WO2024242547A1 - Bio-insecticide a base d'algues rouges pour la lutte contre la cochenille, sa preparation et son utilisation - Google Patents

Bio-insecticide a base d'algues rouges pour la lutte contre la cochenille, sa preparation et son utilisation Download PDF

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WO2024242547A1
WO2024242547A1 PCT/MA2024/050018 MA2024050018W WO2024242547A1 WO 2024242547 A1 WO2024242547 A1 WO 2024242547A1 MA 2024050018 W MA2024050018 W MA 2024050018W WO 2024242547 A1 WO2024242547 A1 WO 2024242547A1
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extract
opuntiae
extracts
insecticidal agent
algae
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PCT/MA2024/050018
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English (en)
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Adil MAZAR
Lamfeddal Kouisni
Nawal MERGHOUB
Mansour SOBEH
Aziz YASRI
Jawhar HAFSA
Mustapha EL BOUHSSINI
Karim EL FAKHOURI
Noamane TAARJI
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Universite Mohammed VI Polytechnique
Original Assignee
Universite Mohammed VI Polytechnique
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/03—Algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides

Definitions

  • the invention relates to the field of prevention and treatment of infestations caused by insect pests such as the cochineal Dactylopius opuntiae (D. opuntiae) on various plant species, in particular Optunia fucus-indica.
  • insect pests such as the cochineal Dactylopius opuntiae (D. opuntiae) on various plant species, in particular Optunia fucus-indica.
  • the present invention firstly relates to an insecticidal agent used in the biological control of the infestation of plant crops by the cochineal Dactylopius opuntiae, comprising an extract or a combination of extracts of red algae.
  • the present invention also relates to a method for producing a bio-sourced insecticide agent against cochineal, namely: D. opuntiae (nymphs and adult females) based on extracts of red algae, in particular of the genus Gelidium or Pterocladia, such as the two species Gelidium. Sesquipedale and Pterocladiella capillacea, for the protection of plants, in particular Opuntia fucus-indica.
  • the plant biomass used for the preparation of the extracts was chosen from a Florideophyceae.
  • the species of macroalgae used for the preparation of the extracts are chosen from the genera Gelidium and Pterocladia.
  • the macroalgae used for the preparation of the extracts according to said invention are either harvested from their natural habitats or cultivated under controlled optimal conditions.
  • the macroalgae used for the preparation of the extracts are collected and washed with sea water or tap water, or more preferably with distilled water.
  • the macroalgae can be dried by any drying method known to those skilled in the art.
  • the drying is carried out in an oven or with hot air.
  • the macroalgae are dried for 6 hours to 6 months, preferably between 1 and 6 days.
  • the drying can be carried out at a temperature which can be from 50 to 90°C.
  • the drying can be carried out at a temperature between 55 and 70°C.
  • the biomass is subsequently subjected to a grinding step.
  • these dried macroalgae are fragmented and ground.
  • a person skilled in the art will be able to determine the ratio (mass (g)/volume (ml)) between the quantity of biomass and the volume of solvents to be used.
  • the ratio varies between 1/2 and 1/1000, preferably from 1/3 to 1/50, more preferably from 1/5 to 1/20.
  • the crushed macroalgae are subjected to a chemical extraction step using a solvent which can be at concentrations of 70% to 100%.
  • the algal extracts obtained are filtered using filters with a porosity of 0.1 to 1 pm (nitrocellulose or PVDF filters) in order to remove any trace of biomass residues.
  • the solvents used to perform the extraction are evaporated using a method which may be a rotavapor or a "speedvac” or any other methods known for drying extracts.
  • the insecticidal agent based on macroalgae extracts is used for its insecticidal activity against the cochineal D. opuntiae, allowing the elimination of the nymph and adult development stages of said insect.
  • the insecticidal agent against the cochineal D. opuntiae, obtained from macroalgae extracts is formulated using concentrations of at least 10%, at least 5%, at least 4%, at least 3%, at least 0.5% of said extract which is the subject of the present invention.
  • the ethanolic extract formula of the macroalgae showed a mortality rate of at least 20%, at least 40%, at least 60%, at least 80% and at least 100% against D. opuntiae nymphs.
  • the ethanolic extract formula showed a mortality rate of at least 20%, at least 40%, at least 60%, at least 80% and at least 100% in adult females of D. opuntiae.
  • this macroalgae extract can be combined with one or more other extracts of macroalgae, microalgae, plants, microorganisms or other type of biomass.
  • Another embodiment consists in combining the macroalgae extract at concentrations of 1 to 15 g/L or more with black soap.
  • the formula may also contain other components that are commonly used in the insecticide industry, namely stabilizers, preservatives, additives, and surfactants.
  • the insecticidal agent composition based on ethanolic extract of red algae, object of said invention is in a liquid form applicable by spraying against the cochineal, or in dry or solid form combined on a support (clays, silicas, diatomaceous earth, waxes, resins, polymers, etc.).
  • the red algae extract used according to the present invention can be solubilized in tap water, distilled water, phosphate buffer or in Tween 80 solutions or in any formulation solvent known to those skilled in the art, with concentrations of 0.1% to 1% (w/w), with or without the use of mechanical dispersion means such as vortex stirring, high shear homogenization or ultrasonication, regardless of the homogenization speed or sonication power.
  • a low energy formulation preparation method may be adopted for the present extract in order to reduce its effective concentration, improve its absorption by biological surfaces of insects and plants and prolong its stability.
  • the algae extract previously concentrated and dried, can be completely solubilized in absolute ethanol at a concentration of 10 to 50 mg/ml, using simple vortex homogenization or with mechanical sonication assistance. By increasing the concentration beyond 50 mg/ml, large particles begin to appear, even using ultrasonication or another homogenization mode, due to the saturation of the solution.
  • the ethanolic solution of algae extract obtained directly after filtration and before evaporation of the solvent, can be used directly for the preparation of said formulation.
