WO2023199694A1 - マイクロ分析チップ - Google Patents

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啓司 宮▲崎▼
淳 三浦
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風花 榎戸
正典 田中
慎 深津
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Definitions

  • the present invention relates to a microanalysis chip in which a microchannel is formed inside a porous base material, an electrolyte concentration measurement system using the microanalysis chip, and an electrolyte concentration measurement method.
  • microchannel devices that utilize micro-sized microchannels to perform biochemical analyzes efficiently (small amounts, quickly, and easily) within a single chip has been an important part of biochemical research. It is attracting attention in a wide range of fields, including medicine, drug discovery, healthcare, the environment, and food.
  • paper-based paper microanalysis chips use inexpensive materials such as paper as the base material and utilize the capillary phenomenon of the paper itself to transfer specimens and test liquids without using electricity. Because it can be driven, it is small, low cost, easy to carry, and easy to dispose of (disposal is completed just by burning it). Also, since it does not require large-scale equipment, anyone can easily use it as a POC (point of care). It becomes possible to realize inspection and diagnosis at low cost. Therefore, it is expected to be used all over the world as a testing device for medical activities in developing countries and remote areas where medical facilities are lacking, as well as at disaster sites, and at airports and other locations where the spread of infectious diseases must be stopped at the border. It is also attracting attention as a healthcare device that can manage and monitor one's own health condition, and as a device for various pathological diagnosis in regular medical settings.
  • Electrolyte measurement is one of the biochemical tests in the pathological diagnosis, and electrolyte measurement is a test that measures ion concentrations (Na + , K + , Cl ⁇ , etc.) in blood and urine.
  • electrolyte measurement is a test that measures the ⁇ ion concentration balance in the body.'' The ion concentration in the body reflects the water content and pH in the body, and it is important that it is properly controlled in order to maintain normal functioning of nerve transmission, heart, and muscles, and to maintain life.
  • Non-Patent Document 1 proposes a filter paper-based measuring device for the concentration of Na ions and K ions.
  • This device has a dispensing section for dispensing a sample, and the dispensed sample permeates from the dispensing section into the regions of the working electrode and the reference electrode, thereby electrically connecting both electrodes. , potential difference measurement becomes possible.
  • KCl ion crystals are deposited on the reference electrode, and when KCl is dissolved into the sample during measurement, the Cl ions in the reference electrode area are concentrated at a high concentration. to obtain a stable reference electrode potential.
  • an ion-selective membrane formed to cover the working electrode selects only the ions to be measured, making it possible to measure them without being affected by other ions.
  • Patent Document 1 discloses a method for obtaining a stable potential at the reference electrode by dispensing a sample into the working electrode and simultaneously dispensing a saturated solution of KCl or NaCl as a standard solution into the reference electrode. ing.
  • An object of the present invention is to provide a microanalysis chip in which an electrolyte layer is placed at an appropriate position, exhibits an appropriate reference electrode potential, and is capable of performing stable analysis.
  • the present invention is a microanalysis chip having a channel region surrounded by a channel wall provided inside a porous base material,
  • the flow path region has a first flow path chamber, a second flow path chamber, and a flow path connecting the first flow path chamber and the second flow path chamber,
  • a reference electrode is arranged in the first channel chamber,
  • a working electrode is arranged in the second channel chamber,
  • the present invention relates to a microanalysis chip, characterized in that an electrolyte is disposed upstream of the reference electrode with respect to the traveling direction of the specimen in the flow path region.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of a reference electrode and a working electrode. Potential change versus Na + concentration. Graph of potential change versus Na + concentration between reference and working electrodes.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating the configuration of a conventional example.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating the configuration of a conventional example.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating a phenomenon caused by a configuration of a conventional example.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating a phenomenon caused by a configuration of a conventional example.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating the configuration of a conventional example.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating the configuration of a conventional example.
  • FIG. 2 is a configuration diagram in which an ion selective membrane is provided on the surface of a reference electrode. Potential change versus Na + concentration.
  • FIG. 3 is a configuration diagram of another reference electrode.
  • FIG. 3 is a configuration diagram of another reference electrode.
  • the role of the reference electrode is to serve as a reference potential for the potential generated at the working electrode. Therefore, the reference electrode must always exhibit the same potential, no matter what concentration of sample is present. If the reference electrode potential is not stable, the potential difference between the reference electrode and the working electrode will be inaccurate.
  • Ag/AgCl is often used for the base electrode of the reference electrode.
  • Ag/AgCl the following equilibrium reaction occurs at the interface with the specimen, and the potential is determined by the concentration of Cl - .
  • FIG. 2B shows the measurement results of the potential when the NaCl solution was directly dispensed onto the Ag/AgCl electrode 3 using the channel of the microanalysis chip while changing the concentration of NaCl (Cl ⁇ concentration).
  • a commercially available electrode 5 is placed on one side, and the Ag/AgCl electrode 3 and the commercially available electrode 5 are connected with a NaCl solution, and the potential between the electrodes at that time is measured, and the change in NaCl concentration is measured. The change in potential was plotted.
  • the potential of the Ag/AgCl electrode decreases.
  • concentration close to saturation approximately 5.2 mol/L at a temperature of 25°C
  • NaCl will no longer dissolve, so the Cl - concentration will become constant and the equilibrium reaction will stop.
  • the potential will no longer change.
  • the amount of electrolyte arranged in the examples described later is also the amount assuming 25°C.
  • the design may be made in accordance with the use environment, and the configuration (electrolyte amount) is not limited to a temperature of 25°C.
  • internal liquid type reference electrodes usually use saturated KCl or NaCl as the internal liquid, and solid electrode types use this saturated liquid as the standard solution using Ag/AgCl.
  • a method is used to ensure a stable reference electrode potential by dispensing directly to the electrode.
  • Non-Patent Document 1 As shown in FIGS. 7A and 7B, a supporting electrolyte membrane (an interface between the sample and the Ag/AgCl electrode) provided on the reference electrode (Ag/AgCl electrode) An electrolyte layer 3a is laminated on the electrolyte layer 3a (provided to further stabilize the contact potential in the electrolyte) 9, and the electrolyte layer 3a is dissolved by the sample, and the sample saturated in concentration is supplied to the supporting electrolyte membrane and the Ag/AgCl electrode. A configuration for stabilizing the interfacial potential is described.
  • a sheet having a first channel chamber, a second channel chamber, and a channel connecting the first channel chamber and the second channel chamber was prepared.
  • a reference electrode (Ag/AgCl electrode) 3 is placed in the first channel chamber of this sheet, a supporting electrolyte membrane 9 is laminated on the electrode, and an electrolyte layer (KCl layer) 3a is further layered on the supporting electrolyte membrane 9. They were laminated, and a commercially available electrode 5 was installed in the second channel chamber to create a microanalysis chip.
