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Verfahren zur Herstellung eines Vaccins gegen infektiösen Hepatitisvirus
Infektiöse Hepatitis ist eine relativ häufige Krankheit, die besonders für die militärischen Streitkräfte ein akutes Problem darstellt, weil sie eine lange Untauglichkeit der von der Krankheit befallenen Personen zur Folge hat. Obwohl die Krankheit in den letzten Kriegen unter den Angehörigen der Streitkräfte häufig auftrat, ist über ihre Äthiologie wenig mehr bekannt, als dass es sich um eine Viruserkrankung handelt, die von einem Menschen auf den andern übertragen wird. Wird die Krankheit durch Bluttransfusion übertragen, so wird sie häufig"Serumhepatitis"statt"infektiöse Hepatitis"genannt. Der hier verwendete Ausdruck"infektiöse Hepatitis"schliesst beide Bezeichnungen ein.
Der Grund, warum so wenig über diese ernste Erkrankung bekannt ist, ist wahrscheinlich die Tatsache, dass alle Untersuchungen an Menschen vorgenommen werden mussten ; denn der Virus. konnte in den üblichen Substraten, wie Embryoneneiem und Laboratoriumstieren, z. B. Nagetieren, Affen, Schimpansen, Vögeln und Schweinen, nicht erfolgreich übertragen bzw. kultiviert werden. Auch Versuche, den Virus in Zellgewebekulturen zu züchten, blieben erfolglos. Das Fehlen einer geeigneten Methode zur Kultivierung des Virus machte es unmöglich, ein zur Immunisierung gegen die Krankheit wirksames Vaccin herzustellen.
Gemäss der Erfindung werden diese Nachteile und Schwierigkeiten überwunden und die Herstellung eines Vaccins gegen infektiösen Hepatitisvirus ermöglicht. Das Verfahren besteht darin, dass lebender infektiöser Hepatitisvirus in einer Gewebekultur des Detroit-6-Stammes epithelartiger Zellen oder aus em- bryonalem Gewebe gewonnener Spindelzellen, wie PD39T-Zellen, in wässerigem Medium kultiviert wird, die erhaltene wässerige Flüssigkeit, die eine hohe Konzentration an lebendem infektiösem Hepatitisvirus enthält, abgetrennt und diese Flüssigkeit mit einem oder mehreren der folgenden Inaktivierungsmittel :
Formaldehyd, Phenol, ss-Propiolacton, Chlor oder mit Ultraviolettlicht kombiniert mit einem oder mehreren der vorgenannten Inaktivierungsmittel behandelt wird, wobei die Infektivität des Virus vollständig zerstört, die Antigenwirkung des Virus aber nicht wesentlich beeinträchtigt wird.
Die für das Gewebekulturmedium verwendeten besonderen Zellen sind epithelartige Zellen des De-
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re, die Haut, die Eingeweide oder der ganze embryonale Körper verwendet werden. Ein besonderes Beispiel ist ein aus Testikelgewebe erhaltener Zellstamm, die sogenannten PD39T-Zellen, deren Isolierung und Kultivierung im folgenden genauer beschrieben wird.
Verfahren zur Isolierung und Kultivierung : Testikel, die bei einer Autopsie von einem elf Tage alten Individuum erhalten werden, wurden in eine Hank'sche Lösung für 2-4 h eingelegt, in Stücke von ungefähr 1 bis 3 mm3 geschnitten und Wälzröhrchen nach der Plasmagerinnungsmethode vorbereitet. Jedes Röhrchen enthielt etwa 8-10 Explantationen mit 2 ml eines Mediums, welches aus 75% Hank'scher Lösung, 20% flüssigem menschlichem Serum und 5% Hühnerembryonenextrakt bestand. Die Medien wurden zwei-bis dreimal pro Woche durch Entfernung der Hälfte des ursprünglichen Mediums aus jedem Röhrchen und Ersetzung mit einem gleichen Volumen an frischem Medium gewechselt. Die Ernte aus den ursprünglichen Explantationen bestand hauptsächlich aus Spindelzellen, die nach 4-8 Inkubationstagen rasch zunahmen.
