WO2024252885A1 - セロビオースの製造方法 - Google Patents

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WO2024252885A1
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phosphorylase
cellobiose
sucrose
yeast
seq
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清綱 豊原
智也 ▲濱▼田
淳一 石丸
健太郎 猪熊
寿 安枝
誠久 蓮沼
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Kobe University NUC
Teijin Ltd
Original Assignee
Kobe University NUC
Teijin Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cellobiose from sucrose using yeast that expresses an enzyme on its surface.
  • Enzymatic degradation and enzymatic synthesis methods have been known as methods for producing cellobiose.
  • an enzymatic degradation method is known in which a cellulase preparation is reacted with cellulose to obtain cellobiose (Patent Document 1, Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 1 an enzymatic synthesis method is known in which starch is used as a starting material and ⁇ -glucan phosphorylase and cellobiose phosphorylase are allowed to act on the starch to obtain cellobiose
  • Patent Document 3 a method is known in which sucrose is used as a starting material and sucrose phosphorylase, glucose isomerase, and cellobiose phosphorylase are allowed to act on the sucrose to obtain cellobiose.
  • cellulose is used as the raw material.
  • Cellulose is the main component of plant cell walls, but it usually exists as a mixture with hemicellulose, lignin, etc. Therefore, when using cellulose in such plant cell walls as a raw material, it is first necessary to remove the hemicellulose, lignin, etc. by methods such as alkali treatment, which poses the problem of high production costs for the raw material.
  • the enzymatic synthesis method has low conversion efficiency from starch to glucose 1-phosphate and from sucrose to cellobiose, and requires reactions to be carried out under mild conditions (around 30°C) using enzymes, resulting in a slow reaction rate and making it unsuitable for low-cost cellobiose production.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing cellobiose from sucrose with a high conversion rate and at low cost.
  • the present inventors have discovered that by allowing sucrose to coexist in a reaction solution containing yeast expressing sucrose phosphorylase (hereinafter sometimes referred to as "SP") and cellobiose phosphorylase (hereinafter sometimes referred to as “CBP”) and glucose isomerase (hereinafter sometimes referred to as "XI”), it is possible to produce cellobiose at a high conversion rate and at low cost, and have completed the present invention.
  • SP sucrose phosphorylase
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • XI glucose isomerase
  • the present invention includes the following inventions.
  • [Item 1] A method for producing cellobiose, comprising a reaction step of allowing sucrose to coexist in a reaction solution containing a recombinant yeast expressing sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase and glucose isomerase.
  • [Item 2] The production method according to Item 1, wherein the recombinant yeast is a yeast of the genus Saccharomyces, Pichia, or Yarrowia.
  • [Item 3] The production method according to Item 1 or 2, wherein the sucrose phosphorylase is derived from a bacterium of the genus Bifidobacterium, Leuconostoc, or Streptococcus.
  • sucrose phosphorylase comprises a secreted sucrose phosphorylase secreted and expressed from a recombinant yeast, and an tethered sucrose phosphorylase expressed in a state tethered to the cell wall of the recombinant yeast.
  • the cellobiose phosphorylase is derived from a bacterium of the genus Clostridium, Ruminococcus, Cellulomonas, or Thermotoga.
  • [Item 6] The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the recombinant yeast is a recombinant yeast that expresses both sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase in a single cell.
  • the recombinant yeast is a combination of a recombinant yeast expressing sucrose phosphorylase and a recombinant yeast expressing cellobiose phosphorylase.
  • the recombinant yeast is a yeast transformed with an expression vector carrying a sucrose phosphorylase gene.
  • [Item 9] The production method described in Item 8, wherein the expression vector comprises a combination of a first expression vector carrying both a sucrose phosphorylase gene and a yeast cell wall domain gene, and a second expression vector carrying only the sucrose phosphorylase gene but not the yeast cell wall domain gene.
  • the glucose isomerase is derived from a bacterium of the genus Streptomyces.
  • the method according to any one of Items 1 to 10 further comprising treating the recombinant yeast at 45° C. to 75° C. for 15 to 150 minutes before allowing sucrose to coexist in the reaction solution.
  • the present invention makes it possible to produce cellobiose from sucrose with a high conversion rate and low cost.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the sucrose phosphorylase activity of a recombinant yeast strain expressing sucrose phosphorylase.
  • FIG. 2 is a graph showing the changes over time in the concentrations of sucrose, glucose, fructose, and cellobiose in the reaction supernatant in an experiment to produce cellobiose from sucrose using a recombinant yeast strain expressing sucrose phosphorylase in combination with a recombinant yeast strain expressing cellobiose phosphorylase.
  • the graph in Figure 2(a) shows the results when a strain expressing cellobiose phosphorylase (CsCBP) derived from Clostridium stercorarium was used
  • the graph in Figure 2(b) shows the results when a strain expressing cellobiose phosphorylase (CuCBP) derived from Cellulomonas uda was used
  • the graph in Figure 2(c) shows the results when a strain expressing cellobiose phosphorylase (TaCBP) derived from Thermosipho africanus was used
  • the graph in Figure 2(d) shows the results when a strain expressing cellobiose phosphorylase (TnCBP) derived from Thermotoga neapolitana was used.
  • Figure 3 is a graph showing the time course of the concentrations of sucrose, glucose, fructose, and cellobiose in the reaction supernatant in an experiment to produce cellobiose from sucrose using a single recombinant yeast strain co-expressing sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase.
  • the graph in Figure 3(a) shows the results when a recombinant yeast with Saccharomyces cerevisiae as the host was used
  • the graph in Figure 3(b) shows the results when a recombinant yeast with Pichia pastoris as the host was used.
  • Figure 4 is a graph showing the time course of the concentrations of sucrose, glucose, fructose, and cellobiose in the reaction supernatant of an experiment to produce cellobiose from sucrose using a single recombinant yeast strain co-expressing sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase with Pichia pastoris as the host.
  • the graph in Figure 4(a) shows the results when the Pp-SP2CBP strain was cultured using glucose as the carbon source
  • the graph in Figure 4(b) shows the results when the Pp-SP2CBP strain was cultured using glycerol as the carbon source.
  • Figure 5 is a graph showing the time course of sucrose, glucose, fructose, and cellobiose concentrations in the reaction supernatant of a repeated experiment of cellobiose production from sucrose using a single recombinant yeast strain co-expressing sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase.
  • the graph in Figure 5(a) shows the results when recombinant yeast with Saccharomyces cerevisiae as the host was cultured using glucose as the carbon source
  • the graph in Figure 5(b) shows the results when recombinant yeast with Pichia pastoris as the host was cultured using glycerol as the carbon source.
  • identity of amino acid sequences means the proportion of identical amino acid residues
  • similarity means the proportion of identical or similar amino acid residues.
  • homology and identity of amino acid sequences can be determined, for example, by the BLAST method (NCBI PBLAST default conditions). Furthermore, for example, when it is expressed as “80% or more homology,” it clearly includes the case of "80% or more identity.”
  • similar amino acid residues refers to amino acid residues having side chains with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity).
  • similar amino acid residues include the following combinations: (1) Amino acid residues having an aliphatic side chain: glycine (Gly or G), alanine (Ala or A), valine (Val or V), leucine (Leu or L), and isoleucine (Ile or I) residues. (2) Amino acid residues having aliphatic hydroxyl side chains: serine (Ser or S) and threonine (Thr or T) residues.
  • Amino acid residues having amide-containing side chains asparagine (Asn or N) and glutamine (Gln or Q) residues.
  • Amino acid residues having aromatic side chains phenylalanine (Phe or F), tyrosine (Tyr or Y), and tryptophan (Trp or W) residues.
  • Amino acid residues having basic side chains lysine (Lys or K), arginine (Arg or R), and histidine (His or H) residues.
  • Amino acid residues having acidic side chains aspartic acid (Asp or D) and glutamic acid (Glu or E) residues.
  • Amino acid groups having sulfur-containing side chains cysteine (Cys or C) and methionine (Met or M) residues. Furthermore, the combination of (1) and a methionine (Met or M) residue, and the combination of (4) and a histidine (His or H) residue are also treated as similar amino acid residues.
  • One aspect of the present invention relates to a method for producing cellobiose.
  • the method includes a step of allowing sucrose to coexist in a reaction solution containing a recombinant yeast expressing sucrose phosphorylase (SP) and cellobiose phosphorylase (CBP) and glucose isomerase (XI).
  • SP sucrose phosphorylase
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • XI glucose isomerase
  • the yeast species is not particularly limited as long as it is capable of expressing sucrose phosphorylase (SP) and cellobiose phosphorylase (CBP).
  • examples include yeasts of the genus Saccharomyces, Pichia, or Yarrowia.
  • yeasts that do not have invertase activity on the cell surface such as Pichia pastoris.
  • yeasts that have strong invertase activity on the cell surface such as Saccharomyces cerevisiae, it is preferable to use a strain in which invertase activity has been lost by gene knockout or the like.
  • Pichia pastoris since Pichia pastoris has been classified and renamed as Komagataella pastoris and Komagataella phaffii, Pichia pastoris is a synonym for both Komagataella pastoris and Komagataella phaffii.
  • sucrose phosphorylase The origin (species) of sucrose phosphorylase (SP) is not particularly limited. Examples include those derived from bacteria of the genus Bifidobacterium, Leuconostoc, or Streptococcus. Of these, those derived from bacteria of the genus Bifidobacterium are preferred, and those derived from Bifidobacterium longum are particularly preferred.
  • the amino acid sequence of sucrose phosphorylase (SP) from Bifidobacterium longum is shown in SEQ ID NO: 34, and an example of a base sequence encoding this is shown in SEQ ID NO: 5.
  • sucrose phosphorylase (SP) derived from Bifidobacterium longum examples include proteins consisting of an amino acid sequence having 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO:34.
  • sucrose phosphorylase When sucrose phosphorylase (SP) is expressed in recombinant yeast, it can be in the form of a secreted enzyme secreted and expressed from the recombinant yeast, or in the form of an tethered enzyme expressed in a state tethered to the cell wall of the recombinant yeast, but either form is acceptable. However, in the present invention, it is preferable to allow the secreted sucrose phosphorylase (SP) secreted and expressed from the recombinant yeast and the tethered sucrose phosphorylase (SP) expressed in a state tethered to the cell wall of the recombinant yeast to coexist in the reaction solution. This makes it possible to improve the conversion efficiency by sucrose phosphorylase (SP). The reason for this is unclear, but it is speculated to be due to the formation of a dimer between the secreted sucrose phosphorylase (SP) and the tethered sucrose phosphorylase (SP).
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • SEQ ID NO: 35 amino acid sequence of cellobiose phosphorylase (CBP) from Clostridium stercorarium is shown in SEQ ID NO: 35, and an example of the base sequence encoding this is shown in SEQ ID NO: 6.
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • it may be in the form of a secreted enzyme secreted and expressed from the recombinant yeast, or in the form of an tethered enzyme expressed in a state tethered to the cell wall of the recombinant yeast, either of which may be used.
  • it is preferable to express it in the form of tethered cellobiose phosphorylase (CBP) expressed in a state tethered to the cell wall of the recombinant yeast.
