JPH01137979A - グルコースイソメラーゼ遺伝子、該遺伝子を有する組換え体および該組換え体を有する微生物 - Google Patents
グルコースイソメラーゼ遺伝子、該遺伝子を有する組換え体および該組換え体を有する微生物Info
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- JPH01137979A JPH01137979A JP62295739A JP29573987A JPH01137979A JP H01137979 A JPH01137979 A JP H01137979A JP 62295739 A JP62295739 A JP 62295739A JP 29573987 A JP29573987 A JP 29573987A JP H01137979 A JPH01137979 A JP H01137979A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
グルコースイソメラーゼ（キシロースイソメラーゼとも
称する。）は、アルドースであるブドウ糖なケトースで
ある果糖に異性化する酵素である。異性化すると甘味度
は１．５倍程増加する。現在当該酵素を固定化して、連
続的に異性化する方法により異性化糖の総生産量は９０
万トン（年間）以上に達している。
称する。）は、アルドースであるブドウ糖なケトースで
ある果糖に異性化する酵素である。異性化すると甘味度
は１．５倍程増加する。現在当該酵素を固定化して、連
続的に異性化する方法により異性化糖の総生産量は９０
万トン（年間）以上に達している。
本発明は、この酵素をコードする、いわゆる構造遺伝子
とその発現を制御する、いわゆる制御遺伝子領域を含む
ＤＮＡを持つ新規な組換え体及びその遺伝子を発現する
新規な微生物に関するものである。
とその発現を制御する、いわゆる制御遺伝子領域を含む
ＤＮＡを持つ新規な組換え体及びその遺伝子を発現する
新規な微生物に関するものである。
［従来の技術とその問題点］
放線菌由来のグルコースイソメラーゼは、現在異性化糖
生産に利用されている。しかしながら、本発明に至るま
では、その構造は解明されておらず、酵素活性と機能の
関係は全く解明されていない。
生産に利用されている。しかしながら、本発明に至るま
では、その構造は解明されておらず、酵素活性と機能の
関係は全く解明されていない。
［問題点を解決するための手段］
本発明者は、放線菌 （Ｓｔｒｅ ｔｏｍｙｃｅｓ ｓ
ｐ、、たとえばＳ、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ Ｓ−
４１）由来のグルコースイソメラーゼをコードする遺伝
子（制御遺伝子および構造遺伝子を含む）の単離並びに
構造の解明に成功した。この事により、本来当該酵素遺
伝子を持たない放線菌にグルコースイソメラーゼを生産
させる事が出来るようになった。また、制御遺伝子領域
を対応する宿主で発現可能な制御遺伝子と置き換えるこ
とにより、他の微生物で当該酵素を発現出来る。これら
の事は、酵素機能と構造の関係を解明するための系を提
供することを意味するものであり、タンパク質工学的手
法を用いて酵素機能の変換をもたらす可能性を提供する
ものである。
ｐ、、たとえばＳ、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ Ｓ−
４１）由来のグルコースイソメラーゼをコードする遺伝
子（制御遺伝子および構造遺伝子を含む）の単離並びに
構造の解明に成功した。この事により、本来当該酵素遺
伝子を持たない放線菌にグルコースイソメラーゼを生産
させる事が出来るようになった。また、制御遺伝子領域
を対応する宿主で発現可能な制御遺伝子と置き換えるこ
とにより、他の微生物で当該酵素を発現出来る。これら
の事は、酵素機能と構造の関係を解明するための系を提
供することを意味するものであり、タンパク質工学的手
法を用いて酵素機能の変換をもたらす可能性を提供する
ものである。
本発明はグルコースイソメラーゼに対応し、放線菌（銭
匹Ｕ叩ム二ｓｐ、）の染色体上に存在し、制限酵素Ｂａ
ｍ ）ＩＩで切り出される５、７ｋｂ断片画分に含まれ
る遺伝子、グルコースイソメラーゼに対応し、放線菌の
染色体の５．７ｋｂ−Ｂａｍ ｌ（１断片画分にプロモ
ーター領域と完全な当該酵素の翻訳領域並びに当該酵素
遺伝子とポリシストロニックに発現するキシルロキナー
ゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡを持つ組換え体及びグルコ
ースイソメラーゼに対応し、放線菌から得られ、ショ糖
密度勾配遠心法によりＢａＩＩＨ１完全消化５．７ｋｂ
−ＤＮＡ断片画分に得られ、制限酵素１Ｉｔｈ１により
切り出されるＤＮＡ断片上に、プロモーター領域を含む
当該酵素構造遺伝子の大部分を含むＤＮＡが組み込まれ
ているベクターを有する微生物に関する。
匹Ｕ叩ム二ｓｐ、）の染色体上に存在し、制限酵素Ｂａ
