WO2024257848A1

WO2024257848A1 - 遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法、及びその製造方法

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Publication number: WO2024257848A1
Application number: PCT/JP2024/021614
Authority: WO
Inventors: 智彦青山; 成宏浅野; 友美角谷; 峻哲川野邊; アジャヤラムセレスタ; 高尾鈴木
Original assignee: Luxna Biotech Co Ltd
Current assignee: Luxna Biotech Co Ltd
Priority date: 2023-06-16
Filing date: 2024-06-14
Publication date: 2024-12-19
Anticipated expiration: 2025-12-16
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Abstract

第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づいて、第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程を含む、遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３'末端に結合している３'ウイング領域と、前記ギャップ領域の５'末端に結合している５'ウイング領域とを含み、前記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、前記３'ウイング領域及び前記５'ウイング領域は２'位に置換基を有する修飾核酸であり、塩基長は、１２～３０ｍｅｒである、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域、３'ウイング領域及び５'ウイング領域の塩基配列が、前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、３'ウイング領域及び５'ウイング領域の核酸の糖部の構造が、前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、前記ギャップ領域に少なくとも１つの５'－ＣＰ核酸を含み、前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、遅発性中枢毒性が低減されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。

Description

遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法、及びその製造方法

　本発明は、遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法、及びその製造方法に関する。

　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となる核酸配列にハイブリダイズして遺伝子発現自体を抑制することで作用を発現する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の向上や、標的核酸への結合親和性、特異性などの改善を目的として様々な修飾核酸が開発及び導入され、様々な製剤が上市されるようになったが、昨今新たな問題として浮上したのが、修飾核酸が潜在的に有する毒性をどう回避するかという問題である。

　アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性は、いわゆる「標的外ＲＮＡとのハイブリダイゼーションに起因する毒性（狭義のオフターゲット毒性）」と細胞内外のタンパク質や金属イオン等との結合に起因する等の「ＲＮＡとのハイブリダイゼーションに起因しない毒性（広義のオフターゲット毒性）」にカテゴライズすることができる。そしてこれらの毒性を回避するために様々なアプローチが採用されている。

　例えば広義のオフターゲット毒性については、特許文献１において、核酸の塩基部や糖部に適切な化学修飾を行うことで回避できることが開示されている。また、狭義のオフターゲット毒性については、特許文献２において、塩基部（チミン）の２’位カルボニル基を修飾することと糖部２’位－４’位を架橋することで、標的外ＲＮＡとのハイブリダイゼーションにおける非ワトソンクリック型塩基対の形成を抑制することによって回避できることが開示されている。さらに、一般的にヌクレオシド間のホスホロチオエート修飾が肝毒性発現の原因であることが知られているところ（例えば、非特許文献１）、特許文献３には、特定の臓器（例えば、肝臓）への集積などが懸念されるホスホロチオエート型核酸を５’位にシクロプロパン構造を有する修飾核酸に置換することで、活性を維持したまま肝毒性を低減できることが開示されている。

国際公開第２０１８／１５５４５０号国際公開第２０１８／１５５４５１号国際公開第２０２０／１５８９１０号国際公開第２０１６／１２７０００号国際公開第２０１１／０５２４３６号国際公開第２０１４／０４６２１２号国際公開第２０１５／１２５７８３号国際公開第９９／１４２２６号

Migawa　M.T.　et　al.,　Nucleic　Acids　Res,　20;47(11):5465-5479　(2019) Moazami　M.P.　et　al.,　bioRxiv,　doi:　https://doi.org/10.1101/2021.02.14.431096　(2021) Ｗ．Ｂｒａｄ　Ｗａｎ　ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７．Ｐｅｔｅｒ　Ｈ．Ｈａｇｅｄｏｒｎ　ｅｔ．Ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．（２０２２）３２：１５１－１６２．

　これまでのアンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性低減技術に係る毒性評価は、全身曝露した後に集積しやすい臓器が肝臓であることを考慮して主に肝毒性を指標になされ、それ以外の組織における毒性評価について深い知見は得られていない。例えば、中枢毒性（急性期の中枢毒性、遅発性中枢毒性等）は医薬品の安全性試験において重要な評価項目であるが、近年、中枢神経疾患を対象疾患としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発が盛んに進められている中、アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性に関してはほとんど知見がない。

　アンチセンスオリゴヌクレオチドと中枢毒性の関係、特に中枢毒性の低減に着目した知見としては、特許文献４にアンチセンスオリゴ核酸の配列と中枢毒性（神経細胞における細胞内遊離カルシウム濃度の振動）の相関関係が開示されている。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート修飾による中枢毒性を評価した文献は、本発明者らが知る限りにおいて、２件しか存在しない（非特許文献２、非特許文献４）。非特許文献２において、ホスホロチオエート修飾を有するギャップマー型オリゴヌクレオチドにおいて、ウイング部分のホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換することで、中枢毒性を低減できることが開示されている。

　しかしながら、非特許文献２には、一部のホスホロチオエート修飾を除去し、かつ糖部の２’位に安定性に関与する修飾を付したアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、「ＡＳＯ」と称することがある。）では、ホスホロチオエート修飾が除去されていないＡＳＯと比較して、アンチセンス活性が低下し得ることが開示されている。前記アンチセンス活性の低下は、ホスホロチオエート修飾の除去に起因するＡＳＯの安定性の低下によるものと考えられる。

　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アンチセンス活性を保持したまま遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法及びその製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進めた結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩（以下、「本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。）において、ギャップ領域に５’－ＣＰ核酸が含まれるように設計、製造することによって、アンチセンス活性を保持したまま遅発性中枢毒性が低減されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。

　［１］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法は、
　第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づいて、第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程を含む、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、
　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　　ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域とを含み、
　　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　　塩基長は、１２～３０ｍｅｒである、
　アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　ギャップ領域、３’ウイング領域及び５’ウイング領域の塩基配列が、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　３’ウイング領域及び５’ウイング領域の核酸の糖部の構造が、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　上記ギャップ領域に少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、遅発性中枢毒性が低減されている。

　［２］上記［１］において、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域は、５’－ＣＰ核酸を含まず、
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域の５’－ＣＰ核酸以外の糖部の構造が上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であることが好ましい。

　［３］上記［１］又は［２］において、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記ギャップ領域の塩基数は、５～２０ｍｅｒであり、
　上記３’ウイング領域は、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記５’ウイング領域は、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であることが好ましい。

　［４］上記［１］～［３］のいずれかにおいて、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　塩基長は、１５～３０ｍｅｒであることが好ましい。

　［５］上記［１］～［４］のいずれかにおいて、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記ギャップ領域に配置されるシトシンが、５－メチルシトシンであることが好ましい。

　［６］上記［１］～［５］のいずれかにおいて、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。

　［７］上記［１］～［６］のいずれかにおいて、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　塩基配列におけるＧＣの比率が０．２～０．６であることが好ましい。

　［８］上記［１］～［７］のいずれかにおいて、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドが一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

　［９］上記［１］～［８］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸は、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されていることが好ましい。

　［１０］上記［１］～［９］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸は、上記ギャップ領域に２個以上配置されていることが好ましい。

　［１１］上記［１］～［１０］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸は、上記ギャップ領域に２～５個配置されていることが好ましい。

　［１２］上記［１］～［１１］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸は、上記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていることが好ましい。

　［１３］上記［１］～［１２］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されていることが好ましい。

　［１４］上記［１］～［１３］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して５分の１以上配置されていることが好ましい。

　［１５］上記［１］～［１４］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸は、上記ギャップ領域における５’末端側に配置されていることが好ましい。

　［１６］上記［１］～［１５］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　上記５’－ＣＰ核酸は、上記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されていることが好ましい。

　［１７］上記［１］～［１６］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、
　ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％であることが好ましい。

　［１８］上記［１］～［１７］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、
　ホスホロチオエート結合の割合が５０％～７０％であることが好ましい。

　［１９］上記［１］～［１８］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側に隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）。

