicillin-streptomycin mixed solution: Nacalai Tesque Cat#09367-34 (penicillin 10,000 units/ml, streptomycin 10,000 ⁇ g/ml, stabilizer included)
  • HEK293T cells (500,000 cells/well) are seeded in a 6-well plate and cultured overnight at 37°C and 5% CO2 . Then, each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration 50 nM) diluted with phosphate-buffered saline (PBS) is transfected into the above cells using the lipofection method. As a negative control group, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide is not dissolved are used. The transfected cells are cultured in a growth medium at 37°C and 5% CO2 for 48 hours.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the growth medium is removed, washed with PBS, and the cells are collected with a cell scraper.
  • the collected solution is centrifuged at 2700 x g, 5 minutes, and 4°C to precipitate the cells.
  • 1 mL of RIPA Lysis and Extraction buffer (ThermoFisher Scientific, Cat # 89900) containing 1/100 of Protease Inhibitor (ThermoFisher Scientific, Cat # 1860932) is added, and the cells are disrupted by an ultrasonic disrupter. Then, the cells are centrifuged under conditions of 15000 ⁇ g, 10 minutes, and 4 ° C., and the supernatant is used as a sample.
  • the collected sample is subjected to protein quantification using Pierce (trademark) BCA Protein Assay kit (ThermoScientific, Cat # 23225). After adjusting the concentration of each sample to a constant level, PierceTM Lane Marker Reducing Sample Buffer (ThermoFisher Scientifier, Cat#39000) is added and heated at 95°C for 5 minutes. The prepared samples are layered so that the protein amount is 10 ⁇ g to 20 ⁇ g/lane, and electrophoresis is performed. Electrophoresis is performed for 30 minutes at a constant voltage of 200V using CriterionTM TDXTM Precast Gel 4-15% (BIO-RAD, Cat#5671085J10). The electrophoresis buffer used is Running Buffer Solution (10x) for SDS-PAGE (Nacalai Tesque, Cat#30329-61) diluted to 1x concentration.
  • a Trans-Blot Turbo Transfer Pack (manufactured by BIO-RAD, Cat#1704157) is used as the membrane, and the Standard protocol (30 minutes) of the BIO-RAD Trans-Blot Turbo Transfer System is used as the transfer device.
  • the membrane is washed with TBST.
  • the composition of TBST is Tris-buffered saline (pH 7.4) (manufactured by Nacalai Tesque, Cat#35438-81) diluted to 1x concentration containing 0.06% polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween-20) (manufactured by Nacalai Tesque, Cat#28353-85).
  • ⁇ RPS25 Antibody Anti-RPS25 antibody (Abcam, Cat# ab102940)
  • Solvent Canget signal Solution 1 (manufactured by Toyobo Co., Ltd., Cat#NKB-101)
  • ⁇ -actin Antibody ⁇ -Actin (13E5)
  • Rabbit mAb HRP conjugate
  • Solvent Blocking One
  • the secondary antibody and dilution solvent were as follows: ⁇ RPS25 Antibody: Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody (manufactured by Invitrogen, Cat#A24537) Solvent: Canget Signal Solution 2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd., Cat#NKB-101) After shaking with the secondary antibody, the plate is washed with TBST and then detected using ECL prime (Amersham, Cat#RPN2232). Amersham Imager 680 is used for detection and analysis.
  • the expression ratio of human RPS25 protein for each single-stranded antisense oligonucleotide determined by the above method is calculated. At this time, the expression ratio of human RPS25 protein determined in the negative control group is set to 1.00. When the protein expression ratio is below 0.80, it can be determined that the single-stranded antisense oligonucleotide is capable of regulating the function of the RPS25 gene.
  • HeLa-S3 cells which are human cervical cancer cells, were cultured in a growth medium at 37° C. and 5% CO 2.
  • the growth medium used had the following composition:
  • composition of growth medium used for cytotoxicity evaluation 10% fetal bovine serum (FBS): GIBCO, CAT# 10437028 1%
  • the above cells (1.0 x 10 4 cells/well) were seeded on a 96-well plate the day before the experiment. After culturing the seeded cells overnight at 37°C and 5% CO 2 , each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration: 1 to 200 nM) complexed with Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Cat#L3000-015) in Opti-Minimum Essential Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat#31985070) was added, and the above cells were cultured for 24 hours at 37°C and 5% CO 2 .
  • Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific, Cat#L3000-015
  • Opti-Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Cat#31985070
  • the solution After adding ultrapure water (10 ⁇ L), the solution is separated by centrifugation into an aqueous layer containing the single-stranded antisense oligonucleotide and a mineral oil layer, and the aqueous layer is analyzed by LC-MS (Waters), and the remaining single-stranded antisense oligonucleotide is calculated from the area intensity of the UV-chromatogram of the obtained single-stranded antisense oligonucleotide.
  • LC-MS Waters
  • Remaining oligonucleotide (%) indicates the remaining rate of undegraded single-stranded antisense oligonucleotide after 72 hours relative to the undegraded single-stranded antisense oligonucleotide at the time of analysis immediately after mixing with serum.
  • Those that have a remaining rate of 50% or more after 72 hours are determined to be stable single-stranded antisense oligonucleotides.
  • the expression evaluation of the RPS25 gene was performed by administering the gene intracerebroventricularly to mice and measuring the amount of mRNA in each area of the prefrontal cortex.
  • the gene expression evaluation means evaluating the amount of mRNA by measuring the amount of complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription reaction. The specific procedures for each expression evaluation are described below.
  • FVB mice (CLEA Japan) were anesthetized with isoflurane (Pfizer, Cat#114133403).
  • antisense oligonucleotides dissolved in artificial cerebrospinal fluid (Tocris Bioscience, Cat#3525/25mL) were administered to the anesthetized FVB mice at 10 ⁇ L/individual using a two-stage needle (Top, Medical Device Approval Number 15800BZZ01460000) attached to a 50 ⁇ L Hamilton syringe (Hamilton, Cat#705LT).
  • Mice in the negative control group were administered only artificial cerebrospinal fluid at 10 ⁇ L/individual.
  • RNA extraction from the stored tissue samples was performed using RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Cat# 74106).
  • Reverse transcription reaction from the extracted mRNA was performed using High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem, Cat# 4368814). For the reverse transcription reaction, 1 ⁇ g of mRNA was diluted to 20 ⁇ L and used.
  • cDNA complementary DNA obtained from this reverse transcription reaction
  • real-time PCR was performed using pre-designed gene-specific probes (see below) in Taqman expression assays (Applied Biosystems) (95°C; 3 seconds, 60°C; 30 seconds, 40 cycles).
  • the expression ratio of mouse RPS25 mRNA for each single-stranded antisense oligonucleotide determined by the above method is shown in Tables 8-1 to 8-2.
  • the expression ratio of mouse RPS25 RNA determined in the negative control group was set to 1.00. Since it is generally believed that when mRNA expression is suppressed, subsequent translation into protein is also suppressed, when the expression ratio is 0.80 or less, it can be determined that the single-stranded antisense oligonucleotide is capable of regulating the function of the mouse RPS25 gene.
  • the target regions to which the single-stranded antisense oligonucleotides listed in Tables 8-1 to 8-2 bind are regions whose sequences are conserved between the human RPS25 gene and the mouse RPS25 gene.
  • Ptosis eye closure, decreased locomotor activity (disappearance) (1 point) 3.
  • Staggering (1 point), ataxic gait (2 points) 4.
  • Abnormal posture/irregular breathing (1 point), lying on the side/prone (2 points), slow/abnormal breathing (4 points) 5.
  • the “score” column in "in vivo delayed neuroTox” was calculated based on the following evaluation criteria. Each score was the average value for each group.
  • ICR means Crl:CD1 mice
  • FVB means FVB/NJcl mice.
  • the evaluation items were 1) posture, 2) abnormal appearance, 3) stereotypic behavior, 4) reactivity to stimuli, 5) grip strength, 6) respiration, and 7) trembling/convulsions, and each was scored as 0 for normal, 1 for slightly abnormal, and 2 for extremely abnormal.
  • the total score obtained for each item was entered in the "score" column of "in vivo acute neuroTox” in Tables 9-1 and 9-2.
  • the evaluation items were 1) posture, 2) external abnormality, 3) stereotypic behavior, 4) reactivity to stimuli, 5) grip strength, 6) respiration, and 7) tremors/convulsions, and were scored as 0 for normal, 1 for slightly abnormal, and 2 for extremely abnormal.
  • the total score obtained for each item was entered in the "Clinical Sign Score” column in "in vivo delayed neuroTox” in Tables 9-1 and 9-2.
  • GGGenome high-speed base sequence search system
  • the sequence information of each single-stranded antisense oligonucleotide was entered into GGGenome, and the number of narrow off-target RNAs was counted from the number of hybridization mismatches for human spliced RNA and human pre-spliced RNA registered in the database. If there was a mismatch, deletion, or insertion during hybridization, the number of mismatches was calculated by summing the number of corresponding bases.
  • the base sequence of the target RNA from the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is "AGCTGTAC”
  • the RNA having the base sequence of " ATCTGTAC” has a mismatch (underlined base) of "1”
  • the number of mismatches is calculated as "1”.
  • the base sequence of the target RNA is "AGCTGTAC”
  • the RNA having the base sequence " ATCTG ⁇ G>TAC” has a mismatch (underlined base) of "1” and a deletion (base surrounded by angle brackets) of "1”
  • the number of mismatches is calculated as "2".
  • the base sequence of the target RNA is "AGCTGTAC”
  • the RNA having the base sequence " ATCTG *AC” has a mismatch (underlined base) of "1” and an insertion (a portion marked with *) of "1”
  • the number of mismatches is calculated as "2".
  • the number of mismatches during hybridization to RNA other than the target (off-target RNA) is counted, and the number of RNAs that perfectly match, the number of RNAs with a number of mismatches of 1 or less, and the number of RNAs with a number of mismatches of 2 or less are calculated for each single-stranded antisense oligonucleotide.
  • RNAs with a mismatch number of 0, 1 or less, or 2 or less The fewer the number of RNAs with a mismatch number of 0, 1 or less, or 2 or less, the lower the narrowly defined off-target toxicity risk; conversely, the greater the number of RNAs with a mismatch number of 0, 1 or less, or 2 or less, the higher the narrowly defined off-target toxicity risk.
  • Tables 10-1 to 10-4 When the base length is 18 or more, the number of RNAs that hybridize with 1 or less mismatches is 10 or less, which is considered to be a low narrowly defined off-target risk, and is a more preferred single-stranded antisense oligonucleotide.