  • recombinant yeast As the recombinant yeast, a recombinant yeast that co-expresses sucrose phosphorylase (SP) and cellobiose phosphorylase (CBP) in a single cell may be used, or a recombinant yeast that expresses sucrose phosphorylase (SP) may be used in combination with a recombinant yeast that expresses cellobiose phosphorylase (CBP).
  • SP sucrose phosphorylase
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • sucrose phosphorylase SP
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • a recombinant yeast that co-expresses the secreted enzyme and the tethered enzyme in a single cell may be used, or a recombinant yeast that expresses the secreted enzyme may be used in combination with a recombinant yeast that expresses the tethered enzyme.
  • the method for preparing recombinant yeast expressing sucrose phosphorylase (SP) and/or cellobiose phosphorylase (CBP) is not particularly limited.
  • one or more types of yeast are transformed with one or more expression vectors carrying the sucrose phosphorylase (SP) gene and/or the cellobiose phosphorylase (CBP) gene.
  • expression vectors include plasmids, cosmids, lambda phages, etc., with plasmids being preferred.
  • sucrose phosphorylase (SP) gene and/or cellobiose phosphorylase (CBP) gene are operably linked to regulatory sequences such as a promoter and a terminator, and carried in the expression vector in the form of an expression cassette that can be expressed autonomously in yeast cells.
  • regulatory sequences such as a promoter and a terminator
  • Such expression vectors can be constructed using standard genetic engineering techniques known to those skilled in the art, by referring appropriately to literature such as Michael R. Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, (2012), Cold Spring Harbor Laboratory.
  • the recombinant yeast is preferably pre-cultured in the presence of a carbon source prior to the reaction.
  • a carbon source there are no particular limitations on the type of carbon source used when culturing the recombinant yeast cells, and it may be selected appropriately depending on the type of yeast. Examples include glucose and glycerol. Of these, in the present invention, it is preferable to use at least glycerol as a carbon source. This can improve the conversion rate of sucrose to cellobiose.
  • a pretreatment prior to the reaction to stop the uptake of glucose.
  • An example of such a pretreatment is a heat treatment in which the yeast is exposed to a certain temperature for a certain period of time.
  • the treatment conditions are sufficient as long as they can stop the uptake of glucose by the yeast used.
  • the heating temperature can be, for example, 45°C or higher, or 50°C or higher, or 55°C or higher, and can be, for example, 75°C or lower, or 70°C or lower, or 65°C or lower.
  • the heating time can be, for example, 15 minutes or more, or 45 minutes or more, or 70 minutes or more, and can be, for example, 150 minutes or less, 120 minutes or less, or 100 minutes or less.
  • the temperature can be about 60°C, and the time can be about 90 minutes.
  • One example of such a pretreatment method is shaking a suspension of the transformed yeast under the above conditions.
  • glucose isomerase (XI) is allowed to coexist in a reaction solution containing recombinant yeast expressing sucrose phosphorylase (SP) and cellobiose phosphorylase (CBP).
  • the amount of recombinant yeast cells in the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, 25 g wet cells/L or more, 50 g wet cells/L or more, or 75 g wet cells/L or more, and can be, for example, 200 g wet cells/L or less, 150 g wet cells/L or less, or 100 g wet cells/L or less.
  • Glucose isomerase also known as xylose isomerase, XI
  • XI xylose isomerase
  • Glucose isomerase may be expressed in yeast or other microorganisms in the same manner as other enzymes, but it is preferable to use the isolated glucose isomerase (XI) enzyme itself.
  • the isolated glucose isomerase (XI) enzyme may be either a commercially available product or one obtained by culturing a microorganism that produces these enzymes. It may also be either a purified product or an unpurified product. In this case, it is preferable to add the isolated glucose isomerase (XI) enzyme to a reaction solution containing recombinant yeast that expresses sucrose phosphorylase (SP) and cellobiose phosphorylase (CBP) and allow them to coexist.
  • SP sucrose phosphorylase
  • CBP cellobiose phosphorylase
  • the amount of glucose isomerase (XI) is not particularly limited, but is usually preferably 0.01 units or more, 0.1 units or more, or 1.0 units or more per mole of sucrose.
  • 1 unit (1 U) means the amount of enzyme that breaks down 1 ⁇ mol of fructose in 1 wt/vol % sucrose at 50°C and pH 7.0 per minute.
  • the reaction is carried out in the presence of sucrose in a reaction solution containing recombinant yeast expressing sucrose phosphorylase (SP) and cellobiose phosphorylase (CBP) and glucose isomerase (XI).
  • sucrose may be naturally occurring or chemically synthesized.
  • concentration as high as possible is preferable.
  • solubility of the cellobiose produced is about 15 to 20%, if it is desired to keep it dissolved, it is preferable to use a sucrose concentration of about 10 to 20%.
  • the conditions for the cellobiose synthesis reaction are not limited, but may be, for example, as follows. That is, the reaction temperature may be, for example, 35°C or higher, 45°C or higher, or 50°C or higher, and, for example, 60°C or lower, or 70°C or lower.
  • the reaction time may be, for example, 60 minutes or more, 12 hours or more, or 24 hours or more, and may be, for example, 36 hours or less, or 48 hours or less.
  • the pressure during the reaction is not particularly limited, and may be reduced pressure, normal pressure, or pressurized, but is usually carried out under normal pressure.
  • the atmosphere during the reaction is also not particularly limited, and any atmosphere may be used as long as the enzyme activity is maintained even in an atmosphere in which the recombinant yeast used cannot grow.
  • cellobiose can be obtained by separating and purifying it from the reaction solution as necessary.
  • any method can be used, including, for example, filtration separation, centrifugation, membrane separation, etc. These methods allow efficient separation of the used bacteria and cellobiose.
  • it may be purified to a higher degree by treatment with an ion exchange resin or recrystallization.
  • the recombinant yeast may be separated and recovered from the reaction solution as necessary and reused in the cellobiose synthesis reaction. Even when the recombinant yeast of the present invention is separated and recovered from the reaction solution and reused in this way, the enzyme activity may be maintained, and high cellobiose synthesis efficiency may be repeatedly obtained. That is, according to a preferred embodiment, the cellobiose production method of the present invention further includes recovering the recombinant yeast from the reaction solution after the reaction step and subjecting it to another reaction step.
  • the method for separating and recovering the recombinant yeast from the reaction solution is not limited, but examples include centrifugation.
  • the number of times the recombinant yeast is separated and recovered and reused is not particularly limited, but according to one embodiment, it can be subjected to a reaction, for example, two or more times, three or more times, four or more times, or five or more times.
  • the activity of the recombinant yeast when reused is not particularly limited, but according to one embodiment, it is preferable that 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the activity in the previous reaction is maintained in the next reaction.
  • Example Group I Cellobiose production using transformed yeast (yeast displaying sucrose phosphorylase on the surface, yeast displaying cellobiose phosphorylase on the surface, and yeast displaying sucrose phosphorylase + cellobiose phosphorylase on the surface)]
  • yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain MAT ⁇ his3 leu2 met15 ura3 strain
  • yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 ⁇ SUC2 strain MAT ⁇ his3 leu2 met15 ura3 suc2 strain
  • the yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain was obtained from ATCC (American Type Culture Collection), and the yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 ⁇ SUC2 strain was obtained from Yeast deletion MAT-A complete set (Thermo Fisher Scientific).
  • Plasmids containing the following expression cassettes X1 to X9 were prepared by the following procedure.
  • vector plasmid pIEG-SSSD (a surface expression vector having an expression cassette in which the SED1 promoter derived from Saccharomyces cerevisiae, the secretory signal peptide sequence of SED1 derived from Saccharomyces cerevisiae, the coding region of the endoglucanase II (TrEGII) gene derived from Trichoderma reesei, the coding region (SED1 anchoring region) of the SED1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae, and the terminator region of the DIT1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae are arranged in this order: Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.105, 2021,
  • the resulting vector plasmid was amplified by PCR using primer pair SED1a-F (SEQ ID NO: 14) and SED1ss-R (SEQ ID NO: 15) with pIBISP-SSSD (SEQ ID NO: 5895-590
  • the resulting plasmid containing expression cassette X1 (SED1 promoter (SEQ ID NO: 1) + SED1 secretion signal (SEQ ID NO: 2) + BlSP (SEQ ID NO: 5) + SED1 anchoring region (SEQ ID NO: 3) + DIT1 terminator (SEQ ID NO: 4)) was named pIBlSP-SSSD.
  • the primer pair BlSP-F (SEQ ID NO: 18) and DIT1t-R (SEQ ID NO: 19) were used to amplify by PCR to prepare a DNA fragment containing the coding region of the sucrose phosphorylase (BlSP) gene derived from Bifidobacterium longum and the terminator region of the DIT1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae.
  • BlSP sucrose phosphorylase
  • vector plasmid pIL2-BG-SSS (a surface expression vector having an expression cassette in which the SED1 promoter derived from Saccharomyces cerevisiae, the secretory signal peptide sequence of SED1 derived from Saccharomyces cerevisiae, the coding region of the ⁇ -glucosidase 1 (AaBGL1) gene derived from Aspergillus aculeatus, the coding region (SED1 anchoring region) of the SED1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae, and the terminator region of the ⁇ -agglutinin gene derived from Saccharomyces cerevisiae are arranged in this order: Metabolic Engineering, Vol.
  • pRS403-F SEQ ID NO: 20
  • pRS403-S SEQ ID NO: 15
  • pRS403-F SEQ ID NO: 20
  • pRS403-S SEQ ID NO: 15
  • pRS403-F SEQ ID NO: 20
  • a DNA fragment was prepared that contained the entire length of the vector plasmid excluding the coding region of the ⁇ -glucosidase 1 (AaBGL1) gene derived from Aspergillus aculeatus, the coding region (SED1 anchoring region) of the SED1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae, and the terminator region of the ⁇ -agglutinin gene derived from Saccharomyces cerevisiae. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing the expression cassette X2 (SED1 promoter (SEQ ID NO: 1) + SED1 secretion signal (SEQ ID NO: 2) + BlSP (SEQ ID NO: 5) + DIT1 terminator (SEQ ID NO: 4)) was named pIL2-BlSP-SSD.
  • Preparation Example 1-3 Preparation of vector plasmid containing Clostridium stercorarium-derived cellobiose phosphorylase (CsCBP) surface expression cassette X3) A DNA fragment containing the coding region of the cellobiose phosphorylase (CsCBP) gene derived from Clostridium stercorarium was prepared by gene synthesis.
  • CsCBP Clostridium stercorarium-derived cellobiose phosphorylase
  • vector plasmid pIEG-SSSD (a surface expression vector having a cassette in which the SED1 promoter derived from Saccharomyces cerevisiae, the secretory signal peptide sequence of SED1 derived from Saccharomyces cerevisiae, the coding region of the endoglucanase II (TrEGII) gene derived from Trichoderma reesei, the coding region (SED1 anchoring region) of the SED1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae, and the terminator region of the DIT1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae are arranged in this order: Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.105, 2021, Using the primer pair SED1a-F (SEQ ID NO: 14) and SED1ss-R (SEQ ID NO: 15) and PCR amplification was performed using the 5'-terminal end of the primer pair SED1a-F (SEQ ID NO: 14)
  • SED1p-F SEQ ID NO: 21
  • DIT1t-R SEQ ID NO: 19
  • vector plasmid pIU5-CBH D (a surface expression vector having a cassette in which the Saccharomyces cerevisiae-derived SED1 promoter, the coding region of the Talaromyces emersonii-derived cellobiohydrolase (TsCBH1) gene, the coding region of the Saccharomyces cerevisiae-derived SED1 gene (SED1 anchoring region), and the terminator region of the Saccharomyces cerevisiae-derived ⁇ -agglutinin gene are arranged in this order: Biotechnology and Bioengineering, Vol.