ｍ ）ＩＩで切り出される５、７ｋｂ断片画分に含まれ
る遺伝子、グルコースイソメラーゼに対応し、放線菌の
染色体の５．７ｋｂ−Ｂａｍ ｌ（１断片画分にプロモ
ーター領域と完全な当該酵素の翻訳領域並びに当該酵素
遺伝子とポリシストロニックに発現するキシルロキナー
ゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡを持つ組換え体及びグルコ
ースイソメラーゼに対応し、放線菌から得られ、ショ糖
密度勾配遠心法によりＢａＩＩＨ１完全消化５．７ｋｂ
−ＤＮＡ断片画分に得られ、制限酵素１Ｉｔｈ１により
切り出されるＤＮＡ断片上に、プロモーター領域を含む
当該酵素構造遺伝子の大部分を含むＤＮＡが組み込まれ
ているベクターを有する微生物に関する。
本発明の遺伝子は第１図に示した塩基配列を有し、３９
３個のアミノ酸とイニシエーター“メチオニンをコード
し、リーダー配列をコードしない構造遺伝子とその５′
−上流域の制御遺伝子からなる。
３個のアミノ酸とイニシエーター“メチオニンをコード
し、リーダー配列をコードしない構造遺伝子とその５′
−上流域の制御遺伝子からなる。
さらに詳しくは、本発明はグルコースイソメラーゼに対
応し、放線菌細胞より得られ、核および核断片由来のＤ
ＮＡで、グルコースイソメラーゼの一次構造またはその
部分構造に対応するオリゴヌクレオチドなどとサザンプ
ロットハイプリダイゼーション法により特定される領域
を含み、同時にプロモーター領域およびイニシエーター
、ターミネータ−をも含む核由来遺伝断片片、該遺伝子
を有する組換え体および該遺伝子を発現する微生物に関
するものである。
応し、放線菌細胞より得られ、核および核断片由来のＤ
ＮＡで、グルコースイソメラーゼの一次構造またはその
部分構造に対応するオリゴヌクレオチドなどとサザンプ
ロットハイプリダイゼーション法により特定される領域
を含み、同時にプロモーター領域およびイニシエーター
、ターミネータ−をも含む核由来遺伝断片片、該遺伝子
を有する組換え体および該遺伝子を発現する微生物に関
するものである。
本発明に係る核由来遺伝子断片は、グルコースイソメラ
ーゼ活性を有する放線菌細胞から抽出・分離し、遺伝子
工学的手法により増幅させることにより製造できる。
ーゼ活性を有する放線菌細胞から抽出・分離し、遺伝子
工学的手法により増幅させることにより製造できる。
放線菌細胞からグルコースイソメラーゼに対応する核遺
伝子断片を分離するには、高分子ＤＮＡを抽出すること
が望ましい。当該放線菌のステージは問わないが、対数
増殖後期が望ましい。
伝子断片を分離するには、高分子ＤＮＡを抽出すること
が望ましい。当該放線菌のステージは問わないが、対数
増殖後期が望ましい。
放線菌細胞から高分子の核ＤＮＡの抽出法としては、例
えばＭｕｒｒａｙとＴｈｏｍｐｓｏｎにより報告された
方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ８．
４３２１ （１９８０）］などがある。調製した放線菌
高分子ＤＮＡからのグルコースイソメラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片の同定のためには、適切な制限酵素などで
切断したＤＮＡ断片をリガーゼを用いて適当なベクター
に結合させ、これらを用いて形質転換した細胞中から、
グルコースイソメラーゼの部分アミノ酸配列決定に基い
て合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニ
ーハイブリダイゼーション法により選別すればよい。用
いるベクターは大腸菌を宿主とした場合では、ｐｔｌｃ
系やλフアージ系が利用し易い。しかし、最も効率的に
当該遺伝子を調製する方法は実施例に示す如く、放線菌
高分子ＤＮＡをＢａｍ ）１１で完全消化後、中性蔗糖
密度勾配遠心法により鎖長５．７ｋｂ程度のＤＮＡ断片
画分を分取し、リガーゼによりｐＵｃベクターのＢａｍ
Ｈ１部位に結合せしめた後、大腸菌にトランスフオー
ムしＤＮＡライブラリーを作製するものである。このラ
イブラリーからのグルコースイソメラーゼ遺伝子の検索
は、上記オリゴヌクレオチドを３２ｐで標識してプロー
ブｂすることにより行なうことができる。
えばＭｕｒｒａｙとＴｈｏｍｐｓｏｎにより報告された
方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ８．
４３２１ （１９８０）］などがある。調製した放線菌
高分子ＤＮＡからのグルコースイソメラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片の同定のためには、適切な制限酵素などで
切断したＤＮＡ断片をリガーゼを用いて適当なベクター
に結合させ、これらを用いて形質転換した細胞中から、
グルコースイソメラーゼの部分アミノ酸配列決定に基い
て合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニ
ーハイブリダイゼーション法により選別すればよい。用