　［２０］上記［１］～［１９］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）。

　［２１］上記［１］～［２０］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合であることが好ましい。

　［２２］上記［１］～［２１］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数が５個以上であることが好ましい。

　［２３］上記［１］～［２２］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数は、５～１０個であることが好ましい。

　［２４］上記［１］～［２３］のいずれかにおいて、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基は、５～１０個連続して配置されていることが好ましい。

　［２５］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩の製造方法は、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩の製造方法であって、
　上記［１］～［２４］のいずれかにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法によって、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程と、
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する工程とを含む。

　［２６］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒである。

　［２７］本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩は、
　上記［２６］のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。

　［２８］本発明の第一の態様における疾患の治療剤は、
　上記［２６］のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は、上記［２７］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を含む、疾患の治療剤であって、
　上記治療剤は、中枢神経系に曝露されるように投与するように用いられる。

　［２９］本発明の第二の態様における疾患の治療剤は、
　上記［２６］のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は、上記［２７］アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を含む、疾患の治療剤であって、
　上記治療剤は、遅発性中枢毒性に敏感な対象に投与される。

　［３０］本発明の第三の態様における疾患の治療剤は、
　上記［２６］のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は、上記［２７］のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を含む、疾患の治療剤であって、
　上記疾患は、中枢神経系の疾患である、治療剤。

　本発明によれば、アンチセンス活性を保持したまま遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法及びその製造方法を提供することが可能になる。

図１は、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの構成の一例を示す模式図である。図２は、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたときの、標的ＲＮＡの発現が抑制されるメカニズムを説明する模式図である。

　以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記す。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ｉ～Ｊ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＩ以上Ｊ以下）を意味し、Ｉにおいて単位の記載がなく、Ｊにおいてのみ単位が記載されている場合、Ｉの単位とＪの単位とは同じである。

　≪遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法≫
　本実施形態の遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法は、
　第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づいて、第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程を含む、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、
　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　　ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域とを含み、
　　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　　塩基長は、１２～３０ｍｅｒである、
　アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　ギャップ領域、３’ウイング領域及び５’ウイング領域の塩基配列が、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　３’ウイング領域及び５’ウイング領域の核酸の糖部の構造が、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　上記ギャップ領域に少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、遅発性中枢毒性が低減されている。

　＜用語の定義等＞
　まず、本明細書において用いられる用語の定義等について以下に説明する。

　（一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）
　本実施形態において「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、又は「ＡＳＯ」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡ(ノンコーディングＲＮＡ)（以下、これら三者をまとめて「標的ＲＮＡ」と称することがある。）に対して相補的なオリゴヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの類似体から構成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することにより、標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列を有するもの、当該相補的な塩基配列において１個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有するもの、及びゆらぎ塩基対を形成する塩基をその塩基配列中に含むものが含まれる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する「糖部が修飾糖である修飾核酸」（糖修飾されている修飾ヌクレオチド）以外の、当該分野で公知の修飾ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。当該分野で公知の修飾ヌクレオチドとしては、糖修飾されている修飾ヌクレオチドに加えて、例えば、後述するリン酸基修飾されている修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾されている修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
　なお、本実施形態におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その両末端の構造は特に制限されず、例えば、－ＯＨであってもよいし、－ＯＲ（ただし、Ｒはアルキル鎖、リン酸エステル体、又は後述する付加物質を示す。）であってもよい。
　また、本実施形態における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であってもよいし、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態をとってもよい。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを、「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。

　（オリゴヌクレオチド）
　本実施形態において「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオシドが、リン酸ジエステル結合又はその他の結合で２～３０個連結されたヌクレオチドのポリマーを意味する。上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造式で示すように核酸塩基部、リン酸部、及び糖部から構成されていると把握することもできる。

　上記オリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドと非天然型のオリゴヌクレオチドとに大別される。「天然のオリゴヌクレオチド」とは天然に存在しているヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然のオリゴヌクレオチド」とは、後述する修飾ヌクレオチドを構成単位として少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然型のオリゴヌクレオチド」としては、好ましくは、糖部が修飾された修飾糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で２つ置き換えられたホスホロジチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がトリエステル化されたエステル誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド化されたホスホアミド誘導体；リン酸ジエステル結合がボロン酸エステル化されたボラノホスフェート誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、メトキシプロピルホスホネート等）誘導体；リン酸ジエステル結合がアミド結合に置換されたアミド誘導体；核酸塩基が修飾された修飾塩基誘導体が挙げられる。更に好ましくは、上記非天然のオリゴヌクレオチドは、糖部が修飾された架橋型修飾糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル誘導体；及び、糖部が後述する修飾糖（例えば、架橋型糖）で修飾され、かつリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で１つ置き換えられているか、又はリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート化されている誘導体等が挙げられる。

　（ヌクレオシド）
　本実施形態において「ヌクレオシド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とが結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」という場合がある。特に糖部分が修飾された修飾ヌクレオシドを「修飾糖ヌクレオシド」という場合がある。

　（ヌクレオチド）
　本実施形態において「ヌクレオチド」とは、上記ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオチドを「天然ヌクレオチド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオチドを「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」という場合がある。「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」としては、上記修飾ヌクレオシドの糖部にリン酸基が結合した化合物、上記修飾ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物、及び、天然ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物等が挙げられる。

　（糖修飾、修飾糖）
　本実施形態において「糖修飾」とは、上記ヌクレオチドの糖部が修飾されていることを意味する。修飾された糖部を特に「修飾糖」という場合がある。糖修飾が施されている修飾ヌクレオチドは修飾核酸として利用可能であり、例えば、ＡｍＮＡ(アミド架橋型修飾核酸、Ａｍｉｄｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ)、ＧｕＮＡ(グアニジン架橋型修飾核酸、Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ｓｃｐＢＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、２’－Ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸など）、２’－Ｆ、５’－メチル－ＤＮＡ、ＬＮＡ（２’，４’－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　Ｅｔｈｙｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、５’－ＣＰ核酸（５’－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
　ＬＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｌ）」、「５（Ｌ）」、「Ｇ（Ｌ）」、「Ｔ（Ｌ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＡｍＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｙ）」、「５（Ｙ）」、「Ｇ（Ｙ）」、「Ｔ（Ｙ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＧｕＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｇｘ）」、「５（Ｇｘ）」、「Ｇ（Ｇｘ）」、「Ｔ（Ｇｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ｓｃｐＢＮＡとしては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｓ）」、「５（Ｓ）」、「Ｇ（Ｓ）」、「Ｔ（Ｓ）」で示される構造を含むものが挙げられる。２’－ＭＯＥ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（ｍ）」、「５（ｍ）」、「Ｇ（ｍ）」、「Ｔ（ｍ）」で示される構造を含むものが挙げられる。５’－ＣＰ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（５’－ＣＰ）」、「５（５’－ＣＰ）」、「Ｇ（５’－ＣＰ）」、「Ｔ（５’－ＣＰ）」で示される構造を含むものが挙げられる。２’－ＯＭｅ核酸としては、例えば、後述する記号「Ａ（Ｍ）」、「Ｃ（Ｍ）」、「Ｇ（Ｍ）」、「Ｕ（Ｍ）」、「Ｔ（Ｍ）」で示される構造を含むものが挙げられる。ＭＣＥ核酸としては、例えば、後述する「Ａ（Ｍｘ）」、「Ｃ（Ｍｘ）」、「Ｇ（Ｍｘ）」、「Ｕ（Ｍｘ）」で示される構造を含むものが挙げられる。

　（２’位に置換基を有する修飾核酸）
　本実施形態において「２’位に置換基を有する修飾核酸」とは、上記ヌクレオチドの糖部２’位に置換基を有する修飾核酸を意味する。例えば、非架橋型修飾核酸として、２’－Ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸、ＭＣＥ核酸など）、２’－Ｆ等が挙げられ、架橋型修飾核酸として、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、ＥＮＡ、Ｓ－ｃＥｔ等が挙げられる。

