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Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q-10
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Das bei der hydrolytischen Behandlung entstehende Gemisch wird gekühlt und mit einer leichten Erd- ölfraktion extrahiert, der Extrakt wird getrocknet, und es wird eine Lösung zur Ausführung des nachstehend beschriebenen modifizierten Craven-Tests hergestellt, der ein Farbtest ist, auf welchen alkoxysubstituierte Chinone allgemein durch Bildung einer blauen Farbe ansprechen.
Mikroorganismen, die zufolge dieser Analyse erhebliche Mengen an Coenzym Q erzeugen, können zur Herstellung von Impfkeimen verwendet werden. Insbesondere wählt man diejenigen Organismen aus, die Coenzym Q-10 in hoher Ausbeute erzeugen. Diese Organismen wurden entdeckt, indem nach der oben beschriebenen Methode gewonnene Kulturextrakte mit bekannten Normproben von Coenzym Q-10 in einem papierchromatographischen System verglichen wurden, wobei die Flecke auf mit Vaseline als nicht beweglicher Phase getränkten Papieren mit ausgewählten Lösungsmittelsystemen, wie Dimethylformamid mit einem sorgfältig gesteuerten Gehalt an Spuren von Wasser, entwickelt wurden.
Nach der Entwicklung wird die Lage von gelben Flecken auf den Papieren durch Besichtigung festgestellt, und die Papiere werden gewünschtenfalls mit Farbstoffen besprüht, um die Flecke noch intensiver hervortreten zu lassen und dadurch das Coenzym Q zu identifizieren. Kulturen von so identifizierten Bakterien. welche Coenzym Q-10 erzeugen, werden zur Züchtung in geeigneten Nährmedien ausgewählt.
Insbesondere wurde gefunden, dass Kulturen des Genus Proteus, wie Proteus vulgaris (Stamm 3307.
H-Form), von dem eine lebende Kultur in der"American Type Culture Collection" unter der Nummer ATCC 6897 hinterlegt worden ist, Coenzym Q-10 erzeugen. Ebenso wurde gefunden, dass Kulturen des Genus Pseudomonas, wie Pseudomonas denitrificans, eine Kultur, die unter der Bezeichnung NRRL-B-1665 in der "Northern Regional Research Laboratories type culture collection" hinterlegt worden ist, und die die charakteristischen Eigenschaften dieser Species besitzt, wie sie in"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (6. Auflage, Breede, Murray und Hitchins) beschrieben worden sind, sowie ein Pseudomonas, von dem eine lebende Kultur unter Nr. 13283 in der"American Type Culture Collection"hin- terlegt worden ist, Coenzym Q-10 hervorbringen, wenn sie gezüchtet werden und die Analyse in der oben beschriebenen Weise ausgeführt wird.
Die Erfindung umfasst auch diejenigen Mutanten, die in Zukunft noch entdeckt oder aus den Species des Genus Proteus und des Genus Pseudomonas durch Ultraviolettbestrahlung, Röntgenbestrahlung, Behandlung mit stickstoffhaltigen Senfgasverbindungen oder durch andere physikalische oder chemische Behandlungen erzeugt werden, sowie spontane Mutationen, wie sie üblicherweise angewandt bzw. gefunden werden.
Nach der Beimpfung des für das erfindungsgemässe Verfahren hergestellten Nährmediums mit einer Kultur dieser Bakterien wird der Ansatz vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, unter sonst sterilen Bedingungen zwecks Verhinderung von Verunreinigungen bei Temperaturen zwischen 15 und 50 C, vorzugsweise zwischen 27 und 37 C, im Verlaufe von 10 h bis 10 Tagen belüftet und gerührt oder heftig geschüttelt, wobei die Zeitdauer von der Wachstumsgeschwindigkeit abhängt. Sobald die Fermentation
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einigermassen vollständig ist, was man nach der Dichte des Wachstums oder auf andere geeignete Weise beurteilt, werden die Zellen und die Brühe geerntet, indem die Belüftung und Bewegung unterbrochen wird, worauf das Zellenmaterial abfiltriert oder abzentrifugiert wird.
Das Zellenmaterial wird dann in
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Chinons in Form des Coenzyms Q-10 hinterbleibt.