いるベクターは大腸菌を宿主とした場合では、ｐｔｌｃ
系やλフアージ系が利用し易い。しかし、最も効率的に
当該遺伝子を調製する方法は実施例に示す如く、放線菌
高分子ＤＮＡをＢａｍ ）１１で完全消化後、中性蔗糖
密度勾配遠心法により鎖長５．７ｋｂ程度のＤＮＡ断片
画分を分取し、リガーゼによりｐＵｃベクターのＢａｍ
Ｈ１部位に結合せしめた後、大腸菌にトランスフオー
ムしＤＮＡライブラリーを作製するものである。このラ
イブラリーからのグルコースイソメラーゼ遺伝子の検索
は、上記オリゴヌクレオチドを３２ｐで標識してプロー
ブｂすることにより行なうことができる。
かくして得られたトランスフォーマントを大量培養して
得られた菌体より常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によ
りプラスミドを抽出、分離し、さらにセシウムクロライ
ド密度勾配超遠心法、ゲル濾過法、アガロースゲル電気
泳動法等によりグルコースイソメラーゼに対応する核由
来遺伝子断片を得ることができる。
得られた菌体より常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によ
りプラスミドを抽出、分離し、さらにセシウムクロライ
ド密度勾配超遠心法、ゲル濾過法、アガロースゲル電気
泳動法等によりグルコースイソメラーゼに対応する核由
来遺伝子断片を得ることができる。
上記の如くして得られた核由来遺伝子が目的とするもの
であることを確認するためには、得られた核由来遺伝子
断片をグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列を部分的
に決定し、それに基いて合成したオリゴヌクレオチドを
プローブとしたサザンプロットハイプリダイゼイション
させればよい。
であることを確認するためには、得られた核由来遺伝子
断片をグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列を部分的
に決定し、それに基いて合成したオリゴヌクレオチドを
プローブとしたサザンプロットハイプリダイゼイション
させればよい。
かくして得られたグルコースイソメラーゼ核遺伝子の最
も大きな利用法は、これらの核遺伝子を微生物、植物お
よび動物のベクター等に組込んで微生物、植物および動
物でグルコースイソメラーゼまたはこの改良酵素を生産
することを可能ならしめることにある。ここで微生物と
してはエシェリヒア・コリなどの原核生物やサッカロミ
セス・セレビシエなどの真核生物がある。
も大きな利用法は、これらの核遺伝子を微生物、植物お
よび動物のベクター等に組込んで微生物、植物および動
物でグルコースイソメラーゼまたはこの改良酵素を生産
することを可能ならしめることにある。ここで微生物と
してはエシェリヒア・コリなどの原核生物やサッカロミ
セス・セレビシエなどの真核生物がある。
さらに、別の利用法はグルコースイソメラーゼのプロモ
ーター領域を改良することにより放線菌における高発現
ベクターを作成出来ることにある。
ーター領域を改良することにより放線菌における高発現
ベクターを作成出来ることにある。
グルコースイソメラーゼ核遺伝子のベクターへの組み込
みは通常、試験管内で次のように行なうことができる。
みは通常、試験管内で次のように行なうことができる。
グルコースイソメラーゼ核遺伝子のＤＮＡ両端を必要に
よりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要なり
ＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩
基を複数個重合せしめる。しかる後、これを目的とする
ベクターに組込む。組込む方法は、ベクターを適当な制
限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−またはアニ
ーリング可能な組合せの塩基を複数個重合せしめる。こ
のように加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合
し、リガーゼを用いて接続せしめる。
よりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要なり
ＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩
基を複数個重合せしめる。しかる後、これを目的とする
ベクターに組込む。組込む方法は、ベクターを適当な制
限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−またはアニ
ーリング可能な組合せの塩基を複数個重合せしめる。こ
のように加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合
し、リガーゼを用いて接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡは、ベクターの宿主である微生物