Übertragung der Kultur : Nach 13 Tagen wurde das Medium von den Kulturen entfernt, die Zellen
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mit 2 ml Hank'scher Lösung gewaschen und etwa 2, 5 ml einer 0, 25 < %/oigen Trypsinlösung bei einem pH-Wert von 7,4 und einer Temperatur von 370C zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 370C während etwa 45-60 min gedreht und der Inhalt der Röhrchen gesammelt und in einem Eisbad gekühlt. Die Suspension wurde bei 4-80C mit 1500-1800 U/min während 10-12 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die zurückbleibenden Zellen wurden in einem gleichen Volumen
Nährmedium (das gleiche wie das vorher verwendete) wieder suspendiert und nochmals zentrifugiert.
Die- ses Verfahren wurde dreimal wiederholt und das dritte Mal nur ein halbes Volumen an Nährmedium für die nochmalige Suspension verwendet. Die Suspension wurde auf eine Konzentration von 120 000 Zellen/ml verdünnt, und diese Zellensuspension wurde zur Herstellung stationärer Kulturen verwendet. 1 ml der Suspension wurde in jedes Röhrchen gegeben, und nach zwei Tagen Inkubation bei 370C wurde 1 ml fri- sches Nährmedium zu jedem Röhrchen zugegeben. Nach acht Tagen enthielten die Röhrchen eine Mono- schicht von Spindelzellen und waren nun zur Verwendung für die Zwecke der Erfindung geeignet.
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:Pferdeserum enthielt, gewaschen. Nach drei Waschungen wurde 1, 5 ml "Maintenance-Medium" (Medium
Nr. 635 (Healy u. a., Canad. J.
Biochem. & Physiol., Band 32 [1954], S. 327-337, +10%Pferdeserum) jedem Röhrchen zugefügt. Danach wurden 0, 5 ml einer Lösung, welche jeden der zu testenden Viren ent- hielt, den verschiedenen Röhrchen zugefügt und die Röhrchen bei 370C bebrütet. Von Zeit zu Zeit wur- den die Röhrchen geprüft, um festzustellen, ob die Zellen für die zu testenden Viren empfänglich waren.
Folgende Resultate wurden erhalten :
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<tb>
<tb> Viren, <SEP> welche <SEP> einen <SEP> cytopathogenen <SEP> Zeit, <SEP> bis <SEP> der <SEP> Effekt
<tb> Effekt <SEP> auf <SEP> Zellen <SEP> ausüben <SEP> sichtbar <SEP> wird
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 4, <SEP> RI-67 <SEP> 6 <SEP> Tage.
<tb>
APC, <SEP> Typ <SEP> 4, <SEP> RN <SEP> 11 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 2, <SEP> Ad-6 <SEP> 11 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 3, <SEP> J. <SEP> F. <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> l, <SEP> Mahoney <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 2, <SEP> MEF-1 <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 3, <SEP> Saukett <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Influenza <SEP> 1233 <SEP> 13 <SEP> Tage
<tb> Influenza <SEP> PRg <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Tollwut <SEP> CVS <SEP> 8 <SEP> Tage
<tb> Gelbes <SEP> Fieber, <SEP> 17 <SEP> D <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> östliche <SEP> Pferde-Encephalomyelitis <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Herpes <SEP> HF <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Vaccina <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Psittacosis, <SEP> Borg <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb>
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<tb>
<tb> Viren,
<SEP> die <SEP> keinen <SEP> cytopathogenen
<tb> Effekt <SEP> auf <SEP> Zellen <SEP> ausüben
<tb> Influenza <SEP> WS
<tb> Epidemischer <SEP> Typhus
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 1
<tb>
Zell-Typ : Der vorherrschende Zelltyp ist eine fibroplastartige Zelle.