  • KCl solutions with varying concentrations are dropped as a sample into the channel connecting the Ag/AgCl electrode and a commercially available electrode, and the potential difference between the Ag/AgCl electrode and the reference electrode is measured. did.
  • the KCl solution was varied in concentration from 10 ⁇ 4 to 800 mmol/L.
  • the results of the test are shown in Figure 8C. Originally, the potential of the Ag/AgCl electrode should remain constant even if the concentration of the specimen was changed, but the variation in potential became nearly 15 mV.
  • the sample that reaches the electrolyte layer first dissolves the electrolyte and comes into contact with the Ag/AgCl electrode with the Cl ⁇ concentration saturated, but it is washed away by the sample that flows later ( Figures 8A and 8B). ).
  • the sample flowing later comes into contact with the Ag/AgCl electrode in a state where the concentration of Cl - is not saturated because the electrolyte has already been dissolved and is no longer present (or has been washed away). Therefore, it is thought that both the sample with a saturated Cl - concentration and the sample with an unsaturated concentration come into contact with the Ag/AgCl electrode at the same time, making the potential unstable.
  • FIG. 9B is a cross section taken along the dotted line in FIG. 9A.
  • the microanalysis chip of the present invention is characterized in that an electrolyte is disposed upstream of the reference electrode with respect to the traveling direction of the specimen in the flow channel region, and the Cl ⁇ concentration of the specimen is saturated.
  • the potential of the reference electrode is stabilized by stably contacting the reference electrode.
  • the reference electrode is placed downstream of the position where the electrolyte is dissolved by the sample flowing through the flow path, and the electrolyte concentration in the sample reaches a concentration close to saturation (88% of the saturation concentration). It is preferable to have a configuration in which a desired amount of electrolyte is placed at a position where the upstream end is present. Note that "88% of the saturated concentration" corresponds to about 4.6 mol/L in a NaCl solution whose saturation is 5.2 mol/L.
  • the microanalysis chip of the present invention has a third channel chamber in which a working electrode is arranged, in addition to the first channel chamber and the second channel chamber, and these are connected by a channel. It's okay. Note that the number of channel chambers arranged on the microanalysis chip is not particularly limited.
  • Example 1 will be described using FIG. 1A, FIG. 1B, and FIG. 1C to FIG. 6.
  • FIG. 5A shows the microanalysis chip of Example 1. It has a channel region 1 surrounded by a channel wall 2 provided inside a porous base material.
  • the flow path region 1 has a first flow path chamber 12, a second flow path chamber 13, and a flow path connecting the first flow path chamber 12 and the second flow path chamber 13, and the flow path includes a dispensing section 11. exists.
  • a reference electrode 3 is arranged in the first channel chamber 12, and an electrolyte layer 3a is arranged upstream of the reference electrode 3 with respect to the traveling direction of the specimen (that is, the dispensing part 11 side is upstream). has been done. By arranging the electrolyte layer 3a upstream of the reference electrode, the electrolyte concentration in the sample stably reaches the reference electrode in a saturated state.
  • a working electrode 6 is arranged in the second channel chamber 13, and the working electrode 6 is composed of a base electrode 6b and an ion selection membrane 6a provided to cover the base electrode 6b.
  • the channel formation was performed by the method described in (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2021-37612). Specifically, a desired flow path pattern is formed on a filter paper in an unfixed state using an electrophotographic method using flow path forming particles (toner) that are characterized by meltability, and then heated in an oven or heater. By infiltrating the channel pattern into the paper, a channel pattern was formed.
  • the formed channel pattern is as shown in FIG. 1B, where numeral 1 is a "channel” and numeral 2 is a "channel wall.”
  • a reference electrode and a working electrode are formed in the channel pattern by screen printing, an inkjet device, a dispenser, or the like. Since this patent is an invention related to a reference electrode, the configuration thereof will be mainly explained with reference to the reference electrode.
  • an Ag/AgCl electrode is printed as a reference electrode on the flow path pattern by screen printing, and further, FIGS. 1A and 1C (the cross-sectional view taken along the dotted line in FIG. 1A is FIG. 1C).
  • an electrolyte NaCl or KCl
  • an inkjet device or a dispenser was printed using an inkjet device or a dispenser on the flow path and at a position upstream of the Ag/AgCl electrode with respect to the traveling direction of the specimen.
  • the concentration of the electrolyte (Cl 2 ⁇ concentration) in the specimen becomes saturated, and in this state, the specimen reaches the reference electrode (Ag/AgCl electrode). As a result, the potential of the reference electrode (Ag/AgCl electrode) is stabilized.
  • chlorides are preferred, particularly sodium chloride (NaCl) or potassium chloride (KCl), which are easy to handle.
  • NaCl sodium chloride
  • KCl potassium chloride
  • the electrolyte (NaCl) is placed on the flow path in front of the reference electrode at a concentration of 3.0 x 10 2 g/L or more, preferably 3.4 x 10 2 g/L or more, per 1 L of sample amount supplied to the reference electrode. It was arranged in layers like this. This is the value obtained by dividing the amount of NaCl required for saturation by the amount of sample supplied to the reference electrode, since the saturation concentration of the electrolyte also depends on the amount of sample. If 3.0 x 10 2 g/L or more of NaCl is placed per 1 L of the sample amount supplied to the reference electrode, the concentration of the sample passing through the NaCl layer will be 4.6 mol/L or more, reaching saturation at 25°C.
  • the concentration is close to , stable measurements are possible.
  • 3.4 ⁇ 10 2 g/L or more of NaCl is placed.
  • the concentration of the specimen that has passed through the NaCl layer becomes almost the saturation concentration (5.2 mol/L), and the concentration of Cl ⁇
  • the concentration is sufficient to maintain a nearly saturated state.
  • the upper limit is not particularly defined, since NaCl may overflow from the flow path when applying NaCl, it is appropriate to set it to 5.6 ⁇ 10 2 g/L or less.
  • the amount of the sample supplied to the reference electrode should be 3.0 ⁇ 10 2 g/L or more, preferably 3.4 ⁇ 10 2 g/L or more, per 1 L of the sample amount supplied to the reference electrode.
  • An electrolyte may be used.
  • the concentrations of the specimens are respectively 3.6 mol/L or more and about 4.2 mol/L (saturation concentration), which are at or near the saturated concentration of the KCl solution.
  • the amount of sample supplied to the dispensing section has an appropriate amount depending on the size and performance of each device, and is generally about 10 ⁇ L to 50 ⁇ L.