　（糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾）
　上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための修飾核酸として利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、後述するリン酸基修飾、核酸塩基修飾が知られている。このようなヌクレオチドの修飾は、例えば、Ｗ．Ｂｒａｄ　Ｗａｎ　ｅｔ．Ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：９６４５－９６６７．（非特許文献３）等に記載されているヌクレオチドの修飾が挙げられる。これらのヌクレオチドの修飾は、上記文献で引用されている文献において述べられている当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。

　（リン酸基）
　本実施形態において「リン酸基」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部の結合様式が天然に存在するホスホジエステル結合（後述する記号「－」で示される結合）であるものを意味する。

　（リン酸基修飾、修飾リン酸基）
　本実施形態において「リン酸基修飾」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部が修飾されていることを意味する。修飾されたリン酸部を特に「修飾リン酸基」という場合がある。上記修飾リン酸基を含む結合様式としては、例えば、ホスホロチオエート結合（後述する記号「∧」で示される結合）、ホスホロジチオエート結合、ホスホアミダート結合（後述する記号「＝」で示される結合）、又はボラノホスフェート結合（後述する記号「×」で示される結合）、アルキルホスホネート等が挙げられる。

　（核酸塩基修飾、修飾核酸塩基）
　本実施形態において「核酸塩基修飾」とは、上記ヌクレオチドの核酸塩基部が修飾されていることを意味する。修飾された核酸塩基部を特に「修飾核酸塩基」という場合がある。修飾核酸塩基としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。

　（ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体）
　上記ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体とは、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(ｐＮＡ)、モルホリノ核酸等が挙げられる。

　（ｎｃＲＮＡ）
　本実施形態において「ｎｃＲＮＡ」とは、タンパク質の翻訳には関わらないＲＮＡの総称を意味する。上記ｎｃＲＮＡとしては、例えば、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｎａｔｕｒａｌ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＮＡＴ）等が挙げられる。

　（オリゴヌクレオチドの核酸塩基部）
　上記オリゴヌクレオチドの核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、ウラシリル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、及び２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基等が挙げられる。好ましくは、上記核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５－メチルシトシニル基、及びウラシリル基等が挙げられる。当該核酸塩基のうち、ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）とは互換性があり、どちらも、相補鎖のアデニン（Ａ）との塩基対を形成することができる。また、シトシン（Ｃ）と５－メチルシトシン（５（ｘ））とは互換性があり、どちらも相補鎖のグアニン（Ｇ）との塩基対を形成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部においても同様である。

　（標的ＲＮＡ）
　本実施形態において「標的ＲＮＡ」とは、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合することによって、その機能が制御されるＲＮＡを意味する。

　（標的ＲＮＡとの結合）
　本実施形態において「標的ＲＮＡとの結合」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的ＲＮＡとの相補性によって、当該標的ＲＮＡの核酸塩基と共に二本鎖核酸を形成することを意味する。上記二本鎖核酸は、上記標的ＲＮＡの少なくとも一部において形成されていればよい。なお、上記標的ＲＮＡとの結合の強さは、例えば、熱安定性の指標により測定することができる。上記熱安定性の指標としては、例えば、上記二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ値）等が挙げられる。上記Ｔｍ値としては、好ましくは４０～９０°Ｃであり、より好ましくは５０～７０°Ｃである。

　（標的領域）
　上記標的領域とは、標的ＲＮＡにおける、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドと結合する領域を意味する。

　（標的領域との結合）
　上記標的領域との結合とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的領域と二本鎖を形成することを意味する。ただし、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも標的領域全体と二本鎖を形成する必要はなく、標的領域の一部の領域と二本鎖形成するものであればよい。すなわち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的領域と完全な相補性を有しているものであることが好ましいが、標的ＲＮＡと結合する限りにおいて、標的領域の少なくとも一部の領域と相補的であればよい。

　（標的領域の一部）
　上記標的領域の一部とは、標的領域のうち１０～１５ｍｅｒの塩基長の領域を意味する。

（標的領域の少なくとも一部と相補的）
　上記標的領域の少なくとも一部と相補的とは、標的ＲＮＡ上の標的領域の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であることを意味する。ここにおいて、少なくとも一部の領域に対応するｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体上の領域の塩基と相補的であることも含む。

（アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計）
　本実施形態において、「アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを実際に合成することまでは要さず、頭の中でイメージすることで十分である。しかしながら、典型的には、該イメージされたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、電子計算機上で機能するプログラム（例：オリゴヌクレオチド設計用ソフトフェア、グラフィックデザインツール、オフィスソフト等）上や紙面上で具体化される。したがって、例えば後述の実施例に記載されるように、遅発性中枢毒性が低減されると予想されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを表の形式でまとめる行為も、本発明の設計方法の実施に該当する。

　（中枢毒性）
　本実施形態において、「中枢毒性」は、「中枢神経毒性」ともいい、げっ歯類から非ヒト霊長類やヒトにおける一般状態変化や脳病理組織学的変化により同定される中枢神経系に由来する毒性所見を指す。上記中枢毒性には、急性期の中枢毒性と遅発性中枢毒性とに分類される。中枢神経系に由来する毒性所見としては、例えば、げっ歯類においては、易刺激性・自発運動減少・失調性歩行及び眼瞼下垂の可逆的で軽微な症状から痙攣や死亡等の重篤な症状を含む一般状態変化が挙げられる。具体的には、「中枢毒性」は、Ｉｒｗｉｎの変法（Irwin　S.,　Psychopharmacologia.　1968;　13(3):　222-257）により行う行動スコアにより評価することができる。

　（遅発性中枢毒性）
　本実施形態において「遅発性中枢毒性」とは、急性期の中枢毒性が現れ得る期間が経過し、回復した後に現れる中枢毒性を意味する。遅発性中枢毒性によって認められる症状としては、例えば、自発運動減少、歩行異常及び後肢の機能異常、振戦、後肢又は尾部の脱力、後肢の反射の消失、体重減少等が挙げられる。

　（遅発性中枢毒性の低減）
　本実施形態において、「遅発性中枢毒性が低減した」とは、後述する第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドが有する遅発性中枢毒性と比較して、第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドが有する遅発性中枢毒性が低いこと、あるいは低いと予想されることを意味する。本毒性は観察日に認められた一般状態所見を以下に例示する基準でスコア化し、観察期間を通してスコアを合算することでＣｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅを算出するが、スコア化する基準についてはこれに限らない。毒性所見の強度によってスコアが加算されるため、低いＣｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅが算出されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全性が高いと判断することができる。また、脳の病理検査において、異常所見が認められた場合と認められなかった場合をスコア化することでＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅを算出するが、スコア化する基準についてはこれに限らない。各スコアは群ごとに平均値を採用する。例えば、一群３匹を用いて実施した場合、採材時点において１匹のみに病理学的所見が認められた時のＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅは１÷３＝０．３３と算出される。また、「遅発性中枢毒性に敏感な対象（個体）」とは、バイオマーカー等で選別される対象を指す。
　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅ；
　　0点：異常なし
　　1点：後肢機能異常、振戦、自発運動減少
　　2点：後肢のひきずり、尾部又は後肢の脱力
　　3点：完全な後肢機能不全、後肢の麻痺、横臥、腹臥
　　4点：安楽殺
　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ；
　　0点：異常なし
　　1点：異常あり（単細胞壊死、空胞化等）

　＜第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド＞
　本実施形態において第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　　ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域とを含み、
　　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　　塩基長は、１２～３０ｍｅｒである、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本実施形態に係る設計方法における「ベースとなるアンチセンスオリゴヌクレオチド」、「改良前のアンチセンスオリゴヌクレオチド」と把握することもできる。