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Abstract

ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３'末端に結合している３'ウイング領域と、上記ギャップ領域の５'末端に結合している５'ウイング領域と、を含み、上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５'－ＣＰ核酸を含み、上記３'ウイング領域及び上記５'ウイング領域は２'位に置換基を有する修飾核酸であり、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。

Description

ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又はその機能を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド
　本発明は、ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又はその機能を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、これを含むＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤に関する。
　Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ２５（ＲＰＳ２５）遺伝子は、リボソーム４０Ｓサブユニットの構成タンパク質の一つをコードする遺伝子である。上記ＲＰＳ２５遺伝子がコードする構成タンパク質（ＲＰＳ２５タンパク質）は、リボソーム４０Ｓサブユニット中における立体構造についても明らかになっている。（非特許文献１）
　ＲＰＳ２５タンパク質は、タンパク質合成プロセスの一部として、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能にするＲＮＡエレメントに結合し、翻訳を制御する。上記ＲＰＳ２５タンパク質が結合する上記ＲＮＡエレメントは、Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）と呼ばれている。ＩＲＥＳとは特にウイルスにおいて多く認められるキャップ非依存的な翻訳機構の一つである。（非特許文献２）
　Ｒｅｐｅａｔ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｎｏｎ－ＡＴＧ翻訳（ＲＡＮ翻訳）が２０１１年に脊髄小脳失調症８型の患者においてはじめて確認された（非特許文献３）。ＲＡＮ翻訳とは特定の配列が繰り返されることでＡＴＧ非依存的にタンパク質（ジペプチドリピート（ＤＰＲ）等）に翻訳される機構を意味する。その後Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子上に変異を有する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（以下、「Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ」と表記する場合がある。）、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィーなど複数のリピート病（特定の遺伝子配列が繰り返されることが原因で発症する疾患）においてもＲＡＮ翻訳の関与が報告された。ＲＡＮ翻訳によって産生したＤＰＲと病態との関連について研究がすすめられ、実際に、ＤＰＲの除去が病態の改善に効果を発揮することが報告されている。（非特許文献４、非特許文献５）
　２０１９年にＲＡＮ翻訳によるジペプチドリピートの産生に寄与が大きい分子としてＲＰＳ２５タンパク質が報告された。ＲＰＳ２５遺伝子をノックダウンすることでＲＡＮ翻訳依存的なＧＧＧＧＣＣ繰り返し配列に由来するＤＰＲ、又はＣＡＧ繰り返し配列に由来するＤＰＲの産生が抑制された。ＧＧＧＧＣＣ繰り返し配列は、筋萎縮性側索硬化症の家族性変異の一つであるＣ９ｏｒｆ７２遺伝子異常伸長変異として知られている。ＣＡＧ繰り返し配列は、ハンチンチン遺伝子及びＡＴＸＮ２遺伝子の異常伸長変異として知られている。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子変異を有する患者から樹立したｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｕｒｕｌｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ（ｉＰＳＣ）由来の運動神経細胞において、ＲＰＳ２５遺伝子をノックダウンすることでＧＧＧＧＣＣ繰り返し配列に由来するＤＰＲの産生が抑制されるとともに、運動神経細胞死も抑制することが明らかにされた。（非特許文献６）
　非特許文献６に開示されているＲＰＳ２５遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウイング部分が２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ核酸）で修飾され、かつヌクレオシド間がホスホロチオエート化されたギャップマーである。なお、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記ＲＰＳ２５遺伝子のセンス鎖の一部の塩基配列を含んでいる。
　本出願の発明者らは、鋭意研究を進めた結果としてＲＰＳ２５遺伝子に結合し、該ＲＰＳ２５遺伝子の発現を効果的に調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩を報告している。（特許文献７）
　一般にギャップマーと呼ばれるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースで構成されるギャップ領域とヌクレアーゼ耐性の向上や、標的ＲＮＡへの結合親和性、特異性などの改善を目的として開発された修飾核酸をウイング領域に配置した化合物であり、標的となるＲＮＡ配列にハイブリダイズして遺伝子発現を抑制することで作用を発現する。ギャップマーを臨床応用するために様々な修飾核酸が開発され、それらを応用した数多くの化合物（ギャップマー）が開発・上市されるようになった。ギャップマーを含む核酸医薬は、その性質上、全身曝露した場合に肝臓等の特定の臓器に集積することが知られており、研究開発過程において肝毒性等の核酸医薬に由来する毒性の課題が明らかとなり、その課題解決に向けた取り組み（メカニズム解明、回避方法の探索等）がなされている。一方で、眼、脳、皮膚など局所投与した場合における高曝露部位に対するギャップマーの潜在的な毒性は十分に明らかとされておらず、またその発現メカニズム解明や回避方法の開発等の課題が残されている。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性は、いわゆる「標的外ＲＮＡとのハイブリダイゼーションに起因する毒性（狭義のオフターゲット毒性）」と「ＲＮＡとのハイブリダイゼーションに起因しない毒性（広義のオフターゲット毒性）」にカテゴライズすることができ、これらの毒性を回避するために様々なアプローチが採用されている。広義のオフターゲット毒性では、先に記したように集積臓器である肝臓での毒性を指標にした検討が数多くされてきた。一方、近年は、髄腔内投与による中枢性疾患を対象疾患としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発も盛んに進められている中、中枢神経系に対する毒性（以下、「中枢毒性」と称することがある。）の課題が浮上している。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドと中枢毒性の関係では、中枢神経系への曝露後１時間以内に痙攣等の中枢神経系症状が発現することが知られており、神経細胞における細胞内遊離カルシウム濃度変化と中枢毒性の相関関係が開示されている。（特許文献８、非特許文献７）また、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート修飾による中枢毒性を評価した文献としては、ホスホロチオエート修飾を有するギャップマーにおいて、ウイング部分に配置されたホスホロチオエート結合のホスホジエステル結合への置換によって中枢毒性が低減されることが開示されている。（非特許文献８）
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢神経系への曝露直後に見られる中枢毒性（以下、「急性中枢毒性」と称することがある。又、本明細書では「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｃｕｔｅ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ」とも記載する。）に対しては、特許文献９において修飾核酸としてヌクレオシド糖部５’位炭素原子に置換基を有するときに低減する効果があることが示されている。なお、中枢毒性については急性中枢毒性以外に、投与後一定時間経過してから発現する中枢毒性（以下、「遅発性中枢毒性」と称することがある。又、本明細書では「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ」とも記載する。）が存在することも知られており、中枢神経系に曝露後翌日以降に、自発運動減少、歩行異常及び後肢の機能異常、振戦、後肢又は尾部の脱力、後肢の反射の消失、体重減少等が認められる。この遅発性中枢毒性に対して、発明者が知る限りにおいて、具体的な解決手段は報告されていない。
国際公開第２０１９／０８４０６８号 国際公開第２０１１／０５２４３６号 国際公開第２０１４／０４６２１２号 国際公開第２０１５／１２５７８３号 国際公開第２０２０／１５８９１０号 国際公開第９９／１４２２６号 国際公開第２０２２／０９７７２７号 国際公開第２０１６／１２７０００号 国際公開第２０２２／２３４８５５号
Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３１（６０１８）：７３０－７３６ Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．（２００９）２３（２３）：２７５３－２７６４ Ｐｒｏｃ.　Ｎａｔｌ.　Ａｃａｄ.　Ｓｃｉ.　ＵＳＡ（２０１１）１０８（１）：２６０－２６５ Ｎｅｕｒｏｎ　（２０１５）８８：６６７－６７７ Ｎｅｕｒｏｎ　（２０２０）１０５：６４５－６６２ Ｎａｔ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１９）２２（９）：１３８３－１３８８ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ（２０２３）３１：１８２－１９６ ＢｉｏＲｘｉｖ．ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０２．１４．４３１０９６（２０２１） Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１６９：１－６ Ｃｕｒｒ.　Ｏｐｉｎ.　Ｓｔｒｕｃｔ.　Ｂｉｏｌ.（２０１４）２４：１６５－１６９ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７ Ｎａｔｕｒｅ　（２０１５）５１８（７５３９）：４０９－４１２
　特許文献１には、ＲＰＳ２５遺伝子を阻害することでＤＰＲの産生が抑制されることが報告されているものの、アンチセンスなどの核酸を用いたアプローチによって同様の効果が認められるかは不明である。また、非特許文献５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＰＳ２５遺伝子の発現を抑制するが、その抑制作用は部分的である。我々は、特許文献７で効果的にＲＰＳ２５遺伝子の発現を効果的に調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩が報告しているが、医薬品として用いるために毒性（例えば、遅発性中枢毒性）が低減されているＲＰＳ２５遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの創生が求められている。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、遅発性中枢毒性が低減されているＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、これを含むＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進めた結果、ＲＰＳ２５遺伝子に結合し、該ＲＰＳ２５遺伝子の発現を効果的に調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩（以下、「本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。）において、ヌクレオシド糖部５’位にシクロプロパン環を有する修飾核酸をギャップ領域に配置することで遅発性中枢毒性を低減することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
　［１］本発明の第一の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。
　［２］本発明の第二の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である（ただし、参考例１～３１に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを除く。）。
　［３］本発明の第三の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である（ただし、参考例１～３１、設計例１～１８係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを除く。）。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾核酸がギャップ領域、５’ウイング領域及び３’ウイング領域に配置されている。上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸（５’－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）を含む。５’ウイング領域及び３’ウイング領域に配置されている２’位に置換基を有する修飾核酸は、非架橋型修飾核酸として、２’－ＭＯＥ核酸（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、２’－ＯＭｅ核酸（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）及びＭＣＥ（２’－Ｏ－（２－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｅｔｈｙｌ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、架橋型修飾核酸として、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ（２’，　４’－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ、以下「ＬＮＡ」と称することがある。）、ＡｍＮＡ（アミド架橋型修飾核酸、Ａｍｉｄｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＧｕＮＡ(グアニジン架橋型修飾核酸、Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、及び／又はｓｃｐＢＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）であり、これら修飾核酸の中から少なくとも１つを含むことが好ましい。このような構成とすることで、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遅発性中枢毒性を低減しつつ、ＲＰＳ２５　ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体に対して高い結合親和性が期待できる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いわゆるギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるため、後述するＲＮＡ分解酵素によるＲＰＳ２５遺伝子の分解反応において触媒として機能する。そのため、少量の投与であっても持続的に所定の効果が奏されると考えられる。
　［４］上記［１］～［３］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
　［５］上記［１］～［４］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列である。
　［６］上記［１］～［５］のいずれかにおいて、上記ギャップ領域の塩基数が、５～２０ｍｅｒであり、
　上記３’ウイング領域が、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域が、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸である。
　［７］上記［１］～［６］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されている。
　［８］上記［１］～［７］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域において２個以上配置されている。
　［９］上記［１］～［８］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域において２～５個配置されている。
　［１０］上記［１］～［７］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されている。
　［１１］上記［１０］において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して５分の１以上配置されている。
　［１２］上記［１］～［１１］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されている。
　［１３］上記［１］～［１２］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側に配置されている。
　［１４］上記［１］～［１３］のいずれかにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されている。
　［１５］上記［１］～［１４］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１５～２０ｍｅｒである。
　［１６］上記［１］～［１５］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１８～２０ｍｅｒである。
　［１７］上記［１］～［１６］のいずれかにおいて、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　［１８］上記［１］～［１７］のいずれかにおいて、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されている。
　［１９］上記［１］～［１８］のいずれかにおいて、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されている。
　［２０］上記［１］～［１９］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
　［２１］上記［１］～［２０］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である。
　［２２］上記［１］～［２１］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％である。
　［２３］上記［２２］において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～７０％である。
　［２４］上記［１］～［２３］のいずれかにおいて、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合である（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）。
　［２５］上記［１］～［２４］のいずれかにおいて、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合である（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）。
　［２６］上記［１］～［２５］のいずれかにおいて、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合である。
　［２７］上記［１］～［２６］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１２３番、１２４番、１８５番、１８６番、２６３番、２６４番、３２４番、３２５番、４４２番、４４３番、又は４４７番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
　［２８］上記［１］～［２７］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて３２４番、３２５番、又は４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
　［２９］上記［１］～［２８］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１８～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であり、
　上記３’ウイング領域は、３～５ｍｅｒであり、
　上記５’ウイング領域は、３～５ｍｅｒである。
　［３０］上記［１］～［２９］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４５０番～４５１番、若しくは４５３番に位置する塩基から連続した１８～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である。
　［３１］上記［１］～［３０］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号５～４７、及び４９～５６の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
　［３２］上記［１］～［３１］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、９、１２、１５～１８、２２、２４、２７～２９、３１～３６、３８、４０～４２、４７、及び４９～５４の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
　［３３］上記［１］～［３２］のいずれかにおいて、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号４１、４７、５０、及び５３～５５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である。
　［３４］本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
　［３５］本発明に係る医薬品は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［３６］上記［３５］において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩が、中枢神経系に曝露されるように投与される。
　［３７］上記［３５］又は［３６］において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩が、遅発性中枢毒性に敏感な対象に投与される。
　［３８］本発明に係るＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［３９］本発明のＲＡＮ翻訳によるジペプチドリピートの産生阻害剤は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［４０］本発明に係るリピート病に対する治療剤は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［４１］本発明に係るリピート病に対する予防剤は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　［４２］上記［４０］の治療剤及び上記［４１］の予防剤において、上記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つである。
　［４３］本発明に係るリピート病の治療方法又は予防方法は、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む。
　［４４］上記［４３］のリピート病の治療方法又は予防方法において、上記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つである。
　［４５］本発明は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳの治療又は予防に使用するための、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を提供する。
　［４６］本発明は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳの治療剤又は予防剤を製造するために使用する、上記［１］～［３３］のいずれかの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記［３４］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を提供する。
