AT404360B

AT404360B - Verfahren zur herstellung von z-l-asparaginsäure-dinatriumsalz aus fumarsäure

Info

Publication number: AT404360B
Application number: AT27297A
Authority: AT
Original assignee: Chemie Linz Gmbh
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 1998-11-25
Also published as: ATA27297A

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 



   Für die Synthese von Aspartam wurden bereits eine Vielzahl von chemischen und enzymatischen Verfahren beschrieben, bei weichen vor allem L-Asparaginsäure und   Phenylalaninmethylester   auf unter-   schiedlichste Weisen,   etwa mit oder ohne enzymatischer Katalyse, miteinander gekoppelt werden. Dabei wird beispielsweise von fester Asparaginsäure ausgegangen, die nach Umwandlung in das Dinatriumsalz mit   Benzyloxycarbonylchlond (Z-CI)   in wässriger Lösung zu   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   umgesetzt wird. Asparaginsäure wird dabei, wie beispielsweise in   EP-A-O   127 940 beschneben, aus Maleinsäure, die zur Fumarsäure isomerisiert wird, auf enzymatischem Wege über das Ammonium-L-Aspartat und anschliei- ssender Kristallisation in Gegenwart einer Säure hergestellt.

   Dabei fallen in der Mutterlauge äquimolare Mengen an Ammoniumsalzen an, die entsprechend entsorgt werden müssen. Weiters ist eine Vielzahl von Schritten erforderlich, um   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   zu erhalten. 



   Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zu finden, bei weichem die Ammoniumionen-hältigen Abwasser vermieden und die Anzahl der Schritte zum   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   reduziert wird. 



   Unerwarteterweise konnte diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst werden, bei welchem, ausgehend von Fumarsäure, Ammonium-L-Aspartat direkt in das Dinatriumsalz der L-Asparaginsäure bei gleichzeitiger quantitativer Rückführung des Ammoniaks überführt wird. 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Z-L-Asparagin-   säure-Dinatriumsalz   aus Fumarsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) Fumarsäure in einem inerten Verdünnungsmittel in Gegenwart von Aspartase oder Aspartase- produzierenden Mikroorganismen mit Ammoniak zu Ammonium-L-Aspartat umgesetzt, anschliessend b) die Ammonium-L-Aspartat hältige Lösung mit Natriumhydroxid versetzt wird, wobei sich je nach eingesetzter Menge an Natriumhydroxid das Mono- oder Dinatrium-L-Aspartat oder ein Gemisch davon bildet und c) der sich abspaltende Ammoniak in eine Fumarsäuresuspension, die als Ausgangslösung für weitere enzymatische Umsetzungen verwendet wird, rückgeführt wird, worauf d)

   die verbleibende Natrium-L-Aspartat hältige Lösung mit Benzyloxycarbonylchlorid bei einem pH-Wert zwischen 9 und 14 bei gleichzeitiger Zugabe von Natriumhydroxid reagieren gelassen wird, sodass sich   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   bildet. 



   Im ersten Schritt a) des erfindungsgemässen Verfahrens wird Fumarsäure in einer enzymatischen Reaktion zu Ammonium-L-Aspartat umgesetzt. 



  Das Ausgangsprodukt für das erfindungsgemässe Verfahren, die Fumarsäure kann beispielsweise durch Isomerisierung von   Maleinsäure   hergestellt werden. 



   Für die enzymatische Reaktion wird Fumarsäure bis zur Löslichkeitsgrenze in ein inertes Verdünnungsmittel eingerührt, sodass eine Suspension erhalten wird. Als inerte Verdünnungsmittel eignen sich Wasser,   Wasser/Ethanol- oder   Wasser/Aceton Gemische und dergleichen. 



  Bevorzugt wird Wasser eingesetzt. In die Fumarsäure-Suspension wird sodann bei Raumtemperatur Ammoniak verflüssigt oder in Form einer 10 bis 35 Gew. %igen Lösung eingeleitet, wodurch sich die Temperatur bis zu   60. C   erhöht und ein pH-Wert zwischen 8 und 9 einstellt. 



