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Die Erfindung betnfft einen molekularbiologischen Test-Kit für den Nachweis der bakteriellen Gene SLT1, SLT2 und rfbE.
Enterohaemorrhagische Stämme von Escherichia coli (EHEC), vor allem des Serotyps 0157:H7, haben als Lebensmittelpathogene in den letzten Jahren hauptsächlich in den USA, aber auch in einigen anderen Ländern durch die Verursachung von sporadischen, aber oft dramatischen und seit 1993 immer häufiger auftretenden Ausbrüchen von Erkrankungen für Aufmerksamkeit gesorgt. Infektionen traten vor allem durch den Verzehr von nicht vollständig durchgebratenem Fleisch (Hamburger), aber auch durch den Konsum von Rohmilch, Joghurt, Mettwurst, Apfel-Cider, Salat, Gemüse oder Keimlingen auf. Weitere Gefahrenquellen stellen mangelnde Hygiene mit Übertragung von Person zu Person sowie Trink- und Gebrauchswasser dar (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype 0157:H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2) : 47-52).
Die Symptome einer Infektion mit enterohämorrhagischen E. coli reichen von wässriger über blutige Diarrhoe bis zu Schädigungen der Niere wie dem Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), das unter Umständen zum Tode führen kann (Griffin, PM, and Tauxe, RV (1991) : The Epidemiology of Infections Caused by Escherichia coli 0157:H7, Other Enterohemorrhagic E. coli, and the Associated Hemolytic Uremic Syndrome. Epidemiol Rev 13 : Besonders gefährdet sind naturgemäss Kinder, alte Menschen und Menschen mit Immunschwäche.
Der Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli erfolgt in der Regel mittels klassischer mikro- biologischer, biochemischer und serologischer Methoden (Ausstrich auf Platte, biochemische Charakterisierung, Agglutinationstests, Enzyme-Linked Immonosorbent Assay - ELISA) und Metho- den der Zellkultur (z. B. Toxintest mit Verozellen), in letzter Zeit wird aber auch der Nachweis mittels modernerer molekularbiologischer oder immunologischer Verfahren immer wichtiger (Paton, AW, and Paton, JC (1998) : Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2' eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb0111, and rfb0157- J Clin Microbiol 36 (2) : 598-602 ; Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999) : Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR.
J Appl Micro- biol 87 : 867-876 ; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000) : A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli 0157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8) : 1032-1037 ; Ohiso, I, et al. (2000) : A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81 : 15-25 ; Zhang, P, et al. (2000) : Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282 : Stokes, DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001):Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369: 295-301).
Chemical Abstract 134: 306102x berichtet über PCR-Testsysteme zum Nachweis von entero- hämorrhagischen E. coli - Genen mittels spezifischer Primer, deren Nukleotidsequenzen eng mit den die Schlüsselfaktoren der E. coli - Pathogenizität steuernden Genen, wie SLT1, SLT2, rfbE, verbunden sind.
Die DE 198 14 828 A beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, wobei mit Hilfe zweier Primer Amplifikate eines Teilstücks der Nukleinsäure hergestellt, diese mit einer Sonde hybridisiert und die resultierenden Hybride nachgewiesen werden.
Da enterohämorrhagische E. coli - Stämme einige genetische Besonderheiten aufweisen, die sie von nicht-pathogenen E. coli - Stämmen unterscheiden, können sie durch den Einsatz moleku- larbiologischer Verfahren, die diese Unterschiede nutzen, spezifisch detektiert werden. Die wich- tigsten für EHEC typischen Gene sind die Toxingene SLT1 und SLT2, sowie deren Varianten.
Deren Genprodukte sind zu einem grossen Teil für die Symptome einer Infektion mit EHEC verant- wortlich. Ein weiteres wichtiges Gen für einen Pathogenitätsfaktor von EHEC ist das eae-Gen. Da die allermeisten Epidemien von EHEC-Stämmen des Serotyps 0157:H7 ausgelöst werden, ist der Nachweis dieses Typs besonders wichtig. Gene, die charakteristisch für diesen Serotyp sind, sind beispielsweise die Gene rfbE, ein Gen aus dem Biosyntheseweg des 0157-Antigens, und fliC, das Gen für das H7-Antigen. Zumindest die beiden Gene für die Toxine SLT1 und SLT2 und das 0157-spezifische Gen rfbE sind wichtig für einen Test zur Routineuntersuchung von Lebensmit- teln, um die gefährlichen Krankheitserreger eindeutig als EHEC zu erkennen.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein Testinstrument bereitzustellen, mit welchem die drei
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für einen Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli - Stämmen bzw. des Serotyps 0157:H7 von E. coli - Stämmen erforderlichen Gene ohne grösseren apparativen und zeitlichen Aufwand in einer einzigen Reaktion detektiert werden können. Insbesondere soll dabei die Ver- wendung mutagener oder giftiger Substanzen vermieden werden. Es soll somit ein verlässliches Werkzeug für die Routineanalytik in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln aber auch zur Cha- rakterisierung von aus beliebigen Quellen isolierten unbekannten E. coli - Stämmen zur Verfügung gestellt werden.
