WO2003010332A2 - Test-kit zum nachweis von enterohämorrhagischen $i(escherichia coli) - stämmen (ehec) - Google Patents

Test-kit zum nachweis von enterohämorrhagischen $i(escherichia coli) - stämmen (ehec) Download PDF

Info

Publication number
WO2003010332A2
WO2003010332A2 PCT/AT2002/000222 AT0200222W WO03010332A2 WO 2003010332 A2 WO2003010332 A2 WO 2003010332A2 AT 0200222 W AT0200222 W AT 0200222W WO 03010332 A2 WO03010332 A2 WO 03010332A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
seq
test kit
kit according
hybridizing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/AT2002/000222
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003010332A3 (de
Inventor
Sabine Vollenhofer-Schrumpf
Manfred Schinkinger
Gert Fränzl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SY-LAB VGMBH
Original Assignee
SY-LAB VGMBH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SY-LAB VGMBH filed Critical SY-LAB VGMBH
Priority to EP02762153A priority Critical patent/EP1409742A2/de
Publication of WO2003010332A2 publication Critical patent/WO2003010332A2/de
Publication of WO2003010332A3 publication Critical patent/WO2003010332A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • EHEC enterohaemorrhagic Escherichia coli strains
  • the invention relates to a test kit for the detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli strains (EHEC).
  • EHEC enterohaemorrhagic Escherichia coli strains
  • EHEC Escherichia coli
  • Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli have been used as food pathogens in the past few years mainly in the USA, but also in some other countries, by causing sporadic, but often dramatic, and more and more frequent occurrences since 1993 Outbreaks of illnesses attracted attention. Infections occurred primarily through the consumption of meat that was not fully roasted (hamburgers), but also through the consumption of raw milk, yoghurt, sausage, apple cider, lettuce, vegetables or seedlings.
  • enterohaemorrhagic E. coli infection ranges from watery to bloody diarrhea to kidney damage such as hemolytic uraemic syndrome (HUS), which may lead to death (Griffin, PM, and Tauxe, RV (1991) : The Epidemiology of Infections Caused by Escherichia coli O157: H7, Other Enterohemorrhagic E. coli, and the Associated Hemolytic Uremic Syndrome. Epidemiol Rev 13: 60-98). Naturally, children, old people and people with immunodeficiency are particularly at risk.
  • HUS hemolytic uraemic syndrome
  • Enterohaemorrhagic E. coli is usually detected using classic microbiological, biochemical and serological methods (smear on plate, biochemical characterization, agglutination tests, enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA) and cell culture methods (e.g. toxin test with Vero cells). Recently, however, detection using modern molecular biological or immunological methods has become increasingly important (Paton, AW, and Paton, JC (1998): Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stxj, stx 2 , eaeA , Enterohemorrhagic E.
  • enterohaemorrhagic E. coli strains have some genetic peculiarities that distinguish them from non-pathogenic E. coli strains, they can be specifically detected using molecular biological methods that use these differences.
  • EHEC The most important genes typical for EHEC are the toxin genes SLT1 and SLT2 and their variants. Their gene products are largely responsible for the symptoms of an infection with EHEC. Another important gene for a pathogenicity factor of EHEC is the eaeA-Gcn. Since the vast majority of epidemics are caused by EHEC strains of the serotype O157: H7, the detection of this type is particularly important. Genes that are characteristic of this serotype are, for example, the genes rfl> E, a gene from the biosynthetic pathway of the O157 antigen, vm ⁇ fliC, the gene for the H7 antigen. At least the two genes for the toxins SLT1 and SLT2 and the 0157-specific gene rfbE are important for a test for routine food testing in order to clearly identify the dangerous pathogens as EHEC.
  • the object of the invention is to provide a test instrument with which the genes required for the detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli strains or the serotype 0157 can be detected in a single reaction without major expenditure of equipment and time.
  • a control should be included in order to check the performance of the test.
  • the use of mutagenic or toxic substances should be avoided in this detection.
  • the aim is to provide a reliable tool for routine analysis in the quality control of food but also for the characterization of unknown E. coli strains isolated from any source.
  • the aim is to have a test instrument that enables even simply equipped laboratories to prove EHEC within a working day in the shortest possible time, with little hands-on time and without expensive equipment.
  • test kit which each has a pair of primers for amplifying at least a part of the SLT1 gene, the SLT2 gene, of the rfbE gene, the e ⁇ -4 gene and a control gene in a single reaction and each contain both an oligonucleotide as a capture probe and an oligonucleotide as a detector probe for hybridization of the amplificates obtained with the primers at room temperature, all capture probes on a common solid surface are immobilized and the detector probes are provided with a visually detectable marking.
  • the described molecular biological detection of EHEC by means of the test kit according to the invention offers significant advantages. Since there is neither a 100% reliable selection medium nor a clear biochemical test for EHEC, detection using microbiological, biochemical and serological methods is difficult. Other bacterial genera such as Escherichia hermannii or Hafnia spp. have, for example, a similar biochemical phenotype as O157: H7, or there are often cross-reactions of anti-O157 sera with other bacteria such as Citrobacter freundii or Yersinia enterocolitica.
  • Int J Food Microbiol 67: 71-80 is based on the fact that for the implementation of the detection reaction and for the Evaluation of the result requires no expensive special equipment such as microarray scanners and image processing systems or special software, hybridization cassettes or hybridization ovens, since the hybridization takes place at room temperature and the evaluation is carried out with the naked eye.
  • Another advantage is the use of capture probes in combination with directly labeled detection probes, so that there is a good specificity from the outset, which may only be guaranteed for microarrays by using at least two capture probes per amplificate (Chizhikov, V. et al, supra ).
  • a purification of amplificates or a removal of non-incorporated labels, as is essential when using fluorescence-labeled primers or nucleotides in microarrays, is in the the use of the test kit according to the invention is also not necessary, which reduces hands-on time and material consumption.
  • test kit is its exceptional sensitivity compared to other existing molecular biological detection methods for EHEC.
  • Fratamico et al. J Food Prot 63 (8): 1032-1037
  • a multiplex PCR with 5 genes from EHEC with which a sensitivity of 1 cfu / g food (prepared) could be achieved, namely with an enrichment time of 12 hours, testing of a single strain and using agarose gel electrophoresis instead of hybridization.
  • hybridization not only increases the sensitivity of a molecular biological test by signal amplification during detection, but also the specificity.
  • the increased number of primers used can lead to unspecific reactions which lead to unspecific bands in gels and can severely impair test interpretation (Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., and Levy , DD (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environments. Microbiol. 67 (7): 3258-3263).
  • German standard DIN10134 "General process-specific requirements for the detection of microorganisms with the polymerase chain reaction (PCR) in food” stipulates, for example, that a PCR result must be verified by hybridization or sequencing. Occurring bands of the apparently correct size can Using agarose gel electrophoresis alone leads to false positive results, however, many molecular biological methods for the detection of EHEC do not meet the above-mentioned condition, but only use agarose gels to evaluate a test result (JP-A - 2001-095576; Hu, Y, Zhang, Q.
  • test kit The combination of pre-enrichment, DNA amplification and detection by the test kit according to the invention also allows routine laboratories equipped as standard to quickly and reliably detect EHEC. Only a thermal cycler and a shaker are required on additional equipment.
  • a preferred embodiment of the test kit is characterized in that the primer pair for the amplification of a part of the SLT1 gene has the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the capture probe for hybridizing the SLT1 gene amplificate preferably has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence of the detector probe is preferably SEQ ID NO: 4.
  • a further preferred embodiment of the test kit is characterized in that the primer pair for the amplification of a part of the SLT2 gene has the nucleotide sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the capture probe for hybridizing the SLT2 gene amplificate preferably has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7.
  • the nucleotide sequence of the detector probe is preferably SEQ ID NO: 8.