  Bevorzugt wird eine wässrige 20 bis 30 Gew.   %ige Ammoniaklösung verwendet. In   das so erhaltene System, vorzugsweise eine Lösung, wird sodann bei 20 bis 60   C,   bevorzugt bei 30 bis 50 C, das Enzym Aspartase oder ein Aspartaseproduzierender Mikroorganismus eingerührt. Bei dieser Zugabe an Enzymbzw. Aspartase-produzierenden Mikroorganismus ist es von Vorteil, wenn durch die Ammoniakzugabe eine Lösung erhalten wird, da im Falle einer Suspension durch Adsorption des Enzyms und dadurch bedingten   Aktivitätsverlust   mehr Enzym erforderlich ist. Für einen fast quantitativen Umsatz nach bis zu 24 bis 30 Stunden sind dabei 30 bis 50   IU     (Enzymaktivität)   pro Mol Fumarsäure erforderlich.

   Aspartase-produzierende Mikroorganismen sind beispielsweise Pseudomonas fluorescens, Protens vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Serratia   marcescens,   Bacterium succinium, Bacillus subtilis, Aerobacter aerogenes, Micrococcus sp. 



  Escherichia coli u. a. 



  Weitere geeignete Aspartase-produzierende Mikroorganismen sind beispielsweise in US 3. 791, 926 und US   3, 198. 712   beschrieben. 



  Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann weiters gereinigte oder synthetische Aspartase eingesetzt werden. Das Enzym bzw. der Aspartaseproduzierende Mikroorganismus kann in flüssiger oder in immobilisierter Form. wie beispielsweise in EP 0   127 940   beschrieben, zugesetzt werden. 



  Nach vollendeter Reaktion, das Reaktionsende kann beispielsweise photometrisch ermittelt werden, wird die das Ammonium-L-Aspartat enthaltende Lösung bevorzugt auf 20 bis   30. C abgekühlt   und im 2. Schritt (b) mit Natriumhydroxid versetzt. Die Menge an zugesetztem Natriumhydroxid ist dabei abhängig vom 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 gewünschten   Natnumsalz.   Für die Weiterreaktion eignen sich dabei sowohl das   Mononatrium- und   das Dinatriumsalz als auch Gemische davon. Natriumhydroxid kann dabei in fester Form, oder als Natronlauge eingesetzt werden. Bevorzugt wird Natronlauge eingesetzt. Die Reaktionslösung erwärmt sich dabei auf etwa 40 bis   60.

   C.   Der sich abspaltende und entweichende Ammoniak wird beispielsweise in einem weiteren Reaktionsgefäss mittels Tauchrohr in eine Fumarsäuresuspension, die nach weiterer Zugabe von Ammoniak wieder als Ausgangslösung für die nächste enzymatische Umsetzung verwendet werden kann, eingeleitet. (Schritt c) Um den Ammoniak aus der Reaktionslösung zu entfernen, wird eine Temperatur zwischen etwa 50 und   100. C eingestellt   und bei Normaldruck bis zu einem Druck von 80 bis 120 mbar die Hauptmenge des Ammoniaks ausgetrieben. 



  Nach etwa 0, 5 bis 10 Stunden wird gegebenenfalls bei einem Vakuum von 200 bis 300 mbar Stickstoff durch die Reaktionslösung geblasen und eine Temperatur von 55 bis 65 C gehalten. sodass auch die Restmenge an Ammoniak entfernt wird. 



  Die so erhaltene Natrium-L-Aspartat-Lösung wird sodann im nächsten Schritt d) bei einer Temperatur von 30 bis 60'C mit Benzyloxycarbonylchlorid   (Z-Ct)   versetzt, wobei durch gleichzeitiges Zutropfen von Natronlauge ein pH-Wert zwischen 9 und 14, bevorzugt zwischen 11 und 12, gehalten wird.   Z-CI   kann dabei in einer äquimolaren Menge, aber auch in leichtem Überschuss zugesetzt werden. Nach der Z-CI Zugabe wird das Reaktionsgemisch noch 0, 5 bis 4 Stunden bei der Reaktionstemperatur stehen gelassen und anschliessend auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf es zu einer Phasentrennung kommt. 



   Die wässrige Phase wird sodann gewaschen, beispielsweise mit   Methyl-tertbutylether,   Diisobutylether, Toluol oder anderen mit Wasser nicht-mischbaren Lösungsmitteln. 



  Die organische Phase wird verworfen und Z-L-Asparaginsäure als Dinatriumsalz in wässriger Lösung erhalten. Zur Entfernung von eventuellen Restmengen an organischen Lösungsmitteln in der wässrigen Phase, wird bei Raumtemperatur ein Vakuum angelegt. 



  Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   als klare, leicht gelbliche Lösung erhalten, die bei Bedarf für die Weiterverarbeitung zu Aspartam. mittels Kopplung mit Phenylalanin, verwendet werden kann. Durch das erfindungsgemässe Verfahren werden Ammoniumionen-hältige Abwässer vermieden und Ammoniak quantitativ für weitere enzymatische Umsetzungen von Fumarsäure rückgeführt. 



  Weiters ist es bei dem   erfindungsgemässen   Verfahren nicht erforderlich, L-Asparaginsäure oder eines der Zwischenprodukte zu isolieren. 



  Beispiel 1 a) Enzymatische Umsetzung 
 EMI2.1 
 
38Mol) eingerührt. In die Fumarsäuresuspension wurden anschliessend 1450 ml 25 Gew. %ige AmmoniakLösung (1314 g) während 30 Minuten eingebracht. Dabei wurde eine Reaktionstemperatur von   45-50* C   und ein pH-Wert von 8, 5 erreicht. Bei   45 *C   und unter leichtem Rühren wurden In die klare Lösung   1. 4 mut   Aspartase Lösung (245   lU/ml)   eingebracht. Danach wurde die Rührung ausgeschaltet und die   Reaktionsiö-   sung bei   45*C gehalten.   Der Reaktionsverlauf wurde photometrisch verfolgt. Eine nahezu quantitative Umsetzung ( > 99 %) wurde nach 25, 5 Stunden erreicht. b) und c) Austreiben von Ammoniak 
In die gemäss a) erhaltene Lösung wurde nach Abkühlen auf   25.

   C   1330 g 50 Gew. %ige Natronlauge innerhalb von 15 Minuten eingebracht. Dabei erwärmte sich die Lösung auf   50. C.   Es wurde ein pH-Wert von 11, 5 gemessen. Der entweichende Ammoniak wurde in eine Fumarsäuresuspension mittels Tauchrohr eingeleitet (Fumarsäure/Ammoniak Waschlösung). Die Wassermenge und Fumarsäuremenge waren dieselben, wie in a) angeführt. Durch Erwärmen auf   57'C   und Anlegen eines Vakuums von 100 mbar wurde die Hauptmenge des Ammoniaks ausgetrieben. Nach 6 Stunden wurde Stickstoff durch die Reaktionslösung geblasen (20 I/Std.). Die Temperatur wurde dabei auf   60. C   erhöht und ein Vakuum von 240 mbar eingestellt (Dauer 4, 5 Stunden). Die Gesamtmenge an Destillat betrug ungefähr 1100 g. Restammoniakgehalt < 100 ppm. 



   Es wurde eine Dinatrium-L-Aspartat-Lösung mit einem Gehalt von 23, 5 Gew. % an L-Asparaginsäure erhalten. Dabei konnte keine Racemisierung beobachtet werden. 



  Der Gehalt an Fumarsäure   betrug < 0, 1   Gew. %, Äpfelsäure und Asparagin konnte nicht nachgewiesen werden. 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 d) Herstellung von Dinatrium   Z- (L)-aspartat  
Es wurden 80 ml einer analog Beispiel la-c) hergestellten Dinatrium L-Aspartat Lösung mit 18, 1 Gew. 
 EMI3.1 
 annd   (Z-CI)     (Gehalt : 92, 5   nach GC) (0, 11 Mol) während 1 Stunde zugetropft. Gleichzeitig wurde durch Zutropfen von 50 Gew. %ige Natronlauge der pH-Wert zwischen 10, 9 und   13, 8 gehalten. Insgesamt   wurden dabei 7, 8 g 50 Gew. %ige Natronlauge zugegeben. Nach dem Zutropfen wurde die   Reaktionslösung   für 2, 5 Stunden bel   45 - 47. C gehalten.   Der pH-Wert betrug konstant 12, 1. Nach dem Abkühlen auf   25.

   C   wurde die wässrige Lösung 2 mal mit jeweils 92 ml Methyl-tert- butylether behandelt. Die organische Phase wurde verworfen ; die   wässrige   Phase wurde 30 Minuten bei   20 *   C und 20 mbar im Rotavapor von Lösungsmittelresten befreit. 