Die Gewebekulturen der besonderen Zellen werden in üblicher Weise bereitet. Der Zellstamm wird in Hank'schem BBS-Medium kultiviert, zu welchem flüssiges menschliches Serum oder Pferdeserum und embryonale Extrakt zugegeben wurde (vgl. Stulberg u. a., Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Band 89 [1955], S. 438-441). Die Flüssigkeit wird von den drei bis sechs Tage alten Kulturen entfernt, die Zel- len in einem Nährmedium, wie dem Medium 199, welches Menschen-oder Pferdeserum enthält, suspen- diert und die Suspension in frische Behälter gefüllt. Die Behälter werden verschlossen und bei etwa 370C während etwa vier bis sieben Tagen bebrütet. Am Ende dieser Behandlung bedeckt eine annähernd zusam- menhängende Zellschicht die Seiten der Kulturenbehälter.
Die Flüssigkeit wird dekantiert und die Zell- schicht mit einer sterilen Hank'schen Lösung, die Pferdeserum oder eine ähnliche physiologische Lösung enthält, gewaschen. Die Gewebekulturen sind dann zur Beimpfung fertig. Vorzugsweise wird die Beimpfung durchgeführt, bevor das"Supportive Maintenance-Medium"den Zellen zugegeben wird.
Als Impfmedium kann irgendeine Flüssigkeit verwendet werden, die lebenden infektiösen Hepatitis- virus enthält. Man kann z. B. Serum, Plasma oder Blut verwenden, die den Virus in verdünnter oder un- verdünnter Form enthalten, oder auch eine den Virus enthaltende Gewebekulturflüssigkeit. Man kann auch einen flüssigen Extrakt des Stuhls, der Milz, der Leber oder des Knochenmarks von an infektiöser Hepa- titis leidenden Patienten als Impfflüssigkeit verwenden.
Als supportives wässeriges Medium für die Zellen während der Inkubationsperiode kann man eines oder mehrere der üblicherweise verwendeten Medien heranziehen. Medium Nr. 199 mit einem Zusatz von 5 bis 20% Pferde- oder Kalbserum ergibt, wie gefunden wurde, ausgezeichnete Ergebnisse. Hank'sches
BBS-Medium mit einem Zusatz von nicht-menschlichem Serum und embryonalem Extrakt kann ebenfalls verwendet werden. Im allgemeinen wird bevorzugt, von der Verwendung menschlichen Serums bei Me- dien abzusehen, besonders wenn die Erfindung für diagnostische Zwecke verwendet werden soll.
Nach der Beimpfung wird die beimpfte Kultur bei einer für das Zellwachstum günstigen Temperatur
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Monoschicht aufreisst und eine Anzahl von kleinen dunklen körnigen Zellen, unregelmässig in Grösse und Aussehen, sichtbar werden, die sich zu Klumpen ballen, wobei das Chromatin eine Randstellung einnimmt. Dies erfordert im allgemeinen einige Tage. In den meisten Fällen wird die Inkubation während einer Periode von sechs bis vierzehn Tagen durchgeführt.
Nach Beendigung der Inkubation wird die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltende Flüssigkeit von dem in der Kultur vorhandenen festen Material getrennt. Dies kann durch Filtration durch ein Seitzfilter, ein Bakterienporzellanfilter oder ein Bakterienfilter aus gefrittetem Glas oder durch Dekantieren oder durch Zentrifugieren erfolgen. Die erhaltene Gewebekulturflüssigkeit enthält eine hohe Konzentration an dem lebenden infektiösen Hepatitisvirus. Diese, den lebenden Virus enthaltenden Flüssigkeiten sind nützlich für die Beimpfung anderer Gewebekulturen und zur Herstellung von Vaccinen.