Angestrebt wurde ein Testinstrument, das auch einfach ausgestatteten Labors in möglichst kurzer Zeit (1 Arbeitstag) den Nachweis der charakteristischen EHEC-Gene ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch einen Test-Kit für den Nachweis der bakteriellen Gene SLT1, SLT2 und rfbE gelöst, welcher jeweils ein Primerpaar zur Amplifizierung mindestens eines Teils des SLT1-Gens, des SLT2-Gens und des rfbE-Gens in einer einzigen Reaktion und jeweils sowohl ein an einer festen Oberfläche immobilisiertes Oligonucleotid als Fangsonde als auch ein Oligonucleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate enthält.
Verglichen mit konventionellen Methoden (Plattenausstrich u. biochemische bzw. serologische Charakterisierung von Einzelkolonien oder ELISA) bietet der beschriebene molekularbiologische Nachweis von EHEC mittels des erfindungsgemässen Test-Kits wesentliche Vorteile. Da es für EHEC weder ein hundertprozentig verlässliches Selektionsmedium noch einen eindeutigen bioche- mischen Test gibt, ist eine Detektion mittels mikrobiologischer, biochemischer und serologischer Verfahren schwierig. Andere Bakteriengattungen wie Escherichia hermannii oder Hafnia spp. besitzen beispielsweise einen ähnlichen biochemischen Phänotyp wie 0157:H7, bzw. gibt es oft Kreuzreaktionen von Anti-0157-Seren mit anderen Bakterien wie Citrobacter freundii oder Yersinia enterocolitica.
Abgesehen davon sagt das Vorhandensein des 0157 Antigens alleine noch nichts darüber aus, ob es sich um einen pathogenen Organismus handelt (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype 0157:H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2) : 47-52).
Oftmals kann die Diagnostik nur von Speziallabors durchgeführt werden. Kommerzielle ELISA- Tests, die das Genprodukt der SLT-Gene mit Hilfe von Antikörpern detektieren, sind zwar ebenfalls erhältlich, jedoch hängt ein erfolgreicher Nachweis davon ab, ob das entsprechende Genprodukt überhaupt gebildet wird. Weiters sind vor allem von SLT 2 mehrere Varianten bekannt, die sich in ihren antigenen Determinanten unterscheiden und nicht von allen Tests erkannt werden. Existie- rende molekularbiologische oder modernere immunologische Tests wiederum erfordern oft den Umgang mit mutagenen oder giftigen Substanzen wie etwa Ethidiumbromid (Zhang, P, et al.
(2000) : Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282 : die Anschaffung teurer optischer Spezialap- parate (Ohiso, I, et al. (2000) : A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81 : 15-25 ; Stokes, DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001): Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369 : Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D. D. (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol.
67 (7) : 3258-3263) oder sind nicht so sensitiv wie die unten beschriebene Methode mittels des erfindungsgemässen Test-Kits (Paton, AW, and Paton, JC (1998) : Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1' stx2, eaeA, Enterohe- morrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfb0157. J Clin Microbiol 36 (2) : 598-602 ; Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999) : Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR. J Appl Microbiol 87 : 867-876 ; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000) : A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli 0157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8) : 1032-1037 ; Ohiso,I, et al.
(2000) : A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli.
J Biotechnol 81:15-25).
Beispielsweise beschreiben Fratamico et al. (J Food Prot 63 (8) : 1032-1037) eine Multiplex- PCR mit 5 Genen aus EHEC, mit der eine Sensitivität von 1 cfu/g Lebensmittel (Faschiertes) erreicht werden konnte, und zwar bei einer Anreicherungszeit von 12 Stunden, Testung eines einzigen Stammes und Verwendung von Agarosegelelektrophorese anstatt Hybridisierung. Die hier beschriebene Methode kann jedoch 1-10 cfu/25 g unter Verwendung 5 verschiedener Stämme
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nachweisen (allerdings wurden 12 Stunden nach Inokulation keine Proben gezogen, sondern erst nach 15 Stunden) und erfordert gleichzeitig nicht den Umgang mit Agarosegelen bzw. Ethidium- bromid. Ausserdem steigert eine Hybridisierung nicht nur die Sensitivität eines molekularbiologi- schen Tests durch Signalamplifikation bei der Detektion, sondern auch die Spezifität.