　本発明によれば、遅発性中枢毒性が低減されている、ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、これを含むＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤を提供することが可能になる。
図１は、本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構成の一例を示す模式図である。 図２は、本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたときの、ＲＰＳ２５遺伝子の発現が抑制されるメカニズムを説明する模式図である。
　以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記すことがある。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ｉ～Ｊ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＩ以上Ｊ以下）を意味する。Ｉにおいて単位の記載がなく、Ｊにおいてのみ単位が記載されている場合、Ｉの単位とＪの単位とは同じである。
　≪ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド≫
　本実施形態の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。以下詳細に説明する。
　＜用語の定義等＞
　まず、本明細書において用いられる用語の定義等について以下に説明する。
　（ＲＰＳ２５遺伝子）
　本実施形態において「ＲＰＳ２５遺伝子」は、Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１６９：１－６（非特許文献９）、Ｃｕｒｒ.　Ｏｐｉｎ.　Ｓｔｒｕｃｔ.　Ｂｉｏｌ.（２０１４）２４：１６５－１６９（非特許文献１０）により定義することができる。「ＲＰＳ２５」の同義語としては、４０Ｓ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ２５、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ２５、Ｓｍａｌｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅＳ２５、Ｒｐｓ２５、２８１０００９Ｄ２１Ｒｉｋ、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓ２５、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ２５、Ｓ２５、ｅＳ２５、及びリボソームタンパク質等が挙げられる。
　（一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）
　本実施形態において「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（以下、「ＡＳＯ」と称することがある。）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡ(ノンコ－ディングＲＮＡ)（以下、これら三者をまとめて「標的ＲＮＡ」と称することがある。）に対して相補的なオリゴヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの類似体から構成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することにより、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列を有するもの、当該相補的な塩基配列において１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有するもの、及びゆらぎ塩基対を形成する塩基をその塩基配列中に含むものが含まれる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する「糖部が修飾糖である修飾核酸」（糖修飾されている修飾ヌクレオチド）以外の、当該分野で公知の修飾ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。当該分野で公知の修飾ヌクレオチドとしては、糖修飾されている修飾ヌクレオチドに加えて、例えば、後述するリン酸基修飾されている修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾されている修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
　なお、本実施形態におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その両末端の構造は特に制限されず、例えば、－ＯＨであってもよいし、－ＯＲ（ただし、Ｒはアルキル鎖、リン酸エステル体、又は後述する付加物質を示す。）であってもよい。
　また、本実施形態における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であってもよいし、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態をとってもよい。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを、「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。
　（オリゴヌクレオチド）
　本実施形態において「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオシドが、リン酸ジエステル結合又はその他の結合で２～３０個連結されたヌクレオシドのポリマーを意味する。上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造式で示すように核酸塩基部、リン酸部、及び糖部から構成されていると把握することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記オリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドと非天然型のオリゴヌクレオチドとに大別される。「天然のオリゴヌクレオチド」とは天然に存在しているヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然のオリゴヌクレオチド」とは、後述する修飾ヌクレオチドを構成単位として少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然型のオリゴヌクレオチド」としては、好ましくは、糖部が修飾された修飾糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で２つ置き換えられたホスホロジチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がトリエステル化されたエステル誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド化されたホスホアミド誘導体；リン酸ジエステル結合がボロン酸エステル化されたボラノホスフェート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、メトキシプロピルホスホネート等）誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド結合に置換されたアミド誘導体：核酸塩基が修飾された修飾塩基誘導体が挙げられる。更に好ましくは、上記非天然のオリゴヌクレオチドは、糖部が修飾された架橋型修飾糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル誘導体；及び、糖部が後述する修飾糖（例えば、架橋型糖）で修飾され、かつリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられているか、又はリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート化されている誘導体等が挙げられる。
　（ヌクレオシド）
　本実施形態において「ヌクレオシド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とが結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」という場合がある。特に糖部分が修飾された修飾ヌクレオシドを「修飾糖ヌクレオシド」という場合がある。
　（ヌクレオチド）
　本実施形態において「ヌクレオチド」とは、上記ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオチドを「天然ヌクレオチド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオチドを「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」という場合がある。「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」としては、上記修飾ヌクレオシドの糖部にリン酸基が結合した化合物、上記修飾ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物、及び、天然ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物等が挙げられる。
　（糖修飾、修飾糖）
　本実施形態において「糖修飾」とは、上記ヌクレオチドの糖部が修飾されていることを意味する。修飾された糖部を特に「修飾糖」という場合がある。糖修飾が施されている修飾ヌクレオチドは修飾核酸として利用可能であり、例えば、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、２’－Ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸など）、２’－Ｆ、５’－メチル－ＤＮＡ、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　Ｅｔｈｙｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、５’－ＣＰ核酸（５’－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
　ＬＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｌ）」、「５（Ｌ）」、「Ｇ（Ｌ）」、「Ｔ（Ｌ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＡｍＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｙ）」、「５（Ｙ）」、「Ｇ（Ｙ）」、「Ｔ（Ｙ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＧｕＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｇｘ）」、「５（Ｇｘ）」、「Ｇ（Ｇｘ）」、「Ｔ（Ｇｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ｓｃｐＢＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｓ）」、「５（Ｓ）」、「Ｇ（Ｓ）」、「Ｔ（Ｓ）」で示される構造を含むものが挙げられる。２’－ＭＯＥ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（ｍ）」、「５（ｍ）」、「Ｇ（ｍ）」、「Ｔ（ｍ）」で示される構造を含むものが挙げられる。５’－ＣＰ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（５’－ＣＰ）」、「５（５’－ＣＰ）」、「Ｇ（５’－ＣＰ）」、「Ｔ（５’－ＣＰ）」で示される構造を含むものが挙げられる。２’－ＯＭｅ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｍ）」、「５（Ｍ）」、「Ｇ（Ｍ）」、「Ｕ（Ｍ）」、「Ｔ（Ｍ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＭＣＥ核酸としては、例えば、後述する「Ａ（Ｍｘ）」、「５（Ｍｘ）」、「Ｇ（Ｍｘ）」、「Ｕ（Ｍｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。
　（２’位に置換基を有する修飾核酸）
　本実施形態において「２’位に置換基を有する修飾核酸」とは、上記ヌクレオチドの糖部２’位に置換基を有する修飾核酸を意味する。例えば、非架橋型修飾核酸として、２’－Ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸、ＭＣＥ核酸など）、２’－Ｆ等が挙げられ、架橋型修飾核酸として、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、ＥＮＡ、Ｓ－ｃＥｔ等が挙げられる。
　（糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾）
　上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための修飾核酸として利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、後述するリン酸基修飾、核酸塩基修飾が知られている。このようなヌクレオチドの修飾は、例えば、Ｗ．Ｂｒａｄ　Ｗａｎ　ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７．（非特許文献１１）等に記載されているヌクレオチドの修飾が挙げられる。これらのヌクレオチドの修飾は、上記文献で引用されている文献において述べられている当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
　（リン酸基）
　本実施形態において「リン酸基」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部の結合様式が天然に存在するホスホジエステル結合（後述する記号「－」で示される結合）であるものを意味する。
　（リン酸基修飾、修飾リン酸基）
　本実施形態において「リン酸基修飾」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部が修飾されていることを意味する。修飾されたリン酸部を特に「修飾リン酸基」という場合がある。上記修飾リン酸基を含む結合様式としては、例えば、ホスホロチオエート結合（後述する記号「∧」で示される結合）、ホスホロジチオエート結合、ホスホアミダート結合（後述する記号「＝」で示される結合）、又はボラノホスフェート結合（後述する記号「×」で示される結合）、アルキルホスホネート等が挙げられる。
　（核酸塩基修飾、修飾核酸塩基）
　本実施形態において「核酸塩基修飾」とは、上記ヌクレオチドの核酸塩基部が修飾されていることを意味する。修飾された核酸塩基部を特に「修飾核酸塩基」という場合がある。修飾核酸塩基としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
　（ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体）
　上記ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(ｐＮＡ)、モルホリノ核酸等が挙げられる。
　（ｎｃＲＮＡ）
　本実施形態において「ｎｃＲＮＡ」とは、タンパク質の翻訳には関わらないＲＮＡの総称を意味する。上記ｎｃＲＮＡとしては、例えば、リボソ－ムＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｎａｔｕｒａｌ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＮＡＴ）等が挙げられる。
　（オリゴヌクレオチドの核酸塩基部）
　上記オリゴヌクレオチドの核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、ウラシリル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、及び２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基等が挙げられる。好ましくは、上記核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、及びウラシリル基等が挙げられる。当該核酸塩基のうち、ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）は、互換性がある。ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）のどちらも、相補鎖のアデニン（Ａ）との塩基対を形成することができる。また、シトシン（Ｃ）と５－メチルシトシン（５（ｘ））とは互換性があり、どちらも相補鎖のグアニン（Ｇ）との塩基対を形成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部においても同様である。
　（標的ＲＮＡ）
　本実施形態において「標的ＲＮＡ」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合することによって、その機能が抑制されるＲＮＡを意味する。言い換えると本実施形態において標的ＲＮＡとはＲＰＳ２５のｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体を意味する。上記標的ＲＮＡとしては、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するヒトＲＰＳ２５のｍＲＮＡ（以下、「ｈＲＰＳ２５」と称することがある。）、配列番号２に記載の塩基配列を有するサルＲＰＳ２５のｍＲＮＡ（以下、「ｃＲＰＳ２５」と称することがある。）、配列番号３に記載の塩基配列を有するマウスＲＰＳ２５のｍＲＮＡ（以下、「ｍＲＰＳ２５」と称することがある。）、配列番号４に記載の塩基配列を有するラットＲＰＳ２５のｍＲＮＡ（「ｒＲＰＳ２５」と称することがある。）等が挙げられる。
　（標的ＲＮＡとの結合）
　本実施形態において「標的ＲＮＡとの結合」とは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的ＲＮＡとの相補性によって、当該標的ＲＮＡの核酸塩基と共に二本鎖核酸を形成することを意味する。上記二本鎖核酸は、上記標的ＲＮＡの少なくとも一部において形成されていればよい。なお、上記標的ＲＮＡとの結合の強さは、例えば、熱安定性の指標により測定することができる。上記熱安定性の指標としては、例えば、上記二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ値）等が挙げられる。上記Ｔｍ値としては、好ましくは４０～９０°Ｃであり、より好ましくは５０～７０°Ｃである。
　（標的領域）
　上記標的領域とは、ＲＰＳ２５のｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡ前駆体における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと結合する領域を意味する。上記標的領域には、示された塩基配列からなる標的領域、及びＲＰＳ２５のｍＲＮＡ前駆体上の領域を含む。
（ｍＲＮＡ前駆体）
　上記ｍＲＮＡ前駆体とは、ＤＮＡから転写されたＲＮＡの一次転写物を意味する。すなわち、上記ｍＲＮＡ前駆体は、エクソン領域、イントロン領域及び非翻訳領域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）を含むＲＮＡである。上記ｍＲＮＡ前駆体は、転写後スプライシングが行われる前のＲＮＡと把握することもできる。上記ｍＲＮＡ前駆体がスプライシングされるとｍＲＮＡとなる。
　（標的領域との結合）
　上記標的領域との結合とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的領域と二本鎖を形成することを意味する。ただし、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも標的領域全体と二本鎖を形成する必要はなく、標的領域の一部の領域と二本鎖形成するものであればよい。すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的領域と完全な相補性を有しているものであることが好ましいが、ＲＰＳ２５の標的ＲＮＡと結合する限りにおいて、標的領域の少なくとも一部の領域と相補的であればよい。
　（標的領域の一部）
　上記標的領域の一部とは、標的領域のうち１０～１５ヌクレオチド塩基長の領域を意味する。
（標的領域の少なくとも一部と相補的）
　上記標的領域の少なくとも一部と相補的とは、標的ＲＮＡ上の標的領域の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であることを意味する。ここにおいて、少なくとも一部の領域に対応するｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体上の領域の塩基と相補的であることも含む。
　＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列＞
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１２３番、１２４番、１８５番、１８６番、２６３番、２６４番、３２４番、３２５番、４４２番、４４３番、又は４４７番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　（Ｂ）上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　（Ｃ）上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であることが好ましい。
　また、本実施形態において、配列表に示されている各塩基配列は核酸塩基部の配列情報のみを示すために用いるものとする。上記核酸塩基部に加えて糖部及びリン酸部を含めたオリゴヌクレオチドの構造情報は、後述する表２－１～表２－４、表３－１、表３－２及び表４に示される記載形式で示すものとする。
　本実施形態において「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方又は両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。）における、オーバーラップする全塩基配列に対する同一塩基の割合（％）を意味する。塩基配列の「配列同一性」は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用いることができる。
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列における上述の所定の標的領域に対して相補的な塩基配列と９５％以上１００％以下の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上１００％以下の配列同一性を有することがより好ましく、１００％の配列同一性を有することが更に好ましい。
　本実施形態において、「１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」としては、例えば、欠失、置換、挿入又は付加によって、欠失、置換、挿入又は付加される前の塩基配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「１又は数個の塩基」の具体的な数としては、上述の欠失、置換、挿入又は付加が、それぞれ独立して、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所に存在してもよいし、複数が組み合わさっておこっていてもよい。
　本実施形態において「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０°Ｃ以上の温度で洗浄する条件をいう。更に、よりストリンジェントな条件、例えば、４５°Ｃ又は６０°Ｃにて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０°Ｃ又は６５°Ｃ以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。
　本実施形態の一側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１２３番、１２４番、１８５番、１８６番、２６３番、２６４番、３２４番、３２５番、４４２番、４４３番、又は４４７番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の他の側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて３２４番、３２５番、又は４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の他の側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１８～２２ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の他の側面において、上記標的領域は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４５０番～４５１番、若しくは４５３番に位置する塩基から連続した１８～２０ｍｅｒで構成された塩基配列であることが好ましい。
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＰＳ２５の標的領域と結合することができる。本明細書において、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの「ＲＰＳ２５の標的領域との結合」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＰＳ２５のｍＲＮＡへの直接結合及びＲＰＳ２５のｍＲＮＡ前駆体への直接結合を包含する。