  • test kit is characterized in that the primer pair for the amplification of part of the r ⁇ E gene has the nucleotide sequences SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • the capture probe for hybridizing the rfbE gene amplificate preferably has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 11.
  • the nucleotide sequence of the detector probe is preferably SEQ ID NO: 12.
  • test kit is characterized in that the primer pair for the amplification of a part of the eaeA gene has the nucleotide sequences SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • the capture probe for hybridizing the ea ⁇ gene plicate preferably has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide sequence of the detector probe is preferably SEQ ID NO: 16.
  • Yet another preferred embodiment of the test kit is characterized in that the human KCNJ9 gene is provided as the control gene.
  • the pair of primers for amplifying part of the human KCNJ9-GG ⁇ .S preferably has the nucleotide sequences SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • the capture probe for hybridizing the XCNJP gene amplificate preferably has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 19.
  • the nucleotide sequence of the detector probe is preferably SEQ ID NO: 20.
  • test kit is characterized in that at least one oligonucleotide is provided for a hybridization negative control, which is immobilized on a solid surface.
  • the negative control can also consist, for example, of a mixture of several random oligonucleotides.
  • the oligonucleotides for the hybridization negative control preferably have the nucleotide sequences SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • a coupling with alkaline phosphatase is preferably provided as the visually detectable marking of the detector probes, which coupling makes hybridization visible by means of enzymatic conversion of organic dyes.
  • the resulting double-stranded DNA fragments are then broken down into single strands (denatured), and one of the respective single strands is hybridized with oligonucleotides (capture probes) bound to any solid surface (membrane, microtiter plate, electrode, chip, polystyrene beads or similar) Nucleotide sequences are each complementary to the relevant single strands.
  • this complex is hybridized with further suitable oligonucleotides (detector probes) which bind to further complementary sites of the single DNA strands and which are provided with a label which can be detected directly or indirectly (see FIG. 1).
  • oligonucleotides detector probes
  • Another optical, autoradiographic or electrochemical detection would also be possible.
  • the individual preferred DNA sequences (primer pairs) for the amplification of four gene segments characteristic of EHEC and the internal PCR / hybridization positive control were especially designed to be used jointly in a single reaction (multiplex reaction).
  • the aim was to form amplification products that were as small as possible and similar in size in order to achieve the highest possible and also similar amplification efficiency for the individual gene segments and the shortest possible reaction time during amplification.
  • the preferred DNA sequences for the capture probes bound to the solid surface and for the labeled detector probes were further selected so that for all DNA sequences a specific hybridization and thus also a specific detection under the same conditions, namely at room temperature (20- 35 ° C), is made possible (multiplex hybridization).
  • DNA sequences according to claims 2 to 4 have proven to be particularly effective for the amplification and detection of part of the SLT1 gene from EHEC.
  • the DNA sequences disclosed in claims 5 to 7 are directed to the amplification and detection of the SLT2 gene which also occurs in EHEC and most of its variants.
  • the subjects of claims 8 to 10 form DNA sequences which are suitable for the amplification and for the detection of a part of the rfbE gene from E. coli strains (in particular O157: H7) which have the O157 antigen.
  • the oligonucleotides described in claims 11 to 13 are used for the amplification and the detection of a part of the eaeA gene from E. coli strains.
  • Claims 15 to 17 describe oligonucleotides for the detection and detection of the human KCNJ9 gene as an internal positive control for the test.
  • oligonucleotides as a negative control for hybridization are set out in claim 19.
  • Bacterial strains Enterohaemorrhagic Escherichia co / z ' strains come from the American Type Culture Collection (ATCC). Table 1 shows a list of the used Strains and the genes that are present. The strains were kept on plate count agar plates, overnight cultures were prepared in liquid LB medium.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Target sequences The DNA sequences for SLT, rflE, eaeA and KCNJ9 genes, which were used for the design of suitable oligonucleotides, come from the GenBank database of the NIH (National Institutes of Health, www.ncbi.nlm .nih.gov) and were prepared and analyzed with the help of DNA analysis software such as GeneRunner (www, generunner.com) or PC / Gene (Intelligenetics Inc., Geneva, Switzerland). After multiple sequence comparisons (Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1988): CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73 (1): 237-244), highly conserved areas of the respective genes were selected.
  • amplification primers, capture probes and detector probes were then determined (Rychlik, W., Spencer, WJ, and Rhoads, RE: (1990): Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucl. Acids Res. 18 (21) : 6409-6412), taking care that the annealing temperatures of all primers for the multiplex amplification reaction do not differ too much from one another. Attempts were also made to find probes with a melting temperature that was as similar as possible. Thus, a simultaneous detection of all known variants of all relevant genes should be achieved under the same conditions.
  • Primer oligonucleotides, capture probes and detector probes The sequences of the primers and probes are given in Table 2 and in the attached sequence listing. In addition to the specific sequence, capture probes have 12 deoxy-thymidines at the 5 'end as "spacers" to the membrane. All oligonucleotides except labeled detector probes were obtained from VBC-GENOMICS Bioscience GmbH (Rennweg 95B, 1030 Vienna, Austria), detector probes were obtained from DNA Technology A / S (Science Park Aarhus, Gustav Wieds Vej 10A, DK-8000 Aarhus, Denmark) and in the described case were coupled with the enzyme alkaline phosphatase (Hermanson, G.
  • Meat samples Mashed mixed pork and beef were purchased from a butcher and kept refrigerated until used.
  • Bacterial count determination After calibration of the measurement method for all strains used by comparing the results with the results from the plate count method (number of colonies on plates), the bacterial count of the overnight cultures used for inoculation was determined by EHEC using a BacTrac 4100 analysis system (SY -LAB Automatic GmbH, Tullnerbach No 61-65, 3011 Neupurkersdorf, Austria) impedimetrically determined according to the manufacturer's instructions.
  • Genomic DNA from EHEC strains was obtained using commercially available spin column kits (NucleoSpin TM Tissue Kit from Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, PO Box 10 13 52, D-52313 Düren, Federal Republic of Germany or High Pure PCR Template Preparation kit from Röche Diagnostics GmbH, Engelhomgasse 3, A-1211 Vienna, Austria) isolated from simple overnight cultures. DNA concentrations were determined in a SmartSpec3000 spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories Ges.
  • the DNA was used for PCR 1 + 9 with water for molecular biology (Sigma,
  • thermostable DNA polymerase Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S., Schare, SS, Higuchi, R., Hörn, GT, Mullis, KB, and Erlich, HA (1988): Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491).
  • Reaction conditions final concentrations: 1x amplification buffer, 2.5 mM MgCl 2 (both from Qiagen, Max-Volmer-Strasse, D-40724 Hilden, Federal Republic of Germany), nucleotide mix (each 200 ⁇ M dATP, dGTP, dCTP and dTTP or 200 ⁇ M each dATP, dGTP, dCTP and 600 ⁇ M dUTP), each 0.15 ⁇ M SLTl-fl and SLTl-rl, each 1 ⁇ M SLT2-fl, SLT2-r2, RFB-fl, RFB-rl, EAE-fl, EAE-rl , KCN-fl and KCN-rl, 0.7 ng / ⁇ l human DNA (Sigma, Hebbelplatz 7, A-1100 Vienna, Austria, Cat.
  • nucleotide mix each 200 ⁇ M dATP, dGTP, dCTP and dTTP or 200 ⁇ M each dATP,
  • Hybridization solution (final concentrations): 5xSSC, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 1% blocking reagent (Röche), 70 pM SLT1-CO, 240 pM SLT2-CO1, 448 pM RFB-CO, 660 pM EAE -COl, 200 pM KCN-CO.
  • a mixture of the detection probes was heated at 45 ° C for about 10 minutes before addition to the hybridization solution.
  • the strip was then washed twice with at least 2 ml of washing solution (0.1X SSC, 0.1% SDS) at room temperature for at least 7 minutes.
  • washing solution 0.1X SSC, 0.1% SDS
  • the color reaction is stopped by swirling the strips in distilled water and evaluating the result immediately after the strips have dried.
  • Multiplex amplification / hybridization The amplification and hybridization conditions described in the material and methods provided very good results with all samples used. The signals for the individual genes were sufficiently strong and did not differ too much in their intensity. No cross-reactions were found between the different amplificates.
  • Random oligonucleotide Table 1 ATCC strains of Escherichia coli used
  • Fig. 2 Hybridization of artificially contaminated meat samples