、植物細胞および動物細胞に導入する。
、植物細胞および動物細胞に導入する。
ここで用い得る宿主としては各種のものがあり、例えば
エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属、バチルス・ズ
ブチリス等のバチルス属等の細菌、サッカロミセス・セ
レビシエ等のサツカロミセス属等の酵母、タバコ、ペチ
ュニア等のナス科植物［細胞等、Ｂａ１ｂＩＣ３７３等
の動物培養細胞が好適である。これら宿主に使用される
ベクターを以下に例示する。
エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属、バチルス・ズ
ブチリス等のバチルス属等の細菌、サッカロミセス・セ
レビシエ等のサツカロミセス属等の酵母、タバコ、ペチ
ュニア等のナス科植物［細胞等、Ｂａ１ｂＩＣ３７３等
の動物培養細胞が好適である。これら宿主に使用される
ベクターを以下に例示する。
ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐＲ
に２４８． ｐＤＦ４１等、ＥＫ系プラスミドベクター
（リラックスド型）のＣａ１Ｅｌ、 ｐＶＨ５１，ｐＡ
ｃ１０５． Ｒ５Ｆ２１２４． ｐｃＲｌ。
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐＲ
に２４８． ｐＤＦ４１等、ＥＫ系プラスミドベクター
（リラックスド型）のＣａ１Ｅｌ、 ｐＶＨ５１，ｐＡ
ｃ１０５． Ｒ５Ｆ２１２４． ｐｃＲｌ。
ｐＭＢ９．ＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４，
ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７゜ｐＢＲ３２１１，ｐＫＹ
２２８Ｊ ｐＫＹ２７Ｑｏ、 ｐＫＮＢ（１，ｐＫ
Ｃ７゜ｐＫＢ１５８． ｐＭＫ２００４． ｐＡｃ
Ｙｃｌ、 ｐＡｃＹｃ１８４． λｄｕ１等、λ
ｇｔ系ファージベクターのλｇｔ・λＣ１λｇｔ・ λ
Ｂ、 λＷＥＳ ・λＢ′、 λＺＪｖｉｒ・λＢ′
、 λへＬＯ−λＢ。
ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７゜ｐＢＲ３２１１，ｐＫＹ
２２８Ｊ ｐＫＹ２７Ｑｏ、 ｐＫＮＢ（１，ｐＫ
Ｃ７゜ｐＫＢ１５８． ｐＭＫ２００４． ｐＡｃ
Ｙｃｌ、 ｐＡｃＹｃ１８４． λｄｕ１等、λ
ｇｔ系ファージベクターのλｇｔ・λＣ１λｇｔ・ λ
Ｂ、 λＷＥＳ ・λＢ′、 λＺＪｖｉｒ・λＢ′
、 λへＬＯ−λＢ。
λＷＥＳ−Ｔｓ６２２． λＤａｍ等、シャロンベク
ターのシャロン４Ａ、シャロン３Ａ、シャロン１６Ａ。
ターのシャロン４Ａ、シャロン３Ａ、シャロン１６Ａ。
シャロン１３Ａ、シャロン１４Ａ、シャロン１５Ａ。
シャロン８．シャロン１０．シャロン１７．シャロン２
０等、チオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）グループベクタ
ー（ＤＬ５１２． λＺＥＱＳ、 λＺＹＶ５φ、
λＺＵＶ φ２゜λＺＵＶφ３． λＹＥＱＳφ１
、 λＹＥＱＳφ、λＹＥＱＳφ３゜λＢａｍ、
λＳｓｔ等、枯草菌のプラスミドベクターｐＴＡ１０１
５． ｐＬｓ１５． ｐＴＡ１０２０． ｐＬ５２８．
ｐＬｓ１３． ｐＴＡ１０５０、 ｐＴＡ１０６０．
ｐＴＡ１０３０． ｐＴＡ１０３１等、スタフィロコ
ッカス由来のプラスミドベクターｐＴ１２７ 。
０等、チオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）グループベクタ
ー（ＤＬ５１２． λＺＥＱＳ、 λＺＹＶ５φ、
λＺＵＶ φ２゜λＺＵＶφ３． λＹＥＱＳφ１
、 λＹＥＱＳφ、λＹＥＱＳφ３゜λＢａｍ、
λＳｓｔ等、枯草菌のプラスミドベクターｐＴＡ１０１
５． ｐＬｓ１５． ｐＴＡ１０２０． ｐＬ５２８．
ｐＬｓ１３． ｐＴＡ１０５０、 ｐＴＡ１０６０．
ｐＴＡ１０３０． ｐＴＡ１０３１等、スタフィロコ
ッカス由来のプラスミドベクターｐＴ１２７ 。
ｐｃ１９４． ｐｃ２２１． ｐＣ２２３，ｐＵＢ１１
２． ｐＬＩＢｌｌｏ。
２． ｐＬＩＢｌｌｏ。
ｐｓＡＯ５０１，ｐｓ八へ１００． ｐＥ１！１４．
ｐＴＰ４． ｐＴＩ’５等、酵母ベクターとしてｐＪＤ
Ｂ２１９． ＹＥｐ１３． ＹＲｐ７． Ｙｌｐｌ。
ｐＴＰ４． ｐＴＩ’５等、酵母ベクターとしてｐＪＤ
Ｂ２１９． ＹＥｐ１３． ＹＲｐ７． Ｙｌｐｌ。
ｐｙｃ、 ｐＴＣ２、植物ベクターとしてＴｉプラスミ
ド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイクウィルス
由来の各種ベクター類（バイナリ−型ベクターをも含む
）、動物ベクターとしてｓｖ４゜由来のｐＳＶＫ”、
ｐＩ−１１β−１ｐＳＶ）Ｉ、ｎ−１−Ｈ＋、 ｐβ
２Ｘ、 ｐｓＸβ＋などがある。ただし、Ｔｉプラスミ
ド由来の植物ベクターの場合は、得られた組換えＤＮＡ