  • TsCBH1 Talaromyces emersonii-derived cellobiohydrolase
  • the vector plasmid was amplified by PCR using primer pair pRS403-F (SEQ ID NO: 20) and pRS403-R (SEQ ID NO: 22) to prepare a DNA fragment containing the entire length of the vector plasmid excluding the expression cassette region. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing expression cassette X3 (SED1 promoter (SEQ ID NO: 1) + SED1 secretion signal (SEQ ID NO: 2) + CsCBP (SEQ ID NO: 6) + SED1 anchoring region (SEQ ID NO: 3) + DIT1 terminator (SEQ ID NO: 4)) was named pIU5-CsCBP-SSSD.
  • the vector plasmid pIU5-CsCBP-SSSD was used as a template, and the primer pair SED1a-F (SEQ ID NO: 14) and SED1ss-R (SEQ ID NO: 15) were used to amplify by PCR to prepare a DNA fragment containing the full length of the vector plasmid excluding the coding region of the CsCBP gene. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing the expression cassette X4 (SED1 promoter (SEQ ID NO: 1) + SED1 secretion signal (SEQ ID NO: 2) + CuCBP (SEQ ID NO: 7) + SED1 anchoring region (SEQ ID NO: 3) + DIT1 terminator (SEQ ID NO: 4)) was named pIU5-CuCBP-SSSD.
  • the vector plasmid pIU5-CsCBP-SSSD was used as a template, and the primer pair SED1a-F (SEQ ID NO: 14) and SED1ss-R (SEQ ID NO: 15) were used to amplify the vector plasmid by PCR, to prepare a DNA fragment containing the full length of the vector plasmid excluding the coding region of the CsCBP gene. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing the expression cassette X5 (SED1 promoter (SEQ ID NO: 1) + SED1 secretion signal (SEQ ID NO: 2) + TaCBP (SEQ ID NO: 8) + SED1 anchoring region (SEQ ID NO: 3) + DIT1 terminator (SEQ ID NO: 4)) was named pIU5-TaCBP-SSSD.
  • Preparation Example 1-6 Preparation of vector plasmid containing Thermotoga neapolitana-derived cellobiose phosphorylase (TnCBP) surface expression cassette X6) A DNA fragment containing the coding region of the Thermotoga neapolitana-derived cellobiose phosphorylase (TnCBP) gene was prepared by gene synthesis.
  • TnCBP Thermotoga neapolitana-derived cellobiose phosphorylase
  • the vector plasmid pIU5-CsCBP-SSSD was used as a template, and the primer pair SED1a-F (SEQ ID NO: 14) and SED1ss-R (SEQ ID NO: 15) were used to amplify the vector plasmid by PCR, to prepare a DNA fragment containing the full length of the vector plasmid excluding the coding region of the CsCBP gene. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing the expression cassette X6 (SED1 promoter (SEQ ID NO: 1) + SED1 secretion signal (SEQ ID NO: 2) + TnCBP (SEQ ID NO: 9) + SED1 anchoring region (SEQ ID NO: 3) + DIT1 terminator (SEQ ID NO: 4)) was named pIU5-TnCBP-SSSD.
  • Preparation Example 1-7 Preparation of vector plasmid containing Bifidobacterium longum-derived sucrose phosphorylase (BISP) surface expression cassette X7) Using the plasmid pIBlSP-SSSD as a template, amplified by PCR using the primer pair BlSP-NheI-F (SEQ ID NO: 23) and BlSP-XhoI-R (SEQ ID NO: 24), and further treated with NheI and XhoI, to prepare a DNA fragment containing the coding region of the BlSP gene.
  • BlSP-NheI-F SEQ ID NO: 23
  • BlSP-XhoI-R SEQ ID NO: 24
  • vector plasmid pIBG-PpSSG61 (a surface expression vector having an expression cassette in which the SPI1 promoter derived from Pichia pastoris, the secretory signal peptide sequence of SPI1 derived from Pichia pastoris, the coding region of the ⁇ -glucosidase 1 (AaBGL1) gene derived from Aspergillus aculeatus, the coding region of the GCW61 gene derived from Pichia pastoris (GCW61 anchoring region), and the terminator region of the AOX1 gene derived from Pichia pastoris are arranged in this order: Biotechnology and Bioengineering, Vol.120, 2023, 1097-1107) was treated with NheI and XhoI to prepare a DNA fragment containing the entire length of the vector plasmid excluding the coding region of the AaBGL1 gene.
  • plasmid pIBG-PpGMG30 (a surface expression vector having an expression cassette in which a GAPDH promoter derived from Pichia pastoris, a secretory signal peptide sequence of ⁇ -factor derived from Saccharomyces cerevisiae, a coding region of ⁇ -glucosidase 1 (AaBGL1) gene derived from Aspergillus aculeatus, a coding region of GCW30 gene derived from Pichia pastoris (GCW30 anchoring region), and a terminator region of AOX1 gene derived from Pichia pastoris are arranged in this order: Biotechnology and Bioengineering, Vol.120, 2023, 1097-1107) was treated with XhoI and Ml
  • the vector plasmid was amplified by PCR using pIH-PpSS (SEQ ID NO: 28) and a DNA fragment containing the entire length of the vector plasmid excluding the coding region of the TrEGII gene and the GCW34 anchoring region was prepared. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing the expression cassette X8 (SPI1 promoter (SEQ ID NO: 10) + SPI1 secretion signal (SEQ ID NO: 11) + BlSP (SEQ ID NO: 5) + AOX1 terminator (SEQ ID NO: 13)) was named pIH-BlSP-PpSS.
  • a DNA fragment containing the full length of the vector plasmid excluding the coding region of the BlSP gene was prepared by treating the vector plasmid pIBlSP-PpSSG30 with NheI and XhoI. These fragments were ligated.
  • this plasmid was used as a template and amplified by PCR using the primer pair CsCBP-F (SEQ ID NO: 31) and AOX1t-R (SEQ ID NO: 32) to prepare a DNA fragment containing the coding region of the CsCBP gene, the GCW30 anchoring region, and the AOX1 terminator region.
  • a vector plasmid pIZ-CBH1-PpSSG34 (a surface expression vector having an expression cassette in which the coding region of SPI1 derived from Pichia pastoris, the coding region of the cellobiohydrolase (TsCBH1) gene derived from Talaromyces emersonii, the coding region of the GCW34 gene derived from Pichia pastoris (GCW34 anchoring region), and the terminator region of the AOX1 gene derived from Pichia pastoris are arranged in this order: Biotechnology and Bioengineering, Vol.
  • RNA fragment was prepared containing the entire length of the vector plasmid excluding the coding region of the TsCBH1 gene, the GCW34 anchoring region, and the AOX1 terminator region. These fragments were ligated by the In-Fusion method.
  • the resulting plasmid containing the expression cassette X9 (SPI1 promoter (SEQ ID NO: 10) + SPI1 secretion signal (SEQ ID NO: 11) + CsCBP (SEQ ID NO: 6) + GCW30 anchoring region (SEQ ID NO: 12) + AOX1 terminator (SEQ ID NO: 13)) was named pIZ-CsCBP-PpSSG30.
  • Preparation Example 2-1 Production of sucrose phosphorylase surface-displaying yeast
  • the plasmid pIBlSP-SSSD described in Preparation Example 1-1 was treated with NdeI, and then used in yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 ⁇ SUC2 strain, which was transformed by the lithium acetate method.
  • This transformed strain is referred to as the ⁇ SUC2-BlSP strain.
  • the plasmid pIBlSP-PpSSG30 described in Preparation Example 1-7 was treated with EcoRV, and then used in yeast Pichia pastoris CBS7435 strain, which was transformed by the lithium acetate method. This transformed strain is referred to as the Pp-BlSP strain.
  • the plasmid pIL2-BlSP-SSD described in Preparation Example 1-2 was treated with NdeI, and then used in the ⁇ SUC2-BlSP strain to transform it by the lithium acetate method. This transformed strain is called the ⁇ SUC2-BlSP2 strain.
  • the plasmid pIH-BlSP-PpSS described in Preparation Example 1-8 was treated with BsrGI, and then used in the Pp-BlSP strain to transform it by the lithium acetate method. This transformed strain is called the Pp-BlSP2 strain.
  • Preparation Example 2-2 Production of cellobiose phosphorylase surface-displaying yeast
  • the plasmids pIU5-CsCBP-SSSD, pIU5-CuCBP-SSSD, pIU5-TaCBP-SSSD, and pIU5-TnCBP-SSSD described in Preparation Examples 1-3 to 1-6 were treated with SpeI, and then used in yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 ⁇ SUC2 strain to transform the strains by the lithium acetate method.
  • These transformed strains are referred to as ⁇ SUC2-CsCBP strain, ⁇ SUC2-CuCBP strain, ⁇ SUC2-TaCBP strain, and ⁇ SUC2-TnCBP strain, respectively.
  • Preparation Example 2-3 Production of yeast displaying sucrose phosphorylase + cellobiose phosphorylase on the surface
  • the plasmid pIU5-CsCBP-SSSD described in Preparation Example 1-3 was treated with SpeI, and then used in the ⁇ SUC2-B1SP2 strain to transform the strain by the lithium acetate method. This transformed strain is referred to as the ⁇ SUC2-SP2CBP strain.
  • the plasmid pIZ-CsCBP-PpSSG30 described in Preparation Example 1-9 was treated with NsiI, and then used in the Pp-B1SP2 strain to transform the strain by the electroporation method. This transformed strain is referred to as the Pp-SP2CBP strain.
  • yeasts transformed in A the ⁇ SUC2-BlSP strain, ⁇ SUC2-BlSP2 strain, ⁇ SUC2-CsCBP strain, ⁇ SUC2-CuCBP strain, ⁇ SUC2-TaCBP strain, ⁇ SUC2-TnCBP strain, and ⁇ SUC2-SP2CBP strains using Saccharomyces cerevisiae as a host were pretreated with 5 mL of YPD medium (1% dried yeast extract (Nacalai Tesque), Bacto TM Peptone (Life Technologies, Inc.)).
  • YPD medium 1% dried yeast extract (Nacalai Tesque), Bacto TM Peptone (Life Technologies, Inc.)
  • the bacteria were transferred to 2% Nacalai Tesque (Nippon Biotechnology) and 2% D-glucose (Nacalai Tesque) and pre-cultured at 30°C and 200 rpm for 18 hours, and then inoculated into 50 mL of YPD medium to an OD600 of 0.05 and cultured with shaking at 30°C and 150 rpm for 48 hours.