Gerade bei Multiplex-PCRs kann es durch die erhöhte Anzahl der verwendeten Primer zu un- spezifischen Reaktionen kommen, die in Gelen zu unspezifischen Banden führen und die Testin- terpretation stark beeinträchtigen können (Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D.
D. (2001):Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7) : 3258- 3263). Die deutsche Norm DIN10134: .Allgemeine verfahrensspezifische Anforderungen zum Nachweis von Mikroorganismen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Lebensmitteln" schreibt beispielsweise vor, dass eine Verifizierung eines PCR-Ergebnisses durch Hybridisierung oder Sequenzierung erfolgen muss.
Die Kombination von Voranreicherung, DNA-Amplifizierung und Detektion durch den erfin- dungsgemässen Test-Kit erlaubt auch standardmässig ausgestatteten Routinelabors, EHEC schnell und sicher nachzuweisen. Lediglich ein Thermocycler und ein Wasserbad sind an zusätzlichen Apparaten notwendig. Wesentlich ist dabei, dass gleichzeitig drei für EHEC typische Gene in einem einzigen Schritt (Multiplex-Verfahren sowohl für Amplifizierung als auch für Hybridisierung) identifi- ziert werden können, wobei diese drei absolut notwendig für die Bewertung einer Probe auf EHEC des Serotyps 0157 sind (SLT1, SLT2, rfbE) und - in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung - das vierte Gen (fliC) weitere Informationen über den Serotyp liefert.
Die DNA- Sequenzen wurden dabei so ausgewählt, dass alle wichtigen Varianten der SLT-Gene und ein bzw. zwei Gene, die den für die meisten Erkrankungen verantwortlichen Serotyp 0157:H7 charakterisie- ren, erkannt werden, auch wenn diese Genprodukte aufgrund der momentanen physiologischen Situation von EHEC in einer Probe zum Zeitpunkt der Probennahme nicht gebildet werden. Somit ist eine verlässliche und sensitive Detektion von enterohämorrhagischen SLT-bildenden Escherichia coli - Stämmen bzw. des E. coli Serotyps 0157:H7, der auch bei Fehlen der SLT-Gene offensicht- lich in seltenen Fällen HUS auslösen kann, relativ einfach und schnell möglich.
Neben dem Nachweis des Serotyps 0157:H7 ist aber auch die Detektion von SLT-Genen mög- lich, die auch in anderen E. coli-Serotypen und sogar in anderen Bakteriengattungen vorkommen und dort die gleiche Erkrankung verursachen können (Paton, AW, and Paton, JC (1996): Entero- bacter cloacae Producing a Shiga-Like Toxin II-Related Cytotoxin Associated with a Case of He- molytic-Uremic Syndrome. J Clin Microbiol 34 (2) : 463-465 ; H, et al. (1995) : Verotoxi- genic Citrobacter freundii associated with severe gastroenteritis and cases of haemolytic uraemic syndrome in a nursery school: green butter as the infection source. Epidemiol Infect 114: 441-450).