を−Ｈアグロバクテリウム・ツメファシェンスＴ３７等
に導入し、木組換え微生物を植物細胞にｃｏ−ｃｕｌｔ
ｕｒｅすることなどにより感染させることによって宿主
植物に組換えＤＮＡを導入することができる。
ド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイクウィルス
由来の各種ベクター類（バイナリ−型ベクターをも含む
）、動物ベクターとしてｓｖ４゜由来のｐＳＶＫ”、
ｐＩ−１１β−１ｐＳＶ）Ｉ、ｎ−１−Ｈ＋、 ｐβ
２Ｘ、 ｐｓＸβ＋などがある。ただし、Ｔｉプラスミ
ド由来の植物ベクターの場合は、得られた組換えＤＮＡ
を−Ｈアグロバクテリウム・ツメファシェンスＴ３７等
に導入し、木組換え微生物を植物細胞にｃｏ−ｃｕｌｔ
ｕｒｅすることなどにより感染させることによって宿主
植物に組換えＤＮＡを導入することができる。
木組換えＤＮＡ産物として得られたグルコースイソメラ
ーゼが天然型のそれと構造的に同じであることは、産物
の免疫沈降またはイミュノプロットなどの手法によって
確認することができる。
ーゼが天然型のそれと構造的に同じであることは、産物
の免疫沈降またはイミュノプロットなどの手法によって
確認することができる。
［実施例］
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
放線菌（Ｓｔｒｅ ｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕ
ｓｃｕｓ Ｓ−４１）を常法に従って対数増殖後期まで
培養後、冷却遠心し、その湿重量（５ｚ、８ｇｒ）を直
ちに液体窒素で凍結した。これに１５％蔗糖、 ２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、 ３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ （＋）
Ｈ８，０） 、 ０．７％ｓｏｓを加えて磨砕し、次い
で５０℃で３０分間保温した後、ＭｕｒｒａｙとＴｈｏ
ｍｐｓｏｎの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、 ８．４３２１ （１９８０）］ に従って核ＤＮ
Ａを抽出した。このＤＮＡは分子量が２５ｋｂ以上でア
ガロースゲル電気泳動上では単一バンドとなり分解は認
められなかった。この高分子ＤＮＡの５００μｇをＢａ
ｍ旧で完全消化し、常法に従ってフェノール処理後エタ
ノール沈澱させた。次いで、１０％〜４０％の中性蔗糖
密度勾配上に重層し、２６．００Ｏｒｐｍで２６時間遠
心した。８００μβづつ分画し、その一部をアガロース
ゲル（０，４％）電気泳動することにより、各画分に含
まれるＤＮＡＭｉ長を調べた。その結果、フラクション
３１の平均ＤＮＡ鎖長が５．８ｋｂであり、８．２５μ
ｇのＤＮＡ量であった。このＤＮＡ画分を約１ｕｇとり
、Ｂａｍ ｔ１１完全消化ｐＵｃ１３の１μｇとりガー
ゼ処理を行なった。反応はＴ４ＤＮＡ リガーゼ（２０
Ｕ）を用いｔ４℃で１４時間行なった。
ｓｃｕｓ Ｓ−４１）を常法に従って対数増殖後期まで
培養後、冷却遠心し、その湿重量（５ｚ、８ｇｒ）を直
ちに液体窒素で凍結した。これに１５％蔗糖、 ２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、 ３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ （＋）
Ｈ８，０） 、 ０．７％ｓｏｓを加えて磨砕し、次い
で５０℃で３０分間保温した後、ＭｕｒｒａｙとＴｈｏ
ｍｐｓｏｎの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、 ８．４３２１ （１９８０）］ に従って核ＤＮ
Ａを抽出した。このＤＮＡは分子量が２５ｋｂ以上でア
ガロースゲル電気泳動上では単一バンドとなり分解は認
められなかった。この高分子ＤＮＡの５００μｇをＢａ
ｍ旧で完全消化し、常法に従ってフェノール処理後エタ
ノール沈澱させた。次いで、１０％〜４０％の中性蔗糖
密度勾配上に重層し、２６．００Ｏｒｐｍで２６時間遠
心した。８００μβづつ分画し、その一部をアガロース
ゲル（０，４％）電気泳動することにより、各画分に含
まれるＤＮＡＭｉ長を調べた。その結果、フラクション
３１の平均ＤＮＡ鎖長が５．８ｋｂであり、８．２５μ
ｇのＤＮＡ量であった。このＤＮＡ画分を約１ｕｇとり
、Ｂａｍ ｔ１１完全消化ｐＵｃ１３の１μｇとりガー
ゼ処理を行なった。反応はＴ４ＤＮＡ リガーゼ（２０
Ｕ）を用いｔ４℃で１４時間行なった。
次いで、大腸菌ＮＭ５２２に常法に従ってトランスフオ
ームし、得られた形質転換様を培養して約２０００個の
コロニーを得た。
ームし、得られた形質転換様を培養して約２０００個の
コロニーを得た。
一方、グルコースイソメラーゼを放線菌から精製し、そ
のＮ−末端領域のアミノ酸配列を解析したところ、５−