  • the extract solution can also be concentrated by a rotavapor or a "speedvac” or other known methods, but this must be stopped before solidification of the extract. Rapid control of the concentration by using an aliquot of ethanolic extract or by controlling the extraction and drying parameters (e.g., solvent/solid ratio, drying time, pressure and temperature) to reach a well-defined concentration, is necessary to control the formulation parameters, as well as the concentration of the algae extract in the final formulations.
  • the algae extract freshly solubilized in ethanol, or obtained directly before evaporation of the solvent, or after slight concentration of the solution, is injected using a syringe needle, with a flow rate of 1 to 10 ml/min, into tap water, distilled water, phosphate buffer or into a black soap solution prepared in said solvents, with gentle stirring with a magnetic bar or by vortexing (e.g., 500 rpm), at a ratio of 5/5 to 1/9 (ethanolic algae extract/aqueous solution).
  • the ethanolic solution of the algae extract can be deposited dropwise on the surface of the aqueous phase, or added all at once, inside or on the surface of the aqueous phase, but in these cases a more powerful agitation (e.g. 2000 rpm) of the water or of the black soap solution must be used to ensure a rapid homogenization of both the organic and aqueous phases.
  • a more powerful agitation e.g. 2000 rpm
  • the concentration of the ethanolic algae solution as well as the ratio of ethanolic algae extract/aqueous solution must be well controlled to control the concentration of the active ingredient in the final formulation.
  • concentration of the organic phase in algae extract or an increase in the ratio of ethanolic algae extract/aqueous solution will increase the concentration of the active ingredient in said formulation.
  • the volume of water lost during evaporation can be restored with water or a black soap solution. Otherwise, a recalculation of the concentration of the algae extract in the system, taking into account the volume remaining after ethanol evaporation, will be necessary.
  • the drying conditions e.g., temperature, time, pressure
  • necessary to reach the desired concentration can be set by the person skilled in the art to avoid recalculating the concentration after each preparation.
  • the prepared formulations can be stored for up to 6 months at 5°C or at room temperature, without risk of aggregation or sedimentation. However, the addition of antimicrobial agent will prevent microbial contamination.
  • Figure 1 Shows the insecticidal activity of the algal extract used alone against the nymphs of the cochineal (D. opuntiae). The effect of the ethanolic algal extract is studied at different concentrations (3, 4 and 5%) after 5 days of its application.
  • Figure 2 Shows the insecticidal activity of the algal extract used against females of the cochineal (D. opuntiae). The effect of the ethanolic algal extract alone is evaluated at different concentrations (3, 4 and 5%) after 8 days of its application.
  • Figure 3 Shows the insecticidal activity of the algal extract used against the nymphs of the cochineal (D. opuntiae). The effect of the ethanolic extract of algae is evaluated at different concentrations (3, 4 and 5%) after treatment with black soap at 15 g/L after 3 and 24 hours of its application.
  • Figure 4 Shows the insecticidal activity of the algal extract used against adult females of the cochineal (D. opuntiae). The effect of the ethanolic algal extract is evaluated at different concentrations (3, 4 and 5%) after treatment with black soap at 15 g/L as a function of time (96, 120, 144, 168 and 192h).
  • Figure 5 Shows the insecticidal activity of the formulations of the algae extract against adult females of the cochineal (D. opuntiae). The effect of the formulation with a concentration of 1.75% in algae extract prepared with water or with 2% black soap is evaluated with or without protective wax at the level of the cladodes, after every 24h for 8 days of its application.
  • Figure 6 Shows the insecticidal activity of the formulations of the algae extract against the nymphs of the cochineal (D. opuntiae). The effect of the formulation with a concentration of 1.75% in algae extract prepared with water or with 2% black soap is evaluated after 4 days of its application.
  • the present invention may be implemented according to several examples.
  • the algae extract used in the examples below was prepared as follows: the macroalgal biomass of the species G. sesquipedale was washed with distilled water, dried in an oven at 60 °C for 5 days, crushed and then stored for later use.
  • the extraction of the insecticide was carried out with ethanol in an ASE 150 solvent-accelerated extractor under the following conditions: temperature of 40 °C, solid/liquid ratio of 1/5 (w/v), extraction time of 15 min and 3 extraction cycles.
  • the extract was separated from the ethanol using a rotary vacuum evaporator.
  • the extracts based on macroalgae of the species Pterocladia were obtained using the same method.
  • Example 1 Evaluation of the insecticidal activity of the algal extract on cochineal nymphs (D. opuntiae).
  • the insecticidal activity of the ethanolic extract of red algae was determined by direct contact application under laboratory conditions at a temperature of 26 ⁇ 2 °C, a relative humidity of 75% and a photoperiod of 14/10 h light/dark.
  • the complete randomized block was adopted as the experimental design with five replicates per concentration for each treatment.
  • Five concentrations of the ethanol extract (3, 4 and 5%) were applied using a 1-litre hand sprayer against D. opuntiae nymphs.
  • Ten first-instar nymphs of D. opuntiae were deposited separately on unsprayed and uninfested cladodes of the same size placed in Petri dishes (9 cm in diameter), including a control treated with water only.
  • Figure 1 shows the effect of ethanolic algal extract on the mortality of D. opuntiae nymphs. The results show that the macroalgal extract has a considerable effect on the nymphs.
  • Application of the algal extract at a concentration of 3% killed 83% of these nymphs, 5 days after treatment. When the concentration used was 4% and 5% the mortality rate increased to 92% and 95%, respectively, 5 days after treatment.
  • Example 2 Evaluation of the insecticidal activity of the algal extract on adult female cochineals (D. opuntiae).
  • Example 3 Evaluation of the insecticidal activity of the algal extract applied after the black soap on the nymphs of the cochineal (D. opuntiae).
  • the insecticidal activity of the ethanolic extract of red algae of the species G. sesquipedale was determined by direct contact application under laboratory conditions at a temperature of 26 ⁇ 2 °C, a relative humidity of 75% and a photoperiod of 14/10 h light/dark. A completely randomized design was adopted using five replicates per concentration for each treatment. Five concentrations of the ethanol extract (3, 4 and 5%) were applied after the application of black soap at 15 g/L using a 1 L hand sprayer against D. opuntiae nymphs.