Die gemäss der Erfindung erstellbaren Protokolle stellen somit ein sehr wertvolles Werkzeug für die Routineanalytik in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, aber auch zur Charakterisierung von aus beliebigen Quellen isolierten unbekannten E. coli - Stämmen dar.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primer- paar zur Amplifizierung des SLT1-Gens die Nukleotidsequenzen 5'-GCT ATA CCA CGT TAC AGC GTG TTG C-3' und 5'-GCT CTT GCC ACA GAC TGC GTC A-3' aufweist.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des SLT1-Gen-Amplifikats die Nukleo- tidsequenz 5'-TTT TTT TTT TTT TAT CTG CAT CCC CGT ACG ACT GA-3' auf. Die Nucleotidse- quenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3'.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung des SLT2-Gens die Nukleotidsequenzen 5'-TTT CCA TGA CAA CGG ACA GC-3' und 5'-CCA CTG AAC TCC ATT AAC GCC-3' aufweist.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des SLT2-Gen-Amplifikats die Nukleo- tidsequenz 5'-TTT TTT TTT TTT GAC TGA TTT GCA TTC CGG AAC G-3' auf. Die Nucleotidse- quenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-TGC GAC ACG TTG CAG AGT GGT AT-3'.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung des rfbE-Gens die Nukleotidsequenzen 5'-CAC ACT TAT TGG ATG GTC TCA ATT C-3' und 5'-TTT CCG AGT ACA TTG GCA TCG-3' aufweist.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des rfbE-Gen-Amplifikats die Nukleotid- sequenz 5'-TTT TTT TTT TTT ACT GGC CTT GTT TCG ATG AGT TTA T-3' auf. Die Nucleotidse- quenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-CTC TTT CCT CTG CGG TCC TAG TT-3'.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Test-Kit weiters ein Primerpaar zur Amplifizierung mindestens eines Teils des fliC-Gens in derselben Reaktion und sowohl ein an derselben festen Oberfläche immobilisiertes Oligonucleotid als Fangsonde als auch ein Oligonucleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate für den Nachweis des fliC-Gens.
Da dieses für das H7-Antigen des EHEC-Serotyps 0157:H7 charakteristische Gen auch bei Fehlen der SLT-Gene für eine HUS-Erkrankung verantwortlich sein kann, liefert dessen Nachweis eine zusätzliche wertvolle Information in der Lebensmittelqualitätskontrolle.
Bei dieser bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist das Primerpaar zur Amplifizierung des fliC-Gens vorzugsweise die Nukleotidsequenzen 5'-CCA ACA AAG CTG CAA CGG TAA G-3' und 5'-GTG ACT TTA TCG CCA TTC CCT AAT T-3'auf.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des fliC-Gen-Amplifikats die Nukleotidsequenz 5'-TTT TTT TTT TTT CAT AAA GAC CTG TCG TGG TGT TTA A-3' auf. Die Nucleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-TTC GCG CCA GCA GAA GTT AAA TCA-3'.
Nachfolgend sind DNA-Sequenzen und Methoden zur Verwendung im erfindungsgemässen Test-Kit zum Nachweis von Fragmenten aus vier für EHEC charakteristischen Genen beschrieben, wobei diese Fragmente durch die Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase gemeinsam in derselben Reaktion amplifiziert werden. Die dabei entstehenden doppelstrangigen DNA-Fragmente werden danach in Einzelstränge zerlegt (denaturiert), und einer der jeweiligen Einzelstränge wird mittels Hybridisierung mit an einer beliebigen festen Oberfläche (Membran, Mikrotiterplatte, Elektrode, Chip, Polystyrolkügelchen oder Ähnliches) gebundenen Oligonukleotiden (Fangsonden), deren Nukleotidsequenzen jeweils komplementär zu den betreffenden Einzelsträngen sind, gebunden.
Gleichzeitig erfolgt eine Hybridisierung dieses Komplexes mit weiteren jeweils passenden Oligonukleotiden (Detektorsonden), die an weitere jeweils komplementäre Stellen der DNA-Einzelstränge binden, und die mit einer Markierung versehen sind, die optisch, autoradiographisch, elektrochemisch oder enzymatisch direkt oder indirekt detektierbar ist (siehe Fig. 1).
Die einzelnen DNA-Sequenzen (Primerpaare) für die Amplifizierung von drei bzw. vier für EHEC charakteristischen Genabschnitte wurden insbesondere geeignet zur gemeinsamen Verwendung in einer einzigen Reaktion (Multiplex-Reaktion) entworfen, wobei mindestens SLT1, SLT2 und rfbE in einer Reaktion enthalten sein müssen. Ausserdem wurde angestrebt, möglichst kleine und in ihrer Grösse ähnliche Amplifizierungsprodukte zu bilden, um eine möglichst hohe und auch ähnliche Amplifizierungseffizienz für die einzelnen Genabschnitte und eine möglichst kurze Reaktionszeit bei der Amplifzierung zu erreichen.
Die DNA-Sequenzen für die an die feste Oberfläche gebundenen Fangsonden sowie für die markierten Detektorsonden wurden weiters so gewählt, dass für alle DNA-Sequenzen eine spezifische Hybridisierung und somit auch ein spezifischer Nachweis unter den gleichen Bedingungen ermöglicht wird (Multiplex-Hybridisierung).