Um ein Vaccin aus Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, herzustellen, behandelt man eine Gewebekulturflüssigkeit mit ultraviolettem Licht, Chemikalien oder einer Kombination dieser Massnahmen unter solchen Bedingungen, dass die Infektivität des Virus vollständig zerstört, aber die Antigenwirkung nicht beeinträchtigt wird. Als Chemikalien kann man Formaldehyd, ss-Propiolacton, Chlor oder Phenol verwenden. Da der Virus und seine Antigenwirkung gegenüber Hitze sehr widerstandsfähig ist, können bei der Herstellung der Vaccine, wenn erwünscht, erhöhte Temperaturen angewendet werden. Die optimale Temperatur hängt natürlich von dem jeweils verwendeten besonderen Mittel ab, aber im allgemeinen können Temperaturen zwischen 20 und 800C angewendet werden.
Wenn man B-Propiolacton, entweder allein oder in Kombination mit andern Mitteln, als"Abtötungsmittel" verwendet, ist eine Konzentration im Bereich von 0, 001 bis 0,0025 g/ml der Gewebekulturflüssigkeit zu bevorzugen. Wird Formaldehyd als Abtötungsmittel verwendet, so liegt die anzuwendende Konzentration
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zentration in der Nähe von 0, 1 bis 0, 50/0 liegt. Ultraviolettes Licht wird vorzugsweise entweder vor oder nach der Anwendung eines der chemischen Abtötungsmittel benutzt. Die flüssige Gewebekultur wird vor- ; zugsweise erwärmt und dann in Form eines dünnen Filmes ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge zwi- schen 2000 und 3000 Angström-Einheiten während kurzer Zeit, das ist 1 oder 2 sec oder weniger, ausge- setzt.
Besonders gute Ergebnisse können bei Verwendung einer Zentrifugal-Filmbildungseinrichtung erhal- ten werden, wie eine solche in der USA-Patentschrift Nr. 2, 725, 482 beschrieben ist, wobei eine Durch- satzgeschwindigkeit von. 200 bis 600 ml/min mit einer Ultraviolett-Leistung-von 15 bis 22 W angewendet wird. Die erhaltenen Vaccine sind vollständig frei von lebenden infektiösen Hepatitisviren und sind zur
Herstellung von Immunisierungsseren für Kaninchen und Affen durch Injektionen geeignet. Die Vaccine können auch für prophylaktische Zwecke verwendet werden.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert : Beispiel l : Herstellung einer Gewebekulturflüssigkeit, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthält.
Eine Zellkultur des Detroit-6-Stammes wird in Hank's BBS-Medium mit einem Zusatz von mensch- lichemSerum und embryonalem Extrakt kultiviert, wie es inProc. Soc. Exper. Biol. and Med. 89 [19551,
S. 438-441, beschrieben ist. Die zwei oder drei Tage alte Kultur wird dreimal mit Medium Nr. 199 (Mor- gan u. a., Proc. Soc. Exper. Biol. and Med. 73 [1950], S. 1-8), das 100/0 Pferdeserum enthält, gewaschen.
Ein Serum wird aus dem Blut eines Patienten (MR 1), der von infektiöser Hepatitis befallen ist, be- reitet und das Serum bis zum fünffachen Volumen mit sterilem Medium Nr. 199, das 100/0 Pferdeserum enthält, verdünnt. 0,5 ml des verdünnten Serums werden der Gewebekultur zugefügt und die Zellschicht mit der Beimpfungsflüssigkeit benetzt. l, 5 ml des Mediums Nr. 199 + 10% Pferdeserum wird zugefügt und die Kultur bei 370C während etwa sieben Tagen bebrütet. Am Ende der Inkubationsperiode zerriss die Mo- n'schicht der Zellen und eine Anzahl von kleinen dunklen körnigen Zellen ballten sich, wobei das Chro- matin eine Randzone bildete. Diese körnigen Zellen waren unregelmässig in Aussehen und Gestalt.