  • Nymph mortality was recorded at 3 hours and 24 hours after treatment. Two controls were considered, one treated with water only, and the second treated with black soap at 15 g/L.
  • Figure 3 shows a pronounced insecticidal effect of ethanolic extracts on D. opuntiae nymphs. An efficiency that varies considerably depending on the concentration as well as the time after treatment. After only 3h of its application, the combination of 3% ethanolic extract with 15 g/L of black soap caused the mortality of 98% of the nymphs. For the concentrations of ethanolic extracts 4 and 5%, a total mortality was recorded for the nymphs. While the application of water alone showed only a very limited effect (14% mortality) after 24h, while the effect of black soap showed a mortality of about (42%) after 3h of its application at 15 g/L. The treatment with black soap followed by the ethanolic algae extract caused a total mortality of D. opuntiae nymphs, 24h after application.
  • Example 4 Evaluation of the insecticidal activity of the algal extract applied after the black soap on adult female cochineals (D. opuntiae).
  • FIG. 4 shows the insecticidal effect of the ethanolic extract on the mortality of adult females of D. opuntiae. The results obtained show that the concentration of the ethanolic extract as well as the duration of treatment have a significant effect on the mortality of females.
  • the insecticidal effect of the ethanolic extract of algae begins to increase significantly beyond the fourth day after treatment, when its application is preceded by the application of black soap at 15 g/L. This efficiency exceeded 50% mortality of females for the 5% concentration of algae extract.
  • Example 5 Evaluation of the insecticidal activity of formulations based on algal extract on nymphs and adult females of the cochineal (D. opuntiae).
  • Formulations based on the ethanolic extract of algae of the species G. sesquipedale were prepared using the method previously described [From 030 to 041], Ethanolic solutions of 50 mg/mL of the dried extract were injected directly using syringe needles with a ratio of ethanolic algae extract/aqueous solution of 2/8, in distilled water or an aqueous solution of 2% black soap. The injection was carried out with a flow rate of 5 mL/min, under continuous stirring at a speed of 500 rpm, and was extended for 15 min after complete injection of the ethanolic solution. The volume of the final mixture obtained was reduced to 75% of the initial volume of the aqueous phase by concentrating the solution using a rotary evaporator. Formulations were stored at 4°C until use and were warmed in lukewarm water directly before application.
  • Figure 5 shows that the algal extract formulation with the concentration of 1.75% prepared with water has a very pronounced insecticidal effect, which reached a high toxicity of D. opuntiae females without protective layer, exceeding 88%, 8 days after treatment. This new formulation with water only also caused a higher mortality of females protected by wax with a percentage of 84%, 8 days after treatment.
  • Figure 6 shows the insecticidal effect of the two types of formulations on the nymphs of the cochineal D. opuntiae.
  • the formulation of 1.75% seaweed extract prepared with 2% of the black soap caused total mortality of the cochineal nymphs, only 4 days after treatment, followed by the formulation of seaweed extract with water with 86%, only 4 days after application.
  • Biopesticide, Bioinsecticide, Bioherbicide and Biofungicide are Biopesticide, Bioinsecticide, Bioherbicide and Biofungicide.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une composition à base d'extraits de macroalgues rouges comme bio-insecticide pour la prévention et le traitement d'infestations causées par des insectes ravageurs comme la cochenille Dactylopius opuntiae (D. opuntiae). Les espèces de macroalgues peuvent être sélectionnées parmi la classe des Florideophyceae, notamment l'espèce G. sesquipedale, par exemple du genre Gelidium ou Pterocladia, mais ne se limitent pas à celles-ci.

Description

BIO-INSECTICIDE A BASE D'ALGUES ROUGES POUR LA LUTTE CONTRE LA COCHENILLE, SA PREPARATION ET SON UTILISATION
L'invention se rapporte au domaine la prévention et du traitement d'infestations causées par des insectes ravageurs comme la cochenille Dactylopius opuntiae (D. opuntiae) sur diverses espèces végétales, notamment Optunia fucus-indica.
ART ANTERIEUR
[001] Opuntia fucus-indica est une plante populaire au Maroc. Elle a été introduite au Maroc vers la fin du 16 siècle (2017, Silva Fennica, 51(1B), id 1618. 22). La superficie cultivée en figuier de barbarie (cactus) a été estimée à 50 000 ha en 1998. Grâce au plan ambitieux du Maroc vert, la superficie totale a atteint plus de 150000 ha en 2017 dont 40% est concentrée dans le sud-ouest du Maroc (2017, Silva Fennica, 51(1B), id 1618. 22) grâce à sa parfaite adaptation dans les zones arides.
[002] En 2014, des champs entiers du figuier de barbarie dans différentes régions du Maroc ont été ravagés par la cochenille sauvage de cactus Dactylopius opuntiae, dont la propagation a causé une destruction totale de ces cultures, ce qui a provoqué une diminution de la production et des pertes économiques importantes.
[003] L'expansion rapide de la cochenille sauvage a suscité l'intérêt pour des recherches sur des méthodes de contrôle alternatives, puisque la plupart des agriculteurs utilisent des insecticides synthétiques. Au Maroc, des progrès significatifs ont été réalisés dans le développement d'options de lutte intégrée pour contrôler cet insecte dévastateur, dont le recours aux variétés résistantes, l'utilisation des ennemis naturels et le développement de nouveaux biopesticides, qui est devenu une priorité dans le domaine de la recherche, car cette dernière est économiquement faisable, fiable et respectueuse de l'environnement.