  • the size of the reference electrode is 3 mm x 3 mm
  • the size of the working electrode is 3 mm x 3 mm
  • the thickness of the paper is 200 ⁇ m
  • the entire channel, including the volume of the channel between them is The volume of the electrode is approximately 3.6 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 (3.6 ⁇ L) (1.8 ⁇ L each for the reference electrode and working electrode). Therefore, about 10 ⁇ L of the sample is enough to supply the sample to the reference electrode and the working electrode.
  • the required sample volume will increase, but since the sample is based on human blood or urine, a smaller amount is preferable, and is generally 50 ⁇ L or less.
  • the present invention does not depend on the size of the device or the amount of sample required, for the above reasons, the sample amount will be described in the range of about 10 ⁇ L to 50 ⁇ L.
  • the amount of sample supplied to the reference electrode 3 is approximately 5 ⁇ L.
  • the electrolyte layer 3a was arranged so that the S portion in FIG. 1A had a saturated concentration. In this case, the electrolyte concentration in the sample becomes 88% or more of the saturation concentration when the entire amount of the placed electrolyte is dissolved. Therefore, between the electrolyte layer 3a and the base electrode 3 in FIGS.
  • the electrolyte concentration in the sample is 88% or more of the saturation concentration. Therefore, in this configuration, "the electrolyte is arranged at a position where the upstream end of the reference electrode is located downstream of the position where the electrolyte concentration in the sample is 88% or more of the saturation concentration. "There is”.
  • the amount of sample supplied to the reference electrode is 5 ⁇ L
  • a NaCl concentration of 4.6 mol/L or more can be obtained. Therefore, when NaCl is placed in a 3 mm x 3 mm area with a thickness of 200 ⁇ m, if NaCl is placed in an amount of 8.3 x 10 5 g/m 3 or more per unit volume of the NaCl placement area, it will pass through the NaCl layer.
  • the NaCl concentration of the sample becomes 4.6 mol/L or more, a value close to saturation.
  • the concentration will be close to the saturation concentration (about 5.2 mol/L) of the sample that has passed through the NaCl layer, and Ag The concentration is sufficient to bring the /AgCl electrode into equilibrium. Note that in specifying the concentration of the solution in which NaCl is dissolved in the specimen, it is necessary to take into consideration the specific gravity of the solution, and the above NaCl concentration is a value that takes this into consideration.
  • the NaCl placement area is 4.2 x 10 6 per unit volume of the NaCl placement area. If NaCl of g/m 3 or more is placed, the NaCl concentration of the sample passing through the NaCl layer will be 4.6 mol/L or more. In order to bring the NaCl concentration of the sample that has passed through the NaCl layer to almost a saturation concentration (approximately 5.2 mol/L), 4.7 x 10 6 g/m 3 or more of NaCl should be placed per unit volume of the NaCl placement area. Bye.
  • the NaCl placement area is 1.7 x 10 5 g per unit volume of the NaCl placement area. If NaCl of /m 3 or more is placed, the NaCl concentration of the sample passing through the NaCl layer will be 4.6 mol/L or more. In order to bring the NaCl concentration of the sample that has passed through the NaCl layer to almost the saturation concentration (approximately 5.2 mol/L), 1.9 x 10 5 g/m 3 or more of NaCl should be placed per unit volume of the NaCl placement area. Bye.
  • the specimen When the specimen reaches the arranged electrolyte (NaCl) layer 3a, it moves toward the reference electrode (Ag/AgCl electrode) 3 while dissolving the arranged electrolyte (NaCl). At this time, the concentration of Cl- in the sample that has passed through the electrolyte (NaCl) layer is always maintained at or near saturation, and this saturated sample is continuously supplied to the reference electrode (Ag/AgCl electrode). Therefore, a stable potential can be obtained.
  • the reference electrode 3 and the electrolyte layer 3a are not in contact with each other, but the electrolyte layer 3a may be in contact with the reference electrode 3 or may overlap with the reference electrode 3.
  • the important point is that the analyte reaches the reference electrode 3 after the concentration of electrolyte in the analyte has become saturated.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the reference electrode potential using samples in which the electrolyte (NaCl) concentration was varied from 10 ⁇ 5 mol/L to 1 mol/L.
  • a commercially available electrode 4 is placed instead of the working electrode on one side of the microanalysis chip where the working electrode is originally formed, as in the case of FIGS. 2A and 2B. and a reference electrode were connected to the specimen, and the potential difference between the two electrodes was measured.
  • a working electrode which is an ion-selective electrode
  • a sample was dispensed, and the potential between it and the reference electrode was measured.
  • the sample used was a solution having an electrolyte (Na + ) concentration of 10 ⁇ 5 mol/L to 1 mol/L, to which interfering ions were added (in the case of K + , KCl was about 5 mmol/L).
  • electrolyte (Na + ) concentration 10 ⁇ 5 mol/L to 1 mol/L, to which interfering ions were added (in the case of K + , KCl was about 5 mmol/L).
  • ion-selective electrode As the working electrode (ion-selective electrode), a solid contact type ion-selective electrode was used, in which an ion-selective membrane having selectivity for target ions was laminated on a base electrode. In this example, an ion selective electrode with Na + as the target ion was used.
  • the base electrode may be selected according to the required characteristics of the device such as cost and performance, and in this example, an Ag/AgCl electrode was used as the base electrode.
  • the ion-selective membrane may be one that is commonly used, and a membrane that is sensitive to the target ions and has sufficient selectivity to interfering ions may be used.
  • a membrane that is sensitive to the target ions and has sufficient selectivity to interfering ions may be used.
  • materials used in ion selective membranes 12-crown-4-ether with a crown ether structure is exemplified as an ionophore, sodium tetraphenylborate (NaTPB) is exemplified as an anion remover, and as a plasticizer.
  • Examples include NPOE and DOS, and examples of the polymer agent include PVC alone and a copolymer of vinyl chloride and vinyl acetate.
  • each component is mixed, dissolved or dispersed in a solvent such as THF or cyclohexanone, and the resulting liquid is applied using an inkjet method onto a base electrode (Ag/AgCl electrode) laminated with an intermediate layer such as NaCl.
  • a solvent such as THF or cyclohexanone
  • the coating method is not limited to the inkjet method, and the ion selective membrane may be laminated on the base electrode after adjusting the viscosity of the solution according to each printing method such as dispenser or screen printing.
  • the potential on the reference electrode side ( ⁇ ) hardly changes even if the concentration of Na + in the sample changes, and the potential on the ion-selective electrode side ( ⁇ ) changes according to the change in the concentration of Na + . I know that there is.
  • the difference is the potential difference between the reference electrode and the working electrode, and is shown by the ⁇ plot in FIG. 6, confirming that the reference electrode exhibits sufficient stability.
  • the present invention is not limited to a microanalysis chip that uses an Ag/AgCl electrode alone as a reference electrode.