Ｆ−Ｑ−Ｐ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−に−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｇ−Ｌ
−Ｗ−Ｔ−Ｖ−Ｑ−４という結果を得たので、縮重の少
ない領域についてオリゴヌクレオチドを合成した。すな
わち、 上記２３ｍａｒをプローブとしてコロニーパイプリダイ
ゼーションを行なったところ、９個の陽性コロニーを得
た。いずれのクローンの挿入ＤＮＡも同じ５．７ｋｂで
あったので、その内の１つｐＧＩ−３２を用いて以下の
研究を行なった。制限酵素によるマツピングとサザーン
プロットハイプリダイゼーションの結果からグルコース
イソメラーゼ遺伝子の大部分はＳｐｈｌで切り出される
２、７ｋｂ上にあることが判明した。従って、構造解析
と放線菌以外でのグルコースイソメラーゼ遺伝子の発現
を容易にする１ ま ため、ベクターとして！１ＵＣ１１９（及びｐＵｃ１１
８）を用い、５ｔｅｖｅｎ Ｈｅｎ１ｋｏｆｆの方法［
Ｇｅｎｅ、 ２８．３５１（１９８４）］及びＹａｎｉ
ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎらの方法［Ｇｅｎｅ、 ３３゜１
０３ （１９８５）］ に基いてｐＧＩ−３２由来のｐ
ＬＩ−ＧＩ−３２およびｐａｌｓ−ＧＩ−６５（抛１
ニよる２、７ｋｂをｐＵｃ１１９に挿入し□たクローン
）の挿入部位を種々の程度に欠損するプラスミドを作製
し、大腸菌でクローニングした。これらの一連の欠損プ
ラスミドを用いてＳａｎｇｅｒ法によりグルコースイソ
メラーゼ遺伝子の完全構造を明らかにした（第１図参照
）。その結果、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の
グルコースイソメラーゼは、３９３個のアミノ酸からな
る分子量４３８４３のタンパク質であることが明らかと
なった。イニシエーターメチオニンの後にリーダー配列
がないため、この酵素は分泌性でないことが前駆体タン
パク質の構造からも明らかとなった。
のＮ−末端領域のアミノ酸配列を解析したところ、５−
Ｆ−Ｑ−Ｐ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−に−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｇ−Ｌ
−Ｗ−Ｔ−Ｖ−Ｑ−４という結果を得たので、縮重の少
ない領域についてオリゴヌクレオチドを合成した。すな
わち、 上記２３ｍａｒをプローブとしてコロニーパイプリダイ
ゼーションを行なったところ、９個の陽性コロニーを得
た。いずれのクローンの挿入ＤＮＡも同じ５．７ｋｂで
あったので、その内の１つｐＧＩ−３２を用いて以下の
研究を行なった。制限酵素によるマツピングとサザーン
プロットハイプリダイゼーションの結果からグルコース
イソメラーゼ遺伝子の大部分はＳｐｈｌで切り出される
２、７ｋｂ上にあることが判明した。従って、構造解析
と放線菌以外でのグルコースイソメラーゼ遺伝子の発現
を容易にする１ ま ため、ベクターとして！１ＵＣ１１９（及びｐＵｃ１１
８）を用い、５ｔｅｖｅｎ Ｈｅｎ１ｋｏｆｆの方法［
Ｇｅｎｅ、 ２８．３５１（１９８４）］及びＹａｎｉ
ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎらの方法［Ｇｅｎｅ、 ３３゜１
０３ （１９８５）］ に基いてｐＧＩ−３２由来のｐ
ＬＩ−ＧＩ−３２およびｐａｌｓ−ＧＩ−６５（抛１
ニよる２、７ｋｂをｐＵｃ１１９に挿入し□たクローン
）の挿入部位を種々の程度に欠損するプラスミドを作製
し、大腸菌でクローニングした。これらの一連の欠損プ
ラスミドを用いてＳａｎｇｅｒ法によりグルコースイソ
メラーゼ遺伝子の完全構造を明らかにした（第１図参照
）。その結果、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の
グルコースイソメラーゼは、３９３個のアミノ酸からな
る分子量４３８４３のタンパク質であることが明らかと
なった。イニシエーターメチオニンの後にリーダー配列
がないため、この酵素は分泌性でないことが前駆体タン
パク質の構造からも明らかとなった。
実施例２
異種微生物に放線菌グルコースイソメラーゼを発現させ
るために、前記実施例１で作製したｐｔｌ−ＧＩ−３２
の一連のデレージョンプラスミドな５ｔｅｖｅｎ Ｈｅ
ｎ１ｋｏｆｆの方法［Ｇｅｎｅ、 ２８．３５１ （１
９８４）］及びＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎらの方法
［Ｇｅｎｅ、 ３３．１０３（１９８５）］ に基いて
作製した。勿論、デレージョンプラスミドの作製方法は
ＢａＲ３１を用いる方法など他の方法もあり、適切であ
ればよい。ここでは遺伝子の５′−フランキング領域を
約２ｋｂ程欠損させることを目的とした。その結果、デ
レージョン変異株の１つでプラスミドｐＵ−ＧＩ−３２