[004] Les insecticides chimiques sont connus pour leur grande efficacité dans la lutte contre les insectes et le maladies des plantes et, en même temps, pour le maintien d'un rendement élevé des cultures (2018, Journal of Basic and Applied Sciences, 7(1), 104-110). Cependant, cette solution n'est pas durable à cause de son impact sur la santé humaine et sur l'environnement (2018, Journal of Basic and Applied Sciences, 7(1), 104-110). En effet, après son application, une partie de l'insecticide serait absorbée par la plante et, si elle n'est pas totalement dégradée, celle- ci pourrait être consommée par les humains et/ou les animaux. Une autre partie pourrait persister dans le sol après irrigation et se retrouver dans les nappes phréatiques. Ainsi, la transition vers des produits insecticides biosourcés est actuellement très souhaitable et recherchée.
[005] Dans la littérature, plusieurs extraits d'espèces d'algues rouges ont montré une activité insecticide élevée contre certains insectes. Par exemple, il a été rapporté que les extraits méthanoliques de Jania rubens et de Galaxaura allongées (algues rouges) ont une activité élevée contre le 3e stade larvaire de Culex pipiens L. (Diptera : Culicidae) (2022, Saudi Journal of Biological Sciences, 29(2), 933-940). Un extrait d'acétate d'éthyle de Laurencia nidifica s'est avéré contenir un sesquiterpène halogéné appelé laurinterol qui a une activité insecticide contre le termite Reticulitermes speratus (2017, Rec. Nat. Prod, 11(1), 63-68). Mori et al. (2016), Tetrahedron Letters, 57(32), 3612-3617) ont isolé la palytoxine de Chondria armata, qui a montré une activité mille fois supérieure contre les blattes américaines par rapport à l'acide domoïque, connu pour ses propriétés insecticides. Dans une autre étude, l'enyne cyclique (12E)-cis- maneonene-E a été isolée de Laurencia papillosa (algue rouge, collectée sur la côte saoudienne de la mer Rouge) et a montré un potentiel élevé en tant qu'insecticide naturel contre deux ravageurs, Tribolium confusum et les larves de moustiques Culex pipiens (2011, CLEAN-Soil, Air, Water, 39(8), 787-794).
[006] Cependant, aucune étude n'a été réalisée à ce jour sur la production d'un insecticide à partir de l'espèce Gelidium Sesquipedale (G. S) pour la lutte contre la cochenille qui a ravagé des milliers d'hectares de cactus au Maroc au cours des dernières années.
[007] Pour cette espèce, seules deux publications (brevets : US 2019/0335761 Al, JP 2014091709) mettent en avant son utilisation pour produire un extrait agissant comme éliciteur de la défense des plantes en stimulant des gènes de défense et en produisant des molécules capables de déclencher les mécanismes de résistance des plantes contre les maladies (1999, Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 55(2), 167-182 ; 1994, International Review of Cytology. Academie Press, 148, 1-36).). Ce mécanisme est complètement différent de celui de l'effet insecticide lorsque le produit agit directement sur les insectes. Nulle part, dans les brevets cités en haut ou tout autre document dans la littérature, on ne rapporte ou divulgue l'utilisation d'extraits de l'algue rouge (GS) comme insecticide ou pesticide contre la cochenille Dactylopius opuntiae.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
[008] La présente invention a premièrement pour objet un agent insecticide utilisé dans le contrôle biologique de l'infestation de cultures végétales par la cochenille Dactylopius opuntiae, comprenant un extrait ou une combinaison d'extraits d'algues rouges.
[009] La présente invention concerne également une méthode pour produire un agent insecticide biosourcé contre la cochenille à savoir : D. opuntiae (nymphes, et femelles adultes) à base d'extraits d'algues rouges notamment du genre Gelidium ou Pterocladia comme les deux espèce Gelidium. Sesquipedale et Pterocladiella capillacea, pour la protection des plantes nota m me nt, Opuntia fucus-indica.
MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION
[010] Dans un premier mode de réalisation, la biomasse végétale utilisée pour la préparation des extraits a été choisie parmi une Florideophyceae.
[011] Selon un deuxième mode de réalisation, les espèces de macroalgues utilisées pour la préparation des extraits sont choisies parmi les genres Gelidium et Pterocladia.
[012] Dans d'autres modes de réalisation, les macroalgues utilisées pour la préparation des extraits selon ladite invention sont soit récoltées de leurs habitats naturels, soit cultivées sous des conditions optimales contrôlées.
[013] Dans un autre mode de réalisation, les macroalgues utilisées pour la préparation des extraits sont collectés et lavés avec de l'eau de mer ou l'eau de robinet, ou plus préférablement avec de l'eau distillée. [014] Dans un autre mode de réalisation, les macroalgues peuvent être séchées par toute méthode de séchage connue de l'homme du métier. Avantageusement, le séchage est réalisé dans l'étuve ou avec de l'air chaud. Selon un mode préféré de réalisation, les macroalgues sont séchées pendant 6h à 6 mois, de préférence entre 1 et 6 jours. [015] Selon un autre mode de réalisation, le séchage peut être réalisé à une température qui peut être de 50 à 90 °C. Avantageusement, le séchage peut être réalisé à une température comprise entre 55 et 70 °C. La biomasse est soumise par la suite à une étape de broyage.
[016] De manière avantageuse, ces macroalgues séchées sont fragmentées et broyées. L'homme du métier saura déterminer le rapport (masse (g)/volume (ml)) entre la quantité de la biomasse et le volume des solvants à utiliser. Avantageusement, le rapport varie entre 1/2 et 1/1000, préférentiellement de 1/3 à 1/50, plus préférentiellement de 1/5 à 1/20.
[017] Dans un autre mode de réalisation, les macroalgues broyées sont soumises à une étape d'extraction chimique en utilisant un solvant qui peut être à des concentrations de 70% à 100%. [018] Dans un autre mode de réalisation, les extraits algales obtenus sont filtrés en utilisant des filtres de porosité de 0,1 à 1 pm (filtres de nitrocellulose ou PVDF) afin d'éliminer toute trace de résidus de biomasse.
[019] Dans un autre mode de réalisation, les solvants utilisés pour faire l'extraction sont évaporés en utilisant une méthode qui peut être un rotavapeur ou un « speedvac » ou toutes autres méthodes connues pour le séchage d'extraits.