  Es wurden 101 g einer leicht gelblichen, klaren Lösung erhalten. Der Gehalt betrug 30, 8 Gew. % DinatriumZ- (L)-Aspartat. 



  Beispiel 2 Herstellung von   Mononatrlum-L-Aspartatlösung   
Analog Beispiel 1 b) und c) wurde in 1300 ml einer gemäss   la)   erhaltenen Lösung nach Abkühlen auf   25. C   588 g 20 Gew. % ige Natronlauge innerhalb von 15 Minuten eingebracht. Dabei erwärmte sich die Lösung auf   50..   Der entweichende Ammoniak wurde in eine Fumarsäuresuspension mittels Tauchrohr eingeleitet (Fumarsäure/Ammoniak   Waschlösung).   Die Wassermenge und Fumarsäuremenge waren dieselben, wie in a) angeführt. Bei Normaldruck wurde die Gesamtmenge des Ammoniaks ausgetrieben und die Reaktionslösung auf 1200 ml eingeengt. Restammoniakgehalt < 300 ppm. 



   Es wurde eine Mononatrium-L-Aspartat-Lösung mit einem Gehalt von 25. 9 Gew. % an L-Asparaginsäure erhalten. Dabei konnte keine Racemisierung beobachtet werden. 



   Der Gehalt an Fumarsäure   betrug < 0, 1   Gew. %, Äpfelsäure und Asparagin konnte nicht nachgewiesen werden. 



   Die Lösung wurde analog Bsp. 1 d zu Dinatrium   Z-     (L)-aspartatweiterverarteitet.   



  Beispiel 3 Herstellung von Dinatrium   Z- (L)-Aspartat   mit einem   ÜberschuB   von Z-Ci 
Es wurden 64, 2 ml einer Dinatrium-L-Aspartat Lösung mit 18, 1 Gew. % L-Asparaginsäure (0, 09 Mol), hergestellt analog Beispiel 1 a-c, auf   45. C   erwärmt. Unter Rühren wurden 17, 7 g Benzyloxycarbonylchlorid (Z-CI,   Gehalt : 92, 5   nach   GC)   (0, 10 Mol) während 1 Stunde zugetropft. Gleichzeitig wurde durch Zutropfen von 50   Gew. %ige Natronlauge   der pH Wert zwischen 9, 4 und   11, 8 gehalten. Insgesamt   wurden dabei 8. 8 g 50 Gew. %ige Natronlauge zugegeben. Nach dem Zutropfen wurde die Reaktionslösung für 2, 5 Stunden bei   45. C gehalten.   Der pH-Wert betrug konstant 11, 3.

   Nach dem Abkühlen auf 25 * C wurde die wässrige Lösung 2 mal mit jeweils 46 ml   Methyl-tert-butylether   behandelt. Die organische Phase wurde verworfen ; die wässrige Phase wurde 30 Minuten bei   20   C und 20 mbar im Rotavapor von Lösungsmittelresten befreit. 



   Es wurden 84, 2 g einer leicht gelblichen, klaren Lösung erhalten. Der Gehalt betrug 31, 4 Gew. %   Dinatrium-Z- (L)-Aspartat.    



  Beispiel 4 : Enzymatische Umsetzung der Fumarsäure/Ammoniak-Waschlösung 
Die gemäss Beispiel 1 a-c erhaltene Fumarsäure/Ammoniak   Waschlösung   wurde nach abgeschlossenem Versuch mit 514 g 25 Gew. % Ammoniak auf pH 8, 5 gestellt und analog Beispiel 1 a-c zu Dinatrium-LAspartat-Lösung weiterverarbeitet. 



  Die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 ersichtlich. 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
 EMI4.1 
 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Versuch <SEP> 1. <SEP> 2. <SEP> 3. <SEP> 4. <SEP> 5.
<tb> 



