WO2024252753A1 - 凍結細胞解凍装置 - Google Patents

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WO2024252753A1
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frozen
culture medium
container
frozen cells
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大貴 石井
峻介 亀野
雅弘 初田
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Nitta Corp
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Nitta Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present invention relates to a frozen cell thawing device that thaws frozen cells and recovers the cells.
  • Patent Document 1 discloses a device for thawing frozen cells that includes a heater for heating a vial. A suspension containing cells is frozen inside the vial. The heat of thawing the frozen cells is transferred from the heater to the vial. The frozen cells gradually thaw from the periphery toward the center.
  • cryoprotectants When freezing cells, a cryoprotectant is mixed into the suspension.
  • Cryoprotectants generally contain dimethyl sulfoxide (DMSO). Since dimethyl sulfoxide damages cells after thawing, it is desirable to complete thawing as quickly as possible. However, if cells are exposed to temperatures above 42°C, they will die. On the other hand, if the contact time between cells and dimethyl sulfoxide is extended due to low-temperature thawing, the cells will die. Therefore, complex and advanced temperature control is required when heating the vials.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present invention aims to provide a device for thawing frozen cells that can avoid the effects of cryoprotectants as much as possible when thawing frozen cells.
  • the frozen cell thawing device of the present invention comprises an inlet pipe for introducing a liquid culture medium, a melting unit that holds a container that contains frozen cells containing a freezing treatment liquid including a cryoprotectant and introduces the culture medium from the inlet pipe while storing the frozen cells, applies thawing heat to the frozen cells from the culture medium that contacts the frozen cells, a liquid flow unit that generates relative movement of the culture medium with respect to the frozen cells, and a discharge pipe that is connected to the container and guides the discharge of the culture medium containing the thawed cells, and when the thawed cells are dispersed in the culture medium, the concentration of the cryoprotectant in the culture medium is maintained at 3 vol% or less.
  • the disclosed frozen cell thawing device can avoid the effects of the cryoprotectant as much as possible when thawing frozen cells.
  • FIG. 1 is an overall view showing, in outline, the configuration of a frozen cell thawing device according to one embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the sensible heat change of a frozen cell.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the change in latent heat of a frozen cell.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a container containing frozen cells used in a simulation of the time required for thawing in a frozen cell thawing device.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the time course and thawing state during thawing in a frozen cell thawing device.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of time course and temperature change during thawing in a frozen cell thawing device.
  • FIG. 13 is a diagram showing a pattern of a culture medium introduction operation in the frozen cell thawing device of the embodiment.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration of a frozen cell thawing device according to one embodiment of the present invention.
  • the frozen cell thawing device 11 includes a first container 13 that contains frozen cells 12, and a melting unit 15 that applies melting heat from a culture medium 14 in the first container 13 to the frozen cells 12 contained in the first container 13.
  • the first container 13 can be composed of, for example, a glass vial 13a and a cap 13b that closes the opening of the vial 13a.
  • the frozen cells 12 are contained in the vial 13a.
  • a suspension is contained in the vial 13a.
  • the suspension is frozen together with the vial 13a.
  • the frozen cells 12 can be cooled with liquid nitrogen, for example. At this time, the temperature of the frozen cells 12 drops to around minus 196°C.
  • An inlet port 16 and an outlet port 17 are formed in the cap 13b.
  • the suspension is composed of a freezing solution and cells dispersed in the freezing solution.
  • the freezing solution contains a culture medium, a cell freezing solution, and human serum albumin.
  • the cell freezing solution contains, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO) as a cryoprotectant.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the concentration of dimethyl sulfoxide is, for example, 5 vol% to 10 vol% of the freezing solution, specifically set to 5 vol%.
  • Dimethyl sulfoxide can prevent the expansion of water that solidifies within the cells when the cells are frozen.
  • Dimethyl sulfoxide can effectively prevent the death of cells.
  • other cryoprotectants include glycerol, ethylene glycol, and propylene glycol.
  • the above cryoprotectants are cell membrane permeable and have the effect of penetrating into cells and suppressing ice crystal formation, but they are known to be transformed into harmful substances through metabolism within the cells and to exhibit biological toxicity.
  • the first container 13 is connected to a sensible heat change unit 23 that heats the vial 13a from the outside.
  • the sensible heat change unit 23 includes a heater 24 that heats the vial 13a to a temperature lower than the melting temperature of the frozen cells 12.
  • the heater 24 can have a shape that receives the vial 13a and supports it, for example. Since the temperature of the heater 24 is limited to a temperature lower than the melting temperature of the frozen cells 12, melting of the frozen cells 12 can be avoided by heat transfer from the vial 13a. On the other hand, the temperature of the frozen cells 12 can be brought as close as possible to the melting temperature by sensible heat change.
  • the temperature of the heater 24 is set to, for example, -1°C.
  • the temperature of the heater 24 may be set to a high temperature within a range that does not kill the cells, for example, 37°C to 42°C, specifically 42°C, in order to hasten the sensible heat change.