[020] Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'agent insecticide à base d'extraits de macroalgues est utilisé pour son activité insecticide contre la cochenille D. opuntiae, permettant l'élimination des stades de développement nymphes et adultes dudit insecte.
[021] Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'agent insecticide contre la cochenille D. opuntiae, obtenu à base d'extraits de macroalgues, est formulé en utilisant des concentrations d'au moins 10%, d'au moins 5%, d'au moins 4%, d'au moins 3%, d'au moins 0.5% dudit extrait objet de la présente invention.
[022] Dans certains modes de réalisation, la formule d'extrait éthanolique des macroalgues a montré un taux de mortalité d'au moins 20%, d'au moins 40%, d'au moins 60%, d'au moins 80% et d'au moins 100% contre les nymphes de D. opuntiae.
[023] Dans certains modes de réalisation, la formule d'extrait éthanolique a montré un taux de mortalité d'au moins 20%, d'au moins 40%, d'au moins 60%, d'au moins 80% et d'au moins 100% chez les femelles adultes de D. opuntiae.
[024] Dans certains modes de réalisation, selon les extraits des espèces de macroalgues objets de cette invention utilisées pour la préparation d'agents insecticide, peuvent être également utilisés contre d'autres insectes ravageurs de plantes (plantations, cultures maraîchères, arbres fruitiers, plantes ornementales, etc.).
[025] Dans d'autres modes de réalisation, cet extrait de macroalgues peut être combiné avec un ou plusieurs autres extraits de macroalgues, microalgues, plantes, microorganismes ou d'autres type de biomasse.
[026] Un autre mode de réalisation consiste à combiner l'extrait de macroalgues à des concentrations de 1 à 15 g/L ou plus avec du savon noir.
[027] Dans certains modes de réalisation, la formule peut également contenir d'autres constituants qui sont couramment utilisés dans l'industrie des insecticides, à savoir les stabilisants, les agents conservateurs, les additifs, et les agents tensio-actifs.
[028] Dans certains modes de réalisation particulièrement avantageux, la composition d'agent insecticide à base d'extrait éthanolique d'algues rouges, objet de ladite invention, est sous une forme liquide applicable par pulvérisation contre la cochenille, ou sous forme sèche ou solide combinée sur support (argiles, silices, terre de diatomée, cires, résines, polymères, etc.).
[029] L'extrait d'algues rouges utilisé selon la présente invention peut être solubilisé dans l'eau de robinet, l'eau distillée, le tampon phosphate ou dans les solutions de Tween 80 ou dans tout solvant de formulation connu de l'homme du métier, avec des concentrations de 0.1% à 1% (w/w), avec ou sans utilisation de moyens de dispersion mécanique comme l'agitation par vortex, l'homogénéisation à taux de cisaillement élevée ou par ultrasonication, indépendamment de la vitesse d'homogénéisation ou la puissance de sonication.
[030] Dans un mode particulier d'utilisation, une méthode de préparation de formulation à faible énergie peut être adoptée pour le présent extrait afin de réduire sa concentration efficace, améliorer son absorption par les surfaces biologiques d'insectes et de plantes et prolonger sa stabilité.
[031] Dans un mode d'application, l'extrait d'algues, préalablement concentré et séché, peut être complètement solubilisé dans l'éthanol absolu à une concentration de 10 à 50 mg/ml, à l'aide d'homogénéisation simple au vortex ou avec assistance mécanique de sonication. En augmentant la concentration au-delà de 50 mg/ml, de grandes particules commencent à apparaître, même en utilisant l'ultrasonication ou un autre mode d'homogénéisation, à cause de la saturation de la solution.
[032] Dans un autre mode d'application, particulièrement avantageux, la solution éthanolique d'extrait d'algues, obtenue directement après filtration et avant évaporation du solvant, peut être utilisée directement pour la préparation de ladite formulation. La solution d'extrait peut être aussi concentrée par un rotavapeur ou un « speedvac » ou autres méthodes connues, mais celle- ci doit être arrêtée avant solidification de l'extrait. Un contrôle rapide de la concentration en utilisant un aliquote d'extrait éthanolique ou en maîtrisant les paramètres d'extraction et de séchage (e.g., rapport solvant/solide, temps, pression et température de séchage) pour atteindre une concentration bien déterminée, est nécessaire pour contrôler les paramètres de formulation, ainsi que la concentration de l'extrait d'algue dans les formulations finales.
[033] L'extrait d'algues fraîchement solubilisé dans l'éthanol, ou obtenu directement avant évaporation du solvant, ou après concentration légère de la solution, est injecté à l'aide d'une aiguille à seringue, avec un débit de 1 à 10 ml/min, dans de l'eau du robinet, l'eau distillée, le tampon phosphate ou dans une solution de savon noir préparée dans lesdites solvants, sous agitation légère avec barreau aimanté ou par vortex (e.g., 500 rpm), à un rapport de 5/5 à 1/9 (extrait éthanolique d'algue/solution aqueuse).
[034] Dans certains modes d'application, la solution éthanolique de l'extrait d'algues peut être déposée goutte-à-goutte sur la surface de la phase aqueuse, ou ajoutée d'un seul coup, à l'intérieur ou sur la surface de la phase aqueuse, mais dans ces cas une agitation plus puissante (e.g. 2000 rpm) de l'eau ou de la solution du savon noir doit être utilisée pour assurer une homogénéisation rapide des deux phases organique et aqueuse.
[035] La concentration de la solution éthanolique d'algues ainsi que le rapport extrait éthanolique d'algue/solution aqueuse doivent être bien maîtrisés pour contrôler la concentration du principe actif dans la formulation finale. Ainsi, une augmentation de la concentration de la phase organique en extrait d'algues ou une augmentation du rapport extrait éthanolique d'algues/solution aqueuse, augmentera la concentration du principe actif dans ladite formulation.