−６８をもつクローンを獲得した。このプラスミドは第
１図に示したグルコースイソメラーゼ遺伝子のイニシエ
ーターメチオニンに続くグルタミンコドンの第１文字ま
でを欠損していた（Ｉ参照）。そこで、このプラスミド
の５′末端に合成二重鎖オリゴヌクレオチド、 ５’−
ｄ［ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣ］ をリガーゼに
より結合した。これをＮｃｏｌにより切断後、大腸菌発
現ベクターｐＫＫ２３３−２のＮｃｏ１部位に結合し、
３′−末端なｆＨｌ−ｉｎ シた後、リガーゼで環状に
した。この発現ベクターをＩａｃＩＱ株である大腸菌Ｎ
Ｍ５２２にトランスフオームした。この発現プラスミド
はＩＰＴＧ添加により菌体内にグルコースイソメラーゼ
を生産することを菌体破砕上清のイミュノプロットおよ
び活性測定により確認した。本菌は微生物工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−り
τＩＴである。
るために、前記実施例１で作製したｐｔｌ−ＧＩ−３２
の一連のデレージョンプラスミドな５ｔｅｖｅｎ Ｈｅ
ｎ１ｋｏｆｆの方法［Ｇｅｎｅ、 ２８．３５１ （１
９８４）］及びＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎらの方法
［Ｇｅｎｅ、 ３３．１０３（１９８５）］ に基いて
作製した。勿論、デレージョンプラスミドの作製方法は
ＢａＲ３１を用いる方法など他の方法もあり、適切であ
ればよい。ここでは遺伝子の５′−フランキング領域を
約２ｋｂ程欠損させることを目的とした。その結果、デ
レージョン変異株の１つでプラスミドｐＵ−ＧＩ−３２
−６８をもつクローンを獲得した。このプラスミドは第
１図に示したグルコースイソメラーゼ遺伝子のイニシエ
ーターメチオニンに続くグルタミンコドンの第１文字ま
でを欠損していた（Ｉ参照）。そこで、このプラスミド
の５′末端に合成二重鎖オリゴヌクレオチド、 ５’−
ｄ［ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣ］ をリガーゼに
より結合した。これをＮｃｏｌにより切断後、大腸菌発
現ベクターｐＫＫ２３３−２のＮｃｏ１部位に結合し、
３′−末端なｆＨｌ−ｉｎ シた後、リガーゼで環状に
した。この発現ベクターをＩａｃＩＱ株である大腸菌Ｎ
Ｍ５２２にトランスフオームした。この発現プラスミド
はＩＰＴＧ添加により菌体内にグルコースイソメラーゼ
を生産することを菌体破砕上清のイミュノプロットおよ
び活性測定により確認した。本菌は微生物工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−り
τＩＴである。
［発明の効果コ
本発明により放線菌グルコースイソメラーゼをコードす
る遺伝子と該遺伝子を有する組換え体並びにその遺伝子
を発現する新規な微生物が提供される。このグルコース
イソメラーゼの活性と構造の関係をタンパク質工学的手
法を駆使することにより明らかにすることが出来るよう
になり、より優れた該酵素の創造につながると共に、グ
ルコースイソメラーゼの生産効率を上げることにも大き
く寄与することが出来る。
る遺伝子と該遺伝子を有する組換え体並びにその遺伝子
を発現する新規な微生物が提供される。このグルコース
イソメラーゼの活性と構造の関係をタンパク質工学的手
法を駆使することにより明らかにすることが出来るよう
になり、より優れた該酵素の創造につながると共に、グ
ルコースイソメラーゼの生産効率を上げることにも大き
く寄与することが出来る。
【図面の簡単な説明】
第１図はグルコースイソメラーゼ遺伝子の塩基配列を示
す。 特許出願人 農林水産省食品総合研究所長代 理 人
弁理士 久保１）藤 部 ≧３犀に乙 ≧ス 田Ｅ Ｑ’ｍ
す。 特許出願人 農林水産省食品総合研究所長代 理 人
弁理士 久保１）藤 部 ≧３犀に乙 ≧ス 田Ｅ Ｑ’ｍ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）グルコースイソメラーゼに対応し、放線菌（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｃｅｓ ｓｐ．）の染色体上に存在し、制限
酵素Ｂａｍ Ｈｌで切り出される５．７ｋｂ断片画分に
含まれる遺伝子。 ２）遺伝子が、第１図に示した塩基配列を有するもので
ある特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３）グルコースイソメラーゼに対応し、放線菌の染色体
の５．７ｋｂ−Ｂａｍ Ｈｌ断片画分にプロモーター領
域と完全な当該酵素の翻訳領域並びに当該酵素遺伝子と
ポリシストロニックに発現するキシルロキナーゼ遺伝子
の一部を含むＤＮＡを持つ組換え体。 ４）ＤＮＡが、原核生物もしくは真核生物のベクターで
ある特許請求の範囲第３項記載の組換え体。 ５）遺伝子が、第１図に示した塩基配列を有するもので