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、ＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、表１に記載されているいずれかの塩基配列を持ち、当該一本鎖オリゴヌクレオチドは、表１に記載されているヒトＲＰＳ２５のｍＲＮＡにおける標的領域と相補的である。なお、当該一本鎖オリゴヌクレオチドは、表１に記載されている塩基配列を含んでいれば３’側及び／又は５’側にそれぞれ１～５塩基延びていてもよい。上記標的領域は、ヒトＲＰＳ２５のｍＲＮＡにおいて、特に、ヒトＲＰＳ２５遺伝子の発現調節に関連する領域（例えば、アンチセンスヌクレオチドが結合しやすいｍＲＮＡの二次構造をもつ領域）と言える。例えば、表１において５’末端位置が「４５１」であり３’末端位置が「４６５」である場合、配列番号１に記載の塩基配列における５’末端から数えて４５１番目から４６５番目までの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列名「ｈ４５１－４６５」）が標的とするヒトＲＰＳ２５のｍＲＮＡにおける標的領域となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表１において、記号「Ａ’」、記号「Ｃ’」、記号「Ｇ’」及び記号「Ｔ’」は、それぞれ天然ヌクレオシド（後述する、ａ、Ａ、ｃ、Ｃ、ｇ、Ｇ、ｔ、及びＵ）又は修飾ヌクレオシド（修飾糖ヌクレオシドを含む）から選択される。なお、修飾糖ヌクレオシドとしては、記号「Ａ’」は、後述するＡ（Ｍ）、Ａ（ｍ）、Ａ（Ｌ）、Ａ（Ｙ）、Ａ（Ｇｘ）、Ａ（５’－ＣＰ）、Ａ(Ｍｘ)又はＡ（Ｓ）から選択され、記号「Ｃ’」は、後述する５（ｘ）、Ｃ（Ｍ）、５（ｍ）、５（Ｌ）、５（Ｙ）、５（Ｇｘ）、５（５’－ＣＰ）、Ｃ（Ｍｘ）又は５（Ｓ）から選択され、記号「Ｇ’」は、後述するＧ（Ｍ）、Ｇ（ｍ）、Ｇ（Ｌ）、Ｇ（Ｙ）、Ｇ（Ｇｘ）、Ｇ（５’－ＣＰ）、Ｇ（Ｍｘ）又はＧ（Ｓ）から選択され、記号「Ｔ’」は、後述するＵ（Ｍ）、Ｔ（ｍ）、Ｔ（Ｌ）、Ｔ（Ｙ）、Ｔ（Ｇｘ）、Ｔ（５’－ＣＰ）、Ｕ（Ｍｘ）又はＴ（Ｓ）から選択される。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号５～４７、及び４９～５６の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、９、１２、１５～１８、２２、２４、２７～２９、３１～３６、３８、４０～４２、４７、及び４９～５４からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、９、１２、１５～１８、２２、２４、２７～２９、３１～３２、３４～３６、３８、４０～４２、４７、及び４９～５４の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが更に好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号４１、４７、５０、及び５３～５５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが更よりに好ましい。
　＜薬理学上許容される塩＞
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬理学上許容される塩の形態であってもよい。ここで、「薬理学上許容される塩」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的に許容される塩、すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、かつ望まれない毒物学的効果を保持しない塩を意味する。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
　＜製薬学的に許容される塩＞
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬学的に許容される塩の形態であってもよい。ここで「製薬学的に許容される塩」とは、上述の薬理学上許容される塩であってかつ酸付加塩又は塩基付加塩であるものを意味する。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びに、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸塩及びカンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩及びアルミニウム塩等の無機塩基塩、並びに、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びＮ，Ｎ－ジベンジルエチルアミン等の有機塩基塩等が挙げられる。更には、アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸との塩（アミノ酸塩）が挙げられる。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
　＜一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造＞
　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含む（例えば、図１参照）。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であることが好ましい。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態（二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）をとってもよい。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いわゆるギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のメカニズムで、標的ＲＮＡの機能を阻害する。まず、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの標的領域に結合する（図２の上部から中央部）。次に、ＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅＨが、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡの複合体を認識し結合する（図２の中央部）。その後、ＲＮａｓｅＨによる酵素分解反応により標的ＲＮＡが切断、分解される。このとき、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨによる酵素分解の影響を受けない（図２の下部）。そのため、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の標的ＲＮＡに結合して当該ＲＮＡを切断、分解することが可能になる。このようにギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述のＲＮａｓｅＨによる酵素分解反応において触媒として機能するため、少量の投与であっても持続的に所定の効果を奏すと考えられる。
　また、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本実施形態においては、上述のようなメカニズムでＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節する（ＲＰＳ２５のｍＲＮＡ前駆体の成熟を調節することを介して作用する場合も含む。）ために好適に用いることが可能である。更に本実施形態によれば、臨床応用時に通常用いられる投与経路である髄腔内投与においても、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節する効果が発揮され得る。ここで、「ＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節する」とは、ＲＰＳ２５遺伝子の発現を抑制することを少なくとも意味し、結果として、ＲＰＳ２５タンパク質の機能（ＲＡＮ翻訳等）を抑制することを少なくとも意味する。
　（ギャップ領域）
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含む。上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であることが好ましい。言い換えると、上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部が修飾されていてもよいデオキシリボースを含む核酸であると把握することもできる。また、上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はこれらの両方から構成されていると把握することもできる。上記ギャップ領域は、糖部がデオキシリボース又は修飾されたデオキシリボースであることによって、ＲＮａｓｅＨが認識可能な複合体を、標的ＲＮＡであるＲＰＳ２５のｍＲＮＡ等と共に形成することが可能になる。ここで、修飾されたデオキシリボースを含む核酸としては、例えば、５’－ＣＰ核酸が挙げられる。
　上記ギャップ領域の塩基数は、５～２０ｍｅｒであることが好ましく、６～１７ｍｅｒであることがより好ましく、７～１３ｍｅｒであることが更に好ましく、９～１３ｍｅｒが更により好ましい。
　糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドとしては、例えば、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシ－５－メチルシチジン一リン酸（５－メチルデオキシシチジンとも言う。）等が挙げられる。言い換えると、上記ギャップ領域を構成する天然ヌクレオチドとしては、後述する記号ａ、ｇ、t及びｃそれぞれに対応する構造式を含むものが挙げられる。
　糖部がデオキシリボース又は修飾されたデオキシリボースである非天然ヌクレオチドとしては、例えば、５’－ＣＰ核酸、２－チオ－チミジン一リン酸、２－アミノアデノシン一リン酸、７－デアザグアノシン一リン酸等が挙げられる。
　なお、上記ギャップ領域は、本発明の効果が奏する限りにおいて、糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドの一部の糖部が修飾糖であってもよい。すなわち、本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域は、一部の糖部がデオキシリボースであり、且つ他の一部の糖部が修飾糖（例えば、修飾されたデオキシリボース）である核酸であってもよい。
　本実施形態において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されていることが好ましい。
　本実施形態において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域において２個以上配置されていることが好ましく、２～５個配置されていることがより好ましい。ここで、「２個以上配置されている」とは、対象の５’－ＣＰ核酸が連続して２個以上配置されている態様と、上記キャップ領域において分散して２個以上配置されている態様が含まれる概念である。
　本実施形態において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていることが好ましい。
　本実施形態において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側に配置されていることが好ましい。また、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されていることが好ましい。ここで、「ギャップ領域における５’末端側に配置されている」とは、ギャップ領域の中心よりも５’末端側に配置されていることを意味する。「ギャップ領域における３’末端側に配置されている」とは、ギャップ領域の中心よりも３’末端側に配置されていることを意味する。
　本実施形態において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されていることが好ましく、５分の１以上配置されていることがより好ましい。このとき、上限値は、例えば、２分の１以下であってもよい。
　本実施形態において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）。ここで、「５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている」とは、「当該５’－ＣＰ核酸が３’ウイング領域のヌクレオシドと結合している」と把握することもできる。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）。
　本実施形態において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合であることが好ましい。
　（３’ウイング領域）
　上記３’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾核酸である。言い換えると、上記３’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾ヌクレオチドから構成されていると把握することもできる。上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、非架橋型の２’位修飾核酸として、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸及びＭＣＥ核酸、架橋型修飾核酸として、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。上記３’ウイング領域及び後述する上記５’ウイング領域が、上記所定の修飾ヌクレオチドから構成されることによって、標的ＲＮＡに対して高い結合親和性が期待でき、ひいては標的ＲＮＡの機能を効果的に抑制できると考えられる。本実施形態の一側面において、上記３’ウイング領域は、糖部が修飾糖である修飾核酸であってもよい。糖部が修飾糖である修飾核酸としては、上記（糖修飾、修飾糖）で挙げられたものが例示される。本実施形態の一側面において、３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸のみで構成されていてもよい。なお、上記３’ウイング領域における修飾核酸は、１つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中に複数種類含まれていてもよい。
　本実施形態において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましく、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。本実施形態の他の側面において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることが好ましい。
　上記３’ウイング領域の塩基数は、３～５ｍｅｒであることが好ましく、３～４ｍｅｒであることがより好ましい。
　（５’ウイング領域）
　上記５’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾核酸である。言い換えると、上記５’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾ヌクレオチドから構成されていると把握することもできる。上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、非架橋型の２’位修飾核酸として、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸及びＭＣＥ核酸、架橋型修飾核酸として、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。本実施形態の一側面において、上記５’ウイング領域は、糖部が修飾糖である修飾核酸であってもよい。糖部が修飾糖である修飾核酸としては、上記（糖修飾、修飾糖）で挙げられたものが例示される。本実施形態の一側面において、５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸のみで構成されていてもよい。なお、上記５’ウイング領域における修飾核酸は、１つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中に複数種類含まれていてもよい。本実施形態の他の側面において、３’ウイング領域及び５’ウイング領域における上記修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸のみで構成されていてもよく、また、架橋型修飾核酸のみで構成されていてもよい。
　本実施形態において、上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましく、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。本実施形態の他の側面において、上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。
　また、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。
　本実施形態の他の側面において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。
　上記５’ウイング領域の塩基数は、３～５ｍｅｒであることが好ましく、３～４ｍｅｒであることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域の塩基数は５～２０ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域の塩基数は７～１３ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであることがより好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域の塩基数は９～１３ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域の塩基数は３～４ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域の塩基数は３～４ｍｅｒであることが更に好ましい。
　（ギャップマー型の構造の表記方法）
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマー型である。ギャップマー型の構造を表記するにあたっては、「Ｘ－Ｙ－Ｚ」の表記方法を用いることがある。上述の表記方法において、「Ｘ」は５’ウイング領域の塩基数を示し、「Ｙ」はギャップ領域の塩基数を示し、「Ｚ」は３’ウイング領域の塩基数を示す。
　「Ｘ－Ｙ－Ｚ」としては、２－８－４、２－８－３、２－８－５、２－９－２、２－９－３、２－９－４、２－９－５、２－１０－３、２－１０－４、２－１０－５、２－１１－３、２－１１－４、２－１１－５、２－１２－３、２－１２－４、２－１２－５、３－８－２、３－８－３、３－８－４、３－８－５、３－９－３、３－９－４、３－９－５、３－１０－３、３－１０－４、３－１０－５、３－１１－３、３－１１－４、３－１１－５、３－１２－３、３－１２－４、３－１２－５、３－１３－３、３－１３－４、４－８－２、４－８－３、４－８－４、４－８－５、４－９－３、４－９－４、４－９－５、４－１０－３、４－１０－４、４－１０－５、４－１１－２、４－１１－３、４－１１－４、４－１１－５、４－１２－４、４－１３－３、５－８－２、５－８－３、５－８－４、５－８－５、５－９－２、５－９－３、５－９－４、５－９－５、５－１０－２、５－１０－３、５－１０－４、５－１０－５、５－１１－２、５－１１－３、５－１１－４、５－１１－５等が挙げられる。例えば、「２－８－４」と表記した場合、５’ウイング領域は２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ギャップ領域は８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、３’ウイング領域は４ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであることを意味する。
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、好ましくは１５～２０ｍｅｒであり、より好ましくは１８～２０ｍｅｒである。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１５～２０ｍｅｒ、１８～２０ｍｅｒである場合、特に、ＲＰＳ２５のｍＲＮＡへの結合が強く、ＲＰＳ２５遺伝子の発現の調節をより効果的に行うことができる。
　本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合されていることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。本実施形態の他の側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％であることが好ましく、５０％～７０％であることがより好ましい。
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、５～２０ｍｅｒからなるギャップ領域、３～５ｍｅｒからなる５’ウイング領域、及び３～５ｍｅｒからなる３’ウイング領域を有するギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該ギャップ領域は、該５’ウイング領域と該３’ウイング領域の間に位置付けられる。該ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含む。そして、該５’ウイング領域及び該３’ウイング領域には、それぞれ少なくとも１つの２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、又はｓｃｐＢＮＡが含まれることが好ましい。該５’ウイング領域及び該３’ウイング領域には、２’－Ｏ－アルキル化若しくは２’－Ｆ化されたヌクレオチドが含まれていてもよい。２’－Ｏ－アルキル化ヌクレオチドとしては、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－アルキル化（例えば、２’－Ｏ－メチル化等）ヌクレオチドを用いてもよい。また、上記ギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第二鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによって二本鎖を形成していてもよい。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する表２－１～表２－４における、実施例２、実施例５、実施例８、実施例１１～実施例１４、実施例１８、実施例２０、実施例２３～実施例２５、実施例２７～実施例３２、実施例３４、実施例３６～実施例３８、実施例４３、実施例４５～実施例５０からなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。また、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する表２－１～表２－４における、実施例３７、実施例４３、実施例４６、及び実施例４９～５１からなる群より選ばれる少なくとも１つであることがより好ましい。
　＜二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド＞
　本実施形態に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶液中で解離して、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとに分離することができる。分離した上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述した標的ＲＮＡに結合することができる。なお、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとの関係において、「第一鎖オリゴヌクレオチド」と把握することもできる。なお、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドのうち上記第一鎖オリゴヌクレオチドが上述した標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖を有しているが、上記第一鎖オリゴヌクレオチドと上記第二鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを便宜上「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ぶことにする。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法による固相合成により製造することができる。例えば、市販の核酸自動合成機を使用して固相担体上で所定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをまず合成する。次に、塩基性物質等を用いて固相担体から合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを切出し、脱保護を行ない、粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。その後、得られた粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ等を用いて精製する。上述の製造法に限らず、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法に準じて、核酸の塩基配列、修飾部位等を適宜変更することにより製造できる。また、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡについては、それぞれ国際公開第２０１１／０５２４３６号（特許文献２）、国際公開第２０１４／０４６２１２号（特許文献３）、及び国際公開第２０１５／１２５７８３号（特許文献４）に記載の方法により製造することができる。２’－ＭＯＥ核酸については、試薬として購入可能なアミダイトを用いることにより製造することができる。５’－ＣＰ核酸については、国際公開第２０２０／１５８９１０号（特許文献５）に記載の方法により製造することができる。ＬＮＡについては、国際公開第９９／１４２２６号（特許文献６）に記載の方法により製造することができる。