[036] La mixture fraîchement préparée en mélangeant la solution éthanolique d'extrait d'algues avec de l'eau ou une solution du savon noir est agitée pendant 5 à 60 minutes avec la même vitesse sélectionnée durant l'addition de la phase organique, pour assurer une diffusion complète de cette dernière dans la phase aqueuse. En augmentant le rapport extrait éthanolique d'algue/solution aqueuse, une durée d'agitation plus élevée sera nécessaire pour éviter l'effondrement du système et ainsi la formation de grandes particules suspendues dans la phase aqueuse.
[037] L'éthanol présent dans la mixture préparée est complètement éliminé à l'aide d'un rota vapeur ou un « speedvac » ou autres méthodes connues, jusqu'à atteindre 50 à 90% du volume initial de la phase aqueuse ajoutée. Une évaporation prolongée, au-delà de 50% du volume initial de la phase aqueuse, risque de voir s'effondrer le système, en favorisant l'agrégation des particules et leur sédimentation contre les parois de récipient d'évaporation.
[038] Dans un autre mode d'application, le volume d'eau perdu durant évaporation peut être restitué avec de l'eau ou une solution de savon noir. Sinon, un recalcul de la concentration de l'extrait d'algues dans le système, en tenant compte le volume restant après évaporation d'éthanol, sera nécessaire. Les conditions de séchage (e.g., température, temps, pression) nécessaires pour atteindre la concentration souhaitée peuvent être fixés par l'homme de métier pour éviter le recalcul de concentration après chaque préparation.
[039] Les formulations préparées peuvent être stockées jusqu'à 6 mois à 5°C ou à température ambiante, sans risques d'agrégation ou de sédimentation. Toutefois, l'ajout d'agent antimicrobiens permettra d'éviter la contamination microbienne.
[040] Lorsque la formulation est conservée au réfrigérateur, ou à température ambiante au- dessous du point de fusion du savon noir, des particules solides peuvent apparaître dans la formulation à cause de la solidification du savon noir, sans causer aucun risque d'agrégation ou de changement des propriétés physico-chimiques du système. Ainsi, un simple chauffage à l'eau tiède restaura l'aspect initial translucide ou transparent de la formulation en fonction de la concentration du système.
DESCRIPTIFS DES FIGURES
[041] Figure 1 : Montre l'activité insecticide de l'extrait algale utilisé seul contre les nymphes de la cochenille (D. opuntiae). L'effet de l'extrait éthanolique d'algue est étudié à différentes concentration (3, 4 et 5%) après 5 jours de son application.
[042] Figure 2 : Montre l'activité insecticide de l'extrait algale utilisé contre les femelles de la cochenille (D. opuntiae). L'effet de l'extrait éthanolique d'algue seul est évalué à différentes concentration (3, 4 et 5%) après 8 jours de son application.
[043] Figure 3 : Montre l'activité insecticide de l'extrait algale utilisé contre les nymphes de la cochenille (D. opuntiae). L'effet de l'extrait éthanolique d'algue est évalué à différentes concentration (3, 4 et 5%) après le traitement avec le savon noir à 15 g/L après 3 et 24h de son application.
[044] Figure 4 : Montre l'activité insecticide de l'extrait algale utilisé contre les femelles adultes de la cochenille (D. opuntiae). L'effet de l'extrait éthanolique d'algue est évalué à différentes concentrations (3, 4 et 5%) après le traitement avec le savon noir à 15 g/L en fonction du temps (96, 120, 144, 168 et 192h).
[045] Figure 5 : Montre l'activité insecticide des formulations de l'extrait d'algues contre les femelles adultes de la cochenille (D. opuntiae). L'effet de la formulation avec une concentration de 1.75% en extrait d'algue préparée avec de l'eau ou avec du savon noir à 2% est évalué avec ou sans cire protectrice au niveau des cladodes, après chaque 24h pendant 8 jours de son application. [046] Figure 6 : Montre l'activité insecticide des formulations de l'extrait d'algues contre les nymphes de la cochenille (D. opuntiae). L'effet de la formulation avec une concentration de 1.75% en extrait d'algue préparée avec de l'eau ou avec du savon noir à 2% est évalué après 4 jours de son application.
DESCRIPTION DETAILEE DE L'INVENTION
La présente invention peut être implémentée selon plusieurs exemples.
L'extrait d'algues utilisé dans les exemples ci-après a été préparé de la manière suivante : la biomasse macroalgale de l'espèce G. sesquipedale est lavée à l'eau distillée, séchée à l'étuve à 60 °C pendant 5 jours, broyée puis stockée pour des utilisations ultérieures. L'extraction de l'insecticide, est réalisée avec de l'éthanol dans un extracteur accéléré par solvant ASE 150, sous les conditions suivantes : température de 40 °C, rapport solide/liquide de 1/5 (p/v), temps d'extraction de 15 min et 3 cycles d'extraction. A la fin de l'extraction, l'extrait est séparé de l'éthanol à l'aide de l'évaporateur rotatif sous vide. Les extraits à base de macroalgues de l'espèce Pterocladia ont été obtenus selon le même procédé.
Exemple 1 : Evaluation de l'activité insecticide de l'extrait algal sur les nymphes de la cochenille (D. opuntiae).
[048] L'activité insecticide de l'extrait éthanolique d'algues rouges a été déterminée par application par contact direct dans des conditions de laboratoire à une température de 26 ± 2 °C, une humidité relative de 75 % et une photopériode de 14/10 h de lumière/obscurité. Le bloc aléatoire complet a été adopté comme dispositif expérimental en cinq répétitions par concentration pour chaque traitement. Cinq concentrations de l'extrait à l'éthanol (3, 4 et 5 %) ont été appliquées à l'aide d'un pulvérisateur à main de 1 litre contre les nymphes de D. opuntiae. Dix nymphes du premier stade de D. opuntiae ont été déposées séparément sur des cladodes non pulvérisés et non infestés de la même taille placés dans des boîtes de Pétri (9 cm de diamètre), y compris un témoin traité avec de l'eau uniquement. L'infestation artificielle sur les surfaces des cladodes a été réalisée en fixant chaque stade de D. opuntiae à l'aide d'une brosse entomologique. Tous les stades de D. opuntiae ont été collectés auprès des cladodes de cactus utilisés pour l'élevage en cages entomologiques. La mortalité des nymphes a été enregistrée après 5 jours. La mortalité a été examinée à l'aide d'un microscope binoculaire (Motic). Les nymphes mortes n'ont montré aucun mouvement et avaient des modifications de couleur.