Die
Flüssigkeit wird von der Kultur abdekantiert und durch ein Seitzfilter oder ein ultrafeines Bakterienfilter aus gefrittetem Glas filtriert. Das Filtrat enthält lebenden infektiösen Hepatitisvirus und kann für die Her- stellung eines abgetöteten Vaccins verwendet werden.
In ähnlicher Weise wurden lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltende Gewebekulturflüssigkeiten aus dem Serum von vier andern Patienten (SAL, G. Pas, D. Keb und H. Pom), die von infektiöser Hepati- tis befallen waren, hergestellt.
Anstatt der Verwendung eines lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltenden Serums als Beimpfungs- flüssigkeit kann man auch eine Stuhlsuspension verwenden. Dies erfolgt dadurch, dass man eine Stuhlprobe eines an infektiöser Hepatitis erkrankten Patienten auf das 100fache Volumen mit steriler physiologischer
Salzlösung oder Medium Nr. 199 verdünnt, zentrifugiert und 0, 5 ml der klaren überstehenden Flüssigkeit als Beimpfung verwendet. Auf diese Weise wurden Gewebekulturflüssigkeiten mit einem Gehalt an leben- dem infektiösem Hepatitisvirus aus den Stühlen von drei Patienten (New, GAR und U. S. A.), die an infek- tiöser Hepatitis litten, hergestellt.
Beispiel 2 : Vaccinherstellung.
Eine Suspension von Detroit-6-Zellen wird aus 100 Stammkulturen, die auf Glas in 100 g (32 oz)-Fla- schen gezogen waren, durch Behandlung mit einer wässerigen Lösung enthaltend 0, 02% Äthylendiamino- tetraessigsäure, hergestellt. Die erhaltene Suspension wird zu 241 Nährmedium (Medium Nr. 199 + 20%
Menschenserum) zugefügt, wobei man eine Suspension mit einem Gehalt von 60 000 Zellen pro ml erhält.
Nach Durchmischung wird die Suspension mittels eines Eisbades auf 0-50C gekühlt und mit einem magnetischer Rührer in gleichmässiger Suspension gehalten. Die Suspension wird in aliquote Teile von 80 ml geteilt und in 300 sterilen 100 g-Flaschen eingebracht. Die Flaschen werden dicht verschlossen und vier Tage bei 37, 50C bebrütet.
Zu dieser Zeit'haben sich die Zellen vervielfältigt und bilden eine fast zusammenhängende Schicht, die die Seite der Kulturflaschen bedeckt. (Jede Flasche enthält ungefähr
15 Millionen Zellen.) Die Zellschichten werden dreimal mit ungefähr 100 ml steriler Hank'scher Lösung, die 10% Pferdeserum enthält, gewaschen, um menschliches Serum zu entfernen, welches Hepatitis-Antikörper enthalten könnte. Die Kulturen sind nun fertig zur Beimpfung. 300 gewaschene Kulturen werden durch Zugabe von 4 ml einer gemäss Beispiel 1 hergestellten, lebenden infektiösen Virus enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit besät, und die Impfflüssigkeit über die ganze Zellschicht gesprüht. Nach einer Inkubation von 30 min, zur Einleitung der Infektion, werden zu jedem Behälter 36 ml eines"MaintenanceMediums" (Medium Nr. 199 + 5% Pferdeserum) zugefügt.
Die Flaschen werden dann sechs Tage bei
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37, 50C bebrütet ; am Ende dieser Zeit sind die Zellschichten zerrissen und einige der Zellen aufgebro- chen. Die Flüssigkeiten werden gesammelt und vereinigt. Die Gesamtausbeute beträgt ungefähr 11, 7 l.