  • the sensible heat change unit 23 heats the temperature of the frozen cells 12 to as high a temperature as possible through sensible heat change prior to thawing, so that the thermal energy of the culture medium can be efficiently utilized for latent heat change, and thawing of the frozen cells 12 based on the culture medium can be promoted. If the temperature of the frozen cells 12 is lower than the melting temperature of the culture medium, the culture medium in contact with the frozen cells 12 will freeze, hindering thawing of the frozen cells 12; however, if the temperature of the frozen cells 12 is increased, the freezing of the culture medium can be avoided even if the culture medium comes into contact with the frozen cells 12, and the culture medium can efficiently thaw the frozen cells 12.
  • a tilt unit 21 is connected to the first container 13 to rotate the first container 13 around the horizontal axis 18.
  • the tilt unit 21 includes a motor 22, for example, connected to a heater 24, to drive the heater 24 around the horizontal axis 18.
  • the motor 22 includes, for example, a drive shaft that rotates around its axis in response to the supply of power. The rotational force of the drive shaft can be transmitted to the heater 24 via a gear mechanism.
  • the tilt unit 21 allows the attitude of the first container 13 to change around the horizontal axis 18.
  • the first container 13 can be held in a first position where the central axis of the vial (cylinder) 13a coincides with the vertical direction, and in a second position where the cap 13b is located below the bottom of the vial 13a. In the second position, the discharge port 17 is located below the introduction port 16.
  • the inlet pipe 25 can be composed of a tube made of soft resin, for example.
  • a second container 27 that holds a liquid culture medium 26 is connected to the other end of the inlet pipe 25.
  • a culture medium suitable for the cells contained in the frozen cells 12 is used as the culture medium 26.
  • the culture medium 26 can provide a survival environment for the cells at room temperature, for example.
  • the liquid culture medium 26 is introduced from the inlet pipe 25 to the first container 13. The introduced culture medium comes into contact with the frozen cells 12. In this way, the heat of fusion is transferred from the culture medium 26 to the frozen cells 12.
  • a heating unit 31 is connected to the second container 27 for heating the culture medium 26 contained in the second container 27.
  • the heating unit 31 can heat the culture medium 26 in the second container 27 to above room temperature. Thermal energy is supplied to the culture medium 26.
  • the culture medium 26 is heated prior to introduction into the first container 13. However, the temperature of the culture medium 26 is maintained below the cell death temperature. Here, the temperature of the culture medium 26 is limited to 37°C or below.
  • One end of a discharge pipe 32 that defines one flow path is connected to the discharge port 17 of the cap 13b.
  • the other end of the discharge pipe 32 is connected to a third container 33 that collects the thawed cells.
  • the discharge pipe 32 guides the discharge of the culture medium containing the thawed cells from the first container 13 to the third container 33.
  • the suspension that has been thawed and diluted with the culture medium flows into the third container 33.
  • a pump 34 is connected to the inlet pipe 25 to move the culture medium from the second container 27 toward the first container 13.
  • the pump 34 can function as a liquid flow unit that generates a relative movement of the culture medium with respect to the frozen cells 12 in the first container 13.
  • a tube pump can be used for the pump 34. Since the first container 13 is sealed, the pressure of the pump 34 can promote the discharge of the diluted suspension from the first container 13.
  • the flow rate of the culture medium can be adjusted according to the operation of the pump 34. By adjusting the flow rate in this way, the concentration of dimethyl sulfoxide in the culture medium can be maintained at 3 vol% or less when the thawed cells in the first container 13 are dispersed in the culture medium.
  • the thawed cells come into contact with the culture medium containing dimethyl sulfoxide at a concentration of 3 vol% or less, the death of the cells due to dimethyl sulfoxide can be reduced regardless of the contact time with the culture medium.
  • the cells can be thawed well.
  • the concentration of dimethyl sulfoxide in the medium is preferably maintained at 1 vol% or less when the thawed cells are dispersed in the medium. This further reduces cell death, allowing the cells to be thawed well.
  • a control unit 35 is connected to the motor 22, the heater 24, the heating unit 31, and the pump 34.
  • the control unit 35 supplies control signals to the motor 22, the heater 24, the heating unit 31, and the pump 34, respectively.
  • the motor 22 drives the first container 13 around the horizontal axis 18 between the first position and the second position in response to the supply of the control signal.
  • the heater 24 contacts the first container 13 at a temperature specified by the control signal in response to the supply of the control signal.
  • the control signal can be generated, for example, based on the output of a temperature sensor attached to the vial 13a.
  • the heating unit 31 contacts the second container 27 at a temperature specified by the control signal in response to the supply of the control signal.
  • the control signal can be generated, for example, based on the output of a temperature sensor incorporated in the second container 27 to detect the temperature of the culture medium 26.
  • the control unit 35 can be composed of, for example, a microprocessor unit (MPU). In this case, the operation of the control unit 35 can be realized based on software stored in the memory in the control unit 35.
  • MPU microprocessor unit
  • Frozen cells 12 are prepared.
  • the frozen cells 12 correspond to a coagulated body of the suspension.
  • the suspension is contained in a first container 13 and frozen together with the first container 13.
  • the freezing treatment liquid is formed, for example, of 50 vol. % culture medium, 34 vol. % cell freezing preservation liquid, and 16 vol. % human serum albumin.