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Ein Test-Kit zum Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli Strämmen (EHEC) enthält jeweils ein Primerpaar zur Amplifizierung mindestens eines Teils des SLT1-Gens, des SLT2-Gens, des r∫bE-Gens, des eaeA-Gens und Kontrollgens in einer einzigen Reaktion sowie jeweils sowohl ein Oligonukleotid als Fangsonde als auch ein Oligonukleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate bei Raumtemperatur, wobei alle Fangsonden auf einer gemeinasamen festen Oberfläche immobilisiert sind und die Detektorsonden mit einer visuell detektierbaren Markierung versehen sind. Mit Hilfe diese Test-Kits wird auf einfache Weise in einer einzigen Reaktion ein verlässlicher Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli-Stämmen ermöglicht.

Description

Test-Kit zum Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli - Stämmen (EHEC)
Die Erfindung betrifft einen Test-Kit zum Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli - Stämmen (EHEC).
Enterohämorrhagische Stämme von Escherichia coli (EHEC), vor allem des Serotyps O157:H7, haben als Lebensmittelpathogene in den letzten Jahren hauptsächlich in den USA, aber auch in einigen anderen Ländern durch die Verursachung von sporadischen, aber oft dramatischen und seit 1993 immer häufiger auftretenden Ausbrüchen von Erkrankungen für Aufmerksamkeit gesorgt. Infektionen traten vor allem durch den Verzehr von nicht vollständig durchgebratenem Fleisch (Hamburger), aber auch durch den Konsum von Rohmilch, Joghurt, Mettwurst, Apfel-Cider, Salat, Gemüse oder Keimlingen auf. Weitere Gefahrenquellen stellen mangelnde Hygiene mit Übertragung von Person zu Person sowie Trink- und Gebrauchswasser dar (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype O157:H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2): 47-52).
Die Symptome einer Infektion mit enterohämorrhagischen E. coli reichen von wässriger über blutige Diarrhöe bis zu Schädigungen der Niere, wie dem Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), das unter Umständen zum Tode führen kann (Griffin, PM, and Tauxe, RV (1991): The Epidemiology of Infections Caused by Escherichia coli O157:H7, Other Enterohemorrhagic E. coli, and the Associated Hemolytic Uremic Syndrome. Epidemiol Rev 13: 60-98). Besonders gefährdet sind naturgemäß Kinder, alte Menschen und Menschen mit Immunschwäche.
Der Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli erfolgt in der Regel mittels klassischer mikrobiologischer, biochemischer und serologischer Methoden (Ausstrich auf Platte, biochemische Charakterisierung, Agglutinationstests, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - ELISA) und Methoden der Zellkultur (z. B. Toxintest mit Verozellen), in letzter Zeit wird aber auch der Nachweis mittels modernerer molekularbiologischer oder immunologischer Verfahren immer wichtiger (Paton, AW, and Paton, JC (1998): Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stxj, stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfoOm, and O157. J Clin Microbiol 36 (2): 598-602; Hu, Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999): Rapid and sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR. J Appl Microbiol 87: 867- 876; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000): A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli O157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8): 1032-1037; Ohiso, I, et al. (2000): A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81: 15-25 ; Zhang, P, et al. (2000): Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene- Coacrylic Acid Film without Molecular Labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282: 218-226; Stokes, DL, Griffm, GD, and Vo-Dinh, T (2001): Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369: 295-301; Vorobyev, A. A. et al. (2000): PCR test Systems for the gene indication of enterohemorrhagic Escherichia coli. Zh. Mikrobiol., Epidemiol. Immunobiol. 6: 90-94 (Russ.)).
Da enterohämorrhagische E. coli — Stämme einige genetische Besonderheiten aufweisen, die sie von nicht-pathogenen E. coli - Stämmen unterscheiden, können sie durch den Einsatz molekularbiologischer Verfahren, die diese Unterschiede nutzen, spezifisch detektiert werden.
Die wichtigsten für EHEC typischen Gene sind die Toxingene SLTl und SLT2 sowie deren Varianten. Deren Genprodukte sind zu einem großen Teil für die Symptome einer Infektion mit EHEC verantwortlich. Ein weiteres wichtiges Gen für einen Pathogenitätsfaktor von EHEC ist das eaeA-Gcn. Da die allermeisten Epidemien von EHEC-Stämmen des Serotyps O157:H7 ausgelöst werden, ist der Nachweis dieses Typs besonders wichtig. Gene, die charakteristisch für diesen Serotyp sind, sind beispielsweise die Gene rfl>E, ein Gen aus dem Biosyntheseweg des O157-Antigens, vmάfliC, das Gen für das H7-Antigen. Zumindest die beiden Gene für die Toxine SLTl und SLT2 und das 0157-spezifϊsche Gen rfbE sind wichtig für einen Test zur Routineuntersuchung von Lebensmitteln, um die gefährlichen Krankheitserreger eindeutig als EHEC zu erkennen.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein Testinstrument bereitzustellen, mit welchem die für einen Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli — Stämmen bzw. des Serotyps 0157 erforderlichen Gene ohne größeren apparativen und zeitlichen Aufwand in einer einzigen Reaktion detektiert werden können. Zusätzlich soll eine Kontrolle inkludiert sein, um die Performance des Tests überprüfen zu können. Insbesondere soll bei diesem Nachweis die Verwendung mutagener oder giftiger Substanzen vermieden werden. Es soll somit ein verlässliches Werkzeug für die Routineanalytik in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln aber auch zur Charakterisierung von aus beliebigen Quellen isolierten unbekannten E. coli - Stämmen zur Verfügung gestellt werden. Angestrebt wird ein Testinstrument, das auch einfach ausgestatteten Labors in möglichst kurzer Zeit, mit geringer Hands-on-time und ohne teuren Apparateaufwand innerhalb eines Arbeitstages den Nachweis von EHEC ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen Test-Kit gelöst, welcher jeweils ein Primerpaar zur Amplifϊzierung mindestens eines Teils des SLTl -Gens, des SLT2-Gens, des rfbE-Gens, des eαβ-4-Gens und eines Kontrollgens in einer einzigen Reaktion sowie jeweils sowohl ein Oligonukleotid als Fangsonde als auch ein Oligonukleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate bei Raumtemperatur enthält, wobei alle Fangsonden auf einer gemeinsamen festen Oberfläche immobilisiert sind und die Detektorsonden mit einer visuell detektierbaren Markierung versehen sind.
Verglichen mit konventionellen Methoden (Plattenausstrich u. biochemische bzw. serologische Charakterisierung von Einzelkolonien oder ELISA) bietet der beschriebene molekularbiologische Nachweis von EHEC mittels des erfindungsgemäßen Test-Kits wesentliche Vorteile. Da es für EHEC weder ein hundertprozentig verlässliches Selektionsmedium noch einen eindeutigen biochemischen Test gibt, ist eine Detektion mittels mikrobiologischer, biochemischer und serologischer Verfahren schwierig. Andere Bakteriengattungen wie Escherichia hermannii oder Hafnia spp. besitzen beispielsweise einen ähnlichen biochemischen Phänotyp wie O157:H7, bzw. gibt es oft Kreuzreaktionen von Anti-O157-Seren mit anderen Bakterien wie Citrobacter freundii oder Yersinia enterocolitica. Abgesehen davon sagt das Vorhandensein des 0157 Antigens alleine noch nichts darüber aus, ob es sich um einen pathogenen Organismus handelt (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype O157:H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2): 47-52).