Proben des gesammelten Produktes werden auf ihre Lebensfähigkeit geprüft, indem man eine Probe ver- dünnt und die Verdünnung feststellt, in welcher an frischen Kulturen von Detroit-6-Zellen noch eine cy- topathogene Änderung bewirkt wird. Die Suspension bei diesem besonderen Beispiel hatte noch bei einer
Verdünnung von 10 : 4. oder 1 : 10000 die Fähigkeit, solche cytopathogene Änderungen zu bewirken. Die
Potenz der Flüssigkeit wurde auch in bezug auf ihre Fähigkeit, Meerschweinchen-Komplement zu fixieren, geprüft. Diese Flüssigkeit war bei einer Verdünnung von 1 : 4 imstande, eine Einheit von Meerschwein- chen-Komplement zu fixieren, in Gegenwart von zwei Einheiten von in Affenserum enthaltenen Antihe- patitis-Antikörpern.
(Die Methode zur Ausführung dieses Komplement-Fixierungstestes ist in Viral &
Rickettsial Infections of Man, herausgegeben von Thomas M. Rivers, M. D. [1948], S. 72-75, J. B.
Lippincott Company beschrieben.)
11, 51 der rohen, das Antigen enthaltenden Flüssigkeit werden durch Behandlung mit einer Vibra- tionseinrichtung oder einem Dispergator homogenisiert, um etwa vorhandene Klumpen zu zerteilen. Die
Suspension wird dann durch Leiten durch eine Reihe von drei Filterkerzen aus gefrittetem Glas mit gra- duierter Porosität geklärt, wobei die letzte Kerze einen mittleren Porendurchmesser von etwa 0,9 Mikron besitzt. Das erhaltene Filtrat ist frei von Zellklumpen und Aggregaten, enthält aber noch den lebenden infektiösen Hepatitisvirus. Versuche mit dieser filtrierten Flüssigkeit zeigen keinen deutlichen Abfall der
Infektivität oder der Komplement-Fixierungsaktivität im Vergleich mit der rohen Flüssigkeit. Ungefähr
11, 2 l an klarem Filtrat werden erhalten.
Hochgereinigtes ss-Propiolacton wird langsam zu 10, 51 der filtrierten Flüssigkeit bei etwa 40C zugefügt, bis die endgültige Konzentration an ss-Propiolacton 0, 001 g/ml beträgt. Der die Flüssigkeit enthaltende Behälter wird in ein auf 600C erhitztes Wasserbad gesetzt ; es wird gerührt, bis die Temperatur in dem Behälter auf ungefähr 600C steigt. Während des Erhitzens wird tropfenweise 1/10 normale Natriumhydroxydlösung zugefügt, um den pH-Wert im Bereich von 6, 9 bis 7, 1 zu halten, was durch die Farbe eines Phenolrot-Indikators in dem Medium Nr. 199 angezeigt wird. Die Flüssigkeit wird bei 600C für weitere 20 min erhitzt und dann gekühlt.
In diesem Stadium zeigt sich keine Restaktivität des Antigens bei einem gewöhnlichen Test in den Röhrchen ; wenn jedoch grosse Volumina (40 ml in jeder von 10 Kulturflaschen getestet werden, bleiben Spuren von Restinfektivität zurück.
Um diese letzten Spuren von Infektivität zu zerstören, wird die behandelte Flüssigkeit durch eine Zentrifugal-Bestrahlungseinrichtung (wie in der USA-Patentschrift Nr. 2, 725, 482 beschrieben) mit voller Geschwindigkeit von 500 ml/min mit einer Ultraviolett-Leistung von 20 W geleitet. Ungefähr 9, 11 Vaccin werden erhalten. Nach dieser Behandlung kann keine RUckstands- bzw. Restinfektivität für Detroit-6-Zel- len bei wiederholten Tests von 400 ml-Proben (40 ml auf jede von 10 Kulturflaschen) mehr festgestellt werden.