  Wasser <SEP> (mi) <SEP> 2070 <SEP> 2000 <SEP> 2423 <SEP> 2450 <SEP> 2100
<tb> Fumarsäure <SEP> (g) <SEP> 973 <SEP> 973 <SEP> 973 <SEP> 973 <SEP> 973
<tb> Ammoniak <SEP> (g) <SEP> 1314 <SEP> 514 <SEP> 752 <SEP> 570 <SEP> 643
<tb> pH-Wert <SEP> bel <SEP> 45 <SEP> C <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 8. <SEP> 18 <SEP> 8, <SEP> 48 <SEP> 8, <SEP> 48 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Enzym-Lsg <SEP> (mi) <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Dauer <SEP> (h) <SEP> 25, <SEP> 5 <SEP> 24 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 28
<tb> Umsatz <SEP> (%) <SEP> > 99 <SEP> > 99 <SEP> > 99 <SEP> 98, <SEP> 6 <SEP> > 99
<tb> 50% <SEP> NaOH <SEP> (g) <SEP> 1330 <SEP> 1229 <SEP> 1316 <SEP> 1333 <SEP> 1312
<tb> pH-Wert <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 11, <SEP> 9 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 11, <SEP> 9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> T <SEP> max <SEP> (-C)

   <SEP> 57 <SEP> 51 <SEP> 53 <SEP> 66 <SEP> 59
<tb> Vakuum <SEP> (mbar) <SEP> 100 <SEP> 174 <SEP> 120 <SEP> 200 <SEP> 170
<tb> Dauer <SEP> (h) <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 2. <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 75 <SEP> 
<tb> N2 <SEP> Purge <SEP> I/h <SEP> 20 <SEP> 35 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30
<tb> Temp. <SEP> ('C) <SEP> 61 <SEP> 60 <SEP> 59 <SEP> 70 <SEP> 63
<tb> Vakuum <SEP> (mbar) <SEP> 240 <SEP> 300 <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> 210
<tb> Dauer <SEP> (h) <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Gehalt <SEP> (%L-Asp) <SEP> 23,5 <SEP> 18,2 <SEP> 21,4 <SEP> 22,6 <SEP> 20,7 <SEP> 
<tb> 
 
Die so erhaltenen Dinatrium-L-Aspartat-Lösungen wurden analog Beispiel 1d und Beispiel 3 zu Z-L-   Asparaginsäure-Dlnatnumsalz   umgesetzt.

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz aus Fumarsäure, dadurch gekenn- zeichnet, dass a) Fumarsäure in einem inerten Verdünnungsmittel in Gegenwart von Aspartase oder Aspartase- produzierenden Mikroorganismen mit Ammoniak zu Ammonium-L-Aspartat umgesetzt, anschliessend b) die Ammonium-L-Aspartat hältige Lösung mit Natriumhydroxid versetzt wird, wobei sich je nach eingesetzter Menge an Natriumhydroxid das Mono- oder Dinatnum-L-Aspartat oder ein Gemisch davon bildet und c) der sich abspaltende Ammoniak in eine Fumarsäuresuspension, die als Ausgangslösung für weitere enzymatische Umsetzungen verwendet wird, rückgeführt wird, worauf d) die verbleibende Natrium-L-Aspartat hältige Lösung mit Benzyloxycarbonylchlorid bel einem pH- Wert zwischen 9 und 14 bei gleichzeitiger Zugabe von Natriumhydroxid reagieren gelassen wird, sodass sich Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als inertes Verdünnungsmittel Wasser, Wasser/Ethanol oder Wasser/Aceton Gemische verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ammoniak verflüssigt oder in Form einer wässrigen 10 bis 35 Gew. %igen Lösung eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, dass Fumarsäure in Gegenwart von 30 bis 50 IU (Enzymaktivität) pro Mol Fumarsäure umgesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der sich abspaltende Ammoniak bei Normaldruck bis zu einem Vakuum von 80 bis 120 mbar bei 50 bis 100'C und gegebenenfalls anschliessendem Einblasen von Stickstoff bei 200 bis 300 mbar und 55 bis 65'C vollständig aus der Reaktionslösung entfernt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion von Benzyloxycarbonylchlo- rid mit der Natrium-L-Aspartat hältigen Lösung bei einem pH-Wert zwischen 11 und 12 durchgeführt wird. <Desc/Clms Page number 5>
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Natrium-L-Aspartat hältige Lösung bei 30 bis 60. C mit Benzyloxycarbonylchlorid versetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an die Reaktion von Natrium- L-Aspartat und Benzyloxycarbonylchlorid, nach erfolgter Phasentrennung, die wässrige Phase mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gewaschen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als mit Wasser nicht mischbares Lösungs- mittel Methyl-tert-butylether, Diisopropylether oder Toluol verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die das Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz enthaltende wässrige Phase zur Weiterverarbeitung zu Aspartam mittels Kopplung mit Phenylalanin verwendet wird.