ある特許請求の範囲第３項記載の組換え体。 ６）グルコースイソメラーゼに対応し、放線菌から得ら
れ、ショ糖密度勾配遠心法によりＢａｍ Ｈｌ完全消化
５．７ｋｂ−ＤＮＡ断片画分に得られ、制限酵素Ｓｐｈ
ｌにより切り出されるＤＮＡ断片上に、プロモーター領
域を含む当該酵素構造遺伝子の大部分を含むＤＮＡが組
み込まれているベクターを有する微生物。 ７）微生物が、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチ
リスまたはサッカロミセス・セレビシエである特許請求
の範囲第６項記載の微生物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62295739A JPH01137979A (ja) | 1987-11-24 | 1987-11-24 | グルコースイソメラーゼ遺伝子、該遺伝子を有する組換え体および該組換え体を有する微生物 |
| SE8800331A SE500307C2 (sv) | 1987-11-24 | 1988-02-02 | Glukosisomerasgen från Streptomyces griseofuscus S-41 samt mikroorganism transformerad med rekombinant DNA innehållande genen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62295739A JPH01137979A (ja) | 1987-11-24 | 1987-11-24 | グルコースイソメラーゼ遺伝子、該遺伝子を有する組換え体および該組換え体を有する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01137979A true JPH01137979A (ja) | 1989-05-30 |
| JPH0544278B2 JPH0544278B2 (ja) | 1993-07-05 |
Family
ID=17824543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62295739A Granted JPH01137979A (ja) | 1987-11-24 | 1987-11-24 | グルコースイソメラーゼ遺伝子、該遺伝子を有する組換え体および該組換え体を有する微生物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01137979A (ja) |
| SE (1) | SE500307C2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016355A3 (en) * | 2007-07-27 | 2009-04-16 | Secretary Trade Ind Brit | Cavitation detection |
| WO2024252885A1 (ja) * | 2023-06-07 | 2024-12-12 | 帝人株式会社 | セロビオースの製造方法 |
-
1987
- 1987-11-24 JP JP62295739A patent/JPH01137979A/ja active Granted
-
1988
- 1988-02-02 SE SE8800331A patent/SE500307C2/sv not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016355A3 (en) * | 2007-07-27 | 2009-04-16 | Secretary Trade Ind Brit | Cavitation detection |
| US8696321B2 (en) | 2007-07-27 | 2014-04-15 | The Secretary Of State For Trade And Industry | Cavitation detection |
| EA019866B1 (ru) * | 2007-07-27 | 2014-06-30 | Ве Секретари Оф Стэйт Фор Трэйд Энд Индастри | Детектирование кавитации |
| WO2024252885A1 (ja) * | 2023-06-07 | 2024-12-12 | 帝人株式会社 | セロビオースの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8800331L (sv) | 1989-05-25 |
| SE500307C2 (sv) | 1994-05-30 |
| JPH0544278B2 (ja) | 1993-07-05 |
| SE8800331D0 (sv) | 1988-02-02 |
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