Nach diesen Behandlungen kann die Flüssigkeit sicher und ohne Gefahr, sich mit Hepatitis zu Infi- zieren, gehandhabt werden. Die inaktivierte Flüssigkeit ist jedoch noch fähig, bei einer Verdünnung von 1 : 2 Komplemente zu fixieren, wie durch die beschriebene Methode festgestellt werden kann. Auf diese Weise wurde ein grosser Teil der Antigenwirkung erhalten, obgleich die Infektivität vollständig zerstört wurde. Um zu zeigen, dass die Immunisierungswirkung erhalten wird, wurden fünf Affen mit dem Vaccin geimpft, wobei jeder Affe 1 ml der Flüssigkeit in den Wadenmuskel erhielt. Nach drei solchen Impfungen, in Zweiwochenintervallen, sind die von den. Tieren gewonnenen Serumproben fähig, zehn infektiöse Dosen des MR 1-Stammes des Hepatitisvirus bei einer Verdünnung von 1 : 10 bis 1 : 320 zu neutralisieren.
Ein ähnliches Experiment mit Kaninchen, wobei dieselbe Menge an Antigen verwendet wurde, durch Ul-
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enthalten.
Fünf Röhrchen einer Gewebekultur von PD39T-Zellen werden vorbereitet und mit 0, 5 ml einer 1 : 5Verdünnung des Serums eines von infektiöser Hepatitis befallenen Patienten beimpft.
1, 5 ml"Maintenance-Lösung" (Medium Nr. 199 + 5% Pferdeserum) wird zu jedem Röhrchen zugefügt und die Kulturen zehn Tage bei 37, 50C bebrütet. Die Kulturflüssigkeiten werden durch ein Bakterienfilter mit einer mittleren Porosität von 0, 3 Mikron geleitet, wobei ein Filtrat erhalten wird, das lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthält.
Beispiel 4 : Vaccinherstellung.
Genügend Formalin wird zu 1, 5 l einer nach Beispiel 2 hergestellten, lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit zugefügt, um eine Endkonzentration von 1 : 4000 zu erhalten.
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Die Mischung wird 1 h bei 750C erhitzt. Die erhaltene Lösung wird durch eine Zentrifugal-Filmbildungseinrichtung des imBeispiel 2 beschriebenen Typs mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/min und Anwendung einer Ultraviolett-Leistung von 20 W geleitet. Das erhaltene Vaccin enthält keinen lebenden infektiösen Hepatitisvirus, besitzt aber Antigenwirkung.
Beispiel 5 : Vaccinherstellung.
Genügend Phenol wird zu 500 ml einer nach Beispiel 2 hergestellten, lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit zugefügt, um eine Endkonzentration von 0, 50/0 zu erhalten.
Die Mischung wird bei 700C erhitzt und dann durch einen Zentrifugalfilmer, wie dem in Beispiel 2 beschriebenen, mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min und Anwendung einer Ultraviolett-Leistung von 20 W geleitet. Das erhaltene Vaccin enthält keinen lebenden infektiösen Hepatitisvirus, besitzt aber Antigenwirkung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines Vaccins gegen infektiösen Hepatitisvirus, dadurch gekennzeichnet, dass lebender infektiöser Hepatitisvirus in einer Gewebekultur des Detroit-6-Stammes epithelartiger Zellen oder aus embryonalem Gewebe gewonnener Spindelzellen, wie PD39T-Zellen, in wässerigem Medium kultiviert wird, die erhaltene wässerige Flüssigkeit, die eine hohe Konzentration an lebendem infektiösem Hepatitisvirus enthält, abgetrennt und diese Flüssigkeit mit einem oder mehreren der folgenden Inaktivierungsmittel : Formaldehyd, Phenol, ss-Propiolacton, Chlor oder mit Ultraviolettlicht kombiniert mit einem oder mehreren der vorgenannten Inaktivierungsmittel behandelt wird, wobei die Infektivität des Virus vollständig zerstört, die Antigenwirkung des Virus aber nicht wesentlich beeinträchtigt wird.