  • the freezing treatment liquid contains dimethyl sulfoxide at a concentration of 5 vol. %. Dimethyl sulfoxide can effectively prevent the death of cells when they are frozen.
  • the first container 13 containing the frozen cells 12 is cooled, for example, with liquid nitrogen.
  • the first container 13 of frozen cells 12 is set in the melting unit 15.
  • the first container 13 is attached to and supported by, for example, a heater 24.
  • An inlet pipe 25 is connected to the inlet port 16 of the cap 13b.
  • the inlet pipe 25 connects the first container 13 to a second container 27.
  • An outlet pipe 32 is connected to the outlet port 17 of the cap 13b.
  • the outlet pipe 32 connects the first container 13 to a third container 33.
  • a control unit 35 controls the tilt unit 21.
  • the first container 13 is positioned at a first position about the horizontal axis 18.
  • the second container 27 holds the liquid culture medium 26.
  • the control unit 35 controls the heating unit 31.
  • a control signal is supplied from the control unit 35 to the heating unit 31.
  • the heating unit 31 heats the culture medium 26 in the second container 27.
  • the culture medium 26 can be heated to a temperature higher than room temperature.
  • the heating unit 31 is maintained at, for example, 37°C.
  • the control unit 35 controls the sensible heat change unit 23.
  • a control signal is supplied from the control unit 35 to the heater 24.
  • the heater 24 heats the frozen cells 12 in the vial 13a. As shown in FIG. 2, thermal energy is transferred from the vial 13a to the frozen cells 12. A sensible heat change is realized in the frozen cells 12. The temperature of the frozen cells 12 rises. The frozen cells 12 are warmed to below the melting temperature. The temperature of the frozen cells 12 is maintained below the melting temperature.
  • the control unit 35 controls the pump 34.
  • the liquid culture medium 26 flows from the second container 27 into the first container 13.
  • the culture medium 38 comes into contact with the surface of the frozen cells 12 in the first container 13.
  • Thermal energy (heat of fusion) 39 is transferred from the culture medium 38 to the surface of the frozen cells 12.
  • the frozen cells 12 melt.
  • the thawed suspension can be dispersed in the culture medium 38 immediately.
  • the thawed suspension is diluted with the culture medium 38.
  • the cells 41 are dispersed in the culture medium 38. Since the suspension is pushed away from the surface of the frozen cells 12 by the flow of the culture medium 38, the concentration of the cryoprotectant can be regulated within a good range.
  • the effect of the cryoprotectant on the cells 41 can be avoided as much as possible. Regardless of the duration of thawing, the death of the cells 41 due to the cryoprotectant can be reduced.
  • the cells 41 can be thawed well. Prior to the introduction of the culture medium 38, the culture medium 38 can be warmed to a temperature higher than room temperature. The thawing of frozen cells 12 can be accelerated.
  • control unit 35 controls the operation of the pump 34 according to the temperature of the frozen cells 12.
  • a control signal is supplied from the control unit 35 to the pump 34.
  • the control signal specifies the amount of operation of the pump 34 based on the volume of the suspension melted by convective heat transfer in the medium 38.
  • the amount of operation of the pump 34 determines the flow rate of the medium 38. Based on the determined flow rate, the concentration of dimethyl sulfoxide in the medium 38 is maintained at 1 vol% or less when the thawed cells 41 are dispersed in the medium 38.
  • the thawed cells 41 come into contact with the medium 38 containing dimethyl sulfoxide at a concentration of 3 vol% or less, preferably 1 vol% or less, death of the cells 41 due to the cryoprotectant can be reduced regardless of the contact time with the medium 38.
  • the cells 41 can be thawed well.
  • the culture medium 38 containing the thawed cells 41 flows from the first container 13 into the third container 33.
  • the cells 41 are thus collected in the third container 33.
  • the cells 41 can be separated from the culture medium 38, for example, by the action of a centrifuge.
  • the control unit 35 may control the tilting unit 21 during thawing of the frozen cells 12.
  • the first container 13 can be positioned at a second position around the horizontal axis 18. In the second position, the discharge port 17 of the cap 13b is positioned below the frozen cells 12, so that discharge of the thawed cells 41 can be facilitated.
  • the heater 24 of the sensible heat change unit 23 heats the vial 13a below the melting temperature of the frozen cells 12. Melting of the frozen cells 12 due to heat transfer from the heater 24 can be avoided. Melting of the frozen cells 12 separated from dilution can be prevented. In this way, the cells 41 can be well protected from a high concentration of cryoprotectant. Cell death due to the cryoprotectant can be reduced.
  • the thermal energy 39 of the medium 38 can be efficiently used for latent heat change. Thawing of the frozen cells 12 based on the medium 38 can be promoted.
  • the temperature of the frozen cells 12 is raised as high as possible, freezing of the medium 38 can be avoided even if the medium 38 comes into contact with the frozen cells 12.
  • the medium 38 can efficiently thaw the frozen cells 12. If the temperature of the frozen cells 12 is lower than the melting temperature of the medium 38, the medium 38 in contact with the frozen cells 12 will freeze. This will cause problems with thawing frozen cells 12.