　≪二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
　本発明の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の製造方法を用いて、該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を基準として所定の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド（第二鎖オリゴヌクレオチド）を製造する。その後、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび上記第二鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより製造することができる。
　≪アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体≫
　本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、
　を有する。上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
　本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
　本実施形態の他の側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。
　本実施形態において「付加物質」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している物質であって、所定の作用を付与するために用いられる物質を意味する。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。また、上記付加物質は、上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。本実施形態の一側面において、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方に結合していることが好ましい。また、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと直接、共有結合で結合していてもよい。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと、リンカー物質を介して結合していてもよい。上記リンカー物質としては例えば、アルキル、ポリエチレングリコール、ペプチド、ジスルフィド、核酸等及び／又はこれらの組み合わせで構成されたリンカーが挙げられる。上記付加物質を上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合させる方法は、例えば後述する実施例に記載の方法が挙げられる。
　上記付加物質として用いられるペプチドとしては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。ＣＰＰｓ（Ｃｅｌｌ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅs：細胞膜透過性ペプチド）、核移行性ペプチド、ＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ポリアルギニン、グルカゴン様ペプチド－１　類縁ペプチド、合成環状ＲＧＤペプチド、脳移行性ペプチド
　上記付加物質として用いられるリガンド化合物としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、糖類（グルコース、マンノース等）、脂質類（コレステロール、パルミチン酸、ドコサヘキサエン酸等）、ビタミン類（葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ（トコフェロール）等）、アミノ酸、モノアミン受容体リガンド（インダトラリン等）
　上記付加物質として用いられる抗体としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。抗インスリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＨＥＲ２抗体
　上記付加物質として用いられるタンパク質としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これに限らない。アルブミン
　上記付加物質として用いられる核酸としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これに限らない。天然ヌクレオチド、アプタマー
　なお、上記付加物質として用いられる核酸は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長にはカウントしないものとする。
　≪ＲＰＳ２５遺伝子の発現調節剤≫
　本実施形態に係るＲＰＳ２５遺伝子の発現調節剤は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を有効成分として含む。本実施形態の一側面において、上記発現調節剤は、ＲＰＳ２５遺伝子に対する発現抑制剤と把握することもできる。本実施形態の他の側面において、上記発現調節剤は、ＲＡＮ翻訳に対する抑制剤と把握することもできる。本実施形態の他の側面において、上記発現調節剤は、ＲＡＮ翻訳の抑制を介したジペプチドリピートの発現抑制剤と把握することもできる。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＰＳ２５のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体に結合することで、ＲＰＳ２５遺伝子の発現を抑制し、その翻訳産物によるＲＡＮ翻訳を抑制する。本発明のＲＰＳ２５遺伝子の発現調節剤の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を有効成分として含有する医薬組成物≫
　本実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。本実施形態の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。以下、上記医薬組成物を、「アンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物」と表記することがある。
　上記医薬組成物は、ＲＰＳ２５遺伝子に関連した疾患、すなわちＲＡＮ翻訳によって産生したジペプチドリピートによって引き起こされうる疾患の治療又は予防に用いられる。言い方を変えると、上記医薬組成物は、ＲＰＳ２５遺伝子の発現を抑制することによって症状の改善が期待できる疾患の治療又は予防に用いることができる。このような疾患を「リピート病」と表記する場合がある。リピート病の具体例としては、例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、筋強直性ジストロフィー等をはじめとする種々の精神神経疾患及び筋疾患等が挙げられる。
　≪リピート病に対する治療剤及び予防剤≫
　本実施形態に係るリピート病に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。本実施形態に係るリピート病に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。上記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
　＜Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ＞
　上記Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳとは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のエクソン１ａ領域とエクソン１ｂ領域との間のイントロン領域に存在するＧＧＧＧＣＣ配列が異常に反復伸長する変異を有するＡＬＳを意味する。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、ＡＬＳの原因遺伝子としては最も高頻度であり孤発性ＡＬＳの約６％、家族性ＡＬＳの約４０％を占める。ＡＬＳは、運動神経細胞が選択的に死滅することで筋肉が萎縮する神経変性疾患である。ＡＬＳは、上位・下位運動神経障害の臨床的特徴又は電気生理学的特徴を組み合わせることで診断される。具体的には脳幹、頚髄、胸髄、腰仙髄の４領域のうち上位・下位運動神経障害を示す所見が１領域にあり、かつ他の領域に筋電図所見が認められればｌａｂｏｒａｔｏｒｙ－ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｐｒｏｂａｂｌｅ、２領域にあればｐｒｏｂａｂｌｅ、３領域にあればｄｅｆｉｎｉｔｅと診断される。
＜Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ＞
　上記Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤとは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のエクソン１ａ領域とエクソン１ｂ領域との間のイントロン領域に存在するＧＧＧＧＣＣ配列が異常に反復伸長する変異を有するＦＴＬＤを意味する。上記ＦＴＬＤは、進行性の異常行動や認知機能障害を認めそれらにより日常生活が阻害されていることに加え、脱抑制行動又は無関心・無気力又は固執・常同性又は口唇傾向と食習慣の変化等から３項目以上の症状が見られる。上記ＦＴＬＤは、画像検査所見において前頭葉や側頭葉前部の萎縮か代謝や血流の低下が見られ、特定の疾患と鑑別される場合に行動異常型ＦＴＬＤと診断される。上記ＦＴＬＤは、物品呼称の障害、単語理解の障害が認められることに加え、対象物に対する知識の障害又は表層性失読・失書等の症状が認められ、前方優位の側頭葉に萎縮がみられ、特定の疾患を鑑別できる場合に意味性認知症ＦＴＬＤと診断される。
　＜ハンチントン病＞
　上記ハンチントン病とは、ハンチンチン遺伝子のエクソン１領域に存在するＣＡＧ配列が異常に反復伸長することによって発症する常染色体優性遺伝形式を示す遺伝性の神経変性疾患を意味する。上記ハンチントン病は、不随意運動を特徴とする運動障害、精神症状、及び認知症状を呈する。特定の神経所見が認められ、かつ遺伝子診断でＣＡＧ配列の異常伸長変異が認められる場合、又は、進行性の経過を示し常染色体優性遺伝の家族歴、特定の神経所見、及び臨床検査所見が認められ、鑑別診断で類似疾患が否定される場合にハンチントン病と診断される。
　＜脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症＞
　上記脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症とは各疾患における責任遺伝子上に存在する特定の３塩基配列（ＣＡＧまたはＣＴＧ）が異常に反復伸長することによって発症する常染色体優性遺伝形式を示す遺伝性の神経変性疾患を意味する。脊髄小脳失調症１、２、３、６，７，１２及び１７型並びに歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症においては、ＣＡＧの繰り返し配列が認められる。脊髄小脳失調症８型ではＣＴＧの繰り返し配列が認められる。上記脊髄小脳失調症及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症は、小脳性または後索性の運動失調又は痙性対麻痺を主要症候とし、緩徐進行性であることを基本とし、遺伝子診断または神経病理学的診断等を組み合わせて診断される。
　＜球脊髄性筋萎縮症＞
　上記球脊髄性筋萎縮症とはアンドロゲン受容体遺伝子のエクソン領域に存在するＣＡＧ配列が異常に反復伸長することによって発症する遺伝性疾患を意味する。上記球脊髄性筋萎縮症は、神経所見（球症状、下位運動神経徴候、手指振戦、四肢腱反射低下）、臨床所見・検査所見、遺伝子診断等を組み合わせて診断される。
　＜Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症＞
　上記Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症とはフラタキシン遺伝子の変異によって発症する常染色体劣性形式を示す遺伝性の神経変性疾患を意味する。上記Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症の多くは、第１イントロンに存在するＧＡＡ配列が異常に反復伸長することによる。
　＜脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群＞
　上記脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群とはＦＭＰ１遺伝子の５’ＵＴＲに存在するＣＧＧ配列が異常に反復伸長することによって発症する遺伝性の神経変性疾患を意味する。上記脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群は、臨床症状（小脳失調、運動時振戦、パーキソニズム、認知症、知的障害）、ＭＲＩ検査による中小脳脚兆候、遺伝子診断等を組み合わせて診断される。
　＜筋強直性ジストロフィー＞
　上記筋強直性ジストロフィーとはＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲに存在するＣＵＧ配列が異常に反復伸長することによって発症する常染色体優性遺伝形式をとる遺伝性の筋疾患を意味する。
　＜個体＞
　上記個体とは、哺乳動物を意味する。上記個体は、好ましくは、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。上記個体は、より好ましくはヒトである。
　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物は、遅発性中枢毒性に敏感な対象（個体）に好適な投与経路で投与されうる。ここで、「遅発性中枢毒性」とは、急性期の中枢毒性が現れ得る期間が経過し、回復した後に現れる中枢毒性を意味する。遅発性中枢毒性によって認められる症状としては、例えば、自発運動減少、歩行異常及び後肢の機能異常、振戦、後肢又は尾部の脱力、後肢の反射の消失、体重減少等が挙げられる。本毒性は観察日に認められた一般状態所見を以下に示す基準でスコア化し、観察期間を通してスコアを合算することでＣｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅを算出する。毒性所見の強度によってスコアが加算されるため、低いＣｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅが算出された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全性が高いと判断することができる。また、脳の病理検査において、異常所見が認められた場合と認められなかった場合をスコア化することでＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅを算出する。各スコアは群ごとに平均値を採用する。また、「遅発性中枢毒性に敏感な対象（個体）」とは、バイオマーカー等で選別される対象を指す。
　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅ；
　　0点：異常なし
　　1点：後肢機能異常、振戦、自発運動減少
　　2点：後肢のひきずり、尾部又は後肢の脱力
　　3点：完全な後肢機能不全、後肢の麻痺、横臥、腹臥
　　4点：安楽殺
　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ；
　　0点：異常なし
　　1点：異常あり（単細胞壊死、空胞化等）
　核酸医薬では、標的ＲＮＡと同一又は類似した塩基配列を有するＲＮＡ（オフターゲット候補遺伝子又はオフターゲット候補ＲＮＡ）にハイブリダイズし、当該オフターゲット候補遺伝子に影響を与えることに起因して毒性発現し得ることが知られている（「狭義のオフターゲット毒性」と称されることがある。）。予期しない狭義のオフターゲット毒性を避けるためには、予め標的外ＲＮＡにハイブリダイズしない領域で標的ＲＮＡを設計することが重要である。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物のオフターゲット候補遺伝子への作用を評価する方法として、「高速塩基配列検索：ＧＧＧｅｎｏｍｅ（ｈｔｔｐｓ//ｇｇｇｅｎｏｍｅ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／ｊａ／）」等を用いた類似塩基配列の検索を行い、狭義のオフターゲット候補遺伝子を見積もることができる。オフターゲット候補遺伝子が少ない場合、狭義のオフターゲット毒性のリスクが低いと判断することができる。
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物（Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳに対する治療剤及び予防剤を含む）を投与するに当たっては、その投与方法及び剤型は特に限定されない。すなわち、当該分野における公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の投与方法及び製剤として用いることができる。投与方法としては、例えば、経口投与、非経口投与等が挙げられる。非経口投与としては、点眼投与、腟内投与、直腸内投与、鼻腔内投与、経皮投与、静脈内注射、点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物は、中枢神経系に曝露されるように投与されることが好ましい。中枢神経系に曝露されるような投与方法としては、例えば、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の製剤には、賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、嬌味剤、芳香剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合することができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を局所投与する場合、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を経口投与する場合、例えば、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等の製剤を用いることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を非経口、髄腔内、又は脳室内投与する場合、例えば、無菌水溶液等の製剤を用いることができる。
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効投与量は、投与される個体の性別、年齢、体重、症状等により、任意に定めることができる。更に、投与の方法、経路、頻度等に応じても任意に定めることができる。例えば、投与量として０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ等が挙げられる。好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは０．１～１０　ｍｇ／ｋｇである。
　≪ＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節する方法≫
　本実施形態におけるＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節する方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記ＲＰＳ２５遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
　本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を細胞、組織又は個体に投与する方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行ってもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで行ってもよい。ｉｎ　ｖｉｖｏで投与する場合、その投与経路は、上述した投与経路が用いられる。
　本実施形態において、「ＲＰＳ２５遺伝子を発現している細胞」としては、例えば、中枢神経系を構成する神経細胞、末梢神経系を構成する神経細胞、その他皮膚組織を構成する細胞等が挙げられる。
　本実施形態におけるリピート病の治療方法又は予防方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として、上記リピート病に罹患している個体に投与する工程を含む。上記個体は、遅発性中枢毒性に敏感な対象（個体）であることが好ましい。
　上記リピート病としては、上述した精神神経疾患、筋疾患等が挙げられる。個体に投与する際の剤型、投与経路及び投与量は上述したものを適宜採用することができる。
　以上、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドについて説明した。上述の構成を備える上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＰＳ２５遺伝子の発現を調節することが可能になる。ここで、ＲＰＳ２５遺伝子の発現に対する抑制活性（ノックダウン活性）は、公知の方法により測定することができる。ノックダウン活性の測定方法としては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ　（２０１５）５１８（７５３９）：４０９－１２（非特許文献１２）や国際公開第２０２２／０９７７２７号（特許文献７）に記載されている方法等が挙げられる。また、後述するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションによっても測定することができる。また、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域に少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸が含まれているため、遅発性中枢毒性が低減される。
≪ＲＰＳ２５遺伝子の発現に対する抑制活性の評価方法≫
＜細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入＞
「ＲＰＳ２５遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法、エレクトロポレーション法又は直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを６時間から３日間処置する。使用する細胞はＲＰＳ２５遺伝子が発現している細胞であればよく、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞、より好ましくは神経細胞、更に好ましくはヒト由来神経細胞が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収してもよいし、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してもよい。
＜ＲＰＳ２５ｍＲＮＡ量の評価＞
　回収した細胞から抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施し、得られた相補的ＤＮＡに対してＲＰＳ２５遺伝子特異的プローブを用いてリアルタイムＰＣＲ法等を実施することでＲＰＳ２５ｍＲＮＡの量を測定する。リアルタイムＰＣＲに用いるプローブとしては、例えばＴａｑｍａｎプローブが挙げられる。反応方法としては例えば「（ｃＤＮＡの変性）―（アニーリング）―（伸長反応）」の３ステップ又は「（ｃＤＮＡの変性）―（アニーリングと伸長反応）」の２ステップを任意の回数繰り返す方法が挙げられる。２または３ステップの繰り返し回数は例えば２５～４５回であり、好ましくは３５～４０回である。（ｃＤＮＡの変性）温度は例えば９０°Ｃ～９８°Ｃであり、好ましくは９２°Ｃ～９５°Ｃである。（アニーリング）温度は例えば４０°Ｃ～７０°Ｃであり、好ましくは５０°Ｃ～６０°Ｃである。（伸長反応）温度は例えば、６５°Ｃ～７５°Ｃであり、好ましくは反応に用いるポリメラーゼの最適温度である。（アニーリングと伸長反応）温度は、例えば５５°Ｃ～７０°Ｃである。
＜ＲＰＳ２５タンパク質量の評価＞
　回収した細胞を溶解し、抽出物を得る。ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）等の免疫化学的手法を用いて上記抽出物中に含まれるＲＰＳ２５タンパク質の量を評価する。ウェスタンブロッティング法において、泳動、転写、検出の各ステップは任意の機器を使用することができる。メンブレンと一次抗体又は二次抗体の反応時間及び反応温度は任意に設定可能であり、例えば４°Ｃで一晩又は室温で１～３時間である。
　なお、本発明は、上述の実施形態に限定されない。例えば、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の実施態様を含む。
　本発明の第一の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。
　本発明の第二の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である（ただし、参考例１～３１に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを除く。）。