Zur Amplifizierung eines Teils des SLT1-Gens aus EHEC haben sich DNA-Sequenzen gemäss der Ansprüche 2 und 3 als besonders effektiv erwiesen. Die in den Ansprüchen 6 und 7 geoffenbarten DNA-Sequenzen sind auf die Amplifizierung des in EHEC ebenfalls vorkommenden SLT2-Gens und der meisten seiner Varianten gerichtet. Die Gegenstände der Ansprüche 10 und 11bilden DNA-Sequenzen, die geeignet zur Amplifizierung eines Teils des rfbE-Gens aus E. coliStämmen (insbesondere 0157:H7), die das 0157 - Antigen aufweisen, sind. Die Primer, die in den Ansprüchen 15 und 16 beschrieben sind, dienen der Amplifizierung eines Teils des fliC-Gens aus E coli - Stämmen (insbesondere 0157:H7), die das H7 - Antigen besitzen. Die Fangsonden und die Detektorsonden zum Nachweis der jeweiligen Amplifikate sind in den Ansprüchen 4, 5, 8, 9, 12, 13,17 und 18 beschrieben.
Im Folgenden wird die Erfindung durch einen ein mehrteiliges, beschreibendes Beispiel umfassenden Beispielsteil näher erläutert.
Beispielsteil:
Material und Methoden:
Bakterien-Stämme : Enterohämorrhagische Escherichia coli-Stämme stammen von der American Type Culture Collection (ATCC). Tabelle 1 zeigt eine Auflistung der verwendeten Stämme und
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der Gene, die jeweils vorhanden sind. Als Negativkontrollstamm wurde ein nicht-pathogener Wild- typstamm aus der firmeneigenen Stammsammlung verwendet, der aus Wasser isoliert worden war. Die Stämme wurden auf Plate-Count-Agarplatten gehalten, Über-Nacht-Kulturen wurden in flüssigem LB-Medium hergestellt.
Ziel-Sequenzen: Die DNA-Sequenzen für SLT-, rfbE - und fliC - Gene, die für das Design von geeigneten Oligonukleotiden verwendet wurden, stammen aus der GenBank Datenbank der NIH (National Institutes of Health, www.ncbi.nlm.nih.gov) und wurden mit Hilfe von DNA-Analyse- software wie GeneRunner (www.qenerunner.com) bzw. PC/Gene (Intelligenetics Inc., Genf, Schweiz) aufbereitet und analysiert. Nach multiplen Sequenzvergleichen (Higgins, D. G. und Sharp, P. M. (1988) : CLUSTAL : package for performing multiple sequence alignment on a micro- computer. Gene 73 (1):237-244) wurden stark konservierte Bereiche der jeweiligen Gene ausge- sucht. In diesen Bereichen wurden dann Amplifizierungsprimer, Fangsonden und Detektorsonden festgelegt (Rychlik, W., Spencer, W. J., and Rhoads, R.
E.: (1990) : Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucl. Acids Res. 18 (21): 6409-6412), wobei darauf geachtet wurde, dass sich die Annealingtemperaturen aller primer für die Multiplex-Amplifizierungs- reaktion nicht zu stark voneinander unterscheiden. Ebenso wurde versucht, Sonden mit möglichst ähnlicher Schmelztemperatur zu finden. So sollte ein gleichzeitiger Nachweis aller bisher bekann- ten Varianten aller betreffenden Gene unter denselben Bedingungen erreicht werden.
Primer-Oligonukleotide, Fangsonden und Detektorsonden : Sequenzen der Primer und Sonden sind in Tabelle 2 angegeben. Fangsonden weisen am 5'- Ende zusätzlich zur spezifischen Sequenz 12 Desoxy-Thymidine als "Abstandshalter" (Spacer) zur Membran auf. Sämtliche Oligo- nukleotide ausgenommen markierte Detektorsonden wurden von VBC-GENOMICS Bioscience GmbH, Rennweg 95B, 1030 Wien, Österreich, bezogen, Detektorsonden wurden von der Firma DNA Technology A/S (Science Park Aarhus, Gustav Wieds Vej 10A, DK-8000 Aarhus,Dänemark) bezogen und waren im beschriebenen Fall mit dem Enzym Alkalische Phosphatase gekoppelt (Hermanson, G. T : Conjugation to DNA. In: Bioconjugate Techniques, Kapitel 17, S.
662-668, Academic Press, San Diego, California, USA, ISBN 0-12-342336-8). Oligonukleotide wurden mittels Phosphoramidit-Chemie (Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H. (1981) : Deoxynu- cleoside phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.