Oftmals kann die Diagnostik nur von Speziallabors durchgeführt werden. Kommerzielle ELISA-Tests, die das Genprodukt der SLT-Gene mit Hilfe von Antikörpern detektieren, sind zwar ebenfalls erhältlich, jedoch hängt ein erfolgreicher Nachweis davon ab, ob das entsprechende Genprodukt überhaupt gebildet wird. Weiters sind vor allem von SLT 2 mehrere Varianten bekannt, die sich in ihren antigenen Determinanten unterscheiden und nicht von allen Tests erkannt werden.
Existierende molekularbiologische oder modernere immunologische Tests wiederum erfordern oft den Umgang mit mutagenen oder giftigen Substanzen wie etwa Ethidiumbromid (Zhang, P, et al. (2000): Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labeis or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282: 218-226), die Anschaffung teurer optischer Spezialapparate (Ohiso, I, et al. (2000): A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81: 15-25; Stokes, DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001): Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection System. Fresenius J Anal Chem 369: 295-301; Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D. D. (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7): 3258-3263 ; Call, D. R. et al. (2001): Detecting and genotyping Escherichia coli O157:H7 using multiplexed PCR and nucleic acid microarrays. Int J Food Microbiol 67: 71-80), sind nicht so sensitiv wie die unten beschriebene Methode mittels des erfindungsgemäßen Test- Kits (Paton, AW, and Paton, JC (1998): Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stxi, stX2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rflOιn, and rß0157. J Clin Microbiol 36 (2): 598-602; Hu, Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999): Rapid and sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR. J Appl Microbiol 87: 867-876; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000): A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli O157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8): 1032-1037; Ohiso, I, et al. (2000): A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81: 15-25) oder sind umständlicher, zeitaufwändiger oder weniger aussagekräftig als der Nachweis unter Verwendung des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Test-Kits (Chen, J. et al. (2001): Detection of Salmonella and simultaneous detection of Salmonella and Shiga-like toxin-producing Escherichia coli using the magnetic capture hybridization polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol 32: 7-11; Cocolin, L. et al. (2000): A multiplex-PCR method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli in artifϊcially contaminated foods. Int J Hyg Environ Health 203: 159-164).
Einer der wesentlichen Vorteile der Erfindung, z. B. gegenüber Microarrays (Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D. D. (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7): 3258-3263; Call, D. R. et al. (2001): Detecting and genotyping Escherichia coli O157:H7 using multiplexed PCR and nucleic acid microarrays. Int J Food Microbiol 67: 71-80) beruht auf der Tatsache, daß für die Durchfuhrung der Detektionsreaktion und für die Auswertung des Ergebnisses keinerlei teures Spezialgerät wie Microarray-Scanner und Bildverarbeitungssysteme bzw. spezielle Software, Hybridisierungskassetten oder Hybridisierungsöfen benötigt werden, da die Hybridisierung bei Raumtemperatur erfolgt und die Auswertung mit freiem Auge vorgenommen wird.
Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung von Fangsonden in Kombination mit direkt markierten Detektionssonden, so dass von vorneherein eine gute Spezifϊtät gegeben ist, die bei Microarrays möglicherweise erst durch die Verwendung von mindestens zwei Fangsonden pro Amplifikat gewährleistet ist (Chizhikov, V. et al, supra). Eine Aufreinigung von Amplifikaten bzw. ein Abtrennen von nicht eingebautem Label, wie sie bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern oder Nukleotiden bei Microarrays unumgänglich ist, ist bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Test-Kits ebenfalls nicht nötig, was die Hands-on- time und den Materialverbrauch vermindert.
Das obengenannte Problem ergibt sich auch bei Real-time PCR-Systemen (Fortin, N. Y. et al. (2001): Use of Real-Time Polymerase Chain Reaction and Molecular Beacons for the Detection of Escherichia coli O157:H7. Anal Biochem 289: 281-288). Auch hier wird Spezialgerät benötigt, das für den routinemäßigen Einsatz in Labors für die Qualitätssicherung von Lebensmitteln kaum erschwinglich ist. Der erfindungsgemäße Test- Kit jedoch vermeidet die Notwendigkeit der Anschaffung solcher Geräte.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Test-Kits besteht in seiner außergewöhnlichen Sensitivität, verglichen mit anderen bestehenden molekularbiologischen Detektionsverfahren für EHEC. Beispielsweise beschreiben Fratamico et al. (J Food Prot 63 (8): 1032-1037) eine Multiplex-PCR mit 5 Genen aus EHEC, mit der eine Sensitivität von 1 cfu/g Lebensmittel (Faschiertes) erreicht werden konnte, und zwar bei einer Anreicherungszeit von 12 Stunden, Testung eines einzigen Stammes und Verwendung von Agarosegelelektrophorese anstatt Hybridisierung. Mit dem hier beschriebenen Test-Kit können jedoch 1-10 cfu/25 g unter Verwendung von 6 verschiedenen Stämmen (5 EHEC, 1 enteropathogener Stamm) bei einer Anreicherungszeit von nur 8 Stunden in Faschiertem nachgewiesen und gleichzeitig der Umgang mit Agarosegelen bzw. Ethidiumbromid vermieden werden.
Außerdem steigert eine Hybridisierung nicht nur die Sensitivität eines molekularbiologischen Tests durch Signalamplifikation bei der Detektion, sondern auch die Spezifität. Gerade bei Multiplex-PCRs kann es durch die erhöhte Anzahl der verwendeten Primer zu unspezifischen Reaktionen kommen, die in Gelen zu unspezifischen Banden fuhren und die Testinterpretation stark beeinträchtigen können (Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D. D. (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7): 3258-3263). Die deutsche Norm DIN10134: „Allgemeine verfahrensspezifische Anforderungen zum Nachweis von Mikroorganismen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Lebensmitteln" schreibt beispielsweise vor, daß eine Verifizierung eines PCR-Ergebnisses durch Hybridisierung oder Sequenzierung erfolgen muß. Zufällig auftretende Banden der scheinbar richtigen Größe können bei alleiniger Verwendung von Agarosegelelektrophorese zu falsch positiven Ergebnissen führen. Viele molekularbiologische Verfahren zum Nachweis von EHEC erfüllen die oben genannte Bedingung jedoch nicht, sondern verwenden ausschließlich Agarosegele zur Auswertung eines Testergebnisses (JP-A - 2001-095576; Hu, Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999): Rapid and sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR. J Appl Microbiol 87: 867-876; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000): A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli O157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8): 1032-1037; Chen, J. et al. (2001): Detection of Salmonella and simultaneous detection of Salmonella and Shiga-like toxin-producing Escherichia coli using the magnetic capture hybridization polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol 32: 7-11; Cocolin, L. et al. (2000): A multiplex-PCR method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli in artificially contaminated foods. Int J Hyg Environ Health 203: 159-164).
Die Kombination von Voranreicherung, DNA-Amplifizierung und Detektion durch den erfindungsgemäßen Test-Kit erlaubt auch standardmäßig ausgestatteten Routinelabors, EHEC schnell und sicher nachzuweisen. Lediglich ein Thermocycler und ein Schüttler sind an zusätzlichen Apparaten notwendig.
Wesentlich an der Erfindung ist, dass gleichzeitig vier für EHEC typische Gene in einem einzigen Schritt (Multiplex- Verfahren sowohl für Amplifizierung als auch für Hybridisierung) identifiziert werden können, wobei drei davon absolut notwendig für die Bewertung einer Probe auf EHEC des Serotyps O157 sind (SLTl, SLT2, rfbE) und das vierte Gen (eaeA) weitere Informationen liefert. Ferner wird erfindungsgemäß eine Amplifikations- Positivkontrolle (Primer und Sonden für die Detektion eines Abschnitts aus einem beliebigen Gen humanen oder nicht-humanen Ursprungs) inkludiert.