[049] La figure 1 montre l'effet de l'extrait éthanolique d'algue sur la mortalité des nymphes de D. opuntiae. Les résultats montrent que l'extrait de macroalgue a un effet considérable sur les nymphes. L'application de l'extrait algale à une concentration de 3% a permis de tuer 83% de ces nymphes, 5 jours après traitement. Quand la concentration utilisée était de 4% et 5% le taux de mortalité a grimpé jusqu'à 92% et 95%, respectivement, 5 jours après traitement.
Exemple 2 : Evaluation de l'activité insecticide de l'extrait algal sur les femelles adultes de la cochenille (D. opuntiae).
[050] L'activité insecticide de l'extrait éthanolique d'algue sur les femelles adultes a été déterminée suivant le même protocole décrit en [048], La mortalité des adultes femelles sans cire protectrice a été comptée toutes les 24 h pendant 8 jours après l'application des traitements. [051] La figure 2 montre l'effet insecticide considérable de l'extrait éthanolique d'algue appliqué seul sur la mortalité des adultes femelles de D. opuntiae. L'application de l'extrait algale à une concentration de 3% a montré une mortalité de 70% des femelles, 8 jours après traitement. Tandis que les concentrations 4% et 5% a engendré des taux de mortalité de 73% et 87%, respectivement, 8 jours après traitement.
Exemple 3 : Evaluation de l'activité insecticide de l'extrait algal appliqué après le savon noir sur les nymphes de la cochenille (D. opuntiae).
[052] L'activité insecticide de l'extrait éthanolique d'algue rouge de l'espèce G. sesquipedale a été déterminée par application par contact direct dans des conditions de laboratoire à une température de 26 ± 2 °C, une humidité relative de 75 % et une photopériode de 14/10 h de lumière/obscurité. Une conception entièrement randomisée a été adoptée en utilisant cinq répétitions par concentration pour chaque traitement. Cinq concentrations de l'extrait à l'éthanol (3, 4 et 5 %) ont été appliquées après l'application du savon noir à 15 g/L à l'aide d'un pulvérisateur à main de 1 litre contre les nymphes de D. opuntiae.
La mortalité des nymphes a été enregistrée à 3 heures et 24 heures après le traitement. Deux témoins ont été considérés, un témoin traité avec de l'eau uniquement, et le deuxième traité avec le savon noir àl5 g/L.
[053] La figure 3 montre un effet insecticide prononcé des extraits éthanoliques sur les nymphes de D. opuntiae. Une efficacité qui varie considérablement en fonction de la concentration ainsi que le temps après le traitement. Après seulement 3h de son application, la combinaison de 3% d'extrait éthanolique avec 15 g/L du savon noir a provoqué la mortalité de 98% des nymphes. Pour les concentrations des extraits éthanoliques 4 et 5%, une mortalité totale a été enregistré pour les nymphes. Alors que l'application de l'eau seul n'a montré qu'un effet très limité (14% de mortalité) après 24h, tandis que l'effet du savon noir a montré une mortalité d'environ (42%) après 3h de son application à 15 g/L. Le traitement par le savon noir suivie de l'extrait d'algue éthanolique a provoqué une mortalité totale des nymphes de D. opuntiae, 24h après application.
Exemple 4 : Evaluation de l'activité insecticide de l'extrait algale appliqué après le savon noir sur les femelles adultes de la cochenille (D. opuntiae).
[054] L'activité insecticide de l'extrait éthanolique d'algue rouge sur les femelles adultes a été déterminée suivant le même protocole décrit en [048],
La mortalité des femelles adultes a été comptée toutes les 24 h pendant 8 jours après l'application des traitements. La mortalité a été examinée à l'aide d'un microscope binoculaire (Motic). Les femelles mortes ont révélé une dessiccation de leur corps et une couleur brun foncé. [055] La figure 4 montre l'effet insecticide de l'extrait éthanolique sur la mortalité des femelles adultes de D. opuntiae. Il ressort des résultats obtenus que la concentration de l'extrait éthanolique ainsi que la durée du traitement ont un effet significatif sur la mortalité des femelles. L'effet insecticide de l'extrait éthanolique d'algue commence à augmenter d'une manière significative au-delà du quatrième jour après traitement, lorsque son application est précédée par l'application du savon noir à 15 g/L. Cette efficacité a dépassé 50% de mortalité des femelles pour la concentration 5% d'extrait d'algue.
La mortalité des femelles a augmenté significativement pour atteindre 36, 47 et 88% après 192h de traitement en utilisant respectivement 3, 4 et 5% de l'extrait éthanolique, précédé par le savon noir à 15 g/L. Example 5 : Evaluation de l'activité insecticide des formulations à base de l'extrait algale sur des nymphes et des femelles adultes de la cochenille (D. opuntiae).
[056] Des formulations à base de l'extrait éthanolique d'algues de l'espèce G. sesquipedale ont été préparées en utilisant la méthode décrite préalablement [De 030 à 041], Des solutions éthanoliques de 50 mg/mL de l'extrait séché ont été injectées directement à l'aide d'aiguilles à seringue avec un rapport extrait éthanolique d'algue/solution aqueuse de 2/8, dans de l'eau distillée ou une solution aqueuse du savon noir de 2%. L'injection a été réalisée avec un débit de 5 mL/min, sous agitation continue à une vitesse de 500 rpm, et a été prolongée pendant 15 min après injection complète de la solution éthanolique. Le volume du mélange final obtenu a été réduit jusqu'à 75% du volume initial de la phase aqueuse en concentrant la solution à l'aide d'un évaporateur rotatif. Les formulations ont été stockées à 4°C jusqu'à utilisation et ont été chauffées à l'eau tiède directement avant application.