  • Pp-BlSP strain, Pp-BlSP2 strain, and Pp-SP2CBP strain which use Pichia pastoris as a host, were transplanted into 5 mL of YPG medium (1% dry yeast extract (Nacalai Tesque), 2% Bacto TM Peptone (Life Technologies), 2% glycerol (Nacalai Tesque)), pre-cultured for 18 hours at 30 ° C. and 200 rpm, and then inoculated into 50 mL of YPG medium so that the OD600 was 0.05, and cultured with shaking at 30 ° C. and 150 rpm for 48 hours.
  • YPG medium 1% dry yeast extract (Nacalai Tesque), 2% Bacto TM Peptone (Life Technologies), 2% glycerol (Nacalai Tesque)
  • reaction solution composition: 10 g/L sucrose (Nacalai Tesque); 80 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0); and pretreated cells of the Pp-BlSP strain or Pp-BlSP2 strain prepared in Preparation Example 2-1 (final cell concentration 100 g wet cells/L)) was prepared and reacted at 35 rpm and 60°C for 60 minutes.
  • the reaction solution was kept at 100°C for 10 minutes, then cooled on ice for 10 minutes, centrifuged to precipitate the cells, etc., and the supernatant was collected and used for analysis of fructose concentration.
  • the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of fructose in 1 minute is defined as 1 IU.
  • Sampling was performed twice, for 4 hours and 24 hours. To stop the reaction, the sampling liquid was placed in a sampling container and kept at 100°C for 10 minutes, then cooled on ice for 10 minutes, and centrifuged to precipitate the cells, etc., and the supernatant was collected and used for analysis.
  • sampled liquid was placed in a sampling container, kept at 100° C. for 10 minutes, then cooled on ice for 10 minutes and centrifuged to precipitate the bacteria and the like, and the supernatant was collected and used for analysis.
  • Figure 2 shows the time course of the sucrose, glucose, fructose, and cellobiose concentrations in the reaction supernatant of an experiment to produce cellobiose from sucrose using a combination of yeast D that displays sucrose phosphorylase and yeast D that displays cellobiose phosphorylase.
  • yeast D displays sucrose phosphorylase
  • yeast D displays cellobiose phosphorylase
  • Figure 3 shows the time course of the concentrations of sucrose, glucose, fructose, and cellobiose in the reaction supernatant of an experiment to produce cellobiose from sucrose using a sucrose phosphorylase + cellobiose phosphorylase surface-displaying yeast ( ⁇ SUC2-SP2CBP strain) with Saccharomyces cerevisiae as the host.
  • the graph in Figure 3(a) shows the results when the ⁇ SUC2-SP2CBP strain was used with Saccharomyces cerevisiae as the host, and the graph in Figure 3(b) shows the results when the Pp-SP2CBP strain was used with Pichia pastoris as the host.
  • Figure 3(a) which used a single recombinant yeast strain co-expressing sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase with the same Saccharomyces cerevisiae as a host, shows that sucrose was converted to cellobiose at a high conversion rate (about 70%) despite the same total amount of yeast cells used in the reaction.
  • Figure 4 shows the time course of the concentrations of sucrose, glucose, fructose, and cellobiose in the reaction supernatant of an experiment to produce cellobiose from sucrose using a sucrose phosphorylase + cellobiose phosphorylase surface-displaying yeast (Pp-SP2CBP strain) with E. Pichia pastoris as the host.
  • the graph in Figure 4(a) shows the results when the Pp-SP2CBP strain was cultured using glucose as the carbon source
  • the graph in Figure 4(b) shows the results when the Pp-SP2CBP strain was cultured using glycerol as the carbon source.
  • the conversion rate of sucrose to cellobiose in the Pp-SP2CBP strain was approximately 40% when it was cultured using glucose as the carbon source, but increased to approximately 80% when it was cultured using glycerol as the carbon source. This indicates that it is preferable to use glycerol as a carbon source when culturing a yeast that displays sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase on the surface using Pichia pastoris as a host.
  • Example Group II Repeated cellobiose production by reusing transformed yeast (sucrose phosphorylase + cellobiose surface display yeast)]
  • ⁇ SUC2-SP2CBP strain prepared in A was transferred to 5 mL of YPD medium (1% dried yeast extract (Nacalai Tesque), 2% Bacto TM Peptone (Life Technologies), 2% D-glucose (Nacalai Tesque)) and pre-cultured at 30°C and 200 rpm for 18 hours, and then inoculated into 50 mL of YPD medium to an OD600 of 0.05, and cultured with shaking at 30°C and 150 rpm for 48 hours.
  • YPD medium 1% dried yeast extract (Nacalai Tesque), 2% Bacto TM Peptone (Life Technologies), 2% D-glucose (Nacalai Tesque)
  • the Pp-SP2CBP strain was transferred to 5 mL of YPG medium (1% dried yeast extract (Nacalai Tesque), 2% Bacto TM Peptone (Life Technologies), 2% glycerol (Nacalai Tesque)), pre-cultured at 30 ° C. and 200 rpm for 24 hours, and then inoculated into 50 mL of YPG medium so that the OD600 was 0.05, and cultured with shaking at 30 ° C. and 150 rpm for 48 hours.
  • YPG medium 1% dried yeast extract (Nacalai Tesque), 2% Bacto TM Peptone (Life Technologies), 2% glycerol (Nacalai Tesque)
  • cellobiose production reaction solution 100 g/L sucrose (Nacalai Tesque); 80 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0); 1 wt% magnesium sulfate; 1.5 IU/mL glucose isomerase (xylose isomerase, Godo Shusei Co., Ltd., derived from Streptomyces griseofuscus); and pretreated cells of ⁇ SUC2-SP2CBP strain or Pp-SP2CBP strain prepared in G-1 (final cell concentration 100 g wet cells/L)) were prepared and reacted at 35 rpm and 60 ° C. for 24 hours (first time).
  • the yeast cells were collected by centrifugation of the reacted liquid, resuspended in a new reaction liquid, and reacted at 35 rpm and 60 ° C. for 24 hours (second time).
  • the third reaction was carried out in the same manner. Sampling was performed three times for each reaction, at 4 hours, 8 hours, and 24 hours. To stop the reaction, each sample was placed in a sampling container, kept at 100°C for 10 minutes, and then cooled on ice for 10 minutes and centrifuged to precipitate the bacteria and the like. The supernatant was collected and used for analysis.
  • sucrose phosphorylase + cellobiose phosphorylase surface-displaying yeast with Pichia pastoris cultured using glycerol as a carbon source was used as a transformed yeast, it was confirmed that the yeast of the Pp-SP2CBP strain maintained a high cellobiose conversion rate of about 80% even when the reaction was repeated three times at 60 ° C. for 24 hours.
  • the manufacturing method of the present invention can be used as a method for manufacturing cellobiose for use in food or pharmaceutical preparations.

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Abstract

低コストで効率の良いセロビオースの製造方法を提供する。本方法は、スクロースホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを表層に発現させた酵母とグルコースイソメラーゼを含有する反応液にスクロースを共存させる工程を含む。

Description

セロビオースの製造方法
　本発明は、酵素表層発現酵母によりスクロースからセロビオースを製造する方法に関する。
　セロビオースの製造方法としては、従来より酵素分解法と酵素合成法とが知られている。酵素分解法としては、例えば、セルラーゼ製剤をセルロースと反応させることによりセロビオースを得る方法（特許文献１、特許文献２）が知られている。酵素合成法としては、例えば、デンプンを出発物質として、αグルカンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを作用させることでセロビオースを得る方法（非特許文献１）や、スクロースを出発物質として、スクロースホスホリラーゼ、グルコースイソメラーゼ、及びセロビオースホスホリラーゼを作用させることでセロビオースを得る方法（特許文献３、特許文献４）が知られている。
　酵素分解法では原料としてセルロースを使用する。セルロースは植物の細胞壁の主成分であるが、通常はヘミセルロース、リグニン等との混合物として存在する。そこで、斯かる植物細胞壁中のセルロースを原料として使用する場合には、まずアルカリ処理等の方法でヘミセルロース、リグニン等を除かねばならず、そのため原料の製造コストが高くなるという課題がある。
　酵素合成法では、デンプンからグルコース１リン酸への変換効率や、スクロースからセロビオースの変換効率が低い上に、酵素を使用した温和な条件（３０℃程度）で反応させる必要があるため、反応速度が遅く、低コストでのセロビオース生産には適していないという課題がある。
特開平２－２９５４９２号公報 特開平８－８９２７４号公報 特開平３－１３００８６号公報 特表２０１９－５０７６０３号公報
Suzuki et al., J. Appl. Glycosci., (2010), 57:113-119
　本発明の目的は、スクロースから高い転換率及び低コストでセロビオースを製造できる方法を提供することにある。
　本発明者らは、スクロースホスホリラーゼ（以下適宜「ＳＰ」と記載することがある）及びセロビオースホスホリラーゼ（以下適宜「ＣＢＰ」と記載することがある）を発現させた酵母とグルコースイソメラーゼ（以下適宜「ＸＩ」と記載することがある）を含有する反応液にスクロースを共存させることにより、高い転換率で安価にセロビオースを製造可能となることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下の発明を包含する。
［項１］スクロースホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを発現する組換え酵母とグルコースイソメラーゼとを含有する反応液中にスクロースを共存させる反応工程を含む、セロビオースの製造方法。
［項２］組換え酵母が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、又はヤロウィア（Yarrowia）属の酵母である、項１に記載の製造方法。
［項３］スクロースホスホリラーゼが、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、又はストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌に由来する、項１又は２に記載の製造方法。
［項４］スクロースホスホリラーゼが、組換え酵母から分泌発現される分泌型スクロースホスホリラーゼと、組換え酵母の細胞壁に係留された状態で発現される係留型スクロースホスホリラーゼとを含む、項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
［項５］セロビオースホスホリラーゼが、クロストリジウム（Clostridium）属、ルミノコッカス（Ruminococcus）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、又はサーモトガ（Thermotoga）属の細菌に由来する、項１～４の何れか一項に記載の製造方法。