Sämtliche im Test-Kit verwendeten DNA-Sequenzen werden so ausgewählt und aufeinander abgestimmt, dass alle Gene in der selben Reaktion amplifiziert und danach auch gemeinsam detektiert werden können, ohne daß irgendwelche unspezifischen (Kreuz)Reaktionen trotz Durchführung bei Raumtemperatur auftreten. Damit ist eine verläßliche und sensitive Detektion von enterohämorrhagischen SLT-bildenden Escherichia coli - Stämmen bzw. des E. coli Serotyps 0157, der auch bei Fehlen der SLT-Gene offensichtlich in seltenen Fällen HUS auslösen kann, relativ einfach und schnell möglich.
Neben dem Nachweis des Serotyps O157 ist aber auch die Detektion von SLT-Genen möglich, die in anderen E. co/z'-Serotypen und sogar in anderen Bakteriengattungen vorkommen und dort die gleiche Erkrankung verursachen können (Paton, AW, and Paton, JC (1996): Enterobacter cloacae Producing a Shiga-Like Toxin II-Related Cytotoxin Associated with a Gase of Hemolytic-Uremic Syndrome. J Clin Microbiol 34 (2): 463-465; Tschäpe, H, et al. (1995): Verotoxigenic Citrobacter freundii associated with severe gastroenteritis and cases of haemolytic uraemic syndrome in a nursery school: green butter as the infection source. Epidemiol Infect 114: 441-450). Die gemäß der Erfindung erstellbaren Protokolle stellen somit ein sehr wertvolles Werkzeug für die Routineanalytik in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, aber auch zur Charakterisierung von aus beliebigen Quellen isolierten unbekannten E. coli - Stämmen dar.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des SLTl -Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:lund SEQ ID NO:2 besitzt.
Vorzugsweise besitzt die Fangsonde zur Hybridisierung des SLTl -Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:3. Die Nukleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt SEQ ID NO:4.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des SLT2-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6 besitzt.
Vorzugsweise besitzt die Fangsonde zur Hybridisierung des SLT2-Gen-Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:7. Die Nukleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt SEQ ID NO:8.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des rßE-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO: 10 besitzt.
Vorzugsweise besitzt die Fangsonde zur Hybridisierung des rfbE-Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l 1. Die Nukleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt SEQ ID NO: 12.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des eaeA-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14 besitzt.
Vorzugsweise besitzt die Fangsonde zur Hybridisierung des e a^-Gen-An plifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 15. Die Nukleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt SEQ ID NO: 16. Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass als Kontrollgen das humane KCNJ9-Gen vorgesehen ist. Das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des humanen KCNJ9-GGΏ.S besitzt vorzugsweise die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18.
Vorzugsweise besitzt die Fangsonde zur Hybridisierung des XCNJP-Gen-Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 19. Die Nukleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt SEQ ID NO:20.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid für eine Hybridisierungs-Negativkontrolle vorgesehen ist, welches an einer festen Oberfläche immobilisiert ist.
Die Negativ-Kontrolle kann beispielsweise auch aus einer Mischung von mehreren Zufallsoligonukleotiden bestehen. Vorzugsweise besitzen die Oligonukleotide für die Hybridisierungs-Negativkontrolle die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 und SEQ ID NO:24.
Vorzugsweise ist als visuell detektierbare Markierung der Detektorsonden eine Kopplung mit Alkalischer Phosphatase vorgesehen, welche mittels enzymatischer Umsetzung von organischen Farbstoffen eine erfolgte Hybridisierung sichtbar macht.
Nachfolgend sind DNA-Sequenzen und Methoden zur Verwendung im erfindungsgemäßen Test-Kit zum Nachweis von Fragmenten aus vier für EHEC charakteristischen Genen beschrieben, wobei diese Fragmente durch die Verwendung einer thermostabilen DNA- Polymerase gemeinsam in derselben Reaktion amplifiziert werden. Die dabei entstehenden doppelsträngigen DNA-Fragmente werden danach in Einzelstränge zerlegt (denaturiert), und einer der jeweiligen Einzelstränge wird mittels Hybridisierung mit an einer beliebigen festen Oberfläche (Membran, Mikrotiterplatte, Elektrode, Chip, Polystyrolkügelchen oder Ähnliches) gebundenen Oligonukleotiden (Fangsonden), deren Nukleotidsequenzen jeweils komplementär zu den betreffenden Einzelsträngen sind, gebunden. Gleichzeitig erfolgt eine Hybridisierung dieses Komplexes mit weiteren jeweils passenden Oligonukleotiden (Detektorsonden), die an weitere jeweils komplementäre Stellen der DNA-Einzelstränge binden, und die mit einer Markierung versehen sind, die visuell direkt oder indirekt detektierbar ist (siehe Fig. 1). Es wäre aber auch eine andere optische, eine autoradiographische oder elektrochemische Detektion möglich. Die einzelnen bevorzugten DNA-Sequenzen (Primerpaare) für die Amplifizierung von vier für EHEC charakteristischen Genabschnitten und der internen PCR/Hybridisierungs- Positivkontrolle wurden insbesondere geeignet zur gemeinsamen Verwendung in einer einzigen Reaktion (Multiplex-Reaktion) entworfen. Außerdem wurde angestrebt, möglichst kleine und in ihrer Größe ähnliche Amplifizierungsprodukte zu bilden, um eine möglichst hohe und auch ähnliche Amplifizierungseffizienz für die einzelnen Genabschnitte und eine möglichst kurze Reaktionszeit bei der Amplifzierung zu erreichen.
Die bevorzugten DNA-Sequenzen für die an die feste Oberfläche gebundenen Fangsonden sowie für die markierten Detektorsonden wurden weiters so gewählt, daß für alle DNA- Sequenzen eine spezifische Hybridisierung und somit auch ein spezifischer Nachweis unter den gleichen Bedingungen, und zwar bei Raumtemperatur (20-35°C), ermöglicht wird (Multiplex-Hybridisierung).
Zur Amplifizierung und zur Detektion eines Teils des SLTl -Gens aus EHEC haben sich DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 2 bis 4 als besonders effektiv erwiesen. Die in den Ansprüchen 5 bis 7 geoffenbarten DNA-Sequenzen sind auf die Amplifizierung und die Detektion des in EHEC ebenfalls vorkommenden SLT2-Gens und der meisten seiner Varianten gerichtet. Die Gegenstände der Ansprüche 8 bis 10 bilden DNA-Sequenzen, die geeignet zur Amplifizierung und zur Detektion eines Teils des rfbE-Gens aus E. coli - Stämmen (insbesondere O157:H7), die das O157 - Antigen aufweisen, sind. Die Oligonukleotide, die in den Ansprüchen 11 bis 13 beschrieben sind, dienen der Amplifizierung und der Detektion eines Teils des eaeA-Gcns aus E. coli - Stämmen. Die Ansprüche 15 bis 17 beschreiben Oligonukleotide zum Nachweis und zur Detektion des humanen KCNJ9-Gens als interner Positivkontrolle für den Test. Oligonukleotide als Negativkontrolle für die Hybridisierung sind schließlich in Anspruch 19 angeführt.
Im Folgenden wird die Erfindung durch einen ein mehrteiliges, beschreibendes Beispiel umfassenden Beispielsteil näher erläutert.
Beispielsteil:
Material und Methoden:
Bakterien-Stämme : Enterohämorrhagische Escherichia co/z'-Stämme stammen von der American Type Culture Collection (ATCC). Tabelle 1 zeigt eine Auflistung der verwendeten Stämme und der Gene, die jeweils vorhanden sind. Die Stämme wurden auf Plate-Count- Agarplatten gehalten, Über-Nacht-Kulturen wurden in flüssigem LB-Medium hergestellt.