　本発明の第三の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である（ただし、参考例１～３１、設計例１～１８係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを除く。）。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記ギャップ領域の塩基数が、５～２０ｍｅｒであり、
　上記３’ウイング領域が、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域が、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域において２個以上配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域において２～５個配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して５分の１以上配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側に配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１５～２０ｍｅｒであることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１８～２０ｍｅｒであることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。
　本発明の一態様において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～７０％であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）。
　本発明の一態様において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）。
　本発明の一態様において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１２３番、１２４番、１８５番、１８６番、２６３番、２６４番、３２４番、３２５番、４４２番、４４３番、又は４４７番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて３２４番、３２５番、又は４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　　上記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
　　上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１８～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であり、
　上記３’ウイング領域は、３～５ｍｅｒであり、
　上記５’ウイング領域は、３～５ｍｅｒであることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４５０番～４５１番、若しくは４５３番に位置する塩基から連続した１８～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号５～４７、及び４９～５６の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、９、１２、１５～１８、２２、２４、２７～２９、３１～３６、３８、４０～４２、４７、及び４９～５４の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号４１、４７、５０及び５３～５５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列であることが好ましい。
　本発明の一態様に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
　本発明の一態様に係る医薬品は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　上記医薬品の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩が、中枢神経系に曝露されるように投与されることが好ましい。
　上記医薬品の一態様において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩が、遅発性中枢毒性に敏感な対象に投与されることが好ましい。
　本発明の一態様に係るＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　本発明の一態様に係るＲＡＮ翻訳によるジペプチドリピートの産生阻害剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　本発明の一態様に係るリピート病に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　本発明の一態様に係るリピート病に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
　上記治療剤及び上記予防剤の一態様において、上記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
　本発明の一態様に係るリピート病の治療方法又は予防方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む。
　上記リピート病の治療方法又は予防方法の一態様において、上記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
　本発明の一態様は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳの治療又は予防に使用するための、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を提供する。
　本発明の一態様は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳの治療剤又は予防剤を製造するために使用する、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を提供する。
　以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　≪ＲＰＳ２５遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製≫
　まず、表２－１～表２－４、表３－１、表３－２及び表４に示される一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。設計したものの一部について、以下の手順でＲＰＳ２５遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。
　修飾核酸として、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、５’－ＣＰ核酸、及び／又はＧｕＮＡ、並びに／或いは、核酸塩基部が５－メチルシトシンである核酸を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（ｎＳ－８型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は、標準的なホスホロアミダイトプロトコールにて実施した。ただし、５’位にレブニリル保護基を有するモノマーを付加する場合は、固相担体をピリジン－酢酸（１：１　ｖ／ｖ）中の０．５Ｍ　ヒドラジン水和物で１時間、合成器の外で室温処理することによって脱保護を行い、その後、固相担体を合成装置に取り付け、合成を再開した。固相担体は、ＣＰＧレジンを使用した。また、ホスホロチオエート化（ＰＳ）骨格形成のための硫化はＤＤＴＴ（（（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ａｍｉｎｏ）－３Ｈ－１，２，４－ｄｉｔｈｉａｚａｏｌｉｎｅ－３－ｔｈｉｏｎｅ）等を使用した。２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ及び／又はｓｃｐＢＮＡを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）基で保護されておらず、かつ３’位が固相に担持されたものとして得た。続いてアルカリ処理することにより、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し、溶液の状態で回収した。その後、回収した溶液から溶媒を留去することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて精製することにより精製された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを得た。得られた各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの純度及び構造をＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）により確認した。
　下記表２－１～表２－４、表３－１、及び表３－２に、上述の方法で製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを列挙する。表２－１～表２－４、表３－１、及び表３－２において示されている一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＲＰＳ２５のｍＲＮＡ（配列番号１）に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本明細書において、下記記号又は表記を用いて、対応する構造を表すことがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上に示す構造式において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は、直鎖若しくは分岐の炭素数１から３のアルキル基を示す。ここで、上述の「＝」で示される結合におけるＲ１及びＲ２は、共にメチル基を示す。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖若しくは分岐の炭素数１から７のアルキル基、又は炭素数３から７のシクロアルキル基を示す。ここにおいて、上述の「Ｇｘ」で示されるＧｕＮＡにおけるＲ３及びＲ５が共に水素原子で、かつ、Ｒ４がメチル基の場合は、「Ｇｍ」と示し、Ｒ３が水素原子で、かつ、Ｒ４及びＲ５が共にメチル基の場合は、「Ｇｄｍ」と示し、Ｒ３及びＲ５が水素原子で、かつ、Ｒ４がｔｅｒｔ－ブチル基の場合は、「ＧｔＢ」と示す。
　≪ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価≫
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに応じて、ヒト胎児腎細胞を用いた発現評価で行った。また上記ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価は、ヒトｉＰＳ細胞由来神経細胞を用いても行うことができる。本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）量を測定することでｍＲＮＡ量を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。
　＜ヒト胎児腎細胞を用いた発現評価＞
　ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６　（商標））を、培養培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地組成
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ＃Ｄ６４２９
１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１８２０
１００倍希釈ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液：ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）
　まず、ヒトＲＰＳ２５遺伝子の発現量測定を行う前日に、９６穴プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１２０００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度０．５ｎＭ、５ｎＭ、１５ｎＭ、又は５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を増殖培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養した。その後、上記増殖培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　ヒトＲＰＳ２５遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｈｕｍａｎ　ＲＰＳ２５：　Ｈｓ０１５６８６６１＿ｇ１
　ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：　４３２６３１７Ｅ（インターナルコントロール）
　上述の方法で求められた、ヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡに対する各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現比率を表５－１～表５－３、表６－１～表６－２に示す（「ｈＲＰＳ２５　発現比率」の欄）。このとき、陰性対照群において求められたヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現比率を１.００とした。発現比率が０．８０以下であるものを、ヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現を抑制することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断した。なお、表中、「－」で示されているものは測定を行っていないことを意味する。一般にｍＲＮＡの発現が抑制されるとその後のタンパク質への翻訳等も抑制されると考えられる。そのため、上記発現比率が０．８０以下であるものは、ヒトＲＰＳ２５遺伝子の機能を調節することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　＜マウス初代培養神経細胞を用いた発現評価＞
　マウス初代培養神経細胞を、培養培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で培養する。マウス初代培養神経細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いる。
　マウス初代培養神経細胞の培養培地組成
Ｂ－２７　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｋｉｔ：ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃Ａ１４１３７０１
１００倍希釈２００ｍＭ－Ｌ－グルタミン溶液：ナカライテスク社製：Ｃａｔ＃１６９４８－０４
１００倍希釈ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液：ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）
　まず、マウス初代培養神経細胞（マウス胎児大脳由来）を９６穴プレートに各細胞（４００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で５日培養する。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度０．０１μＭ、０．１μＭ、又は１μＭ）を上記培養培地に添加する。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳを上記培養培地に添加する。細胞を培養培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養する。その後、上記培養培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施する。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施する（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　マウスＲＰＳ２５遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｍｏｕｓｅ　Ｒｐｓ２５：　Ｍｍ０２３４２７８３＿ｇ１
　ｍｏｕｓｅ　ＧＡＰＤＨ：　４３５２３３９Ｅ（インターナルコントロール）
　≪ヒトｉＰＳ細胞由来運動神経細胞を用いた評価≫
　ヒトｉＰＳ細胞から運動神経細胞を分化誘導し評価に用いる。細胞の維持、分化誘導は以下に記載の培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で行う。
　培地組成一覧
（ＳＮＬ細胞用培地）
ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，Ｃａｔ＃Ｄ６４２９）、
１００倍希釈ペニシリン・ストレプトマイシン混合溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１５１４０－１２２）
１０倍希釈ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１０４３７－０２８）
（ｉＰＳ細胞用培地）
霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社製、Ｃａｔ＃ＲＣＨＥＭＤ００１Ｂ）
１００倍希釈ペニシリン・ストレプトマイシン混合溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃１５１４０－１２２）
（混合培地Ａ）
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２　ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１０５６５－０１８）
２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃２５０３０－０８１）
Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１１１４０－０５０）
１００倍希釈ペニシリン・ストレプトマイシン混合溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ｃａｔ＃１５１４０－１２２）
２μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｈ－４７８４）
Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１７５０２－０４８）
（混合培地Ｂ）
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃２１１０３－０４９）
２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃２５０３０－０８１）
Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１１１４０－０５０）
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃１５２４０－０６２）
２μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｈ－４７８４）
Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１７５０２－０４８）
１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＧＦ－１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製，ｃａｔ＃１００－１１）
１０ｎｇ／ｍＬ　Ｈｕｍａｎ　ＣＮＴＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製，ｃａｔ＃４５０－１３）１０ｎｇ／ｍＬ　Ｈｕｍａｎ　ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステム社製，ｃａｔ＃２１２－ＧＤ－０５０）
Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃１２５８７０１０）
２００μＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ＃Ａ５９６０)
１０ｎｇ／ｍＬ　Ｈｕｍａｎ　ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃４５０－０２）
（神経細胞用培地）
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅｌｅｃｔｒｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃Ａ１４０９８－０１）
２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃２５０３０－０８１）
Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１１１４０－０５０）
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃１５２４０－０６２）
２μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｈ－４７８４）
Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１７５０２－０４８）
１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＧＦ－１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製，ｃａｔ＃１００－１１）
１０ｎｇ／ｍＬ　Ｈｕｍａｎ　ＣＮＴＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製，ｃａｔ＃４５０－１３）
１０ｎｇ／ｍＬ　Ｈｕｍａｎ　ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステム社製，ｃａｔ＃２１２－ＧＤ－０５０）
Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　Ｅｌｅｃｔｒｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃Ａ１４０９７－０１）
２００μＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ＃Ａ５９６０)
１０ｎｇ／ｍＬ　Ｈｕｍａｎ　ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃４５０－０２）
２５μＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ｃａｔ＃２１９８５－０１２３）
０．１％　ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ｃａｔ＃Ａ９５７６）
　＜フィーダー細胞のマイトマイシン処理＞
　ヒトｉＰＳ細胞を播種するためのフィーダー細胞として、マイトマイシン処理したＳＮＬ細胞（セルバイオラボ社製、Ｃａｔ＃ＣＢＡ－３１６）を調製する。ＳＮＬ細胞のマイトマイシン処理は、次のように行う。まず、１０ｃｍシャーレ（イワキ社製、Ｃａｔ＃３０２０－１００）に０．１％ゼラチン（富士フイルム和光純薬社製、Ｃａｔ＃１９０－１５８０５）を加えて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターにて上記シャーレを１時間以上静置する（以下、この操作を「ゼラチン処理」という場合がある。）。その後、上記シャーレから余分なゼラチンを吸引除去し、ＳＮＬ細胞用培地を用いて、解凍したＳＮＬ細胞をシャーレ１枚辺り１～２×１０６個となるように播種する。３～４日間毎に８～１６倍に細胞を希釈して継代し、必要な細胞数まで増殖させる。次に０．１％ゼラチン処理を行った１５ｃｍシャーレ（イワキ社製、Ｃａｔ＃３０３０－１５０）にシャーレ１枚辺り２～４×１０６個のＳＮＬ細胞を播種する。８０～９０％コンフルエントになるまで上記細胞を培養した後、ＳＮＬ細胞用培地で０．４ｍｇ／ｍＬに希釈したマイトマイシンＣ（協和キリン社製、ＹＪコード４２３１４００Ｄ１０３１）を終濃度６．２μｇ／ｍＬになるように上記シャーレに添加する。３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターにて上記シャーレを２時間１５分静置する。その後、上記シャーレから培地を除去し、ＰＢＳで上記ＳＮＬ細胞を１回洗浄する。２．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１５０９０－０４６）をＰＢＳで希釈したのち（終濃度０．２５％）、上記ＳＮＬ細胞に添加して室温で１分間静置した。その後、上記ＳＮＬ細胞をチューブに回収して遠心し、セルバンカー（Ｒ）（ＺＥＮＯＡＱ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ社製、Ｃａｔ＃ＣＢ０１１）で懸濁し凍結保存する。
　＜ヒトｉＰＳ細胞の維持＞