［項６］前記組換え酵母が、スクロースホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを単一の菌体で共に発現する組換え酵母である、項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
［項７］前記組換え酵母が、スクロースホスホリラーゼを発現する組換え酵母と、セロビオースホスホリラーゼを発現する組換え酵母との組み合わせである、項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
［項８］前記組換え酵母が、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を担持する発現ベクターにより形質転換された酵母である、項１～７の何れか一項に記載の製造方法。
［項９］前記発現ベクターが、スクロースホスホリラーゼ遺伝子及び酵母の細胞壁ドメイン遺伝子を共に担持する第１の発現ベクターと、酵母の細胞壁ドメイン遺伝子を担持せずスクロースホスホリラーゼ遺伝子のみを担持する第２の発現ベクターとの組み合わせを含む、項８に記載の製造方法。
［項１０］グルコースイソメラーゼが、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の細菌に由来する、項１～９の何れか一項に記載の製造方法。
［項１１］反応液中にスクロースを共存させる前に、組換え酵母を４５℃～７５℃で１５分～１５０分処理する工程を更に含む、項１～１０の何れか一項に記載の製造方法。
［項１２］前記反応工程の前に、炭素源としてグリセロールを用いて酵母細胞を培養する工程を含む、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
［項１３］前記反応工程の後に、製造されたセロビオースを反応液から分離する工程をさらに含む、項１～１２の何れか一項に記載の製造方法。
［項１４］前記反応工程の後に、前記組換え酵母を反応液から回収し、再度の反応工程に供することをさらに含む、項１～１３の何れか一項に記載の製造方法。
　本発明によれば、高い転換率及び低コストでスクロースからセロビオースを製造することが可能となる。
図１は、スクロースホスホリラーゼを発現する組換え酵母株のスクロースホスホリラーゼ活性測定の結果を示すグラフである。 図２は、スクロースホスホリラーゼを発現する組換え酵母株とセロビオースホスホリラーゼを発現する組換え酵母株を併用したスクロースからのセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を示すグラフである。図２（ａ）のグラフはクロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｓＣＢＰ）を発現する株を用いた場合、図２（ｂ）のグラフはセルロモナス・ウダ（Cellulomonas uda）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｕＣＢＰ）を発現する株を用いた場合、図２（ｃ）のグラフはサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＴａＣＢＰ）を発現する株を用いた場合、図２（ｄ）のグラフはサーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＴｎＣＢＰ）を発現する株を用いた場合を示す。 同上。 図３は、スクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼを共発現する単一の組換え酵母株を用いたスクロースからのセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を示すグラフである。図３（ａ）のグラフはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とする組換え酵母を用いた場合を示し、図３（ｂ）のグラフはピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主とする組換え酵母を用いた場合を示す。 図４は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主とし、スクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼを共発現する単一の組換え酵母株を用いたスクロースからのセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を示すグラフである。図４（ａ）のグラフはグルコースを炭素源として培養したＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた場合の結果を示し、図４（ｂ）のグラフはグリセロールを炭素源として培養したＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた場合の結果を示す。 図５は、スクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼを共発現する単一の組換え酵母株を用いたスクロースからの繰り返しセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を示すグラフである。図５（ａ）のグラフはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とする組換え酵母を、グルコースを炭素源として培養した場合の結果を示し、図５（ｂ）のグラフはピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主とする組換え酵母を、グリセロールを炭素源として培養した場合の結果を示す。
　以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。なお、本明細書に記載した特許文献及び非特許文献は、その全体が援用により本願に組み込まれる。
　なお、本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、一致するアミノ酸残基の割合を意味し、「相同性」（similarity）とは、一致又は類似するアミノ酸残基の割合を意味する。アミノ酸配列の相同性及び同一性は、例えばＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）により決定することができる。また、例えば「８０％以上の相同性」と表現するときには、「８０％以上の同一性」の場合を含んでいることは明らかである。
　また、本明細書において、「類似するアミノ酸残基」とは、同様の化学的特質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。類似するアミノ酸残基としては、例えば以下の組合せが挙げられる。
（１）脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基：グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、及びイソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）残基。
（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基：セリン（Ｓｅｒ又はＳ）及びトレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）残基。
（３）アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）残基。
（４）芳香族側鎖を有するアミノ酸残基：フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）残基。
（５）塩基性側鎖を有するアミノ酸残基：リジン（ＬｙｓまたＫ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（６）酸性側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）残基。
（７）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基：システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）残基。
　さらに、（１）とメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）の組み合わせ、及び、（４）とヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基の組み合わせも、類似するアミノ酸残基として扱われる。
　本発明の一側面は、セロビオースの製造方法に関する。斯かる製造方法は、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現する組換え酵母と、グルコースイソメラーゼ（ＸＩ）とを含有する反応液中に、スクロースを共存させる工程を含む。
　酵母の種は、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現可能なものであれば、特に限定されない。例としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、又はヤロウィア（Yarrowia）属の酵母が挙げられる。中でも、スクロースがインベルターゼの作用により分解されることを防ぐために、細胞表層にインベルターゼ活性を持たない酵母を用いることが好ましく、例としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のように細胞表層に強いインベルターゼ活性を持つ酵母については、遺伝子のノックアウトなどによりインベルターゼ活性を喪失させた株を用いることが好ましい。なお、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）及びコマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）に分類及び改名されているため、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）及びコマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）の両方の同義語である。
　スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）の由来（種）は特に限定されない。例としては、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、又はストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌に由来するものが挙げられる。中でも、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の細菌に由来するものが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）に由来するものがとりわけ好ましい。ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）のスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）のアミノ酸配列を配列番号３４に示し、これをコードする塩基配列の一例を配列番号５に示す。ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）に由来するスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）としては、前記の配列番号３４と８０％以上、又は８５％以上、又は８８％以上、又は９０％以上、又は９３％以上、又は９５％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
　スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を組換え酵母に発現させる場合、組換え酵母から分泌発現される分泌型酵素の形態と、組換え酵母の細胞壁に係留された状態で発現される係留型酵素の形態とが考えられるが、どちらの形態でもよい。ただし本発明では、組換え酵母から分泌発現される分泌型スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）と、組換え酵母の細胞壁に係留された状態で発現される係留型スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）とを、反応液内に共存させることが好ましい。これにより、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）による変換効率を向上させることが可能となる。その理由は定かではないが、分泌型スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）と係留型スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）が二量体を形成することによるものと推測される。
　セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）の由来（種）は特に限定されないが、クロストリジウム（Clostridium）属、ルミノコッカス（Ruminococcus）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、又はサーモトガ（Thermotoga）属の細菌に由来するものが挙げられる。中でも、クロストリジウム（Clostridium）属の細菌に由来するものが好ましく、クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来のものがとりわけ好ましい。クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）のセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）のアミノ酸配列を配列番号３５に示し、これをコードする塩基配列の一例を配列番号６に示す。クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）に由来するセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）としては、前記の配列番号３５と８０％以上、又は８５％以上、又は８８％以上、又は９０％以上、又は９３％以上、又は９５％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
　セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を組換え酵母に発現させる場合、組換え酵母から分泌発現される分泌型酵素の形態と、組換え酵母の細胞壁に係留された状態で発現される係留型酵素の形態とが考えられるが、どちらの形態でもよい。ただし本発明では、組換え酵母の細胞壁に係留された状態で発現される係留型セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）の形態とすることが好ましい。
　組換え酵母としては、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を単一の菌体で共発現する組換え酵母を用いてもよく、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を発現する組換え酵母と、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現する組換え酵母とを組み合わせて用いてもよい。また、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及び／又はセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）として、分泌型酵素と係留型酵素とを併用する場合には、分泌型酵素及び係留型酵素を単一の菌体で共発現する組換え酵母を用いてもよく、分泌型酵素を発現する組換え酵母と、係留型酵素を発現する組換え酵母とを組み合わせて用いてもよい。
　スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及び／又はセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現する組換え酵母を調製する手法は特に制限されない。例としては、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）遺伝子及び／又はセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）遺伝子を担持する１種又は２種以上の発現ベクターで、１種又は２種以上の酵母を形質転換する手法を挙げることができる。発現ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ラムダファージ等が挙げられるが、プラスミドが好ましい。また、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）遺伝子及び／又はセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）遺伝子を、更にプロモーター、ターミネーター等の調節配列を作動式に連結し、酵母細胞内で自律的に発現可能な発現カセットの形態として、発現ベクターに担持させることが好ましい。なお、斯かる発現ベクターの構築は、当業者に公知の遺伝子工学の標準的な手法を用いて、例えばMichael R. Green et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, (2012), Cold Spring Harbor Laboratory等の文献を適宜参照することにより実施することが可能である。
　組換え酵母は、反応に先立って炭素源の存在下で前培養することが好ましい。組換え酵母の細胞を培養する際に用いる炭素源の種類は特に制限されず、酵母の種類に応じて適宜選択すればよい。例としてはグルコース、グリセロール等が挙げられる。中でも、本発明では炭素源として少なくともグリセロールを使用することが好ましい。これにより、スクロースからセロビオースへの転換率を向上できる。
　組換え酵母は、反応に先立って前処理に供し、グルコースの取り込みを停止させることが好ましい。かかる前処理としては、一定の温度に一定時間に亘って晒す加熱処理が挙げられる。この場合の処理条件は、用いる酵母のグルコース取り込みを停止させることができさえすればよく、加熱温度としては例えば４５℃以上、又は５０℃以上、又は５５℃以上とすることができ、また、例えば７５℃以下、又は７０℃以下、又は６５℃以下とすることができる。また、加熱時間としては例えば１５分以上、又は４５分以上、又は７０分以上とすることができ、また、例えば１５０分以内、又は１２０分間以内、又は１００分以内とすることができる。好ましい一例によれば、温度は約６０℃、時間は約９０分間とすることができる。かかる前処理の方法の一例としては、形質転換酵母の懸濁液を前記条件で振とうすることが挙げられる。