Ziel-Sequenzen: Die DNA-Sequenzen für SLT-, rflE - , eaeA - und KCNJ9 - Gene, die für das Design von geeigneten Oligonukleotiden verwendet wurden, stammen aus der GenBank Datenbank der NIH (National Institutes of Health, www.ncbi.nlm.nih. gov ) und wurden mit Hilfe von DNA-Analysesoftware wie GeneRunner (www, generunner.com) bzw. PC/Gene (Intelligenetics Inc., Genf, Schweiz) aufbereitet und analysiert. Nach multiplen Sequenzvergleichen (Higgins, D. G. und Sharp, P. M. (1988): CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73 (1): 237-244) wurden stark konservierte Bereiche der jeweiligen Gene ausgesucht. In diesen Bereichen wurden dann Amplifizierungsprimer, Fangsonden und Detektorsonden festgelegt (Rychlik, W., Spencer, W. J., and Rhoads, R. E.: (1990): Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucl. Acids Res. 18 (21): 6409-6412), wobei darauf geachtet wurde, daß sich die Annealingtemperaturen aller Primer für die Multiplex-Amplifizierungsreaktion nicht zu stark voneinander unterscheiden. Ebenso wurde versucht, Sonden mit möglichst ähnlicher Schmelztemperatur zu finden. So sollte ein gleichzeitiger Nachweis aller bisher bekannten Varianten aller betreffenden Gene unter denselben Bedingungen erreicht werden.
Primer-Oligonukleotide, Fangsonden und Detektorsonden: Die Sequenzen der Primer und Sonden sind in Tabelle 2 bzw. im angeschlossenen Sequenzprotokoll angegeben. Fangsonden weisen am 5'- Ende zusätzlich zur spezifischen Sequenz 12 Desoxy-Thymidine als „Abstandshalter" (Spacer) zur Membran auf. Sämtliche Oligonukleotide ausgenommen markierte Detektorsonden wurden von VBC-GENOMICS Bioscience GmbH (Rennweg 95B, 1030 Wien, Österreich) bezogen, Detektorsonden wurden von der Firma DNA Technology A/S (Science Park Aarhus, Gustav Wieds Vej 10A, DK-8000 Aarhus, Dänemark) bezogen und waren im beschriebenen Fall mit dem Enzym Alkalische Phosphatase gekoppelt (Hermanson, G. T: Enzyme Conjugation to DNA. In: Bioconjugate Techniques, Kapitel 17, S. 662-668, Academic Press, San Diego, California, USA, ISBN 0-12-342336-8). Oligonukleotide wurden mittels Phosphoramidit-Chemie (Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H. (1981): Deoxynucleoside phosphoramidites — a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862) in automatisierten Systemen synthetisiert.
Immobilisierung der Fangsonden auf Membranen zur Verwendung als Teststreifchen: Fangsonden wurden in 5xSSC (20x SSC = 3M NaCl und 0,3M Tri-Natriumciτrat-Dihydrat) in einer Konzentration von 2 μg / μl gelöst. Je 1 μg (0,5 μl) der jeweiligen Fangsonden wurden nebeneinander auf in Streifchen geschnittene positiv geladene Nylonmembran (Röche Diagnostics GmbH, Engelhomgasse 3, A-1211 Wien, Österreich) mittels Mikropipette oder mittels Replikator aufgetragen. Als Negativkontrolle diente eine Mischung aus 4 verschiedenen Oligonukleotiden mit zufälliger Nukleotidsequenz. Die aufgetragene DNA wurde mittels UV-crosslinking immobilisiert (7 Minuten, UV-C Lampe, Abstand ca. 30 cm). Reihenfolge von links nach rechts: SLT1-CPD, SLT2-CPD, RFB-CPD1, EAE-CPD, KCN- CPD, Mischung aus RANl-4 (Fig. 2 und 3). Streifchen wurden danach eine Stunde in Prähybridisierungslösung (5xSSC (20x SSC = 3M NaCl und 0,3M Tri-Natriumcitrat- Dihydrat), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1% Blocking Reagenz (Röche), 100 μg / ml denaturierte Heringsperma-DNA (Röche) vorgeblockt (1 ml pro Teststreifen) und getrocknet bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Fleischproben: Faschiertes gemischtes Schweine- und Rindfleisch wurde bei einem Fleischhauer gekauft und bis zur Verwendung gekühlt aufbewahrt.
Keimzahlbestimmung: Nach Kalibrierung der Meßmethode für alle verwendeten Stämme durch Vergleich der Ergebnisse mit den Ergebnissen aus der Plate-Count-Methode (Kolonienzahl auf Platten) wurde die Keimzahl der zur Inokulation verwendeten Über-Nacht- Kulturen von EHEC mittels BacTrac 4100 - Analysesystem (SY-LAB Geräte GmbH, Tullnerbachstraße 61-65, 3011 Neupurkersdorf, Österreich) nach Vorgabe des Herstellers impedimetrisch bestimmt.
Anzucht und Voranreicherung: Je 25 g Faschiertes wurden in Stomacherbeutel mit Filtereinsatz (Bagfilter von Interscience, F-78860 St. Nom, Frankreich) eingewogen, mit 225 ml Anreicherungsmedium (gepuffertes Peptonwasser von Oxoid (CM 509) + 5 g / L Lactose) versetzt, im Stomacher eine Minute lang homogenisiert, mit Verdünnungen von EHEC- ÜberNacht-Kulturen mit bekannter Keimzahl inokuliert und bei 37 ° C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beimpfung (4, 8 und 15 Stunden) wurden für DNA- Extraktionen Proben entnommen.
TestdurcMührung:
DNA-Extraktion:
Genomische DNA aus EHEC-Stämmen (Reinkulturen) wurde mittels kommerziell erhältlicher Spin Column Kits (NucleoSpin™ Tissue Kit von Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, P.O. Box 10 13 52, D-52313 Düren, Bundesrepublik Deutschland bzw. High Pure PCR Template Preparation Kit von Röche Diagnostics GmbH, Engelhomgasse 3, A-1211 Wien, Österreich) aus einfachen Über-Nacht-Kulturen isoliert. DNA-Konzentrationen wurden in einem SmartSpec3000 Spektrophotometer (Bio-Rad Laboratories Ges. m. b. H., Auhofstrasse 51-55, A-1130 Wien, Österreich) nach Standardmethoden bestimmt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, 1989, Anhang E.5).
DNA aus den Fleischproben wurde durch folgendes Vorgehen isoliert:
Zentrifugation von 1 ml Kulturüberstand der Fleischprobe in 1,5 ml Röhrchen in einer
Eppendorfzentrifuge (5 Minuten, 16.000 g)
Abheben und Verwerfen des Überstands, Aufnahme der sedimentierten Bakterien in 1 ml sterilem destilliertem Wasser, gründliche Resuspendierung
Abzentrifugieren der Bakterien wie oben und Resuspendierung des Bakterien-Pellets in 100 μl ( bei 4-8 Stunden Inkubation) bzw. 200 μl (15 Stunden Inkubation) sterilem destilliertem Wasser.
Erhitzen der Bakteriensuspension auf 100 °C (20 Minuten, Heizblock)
Abzentrifugieren der Zellreste wie oben und Transfer von 80 bzw. 170 μl des resultierenden Überstandes in frische Röhrchen.
Aufbewahrung der Proben bis zur Amplifizierung bei -20 ° C.
Die DNA wurde für die PCR 1 + 9 mit Wasser für die Molekularbiologie (Sigma,
Hebbelplatz 7, A-l 100 Wien, Österreich, Kat. No. W4502) verdünnt.
Für Spezifitätstests wurden 100 μl Über-Nacht-Kulturen aller vorhandenen Bakterienstämme der firmeneigenen Stammsammlung aufgekocht, und der Überstand nach Abzentrifugieren der ZeHtrümmer für die PCR verwendet.
Multiplex-DNA-Amplifizierung:
Amplifizierungsreaktionen erfolgten standardmäßig mittels thermostabiler DNA-Polymerase (Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Schare, S. S., Higuchi, R., Hörn, G. T., Mullis, K. B., und Erlich, H. A. (1988): Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491). Multiplex-Aufamplifizierungen wurden mit folgendem Zeit/Temperaturprofil in einem GP-001 Thermocycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, N.S.W. Australien) und einem Volumen von 25 μl durchgeführt: 15 Minuten Denaturierung bei 95 °C, dann 2 Zyklen mit 30 Sekunden Denaturierung bei 95 °C, 30 Sekunden Annealing bei 65 °C und 30 Sekunden Extension bei 72 °C. Anschließend 40 Zyklen mit 30 Sekunden Denaturierung bei 95 °C, 30 Sekunden Annealing, wobei die Temperatur 5 Zyklen lang in jedem Zyklus um 1 °C abgesenkt wurde, bis 60 °C erreicht waren (Touchdown-Amplifizierung), 30 Sekunden 72 °C, abschließende Extension 10 Minuten bei 72 °C.
Reaktionsbedingungen (Endkonzentrationen): lx Amplifizierungspuffer, 2,5 mM MgCl2 (beides von Qiagen, Max-Volmer-Straße, D-40724 Hilden, Bundesrepublik Deutschland), Nukleotidmix (je 200 μM dATP, dGTP, dCTP und dTTP oder je 200 μM dATP, dGTP, dCTP und 600 μM dUTP), je 0,15 μM SLTl-fl und SLTl-rl, je 1 μM SLT2-fl, SLT2-r2, RFB-fl, RFB-rl, EAE-fl, EAE-rl, KCN-fl und KCN-rl, 0,7 ng / μl Human-DNA (Sigma, Hebbelplatz 7, A-1100 Wien, Österreich, Kat. No. D7011), 0,8 μg / μl BSA (Sigma, Kat. No. A3912), 1-2,5 U thermostabile DNA-Polymerase (HotStar, Qiagen, Max- Volmer-Straße, D- 40724 Hilden, Bundesrepublik Deutschland), bei Bedarf und Verwendung von dUTP statt dTTP: 1 U Uracil-N-Glycosylase (Röche Diagnostics GmbH, Engelhomgasse 3, A-1211 Wien, Österreich). Nukleotidmix und einzelne Nukleotide von Genecraft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Münster, Bundesrepublik Deutschland.