Tetrahedron Lett. 22 : in automatisierten Systemen synthetisiert.
Immobilisierung der Fangsonden auf Membranen zur Verwendung als Teststreifchen : Fang- sonden wurden in 6xSSC (20x SSC = 3M NaCI und 0,3M Tri-Natriumcitrat-Dihydrat) in einer Kon- zentration von 2 g / l gelöst. Je 1 g (0,5 l) der jeweiligen Fangsonden wurden nebeneinander auf in Streifchen geschnittene positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics GmbH, Engel- horngasse 3, A-1211 Wien, Österreich) mittels Mikropipette aufgetragen. Als Negativkontrolle diente 1 g denaturierte Heringsperma-DNA (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich). Die aufgetragene DNA wurde mittels UV-crosslinking immobilisiert (3 Minuten, UV-C Lampe, Abstand ca. 30 cm). Reihenfolge von links nach rechts: SLT1-CPD, SLT2-CPD, RFB-CPD1, FLI-CPD, Heringsperma-DNA.
Fleischproben: Faschiertes gemischtes Schweine- und Rindfleisch wurde bei einem Fleisch- hauer gekauft und bis zur Verwendung gekühlt aufbewahrt.
Keimzahlbestimmung: Nach Kalibrierung der Messmethode für alle verwendeten Stämme durch Vergleich der Ergebnisse mit den Ergebnissen aus der Plate-Count-Methode (Kolonienzahl auf Platten) wurde die Keimzahl der zur Inokulation verwendeten Über-Nacht-Kulturen von EHEC mittels BacTrac 4100 - Analysesystem (SY-LAB Geräte GmbH, Tullnerbachstrasse 61-65,3011 Neupurkersdorf, Österreich) nach Vorgabe des Herstellers impedimetrisch bestimmt.
Anzucht und Voranreicherung: Je 25 g Faschiertes wurden in Stomacherbeutel mit Filterein- satz (Bagfilter von Interscience, F-78860 St. Nom, Frankreich) eingewogen, mit 225 ml Anreiche- rungsmedium (gepuffertes Peptonwasser von Oxoid (CM 509) + 5 g/ L Lactose) versetzt, im Stomacher eine Minute lang homogenisiert, mit Verdünnungen von EHEC- Über-Nacht-Kulturen mit bekannter Keimzahl inokuliert und bei 37 C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beimpfung (4,6, 8 und 15 Stunden) wurden für DNA-Extraktionen Proben entnommen.
DNA-Amplifizierunq einzelner Genabschnitte: Alle Amplifizierungsreaktionen erfolgten stan- dardmässig mittels thermostabiler DNA-Polymerase (Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Schare, S. S., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., und Erlich, H. A. (1988) : Primerdirected enzymatic
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amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491).Aufamplifizie- rungen für einzelne Genabschnitte wurden mit folgendem Zeit/Temperaturprofil in einem GP-001 Thermocycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, N. S.W. Australien) und in einem Volumen von 25 l durchgeführt : 15 Minuten 95 C, dann 40 Zyklen mit 30 Sekunden 94 C, 30 Sekunden 60 C und 30 Sekunden 72 C, abschliessende Extension 10 Minuten bei 72 C.
Reaktionsbedingungen (Endkonzentrationen): 1xAmplifizierungspuffer, 2,5 mM MgCI2, Nukleo- tidmix (je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP oder je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und 600 uM dUTP), je 1 uM SLT1-f1, SLT1-r1, SLT2-f1, SLT2-r2, RFB-f1, RFB-r1, FLI-f1 und FLI-r1, 1-2,5 U thermostabile DNA-Polymerase, bei Bedarf und Verwendung von dUTP statt dTTP: 1 U Uracil-N- Glycosylase (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich).
Nukleotid- mix von Roche, einzelne Nukleotide sowie Amplifizierungspuffer und DNA-Polymerase von Genec- raft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Münster, Bundesrepublik Deutschland.
EMI6.1
segelen aufgetrennt, wobei 1x TBE (0,09 M Tris-Base, 0,09M Borsäure, 0,002M EDTA) als Lauf- puffer und eine 100 Basenpaar-Leiter (Life Technologies GmbH, Haus 223, A-5090 Lofer, Öster- reich) als Molekulargewichtsmarker verwendet wurden. Gele wurden danach mit Ethidiumbromid gefärbt und mittels Bildverarbeitungssystem dokumentiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Mania- tis, T.: Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 6).