Dieser, Coenzym Q-10 enthaltende rohe Rückstand kann auf verschiedene Weise analysiert werden, z. B. durch den modifizierten Craven-Test (Erzeugung einer blauen Farbe durch Einwirkung von Cyanessigsäureäthylester und Alkali in äthanolischer Lösung), durch Papierchromatographie und durch die Differenz in der Intensität der Lichtabsorption bei 275 mp vor und nach der Reduktion mit Reduktionsmitteln wie Natriumborhydrid.
Im Rahmen der Erfindung kann man auch die ganze Fermentationsbrühe hydrolysieren ; es ist jedoch gewöhnlich vorzuziehen, die Gesamtvolumina kleiner zu halten, indem man nur die Feststoffe, wie das Zellenmaterial, hydrolysiert, weil das durch Fermentation erzeugte verfügbare Coenzym Q gewöhnlich darin enthalten ist.
Die Zellen in der Brühe können auch bereits vor der Hydrolyse durch Lyse zerstört werden.
Die Erfindung umfasst auch die Möglichkeit der Hydrolyse mit andern Säuren oder Alkalien sowie den Schutz des Coenzyms Q-10 während dieser Behandlung durch andere Oxydationsverzögerer als Pyrogallol oder durch Reduktionsmittel, wie eine Kombination von Metall und Säure oder von Metall und Alkali, Hydride u. dgl., oder den Schutz des Coenzyms ohne solche Mittel mit Hilfe einer Schutzatmosphäre aus einem nicht reaktionsfähigen, sauerstofffreien Gas, wie Stickstoff, oder einer reduzierenden Atmosphäre, wie Wasserstoff.
Ferner umfasst die Erfindung die unmittelbare Extraktion ohne vorherige Hydrolyse, da sich herausgestellt hat, dass die Lösungsmittelbehandlungen, das Rühren mit Chloroform, Aceton, Alkohol u. dgl., einzeln oder in Mischung miteinander, die Zellwandungen durch Lyse zerstören und die Zellenbestandteile in Freiheit setzen.
Die auf diese Weise erhaltenen organischen Lösungsmittelextrakte hinterlassen beim Abdampfen ein verhältnismässig rohes Konzentrat von Coenzym Q-10, welches rein genug für die unmittelbare Anwendung in rohen Gemischen, z. B. zur Ergänzung von Nahrungsmitteln, und in der reduzierten Form (Hydrochinon des Coenzyms Q-10) als Oxydationsverzögerer geeignet ist, wie die Hydrochinone, die allgemein zur Verhinderung des Ranzigwerdens und Verderbens technischer Fette, Öle u. dgl. verwendet werden. Da dieses Chinon ein natürlicher Bestandteil des Brustgewebes ist, ist es in dieser Beziehung sogar noch geeigneter.
Solche verhältnismässig rohe Präparate können nach chromatographischen Verfahren weiter gereinigt werden, wobei man eines oder mehrere der verschiedenen, an sich bekannten Adsorptionsmittel verwen-
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mitteln, wie Äthern, Chloroform, halogenierten Lösungsmitteln, Benzol, Ketonen oder Alkoholen bestehen, je nachdem, wie es die Polarität des Adsorptionsmittels erfordert. Im Falle der Verteilungschromatographie kann man hydrophobe Träger aus vielen verschiedenen Stoffen, wie Kieselgel, Kautschukpulver, Cellulose oder Diatomeenerde, nach bekannten Methoden herstellen, und die Eluierungsmittel müssen stärker polar, jedoch nicht mischbar sein, wie Alkohole, Amide u. dgl., während die auf dem Träger befindliche Lösungsmittelphase aus nicht polaren Lösungsmitteln, wie Benzol, Erdölfraktionen u. dgl., ausgewählt wird.
Eine andere Methode, mit der man eine wesentliche Reinigung erzielt, ist die Gegenstromextraktion mit Lösungsmittelphasen, wie Dimethylformamid mit einem Gehalt an Wasser und Erdölfraktionen. Die zuletzt gewonnenen Eluate oder Konzentrate können durch Kristallisieren aus Lösungsmitteln gereinigt werden, in denen der Löslichkeitsbereich bei niedrigen Temperaturen wertvoll ist ; besondere Beispiele hiefür sind Aceton oder Äthanol. Auf diese Weise erhält man praktisch reines Coenzym Q-10 als orangegelben festen Stoff, der im Bereich von 47 bis 500C schmilzt. Solche kristalline Präparate werden als reines Coenzym Q-10 durch Unterscheidung von andern "Coenzymen Q" (Q-9, Q-8 usw. ) mit Hilfe der Papierchromatographie, des Ultrarotspektrums und des kernmagnetischen Resonanzspektrums identifiziert.