  • a configuration in which Ag/AgCl is used as a base electrode and a supporting electrolyte layer is provided on top of it to stabilize the interfacial potential with the sample and reduce the influence of interfering ions can also be used. good.
  • TBA-TBB tetrabutylammonium tetrabutylborate
  • TDMACl tridedecylmethylammonium chloride
  • PVC polyvinyl ether styrene resin
  • an ion selective membrane 6a was also provided on the reference electrode.
  • a conceivable configuration is to use an ion selective membrane in which the selected ion is Na + and to arrange NaCl as an electrolyte upstream of the reference electrode.
  • the sample dissolves the electrolyte NaCl
  • the sample contains Cl - which has reached a saturation concentration, as well as Na + whose concentration does not change because no further dissolution of NaCl occurs. also exists.
  • a reference electrode ion-selective electrode
  • a stable potential is obtained because the concentration of Na + does not change (FIG. 11B).
  • the electrolyte is not limited to chloride, but may be a hydroxide such as sodium hydroxide (NaOH) if the ion-selective membrane used as the reference electrode is a Na + selective membrane. Just choose the electrolyte that matches the ion.
  • a laminate layer 14 is provided on the front and back surfaces of the reference electrode (FIG. 10).
  • Ag/AgCl electrodes are printed on paper by screen printing, but since the Ag/AgCl paste ink for screen printing has a certain degree of viscosity, it is not printed entirely in the thickness direction of the filter paper. , is printed with some of the filter paper remaining on the back side. Furthermore, in consideration of misalignment due to printing of Ag/AgCl electrodes, printing is performed with a gap of at least 0.2 mm from the channel wall. Therefore, filter paper portions that act as flow channels remain on the left and right sides and below the reference electrode. When the surface of the reference electrode is covered with a laminate layer, the area in which the saturated sample advances is restricted, and it preferentially passes through the filter paper portions remaining on the left, right, and under sides of the Ag/AgCl electrode.
  • the relationship between the electrolyte 3a and the reference electrode 3 according to the present invention is not limited to the arrangement shown in FIGS. 1A to 1C, and may be arranged as shown in FIGS. 12A and 12B, for example.
  • An electrolyte layer (NaCl or KCl) may be disposed upstream of the reference electrode (Ag/AgCl electrode) with respect to the traveling direction of the specimen. Furthermore, even if the contact area between the reference electrode and the specimen is small, if a saturated specimen comes, it can function as a stable reference electrode (FIG. 12B).

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Abstract

安定した分析を行うことができるマイクロ分析チップを提供することを目的とする。多孔質基材の内部に設けられた流路壁で囲まれた流路領域を有するマイクロ分析チップであって、前記流路領域は、第一流路室、第二流路室、及び前記第一流路室と前記第二流路室とを繋ぐ流路を有し、前記第一流路室には参照電極が配されており、前記第二流路室には作用電極が配されており、前記流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、前記参照電極の上流側に電解質が配置されていることを特徴とする。

Description

マイクロ分析チップ
　本発明は、多孔質基材の内部にマイクロ流路を形成したマイクロ分析チップ、該マイクロ分析チップを用いた電解質濃度測定システムおよび電解質濃度測定方法に関するものである。
　近年、マイクロサイズの微細流路を利用して、生化学における分析を１つのチップ内で効率的（微量、迅速、簡便）に行うことができるマイクロ流路デバイスの開発が、生化学の研究、医療、創薬、ヘルスケア、環境、食品など、幅広い分野で注目されている。
　その中でも、紙をベースとしたペーパーマイクロ分析チップは、基材として紙のような安価な材料を用いてかつ、紙自体の毛細血管現象を利用することで、検体や検査液を電力を使わず駆動させることができるため、小型で低コストで、かつ持ち運びが容易で、廃棄性も高く（燃やすだけで廃棄完了）、また大がかりな装置もいらない為、誰でも簡単にＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｅ）による検査診断を低コストで実現することが可能となる。よって、医療設備の整っていない途上国や僻地、ならびに災害現場等での医療活動や、感染症の広がりを水際で食い止めなければならない空港等での検査デバイスとして、世界中で期待されている。又、自身の健康状態を管理・モニタリングできるヘルスケアデバイスや、通常の医療現場における様々な病理診断デバイスとしても注目を集めている。