　＜第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド＞
　本実施形態において第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　ギャップ領域、３’ウイング領域及び５’ウイング領域の塩基配列が、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　３’ウイング領域及び５’ウイング領域の核酸の糖部の構造が、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　上記ギャップ領域に少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、遅発性中枢毒性が低減されている。
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本実施形態に係る設計方法における「改良後のアンチセンスオリゴヌクレオチド」と把握することもできる。

　本実施形態において、「塩基配列が同一である」とは、２つのオリゴヌクレオチドを比較したとき、両者の塩基配列が完全に同一である場合のみならず、対応する核酸塩基がその核酸塩基の修飾体（例えば、母核の構造が同一で、置換基が異なる修飾体）に置き換わっている場合も含まれる。例えば、シトシンと５－メチルシトシンとは同一とみなすことができる。

　本実施形態において、「核酸の糖部の構造が同一である」とは、２つのオリゴヌクレオチドを比較したとき、両者の同じ位置に配置されているヌクレオチドの糖部の構造それぞれが同一であることを意味する。

　＜アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列＞
　本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドとで同一であれば、特に制限されないが例えば、後述する実施例に記載の塩基配列が挙げられる。
　本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
　（Ａ）配列番号１～２７のいずれかに記載の塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列、
　（Ｂ）配列番号１～２７のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又は、
　（Ｃ）配列番号１～２７のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であることが好ましい。
　また、本実施形態において、配列表に示されている各塩基配列は核酸塩基部の配列情報のみを示すために用いるものとする。上記核酸塩基部に加えて糖部及びリン酸部を含めたオリゴヌクレオチドの構造情報は、後述する実施例における表１に示される記載形式で示すものとする。

　本実施形態において「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方又は両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。）における、オーバーラップする全塩基配列に対する同一塩基の割合（％）を意味する。塩基配列の「配列同一性」は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用いることができる。

　本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１～２７のいずれかに記載の塩基配列に対して９５％以上１００％以下の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上１００％以下の配列同一性を有することがより好ましく、１００％の配列同一性を有することが更に好ましい。

　本実施形態において、「１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」としては、例えば、欠失、置換、挿入又は付加によって、欠失、置換、挿入又は付加される前の塩基配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「１又は数個の塩基」の具体的な数としては、上述の欠失、置換、挿入又は付加が、それぞれ独立して、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所に存在してもよいし、複数が組み合わさっておこっていてもよい。

　本実施形態において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０°Ｃ以上の温度で洗浄する条件をいう。更に、よりストリンジェントな条件、例えば、４５°Ｃ又は６０°Ｃにて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０°Ｃ又は６５°Ｃ以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。

　＜薬理学上許容される塩＞
　本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬理学上許容される塩の形態であってもよい。ここで、「薬理学上許容される塩」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的に許容される塩、すなわち、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、かつ望まれない毒物学的効果を保持しない塩を意味する。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。

　＜製薬学的に許容される塩＞
　本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬学的に許容される塩の形態であってもよい。ここで「製薬学的に許容される塩」とは、上述の薬理学上許容される塩であってかつ酸付加塩又は塩基付加塩であるものを意味する。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びに、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐａｒａ－トルエンスルホン酸塩及びカンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩及びアルミニウム塩等の無機塩基塩、並びに、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６－ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びＮ，Ｎ－ジベンジルエチルアミン等の有機塩基塩等が挙げられる。更には、アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸との塩（アミノ酸塩）が挙げられる。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。

　＜アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造＞
　本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含む（例えば、図１参照）。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態（一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）であることが好ましい。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態（二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）をとってもよい。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。

　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いわゆるギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のメカニズムで、標的ＲＮＡの機能を阻害する。まず、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの標的領域に結合する（図２の上部から中央部）。次に、ＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅＨが、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡの複合体を認識し結合する（図２の中央部）。その後、ＲＮａｓｅＨによる酵素分解反応により標的ＲＮＡが切断、分解される。このとき、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨによる酵素分解の影響を受けない（図２の下部）。そのため、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の標的ＲＮＡに結合して当該ＲＮＡを切断、分解することが可能になる。このようにギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述のＲＮａｓｅＨによる酵素分解反応において触媒として機能するため、少量の投与であっても持続的に所定の効果を奏すと考えられる。

　（ギャップ領域）
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含む。
　また、第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であることが好ましい。言い換えると、上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部が修飾されていてもよいデオキシリボースを含む核酸であると把握することもできる。また、上記ギャップ領域は、５～２０ｍｅｒの、糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はこれらの両方から構成されていると把握することもできる。上記ギャップ領域は、糖部がデオキシリボース又は修飾されたデオキシリボースであることによって、ＲＮａｓｅＨが認識可能な複合体を、標的ＲＮＡと共に形成することが可能になる。ここで、修飾されたデオキシリボースを含む核酸としては、例えば、５’－ＣＰ核酸が挙げられる。

　上記ギャップ領域の塩基数は、５～２０ｍｅｒであることが好ましく、６～１７ｍｅｒであることがより好ましく、７～１３ｍｅｒであることが更に好ましく、９～１３ｍｅｒが更により好ましい。

　糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドとしては、例えば、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシ－５－メチルシチジン一リン酸（５－メチルデオキシシチジンとも言う。）等が挙げられる。言い換えると、上記ギャップ領域を構成する天然ヌクレオチドとしては、後述する記号ａ、ｇ、t及びｃそれぞれに対応する構造式を含むものが挙げられる。

　糖部がデオキシリボース又は修飾されたデオキシリボースである非天然ヌクレオチドとしては、例えば、５’－ＣＰ核酸、２－チオ－チミジン一リン酸、２－アミノアデノシン一リン酸、７－デアザグアノシン一リン酸等が挙げられる。

　なお、上記ギャップ領域は、本発明の効果が奏する限りにおいて、糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドの一部の糖部が修飾糖であってもよい。すなわち、本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域は、一部の糖部がデオキシリボースであり、且つ他の一部の糖部が修飾糖（例えば、修飾されたデオキシリボース）である核酸であってもよい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されていることが好ましい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域において２個以上配置されていることが好ましく、２～５個配置されていることがより好ましい。ここで、「２個以上配置されている」とは、対象の５’－ＣＰ核酸が連続して２個以上配置されている態様と、上記キャップ領域において分散して２個以上配置されている態様が含まれる概念である。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていることが好ましい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側に配置されていることが好ましい。また、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されていることが好ましい。ここで、「ギャップ領域における５’末端側に配置されている」とは、ギャップ領域の中心よりも５’末端側に配置されていることを意味する。「ギャップ領域における３’末端側に配置されている」とは、ギャップ領域の中心よりも３’末端側に配置されていることを意味する。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されていることが好ましく、５分の１以上配置されていることがより好ましい。このとき、上限値は、例えば、２分の１以下であってもよい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されており、かつ２個以上配置されていてもよい。また、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されており、かつ少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていてもよい。また、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側に配置されており、かつ少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていてもよい。また、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記５’－ＣＰ核酸が、上記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されており、かつ少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されていてもよい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）。ここで、「５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている」とは、「当該５’－ＣＰ核酸が３’ウイング領域のヌクレオシドと結合している」と把握することもできる。
　本実施形態の一側面において、上記ギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合であることが好ましい（ただし、上記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と上記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸と、上記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合であることが好ましい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数が５個以上であることが好ましく、５～１０個であることがより好ましい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸が２個以上配置されており、かつ糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数が５個以上であってもよい。また、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、上記５’－ＣＰ核酸が２～５個配置されており、かつ糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数が５～１０個であってもよい。

　本実施形態の一側面において、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域は、５’－ＣＰ核酸を含まず、
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域の５’－ＣＰ核酸以外の糖部の構造が上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であることが好ましい。

　本実施形態の他の側面において、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域に配置されるシトシンは、５－メチルシトシンであってもよい。