  • the "temperature having a sufficient amount of heat to thaw the cells” is expressed by the following formula, where M i is the mass [kg] of the frozen cells 12, ⁇ i is the initial temperature [°C] of the frozen cells, C i is the specific heat [J/(kg ⁇ K)] of the frozen cells, L is the latent heat [J/kg] of the frozen cells, M w is the mass [kg] of the medium, ⁇ w is the initial temperature [°C] of the medium, and C w is the specific heat [J/(kg ⁇ K)] of the medium.
  • the frozen cells and culture medium were placed in a cylindrical container.
  • the container was assumed to be insulated in the calculations. Convective heat transfer was not taken into account. Only temperature changes (sensible heat changes) and phase changes (latent heat changes) due to thermal conduction were considered.
  • the calculations were performed centrally, assuming that there was no temperature gradient in the radial direction of the cylinder. As shown in Figure 5, in Example 1, it was calculated that the amount of melting per unit time was maintained roughly constant. As shown in Figure 6, it was calculated that the temperature was maintained roughly constant on the surface of the frozen cells regardless of the passage of time.
  • the heat of thawing is transferred to the frozen cells 12 from the culture medium in contact with the frozen cells 12.
  • the thawed suspension can be dispersed in the culture medium immediately.
  • the thawed suspension can be diluted with the culture medium. Since the suspension is pushed away from the frozen cells 12 by the flow of the culture medium, the concentration of dimethyl sulfoxide contained in the cell cryopreservation solution can be regulated within a good range. In this way, the influence of the cryoprotectant can be avoided as much as possible when thawing the frozen cells. Regardless of the duration of thawing, cell death due to dimethyl sulfoxide contained in the cryoprotectant is reduced, and the cells can be thawed well.
  • Example 2 The inventor prepared a suspension of iris pigmented epithelial cells.
  • the cell concentration was set to 1.0-2.0x10 6 [live cells/mL] in the freezing solution.
  • the freezing solution was formed of 50 vol% medium, 34 vol% cell cryopreservation solution, and 16 vol% human serum albumin.
  • the freezing solution contained dimethyl sulfoxide at a concentration of 5 vol%.
  • the suspension was sealed in a 5 [mL] storage container.
  • the storage container was slowly cooled in a freezer at minus 80°C.
  • the cells were frozen in the storage container.
  • the total amount of frozen cells and medium was adjusted to 30 [mL].
  • the medium was introduced into the storage container in several patterns. In Example 7, two storage containers were directly connected. In this verification, a heating unit was used instead of the sensible heat change unit 23.