　上記病理診断における生化学検査の一つとして電解質測定があるが、電解質測定とは、血中や尿中のイオン濃度（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ－等）を測定する検査である。つまり、電解質測定は、「体内のイオン濃度バランス」を測定する検査である。体内のイオン濃度は、体内の水分量やｐＨを反映しており、神経の伝達や心臓、筋肉を正常に働かし、生命を維持するためには、適切にコントロールされていることが重要である。
　又、電解質濃度に変化が生じた場合、腎機能やホルモンのはたらきに異常が発生している可能性が高い等、病気のスクリーニングにも不可欠な検査であり、さらには、災害現場等で、患者の生理機能（生命状態）を確認する上でも、大変重要な検査となっている。
　この電解質測定をμＰＡＤｓで行う研究が様々な大学・企業で行われている。
　非特許文献１では、ＮａイオンおよびＫイオンの濃度に対する濾紙ベースの測定デバイスについて提案されている。このデバイスは、検体を分注するための分注部を持ち、分注された検体が分注部から作用電極および参照電極それぞれの領域へと浸透することによって、両電極を電気的に接続し、電位差測定が可能となる。また前記デバイスでは、参照電極において安定した電位を得るために、ＫＣｌイオン結晶を参照電極上に堆積させており、測定時においてＫＣｌが検体へ溶解することで、参照電極領域のＣｌイオンを高濃度に保持し、安定した参照電極の電位を得る。さらに、作用電極を被覆するように形成したイオン選択膜で測定対象のイオンのみを選択し、他のイオンの影響を受けずに測定できるようにしている。
　また、特許文献１には、検体を作用電極部に分注し、同時に標準液としてＫＣｌやＮａＣｌの飽和溶液を参照電極部に分注することで参照電極において安定した電位を得る方法が開示されている。
特開昭６２－０３９７５８号公報
Ｎｉｐａｐａｎ　Ｒｕｅｃｈａ，　Ｏｒａｗｏｎ　Ｃｈａｉｌａｐａｋｕｌ，Ｋｏｊｉ　Ｓｕｚｕｋｉ　ａｎｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｃｈｉｔｔｅｒｉｏ，"Ｆｕｌｌｙ　Ｉｎｋｊｅｔ－Ｐｒｉｎｔｅｄ　Ｐａｐｅｒ－Ｂａｓｅｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ　Ｉｏｎ－Ｓｅｎｓｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅｓ"，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ　２９，２０１７　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ，８９，ｐｐ．１０６０８－１０６１６
　しかしながら、電解質層（ＫＣｌ層）の配置は極めて難しく、単純にＫＣｌ層が支持電解質やＡｇＣｌ上に積層・配置されているだけでは、参照電極側の電位は安定しない。そのため、同じ濃度の検体でもデバイス間のバラツキが大きくなってしまい、安定した測定結果を得ることが困難になる。この課題は、本願の発明者らの検討により見出されたものである。
　本発明は、電解質層が適切な位置に配置されており、適切な参照電極の電位を示し、安定した分析を行うことができるマイクロ分析チップを提供することを目的とする。
　本発明は、多孔質基材の内部に設けられた流路壁で囲まれた流路領域を有するマイクロ分析チップであって、
　前記流路領域は、第一流路室、第二流路室、及び前記第一流路室と前記第二流路室とを繋ぐ流路を有し、
　前記第一流路室には参照電極が配されており、
　前記第二流路室には作用電極が配されており、
　前記流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、前記参照電極の上流側に電解質が配置されていることを特徴とするマイクロ分析チップに関する。
　本発明により、安定した分析を行うことができるマイクロ分析チップを提供することができる。
参照電極の構成図。 流路パターンの構成図。 参照電極部の断面図。 電位差測定の模式図。 Ｃｌ－濃度に対する電位変化。 参照電極のＣｌ－濃度に対する電位変化の説明図。 参照電極の電位のバラツキを示すグラフ。 参照電極並びに作用電極の構成図。 Ｎａ＋濃度に対する電位変化。 参照電極並びに作用電極間のＮａ＋濃度に対する電位変化のグラフ。 従来例の構成を説明する説明図。 従来例の構成を説明する説明図。 従来例の構成による現象を説明する説明図。 従来例の構成による現象を説明する説明図。 参照電極の電位のバラツキを示すグラフ。 従来例の構成を説明する説明図。 従来例の構成を説明する説明図。 ラミネート層を設けた分析チップの断面図。 参照電極表面に、イオン選択膜を設けた構成図。 Ｎａ＋濃度に対する電位変化。 他の参照電極の構成図。 他の参照電極の構成図。
　本発明の作用を詳しく説明する。
　参照電極の役割は、作用電極で生じる電位に対し、基準電位となるものである。そのため、どんな濃度の検体が来ても、参照電極は常に同じ電位を示す必要がある。参照電極の電位が安定しなければ、参照電極と作用電極との電位差は不正確になる。
　一般的に参照電極のベース電極にはＡｇ／ＡｇＣｌが用いられることが多い。Ａｇ／ＡｇＣｌは、検体との界面で下記のような平衡反応が起こり、Ｃｌ－の濃度によって電位が決まる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　よって、Ｃｌ－濃度を一定にすることで、電位を安定させることができる。
　飽和した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液や塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液においては、Ｃｌ－の濃度が一定なので、飽和したＮａＣｌ溶液やＫＣｌ溶液をＡｇＣｌと反応させていれば、常に同じ界面電位が得られることになる。
　図２Ｂに、マイクロ分析チップの流路を用いて、ＮａＣｌ（Ｃｌ－濃度）の濃度を変えて、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極３に直接ＮａＣｌ溶液を分注した際の電位の測定結果を示す。測定に際しては、図２Ａに示すように、片側に、市販電極５を置き、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極３と市販電極５間をＮａＣｌ溶液で繋ぎ、その際の電極間電位を測定し、ＮａＣｌの濃度変化による電位の変化をプロットした。
　ＮａＣｌの濃度、すなわちＣｌ－濃度を上げていくとＡｇ／ＡｇＣｌ電極の電位は下がっていく。ＮａＣｌの濃度が飽和に近い濃度（温度２５℃の場合、５．２ｍｏｌ／Ｌ程度）に到達すると、ＮａＣｌがそれ以上、溶けることはないので、Ｃｌ－濃度が一定となり、上記平衡反応も止まり、電位もそれ以上変化することはなくなる。尚、測定は、室温（２５℃程度）で行われることが多いと思われるため、以下の説明においては、室温（２５℃程度）での使用を想定し、２５℃での飽和濃度に基づいた設計としている。後述の実施例において配置している電解質量も２５℃を想定した量となっている。しかし、異なる環境での使用が想定される場合には、その使用環境に応じた設計とすればよく、２５℃を想定した構成（電解質量）に限定されるものではない。
　上記した原理を元に、通常、内部液タイプの参照電極では、飽和したＫＣｌやＮａＣｌが内部液として使用されており、また、固体電極型タイプにおいては、標準液としてこの飽和液をＡｇ／ＡｇＣｌ電極に直接分注し、安定した参照電極の電位を確保する手法がとられている。
　しかしながら、それでは検体とは別に、参照液を用意する必要があり、簡易で低コストな検査デバイスであるマイクロ分析チップにおいては、その手間とコストが課題となる。