　（３’ウイング領域）
　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記３’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾核酸である。言い換えると、上記３’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾ヌクレオチドから構成されていると把握することもできる。上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、非架橋型の２’位修飾核酸として、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸及びＭＣＥ核酸、架橋型修飾核酸として、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。上記３’ウイング領域及び後述する上記５’ウイング領域が、上記所定の修飾ヌクレオチドから構成されることによって、標的ＲＮＡに対して高い結合親和性が期待でき、ひいては標的ＲＮＡの機能を効果的に制御できると考えられる。本実施形態の一側面において、上記３’ウイング領域は、糖部が修飾糖である修飾核酸であってもよい。糖部が修飾糖である修飾核酸としては、上記（糖修飾、修飾糖）で挙げられたものが例示される。本実施形態の一側面において、３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸のみで構成されていてもよい。なお、上記３’ウイング領域における修飾核酸は、１つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中に複数種類含まれていてもよい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましく、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記３’ウイング領域の塩基数は、３～５ｍｅｒであることが好ましい。

　（５’ウイング領域）
　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾核酸である。言い換えると、上記５’ウイング領域は、２’位に置換基を有する修飾ヌクレオチドから構成されていると把握することもできる。上記５’ウイング領域における上記修飾核酸は、非架橋型の２’位修飾核酸として、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸及びＭＣＥ核酸、架橋型修飾核酸として、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。本実施形態の一側面において、上記５’ウイング領域は、糖部が修飾糖である修飾核酸であってもよい。糖部が修飾糖である修飾核酸としては、上記（糖修飾、修飾糖）で挙げられたものが例示される。本実施形態の一側面において、５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸のみで構成されていてもよい。なお、上記５’ウイング領域における修飾核酸は、１つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの中に複数種類含まれていてもよい。本実施形態の他の側面において、３’ウイング領域及び５’ウイング領域における上記修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸のみで構成されていてもよい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましく、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。
　また、上記３’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていて、
　上記５’ウイング領域における上記２’位に置換基を有する修飾核酸が、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる修飾核酸で構成されていることがより好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記５’ウイング領域の塩基数は、３～５ｍｅｒであることが好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域の塩基数は５～２０ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであることが好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域の塩基数は７～１３ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであることがより好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、上記ギャップ領域の塩基数は９～１３ｍｅｒであり、上記３’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであり、上記５’ウイング領域の塩基数は３～５ｍｅｒであることが更に好ましい。

　（核酸の糖部の構造）
　核酸の糖部の構造は、上記（ギャップ領域）、（３’ウイング領域）、及び（５’ウイング領域）の欄において述べた構成であれば特に制限されないが、例えば、以下の表１に示すものが挙げられる。表１において、構造例１、５、９、１２、１５、２０，２２、及び２５は、上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部の構造に対応し、それら以外は、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部の構造に対応する。

　（その他の構成）
　本実施形態の一側面において、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記３’ウイング領域の３’末端に結合している天然ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。上記３’ウイング領域の３’末端に結合している天然ヌクレオチドの塩基数は、１又は数個であってもよく、１個であってもよい。

　（ギャップマー型の構造の表記方法）
　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマー型である。ギャップマー型の構造を表記するにあたっては、「Ｘ－Ｙ－Ｚ」の表記方法を用いることがある。上述の表記方法において、「Ｘ」は５’ウイング領域の塩基数を示し、「Ｙ」はギャップ領域の塩基数を示し、「Ｚ」は３’ウイング領域の塩基数を示す。

　「Ｘ－Ｙ－Ｚ」としては、２－８－４、２－８－３、２－８－５、２－９－２、２－９－３、２－９－４、２－９－５、２－１０－３、２－１０－４、２－１０－５、２－１１－３、２－１１－４、２－１１－５、２－１２－３、２－１２－４、２－１２－５、３－８－２、３－８－３、３－８－４、３－８－５、３－９－３、３－９－４、３－９－５、３－１０－３、３－１０－４、３－１０－５、３－１１－３、３－１１－４、３－１１－５、３－１２－３、３－１２－４、３－１２－５、３－１３－３、３－１３－４、４－８－２、４－８－３、４－８－４、４－８－５、４－９－３、４－９－４、４－９－５、４－１０－３、４－１０－４、４－１０－５、４－１１－２、４－１１－３、４－１１－４、４－１１－５、４－１２－４、４－１３－３、５－８－２、５－８－３、５－８－４、５－８－５、５－９－２、５－９－３、５－９－４、５－９－５、５－１０－２、５－１０－３、５－１０－４、５－１０－５、５－１１－２、５－１１－３、５－１１－４、５－１１－５等が挙げられる。例えば、「２－８－４」と表記した場合、５’ウイング領域は２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ギャップ領域は８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、３’ウイング領域は４ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであることを意味する。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１５～３０ｍｅｒであり、好ましくは１５～２０ｍｅｒであり、より好ましくは１８～２０ｍｅｒである。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、１５～２０ｍｅｒ、１８～２０ｍｅｒである場合、特に、標的ＲＮＡへの結合が強く、標的ＲＮＡの発現の調節をより効果的に行うことができる。

　本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合されていることが好ましい。

　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。本実施形態の他の側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であることが好ましい。

　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％であることが好ましく、５０％～７０％であることがより好ましい。

　上記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　塩基配列におけるＧＣの比率が０．２～０．６であることが好ましい。「ＧＣの比率」とは、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列の全体に対する、グアニン及びシトシン（５－メチルシトシンも含む）の個数の割合を意味する。

　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）の一態様としては、５～２０ｍｅｒからなるギャップ領域、３～５ｍｅｒからなる５’ウイング領域、及び３～５ｍｅｒからなる３’ウイング領域を有するギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該ギャップ領域は、該５’ウイング領域と該３’ウイング領域の間に位置付けられる。該ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含む。そして、該５’ウイング領域及び該３’ウイング領域には、それぞれ少なくとも１つの２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、又はｓｃｐＢＮＡが含まれることが好ましい。該５’ウイング領域及び該３’ウイング領域には、２’－Ｏ－アルキル化若しくは２’－Ｆ化されたヌクレオチドが含まれていてもよい。２’－Ｏ－アルキル化ヌクレオチドとしては、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－アルキル化（例えば、２’－Ｏ－メチル化等）ヌクレオチドを用いてもよい。また、上記ギャップマー型の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第二鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによって二本鎖を形成していてもよい。

　本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、上記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、上記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　上記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　上記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　上記３’ウイング領域及び上記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒである。

　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、後述する表２－１～２－８における、配列番号２，３，４，５，７，８，１０，１２，１３，１５，１６，１８，１９，２０，２１，２３，２４，２６，及び２７からなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。ここで、「表２－１における配列番号２の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、表２－１における配列名が「ｈ４５１－４６５－Ｎ」である一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。他の場合も同様である。

　＜二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド＞
　本実施形態に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、９０％以上１００％以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。

　上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶液中で解離して、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとに分離することができる。分離した上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述した標的ＲＮＡに結合することができる。なお、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとの関係において、「第一鎖オリゴヌクレオチド」と把握することもできる。なお、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドのうち上記第一鎖オリゴヌクレオチドが上述した標的ＲＮＡに対するアンチセンス鎖を有しているが、上記第一鎖オリゴヌクレオチドと上記第二鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを便宜上「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ぶことにする。

　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
　本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩の製造方法は、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩の製造方法であって、
　上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法によって、上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程と、
　上記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する工程とを含む。

　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ホスホロアミダイト法による固相合成により製造することができる。例えば、市販の核酸自動合成機を使用して固相担体上で所定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをまず合成する。次に、塩基性物質等を用いて固相担体から合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを切出し、脱保護を行ない、粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。その後、得られた粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ等を用いて精製する。上述の製造法に限らず、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法に準じて、核酸の塩基配列、修飾部位等を適宜変更することにより製造できる。また、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡについては、それぞれ国際公開第２０１１／０５２４３６号（特許文献５）、国際公開第２０１４／０４６２１２号（特許文献６）、及び国際公開第２０１５／１２５７８３号（特許文献７）に記載の方法により製造することができる。２’－ＭＯＥ核酸については、試薬として購入可能なアミダイトを用いることにより製造することができる。５’－ＣＰ核酸については、国際公開第２０２０／１５８９１０号（特許文献３）に記載の方法により製造することができる。ＬＮＡについては、国際公開第９９／１４２２６号（特許文献８）に記載の方法により製造することができる。