[057] La figure 5 montre que la formulation d'extrait algale avec la concentration de 1.75% préparée avec de l'eau a un effet insecticide très prononcé, qui a atteint une toxicité élevée des femelles D. opuntiae sans couche protectrice, dépassant 88%, 8 jours après traitement. Cette nouvelle formulation avec de l'eau seulement a provoqué également une mortalité supérieure des femelles protégé par la cire avec un pourcentage de 84%, 8 jours après traitement.
[058] La deuxième formulation d'extrait d'algue à 1.75% préparée avec 2% du savon noir comme détergent a provoqué une mortalité importante avec un taux de 76% des femelles D. opuntiae sans cire, seulement 4 jours après traitement. Cette efficacité a augmenté d'une manière significative allant jusqu'à 96%, 7 jours après traitement. Cette nouvelle formulation avec le savon noir a causé un taux de mortalité très élevé d'ordre 74% des femelles protégées par la cire, seulement 5 jours après traitement. Alors, que le savon noir seul a causé des taux de mortalités qui varie entre 34 et 24% des femelles sans cire, et ceux avec cire, respectivement, 8 jours après traitement.
Les deux formulations d'extraits d'algues de l'espèce G. sesquipedale n'ont provoqué aucune phytotoxicité au niveau des cladodes traités.
[059] La figure 6 montre l'effet insecticide des deux types de formulations sur les nymphes de la cochenille D. opuntiae. La formulation d'extrait d'algue à 1.75% préparée avec 2% du savon noir a provoqué une mortalité totale des nymphes de la cochenille, 4 jours seulement après traitement, suivi par la formulation d'extrait d'algue avec de l'eau avec 86%, 4 jours seulement après application.
[056] Les formulations préparées à base d'extraits d'algues en utilisant la méthode décrite préalablement [de 030 à 041] a permis une réduction de la concentration efficace de (3, 4 et 5%) à 1.75%, principalement contre les femelles adultes de la cochenille sans ou avec cire, toute en prolongeant la stabilité du système sans aucune agrégation ou sédimentation prononcée.
APPLICATION INDUSTRIELLE
Biopesticide, Bioinsecticide, Bioherbicide et Biofungicide.

Claims

REVENDICATIONS
1. Agent insecticide pour le contrôle biologique de l'infestation de cultures végétales par la cochenille Dactylopius opuntiae, caractérisé en ce qu'il comprenne un extrait ou une combinaison d'extraits d'algues rouges.
2. Agent insecticide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une composition à base d'extraits d'algue rouge, formulée pour la protection biologique de culture de cactus Opuntia ficus-indica.
3. Agent insecticide selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les extraits d'algue rouge soient obtenus à partir de macroalgues de la classe des Florideophyceae, notamment du genre Gelidium et/ou Pterocladia, utilisés seuls ou en association, et plus particulièrement des espèces G. sesquipedale et P. capillacea du.
4. Agent insecticide selon l'une au moins des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la formule développée comprenne de 0.1% et 10% en poids d'extrait d'algue rouge par rapport au poids total de la formule développée.
5. Procédé pour la préparation d'un agent insecticide selon l'une au moins des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la température de séchage de la macroalgue utilisée pour obtenir l'extrait ou la combinaison d'extraits d'algues rouges soit comprise entre 50 et 65°C.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les extraits soient obtenus par un prétraitement mécanique de la matière sèche, suivi d'une extraction avec des solvants choisis parmi l'eau, les alcools, notamment l'éthanol, ou d'autres solvants organiques.
7. Procédé selon les revendications 5 et 6 d'une formule améliorée de l'agent insecticide, au moyen d'une méthode à faible énergie, permettant l'amélioration de la stabilité de l'agent insecticide et la réduction de la concentration efficace contre les femelles et les nymphes de Dactylopius opuntiae.
8. Procédé selon les revendications 5 à 7, caractérisée en ce que les formules améliorées soient préparées directement avant évaporation du solvant ou après légère concentration de la solution par évaporation.
9. Procédé selon les revendications 5 à 8, caractérisé en ce que les formules améliorées soient concentrées jusqu'à atteindre 50 à 90% du volume initial de la phase aqueuse.
10. Procédé selon les revendications 5 à 9, caractérisé en ce que les formules améliorées soient préparées par injection, déposition goutte-à-goutte ou addition d'un seul coup de la solution éthanolique de l'extrait d'algue dans ou sur la surface de la phase aqueuse ou d'une solution de savon noir à 2%.
11. Procédé selon les revendications 5 à 10, caractérisé en ce que les formules améliorées soient préparée avec une solution de 10 à 50 mg/ml d'extrait éthanolique d'algue rouge, dans un rapport volumique de 5/5 à 1/9 d'extrait éthanolique d'algue/solution aqueuse.
12. Utilisation d'un agent insecticides selon l'une au moins des revendications 1 à 4, pour le contrôle biologique de l'infestation de cultures végétales par la cochenille Dactylopius opuntiae, sous forme sèche en combinaison avec un support choisi parmi billes d'argile, polymères, silices ou résines ou sous forme liquide, préférentiellement sous forme liquide applicable par pulvérisation.
13. Utilisation de l'agent insecticide selon la revendication 12, caractérisée en ce que la formule développée, dite améliorée, soit utilisée seule ou en association avec un autre extrait ou substance naturelle telle que extraits de plantes, macroalgues, ou microalgues, ou une substance chimique telle que adjuvants, émulsifiants, conservateurs, stabilisants.
14. Utilisation de l'agent insecticide selon la revendication 12 ou de sa formule améliorée selon la revendication 13, dans protection biologique de culture de cactus Opuntia ficus-indica contre les femelles et les nymphes de Dactylopius opuntiae.
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