　その課題を解決するため、非特許文献１では、図７Ａ、図７Ｂに示すように、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）３上に設けられた支持電解質膜（検体とＡｇ／ＡｇＣｌ電極との界面における接触電位をより安定させるために設けられる）９上に、電解質層３ａを積層し、検体によりこの電解質層を溶かし、濃度的に飽和化させた検体を支持電解質膜やＡｇ／ＡｇＣｌ電極に供給し界面電位を安定させる構成が記載されている。
　しかしながら、インクジェットやディスペンサー等の様々な印刷手法で、且つ電解質を様々な濃度およびピッチ間隔にて、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極上もしくは支持電解質膜上に電解質を積層しても、安定した電位を得ることは困難であった。
　この構成において、安定した電位を得ることが困難であることを確認する試験を以下のようにして行った。
　第一流路室、第二流路室、及び第一流路室と第二流路室とを繋ぐ流路を有するシートを用意した。このシートの第一流路室に、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）３を配置し、その電極上に支持電解質膜９を積層し、更に、支持電解質膜９上に電解質層（ＫＣｌ層）３ａを積層し、また、第二流路室には、市販電極５を設置して、マイクロ分析チップを作成した。このマイクロ分析チップにおいて、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極と市販電極とつながっている流路部に、検体として、濃度を変化させたＫＣｌ溶液を滴下し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極と参照電極との間の電位差を測定した。ＫＣｌ溶液は、濃度１０－４～８００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で変化させた。試験の結果を図８Ｃに示す。本来は検体の濃度を変化させても、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の電位は一定でなければならないが、電位のバラツキが１５ｍＶ近くになった。
　電位のばらつきが生じる理由は、次のように考えられる。
　最初に電解質層に到達した検体は電解質を溶解して、Ｃｌ－の濃度が飽和になった状態でＡｇ／ＡｇＣｌ電極と接触するものの、後から流れてくる検体に押し流される（図８Ａ、図８Ｂ）。そして、後から流れてくる検体は、電解質がすでに溶解されて存在しない（或いは、押し流されている）ために、Ｃｌ－の濃度が飽和とならない状態でＡｇ／ＡｇＣｌ電極に接触することになる。そのため、Ｃｌ－濃度が飽和である検体と、飽和になっていない検体との両方が、同時にＡｇ／ＡｇＣｌ電極に接触することになり、電位が不安定になっていると考えられる。
　また、図９Ａ、図９Ｂに示すよう、電解質をしみ込ませた濾紙１０を参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）３もしくは支持電解質膜９上に配置しても、結果は同様であった。図９Ｂは、図９Ａ中の点線部における断面である。
　すなわち、Ｃｌ－濃度が飽和である検体が、安定してＡｇ／ＡｇＣｌ電極に供給されるような構成にしなければ、測定される界面電位が安定しないことが確認された。
　本発明のマイクロ分析チップは、流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、参照電極の上流側に電解質が配置されていることを特徴とし、検体のＣｌ－濃度が飽和になった状態で安定して参照電極に接触することで、参照電極の電位を安定させたものである。
　即ち、本発明のマイクロ分析チップは、流路を流れる検体が電解質を溶解して、検体中の電解質濃度が飽和に近い濃度（飽和濃度の８８％）となる位置よりも下流側に参照電極の上流側端部が存在することとなる位置に、所望量の電解質を配置した構成を有することが好ましい。尚、「飽和濃度の８８％」とは、５．２ｍｏｌ／Ｌが飽和であるＮａＣｌ溶液においては、約４．６ｍｏｌ／Ｌに相当する。
　また、本発明のマイクロ分析チップは、第一流路室および第二流路室以外に、作用電極が配された第三流路室などを有し、それらが流路で繋がっている構成であってもよい。尚、マイクロ分析チップ上に配する流路室の数は、特に制限はされない。
　以下、本発明の例示的な実施形態について図面を参照して説明する。なお、以下の実施形態は例示であり、本発明を実施形態の内容に限定するものではない。また、以下の各図においては、実施形態の説明に必要ではない構成要素については図から省略する。
　＜実施例１＞
　実施例１について、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ～図６を用いて説明する。
　図５Ａが実施例１のマイクロ分析チップである。多孔質基材の内部に設けられた流路壁２で囲まれた流路領域１を有する。流路領域１は、第一流路室１２、第二流路室１３、及び第一流路室１２と第二流路室１３とを繋ぐ流路を有し、該流路には分注部１１が存在する。第一流路室１２には参照電極３が配置されており、検体の進行方向を基準（即ち、分注部１１側が上流となる）として、参照電極３の上流側には、電解質層３ａが配置されている。電解質層３ａを参照電極の上流側に配置することによって、検体中の電解質濃度が飽和になった状態で安定して参照電極に到達する。第二流路室１３には作用電極６が配置されており、作用電極６は、ベース電極６ｂとそれを覆うように設けられたイオン選択膜６ａで構成される。
　流路形成については、（特開２０２１－３７６１２号公報）に記載された方法で行った。具体的には、溶融性に特徴を持つ流路形成用粒子（トナー）を用いて、電子写真方式で、濾紙上に所望の流路パターンを未定着の状態で形成し、その後、オーブンもしくはヒーターにより、流路パターンを紙の内部に浸透させることで、流路パターンを形成した。形成された流路パターンは、図１Ｂに示すとおりであり、符号１が「流路」、符号２が、「流路壁」である。
　次いで、流路パターンに、参照電極並びに作用電極を、スクリーン印刷やインクジェット装置、もしくは、ディスペンサー等により形成する。本特許は参照電極に関わる発明である為、参照電極中心にその構成を説明する。
　図１Ａに示すように、流路パターン上に、参照電極として、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極をスクリーン印刷により印字し、更に、図１Ａおよび図１Ｃ（図１Ａ中の点線に沿った断面図が図１Ｃ）に示すよう、流路上で且つ検体の進行方向に対し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の上流側となる位置に、電解質（ＮａＣｌもしくはＫＣｌ）をインクジェット装置やディスペンサーにより印字した。このような位置に電解質層３ａ（ＮａＣｌもしくはＫＣｌ）を配置することで、進んできた検体は必ず、電解質層３ａを通過することになる。その際、電解質を溶かすことで、検体中の電解質の濃度（Ｃｌ－濃度）が飽和となり、その状態で検体が参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）に到達する。その結果、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電位が安定化される。
　電解質としては、塩化物が好ましく、特に、取り扱いが容易な塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）もしくは塩化カリウム（ＫＣｌ）が好ましい。以下、溶解度の温度依存性がより安定しているＮａＣｌで説明する。
　電解質（ＮａＣｌ）は、参照電極手前の流路上に、参照電極に供給される検体量１Ｌ当たり、３．０×１０２ｇ／Ｌ以上、好ましくは３．４×１０２ｇ／Ｌ以上となるように、層状に配置した。これは、電解質の飽和濃度が検体量にも依存するため、飽和に必要なＮａＣｌ量を、参照電極に供給される検体量で割った値となっている。参照電極に供給される検体量１Ｌ当たり、３．０×１０２ｇ／Ｌ以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体の濃度は４．６ｍｏｌ／Ｌ以上となり、２５℃での飽和に近い濃度となるため、安定した測定が可能となる。好ましくは、３．４×１０２ｇ／Ｌ以上のＮａＣｌを配置することであり、この場合、ＮａＣｌ層を通過した検体の濃度はほぼ飽和濃度（５．２ｍｏｌ／Ｌ）となり、Ｃｌ－の濃度がほぼ飽和した状態を保つのに十分な濃度となる。上限は特に規定されないが、ＮａＣｌを塗工する際、流路からＮａＣｌが溢れてしまう場合があるので、５．６×１０２ｇ／Ｌ以下とすることが適当である。