　本発明では、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現する組換え酵母を含む反応液中に、グルコースイソメラーゼ（ＸＩ）を共存させる。反応液中の組換え酵母の菌体量は、特に制限されるものではないが、例えば２５ｇ湿潤細胞／Ｌ以上、又は５０ｇ湿潤細胞／Ｌ以上、又は７５ｇ湿潤細胞／Ｌ以上、また、例えば２００ｇ湿潤細胞／Ｌ以下、又は1５０ｇ湿潤細胞／Ｌ以下、又は1００ｇ湿潤細胞／Ｌ以下とすることができる。
　グルコースイソメラーゼ（別名キシロースイソメラーゼ、ＸＩ）としては、限定されるものではないが、例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の酵母に由来するものが挙げられる。中でも、ストレプトマイセス・グリセオフスクス（Streptomyces griseofuscus）に由来するものがとりわけ好ましい。なお、グルコースイソメラーゼとしては種々の市販品を入手できるところ、それらを用いることができる。
　グルコースイソメラーゼ（ＸＩ）は、他の酵素と同様に酵母又はその他の微生物に発現させてもよいが、単離されたグルコースイソメラーゼ（ＸＩ）酵素そのものを用いることが好ましい。単離されたグルコースイソメラーゼ（ＸＩ）酵素としては、市販品あるいはこれら酵素を生産する微生物等の培養により得られたもののいずれでもよい。また精製品あるいは未精製品のいずれでもよい。この場合、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現する組換え酵母を含む反応液に、単離されたグルコースイソメラーゼ（ＸＩ）酵素を加えて共存させることが好ましい。
　グルコースイソメラーゼ（ＸＩ）の量は、特に制限されないが、通常はスクロース１モルに対し０．０１単位以上、又は０．１単位以上、又は１．０単位以上とすることが好ましい。ここで１単位（１Ｕ）とは、５０℃において１ｗｔ／ｖｏｌ％のスクロースに、ｐＨ７．０において１分間に１μｍｏｌのフルクトースを分解する酵素量を意味する。
　本発明では、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を発現する組換え酵母とグルコースイソメラーゼ（ＸＩ）とを含む反応液中に、スクロースを共存させて反応を実施する。スクロースは、天然に存在するものでもよく、化学合成されたものでもよい。スクロースの量は、特に制限されないが、生産性の点からはできるだけ高い濃度が好ましい。ただし、生成するセロビオースの溶解度は１５から２０％程度なので、溶解した状態を保ちたい場合には１０から２０％程度のスクロース濃度を用いるのが好ましい。
　セロビオース合成反応時の条件は、制限されるものではないが、例えば以下の通りとすることができる。即ち、反応温度としては例えば３５℃以上、又は４５℃以上、又は５０℃以上、また、例えば６０℃以下、又は７０℃以下とすることができる。また、反応時間としては例えば６０分以上、又は１２時間以上、又は２４時間以上とすることができ、また、例えば３６時間以内、又は４８時間以内とすることができる。反応時の圧力は特に制限されず、減圧下でも常圧下でも加圧下でもよいが、通常は常圧下で行うことができる。反応時の雰囲気も特に制限されず、使用する組換え酵母が生育できない雰囲気下でも酵素の活性が保持される限り、任意の雰囲気とすることができる。
　反応の終了後、必要に応じてセロビオースを反応液から分離・精製することにより、セロビオースを得ることができる。分離・精製の手法は特に制限されず、任意の手法を用いることができるが、例えばろ過分離、遠心分離、膜分離等が挙げられる。これらの方法により、用いた菌体とセロビオースを効率的に分離することができる。さらに、得られたセロビオースあるいはその溶液中の不純物を除くために、イオン交換樹脂で処理をしたり、再結晶をすることでより高度に精製してもよい。
　なお、反応の終了後、必要に応じて組換え酵母を反応液から分離・回収し、セロビオース合成反応に再利用してもよい。本発明の組換え酵母は、こうして反応液から分離・回収して再利用した場合でも、酵素活性が維持され、繰り返し高いセロビオース合成効率が得られる場合がある。即ち、好ましい態様によれば、本発明のセロビオースの製造方法は、前記反応工程の後に、前記組換え酵母を反応液から回収し、再度の反応工程に供することをさらに含む。組換え酵母を反応液から分離・回収する手法は限定されないが、例えば遠心分離等が挙げられる。前記組換え酵母の分離・回収及び再利用の回数は特に限定されないが、一態様によれば、例えば２回以上、又は３回以上、又は４回以上、又は５回以上の反応に供することが出来る。前記組換え酵母の再利用時の活性は特に限定されないが、一態様によれば、前段の反応に於ける活性の６０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上、又は９０％以上の活性が、次段の反応でも維持されることが好ましい。
　以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。
　なお、本実施例に示すＰＣＲ法は、何れもＫＯＤ ＯｎｅＴＭ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を用いて実施した。また、本実施例に示す全ての酵母への遺伝子導入は、酢酸リチウム法によって実施した。
［実施例群Ｉ：形質転換酵母（スクロースホスホリラーゼ表層提示酵母、セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母、及びスクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母）を利用したセロビオース生産］
Ａ．形質転換酵母の作製
　酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１ΔＳＵＣ２株に、調製したプラスミドを使用して酢酸リチウム法によって、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）の２種の酵素を発現する種々の組換え酵母株を構築した。以下具体的に記載する。
・菌株及び培地
　菌株としては、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）及び酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１ΔＳＵＣ２株（MATα his3 leu2 met15 ura3 suc2株）を用いた。酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１株をＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１ΔＳＵＣ２株をＹｅａｓｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ＭＡＴ－Ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｔ（Thermo Fisher Scientific）から、それぞれ入手した。
・発現カセットを含むプラスミドの構築
　下記発現カセットＸ１～Ｘ９をそれぞれ含むプラスミドを、以下の手順により調製した。
・Ｘ１：ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４）
・Ｘ２：ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４）
・Ｘ３：ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＣｓＣＢＰ（配列番号６）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４）
・Ｘ４：ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＣｕＣＢＰ（配列番号７）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４）
・Ｘ５：ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＴａＣＢＰ（配列番号８）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４）
・Ｘ６：ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＴｎＣＢＰ（配列番号９）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４）
・Ｘ７：ＳＰＩ１プロモーター（配列番号１０）＋ＳＰＩ１分泌シグナル（配列番号１１）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＧＣＷ３０アンカーリング領域（配列番号１２）＋ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号１３）
・Ｘ８：ＳＰＩ１プロモーター（配列番号１０）＋ＳＰＩ１分泌シグナル（配列番号１１）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号１３）
・Ｘ９：ＳＰＩ１プロモーター（配列番号１０）＋ＳＰＩ１分泌シグナル（配列番号１１）＋ＣｓＣＢＰ（配列番号６）＋ＧＣＷ３０アンカーリング領域（配列番号１２）＋ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号１３）
（調製例１－１：ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来スクロースホスホリラーゼ（ＢｌＳＰ）表層発現カセットＸ１を含有するベクタープラスミドの調製）
　ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来スクロースホスホリラーゼ（ＢｌＳＰ）遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子合成により調製した。次に、ベクタープラスミドｐＩＥＧ－ＳＳＳＤ（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１プロモーター、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＴｒＥＧII）遺伝子のコーディング領域、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域（ＳＥＤ１アンカーリング領域）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている発現カセットを有する表層発現用ベクター：Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.105, 2021, 5895-5904）を鋳型とし、プライマー対ＳＥＤ１ａ－Ｆ（配列番号１４）及びＳＥＤ１ｓｓ－Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＴｒＥＧII遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ１（ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４））を含むプラスミドをｐＩＢｌＳＰ－ＳＳＳＤと命名した。
（調製例１－２：ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来スクロースホスホリラーゼ（ＢｌＳＰ）分泌発現カセットＸ２を含有するベクタープラスミドの調製）
　プラスミドｐＩＢｌＳＰ－ＳＳＳＤを鋳型とし、プライマー対ＤＩＴ１ｔ－Ｆ（配列番号１６）及びＢｌＳＰ－Ｒ（配列番号１７）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＳＥＤ１アンカーリング領域を除いたプラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片の両端をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結し、閉環させた。次に、このプラスミドを鋳型とし、プライマー対ＢｌＳＰ－Ｆ（配列番号１８）及びＤＩＴ１ｔ－Ｒ（配列番号１９）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来スクロースホスホリラーゼ（ＢｌＳＰ）遺伝子のコーディング領域及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。また、ベクタープラスミドｐＩＬ２－ＢＧ－ＳＳＳ（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１プロモーター、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・アクレアタス由来β－グルコシダーゼ１（ＡａＢＧＬ１）遺伝子のコーディング領域、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域（ＳＥＤ１アンカーリング領域）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来α－アグルチニン遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている発現カセットを有する表層発現用ベクター：Metabolic Engineering, Vol.57, 2020, 110-117）を鋳型とし、プライマー対ｐＲＳ４０３－Ｆ（配列番号２０）及びＳＥＤ１ｓｓ－Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、アスペルギルス・アクレアタス由来β－グルコシダーゼ１（ＡａＢＧＬ１）遺伝子のコーディング領域、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域（ＳＥＤ１アンカーリング領域）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来α－アグルチニン遺伝子のターミネーター領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ２（ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４））を含むプラスミドをｐＩＬ２－ＢｌＳＰ－ＳＳＤと命名した。
（調製例１－３：クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｓＣＢＰ）表層発現カセットＸ３を含有するベクタープラスミドの調製）
　クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｓＣＢＰ）遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子合成により調製した。次に、ベクタープラスミドｐＩＥＧ－ＳＳＳＤ（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１プロモーター、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＴｒＥＧII）遺伝子のコーディング領域、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域（ＳＥＤ１アンカーリング領域）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されているカセットを有する表層発現用ベクター：Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.105, 2021, 5895-5904）を鋳型とし、プライマー対ＳＥＤ１ａ－Ｆ（配列番号１４）及びＳＥＤ１ｓｓ－Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＴｒＥＧII遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。次に、このプラスミドを鋳型とし、プライマー対ＳＥＤ１ｐ－Ｆ（配列番号２１）及びＤＩＴ１ｔ－Ｒ（配列番号１９）を用いてＰＣＲ法により増幅し、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１プロモーター、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｓＣＢＰ）のコーディング領域、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域（ＳＥＤ１アンカーリング領域）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。また、ベクタープラスミドｐＩＵ５－ＣＢＨＤ（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１プロモーター、タラロマイセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来セロビオヒドロラーゼ（ＴｓＣＢＨ１）遺伝子のコーディング領域、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域（ＳＥＤ１アンカーリング領域）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来α－アグルチニン遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されているカセットを有する表層発現用ベクター：Biotechnology and Bioengineering, Vol.114, 2017, 1201-1207）を鋳型とし、プライマー対ｐＲＳ４０３－Ｆ（配列番号２０）及びｐＲＳ４０３－Ｒ（配列番号２２）を用いてＰＣＲ法により増幅し、発現カセット領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ３（ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＣｓＣＢＰ（配列番号６）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４））を含むプラスミドをｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤと命名した。
（調製例１－４：セルロモナス・ウダ（Cellulomonas uda）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｕＣＢＰ）表層発現カセットＸ４を含有するベクタープラスミドの調製）
　セルロモナス・ウダ（Cellulomonas uda）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｕＣＢＰ）遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子合成により調製した。次に、ベクタープラスミドｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤを鋳型とし、プライマー対プライマー対ＳＥＤ１ａ－Ｆ（配列番号１４）及びＳＥＤ１ｓｓ－Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＣｓＣＢＰ遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ４（ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＣｕＣＢＰ（配列番号７）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４））を含むプラスミドをｐＩＵ５－ＣｕＣＢＰ－ＳＳＳＤと命名した。