Reinigung amplifizierter Fragmente aus Einzelamplifizierungen: Um die Grenze der Nachweis- barkeit für die einzelnen Genabschnitte zu bestimmen, wurden Fragmente aus einem Agarosegel nach einer Elektrophorese ausgeschnitten und mittels eines Spin Column Kits (QIAquick Gel Extraction Kit von Qiagen, Max-Volmer-Strasse 4, D-40724 Hilden, Bundesrepublik Deutschland) aufgereinigt.
Testdurchführung :
DNA-Extraktion :
Genomische DNA aus EHEC-Stämmen und aus dem Negativkontrollstamm (Reinkulturen) wurde mittels kommerziell erhältlicher Spin Column Kits (NucleoSpin TM Tissue Kit von Macherey- Nagel GmbH & Co.KG, P.O. Box 10 13 52, D-52313 Düren bzw. High Pure PCR Template Prepa- ration Kit von Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich) aus einfa- chen Über-Nacht-Kulturen isoliert.
DNA aus den Fleischproben wurde durch folgendes Vorgehen isoliert: - Zentrifugation von 1 ml Kulturüberstand der Fleischprobe in 1,5 ml Röhrchen in einer Eppen- dorfzentrifuge (5 Minuten, 16. 000 g) - Abheben und Verwerfen des Überstands, Aufnahme der sedimentierten Bakterien in 1 ml sterilem destilliertem Wasser, gründliche Resuspendierung - Abzentrifugieren der Bakterien wie oben und Resuspendierung des Bakterien-Pellets in 100 l (bei 4-8 Stunden Inkubation) bzw. 200 l (15 Stunden Inkubation) sterilem destilliertem Was- ser.
- Erhitzen der Bakteriensuspension auf 100 C (20 Minuten, Heizblock) - Abzentrifugieren der Zellreste wie oben und Transfer von 80 bzw. 170 l des resultierenden Überstandes in frische Röhrchen.
- Aufbewahrung der Proben bis zur Amplifizierung bei -20 C.
Multiplex-DNA-Amplifizierung:
Multiplex-Aufamplifizierungen wurden mit folgendem Zeit/Temperaturprofil in einem GP-001 Thermocycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, N.S.W. Australien) und einem Volumen von 25 l durchgeführt : 15 Minuten Denaturierung bei 95 C, dann 2 Zyklen mit 30 Se- kunden Denaturierung bei 94 C, 30 Sekunden Annealing bei 65 C und 30 Sekunden Extension bei 72 C. Anschliessend 40 Zyklen mit 30 Sekunden Denaturierung bei 94 C, 30 Sekunden An- nealing, wobei die Temperatur 5 Zyklen lang in jedem Zyklus um 1 C abgesenkt wurde, bis 60 C erreicht waren (Touchdown-Amplifizierung), 30 Sekunden 72 C, abschliessende Extension 10 Minuten bei 72 C.
Reaktionsbedingungen (Endkonzentrationen): 1x Amplifizierungspuffer, 2,5 mM MgCI2, Nukleo-
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tidmix (je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP oder je 200 M dATP, dGTP, dCTP und 600 uM dUTP), je 0,15 uM SLT1-f1 und SLT1-r1, je 1 uM SLT2-f1, SLT2-r2, RFB-f1, RFB-r1, FLI-f1 und FLI-r1, 1-2,5 U thermostabile DNA-Polymerase, bei Bedarf und Verwendung von dUTP statt dTTP: 1 U Uracil-N-Glycosylase (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich). Nukleotidmix von Roche, einzelne Nukleotide von Genecraft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Münster, Bundesrepublik Deutschland.
Hybridisierung: Prähybridisierungslösung (Endkonzentrationen) : 5xSSC (20x SSC = 3M NaCI und 0,3M Tri-Natriumcitrat-Dihydrat), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1% Blocking Reagenz (Roche), 100 g / ml denaturierte Heringsperma-DNA (Roche). Hybridisierungslösung (Endkonzentrationen): 5xSSC, 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1 % Blocking Reagenz (Roche), 70 pM SLT1-CO, 1 nM SLT2-CO, 136 pM RFB-CO, 1 nM FLI-CO.
- Die Streifchen mit den immobilisierten Fangsonden wurden in Prähybridisierungslösung bei
42 C im Schüttelwasserbad zum Abblocken freier Stellen auf der Membran inkubiert (0,5 ml pro Streifchen, ca. 15 Minuten).