  • Table 3 The experimental conditions and results are shown in Table 3.
  • cell viability refers to the total number of viable cells, including the remaining frozen cells
  • cell yield refers to the number of cells contained in the medium discharged from the discharge pipe 32.
  • Frozen cell thawing device 12 Frozen cells 13 Container (first container) 15 Melting unit 23 Sensible heat change unit 25 Inlet pipe 26 Culture medium (in the second container) 31 Heating unit 32 Discharge pipe 34 Liquid flow unit (pump) 38 Culture medium (in the first container)

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Abstract

凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避することができる凍結細胞解凍装置を提供する。凍結細胞解凍装置１１は、液体の培地２６を案内する導入配管２５と、凍結保護剤を含む凍結処理液を含有する凍結細胞１２を収容しながら導入配管２５から培地２６を導入する容器１３を保持し、凍結細胞１２に接触する培地から凍結細胞１２に融解熱を加える融解ユニット１５と、凍結細胞１２に対して培地の相対移動を生み出す液流れユニット３４と、容器１３に接続されて、解凍された細胞を含む培地の排出を案内する排出配管３２とを備え、解凍された細胞が培地に分散する際に培地中で凍結保護剤の濃度は３ｖｏｌ％以下、好ましくは１ｖｏｌ％以下に維持される。

Description

凍結細胞解凍装置
　本発明は、凍結細胞を解凍して細胞を回収する凍結細胞解凍装置に関する。
　特許文献１は、バイアルを加熱するヒーターを備える凍結細胞解凍装置を開示する。細胞を含む懸濁液はバイアル内で凍結する。ヒーターからバイアルに凍結細胞の融解熱は伝達される。凍結細胞は外周から中心に向かって徐々に融解していく。
特許第６６６１６１６号公報
　細胞の凍結にあたって懸濁液には凍結保護剤が混ぜられる。凍結保護剤には一般にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれる。解凍後のジメチルスルホキシドは細胞にダメージを与えることから、できるだけ短時間で解凍は完了することが望まれる。とはいえ、細胞が４２℃を超えた高温に曝されると、細胞は死滅してしまう。その一方で、低温の解凍に伴って細胞とジメチルスルホキシドとの接触時間が延びると、細胞は死滅してしまう。したがって、バイアルの加熱にあたって複雑かつ高度な温度制御が要求される。
　本発明は、凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避することができる凍結細胞解凍装置を提供することを目的とする。
　本発明の凍結細胞解凍装置は、液体の培地を案内する導入配管と、凍結保護剤を含む凍結処理液を含有する凍結細胞を収容しながら前記導入配管から前記培地を導入する容器を保持し、前記凍結細胞に接触する前記培地から前記凍結細胞に融解熱を加える融解ユニットと、前記凍結細胞に対して前記培地の相対移動を生み出す液流れユニットと、前記容器に接続されて、解凍された細胞を含む前記培地の排出を案内する排出配管とを備え、解凍された前記細胞が前記培地に分散する際に前記培地中で前記凍結保護剤の濃度は３ｖｏｌ％以下に維持される。
　以上のように開示の凍結細胞解凍装置によれば、凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避できる。
本発明の一実施形態に係る凍結細胞解凍装置の構成を概略的に示す全体図である。 凍結細胞の顕熱変化の様子を概略的に示す模式図である。 凍結細胞の潜熱変化の様子を概略的に示す模式図である。 凍結細胞解凍装置での解凍に費やされる時間のシミュレーションに用いた凍結細胞を収容した容器を説明する図である。 凍結細胞解凍装置での解凍における時間経過と解凍の様子の一例を示す図である。 凍結細胞解凍装置での解凍における時間経過と温度変化の一例を示す図である。 実施例に係る凍結細胞解凍装置での培地投入動作のパターンを示す図である。
　以下、添付図面を参照しつつ本発明の一実施形態を説明する。
（凍結細胞解凍装置１１の構成）
　図１は本発明の一実施形態に係る凍結細胞解凍装置の構成を概略的に示す。凍結細胞解凍装置１１は、凍結細胞１２を収容する第１容器１３を保持し、第１容器１３に収容される凍結細胞１２に第１容器１３内の培地１４から融解熱を加える融解ユニット１５を備える。ここでは、第１容器１３は、例えばガラス製のバイアル１３ａと、バイアル１３ａの開口を塞ぐキャップ１３ｂとで構成されることができる。バイアル１３ａに凍結細胞１２は収容される。細胞の凍結にあたってバイアル１３ａには懸濁液が収容される。懸濁液はバイアル１３ａとともに凍結される。凍結細胞１２の保存にあたって例えば凍結細胞１２は液体窒素で冷却されることができる。このとき、凍結細胞１２の温度はマイナス１９６℃付近まで低下する。キャップ１３ｂには導入ポート１６および排出ポート１７が形成される。
　懸濁液は凍結処理液と当該凍結処理液に分散する細胞とで構成される。凍結処理液は培地と細胞凍結保存液とヒト血清アルブミンとを含有する。細胞凍結保存液には凍結保護剤として、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含有される。ジメチルスルホキシドの濃度は例えば凍結処理液の５ｖｏｌ％以上１０ｖｏｌ％以下であり、具体的には５ｖｏｌ％に設定される。ジメチルスルホキシドは細胞の凍結にあたって細胞内で凝固する水分の膨張を防止することができる。ジメチルスルホキシドは良好に細胞の死滅を防止することができる。凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシドの他にグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。上記の凍結保護剤は細胞膜透過性であり、細胞内へ浸透し氷晶形成を抑制する効果がある反面、細胞内で代謝により有害物質へ変化し、生物学的毒性を発現することが知られている。 