　１０ｃｍシャーレに０．１％ゼラチンを添加して、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターにて１時間以上静置する。ＳＮＬ細胞用培地を用いてマイトマイシン処理済みのＳＮＬ細胞を懸濁する。その後、１．５×１０６個の上記ＳＮＬ細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、２～３日培養する。続いてＳＮＬ細胞用培地を上記シャーレから除去しＰＢＳにて上記ＳＮＬ細胞を洗浄する。その後、１／１０００量のＹ―２７６３２（トクリス社製、Ｃａｔ＃１２５４）を含むｉＰＳ細胞用培地で懸濁したヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手、ＡＪ－Ｈ１－０１）を上記シャーレに播種する。培地交換は播種した日の翌々日以降、分化誘導開始まで毎日実施する。
　＜ヒトｉＰＳ細胞から運動神経細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞の細胞培養液にＹ－２７６３２（終濃度１０μＭ）を添加することで、上記Ｙ－２７６３２に上記ｉＰＳ細胞を１時間以上曝露する。培養上清を除きＰＢＳで上記細胞を洗浄したのち、Ｃｅｌｌ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＴＫ溶液）（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社製、Ｃａｔ＃ＲＣＨＥＴＰ００２）を添加して室温にて１分間反応させる。ＣＴＫ溶液を除去し、ＰＢＳで上記細胞を２回洗浄したのち、ｉＰＳ細胞用培地を１ｍＬ添加する。セルスクレイパーで上記細胞を剥離し、セルストレイナー（ベクトン・ディッキンソン社製、Ｃａｔ＃３５２３５０）を通して細胞塊を分散し、細胞の懸濁液を得る。得られた懸濁液を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ＃３４７１）に移す。混合培地Ａに、ＬＤＮ１９３１８９（ステムジェント社製、Ｃａｔ＃０４－００７４）（終濃度０．３μＭ）、ＳＢ４３１５４２（トクリス社製、Ｃａｔ＃１６１４）（終濃度２μＭ）、ＣＨＩＲ－９９０２１（ステムジェント社製、Ｃａｔ＃０４－０００４－１０）（終濃度３μＭ）、及びＹ－２７６３２（終濃度１０μＭ）を添加した培地に交換して、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーターにて細胞を培養する（培養０日目）。
　培養２日目及び４日目に、ピペットで培養液を除去し混合培地Ａに、ＬＤＮ１９３１８９（終濃度０．３μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度２μＭ）、及びＣＨＩＲ－９９０２１（終濃度３μＭ）を添加した新鮮な培地に交換する。
　培養７日目、９日目及び１１日目にピペットで培養液を除去し混合培地ＡにＬＤＮ１９３１８９（終濃度０．３μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度２μＭ）、ＣＨＩＲ－９９０２１（終濃度３μＭ）、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（富士フイルム和光純薬社製、Ｃａｔ＃１６６－２３９９１）（終濃度０．５μＭ）、及びＲｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ＃Ｒ２６２５）（終濃度０．１μＭ）を添加した新鮮な培地に交換する。
　培養１４日目及び１６日目にピペットで培養液を除去し、混合培地Ａに、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（終濃度０．５μＭ）、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ（終濃度０．１μＭ）、Ｈｕｍａｎ　ＢＤＮＦ（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ＃Ａ５９６０）（終濃度２００μＭ）、を添加した新鮮な培地に交換する。
　培養１８日目に、混合培地Ｂに、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（終濃度０．５μＭ）、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ（終濃度０．１μＭ）、及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（カルビオケム社製、Ｃａｔ＃５６５７９０）（終濃度０．１μＭ）を添加した新鮮な培地に交換する。
　培養２１日目に、細胞塊をＰＢＳで洗浄後、遠心分離して上清を除去する。Ａｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジーズ社製、Ｃａｔ＃ＡＴ１０４）、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）を上記細胞塊に添加して３７°Ｃにて１０分間インキュベートする。上記細胞塊を氷冷したのち、上記細胞塊をピペッティング操作によって分散させる。遠心（３００×ｇ、５分間、４°Ｃ）後、沈殿した細胞を回収し混合培地Ｂに懸濁する操作を２回繰り返す。以上の操作によって、ｉＰＳ細胞に由来する運動神経細胞を得た。得られた運動神経細胞はセルバンカー（Ｒ）に懸濁し、分注して冷凍保存する。
　＜ヒトｉＰＳ細胞由来運動神経細胞の培養と一本鎖アンチセンスヌクレオチドの評価＞
　９６　Ｗｅｌｌ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｂｔｍ　Ｐｌｔ　Ｐｏｌｙｂａｓｅ　Ｂｌａｃｋ　ｗ／　Ｌｉｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　ＰＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１６５３０５）に、ＰＢＳにて６．６６倍希釈したＰｏｌｙ－Ｌ－Ｏｒｎｉｔｉｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＬＯ）溶液（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ＃Ｐ４９５７）を添加し、室温で２時間以上静置する。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳで希釈したｉＭａｔｒｉｘを０．５μｇ／ｃｍ２になるようプレートに添加し、４°Ｃで一晩静置する。次に前項で凍結保存したヒトｉＰＳ細胞由来運動神経細胞を解凍し、神経細胞用培地に懸濁する。その後、遠心分離にて上清を除去し、１／１００量のＣｕｌｔｕｒｅ　Ｏｎｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，Ａ３３２０２０１）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（終濃度０．１μＭ）を含む神経細胞用培地に上記細胞を再懸濁する。この細胞をコーティングした９６ウェルプレート上に３００００個／ウェルになるよう播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターにて２８日間培養する。２～３日に１回の頻度で神経細胞培地を半量交換する。培養開始から７日目までは神経細胞用培地にＣｕｌｔｕｒｅ　Ｏｎｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅを含む培地を使用する。
　播種後、培養１、１１、１８、２６日目（それぞれ、Ｄ１、Ｄ１１、Ｄ１８、Ｄ２６と表記する。）において、ＰＢＳで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ）を培養培地に添加する。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳを培養培地に添加した細胞を用いる。細胞を培養培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間または７２時間培養したのち、一本鎖アンチセンスヌクレオチドを含む培地を除去し、神経細胞培地にて継続培養を行う（２～３日に１回半量培地交換を実施）。その後、上記培養培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施する。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施する（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。「発現抑制率」は、以下の式（１）によって算出する。
　（発現抑制率）＝１－（発現比率）　　（式１）
　上記発現抑制率の値が大きい値であるほど、ヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現を抑制することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断する。
　ヒトＲＰＳ２５遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｈｕｍａｎ　ＲＰＳ２５：　Ｈｓ０１５６８６６１＿ｇ１
　ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：　４３２６３１７Ｅ（インターナルコントロール）
　≪ＲＰＳ２５タンパク質の発現評価≫
　ＲＰＳ２５タンパク質の発現評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに応じて、ヒト胎児腎細胞を用いて発現評価を行う。本実施例におけるタンパク質発現量評価とは、ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質量を評価することを意味する。以下、発現評価の具体的手順について説明する。
　＜ヒト胎児腎細胞を用いた発現評価＞
　ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６　（商標））を、培養培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で培養する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いる。
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地組成
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ＃Ｄ６４２９
１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１８２０
１００倍希釈ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液：ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）
　＜ウェスタンブロッティングによるタンパク質の定量解析＞
　まず、６穴プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５０００００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で一晩培養する。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度５０ｎＭ）をリポフェクション法を用いて、上述の細胞にトランスフェクションする。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いる。トランスフェクションした細胞を増殖培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で４８時間培養する。その後、上記増殖培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、セルスクレイパーで細胞を回収する。回収液を２７００×ｇ、５分、４°Ｃの条件下で遠心し細胞を沈殿させる。上清を除去後、Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃１８６０９３２）を１／１００量含む１ｍＬのＲＩＰＡ　Ｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃８９９００）を添加し、超音波破砕機によって細胞を破砕する。その後１５０００×ｇ、１０分、４°Ｃの条件下で遠心し、上清をサンプルとする。回収したサンプルはＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃２３２２５）を用いてタンパク質定量を行う。各サンプルの濃度が一定になるように調整したのち、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｌａｎｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｅｒ社製、Ｃａｔ＃３９０００）を添加し、９５°Ｃで５分加熱処理を行う。調製したサンプルをタンパク質量が１０μｇ～２０μｇ／レーンになるように重層し、電気泳動を行う。電気泳動はＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）　ＴＤＸ（商標）プレキャストゲル　４～１５％（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製、Ｃａｔ＃５６７１０８５Ｊ１０）を使用し、２００Ｖ定電圧条件で３０分間行う。泳動バッファーには１×濃度に希釈したＲｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０×）ｆｏｒ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃３０３２９－６１）を使用する。
　泳動後、セミドライ方式にてトランスファーを行う。メンブレンにはＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐａｃｋ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製、Ｃａｔ＃１７０４１５７）を使用し、トランスファー装置にはＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＳｙｓｔｅｍのＳｔａｎｄａｒｄプロトコル（３０分）を使用する。トランスファー後、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄する。なお、ＴＢＳＴの組成は０．０６％　ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ－２０）（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃２８３５３－８５）を含む１×濃度に希釈したトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃３５４３８－８１）である。洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃０３９５３－９５）またはＰＶＤＦ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡株式会社製、Ｃａｔ＃ＮＹＰＢＲ０１）で１時間、室温条件で振盪することでブロッキングを行う。ブロッキング後、ＴＢＳＴで洗浄し、希釈した一次抗体を添加し４°Ｃ条件下で一晩振盪する。一次抗体と希釈溶媒は以下のとおりである。
・ＲＰＳ２５
抗体：Ａｎｔｉ－ＲＰＳ２５　ａｎｔｉｂｏｄｙ（アブカム社製、Ｃａｔ＃ａｂ１０２９４０）
溶媒：Ｃａｎｇｅｔ　ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１（東洋紡株式会社製、Ｃａｔ＃ＮＫＢ－１０１）
・β－ａｃｔｉｎ
抗体：β―Ａｃｔｉｎ　（１３Ｅ５）　Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ（ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ＃５１２５）
溶媒：Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ
　一次抗体振盪後、ＴＢＳＴで洗浄し、希釈した二次抗体を添加し室温で１時間振盪する。二次抗体と希釈溶媒は以下のとおりである。
・ＲＰＳ２５
抗体：Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｃａｔ＃Ａ２４５３７）
溶媒：Ｃａｎｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（東洋紡株式会社製、Ｃａｔ＃ＮＫＢ－１０１）
　二次抗体振盪後、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、Ｃａｔ＃ＲＰＮ２２３２）を用いて検出を行う。なお、検出ならびに解析にはＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｍａｇｅｒ６８０を使用する。
　上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるヒトＲＰＳ２５タンパク質の発現比率を算出する。このとき、陰性対照群において求められたヒトＲＰＳ２５タンパク質の発現比率を１.００とする。タンパク質発現比率が０．８０を下
回っているときＲＰＳ２５遺伝子の機能を調節することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞毒性評価≫
　ヒト子宮頸がん細胞としてＨｅＬａ－Ｓ３細胞を、増殖培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件で培養した。増殖培地としては、以下の組成のものを用いた。
　細胞毒性評価に用いた増殖培地の組成
１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ＧＩＢＣＯ社製、ＣＡＴ＃１０４３７０２８
１％　非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）：ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ＃１１１４００５０
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　低グルコース　（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）　（富士フイルム和光純薬社製、Ｃａｔ＃０４１－２９７７５））
　実験前日に９６穴プレートに上記細胞（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種した。播種した細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した後、Ｏｐｔｉ－Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃３１９８５０７０）にて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製社製、Ｃａｔ＃Ｌ３０００－０１５）との複合体を形成させた各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度：１～２００ｎＭ）を、添加し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で２４時間上記細胞を培養した。その後、上記増殖培地に、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ　３／７　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｇ８０９３）又はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃　Ｇ８０８１）を添加してカスパーゼ活性および細胞生存率を評価した。上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける細胞毒性評価結果（細胞生存率）を表７－１～表７－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの血清中安定性評価≫
　４００ｐｍｏｌの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ＝８．０）溶液（４μＬ）に対して、マウス血清（２０μＬ）又はヒト血清（２０μＬ）を混合させた後、ミネラルオイル（１５μＬ）を添加する。この溶液を３７°Ｃにてインキュベートした後、８ｍｏｌ／Ｌ　尿素溶液（１０μＬ）を混合させて血清中の核酸分解酵素を失活させる。超純水（１０μＬ）を添加後に遠心分離により一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む水層とミネラルオイル層に分離し、水層をＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）によって分析し、得られた一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのＵＶ－クロマトグラムの面積強度より残存する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを算出する。「残存オリゴヌクレオチド（％）」とは、血清との混合直後に分析した時点における未分解の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する、７２時間後における未分解の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの残存率を示す。
　７２時間後において残存率が５０％以上であるものを、安定な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断する。
　≪ＲＰＳ２５遺伝子のｉｎ　ｖｉｖｏ発現評価≫
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価は、マウス脳室内投与を実施し前頭前皮質のそれぞれの部位のｍＲＮＡ量を測定することによって行った。本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）量を測定することでｍＲＮＡ量を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。
　イソフルラン（ファイザー社製、Ｃａｔ＃１１４１３３４０３）を用いてＦＶＢマウス（日本クレア）に麻酔をかけた。次に、５０μＬハミルトンシリンジ（ハミルトン社製、Ｃａｔ＃７０５ＬＴ）に装着した２段針（トップ社製、医療機器承認番号１５８００ＢＺＺ０１４６００００）を用いて、人工脳脊髄液（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃａｔ＃３５２５／２５ｍＬ）に溶解したアンチセンスオリゴヌクレオチドを１０μＬ／個体で麻酔したＦＶＢマウスに投与した。陰性対照群のマウスには人工脳脊髄液のみを１０μＬ／個体で投与した。
　投与後一定の飼育期間を設けたのち、上記ＦＶＢマウスを安楽死させ脳、頚髄、腰髄の３部位を採取した。採取した組織は、ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｃａｔ＃ＡＭ７０２４）に漬けて一晩静置したのち―８０℃にて保管した。保管した組織サンプルからのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃７４１０６）を用いて実施した。抽出したｍＲＮＡからの逆転写反応は、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｃａｔ＃４３６８８１４）を用いて実施した。逆転写反応には、１μｇのｍＲＮＡを２０μＬに希釈して使用した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。
　マウスＲＰＳ２５遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｍｏｕｓｅ　Ｒｐｓ２５：　Ｍｍ０２３４２７８３＿ｇ１
　ｍｏｕｓｅ　ＧＡＰＤＨ：　４３５２３３９Ｅ（インターナルコントロール）
　上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるマウスＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現比率を表８－１～表８－２に示す。この時、陰性対象群において求められたマウスＲＰＳ２５、ＲＮＡの発現比率を１．００とした。一般にｍＲＮＡの発現が抑制されるとその後のタンパク質への翻訳等も抑制されると考えられるため、上記発現比率が０．８０以下の場合、マウスＲＰＳ２５遺伝子の機能を調節することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。なお、表８－１～表８－２に列挙されている一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合する標的領域は、ヒトＲＰＳ２５遺伝子とマウスＲＰＳ２５遺伝子との間で配列が保存されている領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性のｉｎ　ｖｉｖｏ評価≫
　各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける中枢毒性は、マウス脳室内投与を実施し、投与直後～１時間後及び投与後最大２８日まで飼育し、一般状態・体重の観察及び組織サンプルの採材時点での病理学的検査（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行うことで評価した。
　結果を表９－１～表９－２に示す。表９－１～表９－２の「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｃｕｔｅ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ」における「ｓｃｏｒｅ」の欄は、以下の評価基準に基づき算出した。項目１－５について、認められた所見のうち最大点数を個体ごとに記録し、各項目の点数を合計する。例えば、１個体において、眼瞼下垂、側臥、呼吸緩徐、痙攣が認められた場合、合計点数は１＋４＋４＝９となる。点数は高いほど重篤な所見であることを示すため、合計点数が高いほど急性中枢毒性所見が重篤であると判断できる。なお、ｓｃｏｒｅは、群ごとに平均値を採用した。なお、表中、「－」で示されているものは測定を行っていないことを意味する。