（調製例１－５：サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＴａＣＢＰ）表層発現カセットＸ５を含有するベクタープラスミドの調製）
　サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＴａＣＢＰ）遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子合成により調製した。次に、ベクタープラスミドｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤを鋳型とし、プライマー対ＳＥＤ１ａ－Ｆ（配列番号１４）及びＳＥＤ１ｓｓ－Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＣｓＣＢＰ遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ５（ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＴａＣＢＰ（配列番号８）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４））を含むプラスミドをｐＩＵ５－ＴａＣＢＰ－ＳＳＳＤと命名した。
（調製例１－６：サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＴｎＣＢＰ）表層発現カセットＸ６を含有するベクタープラスミドの調製）
　サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＴｎＣＢＰ）遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を遺伝子合成により調製した。次に、ベクタープラスミドｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤを鋳型とし、プライマー対ＳＥＤ１ａ－Ｆ（配列番号１４）及びＳＥＤ１ｓｓ－Ｒ（配列番号１５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＣｓＣＢＰ遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ６（ＳＥＤ１プロモーター（配列番号１）＋ＳＥＤ１分泌シグナル（配列番号２）＋ＴｎＣＢＰ（配列番号９）＋ＳＥＤ１アンカーリング領域（配列番号３）＋ＤＩＴ１ターミネーター（配列番号４））を含むプラスミドをｐＩＵ５－ＴｎＣＢＰ－ＳＳＳＤと命名した。
（調製例１－７：ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来スクロースホスホリラーゼ（ＢｌＳＰ）表層発現カセットＸ７を含有するベクタープラスミドの調製）
　プラスミドｐＩＢｌＳＰ－ＳＳＳＤを鋳型とし、プライマー対ＢｌＳＰ－ＮｈｅＩ－Ｆ（配列番号２３）及びＢｌＳＰ－ＸｈｏＩ－Ｒ（配列番号２４）を用いてＰＣＲ法により増幅し、さらにＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理することで、ＢｌＳＰ遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。また、ベクタープラスミドｐＩＢＧ－ＰｐＳＳＧ６１（ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＳＰＩ１プロモーター、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＳＰＩ１の分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・アクレアタス由来β－グルコシダーゼ１（ＡａＢＧＬ１）遺伝子のコーディング領域、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＧＣＷ６１遺伝子のコーディング領域（ＧＣＷ６１アンカーリング領域）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＡＯＸ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている発現カセットを有する表層発現用ベクター：Biotechnology and Bioengineering, Vol.120, 2023, 1097-1107）をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、ＡａＢＧＬ１遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をライゲーション法により連結した。次に、このプラスミドを鋳型とし、ＸｈｏＩ及びＭｌｕＩで処理し、ＧＣＷ６１アンカーリング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。さらに、プラスミドｐＩＢＧ－ＰｐＧＭＧ３０（ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＧＡＰＤＨプロモーター、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来α－ファクターの分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・アクレアタス由来β－グルコシダーゼ１（ＡａＢＧＬ１）遺伝子のコーディング領域、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＧＣＷ３０遺伝子のコーディング領域（ＧＣＷ３０アンカーリング領域）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＡＯＸ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている発現カセットを有する表層発現用ベクター：Biotechnology and Bioengineering, Vol.120, 2023, 1097-1107）をＸｈｏＩ及びＭｌｕＩで処理し、ＧＣＷ３０アンカーリング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をライゲーション法により連結した。得られた発現カセットＸ７（ＳＰＩ１プロモーター（配列番号１０）＋ＳＰＩ１分泌シグナル（配列番号１１）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＧＣＷ３０アンカーリング領域（配列番号１２）＋ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号１３））を含むプラスミドをｐＩＢｌＳＰ－ＰｐＳＳＧ３０と命名した。
（調製例１－８：ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来スクロースホスホリラーゼ（ＢｌＳＰ）分泌発現カセットＸ８を含有するベクタープラスミドの調製）
　プラスミドｐＩＢｌＳＰ－ＰｐＳＳＧ３０を鋳型とし、プライマー対ＢｌＳＰ－Ｆ２（配列番号２５）及びＢｌＳＰ－Ｒ２（配列番号２６）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＢｌＳＰ遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。また、ベクタープラスミドｐＩＨ－ＥＧ－ＳＳＧ３４（ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＳＰＩ１プロモーター、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＳＰＩ１の分泌シグナルペプチド配列、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＴｒＥＧII）遺伝子のコーディング領域、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＧＣＷ３４遺伝子のコーディング領域（ＧＣＷ３４アンカーリング領域）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＡＯＸ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている発現カセットを有する表層発現用ベクター：Biotechnology and Bioengineering, Vol.120, 2023, 1097-1107）を鋳型とし、プライマー対ＡＯＸ１ｔ－Ｆ（配列番号２７）及びＳＰＩ１ｓ ｓ－Ｒ（配列番号２８）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＴｒＥＧII遺伝子のコーディング領域及びＧＣＷ３４アンカーリング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ８（ＳＰＩ１プロモーター（配列番号１０）＋ＳＰＩ１分泌シグナル（配列番号１１）＋ＢｌＳＰ（配列番号５）＋ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号１３））を含むプラスミドをｐＩＨ－ＢｌＳＰ－ＰｐＳＳと命名した。
（調製例１－９：クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来セロビオースホスホリラーゼ（ＣｓＣＢＰ）表層発現カセットＸ９を含有するベクタープラスミドの調製）
プラスミドｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤを鋳型とし、プライマー対ＣｓＣＢＰ－ＮｈｅＩ－Ｆ（配列番号２９）及びＣｓＣＢＰ－ＸｈｏＩ－Ｒ（配列番号３０）を用いてＰＣＲ法により増幅し、さらにＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理することで、ＣｓＣＢＰ遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。また、ベクタープラスミドｐＩＢｌＳＰ－ＰｐＳＳＧ３０をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理することで、ＢｌＳＰ遺伝子のコーディング領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をライゲーション法により連結した。次に、このプラスミドを鋳型とし、プライマー対ＣｓＣＢＰ－Ｆ（配列番号３１）及びＡＯＸ１ｔ－Ｒ（配列番号３２）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＣｓＣＢＰ遺伝子のコーディング領域、ＧＣＷ３０アンカーリング領域、及びＡＯＸ１ターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。また、ベクタープラスミドｐＩＺ－ＣＢＨ１－ＰｐＳＳＧ３４（ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＳＰＩ１、タラロマイセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来セロビオヒドロラーゼ（ＴｓＣＢＨ１）遺伝子のコーディング領域、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＧＣＷ３４遺伝子のコーディング領域（ＧＣＷ３４アンカーリング領域）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来ＡＯＸ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている発現カセットを有する表層発現用ベクター：Biotechnology and Bioengineering, Vol.120, 2023, 1097-1107）を鋳型とし、プライマー対ＡＯＸ１ｔ－Ｆ２（配列番号３３）及びＳＰＩ１s s－Ｒ（配列番号２８）を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＴｓＣＢＨ１遺伝子のコーディング領域、ＧＣＷ３４アンカーリング領域、及びＡＯＸ１ターミネーター領域を除いたベクタープラスミド全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結した。得られた発現カセットＸ９（ＳＰＩ１プロモーター（配列番号１０）＋ＳＰＩ１分泌シグナル（配列番号１１）＋ＣｓＣＢＰ（配列番号６）＋ＧＣＷ３０アンカーリング領域（配列番号１２）＋ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号１３））を含むプラスミドをｐＩＺ－ＣｓＣＢＰ－ＰｐＳＳＧ３０と命名した。
・形質転換酵母の作製
（調製例２－１：スクロースホスホリラーゼ表層提示酵母の製造）
　調製例１－１に記載のプラスミドｐＩＢｌＳＰ－ＳＳＳＤをＮｄｅＩで処理し、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１ΔＳＵＣ２株に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ株と称する。同様に、調製例１－７に記載のプラスミドｐＩＢｌＳＰ－ＰｐＳＳＧ３０をＥｃｏＲＶで処理し、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＣＢＳ７４３５株に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をＰｐ－ＢｌＳＰ株と称する。
　また、調製例１－２に記載のプラスミドｐＩＬ２－ＢｌＳＰ－ＳＳＤをＮｄｅＩで処理し、ΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ株に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ２株と称する。同様に、調製例１－８に記載のプラスミドｐＩＨ－ＢｌＳＰ－ＰｐＳＳをＢｓｒＧＩで処理し、Ｐｐ－ＢｌＳＰ株に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をＰｐ－ＢｌＳＰ２株と称する。
（調製例２－２：セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母の製造）
　調製例１－３～１－６に記載のプラスミドｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤ、ｐＩＵ５－ＣｕＣＢＰ－ＳＳＳＤ、ｐＩＵ５－ＴａＣＢＰ－ＳＳＳＤ、又はｐＩＵ５－ＴｎＣＢＰ－ＳＳＳＤをＳｐｅＩで処理し、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１ΔＳＵＣ２株に供し、酢酸リチウム法によりそれぞれ形質転換した。これらの形質転換株をそれぞれΔＳＵＣ２－ＣｓＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＣｕＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＴａＣＢＰ株、及びΔＳＵＣ２－ＴｎＣＢＰ株と称する。
（調製例２－３：スクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母の製造）
　調製例１－３に記載のプラスミドｐＩＵ５－ＣｓＣＢＰ－ＳＳＳＤをＳｐｅＩで処理し、ΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ２株に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株と称する。同様に、調製例１－９に記載のプラスミドｐＩＺ－ＣｓＣＢＰ－ＰｐＳＳＧ３０をＮｓｉＩで処理し、Ｐｐ－ＢｌＳＰ２株に供し、エレクトロポレーション法により形質転換した。この形質転換株をＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株と称する。
Ｂ．形質転換酵母の前処理
　Ａで形質転換した酵母（菌株）のうち、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とするΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ株、ΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ２株、ΔＳＵＣ２－ＣｓＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＣｕＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＴａＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＴｎＣＢＰ株、及びΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株について、５ｍＬのＹＰＤ培地（乾燥酵母エキス（ナカライテスク）１％、ＢａｃｔｏＴＭ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Life Technologies）２％、Ｄ－グルコース（ナカライテスク）２％）に移植し、３０℃、２００ｒｐｍにて１８時間前培養したのち、５０ｍＬのＹＰＤ培地にＯＤ６００が０．０５となるように植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて４８時間振とう培養した。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主とするＰｐ－ＢｌＳＰ株、Ｐｐ－ＢｌＳＰ２株、及びＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株について、５ｍＬのＹＰＧ培地（乾燥酵母エキス（ナカライテスク）１％、ＢａｃｔｏＴＭ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Life Technologies）２％、グリセロール（ナカライテスク）２％）に移植し、３０℃、２００ｒｐｍにて１８時間前培養したのち、５０ｍＬのＹＰＧ培地にＯＤ６００が０．０５となるように植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて４８時間振とう培養した。これらの培養液を遠心分離して菌体を沈降させ、純水で２回洗浄し、できる限り上澄みを除いて固体の湿潤状態の菌体（wet cell）の重量を測定し、これと同量の純水を加え菌体懸濁液を得た（約５００ｇ湿潤細胞／Ｌ）。菌体懸濁液は６０℃で９０分間保持し、前処理菌体とした。
Ｃ．酵母細胞表層のスクロースホスホリラーゼ活性測定