　≪二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
　本発明の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の製造方法を用いて、該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を基準として所定の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド（第二鎖オリゴヌクレオチド）を製造する。その後、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび上記第二鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより製造することができる。

　≪アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体≫
　本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、
　を有する。上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。

　本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。

　本実施形態の他の側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
　上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
　上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖（例えば、飽和脂肪族炭化水素等）、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖（例えば、炭水化物、多糖等）からなる群より選ばれる。

　本実施形態において「付加物質」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している物質であって、所定の作用を付与するために用いられる物質を意味する。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。また、上記付加物質は、上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に結合していてもよいし、３’末端に結合していてもよいし、５’末端及び３’末端の両方に結合していてもよい。本実施形態の一側面において、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方に結合していることが好ましい。また、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと直接、共有結合で結合していてもよい。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと、リンカー物質を介して結合していてもよい。上記リンカー物質としては例えば、アルキル、ポリエチレングリコール、ペプチド、ジスルフィド、核酸等及び／又はこれらの組み合わせで構成されたリンカーが挙げられる。上記付加物質を上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合させる方法は、例えば後述する実施例に記載の方法が挙げられる。

　上記付加物質として用いられるペプチドとしては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。ＣＰＰｓ（Ｃｅｌｌ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅs：細胞膜透過性ペプチド）、核移行性ペプチド、ＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ポリアルギニン、グルカゴン様ペプチド－１　類縁ペプチド、合成環状ＲＧＤペプチド、脳移行性ペプチド

　上記付加物質として用いられるリガンド化合物としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、糖類（グルコース、マンノース等）、脂質類（コレステロール、パルミチン酸、ドコサヘキサエン酸等）、ビタミン類（葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ（トコフェロール）等）、アミノ酸、モノアミン受容体リガンド（インダトラリン等）

　上記付加物質として用いられる抗体としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。抗インスリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＨＥＲ２抗体

　上記付加物質として用いられるタンパク質としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これに限らない。アルブミン

　上記付加物質として用いられる核酸としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。天然ヌクレオチド、アプタマー
　なお、上記付加物質として用いられる核酸は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長にはカウントしないものとする。

　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を有効成分として含有する医薬組成物≫
　本実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む。上記医薬組成物としては、例えば、疾患の治療剤、疾患の予防剤等が挙げられる。本実施形態の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。以下、上記医薬組成物を、「アンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物」と表記することがある。

　上記医薬組成物（治療剤、予防剤等）は、中枢神経系の疾患の治療又は予防に用いられる。上記中枢神経系の疾患としては、例えば、ＲＰＳ２５遺伝子に関連した疾患、すなわちＲＡＮ翻訳によって産生したジペプチドリピートによって引き起こされうる疾患（「リピート病」と表記する場合がある。）が挙げられる。リピート病の具体例としては、例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＡＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２　ＦＴＬＤ、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ失調症、脆弱Ｘ随伴振戦失調症候群、筋強直性ジストロフィー等をはじめとする種々の精神神経疾患及び筋疾患等が挙げられる。

　＜個体＞
　上記個体とは、哺乳動物を意味する。上記個体は、好ましくは、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。上記個体は、より好ましくはヒトである。

　本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）又はその医薬組成物は、遅発性中枢毒性に敏感な対象（個体）に好適な投与経路で投与されうる。ここで、「遅発性中枢毒性」とは、急性期の中枢毒性が現れ得る期間が経過し、回復した後に現れる中枢毒性を意味する。遅発性中枢毒性によって認められる症状としては、例えば、自発運動減少、歩行異常及び後肢の機能異常、振戦、後肢又は尾部の脱力、後肢の反射の消失、体重減少等が挙げられる。

　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物を投与するに当たっては、その投与方法及び剤型は特に限定されない。すなわち、当該分野における公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の投与方法及び製剤として用いることができる。投与方法としては、例えば、経口投与、非経口投与等が挙げられる。非経口投与としては、点眼投与、腟内投与、直腸内投与、鼻腔内投与、経皮投与、静脈内注射、点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物は、中枢神経系に曝露されるように投与されることが好ましい。中枢神経系に曝露されるような投与方法としては、例えば、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。

　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の製剤には、賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、嬌味剤、芳香剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合することができる。

　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を局所投与する場合、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。

　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を経口投与する場合、例えば、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等の製剤を用いることができる。

　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を非経口、髄腔内、又は脳室内投与する場合、例えば、無菌水溶液等の製剤を用いることができる。

　本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効投与量は、投与される個体の性別、年齢、体重、症状等により、任意に定めることができる。更に、投与の方法、経路、頻度等に応じても任意に定めることができる。例えば、投与量として０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ等が挙げられる。好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇである。

　以上、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法、及び製造方法について説明した。上述の設計方法及び製造方法によって得られる上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域に少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸が含まれているため、遅発性中枢毒性が低減される。

　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計≫
　まず、表２－１～表２－８に示される一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。それぞれの表の中で、最初の行に記載した配列が親配列（第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応する配列）、２行目以下はその親配列に基づいて５’－ＣＰ核酸を導入した配列（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応する配列）である。

　本明細書において、下記記号又は表記を用いて、対応する構造を表すことがある。

　上に示す構造式において、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、又は、直鎖若しくは分岐の炭素数１から３のアルキル基を示す。ここで、上述の「＝」で示される結合におけるＲ^１及びＲ^２は、共にメチル基を示す。Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖若しくは分岐の炭素数１から７のアルキル基、又は炭素数３から７のシクロアルキル基を示す。ここにおいて、上述の「Ｇｘ」で示されるＧｕＮＡにおけるＲ^３及びＲ^５が共に水素原子で、かつ、Ｒ^４がメチル基の場合は、「Ｇｍ」と示し、Ｒ^３が水素原子で、かつ、Ｒ^４及びＲ^５が共にメチル基の場合は、「Ｇｄｍ」と示し、Ｒ^３及びＲ^５が水素原子で、かつ、Ｒ^４がｔｅｒｔ－ブチル基の場合は、「ＧｔＢ」と示す。

　≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造≫
　設計したものの一部について、以下の手順で一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。
　修飾核酸として、２’－Ｏ－メチル核酸、２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、５’－ＣＰ核酸、及び／又はＧｕＮＡ、並びに／或いは、核酸塩基部が５－メチルシトシンである核酸を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（ｎＳ－８型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は、標準的なホスホロアミダイトプロトコールにて実施した。ただし、５’位にレブニリル保護基を有するモノマーを付加する場合は、固相担体をピリジン－酢酸（１：１　ｖ／ｖ）中の０．５Ｍヒドラジン水和物で１時間、合成器の外で室温処理することによって脱保護を行い、その後、固相担体を合成装置に取り付け、合成を再開した。固相担体は、ＣＰＧレジンを使用した。また、ホスホロチオエート化（ＰＳ）骨格形成のための硫化はＤＤＴＴ（（（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ａｍｉｎｏ）－３Ｈ－１，２，４－ｄｉｔｈｉａｚａｏｌｉｎｅ－３－ｔｈｉｏｎｅ）等を使用した。２’－ＭＯＥ核酸、ＡｍＮＡ及び／又はｓｃｐＢＮＡを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）基で保護されておらず、かつ３’位が固相に担持されたものとして得た。続いてアルカリ処理することにより、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し、溶液の状態で回収した。その後、回収した溶液から溶媒を留去することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて精製することにより精製された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを得た。得られた各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの純度及び構造をＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）により確認した。測定結果は、表２－１～表２－８に記載した。