　尚、電解質がＫＣｌである場合にも、参照電極に供給される検体量１Ｌ当たり、３．０×１０２ｇ／Ｌ以上、好ましくは３．４×１０２ｇ／Ｌ以上となるように、電解質を用いればよい。この場合、検体の濃度はそれぞれ、３．６ｍｏｌ／Ｌ以上、４．２ｍｏｌ／Ｌ程度（飽和濃度）となり、ＫＣｌ溶液の飽和濃度またはそれに近い値となる。
　尚、分注部に供給される検体量は、各デバイスの大きさや性能に伴い適正な量があり、一般的には、約１０μＬ～５０μＬである。例えば、小さいデバイスの一例として、参照電極の大きさが３ｍｍ×３ｍｍ、作用電極の大きさが３ｍｍ×３ｍｍで、紙の厚みが２００μｍの場合、その間の流路の体積も含めて、流路全体の体積は３．６×１０－９ｍ３（３．６μＬ）程度である（参照電極、作用電極各１．８μＬずつ）。そのため、約１０μＬの検体があれば十分に参照電極と作用電極に検体を供給できる。
　デバイスの大きさを大きくすれば、必要検体量は多くなるが、検体は人の血液や尿がベースになるので、少ないほうが好ましく、一般的には５０μＬ以下である。本発明は、デバイスの大きさや必要検体量に依存するものではないが、上記の理由から、検体量の範囲として約１０μＬ～５０μＬでその説明を行うものとする。
　実施例１のマイクロ分析チップの場合、１０μＬの検体を流路領域中央にある分注部１１に分注供給し、その約半分が参照電極３側（図１ＡのＳ部）に供給され、残り半分が作用電極側に供給されるので、参照電極３に供給される検体量は約５μＬとなる。尚、本実施例では図１ＡのＳ部が飽和濃度になる電解質層３ａを配置した。この場合、検体中の電解質濃度は、配置した電解質の全量が溶解した際には飽和濃度の８８％以上の濃度になる。そのため、図１Ａ～図１Ｃにおける電解質層３ａとベース電極３との間では、検体中の電解質濃度は飽和濃度の８８％以上の濃度になっている。よって、本構成は、「検体中の電解質濃度が飽和濃度の８８％以上の濃度となる位置よりも下流側に参照電極の上流側端部が存在することとなる位置に、電解質が配置されている」との構成を満たす。
　例えば、参照電極に供給される検体量が５μＬの場合、１．５ｍｇのＮａＣｌを配置すれば、４．６ｍｏｌ／Ｌ以上のＮａＣｌ濃度が得られる。そのため、ＮａＣｌを３ｍｍ×３ｍｍの領域に厚さ２００μｍで配置する場合には、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり８．３×１０５ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体のＮａＣｌ濃度は４．６ｍｏｌ／Ｌ以上となり、飽和に近い値となる。更に、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり９．４×１０５ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体の飽和濃度（５．２ｍｏｌ／Ｌ程度）に近い濃度となり、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を平衡状態にするには十分な濃度となる。尚、ＮａＣｌが検体に溶解した溶解液の濃度の特定には、溶解液の比重を考慮する必要があり、上記ＮａＣｌ濃度はそれを考慮した値である。
　参照電極に供給される検体量が２５μＬであり、上記の場合と同様にＮａＣｌを３ｍｍ×３ｍｍの領域に厚さ２００μｍで配置する場合には、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり４．２×１０６ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体のＮａＣｌ濃度は４．６ｍｏｌ／Ｌ以上となる。ＮａＣｌ層を通過した検体のＮａＣｌ濃度をほぼ飽和濃度（５．２ｍｏｌ／Ｌ程度）とするためには、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり４．７×１０６ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すればよい。
　また、参照電極に供給される検体量が５μＬであり、ＮａＣｌを６．７ｍｍ×６．７ｍｍの領域に厚み２００μｍで配置する場合には、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり１．７×１０５ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すれば、ＮａＣｌ層を通過した検体のＮａＣｌ濃度は４．６ｍｏｌ／Ｌ以上となる。ＮａＣｌ層を通過した検体のＮａＣｌ濃度をほぼ飽和濃度（５．２ｍｏｌ／Ｌ程度）とするためには、ＮａＣｌ配置領域の単位体積当たり１．９×１０５ｇ／ｍ３以上のＮａＣｌを配置すればよい。
　検体が、配置された電解質（ＮａＣｌ）層３ａに届くと、配置された電解質（ＮａＣｌ）を溶かしながら参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）３の方向に進む。このとき、電解質（ＮａＣｌ）層を通った検体のＣｌ－の濃度は、常に飽和あるいは飽和に近い状態が保たれ、この飽和検体が、継続的に参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）に供給されるため、安定した電位が得られることになる。
　本構成（図１Ａ）では、参照電極３と電解質層３ａとが接していないが、電解質層３ａは参照電極３と接していてもよく、参照電極３の上に重なっていてもよい。重要な点は、検体中の電解質の濃度が飽和になった後に、検体が参照電極３に到達することである。
　電解質（ＮａＣｌ）の濃度を１０－５ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌまで濃度を変化させた検体を用いて、参照電極電位を測定した結果を図３に示す。参照電極の性能だけに注目する為、本来、マイクロ分析チップに作用電極が形成される片側には、図２Ａ、図２Ｂの場合と同様に、作用電極の代わりに市販電極４をおき、市販電極と参照電極を検体で繋ぎ、両極間の電位差を測定した。
　測定の結果、濃度が異なる検体を用いて、得られる電位が一定であることが確認できた。濃度が異なる検体を用いた際のばらつきは０．３ｍＶ程度に収まっていた（図３）。さらに、同様にして作成した複数のマイクロ分析チップを用いて、同じ濃度（１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、図３中〇）で測定しても、ばらつきは約０．２ｍＶに収まることが確認できた（図４）。
　更に、図５Ａに示すように、イオン選択電極である作用電極を片側に配置し、両電極が配置された状態にて、検体を分注し、参照電極との間の電位を測定した。検体としては、電解質（Ｎａ＋）濃度が１０－５ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌであり、これに妨害イオンを添加（Ｋ＋の場合ＫＣｌを５ｍｍｏｌ／Ｌ程度）した溶液を用いた。結果を図５Ｂに示す。
　作用電極（イオン選択電極）には、ベース電極上に、目的イオンについての選択性を持つイオン選択膜を積層した固体接触型のイオン選択電極を用いた。本実施例では、Ｎａ＋を目的イオンとするイオン選択電極とした。
　ベース電極については、Ａｇ／ＡｇＣｌやカーボン、並びにＰＥＤＯＴ／ＰＡＳＳを使った取り組みが提案されており、本発明では特に限定されることなく用いることができる。コストや性能等、デバイスの必要特性に合わせたベース電極を選択すればよく、本実施例では、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極をベース電極とした。