　反応液５ｍＬ（組成：１０ｇ／Ｌスクロース（ナカライテスク）；８０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；及び調製例２－１で調製したＰｐ－ＢｌＳＰ株またはＰｐ－ＢｌＳＰ２株の前処理菌体（最終菌体濃度１００ｇ湿潤細胞／Ｌ））を調製し、３５ｒｐｍ、６０℃にて６０分間反応させた。反応を停止させるために、反応液を１００℃、１０分間保持し、その後１０分間氷冷した後に遠心して菌体などを沈殿させ、上清を集めてフルクトース濃度の分析に用いた。１分間で１μｍｏｌのフルクトースを遊離する酵素量を１ＩＵとする。
Ｄ．スクロースホスホリラーゼ表層提示酵母とセロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母を併用したスクロースからのセロビオース生産
　反応液５ｍＬ（組成：１００ｇ／Ｌスクロース（ナカライテスク）；８０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；１重量％硫酸マグネシウム；１．５ＩＵ／ｍＬグルコースイソメラーゼ（キシロースイソメラーゼ、合同酒精(株)製、ストレプトマイセス・グリセオフスクス（Streptomyces griseofuscus）由来）；調製例２－１で調製したΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ２株の前処理菌体（最終菌体濃度５０ｇ湿潤細胞／Ｌ）；及び調製例２－２で調製したΔＳＵＣ２－ＣｓＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＣｕＣＢＰ株、ΔＳＵＣ２－ＴａＣＢＰ株、またはΔＳＵＣ２－ＴｎＣＢＰ株の前処理菌体（最終菌体濃度５０ｇ湿潤細胞／Ｌ））を調製し、３５ｒｐｍ、６０℃にて２４時間反応させた。サンプリングは４時間及び２４時間の２回行った。反応を停止させるために、サンプリング液はサンプリング容器にとって１００℃、１０分間保持し、その後１０分間氷冷した後に遠心して菌体などを沈殿させ、上清を集めて分析に用いた。
Ｅ．スクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母を用いたスクロースからのセロビオース生産
　反応液５ｍＬ（組成：１００ｇ／Ｌスクロース（ナカライテスク）；８０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；１重量％硫酸マグネシウム；１．５ＩＵ／ｍＬグルコースイソメラーゼ（キシロースイソメラーゼ、合同酒精(株)製、ストレプトマイセス・グリセオフスクス（Streptomyces griseofuscus）由来）；及び調製例２－３で調製したΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株またはＰｐ－ＢｌＳＰ２株の前処理菌体（最終菌体濃度１００ｇ湿潤細胞／Ｌ））を調製し、３５ｒｐｍ、６０℃にて２４時間反応させた。サンプリングは４時間、８時間、及び２４時間の３回行った。反応を停止させるために、サンプリング液はサンプリング容器にとって１００℃、１０分間保持し、その後１０分間氷冷した後に遠心して菌体などを沈殿させ、上清を集めて分析に用いた。
Ｆ．分析
　Ｃ、Ｄ、及びＥの上清の分析にはＨＰＬＣを用いた。分析条件は下記とした。
・装置：ポンプユニット（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＢ）、オートサンプラー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ－２０ＡＣ）、カラムオーブン（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＴＯ－２０ＡＣ）
・使用カラム：Ｓｕｇａｒ－Ｄ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ、Ｃｏｄｅ：０５３９７－５１、ＩＤ４．６×２５０ｍｍ）
・ガードカラム：Ｓｕｇａｒ－Ｄ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ、Ｃｏｄｅ：０５３９７－８１）
・移動相：アセトニトリル／水＝７０／３０、流量１．０ｍＬ／分
・カラムオーブン温度：３０℃
・検出器：示差屈折率検出器（ＲＩＤ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＩＤ－１０Ａ）
・分析時間：１５分
・検量線：糖混合液（スクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース）を使用し、１、５、１０ｇ／Ｌの３点で校正した。
Ｇ．結果
　Ｃのスクロースホスホリラーゼ活性測定の結果を図１に示す。スクロースホスホリラーゼを細胞壁に係留された状態で発現させるための発現カセットＸ１のみを導入されたΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ株と比較して、発現カセットＸ１に加えてスクロースホスホリラーゼを分泌発現させるための発現カセットＸ２を導入されたΔＳＵＣ２－ＢｌＳＰ２株は、著しく高いスクロースホスホリラーゼ活性を示すことが分かった。このことにより、スクロースホスホリラーゼについては、係留型と分泌型を併用することが好ましいことがわかった。
　Ｄのスクロースホスホリラーゼ表層提示酵母とセロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母を併用したスクロースからのセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を図２に示す。セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母としてΔＳＵＣ－ＣｓＣＢＰ株を用いた場合には、スクロースのセロビオースへの転換率は反応開始から２４時間で約３０％であった（図２（ａ））。一方で、セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母としてΔＳＵＣ－ＣｕＣＢＰ株（図２（ｂ））、ΔＳＵＣ－ＴａＣＢＰ株（図２（ｃ））又はΔＳＵＣ－ＴｎＣＢＰ株（図２（ｄ））を用いた場合には、転換率は反応開始から２４時間でも１０％以下であった。この結果により、ＣＢＰ遺伝子としてはクロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来のものが好ましいことがわかった。
　Ｅのサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主としたスクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母（ΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株）を用いたスクロースからのセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を図３に示す。図３（ａ）のグラフはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とするΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた場合の結果を示し、図３（ｂ）のグラフはピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主とするＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた場合の結果を示す。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主としてスクロースホスホリラーゼのみを発現する組換え酵母株とセロビオースホスホリラーゼのみを発現する組換え酵母株を併用した図２（ａ）の実験結果と比較して、同じサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主としてスクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼを共発現する単一の組換え酵母株を用いた図３（ａ）では、反応に使用した酵母菌体の総量は同じであるにも関わらず、スクロースがセロビオースにより高い転換率（約７０％）で転換されていることがわかる。このことにより、スクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼについては単一の組換え酵母株に共発現させることが好ましいことがわかった。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主としてスクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼを共発現する単一の組換え酵母株を用いた図３（ｂ）では、スクロースのセロビオースへの転換率は約８０％にまで向上した。
　Ｅのピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主としたスクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母（Ｐｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株）を用いたスクロースからのセロビオース生産実験の反応液上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を図４に示す。図４（ａ）のグラフはグルコースを炭素源として培養したＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた場合の結果を示し、図４（ｂ）のグラフはグリセロールを炭素源として培養したＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた場合の結果を示す。Ｐｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株のスクロースのセロビオースへの転換率は、グルコースを炭素源として培養した場合には約４０％であったが、グリセロールを炭素源として培養した場合には、約８０％にまで向上した。このことにより、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主としたスクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母を培養する際には、グリセロールを炭素源に用いることが好ましいことがわかった。
［実施例群II：形質転換酵母（スクロースホスホリラーゼ＋セロビオース表層提示酵母）を再利用した繰り返しセロビオース生産］
Ａ．形質転換酵母の作製
　実施例群ＩのＡで形質転換した酵母（菌株）のうち、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とするΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）を宿主とするＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株を用いた。
Ｂ．形質転換酵母の前処理
　Ａで用意したΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株について、５ｍＬのＹＰＤ培地（乾燥酵母エキス（ナカライテスク）１％、ＢａｃｔｏＴＭ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Life Technologies）２％、Ｄ－グルコース（ナカライテスク）２％）に移植し、３０℃、２００ｒｐｍにて１８時間前培養したのち、５０ｍＬのＹＰＤ培地にＯＤ６００が０．０５となるように植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて４８時間振とう培養した。また、Ｐｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株について、５ｍＬのＹＰＧ培地（乾燥酵母エキス（ナカライテスク）１％、ＢａｃｔｏＴＭ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Life Technologies）２％、グリセロール（ナカライテスク）２％）に移植し、３０℃、２００ｒｐｍにて２４時間前培養したのち、５０ｍＬのＹＰＧ培地に、ＯＤ６００が０．０５となるように植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて４８時間振とう培養した。これらの培養液を遠心分離して菌体を沈降させ、純水で２回洗浄し、できる限り上澄みを除いて固体の湿潤状態の菌体（wet cell）の重量を測定し、これと同量の純水を加え菌体懸濁液を得た（約５００ｇ湿潤細胞／Ｌ）。菌体懸濁液は６０℃で９０分間保持し、前処理菌体とした。
Ｃ．形質転換酵母を再利用した繰り返しセロビオース生産
　反応液５ｍＬ（組成：１００ｇ／Ｌスクロース（ナカライテスク）；８０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；１重量％硫酸マグネシウム；１．５ＩＵ／ｍＬグルコースイソメラーゼ（キシロースイソメラーゼ、合同酒精（株）製、ストレプトマイセス・グリセオフスクス（Streptomyces griseofuscus）由来）；及びＧ－１で調製したΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株またはＰｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株の前処理菌体（最終菌体濃度１００ｇ湿潤細胞／Ｌ））を調製し、３５ｒｐｍ、６０℃にて２４時間反応させた（１回目）。反応させた液の遠心分離で酵母細胞を回収し、新しい反応液に再懸濁し、３５ｒｐｍ、６０℃にて２４時間反応させた（２回目）。同様に３回目の反応を行った。サンプリングは、各回の反応において４時間、８時間、及び２４時間の３回行った。反応を停止させるために、各サンプリング液はサンプリング容器にとって１００℃、１０分間保持し、その後１０分間氷冷した後に遠心して菌体などを沈殿させ、上清を集めて分析に用いた。
Ｄ．分析
　上記Ｄで得られた上清につき、実施例群ＩのＦに記載の方法で分析した。
Ｅ．結果
　上記Ｄで得られた上清中のスクロース、グルコース、フルクトース、及びセロビオース濃度の経時変化を、図５（ａ）（ΔＳＵＣ２－ＳＰ２ＣＢＰ株）及び図５（ｂ）（Ｐｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株）に示す。この結果により、本発明の、スクロースホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを発現する組換え酵母とグルコースイソメラーゼとを含有する反応液中にスクロースを共存させる工程を含む、セロビオースの製造方法は、当該工程を繰り返しても高いセロビオースへの転換率が維持されることがわかった。また、グリセロールを炭素源として培養したピキア・パストリスを宿主としたスクロースホスホリラーゼ＋セロビオースホスホリラーゼ表層提示酵母を形質転換酵母として用いた場合には、Ｐｐ－ＳＰ２ＣＢＰ株の酵母は、６０℃、２４時間の反応を３回繰り返しても、約８０％の高いセロビオース転換率が維持されることが確認された。
　本発明の製造方法は、食品又は医薬品製剤に使用するセロビオースの製造方法として利用することができる。

Claims (14)

  1. 　スクロースホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを発現する組換え酵母とグルコースイソメラーゼとを含有する反応液中にスクロースを共存させる反応工程を含む、セロビオースの製造方法。
  2. 　組換え酵母が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、又はヤロウィア（Yarrowia）属の酵母である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　スクロースホスホリラーゼが、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、又はストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌に由来する、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　スクロースホスホリラーゼが、組換え酵母から分泌発現される分泌型スクロースホスホリラーゼと、組換え酵母の細胞壁に係留された状態で発現される係留型スクロースホスホリラーゼとを含む、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
  5. 　セロビオースホスホリラーゼが、クロストリジウム（Clostridium）属、ルミノコッカス（Ruminococcus）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、又はサーモトガ（Thermotoga）属の細菌に由来する、請求項１～４の何れか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記組換え酵母が、スクロースホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼを単一の菌体で共に発現する組換え酵母である、請求項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記組換え酵母が、スクロースホスホリラーゼを発現する組換え酵母と、セロビオースホスホリラーゼを発現する組換え酵母との組み合わせである、請求項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記組換え酵母が、スクロースホスホリラーゼ遺伝子を担持する発現ベクターにより形質転換された酵母である、請求項１～７の何れか一項に記載の製造方法。
  9. 　前記発現ベクターが、スクロースホスホリラーゼ遺伝子及び酵母の細胞壁ドメイン遺伝子を共に担持する第１の発現ベクターと、酵母の細胞壁ドメイン遺伝子を担持せずスクロースホスホリラーゼ遺伝子のみを担持する第２の発現ベクターとの組み合わせを含む、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　グルコースイソメラーゼが、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の細菌に由来する、請求項１～９の何れか一項に記載の製造方法。
  11. 　反応液中にスクロースを共存させる前に、組換え酵母を４５℃～７５℃で１５分～１５０分処理する工程を更に含む、請求項１～１０の何れか一項に記載の製造方法。
  12. 　前記反応工程の前に、炭素源としてグリセロールを用いて酵母細胞を培養する工程を含む、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
  13. 　前記反応工程の後に、製造されたセロビオースを反応液から分離する工程をさらに含む、請求項１～１２の何れか一項に記載の製造方法。
  14. 　前記反応工程の後に、前記組換え酵母を反応液から回収し、再度の反応工程に供することをさらに含む、請求項１～１３の何れか一項に記載の製造方法。
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