Hvbridisierung:
Hybridisierangslösung (Endkonzentrationen): 5xSSC, 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1% Blocking Reagenz (Röche), 70 pM SLT1-CO, 240 pM SLT2-CO1, 448 pM RFB-CO, 660 pM EAE-COl, 200 pM KCN-CO. Eine Mischung der Detektionssonden wurde vor der Zugabe zur Hybridisierungslösung etwa 10 Minuten bei 45 ° C erwärmt.
10 μl der Proben aus der Multiplex- Amplifizierungsreaktion wurden mit 10 μl 0,4 M NaOH, 10 mM EDTA versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert. Denaturierte DNA einer Probe und ein vorgeblocktes Streif chen wurden jeweils gemeinsam in 0,5 ml Hybridisierungslösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (in einem sterilen 2 ml Plastikröhrchen).
Danach wurde das Streifchen zweimal mit mindestens 2 ml Waschlösung (0,lxSSC, 0,1% SDS) bei Raumtemperatur für mindestens 7 Minuten gewaschen.
Farbdetektion: Die Detektion erfolgte in diesem Beispiel enzymatisch mittels Umsetzung von NBT (Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid) und BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat) (AppliChem GmbH, Otto weg 10b, D-64291 Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) durch die an die Detektorsonden gekoppelte Alkalische Phosphatase. NBT-Stocklösung: 22,5 mg / ml NBT in 70% Dimethylformamid mit 0,25 M MgCl2. BCIP-Stocklösung: 37,5 mg / ml BCIP in Dimethylformamid. Die Streifchen wurden kurz in Substratpuffer ohne Substrate (0,1M Tris/HCl, pH 9,5) geschwenkt.
Inkubation der Streifchen in Substratpuffer mit Substraten (je 100 μl NBT- bzw.
BCIP-Stocklösung pro 10 ml Substratpuffer, 1 ml pro Streifchen) bei 37 ° C (bis zu 2
Stunden).
Abbruch der Farbreaktion durch Schwenken der Streifchen in destilliertem Wasser und Auswertung des Ergebnisses unmittelbar nach Trocknen der Streifchen.
Ergebnisse:
Multiplex-Amplifizierung/-Hybridisierung: Die in Material und Methoden beschriebenen Amplifizierungs- und Hybridisierungsbedmgungen lieferten sehr gute Ergebnisse mit allen verwendeten Proben. Die Signale für die einzelnen Gene waren genügend stark und unterschieden sich auch nicht zu sehr in ihrer Intensität. Es wurden keine Kreuzreaktionen zwischen den verschiedenen Amplifikaten festgestellt.
Spezifität Sensitivität: In Versuchen mit gereinigter genomischer DNA aus 5 verschiedenen EHEC-Stämmen konnten je nach Stamm bei Vorliegen von 1000 bis 10000 Genomäquivalenten pro Assay alle in den jeweiligen Stämmen vorhandenen Gene und die interne Positivkontrolle gefunden werden (Fig. 3).
Versuche mit künstlich kontaminierten Fleischproben zeigten, daß bei einer Anreicherungszeit von 8 Stunden bereits bei allen 6 verwendeten Stämmen (5 EHEC- Stämme, 1 EPEC-Stamm) der Nachweis aller vorhandenen Gene und der internen Positivkontrolle bei einer Inokulationsmenge von 1-10 EHEC / 25 g Faschiertem möglich ist (Fig. 2). Die positive Reaktion der Streifchen Nr. 62 und 66 bei eaeA könnte auf eine Kreuzkontamination bei der Aufarbeitung oder darauf zurückzuführen sein, daß tatsächlich in sehr geringen Mengen (< 10/ 25g) ein Mikroorganismus, der ein eaeA-Gen enthält, von Anfang an in der Probe vorhanden war. Dies wäre durchaus möglich, da die Probe vor der künstlichen Kontaminierung nicht sterilisiert wurde. Keiner der Bakterienstämme aus der firmeneigenen Stammsammlung zeigte eine positive Reaktion (Resultate nicht gezeigt) außer einem E. coli — Stamm (eaeA-Ge ). Dieser wurde noch einmal getestet, wobei festgestellt wurde, daß dieser Stamm tatsächlich ein eaeA-Gen besitzt.
Sequenzprotokoll - freier Text:
<210> 1 <223> Forward Primer für einen Teil des SLTl -Gens von Escherichia coli
<210> 2
<223> Reverse Primer für einen Teil des SLTl -Gens von Escherichia coli
<210> 3
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des SLTl -Gens
<210> 4
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des SLTl -Gens
<210> 5
<223> Forward Primer für einen Teil des SLT2-Gens von Escherichia coli.
<210> 6
<223> Reverse Primer für einen Teil des SLT2-Gens von Escherichia coli
<210> 7
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des SLT2-Gens
<210> 8
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des SLT2-Gens
<210> 9
<223> Forward Primer für einen Teil des r/δE-Gens von Escherichia coli
<210> 10
<223> Reverse Primer für einen Teil des rfbE-Gens von Escherichia coli
<210> 11
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des rfbE-Gens
<210> 12
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des rfbE-Gens
<210> 13
<223> Forward Primer für einen Teil des eaeA-Gens von Escherichia coli <210> 14
<223> Reverse Primer für einen Teil des eaeA-Gens von Escherichia coli
<210> 15
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des eaeA-Gens
<210> 16
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des eaeA-Gens
<210> 17
<223> Forward Primer für einen Teil des humanen KCNJ9-Gens
<210> 18
<223> Reverse Primer für einen Teil des humanen KCNJ9-Gens
<210> 19
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des XOVJ9-Gens
<210> 20
<223> Oligonukleotid zur Hybridisierung des amplifizierten Teils des KCNJ9-Gens
<210> 21
<223> Zufallsoligonukleotid
<210> 22
<223> Zufallsoligonukleotid
<210> 23
<223> Zufallsoligonukleotid
<210> 24
<223> Zufallsoligonukleotid Tabelle 1: Verwendete ATCC-Stämme von Escherichia coli
Figure imgf000019_0001
*: Haemolytisch-Uraemisches Syndrom
Tabelle 2: Primer-Oligonukleotide, Fangsonden und Detektorsonden
Figure imgf000020_0001
Legenden zu den Abbildungen:
Fig. 2: Hybridisierung künstlich kontaminierter Fleischproben
10 - 28: 4 Stunden Voranreicherung
29 - 47: Stämme wie bei 10-28, 8 Stunden Voranreicherung
48 - 66: Stämme wie bei 10 - 28, 15 Stunden Voranreicherung
67: ATCC 43895, 10 000 Genomäquivalente (Positiv-Kontrolle für Amplifizierung)
68-71 : Wasserkontrollen (Negativkontrollen für Amplifizierung)
10 = ATCC 43889, 1 - 10 cfu/25g
11 = ATCC 43889, 10 - 100 cfu/25g
12 = ATCC 43889, 100 - 1000 cfu/25g
13 = ATCC 43890, 1 - 10 cfu 25g
14 = ATCC 43890, 10 - 100 cfu/25g
15 = ATCC 43890, 100 - 1000 cfu/25g
16 = ATCC 43895, 1 - 10 cfu/25g
17 = ATCC 43895, 10 - 100 cfu/25g
18 = ATCC 43895, 100 - 1000 cfu 25g
19 = ATCC 35150, 1 - 10 cfu/25g
20 = ATCC 35150, 10 - 100 cfu/25g
21 = ATCC 35150, 100 - 1000 cfu/25g
22 = ATCC 23545, 1 - 10 cfu/25g
23 = ATCC 23545, 10 - 100 cfu/25g
24 = ATCC 23545, 100 - 1000 cfu/25g
25 = ATCC 43887, 1 - 10 cfu 25g
26 = ATCC 43887, 10 - 100 cfu/25g
27 = ATCC 43887, 100 - 1000 cfu/25g
28 = Negativkontrolle (keine künstliche Inokulierung)
Fig. 3: Nachweisgrenze
218 = ATCC 43889, 106 Genomäquivalente
219 = ATCC 43889, 105 Genomäquivalente
220 = ATCC 43889, 104 Genomäquivalente
221 = ATCC 43889, 103 Genomäquivalente
222 = ATCC 43889, 102 Genomäquivalente
223 = ATCC 43890, 106 Genomäquivalente
224 = ATCC 43890, 105 Genomäquivalente
225 = ATCC 43890, 104 Genomäquivalente
226 = ATCC 43890, 103 Genomäquivalente
227 = ATCC 43890, 102 Genomäquivalente
228 = ATCC 43895, 106 Genomäquivalente
229 = ATCC 43895, 105 Genomäquivalente
230 = ATCC 43895, 104 Genomäquivalente
231 = ATCC 43895, 103 Genomäquivalente
232 = ATCC 43895, 102 Genomäquivalente 233 = ATCC 35150, 106 Genomäquivalente
234 = ATCC 35150, 105 Genomäquivalente
235 = ATCC 35150, 104 Genomäquivalente
236 = ATCC 35150, 103 Genomäquivalente
237 = ATCC 35150, 102 Genomäquivalente
238 = ATCC 23545, 106 Genomäquivalente
239 = ATCC 23545, 105 Genomäquivalente
240 = ATCC 23545, 104 Genomäquivalente
241 = ATCC 23545, 103 Genomäquivalente
242 = ATCC 23545, 102 Genomäquivalente
243 = Negativkontrolle (Wasser)
244 - 246 = andere Proben