- 10 l der Proben aus der Multiplex-Amplifizierungsreaktion wurden mit 1 l 1 N NaOH versetzt und 10 Minuten bei 37 C denaturiert.
- Denaturierte DNA einer Probe und ein vorgeblocktes Streifchen wurden jeweils gemeinsam in
0,5 ml vorgewärmter Hybridisierungslösung für 15 Minuten bei 42 C inkubiert (in einem steri- len 2 ml Plastikröhrchen).
- Danach wurde das Streifchen zweimal mit mindestens 2 ml Waschlösung (0,1xSSC, 0,1%
SDS) bei 42 C für mindestens 5 Minuten gewaschen.
Farbdetektion : Die Detektion erfolgte in diesem Beispiel enzymatisch mittels Umsetzung von Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid und 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat durch die an die Detektorsonden gekoppelte Alkalische Phosphatase. Verwendet wurde hierfür der Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit von Bio-Rad Laboratories Ges. m. b. H. (Auhofstrasse 78D, A-1130 Wien, Österreich).
- Die Streifchen wurden kurz in Substratpuffer ohne Substrate (0,1 M Tris/HCI, pH 9,5) ge- schwenkt.
- Inkubation der Streifchen in Substratpuffer mit Substraten (1 ml pro Streifchen) bei 37 C (bis zu 2 Stunden).
- Abbbruch der Farbreaktion durch Schwenken der Streifchen in destilliertem Wasser und Aus- wertung des Ergebnisses unmittelbar nach Trocknen der Streifchen.
Ergebnisse :
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zierungs- und Hybridisierungsbedingungen lieferten sehr gute Ergebnisse mit allen verwendeten Proben. Die Signale für die einzelnen Gene waren genügend stark und unterschieden sich auch nicht zu sehr in ihrer Intensität. Es wurden keine Kreuzreaktionen zwischen den verschiedenen Amplifikaten festgestellt, ausser einer ganz leichten Reaktion zwischen SLT1-Fragment und RFB-CPD. Dieses Problem konnte durch Verwendung der alternativen Fangsonde RFB-CPD1 gelöst werden.
Spezifität. Sensitivität : Mit dem beschriebenen Multiplex-Assay konnten < 5 ng gereinigtes amplifiziertes Fragment (SLT1, SLT2, RFB oder FLI) reproduzierbar nachgewiesen werden. Dies ist eine höhere Sensitivität als sie routinemässig beispielsweise in einer Agarosegelelektrophorese durch Färbung der DNA mit Ethidiumbromid möglich ist. Eine Hybridisierung nach erfolgter Amplifi- zierung erhöht also die Sensitivität (siehe auch Paton, AW, and Paton, JC (1998) : Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2' eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbOm, and rfbO157. J Clin Microbiol 36 (2) : 598-602).
In Versuchen mit gereinigter genomischer DNA aus 5 verschiedenen EHEC-Stämmen konnten je nach Stamm bei Vorliegen von 10 bis 100 Genomäquivalenten pro Assay alle in den jeweiligen Stämmen vorhandenen Gene gefunden werden (Abbildung 2).
Versuche mit künstlich kontaminierten Fleischproben zeigten, dass bei einer Anreicherungszeit von 8 Stunden bei 4 von 5 Stämmen der Nachweis aller vorhandenen Gene bei einer Inokulati- onsmenge von 1-10 EHEC/ 25 g Faschiertem und in einem Fall bei einer Inokulationsmenge von
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werden. (Abbildung 3).
Tabelle 1: Verwendete ATCC-Stämme von Escherichia coli TCC-Nummer Bescbreibung Scrotyp Vorhandene ATCC-Nummer Beschreibung Toxingene ATCC 43889 Aus Faeces eines HUS*-Patienten,NOrth Carolina 0157:H7 SLT2 ATCC 43890 Aus hurmanen Faceces, Calfonmien O157 :H7 SLTI
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EDL 933 O157:H7 SLT1,SLT2 ATCC 35150 Aus humanen Faeces, Stamm EDL 931 O138:K81(B):H14 SLT2-Variante ATCC 23545 Aus Schwein (Edema Discase) O138 :K81(B):H14 SLTs-Variante * Haemolytisch-Uraemisches Syndrom
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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Tabelle 2: Primer-Oligonukleotide, Fangsonden und Detektorsonden Name Sequenz Funktion
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SLT1-CO 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3' Detektorsonde fur SLTI-Amplifikat SLT2-fl 5-CCA CTG TGA CAA CGG ACA GC-3' Forward Primer für SLT2-Gen
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