　≪アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性評価（１）≫
　一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける遅発性中枢毒性は、ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウス又はＩＣＲマウスに脳室内投与を実施し、投与後最大２８日まで飼育し、一般状態・体重の観察及び組織サンプルの採材時点での病理学的検査（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行うことで評価した。「ｓｃｏｒｅ」の欄は、以下の評価基準に基づき算出した。各ｓｃｏｒｅは、群ごとの平均値を採用した。
　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅ；
　　0点：異常なし
　　1点：後肢機能異常、振戦、自発運動減少
　　2点：後肢のひきずり、尾部又は後肢の脱力
　　3点：完全な後肢機能不全、後肢の麻痺、横臥、腹臥
　　4点：安楽殺
　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ；
　　0点：異常なし
　　1点：異常あり（単細胞壊死、空胞化等）

　代表例として、表２―１～表２－７に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの遅発性中枢毒性の評価結果を表３－１～表３－７に示す。なお、表３－１～表３－８において、「－」で示されているもの箇所は測定評価を行っていないことを意味する。また、表３－７における「観察日」及び「Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅ」の欄は、後述する「アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性評価（２）」に記載されている実験によって得られた評価結果である。表３－１～表３－７の結果から、親配列の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド）に比べて、５’－ＣＰを導入した配列の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）において、遅発性中枢毒性が低減していることが確認された。

　≪アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性評価（２）≫
　表２－７～表２－８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける遅発性中枢毒性は、ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウスまたはＩＣＲマウスに脳室内投与を実施し、投与後最大２８日まで評価することによって行った。評価項目は行動評価、一般状態及び体重の観察、及び採材時点の脳の病理学的検査（ヘマトキシリン・エオシン染色）である。マウスの行動評価は、Functional　observational　battery（FOB）によって行った。評価項目として、１）姿勢、２）外見上の異常、３）常同行動、４）刺激に対する反応性、５）グリップ力、６）呼吸、７）身震い・痙攣についてそれぞれ正常を０、やや異常ありを１、極度に異常ありを２とスコア化した（表３－７におけるＣｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ　ｓｃｏｒｅの欄）。各病理組織所見は大脳皮質上の２か所における神経細胞の１）単細胞壊死、２）空胞化、３）泡沫化の程度に応じてスコア化を行い、所見なしは０、軽度は１、中等度は２、重度は３とした（表３－８における病理組織所見スコアの欄）。

　代表例として、表２－７～表２―８に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの遅発性中枢毒性の評価結果を表３－７～３－８に示す。なお、表３－７における「採材日」及び「Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ」の欄は、上述の「アンチセンスオリゴヌクレオチドの中枢毒性評価（１）」に記載されている実験によって得られた評価結果である。表３－７～３－８の結果から、親配列の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド）に比べて、５’－ＣＰを導入した配列の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）において、遅発性中枢毒性が低減していることが確認された。

　≪ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価）≫
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに応じて、ヒト胎児腎細胞を用いた発現評価で行った。また上記ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価は、ヒトｉＰＳ細胞由来神経細胞を用いても行うことができる。本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）量を測定することでｍＲＮＡ量を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。

　＜ヒト胎児腎細胞を用いた発現評価＞
　ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６　（商標））を、培養培地中、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２の条件で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。

　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養培地組成
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：ＳＩＧＭＡ社製、Ｃａｔ＃Ｄ６４２９
１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１８２０
１００倍希釈ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液：ナカライテスク社製　Ｃａｔ＃０９３６７－３４（ペニシリン　１００００ユニット／ｍｌ，　ストレプトマイシン　１００００μｇ／ｍｌ、安定剤含有）

　まず、ヒトＲＰＳ２５遺伝子の発現量測定を行う前日に、９６穴プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１２０００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２の条件で一晩培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度０．５ｎＭ、５ｎＭ、１５ｎＭ、又は５０ｎＭ）をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないＰＢＳをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を増殖培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ_２の条件で４８時間培養した。その後、上記増殖培地を除去し、Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９９００３）を用いて、抽出した全ＲＮＡに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。

　ヒトＲＰＳ２５遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｈｕｍａｎ　ＲＰＳ２５：　Ｈｓ０１５６８６６１＿ｇ１
　ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：　４３２６３１７Ｅ（インターナルコントロール）

　上述の方法で求められた、ヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡに対する各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現比率を表４－１～表４－７に示す（「ｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価」の欄）。このとき、陰性対照群において求められたヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現比率を１.００とした。発現比率が０．８０以下であるものを、ヒトＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現を抑制することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断した。なお、表中、「－」で示されているものは測定を行っていないことを意味する。一般にｍＲＮＡの発現が抑制されるとその後のタンパク質への翻訳等も抑制されると考えられる。そのため、上記発現比率が０．８０以下であるものは、ヒトＲＰＳ２５遺伝子の機能を調節することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。

　≪ＲＰＳ２５遺伝子のｉｎ　ｖｉｖｏ発現評価≫
　ＲＰＳ２５遺伝子の発現評価は、マウス脳室内投与を実施し前頭前皮質のそれぞれの部位のｍＲＮＡ量を測定することによって行った。本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）量を測定することでｍＲＮＡ量を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。

　イソフルラン（ファイザー社製、Ｃａｔ＃１１４１３３４０３）を用いてＦＶＢマウス（日本クレア）に麻酔をかけた。次に、５０μＬハミルトンシリンジ（ハミルトン社製、Ｃａｔ＃７０５ＬＴ）に装着した２段針（トップ社製、医療機器承認番号１５８００ＢＺＺ０１４６００００）を用いて、人工脳脊髄液（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃａｔ＃３５２５／２５ｍＬ）に溶解したアンチセンスオリゴヌクレオチドを１０μＬ／個体で麻酔したＦＶＢマウスに投与した。陰性対照群のマウスには人工脳脊髄液のみを１０μＬ／個体で投与した。

　投与後一定の飼育期間を設けたのち、上記ＦＶＢマウスを安楽死させ、脳、頚髄、腰髄の３部位を採取した。採取した組織は、ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｃａｔ＃ＡＭ７０２４）に漬けて一晩静置したのち―８０℃にて保管した。保管した組織サンプルからのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃７４１０６）を用いて実施した。抽出したｍＲＮＡからの逆転写反応は、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｃａｔ＃４３６８８１４）を用いて実施した。逆転写反応には、１μｇのｍＲＮＡを２０μＬに希釈して使用した。この逆転写反応から得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用して、Ｔａｑｍａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、予め設計された遺伝子特異的プローブ（下記参照）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した（９５°Ｃ；３秒間、６０°Ｃ；３０秒間を４０サイクル）。

　マウスＲＰＳ２５遺伝子の発現評価で用いた遺伝子特異的プローブ一覧
　ｍｏｕｓｅ　Ｒｐｓ２５：　Ｍｍ０２３４２７８３＿ｇ１
　ｍｏｕｓｅ　ＧＡＰＤＨ：　４３５２３３９Ｅ（インターナルコントロール）

　代表例として、表２－１～表２－７に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、上述の方法で求められたマウスＲＰＳ２５ｍＲＮＡの発現比率を表４－１～表４－７に示す（「ｉｎ　ｖｉｖｏ評価」の欄）。この時、陰性対象群において求められたマウスＲＰＳ２５、ＲＮＡの発現比率を１．００とした。表４－１～表４－７における「採材日」は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与してから所定の組織を採取するまでの日数を示している。一般にｍＲＮＡの発現が抑制されるとその後のタンパク質への翻訳等も抑制されると考えられるため、上記発現比率が０．８０以下の場合、マウスＲＰＳ２５遺伝子の機能を調節することが可能な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであると判断できる。なお、表４－１～表４－７に列挙されている一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合する標的領域は、ヒトＲＰＳ２５遺伝子とマウスＲＰＳ２５遺伝子との間で配列が保存されている領域である。