Bei diesen Analysen lässt sich das erfindungsgemäss gewonnene Erzeugnis nicht von andern reinen Proben von aus Rinderherzmuskel hergestelltem authentischem Coenzym Q-10 unterscheiden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ihren Umfang jedoch nicht einschrän-
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ken. Es können Abänderungen hinsichtlich des Impforganismus, des Nährmediums, in welchem der ausgewählte Organismus gezüchtet wird, des Fermentationsverfahrens und der Einzelheiten der Isolierung des Coenzyms Q-10 vorgenommen werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Beispiel l : Ein Nährmedium wurde aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> Technisches, <SEP> enzymatisch <SEP> angedautes
<tb> Casein <SEP> (N <SEP> -Zamine) <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Technischer <SEP> Fleischextrakt <SEP> (Difco) <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> mit <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> cm3
<tb>
Nach der Hitzesterilisierung (im Autoklaven mit Dampf von 1 atü behandelt und gekühlt) wurde ein
250 cm3-Kolben, der 50 cm3 des Mediums enthielt, aseptisch mit einer Kultur von Proteus vulgaris
ATCC 6897 beimpft und unter sonst sterilen Bedingungen 24 h auf einem rotierenden Schütteltisch bei etwa 280C in Bewegung gehalten.
Diese Subkultur wurde dann in Anteilen als Impfstoff auf zwanzig ste- rile Kolben verteilt, die je etwa 50 cm3 des nach der obigen Vorschrift hergestellten Nährmediums enthielten. Die Kolben wurden dann 60 - 70 h bei etwa 280C unter Belüftung und Bewegung auf einem ro- tierenden Schütteltisch bebrütet.
Die erhaltene Brühe (insgesamt 950 cm3) wurde zentrifugiert, und die Zellenfeststoffe wurden getrocknet (1, 73 g Trockengewicht). Dieses Material wurde mit einem Gemisch von 50 cm3 Wasser,
100 cm3 lomiger äthanolischer Kalilauge und 4 g Pyrogallol durch 30 min langes Kochen am Rückflusskühler hydrolysiert. Das Gemisch wurde gekühlt und dreimal mit je 100 cm3 "Skelly-solve B" extrahiert.
Die vereinigten organischen Extrakte wurden unter dem Abzug mit Hilfe eines Luftstromes zu einem Rückstand eingeengt, der in 5 cm3 950/obigem Äthanol aufgenommen und dem modifizierten kolorimetrischen Craven-Test unterworfen wurde.
Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung (Modifizierter Craven-Test).
4 cm3 der obigen, zu analysierenden Lösung in Alkohol wurden mit 1 cm3 Cyanessigsäureäthylester und 1 cm3 0, 2n-Kalilauge versetzt. Es entwickelte sich eine blaue Farbe, was einen positiven Test anzeigte. Die Farbe wurde 30 min nach Zusatz der Reagenzien in einem"Lumitron"-Kolorimeter unter Verwendung eines blauen Filters bestimmt, welches die Wellenlänge von 620 mu des sichtbaren Lichts durchlässt. Der Wert der Ablesung betrug 62 und wurde mit Eichkurven verglichen, die bei Ausführung der gleichen Analyse mit authentischem Coenzym Q-10 erhalten worden waren. Es ergab sich ein Gehalt von 250 y an Coenzym Q in der gesamten Probe oder 144, 0 y je g trockenen Zellenmaterials.
Beispiel 2 : Die Fermentation gemäss Beispiel 1 wurde mit Proteus vulgaris ATCC 6897 und dem in Beispiel 1 angegebenen Nährmedium durchgeführt, und das hiebei erhaltene Zellenmaterial wurde gesammelt. Das-Trockengewicht betrug 2, 11 g. Dieses trockene Zellenmaterialwurde mit alkoholischer Kalilauge und Pyrogallol hydrolysiert und gemäss Beispiel 1 mit"Skellysolve B"extrahiert. Die Extrakte wurden eingeengt und durch Papierchromatographie untersucht.