　イオン選択膜としては、一般的に用いられるものであればよく、目的のイオンに対して感度を持ち、且つ妨害イオンに対し十分な選択性を持つ膜を用いればよい。イオン選択膜に使われる材料は、イオノフォアとしては、クラウンエーテル構造をもつ１２－クラウン－４－エーテルが例示され、アニオン除剤としては、テトラフェニルホウ酸ナトリウム（ＮａＴＰＢ）が例示され、可塑剤としては、ＮＰＯＥやＤＯＳが例示され、高分子剤としてＰＶＣ単体や、塩化ビニルと酢酸ビニルとの共重合体が例示される。
　そして、各成分をそれぞれ適量混合し、それらを溶媒であるＴＨＦやシクロヘキサノンに溶解あるいは分散させ、得られた液を、ＮａＣｌ等の中間層を積層したベース電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）上にインクジェット法で塗布することにより、作製できる。また、塗布方法も、インクジェット方式にこだわるものではなく、ディスペンサーやスクリーン印刷等、各印刷方法に合わせて、溶液の粘度を調整した上でベース電極上にイオン選択膜を積層すればよい。
　この試験においては、検体中のＮａ＋の濃度に合わせて、電極間の電位プロファイルが得られることになるが、十分な感度（グラフの傾き）と選択性を示す結果が得られているのがわかる。
　更に、このデバイスを用いて、参照電極と作用電極（イオン選択電極）との間の分注部に、市販の電極をセットし、参照電極と市販の電極間の電位を測定し（図６における□プロット）、また、作用電極（イオン選択電極）と市販の電極間の電位（図６における〇プロット）を測定した。
　参照電極側電位（□）は、検体中のＮａ＋の濃度が変わっても電位がほとんど変化せず、イオン選択電極側の電位（〇）が、Ｎａ＋の濃度の変化に応じて変化していることがわかる。そして、その差分が参照電極と作用電極との電位差であり、図６中、●プロットで示され、参照電極が十分な安定性を発揮していることが確認できた。
　尚、本発明は、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を単体で用いたマイクロ分析チップに限るものではない。非特許文献１にあるように、Ａｇ／ＡｇＣｌをベース電極とし、その上に、検体との界面電位を安定させたり、妨害イオンの影響を低減させたりするための支持電解質層を設けた構成でもよい。例えば、非特許文献１にあるようＴＢＡ－ＴＢＢ（テトラブチルアンモニウムテトラブチルほう酸塩）やＴＤＭＡＣｌ（トリドデシルメチルアンモニウムクロリド）と可塑剤、並びにＰＶＣを其々適量混合し、これらを溶媒であるＴＨＦやシクロヘキサノンに混ぜて作製された溶液を塗布乾燥させて、支持電解質層を形成することができる。
　＜実施例２＞
　本実施例では、図１１Ａに示すように、参照電極にもイオン選択膜６ａを設けた。選択イオンがＮａ＋であるイオン選択膜を用い、参照電極の上流に電解質として、ＮａＣｌを配置する構成が考えられる。この場合、検体が電解質であるＮａＣｌを溶かした際、検体には飽和濃度に達したＣｌ－と共に、同濃度で、かつＮａＣｌの溶解がそれ以上起こらないために、濃度が変化しなくなったＮａ＋も存在する。この検体が、イオン選択膜を設けた参照電極（イオン選択電極）に接触すると、Ｎａ＋の濃度が変化しないので、安定した電位が得られる（図１１Ｂ）。
　この構成の場合、電解質は塩化物に限るものではなく、参照電極に用いたイオン選択膜がＮａ＋の選択膜であった場合、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）のような水酸化物でもよく、目的イオンに合わせた電解質を選択すればよい。
　＜実施例３＞
　実施例１における作用をより有効にするための構成を説明する。
　Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の上流に電解質層（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）３ａを配置する参照電極の構成において、参照電極の表面および裏面にラミネート層１４を設ける（図１０）。
　通常、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極はスクリーン印刷によって紙上に印字されるが、スクリーン印刷用のＡｇ／ＡｇＣｌペーストインクは、ある程度の粘度を持っている為、濾紙の厚み方向に対し全て印字されるわけではなく、裏面側に、ある程度、濾紙の部分を残したまま印字される。また、流路に対しても、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の印字によるズレを考慮し、流路壁から少なくとも０．２ｍｍ程度は隙間を開けて印字される。よって、参照電極の左右や下側には、流路として作用する濾紙部が残っている。参照電極の表面をラミネート層で覆うと、飽和検体が進める領域が制限され、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の左右や下側に残っている濾紙部を優先して通過することになる。
　このような構成をとることにより、制限された流路を通ってきた検体のみが参照電極に接触することとなり、参照電極に接する検体を飽和検体に制限することが容易となる。そのため、出力電位がより安定することになる。
　尚、本発明に関わる電解質３ａと参照電極３との関係は図１Ａ～図１Ｃに示した配置構成に限るものではなく、例えば、図１２Ａ、図１２Ｂに示すような配置でもよい。検体の進行方向に対し、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の上流側に、電解質層（ＮａＣｌやＫＣｌ）が配置されていればよい。また、参照電極と検体とが接触する面積が狭くても、飽和した検体がくれば、安定した参照電極として作用することができる（図１２Ｂ）。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２２年４月１２日提出の日本国特許出願特願２０２２－０６５８９５を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims (11)

  1. 　多孔質基材の内部に設けられた流路壁で囲まれた流路領域を有するマイクロ分析チップであって、
    　前記流路領域は、第一流路室、第二流路室、及び前記第一流路室と前記第二流路室とを繋ぐ流路を有し、
    　前記第一流路室には参照電極が配されており、
    　前記第二流路室には作用電極が配されており、
    　前記流路領域における検体の進行方向を基準としたとき、前記参照電極の上流側に電解質が配置されていることを特徴とするマイクロ分析チップ。
  2. 　該流路を流れる検体が、該電解質を溶解して、該検体中の電解質濃度が飽和濃度の８８％以上の濃度となる位置よりも下流側に参照電極の上流側端部が存在することとなる位置に、該電解質が配置されている請求項１に記載のマイクロ分析チップ。
  3. 　該電解質が、塩化物である請求項１または２に記載のマイクロ分析チップ。
  4. 　該塩化物が、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムである請求項３に記載のマイクロ分析チップ。
  5. 　該電解質が、水酸化物である請求項１または２に記載のマイクロ分析チップ。
  6. 　該電解質の量が、参照電極に供給される検体量１Ｌ当たり、３．０×１０２ｇ／Ｌ以上である請求項４に記載のマイクロ分析チップ。
  7. 　該電解質の量が、参照電極に供給される検体量１Ｌ当たり、３．４×１０２ｇ／Ｌ以上である請求項６に記載のマイクロ分析チップ。
  8. 　該参照電極のベース電極が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極である請求項１～７のいずれか１項に記載のマイクロ分析チップ。
  9. 　該作用電極が、ベース電極の上に、イオン選択膜を重ねたイオン選択電極である請求項１～８のいずれか１項に記載のマイクロ分析チップ。
  10. 　該参照電極が、ベース電極の上に、イオン選択膜を重ねたイオン選択電極である請求項１～９のいずれか１項に記載のマイクロ分析チップ。
  11. 　該参照電極の表面にラミネート層を有する請求項１～１０のいずれか１項に記載のマイクロ分析チップ。
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