　≪ヒト神経芽細胞腫株におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ発現抑制≫
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト神経芽細胞腫株におけるＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ　ｍＲＮＡ発現抑制効果を評価した。アンチセンスオリゴで処理しない細胞株をコントロールとした。ヒト神経芽細胞腫株として、ＫＥＬＬＹ細胞（ＥＣＡＣＣ社、ＥＣ９２１１０４１１－Ｆ０）を用いた。各アンチセンスオリゴヌクレオチドを市販のトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、リポフェクトアミン３０００）を用いてＫＥＬＬＹ細胞に取り込ませ、ｑＲＴ－ＰＣＲ法にてｍＲＮＡの発現量を測定し、ノックダウン活性（ｍＲＮＡの発現抑制）を調べた。以下に具体的な手順を示す。

　対数増殖期のＫＥＬＬＹ細胞を２．０×１０^４個／ウェルにて、９６ウェルプレートのウェル（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ－１６４０））中に播種した。２４時間後、各アンチセンスオリゴヌクレオチドをウェル内に添加し、２４時間インキュベートした（培地中でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの終濃度：１ｎＭ又は１０ｎＭ）。

　インキュベート後、細胞を回収し、ＲＮＡ抽出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＭａｇＭＡＸ　ｍｉｒＶａｎａ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を用いて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。当該ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型として、核酸増幅反応用試薬（ＱＩＡＧＥＮ社、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ　Ｐｒｏｂｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔ）を用いて逆転写反応とＰＣＲ増幅反応を行った。核酸増幅反応は、４５℃、１０分→９５℃、５分→［（９５℃、５秒→６０℃、３０秒）×４０サイクル］の温度サイクリングで行った。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のβアクチン（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＡＣＴＢのｍＲＮＡ量に対するＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳのｍＲＮＡ量をΔΔＣｔ法によって評価した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ量は、オリゴヌクレオチド無処理細胞のｍＲＮＡ量を１とした場合の相対値にて示した。

　用いたプライマーセットは、下記のとおりである：（ＰＴＥＮ検出用プライマーセット）ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｈｓ０１３７２９５７＿ｍ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（ＡＣＴＢ検出用プライマーセット）ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）

　結果を表４－８に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを取り込んでいない細胞（無処理細胞、「コントロール」）を１としたときに、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞ではＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳ遺伝子のノックダウン（ｍＲＮＡの発現抑制）を示すことが確認された。

≪ヒト子宮頸癌由来ＨｅｌａＳ３細胞株におけるアンチセンスヌクレオチドによるカスパーゼ３／７活性評価≫
　以下の手順で、カスパーゼ３／７の活性を評価した。ヒト子宮頸癌由来Ｈｅｌａ細胞株として、ＨｅｌａＳ３細胞（ＡＴＣＣ社、ＣＣＬ－２．２）を用いた。各アンチセンスオリゴヌクレオチドを市販のトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、リポフェクトアミン３０００）を用いてＨｅｌａＳ３細胞に取り込ませ、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ　３／７　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてカスパーゼ３／７活性を調べた。以下により具体的な手順を示す。

　まず、対数増殖期のＨｅｌａＳ３細胞を２．０×１０^４個／ウェルにて、９６ウェルプレートのウェル（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に播種した。２４時間後、各アンチセンスオリゴヌクレオチドをウェル内に添加し（培地中でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの終濃度：３、１０、３０、１００、または３００ｎＭ）、２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を回収し、キットを用いてカスパーゼ３／７活性を調べた。各アンチセンスオリゴヌクレオチドによる活性値は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを取り込んでいない細胞（無処理細胞、「コントロール」）の活性値を１００とした場合の相対値にて示した。

　結果を表５に示す。表５の結果から、親配列の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド）に比べて、５’－ＣＰを導入した配列の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（第二のアンチセンスオリゴヌクレオチド）においてカスパーゼ３／７活性の上昇が抑制されており、細胞毒性が低減していることが確認された。

　以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。

　今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味、および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims

　第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づいて、第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程を含む、
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法であって、
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　　ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、前記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域とを含み、
　　前記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　　前記３’ウイング領域及び前記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　　塩基長は、１２～３０ｍｅｒである、
　アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
　　ギャップ領域、３’ウイング領域及び５’ウイング領域の塩基配列が、前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　３’ウイング領域及び５’ウイング領域の核酸の糖部の構造が、前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一であり、
　　前記ギャップ領域に少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、遅発性中枢毒性が低減されている、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、前記ギャップ領域は、５’－ＣＰ核酸を含まず、
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、前記ギャップ領域の５’－ＣＰ核酸以外の糖部の構造が前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記ギャップ領域の塩基数は、５～２０ｍｅｒであり、
　前記３’ウイング領域は、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　前記５’ウイング領域は、３～５ｍｅｒの、２’位に置換基を有する修飾核酸である、請求項１又は請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　塩基長は、１５～３０ｍｅｒである、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記ギャップ領域に配置されるシトシンが、５－メチルシトシンである、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記３’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、
　前記５’ウイング領域における前記２’位に置換基を有する修飾核酸は、２’－ＭＯＥ核酸、ＬＮＡ、ＡｍＮＡ、ＧｕＮＡ、及びｓｃｐＢＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　塩基配列におけるＧＣの比率が０．２～０．６である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第一のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドが一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸は、前記ギャップ領域の５’側から数えて２番目に少なくとも配置されている、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸は、前記ギャップ領域に２個以上配置されている、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸は、前記ギャップ領域に２～５個配置されている、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸は、前記ギャップ領域の少なくとも１か所において連続して２～４ｍｅｒ配置されている、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域に対して９分の１以上配置されている、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸が、前記ギャップ領域に対して５分の１以上配置されている、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸は、前記ギャップ領域における５’末端側に配置されている、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、
　前記５’－ＣＰ核酸は、前記ギャップ領域における５’末端側及び３’末端側に配置されている、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、
　ホスホロチオエート結合の割合が５０％～８０％である、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシド間結合において、
　ホスホロチオエート結合の割合が５０％～７０％である、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　前記５’－ＣＰ核酸と、前記５’－ＣＰ核酸の３’側に隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合である（ただし、前記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合を除く）、請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
前記５’－ＣＰ核酸と、前記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホロチオエート結合である（ただし、前記５’－ＣＰ核酸がギャップ領域の３’末端に配置されている場合と前記５’－ＣＰ核酸の３’側で隣接しているヌクレオシドが５’－ＣＰ核酸である場合を除く）、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　前記５’－ＣＰ核酸と、前記５’－ＣＰ核酸の５’側で隣接しているヌクレオシドとの結合が、ホスホジエステル結合である、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数が５個以上である、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基の数は、５～１０個である、請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するギャップ領域において、
　糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボース（ただし、５’－ＣＰ核酸は含まない）で構成される塩基は、５～１０個連続して配置されている、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法。
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩の製造方法であって、
　請求項１～請求項２４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法によって、前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程と、
　前記第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する工程とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩の製造方法。
　遅発性中枢毒性が低減されているアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
　前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドがリン酸基及び／又は修飾リン酸基で結合されており、
　前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域と、前記ギャップ領域の３’末端に結合している３’ウイング領域と、前記ギャップ領域の５’末端に結合している５’ウイング領域と、を含み、
　前記ギャップ領域は、糖部が修飾された核酸を含んでいてもよいデオキシリボースから構成される核酸であり、
　前記ギャップ領域は、少なくとも１つの５’－ＣＰ核酸を含み、
　前記３’ウイング領域及び前記５’ウイング領域は２’位に置換基を有する修飾核酸であり、
　前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、１２～３０ｍｅｒである、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩。
　請求項２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
　前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
　前記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、核酸、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる、アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩。
　請求項２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は、請求項２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を含む、疾患の治療剤であって、
　前記治療剤は、中枢神経系に曝露されるように投与するように用いられる、治療剤。
　請求項２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は、請求項２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を含む、疾患の治療剤であって、
　前記治療剤は、遅発性中枢毒性に敏感な対象に投与される、治療剤。
　請求項２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は、請求項２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を含む、疾患の治療剤であって、
　前記疾患は、中枢神経系の疾患である、治療剤。