Papierehromatographisches Verfahren.
Whatman-Filterpapier Nr. l wird mit Vaseline getränkt, indem ein Blatt durch eine 50/oige Lösung von Vaseline in Petroläther gezogen und dann trocknen gelassen wird. Das Papier wird in kreisförmige Scheiben von etwa 30 cm Durchmesser geschnitten, und es wird in der Mitte ein kreisförmiges Loch von etwa 1 bis 1, 5 cm Durchmesser gebohrt. Die zu untersuchenden Proben werden in einem geeigneten Lösungsmittel aufgenommen und als kleine Flecke auf Punkte auf dem Papier aufgetupft, die konzentrisch in einem Kreis um das Mittelloch verteilt sind. Normproben von bekanntem Coenzym Q-10 werden ebenfalls aufgetupft, u. zw. sowohl allein als auch im Gemisch mit der zu untersuchenden Probe. Wenn das Material sichtbar als gelber Fleck erscheinen soll, benötigt man etwa 30 y.
Im ultravioletten Licht kann man bereits 3 y als dunkle (ultraviolett absorbierende) Fläche sehen. Nach dem Aufbringen der Testtupfen und Trocknen werden die Papiere entwickelt, indem man sie waagrecht in eine Glaskammer einbringt, die auf den äusseren Kanten des Kreises abgestützt ist. (Dies geschieht zweckmässig, indem man das Papier auf eine feuerfeste flache Schüssel aus schwer schmelzbarem Glas mit geschliffenen Kanten legt und mit einer ähnlichen, aber umgekehrten Schüssel zudeckt.) Das Lösungsmittel für die Entwick-
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Docht wird durch das Mittelloch in das Lösungsmittel eingeführt (wodurch das Blatt infolge der aufsteigenden Kapillarwirkung mit Lösungsmittel gespeist wird). Dann wird das Blatt getrocknet und besichtigt, was erforderlichenfalls im ultravioletten Licht erfolgt.
Soll der Fleck noch intensiver erscheinen, so kann er mit einer reduzierten Lösung von Methylenblau (Leukofarbstoff) besprüht werden, die von einem Chinon dieser Art rasch zu einem blauen Fleck oxydiert wird (auf diese Weise kann man etwa 1 y Coenzym Q-10 nachweisen). Je nach dem Prozentgehalt des Entwicklers an Wasser besitzt das Coenzym Q-10 einen Rf-Wert von 0, 2 bis 0, 6.
Als der durch Fermentation von Proteus vulgaris ATCC 6897 gewonnene Extrakt nach diesem papierchromatographischen Verfahren untersucht und mit authentischen Proben von Coenzym Q-10 verglichen wurde, die auf einem solchen Papier mit Dimethylformamid mit einem Wassergehalt von 2% entwickelt wurden, wurde eine deutliche gelbe Zone mit einem Rf-Wert von 0, 33 festgestellt, die sich nach dem Vermischen mit bekanntem Coenzym Q-10 nicht zerlegen liess, wodurch die Identität des durch Fermentation hergestellten Stoffes mit dem aus Rinderherzmuskel hergestellten Coenzym Q-10 bewiesen war.
Beispiel 3 : Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurde eine Reihe von Kolben, die das Nährmedium gemäss Beispiel 1 enthielten, mit Pseudomonas sp. ATCC 13 283 aus einer Kultur beimpft, die im Verlaufe von 21 h bei 280C in einem Schüttelkolben nach dem obigen Verfahren gezüchtet worden war. Nachdem eine Reihe von zwanzig so beimpften Kolben, die je etwa 50 cm3 Nährmedium enthielten, 68 h bei 280C in einer rotierenden Schüttelmaschine in Bewegung gehalten worden war, wurden 940 cm3 Brühe geerntet, und das getrocknete Zellmaterial wog 2, 60 g. Es wurde nach Beispiel 1 aufgearbeitet und lieferte eine Testlösung, die nach dem kolorimetrischen Verfahren des Beispiels 1 analysiert wurde.
Der kolorimetrische Wert von 7, 0 bedeutete einen Gehalt von mehr als 1000 y Coenzym Q in der gesamten Probe oder mehr als 376 y/g Trockengewicht der Zellen.
Beispiel 4 : Eine Fermentation von Pseudomonas sp. (ATCC 13 283) wurde in insgesamt etwa 11 des Nährmediums gemäss Beispiel 1 nach dem Verfahren des Beispiels 3 durchgeführt. Nach 66 h wurde das Zellenmaterial, wie oben beschrieben, geerntet und getrocknet, wobei 2. 56 g erhalten wurden. Dieser Rückstand wurde durch alkalische Hydrolyse nach Beispiel 1 aufgearbeitet, und die Skelly-solveExtrakte wurden nach der im Beispiel 2 beschriebenen papierchromatographischen Methode untersucht. Das Papierchromatogramm wurde mit bekannten Standardlösungen von authentischem Coenzym Q-10 aufgenommen und das zur Entwicklung verwendete Lösungsmittel war Dimethylformamid mit einem Gehalt von 1% Wasser.
Sobald die Papierscheibe vollständig entwickelt war, zeigte sich, dass die untersuchte Probe einen gelben Fleck erzeugte, der von demjenigen von authentischem Coenzym Q-10 nicht getrennt werden konnte. Im Falle dieses Lösungsmittelgemisches betrug der Rf-Wert 0, 51.
Beispiel 5 : Eine Kultur von Pseudomonas denitrificans NRRL B-1665 wurde hergestellt, indem 50 cm3 sterile"Difco-Nährbrühe"in einem 250 cm3 -Kolben unter sonst sterilen Bedingungen mit einer reinen Kultur dieses Bakteriums beimpft und 24 h bei 280C auf einem rotierenden Schütteltisch in Bewegung gehalten wurden.
Diese Brühe wurde dann zum Beimpfen von zwanzig in ähnlicher Weise vorbereiteten Kolben verwendet, die je etwa 50 cm3 sterile Difco-Nährbrühe enthielten. Die Kolben wurden 60 h bei 280C auf einem rotierenden Schütteltisch in Bewegung gehalten. Insgesamt ergab sich hiebei eine Ernte von 11 Brühe. Das Zellenmaterial wurde abzentrifugiert und getrocknet. Gewicht =1,01 g.
Dieses Material wurde gemäss Beispiel 1 der alkalischen Hydrolyse unterworfen und mit Skelly-solve extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und nach Beispiel 1 kolorimetrisch untersucht. Die Photometerablesung betrug 79, 8, was nach den mit authentischen Proben dieses Chinons hergestellten Eichkurven 30 y Coenzym Q-10 oder 30 y/g Trockenzellgewicht entspricht.
Beispiel6 :ZurHerstellungdesCoenzymsQ-10durchFermentationkannmanvieleverschiedene Medien verwenden, die sowohl Rohstoffe als auch Reinsubstanzen enthalten können. Ein Nährmedium wird durch Vermischen der folgenden Bestandteile mit 11 Wasser hergestellt :
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<tb>
<tb> Zuckerrübenmelasse <SEP> 120 <SEP> g
<tb> (NHHPO <SEP> 6 <SEP> g
<tb> MgS04. <SEP> 7 <SEP> Hp <SEP> 1 <SEP> g
<tb> MnSO. <SEP> 4 <SEP> Hp <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> ZnS04. <SEP> 7HO <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Na2Mo04. <SEP> 2 <SEP> HO <SEP> 5 <SEP> mg
<tb>
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Nach dem Auffüllen mit destilliertem Wasser wird der pH-Wert auf 7,5 eingestellt. Dann wird das Medium mindestens 20 min mit Dampf von 1 atü sterilisiert und gekühlt.
(Dies kann vorteilhaft auch nach der Verteilung der einzelnen Anteile auf die Schüttelkolben erfolgen.)
Nach dem Zusatz des Mediums und dem Sterilisieren werden die Kolben mit einer reinen Kultur eines geeigneten Stammes von Pseudomonas denitrificans, z. B. NRRL B-1665, unter aseptischen Bedingungen beimpft. Man lässt das Wachstum 60 - 100 h fortschreiten, wobei die Kolben in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 C in Bewegung gehalten werden. Dann wird die Brühe geerntet. Ein typischer Versuch lieferte aus 1000 cm geernteter Brühe 19,9 g trockenes Zellmaterial, welches nach dem oben beschriebenen Verfahren zu 41,4 mg Coenzym Q-10, bestimmt durch Kolorimetrie und Papierchromatographie, aufgearbeitet wurde.
Beispiel 7 : Ein synthetisches Medium wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt, die in 11 destilliertem Wasser gelöst werden :
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<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Mononatriumglutaminat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> (MHHPC <SEP> 4 <SEP> g
<tb> MgSO4 <SEP> 4 <SEP> g
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 091 <SEP> g
<tb> Na2Mo04 <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> Fes4. <SEP> 7 <SEP> Hp <SEP> 20 <SEP> mg
<tb>
Das Medium wird vor dem Sterilisieren unter den Bedingungen des Beispiels 6 auf einen PH-Wert von 6,5 bis 6,8 eingestellt. Nach dem Beimpfen mit einer geeigneten reinen Kultur einer Species des Genus Pseudomonas, wie z. B. Pseudomonas dinitrificans (NRRL B-1665), wird die Fermentation nach Beispiel 6 durchgeführt. Das Coenzym Q-10 wird als roher Extrakt isoliert und nach den Verfahren der Beispiele 1 und 2 bestimmt.
Aus einer Probe von 995 cm3 an geernteter Brühe wurden 3,9 g getrocknete Zellen gewonnen. Beim Aufarbeiten dieses trockenen Materials nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden 3, 95mg Coenzym Q-10 erhalten, bestimmt durch kolorimetrische und papierchromatographische Analyse.
Beispiel 8: Ein Nährmedium wird aus den folgenden Bestandteilen in 11 destilliertem Wasser hergestellt :
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<tb>
<tb> Soja-Pepton <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 30 <SEP> g
<tb> (NH4) <SEP> 2HPO <SEP> 4 <SEP> g
<tb> MgSO4 <SEP> 4 <SEP> g
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 091 <SEP> g <SEP>
<tb> Na2MoO <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> FeS04'7 <SEP> hop <SEP> 20 <SEP> mg
<tb>
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B.NRRL B-1665, beimpft.
Nach der, wie oben beschriebenen, durchgeführten Fermentation betrug die Menge der geernteten Brühe von einem Versuch 995 cm3, woraus 4, 25 g trockene Zellsubstanz isoliert wurden. Beim Aufarbeiten nach den obigen Verfahren wurden 4, 5 mg Coenzym Q gewonnen, was durch kolorimetrische Analyse festgestellt wurde.
Beispiel 9: Ein Nährmedium wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt, die in 11 destillier. tem Wasser gelöst werden :
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<tb>
<tb> Kristalline <SEP> Dextrose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Technischer <SEP> Hefeextrakt
<tb> (Difco) <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb>
Das Medium wird vor dem Sterilisieren auf einen PH-Wert von 7, 0 eingestellt. Nach den oben beschriebenen Verfahren wird es unter aseptischen Bedingungen mit einem geeigneten Stamm von Pseudomonas sp., wie Pseudomonas denitrificans NRRL B-1665, beimpft und dann 60 h bis 10 Tage bei etwa 280C in Bewegung gehalten. Hierauf wird die Zellensubstanz geerntet.
Bei einem typischen Arbeitsgang lieferte 11 geerntete Brühe 9, 4 g trockene Zellsubstanz. Beim Aufarbeiten dieses Materials nach den obigen Verfahren wurden zufolge der kolorimetrischen und der papierchromatographischen Analyse 5, 7 mg Coenzym Q-10 gewonnen.
Beispiel 10 : Dieses Beispiel erläutert die Herstellung in grosstechnischem Massstabe. Ein Nähr- medium wird durch Vermischen der folgenden Bestandteile hergestellt :
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<tb>
<tb> Zuckerrübenmelasse <SEP> 1250 <SEP> g
<tb> (NH4)2HPO4 <SEP> 20 <SEP> g
<tb> MgS04. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MnSO4. <SEP> hop <SEP> 2 <SEP> g
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,2g
<tb> Na2MoO. <SEP> 2 <SEP> H <SEP> O <SEP> 50 <SEP> mg
<tb>
Man füllt mit reinem Wasser auf 10 1 auf, stellt den pH-Wert auf 7,5 ein und sterilisiert den Ansatz durch Direktdampfbeheizung mit Dampf von 1200C und 1 atü für eine Zeitdauer von nicht weniger als 30 min.
Der ganze Ansatz, der sich in einer mit einer Anordnung zum heftigen Rühren und zum gleichzeitigen Belüften mit einem starken Strom von steriler Luft versehenen sterilen Fermentationskammer befindet, wird auf eine wesentlich unterhalb 400C liegende Temperatur gebracht und unter sonst sterilen Bedingungen mit dem gesamten Inhalt eines Schüttelkolbens beimpft, der etwa 500 cm3 einer Brühe eines nach Beispiel 1, 2,3, 4 oder 5 hergestellten vegetativen Wachstums des reinen Stammes des ausgewählten Organismus enthält.
Der Ansatz wird, je nach der erzielten Wachstumsgeschwindigkeit, ungefähr 2 Tage bei 28 C belüftet und heftig gerührt. Wenn das Wachstum ausreicht, was nach der Dichte der Zellsubstanz beurteilt wird, wird der Inhalt dieses Fermentationsgefässes zur Beimpfung eines grösseren Ansatzes verwendet :
Das Nährmedium für 1000 1 wird, wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung grösserer Mengen, hergestellt :
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<tb>
<tb> Zuckerrübenmelasse <SEP> 60 <SEP> kg
<tb> (NH4)2HPO4 <SEP> 5kg
<tb> mgso <SEP> 4-7 <SEP> H20 <SEP> 1 <SEP> kg
<tb> Mins04. <SEP> Hp <SEP> 200 <SEP> g <SEP>
<tb> ZnSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 20 <SEP> g
<tb> FeS04. <SEP> H20 <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Na2Mo04. <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb>
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ander vermischt.
Sie werden mit etwa 1000 1 eines entsprechend vorbehandelten, gereinigten Wassers entweder in dem Fermentationsgefäss selbst oder in einem besonderen Bottich verdünnt. Das Wasser ist vor seiner Einführung in das sterile Fermentationsgefäss sterilisiert worden oder wird auf dem oben be-
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schriebenen Wege in situ sterilisiert. Der pH-Wert wird vor dem Sterilisieren auf 7, 0 bis 7,5 eingestellt.
Nach dem Kühlen des Mediums auf unterhalb 400C wird das nach der obigen Vorschrift hergestellte Impf-
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- 10heftig gerührt und belüftet. Ein steriler Zusatz von weiteren etwa 60 kg Zuckerrübenmelasse und 3 - 5 kg
Diammoniumphosphat in gewissen Zeitabständen. die zwischen 1 und 4 Tagen der Fermentationsdauer schwanken, bewirkt gewöhnlich ein stärkeres Wachstum je Raumeinheit, wodurch erhebliche Ersparnisse erzielt werden. Sobald der Ansatz eine ausreichende Dichte des vegetativen Wachstums erreicht hat, wird die Zellsubstanz auf an sich bekannte Weise geerntet.
Beispiel 11: Zellen von Pseudomonas denitrificans, die durch Fermentation in grosstechnischem
Massstabe gewonnen worden waren, wurden von der ganzen Brühe abzentrifugiert. Insgesamt wurden
275 g feuchte Zellsubstanz erhalten, was 75 g Trockengewicht entspricht. Der feuchte Kuchen wurde mit
25 g Pyrogallol, 400 cm3 Äthanol (2% Benzol, absolut) und 100 g Kaliumhydroxyd in einem 11-Kolben gemischt, und das Gemisch wurde 1 h am Rückflusskühler gekocht, 1/2 h im Eisbad gekühlt, mit 300 cm3
Wasser verdünnt und dreimal nacheinander mit je 800 cm3 einer leichten Erdölfraktion, wie"Skelly- solve B", extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zweimal mit je 300 cm3 Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert.
Beim Einengen des Filtrates durch Abdampfen des ganzen Lösungsmittels im Vakuum hinterblieb ein orangefarbener Rückstand (760 mg) von rohem öligem
Extrakt, der Coenzym Q-10 enthielt.
Analyse durch Absorptionsdifferenz im Ultraviolett.
Eine kleine Probe des rohen Extraktes (die so gewählt wird, dass sie etwa 1 mg reines Coenzym Q-10 enthält) wird in reinem Äthanol gelöst. (Hiezu sind 25 cm3 zweckmässig.) 10 cm3 der Lösung werden mit einem Überschuss (10 - 20 mg) an festem Natriumborhydrid versetzt. Nach gründlichem Rühren im Ver- laufe von 1 min ist die Reduktion beendet, und die suspendierten Feststoffe werden abzentrifugiert. Die optische Dichte der überstehenden Lösung der reduzierten Form bei 275 mi wird dann im Spektrophoto- meter, z. B."Beckman Modell DU", bestimmt. Die optische Dichte der unbehandelten Lösung bei
275 mfi wird ebenfalls bestimmt. Aus den so erhaltenen Dichten werden die E%-Werte sowohl für die oxydierte als auch für die reduzierte Form berechnet.
Die Differenz in E% ist für reines Coenzym Q-10 ungefähr 140, wenn die Messungen bei 275 mli ausgeführt werden. Multipliziert man die für die unbe-
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soCoenzym Q-10.
Bei Anwendung dieser Methode auf das nach dem obigen Verfahren erhaltene rohe Öl ergab sich eine Absorptionsdifferenz entsprechend einem Gehalt von 134 mg Coenzym Q-10.
Chromatographie an Aluminiumsilikaten als Adsorptionsmittel.
Eine Lösung von 680 mg des orangefarbigen öligen Rückstandes in 10 cm3 einer leichten Erdölfraktion (Skelly-solve B) wurde auf eine chromatographischesäule von llgAluminiumsilikat (Florisil, Korngrösse 0, 149-0, 250 mm) gegossen, die sich in Skelly-solve B in einem Rohr von 1 cm Durchmesser befand. Nachdem die Lösung in die Säule hineingelaufen war, wurde zunächst weiter mit Skelly-solve B und dann mit Gemischen von Diäthyläther und Skelly-solve B eluiert.
Die hiebei gewonnenen Fraktionen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt :
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Volumen <SEP> der <SEP> Entwicklungslösungsmittel <SEP> Farbe
<tb> Fraktion <SEP> in <SEP> cm3
<tb> 1 <SEP> 125 <SEP> 125 <SEP> cm3 <SEP> Skelly-solve <SEP> B <SEP> farblos <SEP>
<tb> 2-100 <SEP> 100 <SEP> cm3 <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> + <SEP> blassgelb
<tb> 95% <SEP> Skelly-solve <SEP> B
<tb> 3 <SEP> 80 <SEP> 100 <SEP> cm3 <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> + <SEP> orange
<tb> 500/0 <SEP> Skelly-solve <SEP> B
<tb>
Alle Fraktionen wurden gesondert eingedampft und hinterliessen ölige Rückstände. Fraktion 3 enthielt das Coenzym Q-10. Eine Bestimmung nach der Methode der Absorptionsdifferenz im Ultraviolett ergab die Anwesenheit von 134 mg Coenzym Q-10 in dieser Fraktion.
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Von dem Rückstand der oben beschriebenen Fraktion 3 wurde eine Lösung in 3 cm Skelly-solve B hergestellt. Diese wurde in eine Adsorptionskolonne, bestehend aus 1, 5 g eines Aluminiumsilikates (De- calso, Korngrösse 0, 297 mm und feiner) in einem 0, 5 cm weiten Rohr in Skelly-solve B eingegossen.
Die
Adsorptionskolonne wurde mit Skelly-solve B und Gemischen von Äther und Skelly-solve B in der folgenden Weise eluiert :
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<tb>
<tb> Entwicklungslösungsmittel <SEP> Fraktion <SEP> Farbe
<tb> Nr. <SEP> Vol., <SEP> cm3
<tb> 45 <SEP> cm <SEP> Skelly-solve <SEP> B <SEP> 1 <SEP> 15 <SEP> farblos
<tb> 40 <SEP> cm <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> + <SEP>
<tb> 95% <SEP> Skelly-solve <SEP> B <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> orange
<tb> 40 <SEP> cm <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> +
<tb> 95% <SEP> Skelly-solve <SEP> B <SEP> 3 <SEP> 40 <SEP> blassgelb
<tb> 40 <SEP> cm <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> +
<tb> 95% <SEP> Skelly-solve <SEP> B <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> farblos
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