Claims

Patentansprüche :
1. Test-Kit zum Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli - Stämmen (EHEC), enthaltend:
• jeweils ein Primerpaar zur Amplifizierung mindestens eines Teils des SLT1- Gens, des SLT2-Gens, des rfbE-Gens, des eaeA-Gens und eines Kontrollgens in einer einzigen Reaktion sowie
• jeweils sowohl ein Oligonukleotid als Fangsonde als auch ein Oligonukleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate bei Raumtemperatur, wobei alle Fangsonden auf einer gemeinsamen festen Oberfläche immobilisiert sind und die Detektorsonden mit einer visuell detektierbaren Markierung versehen sind.
2. Test-Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des SLTl -Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:l und SEQ ID NO:2 besitzt..
3. Test-Kit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fangsonde zur Hybridisierung des SLTl -Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 3 besitzt.
4. Test-Kit nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz der Detektorsonde zur Hybridisierung des SLTl -Gen- Amplifikats SEQ ID NO:4 ist.
5. Test-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des SLT2-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6 besitzt.
6. Test-Kit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fangsonde zur Hybridisierung des SLT2-Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:7 besitzt.
7. Test-Kit nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz der Detektorsonde zur Hybridisierung des SLT2-Gen- Amplifikats SEQ ID NO: 8 ist.
8. Test-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des rfbE-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10 besitzt.
9. Test-Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fangsonde zur Hybridisierung des r M-Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:l 1 besitzt.
10. Test-Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz der Detektorsonde zur Hybridisierung des r M-Gen- Amplifikats SEQ ID NO: 12 ist.
11. Test-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des eaeA-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14 besitzt.
12. Test-Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Fangsonde zur Hybridisierung des eaeA -Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 15 besitzt.
13. Test-Kit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz der Detektorsonde zur Hybridisierung des eaeA-Gen- Amplifikats SEQ ID NO: 16 ist.
14. Test-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Kontrollgen das humane KCNJ9-Gen vorgesehen ist.
15. Test-Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung eines Teils des humanen KCNJ9-Gens die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 besitzt.
16. Test-Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Fangsonde zur Hybridisierung des humanen KCNJ9-Gen- Amplifikats die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 19 besitzt
17. Test-Kit nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz der Detektorsonde zur Hybridisierung des humanen KCNJ9-Gen- Amplifikats SEQ ID NO:20 ist.
18. Test-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid für eine Hybridisierungs-Negativkontrolle vorgesehen ist, welches an einer festen Oberfläche immobilisiert ist.
19. Test-Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass vier Oligonukleotide für die Hybridisierungs-Negativkontrolle vorgesehen sind, welche die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 und SEQ ID NO:24 besitzen.
20. Test-Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass als visuell detektierbare Markierung der Detektorsonden eine Kopplung mit Alkalischer Phosphatase vorgesehen ist, welche mittels enzymatischer Umsetzung von organischen Farbstoffen eine erfolgte Hybridisierung sichtbar macht.
PCT/AT2002/000222 2001-07-26 2002-07-26 Test-kit zum nachweis von enterohämorrhagischen $i(escherichia coli) - stämmen (ehec) Ceased WO2003010332A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02762153A EP1409742A2 (de) 2001-07-26 2002-07-26 Test-kit zum nachweis von enterohämorrhagischen escherichia coli-stämmen (ehec)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ATA1172/2001 2001-07-26
AT0117201A AT411832B (de) 2001-07-26 2001-07-26 Test-kit für den nachweis der bakteriellen gene slt1, slt2 und rfbe

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003010332A2 true WO2003010332A2 (de) 2003-02-06
WO2003010332A3 WO2003010332A3 (de) 2003-11-06

Family

ID=3686560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/AT2002/000222 Ceased WO2003010332A2 (de) 2001-07-26 2002-07-26 Test-kit zum nachweis von enterohämorrhagischen $i(escherichia coli) - stämmen (ehec)

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1409742A2 (de)
AT (1) AT411832B (de)
WO (1) WO2003010332A2 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005659A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Statens Serum Institut Diagnostics of diarrheagenic escherichia coli (dec) and shigella spp.
CN100441696C (zh) * 2004-10-22 2008-12-10 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 肠出血性大肠杆菌o157：h7菌株的检测方法
EP4382623A3 (de) * 2021-07-27 2024-10-16 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von stec und mindestens einer von salmonella, c. jejuni, c. coli und shigella

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5654417A (en) * 1995-04-14 1997-08-05 Children's Hospital And Medical Center Nucleic acid probes for detecting E. coli O157:H7
DE19814828A1 (de) * 1998-04-02 1999-10-07 Roche Diagnostics Gmbh Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
FR2777907B1 (fr) * 1998-04-28 2002-08-30 Pasteur Sanofi Diagnostics Sequences nucleotidiques pour la detection des escherichia coli enterohemorragiques (ehec)
DE19946296A1 (de) * 1999-09-28 2001-03-29 Roche Diagnostics Gmbh Multiplex-PCR zum Nachweis von EHEC-Infektionen

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005659A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Statens Serum Institut Diagnostics of diarrheagenic escherichia coli (dec) and shigella spp.
CN100441696C (zh) * 2004-10-22 2008-12-10 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 肠出血性大肠杆菌o157：h7菌株的检测方法
EP4382623A3 (de) * 2021-07-27 2024-10-16 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von stec und mindestens einer von salmonella, c. jejuni, c. coli und shigella

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003010332A3 (de) 2003-11-06
EP1409742A2 (de) 2004-04-21
AT411832B (de) 2004-06-25
ATA11722001A (de) 2003-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU651077B2 (en) Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor
Nocker et al. Discrimination between live and dead cells in bacterial communities from environmental water samples analyzed by 454 pyrosequencing
US6723505B1 (en) Method for identification of the indicators of contamination in liquid samples
US20120288864A1 (en) Detection of salmonella by real-time multiplex pcr
US6312930B1 (en) Method for detecting bacteria using PCR
Gutierrez et al. A quantitative PCR‐ELISA for the rapid enumeration of bacteria in refrigerated raw milk
Hofstra et al. Microbes in food processing technology
Yamazaki et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Campylobacter fetus
Chen et al. A rapid, sensitive and automated method for detection of Salmonella species in foods using AG‐9600 AmpliSensor Analyzer
Rademaker et al. Characterization of the diversity of ecologically important microbes by rep-PCR genomic fingerprinting
Abd-El-Haleem et al. Multiplex-PCR and PCR-RFLP assays to monitor water quality against pathogenic bacteria
EP1366189B1 (de) Nachweis von pathogenen bakterien
Baez et al. Nonradioactive colony hybridization assay for detection and enumeration of enterotoxigenic Clostridium perfringens in raw beef
AT411832B (de) Test-kit für den nachweis der bakteriellen gene slt1, slt2 und rfbe
Harris et al. The detection of foodborne pathogens by the polymerase chain reaction (PCR)
WO2005035789A1 (ja) アリサイクロバチラス属菌検出用プライマー
JP3525259B2 (ja) ペクチネータス属菌の検出
KR100248909B1 (ko) 중합효소 연쇄반응을 이용한 대장균 o157:h7의 다종 유전자 동시검출방법
KR102407237B1 (ko) 캠필로박터를 선택적으로 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 pcr 키트
DE10214153A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen mittels in situ-Hybridisierung und Durchflusszytometrie
Smith et al. Molecular diagnostics in food safety: rapid detection of food-borne pathogens
EP1772522A1 (de) Kontrolle der Konservierung mit Biomarkern
Kumar Modern trends to investigate foodborne Listeriosis
KR20110101612A (ko) 그람양성 식중독 유발 세균 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 이의 용도
Saini et al. Multiplexed Stn and PlcA based specific genetic marker for early detection of Salmonella enterica and Listeria monocytogenes in milk samples

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC PT SE SK TR BF BJ CF CG CI GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002762153

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 091622002

Country of ref document: AT

Date of ref document: 20030206

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 91622002

Country of ref document: AT

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002762153

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002762153

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP