AT400640B - Verfahren zum nachweis eines antikörpers - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein verfahren zum Nachweis eines in einer Probe enthaltenen Antikörpers durch Bindung des nachzuweisenden Antikörpers an ein bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen.
Verfahren der eingangs genannten Art werden als Immuntests bezeichnet und sind im besonderen als 5 Serumtests bekannt, bei welchen immobilisierte Antigene nach einem Blocken mit dem Serum, in welchem Antikörper nachgewiesen werden sollen, in Kontakt gebracht werden. Ein bekannter Test, welcher unter die Gruppen der sogenannten "Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) fällt, ist hiebei beispielsweise für den Nachweis einer HlV-lnfektion entwickelt worden. Analoge Tests sind naturgemäß auch für andere virale Infektionen bereits bekannt, wobei jeweils der gegen den Virus gebildete Antikörper durch eine 10 Antikörper-Antigen-Reaktionnachgewiesen werden soll. Im bekannten Fall wird hiebei auf eine Mikrotiterplatte immobilisiertes HIV-Antigen aufgebracht, worauf ein erstmaliges Waschen erfolgt. Nach einem Blocking mit Rinderserumalbumin wird ein Patientenserum aufgetragen, worauf nach einer längeren Inkubationszeit eine Bindung der gegen den Virus gebildeten Antikörper am Antigen erfolgt. In der Folge ist wiederum ein Waschen erforderlich, worauf die erfolgte Antikörper-Antigen-Reaktion durch geeignete Mittel sichtbar 15 gemacht werden muß. Zu diesem Zweck werden bei dem bekannten Test durch einen zweiten Antikörper oder ein weiteres Antigen, welche selbst wiederum enzymmarkiert sind, die am immobilisierten Antigen gebundenen Antikörper detektiert, wobei das Enzym gleichzeitig ais Marker und als Signalverstärker wirksam wird. Bei diesen bekannten HIV-Tests erfolgt die im wesentlichen gleiche Antigen-Antikörper-Reaktion zweifach, sodaß eine Fehireaktion statistisch entsprechend doppelt auftreten kann. Ein bedeuten-20 des Problem derartiger Tests ist immer ein hoher Anteil sogenannter "falsch positiv" Reaktionen, bei welchen das Vorliegen einer Infektion angezeigt wird, obwohl eine Infektion nicht vorliegt. Derartige "falsch positiv" Reaktionen können zahllose Gründe haben, wobei üblicherweise unspezifische Bindungen, wie sie auch von anderen Antikörpern mit Antigenen bei ansprechend-hoher Konzentration auftreten können, für derartige "falsch positiv" Resultate verantwortlich gemacht werden. 25 Die bekannten, unter die Gruppe der Immunassays mit enzymmarkierten Antikörpern zu subsumierenden Tests haben eine relativ hohe Spezifität. Insbesondere für kritische Tests, bei welchen eine überaus große Nachweisempfindlichkeit und ein frühzeitiges Erkennen von Antikörpern gefordert wird, versagen bekannte Tests häufig sowohl durch "falsch positiv" Reaktionen als auch an der geforderten Empfindlichkeit, da überaus kleine Konzentrationen von Antikörpern nicht zuverlässig detektiert werden können. 30 Die Erfindung zielt nun darauf ab, Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß bei verbesserter Nachweisempfindlichkeit gleichzeitig die Anzahl der "falsch positiven" Resultate reduziert wird. Zur Lösung dieser Aufgabe besteht das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen darin, daß man die Probe in einem Reaktionsgemisch, welches mehr als 4 ug/ml eines enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Proteins oder eines enzymkonjugierten Fc 35 erkennenden Antikörpers enthalt, inkubiert und das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Protein oder das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem Fc erkennenden Antikörper an ein oberflächengebundenes bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen bindet, wobei die Reaktionen zwischen dem enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenz-40 enthaltenden Protein und dem Probenantikörper oder dem enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörper und dem Probenantikörper sowie dem bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifischen Antigen gleichzeitig oder in unmittelbarer Abfolge erfolgt. Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, daß bei gegenüber bekannten Verfahren wesentlich höheren Konzentrationen, nämlich Konzentrationen mit mehr als 4 ug/ml eines enzymkonjugierten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Proteins bzw. eines 45 enzymkonjugierten das konstante Ende eines Antigens erkennenden Antikörpers die Anzahl der unspezifischen Bindungen und damit die Anzahl der Fehlanzeigen wesentlich herabgesetzt werden kann, wenn gleichzeitig Probe- und enyzmkonjugiertes Markermolekül in Kompetition in relativ hohen Konzentrationen reagieren. Zu diesem Zweck können die Reaktionen gleichzeitig oder überlappend vorgenommen werden, wodurch sich zunächst der triviale Vorteil ergibt, daß ein mehrfaches Waschen entfallen kann. Überraschen-50 derweise und entgegen allen Erwartungen hat sich nun die wesentliche Erhöhung des insgesamt vorliegenden Porteins bzw. enzymkonjugierten Antikörpergehaltes dahingehend ausgewirkt, daß die Spezifität des Tests erhöht wird, daß die Empfindlichkeit gesteigert und daß die Anzahl von "falsch positiv" Reaktionen entsprechend reduziert wird. Eine derartige Verbesserung und Beschleunigung von immunbasierenden Antikörperdetektionssystemen ist insbesondere im Zusammenhang mit HIV-I und HIV-ll-Antikörpem in 55 keiner Weise zu erwarten gewesen, wobei die erfindungsgemäße Vorgangsweise gegenüber bekannten Testverfahren eine bis zu 10-fach verbesserte Empfindlichkeit bei gleichzeitig wesentlicher Verringerung der erforderlichen Inkubationszeit zur Folge hat. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens genügen Inkubationszeiten von weniger als 30 Minuten, wie dies einer bevorzugten Verfahrensweise entspricht.
Claims (11)
- AT 400 640 B wobei diese geringen Inkubationszeiten von inbesondere etwa 15 Minuten bei gleichzeitig erhöhter Spezifität der Tests durchaus als überraschend zu bezeichnen sind. In besonders vorteilhafter Weise wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, daß als Enzym für die Enzymkonjugate Peroxidasen, Phosphatasen oder Lipasen verwendet werden, wobei mit Vorteil als Enzymsubstrate für die Peroxidasen 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonate), Benzidin, Chlomaphtol, 3-Amino-9-ethyl-carbazol, o-Phenylendiamin sowie deren Derivate verwendet werden bzw. als Enzymsubstrate für die Phosphatasen ortho oder para Nitrophenylphosphat, Indolylphosphat sowie deren Derivate bzw. als Enzymsubstrate für die Lipasen ortho oder para Nitrophenylester, Indonesier sowie deren Derivate verwendet werden. Die Reaktionen werden bevorzugt in einem Puffer mit 1 bis 10 % IgG-armem oder IgG-freiem Serum vorgenommen, wobei eine relativ hohe Fremdproteinkonzentration durchaus wünschenswert ist und überraschenderweise die Spezifität erhöht und die Reaktionsgeschwindigkeit nicht wesentlich verringert, in besonders vorteilhafter Weise wird hiebei so vorgegangen, daß die Reaktionen in einem Puffer mit 1 bis 10 % Fremdprotein, wie z.B. Serumalbumin vorgenommen werden. Neben Rinderserumalbumin kann auch foetales Kalbsserum verwendet werden, wobei bevorzugt 2 bis 5 % der entsprechenden Proteine eingesetzt werden. Die Pozentangaben verstehen sich hiebei jeweils im Fall von Rinderserumalbumin als w/v und im Fall von foetalem Kälberserum als v/v %. Mit Vorteil wird die Reaktion in einem Puffer mit nichtionogenen Detergentien in einer Menge von < 2 v/v % vorgenommen. Prinzipiell sind für die Durchführung des Tests als Antigene gentechnisch gewonnene oder veränderte Proteine oder Peptide aus Viren geeignet, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens, entspricht. In besonders vorteilhafter Weise werden als Antigene Proteine, Peptide oder gentechnisch veränderte Proteine aus Bakterienhüllen sowie allergenen Proteinen verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren erfaßt somit in wesentlicher Vereinfachung gegenüber bekannten Verfahrensweise zunächst das übliche Coating einer Titerplatte mit einem Antigen, wobei hier in üblich«· Weise mit 0,1 bis 1 ug Antigen in 50 ul Coatingpuffer alkalisch inkubiert wird. Die Inkubation wird üblicherweise bei 37 ° und 2 bis 3 Stunden vorgenommen. Nach einem Waschen mit einem Dilutionspuffer ohne Protein, wie beispielsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung, erfolgt das Blocking in noch konventioneller Weise mit Rinderserumalbumin und/oder foetalem Kälberserum. Nach einem kurzen waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung erfolgt der einstufige Detektionsschritt, wobei eine Inkubation von 10 Minuten bei Raumtemperatur ausreicht. Die Enzymkonjugate werden gleichzeitig mit den Proben aufgegeben, wodurch die Immunreaktion und die Konjugataddition entsprechend rasch und mit hoher Spezifität ablaufen. Ein bei bekannten Tests hier zwischen der Aufgabe von Proben und Marker erforderlicher Waschschritt entfällt. Offensichtlich erfolgt zunächst eine Markierung aller Antikörper, wobei gleichzeitig oder anschließend die selektive Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft, welche zur Festlegung der markierten und für den Test spezifischen Antikörper führt. Nach dem Auswaschen der Probelösung wird mit dem entsprechenden Enzymsubstrat 5 bis 10 Minuten bis zur Farbentwicklung inkubiert. Patentansprüche 1. Verfahren zum Nachweis eines in einer Probe enthaltenen Antikörpers durch Bindung des nachzuweisenden Antikörpers an ein bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe in einem Reaktionsgemisch, welches mehr als 4 ug/ml eines enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Proteins oder eines enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörpers enthalt, inkubiert und das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Protein oder das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem Fc erkennenden Antikörper an ein oberflächengebundenes bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen bindet, wobei die Reaktionen zwischen dem enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Protein und dem Probenantikörper oder dem enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörper und dem Probenantikörper sowie dem bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifischen Antigen gleichzeitig oder in unmittelbarer Abfolge erfolgen.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß als Enzym für die Enzymkonjugate Peroxidasen, Phosphatasen oder Lipasen verwendet werden. 3 AT 400 640 B
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate für die Peroxidasen 2,2’-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsuIfonate), Benzidin, Chlornaphtol, 3-Amino-9-ethyl-car-bazol, o-Phenylendiamin sowie deren Derivate verwendet werden.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate für die Phosphatasen ortho oder para Nitrophenylphosphat, Indolylphosphat sowie deren Derivate verwendet werden.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate für die Lipasen ortho oder para Nitrophenylester, Indonesier sowie deren Derivate verwendet werden.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit weniger als 30 Minuten beträgt.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen in einem Puffer mit 1 bis 10 % IgG-armem oder IgG-freiem Serum vorgenommen werden.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet daß die Reaktionen in einem Puffer mit 1 bis 10 % Fremdprotein, wie z.B. Serumalbumin vorgenommen werden.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen in einem Puffer mit nichtionogenen Detergentien in einer Menge von < 2 Gew% vorgenommen werden.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigene gentechnisch gewonnene oder veränderte Proteine oder Peptide aus Viren verwendet werden.
- 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet daß als Antigene Proteine, Peptide oder gentechnisch veränderte Proteine aus Bakterienhüllen sowie allergenen Proteinen verwendet werden. . 4
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