　第１容器１３には、外側からバイアル１３ａを加熱する顕熱変化ユニット２３が結合される。顕熱変化ユニット２３は、例えば、凍結細胞１２の融解温度未満でバイアル１３ａを加熱するヒーター２４を備える。ヒーター２４は、例えば、バイアル１３ａを受け止めバイアル１３ａを支持する形状を有することができる。ヒーター２４の温度は凍結細胞１２の融解温度未満に制限されることから、バイアル１３ａからの熱伝達で凍結細胞１２の融解は回避されることができる。その一方で、凍結細胞１２の温度は顕熱変化で可能な限り融解温度に近づくことができる。ここでは、ヒーター２４の温度は例えばマイナス１℃に設定される。あるいは、ヒーター２４の温度は、顕熱変化を早めるために細胞を死滅させない範囲の高温、例えば３７℃～４２℃、具体的には４２℃に設定しても良い。
　顕熱変化ユニット２３によって、凍結細胞１２の温度は融解に先立って顕熱変化でできる限り高温まで加熱されることから、培地の熱エネルギーは効率的に潜熱変化に利用されることができ、培地に基づく凍結細胞１２の解凍は促進されることができる。凍結細胞１２の温度が培地の融解温度よりも低温であると、凍結細胞１２に接触する培地は凍結してしまい、凍結細胞１２の解凍に支障を来してしまうが、凍結細胞１２の温度が高まれば、凍結細胞１２に培地が接触しても培地の凍結は回避されることができ、培地は効率的に凍結細胞１２を解凍することができる。
　第１容器１３には水平軸線１８回りに第１容器１３の回転を生み出す傾斜ユニット２１が結合される。傾斜ユニット２１は、例えばヒーター２４に接続されて、水平軸線１８回りでヒーター２４を駆動するモーター２２を備える。モーター２２は、例えば、電力の供給に応じて軸心回りで回転する駆動軸を備える。駆動軸の回転力は歯車機構を介してヒーター２４に伝達されることができる。傾斜ユニット２１の働きで第１容器１３の姿勢は水平軸線１８回りに変化することができる。第１容器１３は、バイアル（円筒）１３ａの中心軸線が鉛直方向に一致する第１位置と、バイアル１３ａの底よりもキャップ１３ｂが下方に位置する第２位置とで保持されることができる。第２位置では導入ポート１６よりも排出ポート１７は下方に位置する。
　キャップ１３ｂの導入ポート１６には、１本の流路を区画する導入配管２５の一端が連結される。導入配管２５は例えば軟質樹脂製のチューブで構成されることができる。導入配管２５の他端には、液体の培地２６を保持する第２容器２７が接続される。培地２６には、凍結細胞１２に含まれる細胞に適した培地が用いられる。培地２６は例えば常温で細胞の生存環境を提供することができる。第１容器１３には導入配管２５から液体の培地２６が導入される。導入された培地は凍結細胞１２に接触する。こうして培地２６から凍結細胞１２に融解熱は伝達される。
　第２容器２７には第２容器２７に収容される培地２６を加熱する加温ユニット３１が結合される。加温ユニット３１の働きで第２容器２７内の培地２６は室温以上に温められることができる。培地２６に熱エネルギーは供給される。培地２６は第１容器１３への導入に先立って加熱される。ただし、培地２６の温度は細胞の死滅温度未満に維持される。ここでは、培地２６の温度は３７℃以下に制限される。
　キャップ１３ｂの排出ポート１７には、１本の流路を区画する排出配管３２の一端が連結される。排出配管３２の他端には、解凍された細胞を回収する第３容器３３が接続される。排出配管３２は、第１容器１３から第３容器３３に、解凍された細胞を含む培地の排出を案内する。第３容器３３には、解凍されて培地で希釈化された懸濁液が流れ込む。
　導入配管２５には第２容器２７から第１容器１３に向かって培地を動かすポンプ３４が結合される。ポンプ３４は第１容器１３内で凍結細胞１２に対して培地の相対移動を生み出す液流れユニットとして機能することができる。ポンプ３４には例えばチューブポンプが用いられることができる。第１容器１３は密閉されることから、ポンプ３４の圧力は第１容器１３から希釈化された懸濁液の排出を促すことができる。ポンプ３４の働きに応じて、培地の流量は調整されることができる。こうして流量が調整されることで、第１容器１３内で解凍された細胞が培地に分散する際に培地中でジメチルスルホキシドの濃度は３ｖｏｌ％以下に維持されることができる。解凍された細胞は３ｖｏｌ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含む培地に接触するので、培地との接触時間に関係なくジメチルスルホキシドに基づく細胞の死滅は低減されることができる。細胞は良好に解凍されることができる。
　凍結細胞解凍装置１１では、解凍された細胞が培地に分散する際に培地中でジメチルスルホキシドの濃度は、好ましくは１ｖｏｌ％以下に維持される。細胞の死滅はさらに低減され、細胞は良好に解凍されることができる。
　モーター２２、ヒーター２４、加温ユニット３１およびポンプ３４には制御ユニット３５が接続される。制御ユニット３５は、モーター２２、ヒーター２４、加温ユニット３１およびポンプ３４にそれぞれ制御信号を供給する。モーター２２は制御信号の供給に応じて第１位置および第２位置の間で水平軸線１８回りに第１容器１３を駆動する。ヒーター２４は制御信号の供給に応じて制御信号で特定される温度で第１容器１３に接触する。制御信号は、例えば、バイアル１３ａに装着される温度センサーの出力に基づき生成されることができる。加温ユニット３１は制御信号の供給に応じて制御信号で特定される温度で第２容器２７に接触する。制御信号は、例えば、第２容器２７に組み込まれて培地２６の温度を検出する温度センサーの出力に基づき生成されることができる。制御ユニット３５は例えばマイクロプロセッサーユニット（ＭＰＵ）から構成されることができる。このとき、制御ユニット３５の動作は制御ユニット３５内のメモリーに格納されるソフトウエアに基づき実現されることができる。
　次に凍結細胞解凍装置１１の動作を説明する。凍結細胞１２は準備される。凍結細胞１２は懸濁液の凝固体に相当する。懸濁液は第１容器１３に収容されて第１容器１３ともども凍結される。懸濁液の調製にあたって凍結処理液に細胞は混入される。凍結処理液は、例えば、５０ｖｏｌ％の培地、３４ｖｏｌ％の細胞凍結保存液および１６ｖｏｌ％のヒト血清アルブミンで形成される。ここでは、凍結処理液は５ｖｏｌ％の濃度でジメチルスルホキシドを含有する。ジメチルスルホキシドは細胞の凍結時に良好に細胞の死滅を防止することができる。凍結細胞１２の保存にあたって凍結細胞１２を収容する第１容器１３は例えば液体窒素で冷却される。
　凍結細胞１２の第１容器１３は融解ユニット１５にセットされる。第１容器１３は例えばヒーター２４に装着され支持される。キャップ１３ｂの導入ポート１６には導入配管２５が結合される。導入配管２５は第１容器１３に第２容器２７を接続する。キャップ１３ｂの排出ポート１７には排出配管３２が結合される。排出配管３２は第１容器１３に第３容器３３を接続する。制御ユニット３５は傾斜ユニット２１を制御する。ここでは、第１容器１３は水平軸線１８回りに第１位置に位置決めされる。
　第２容器２７には液体の培地２６が保持される。制御ユニット３５は加温ユニット３１を制御する。加温ユニット３１には制御ユニット３５から制御信号が供給される。加温ユニット３１は第２容器２７内の培地２６を加熱する。培地２６は室温よりも高温に温められることができる。ここでは、加温ユニット３１は例えば３７℃に維持される。
　制御ユニット３５は顕熱変化ユニット２３を制御する。ヒーター２４には制御ユニット３５から制御信号が供給される。ヒーター２４はバイアル１３ａ内の凍結細胞１２を加熱する。図２に示されるように、凍結細胞１２にはバイアル１３ａから熱エネルギーが伝達される。凍結細胞１２では顕熱変化が実現される。凍結細胞１２の温度は上昇していく。凍結細胞１２は融解温度未満まで温められる。凍結細胞１２の温度は融解温度未満で維持される。
　制御ユニット３５はポンプ３４を制御する。液体の培地２６は第２容器２７から第１容器１３に流入する。図３に示されるように、第１容器１３内で培地３８は凍結細胞１２の表面に接触する。凍結細胞１２の表面には培地３８から熱エネルギー（融解熱）３９が伝達される。凍結細胞１２は融解する。解凍された懸濁液はすぐさま培地３８に分散することができる。融解した懸濁液は培地３８で希釈化される。細胞４１は培地３８に分散する。培地３８の流れで懸濁液は凍結細胞１２の表面から押しのけられることから、凍結保護剤の濃度は良好な範囲で規制されることができる。こうして細胞４１に対してできる限り凍結保護剤の影響は回避されることができる。解凍の継続時間に関係なく、凍結保護剤に基づく細胞４１の死滅は低減されることができる。細胞４１は良好に解凍されることができる。培地３８の導入に先立って培地３８は室温よりも高温に温められることができる。凍結細胞１２の融解は促進されることができる。
　ここでは、制御ユニット３５は凍結細胞１２の温度に応じてポンプ３４の動作を制御する。ポンプ３４には制御ユニット３５から制御信号が供給される。制御信号は、培地３８の対流熱伝達で融解する懸濁液の容量に基づきポンプ３４の動作量を特定する。ポンプ３４の動作量は培地３８の流量を決定する。決定された流量に基づき、解凍された細胞４１が培地３８に分散する際に培地３８中でジメチルスルホキシドの濃度は１ｖｏｌ％以下に維持される。解凍された細胞４１は３ｖｏｌ％以下、好ましくは１ｖｏｌ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含む培地３８に接触するので、培地３８との接触時間に関係なく凍結保護剤に基づく細胞４１の死滅は低減されることができる。細胞４１は良好に解凍されることができる。
　解凍された細胞４１を含有する培地３８は第１容器１３から第３容器３３に流入する。こうして細胞４１は第３容器３３に回収される。細胞４１は例えば遠心分離機の働きで培地３８から分離されることができる。凍結細胞１２の解凍中に制御ユニット３５は傾斜ユニット２１を制御してもよい。制御に応じて第１容器１３は水平軸線１８回りで第２位置に位置決めされることができる。第２位置ではキャップ１３ｂの排出ポート１７は凍結細胞１２よりも下方に位置することから、解凍された細胞４１の排出は促進されることができる。
　本実施形態では、顕熱変化ユニット２３のヒーター２４は凍結細胞１２の融解温度未満でバイアル１３ａを加熱する。ヒーター２４からの熱伝達に基づく凍結細胞１２の融解は回避されることができる。希釈化から分離された凍結細胞１２の融解は阻止されることができる。こうして細胞４１は高濃度の凍結保護剤から良好に保護されることができる。凍結保護剤に基づく細胞の死滅は低減されることができる。その一方で、凍結細胞１２の温度は融解に先立って顕熱変化でできる限り高温まで加熱されることから、培地３８の熱エネルギー３９は効率的に潜熱変化に利用されることができる。培地３８に基づく凍結細胞１２の解凍は促進されることができる。しかも、凍結細胞１２の温度ができる限り高まれば、凍結細胞１２に培地３８が接触しても培地３８の凍結は回避されることができる。培地３８は効率的に凍結細胞１２を解凍することができる。凍結細胞１２の温度が培地３８の融解温度よりも低温であると、凍結細胞１２に接触する培地３８は凍結してしまう。凍結細胞１２の解凍に支障を来してしまう。
　凍結細胞１２の解凍にあたって「細胞の解凍に十分な熱量を持つ温度」は次式で表される。ただし、Ｍｉは凍結細胞１２の質量［ｋｇ］、θｉは凍結細胞の初期温度［℃］、Ｃｉは凍結細胞の比熱［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］、Ｌは凍結細胞の潜熱［Ｊ／ｋｇ］、Ｍｗは培地の質量［ｋｇ］、θｗは培地の初期温度［℃］、および、Ｃｗは培地の比熱［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　［数２］に基づき表１に示す「細胞の解凍に十分な熱量を持つ温度」が算出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ここでは、比熱Ｃｉ＝２０４０［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］（氷０［℃］の比熱）、比熱Ｃｗ＝４１８０［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］（水２０［℃］の比熱）、および、潜熱Ｌ＝３．３３６ｘ１０５［Ｊ／ｋｇ］に設定された。