　1.　多動(1点)、常同行動（グルーミング、旋回）(1点)　、立ち上がり行動(1点)、発声
　(1点)、過敏・挙尾(1点)
　2.　眼瞼下垂、閉眼、自発運動減少(消失)　(1点)
　3.　よろめき　(1点)、失調性歩行(2点)
　4.　異常姿勢・呼吸不規則　(1点)、側臥/腹臥　(2点)　、呼吸緩徐　/異常(4点)
　5.　跳躍、振戦　、筋攣縮(2点)、痙攣　(4点)
　また、「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ」における「ｓｃｏｒｅ」の欄は、以下の評価基準に基づき算出した。各ｓｃｏｒｅは、群ごとの平均値を採用した。「ＩＣＲ」は、Ｃｒｌ：ＣＤ１マウスを意味し、「ＦＶＢ」は、ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウスを意味する。
　　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅ；
　0点：異常なし
　1点：後肢機能異常、振戦、自発運動減少
　2点：後肢のひきずり、尾部又は後肢の脱力
　3点：完全な後肢機能不全、後肢の麻痺、横臥、腹臥
　4点：安楽殺
　　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ；
　0点：異常なし
　1点：異常あり（単細胞壊死、空胞化等）
　なお、表９－１の実施例５１及び表９－２の参考例３１については、下記方法により中枢毒性評価を行った。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性のｉｎ　ｖｉｖｏ評価（２）≫
　表９－１の実施例５１及び表９－２の参考例３１の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける急性中枢毒性（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｃｕｔｅ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ）については、ＩＣＲマウスに脳室内投与を実施し、投与１日後に評価することによって行った。評価項目は行動評価であり、マウスの行動評価は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ　ｂａｔｔｅｒｙ（ＦＯＢ）によって行った。評価項目として、１）姿勢、２）外見上の異常、３）常同行動、４）刺激に対する反応性、５）グリップ力、６）呼吸、７）身震い・痙攣についてそれぞれ正常を０、やや異常ありを１、極度に異常ありを２とスコア化した。各項目で得られたスコアの合計値を、表９－１及び表９－２の「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｃｕｔｅ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ」における「ｓｃｏｒｅ」の欄に記入した。
　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性のｉｎ　ｖｉｖｏ評価（３）≫
　表９－１の実施例５１及び表９－２の参考例３１の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける遅発性中枢毒性（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｎｅｕｒｏＴｏｘのＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｓｉｇｎ　Ｓｃｏｒｅ）は、ＩＣＲマウスに脳室内投与を実施し、投与後２８日まで評価することによって行った。評価項目は行動評価であり、マウスの行動評価は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ　ｂａｔｔｅｒｙ（ＦＯＢ）によって行った。評価項目として、１）姿勢、２）外見上の異常、３）常同行動、４）刺激に対する反応性、５）グリップ力、６）呼吸、７）身震い・痙攣についてそれぞれ正常を０、やや異常ありを１、極度に異常ありを２とスコア化した。各項目で得られたスコアの合計値を、表９－１及び表９－２の「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｎｅｕｒｏＴｏｘ」における「Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｓｉｇｎ　Ｓｃｏｒｅ」の欄に記入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　≪狭義のオフターゲット毒性のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ評価≫
　各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける狭義のオフターゲット毒性評価を、上述の高速塩基配列検索システム（ＧＧＧｅｎｏｍｅ）を用いて行った。各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列情報をＧＧＧｅｎｏｍｅに入力し、データベースに登録されたｈｕｍａｎ　ｓｐｌｉｃｅｄ　ＲＮＡ及びｈｕｍａｎ　ｐｒｅ－ｓｐｌｉｃｅｄ　ＲＮＡを対象に、ハイブリダイズの不一致数から狭義のオフターゲットＲＮＡ数をカウントした。ハイブリダイズした際、ミスマッチ、デリーション、インサーションがあれば、それぞれの該当塩基数を合計することで不一致数を算出した。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列から標的となるＲＮＡの塩基配列が「ＡＧＣＴＧＴＡＣ」の場合、「ＡＴＣＴＧＴＡＣ」の塩基配列を持つＲＮＡはミスマッチ（下線の塩基）が「１」となり、不一致数は「１」と算出される。また、標的となるＲＮＡの塩基配列が「ＡＧＣＴＧＴＡＣ」の場合、「ＡＴＣＴＧ<Ｇ>ＴＡＣ」の塩基配列を持つＲＮＡはミスマッチ（下線の塩基）が「１」、デリーション（山括弧で囲まれている塩基）が「１」となり、不一致数は「２」と算出される。また、標的となるＲＮＡの塩基配列が「ＡＧＣＴＧＴＡＣ」の場合、「ＡＴＣＴＧ＊ＡＣ」の塩基配列を持つＲＮＡはミスマッチ（下線の塩基）が「１」、インサーション（＊で表記された箇所）が「１」となり、不一致数は「２」と算出される。このように標的以外のＲＮＡ（オフターゲットＲＮＡ）に対するハイブリダイズの際の不一致数をカウントし、完全一致するＲＮＡ数、不一致数が１以下のＲＮＡ数、不一致数が２以下のＲＮＡ数を各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドについて計算する。不一致数が０、１以下、２以下のＲＮＡ数が少ないほど狭義のオフターゲット毒性リスクは低いことを意味し、逆に、不一致数が０、１以下、２以下のＲＮＡ数が多いほど狭義のオフターゲット毒性リスクが高いことを意味する。結果を表１０－１～表１０－４に示す。塩基長が１８以上となると、不一致数が１以下でハイブリダイズするＲＮＡ数は１０以下となり、狭義のオフターゲットリスクが低いと考えられ、より好ましい一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
　今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims (46)

  1. 　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、前記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
    　前記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
    　前記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
    　前記３’ウイング領域及び前記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
    　　配列番号１に記載の塩基配列における、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
    　　前記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
    　　前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  2. 　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、前記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
    　前記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
    　前記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
    　前記３’ウイング領域及び前記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
    　　配列番号１に記載の塩基配列における、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
    　　前記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
    　　前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩（ただし、参考例１～３１に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを除く。）。
  3. 　ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能を調節する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、前記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
    　前記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
    　前記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
    　前記３’ウイング領域及び前記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒであり、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
    　　配列番号１に記載の塩基配列における、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
    　　前記標的領域において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
    　　前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩（ただし、参考例１～３１、設計例１～１８に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを除く。）。
  4. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、
    　配列番号１に記載の塩基配列における、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９５％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  5. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、
    　配列番号１に記載の塩基配列における、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも１つの標的領域に対して相補的な塩基配列である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  6. 　前記ギャップ領域の塩基数が、５～２０ｍｅｒであり、
    　前記３’ウイング領域が、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
    　前記５’ウイング領域が、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  7. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されている、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  8. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域において２個以上配置されている、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  9. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域において２～５個配置されている、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  10. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されている、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  11. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域に対して５分の１以上配置されている、請求項１０に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  12. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されている、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  13. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域における５’末端側に配置されている、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  14. 　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されている、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  15. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１５～２０ｍｅｒである、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  16. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１８～２０ｍｅｒである、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  17. 　前記３’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
    　前記５’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  18. 　前記３’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
    　前記５’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されている、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  19. 　前記３’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
    　前記５’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されている、請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  20. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  21. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  22. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％である、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  23. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～７０％である、請求項２２に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  24. 　前記ギャップ領域において、前記５’－ＣＰ核酸と、前記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合である（ただし、前記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  25. 　前記ギャップ領域において、前記５’－ＣＰ核酸と、前記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合である（ただし、前記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と前記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）、請求項１～請求項２４のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  26. 　前記ギャップ領域において、前記５’－ＣＰ核酸と、前記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合である、請求項１～請求項２５のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  27. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
    　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて１２３番、１２４番、１８５番、１８６番、２６３番、２６４番、３２４番、３２５番、４４２番、４４３番、又は４４７番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
    　　前記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
    　　前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である、請求項１～請求項２６のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  28. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
    　　配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて３２４番、３２５番、又は４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１４～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
    　　前記標的領域において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
    　　前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である、請求項１～請求項２７のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  29. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４４８番～４５３番に位置する塩基から連続した１８～２２ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であり、
    　前記３’ウイング領域は、３～５ｍｅｒであり、
    　前記５’ウイング領域は、３～５ｍｅｒである、請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  30. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端から数えて４５０番～４５１番、若しくは４５３番に位置する塩基から連続した１８～２０ｍｅｒで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１～請求項２９のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  31. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号５～４７、及び４９～５６の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である、請求項１～請求項３０のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  32. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６、９、１２、１５～１８、２２、２４、２７～２９、３１～３６、３８、４０～４２、４７、及び４９～５４の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である、請求項１～請求項３１のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  33. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号４１、４７、５０、及び５３～５５の塩基配列からなる群より選ばれる１つの塩基配列である、請求項１～請求項３２のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
  34. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
    　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
    　前記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩。
  35. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬品。
  36. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は前記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩が、中枢神経系に曝露されるように投与される、請求項３５に記載の医薬品。
  37. 　前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は前記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩が、遅発性中枢毒性に敏感な対象に投与される、請求項３５又は請求項３６に記載の医薬品。
  38. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＲＰＳ２５遺伝子の発現及び／又は機能調節剤。
  39. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＲＡＮ翻訳によるジペプチドリピートの産生阻害剤。
  40. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、リピート病に対する治療剤。
  41. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、リピート病に対する予防剤。
  42. 　前記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項４０に記載のリピート病に対する治療剤、又は請求項４１に記載のリピート病に対する予防剤。
  43. 　請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を個体に投与することを含む、リピート病の治療方法又は予防方法。
  44. 　前記リピート病は、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項４３に記載のリピート病の治療方法又は予防方法。
  45. 　Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳの治療又は予防に使用するための、請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩。
  46. 　Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳの治療剤又は予防剤を製造するために使用する、請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩又は請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩。
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