　次に、凍結細胞を収容した容器に培地を供給した状況を想定し、解凍に費やされる時間をシミュレーションしたところ、表２に示す計算結果が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図４に示されるように、円筒形の容器に凍結細胞および培地は収容された。なお、計算にあたって容器は断熱と仮定された。対流熱伝達は考慮されなかった。熱伝導に基づく温度変化（顕熱変化）および相変化（潜熱変化）のみが考慮された。円柱の半径方向に温度勾配はないものと仮定され一元的に計算は実施された。図５に示されるように、例１では単位時間あたりの融解量は概ね一定に維持されることが算出された。図６に示されるように、時間の経過に拘わらず凍結細胞の表面では温度は概ね一定に維持されることが算出された。
（凍結細胞解凍装置１１の作用・効果）
　本実施形態の凍結細胞解凍装置１１において、凍結細胞１２には凍結細胞１２に接触する培地から融解熱が伝達される。解凍された懸濁液はすぐさま培地に分散することができる。融解した懸濁液は培地で希釈化されることができる。培地の流れで懸濁液は凍結細胞１２から押しのけられることから、細胞凍結保存液に含有されるジメチルスルホキシドの濃度は良好な範囲で規制されることができる。このようにして、凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避することができる。解凍の継続時間に関係なく、凍結保護剤に含有されるジメチルスルホキシドに基づく細胞の死滅は低減され、細胞は良好に解凍されることができる。
（実施例）
　本発明者は虹彩色素上皮細胞の懸濁液を調製した。細胞の濃度は凍結処理液中で１．０～２．０ｘ１０６［ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］に設定された。凍結処理液は、５０ｖｏｌ％の培地、３４ｖｏｌ％の細胞凍結保存液および１６ｖｏｌ％のヒト血清アルブミンで形成された。凍結処理液は５ｖｏｌ％の濃度でジメチルスルホキシドを含有した。懸濁液は５［ｍＬ］の保存容器に封入された。保存容器はマイナス８０℃のフリーザーで緩慢冷却された。保存容器内で細胞は凍結した。凍結細胞および培地の総量は３０［ｍＬ］に調整された。図７に示されるように、培地はいくつかのパターンで保存容器に導入された。実施例７では２つの保存容器が直接に接続された。本検証では顕熱変化ユニット２３に代えて加温ユニットが用いられた。実験条件及び結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表３中、「細胞生存率」では、残存する凍結細胞も含んで生存する細胞の総数が計数され、「細胞収率」では、排出配管３２から排出された培地内に含まれる細胞が計数された。
１１　凍結細胞解凍装置
１２　凍結細胞
１３　容器（第１容器）
１５　融解ユニット
２３　顕熱変化ユニット
２５　導入配管
２６　（第２容器内の）培地
３１　加温ユニット
３２　排出配管
３４　液流れユニット（ポンプ）
３８　（第１容器内の）培地

Claims (6)

  1. 　液体の培地を案内する導入配管と、
    　凍結保護剤を含む凍結処理液を含有する凍結細胞を収容しながら前記導入配管から前記培地を導入する容器を保持し、前記凍結細胞に接触する前記培地から前記凍結細胞に融解熱を加える融解ユニットと、
    　前記凍結細胞に対して前記培地の相対移動を生み出す液流れユニットと、
    　前記容器に接続されて、解凍された細胞を含む前記培地の排出を案内する排出配管と
    　を備え、
    　解凍された前記細胞が前記培地に分散する際に前記培地中で前記凍結保護剤の濃度は３ｖｏｌ％以下に維持される
    　凍結細胞解凍装置。
  2. 　前記凍結細胞は、前記凍結保護剤を５ｖｏｌ％以上１０ｖｏｌ％以下で含有する
    　請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。
  3. 　解凍された前記細胞が前記培地に分散する際に前記培地中で前記凍結保護剤の濃度は１ｖｏｌ％以下に維持される
    　請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。
  4. 　前記容器への導入に先立って前記培地を加熱する加温ユニットを備える
    　請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。
  5. 　前記容器に接続されて、前記容器を加熱する顕熱変化ユニットを備える
    　請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。
  6. 　前記凍結保護剤は、ジメチルスルホキシドを含有する
    　請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009189362A (ja) * 2008-01-15 2009-08-27 Panasonic Corp 細胞培養装置
WO2015159950A1 (ja) * 2014-04-17 2015-10-22 東京エレクトロン株式会社 多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム
JP2019006695A (ja) * 2017-06-22 2019-01-17 学校法人明治大学 生体試料保存容器
JP2019154761A (ja) * 2018-03-13 2019-09-19 テルモ株式会社 融解装置及び融解方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009189362A (ja) * 2008-01-15 2009-08-27 Panasonic Corp 細胞培養装置
WO2015159950A1 (ja) * 2014-04-17 2015-10-22 東京エレクトロン株式会社 多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム
JP2019006695A (ja) * 2017-06-22 2019-01-17 学校法人明治大学 生体試料保存容器
JP2019154761A (ja) * 2018-03-13 2019-09-19 テルモ株式会社 融解装置及び融解方法

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