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préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes et procédé pour la produire.
La presente invention concerne une préparation pharmaceutique contenant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes. En particulier, la présente invention concerne une préparation pharmaceutique stabi- lisée contenant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes qui est protégée contre la perte ou 1'in- activation du composant actif (c'est-à-dire le facteur de stimulation des colonies de granulocytes) due ä l'adsorption sur la paroi d'un récipient dans lequel la préparation est introduite, ou bien due ä l'association, ä la polymerisation ou à 1'oxydation de ce composant.
La chimiothérapie a été mise en pratique comme moyen pour traiter différentes maladies infectieuses, mais il a eté observé récemment que la chimiothé- rapie est ä l'origine de divers inconvénients cliniques graves, comme l'apparition d'organismesqui résìstent aux médicaments, la mutation d'organismes causaux et d'importants effets secondaires. Pour éviter ces inconvé- nients associés à la chimiotherapie au moyen d'agents thérapeutiques tels que les antibiotiques et bactéricides, des tentatives ont été faites en vue d'utiliser une substance qui active les capacités prophylactiques de 1'hôte d'un organisme infectieux et d'apporter ainsi une solution complète aux inconvénients précités de la chimiothérapie.
Parmi les differentes capacités prophylactiques de l'hote, la phagocytose bactéricide par les leucocytes exerce, croit-on, la plus grande influence à la période initiale d'une infection bactérienne et il est donc admis comme important d'augmenter la capacité anti-infectieuse de l'hôte en favorisant la croissance des neutrophiles et leur différentiation dans l'étant de maturité, Un. facteur de stimulation
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, des colonies de granulocytes (FSC-G) est l'une des substances fort utiles exerçant de tels effets et la Demanderesse a déjà déposé une demande de brevet à propos d'un agent anti-infectieux contenant un
FSC-G (demande de brevet japonais no 23777/1985).
Comme déjà indiqué, la chimiothérapie telle qu'elle est pratiquée couramment débouche sur divers inconvénients inéluctables et de grands efforts ont été consacrés à la mise au point d'une substance medicamenteuse qui soit capable d'activer les fonctions prophylactiques de l'hole ou du patient qui a été infecté.
Il va de soi que le FSC-G manifeste par luimême la capacité d'activer les fonctions prophylactiques de l'hole et il a été découvert aussi que le FSC-G exerce de plus grands effets thérapeutiques dans les applications cliniques lorsqu'il est utilisé conjointement avec une substance qui active les capacités prophylactiques de l'hole.
Le FSC-G est utilisé en très faible quantité et une préparation pharmaceutique contenant 0, 1 ä 500 (de preference 5 à 50jog) de FSC-G est habituellement administrée ä raison de 1 à 7 fois par semaine à l'adulte. Toutefois, le FSC-G a tendance à s'adsorber sur la paroi de son recipient, par exemple une ampoule injectable ou bien une seringue. Par conséquent, si le médicament est administré par injection sous une forme telle qu'une solution aqueuse, il s'adsorbe sur la paroi de son récipient, par exemple l'ampoule ou la seringue.
I1 en résulte soit l'incapacité du FSC-G à exercer pleinement son activite comme agent pharmaceutique, soit la nécessite d'incorporer le FSC-G en une quantité plus importante que nécessaire pour tenir compte des pertes possibles par adsorption.
De plus,-le FSC-G est labile. et très sensible
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, à des facteurs ambiants, comme la température, l'humidite, l'oxygène et le rayonnement ultraviolet. Sous l'effet de ces facteurs, le FSC-G subit des altérations physiques ou chimiques telles que l'association, la polymérisation et l'Oxydation et subit une forte perte d'ac- tivité. Ce phénomène rend difficile d'accomplir parfaitement un acte thérapeutique en administrant une très petite quantité de FSC-G de manière fort exacte.
11 est des lors necessaire de mettre au point une préparation pharmaceutique stable de FSC-G qui soit parfaitement protégée contre une baisse d'activité de son composant actif. Tel est le but principal de la présente invention qui a pour objet une préparation pharmaceutique stable de FSC-G.
La Demanderesse a exécuté des études détaillées afin d'augmenter la stabilité d'une préparation pharmaceutique contenant du PSC-G et a découvert que ce but peut etre atteint efficacement en ajoutant un surfactif, un saccharide, une protéine ou un composé de haut poids moléculaire pharmaceutiquement acceptables.
Par conséquent. la préparation pharmaceutique stable contenant du FSC-G de la présente invention est caractérisée par le fait qu'elle contient tant du FSC-G qu'au moins une substance choisie dans la classe formée par un surfactif, un saccharide, une protéine et un com-
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posé de haut poids moleculaire pharmaceutiquement accepose p tables.
Le FSC-G qui doit être contenu dans la prépa- ration pharmaceutique de la présente invention peut etre obtenu suivant l'un quelconque des procédés tels que ceux décrits dans les mémoires de demandes de brevets japonais n* 153273/1984,269455/1985, 269456/1985,
270838/1985 et 270839/1985. Par exemple, un FSC-G humain peut être préparé soit par culture d'une lignée : cellulaire (numéro d'accès CNCM 1-315 ou 1-483) isolée
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à partir de cellules de tumeurs recueillies chez des patients porteurs d'un cancer de la cavité orale, soit par expression d'un ADN recombinant (qui a été préparé à 1'intervention d'un gène codant pour le FSC-G humain) dans une cellule hôte appropriée (par exemple E. coli des cellules C 127 ou des cellules d'ovaire d'un hamster de Chine).
Tout FSC-G humain qui a été purifié jusqu'à un degré élevé peut être utilisé comme FSC-G pour la préparation pharmaceutique de la présente invention. Les FSC-G humains préférés sont ceux obtenus par isolement à partir du liquide surnageant de la culture d'une cellule produisant du FSC-G humain, ainsi qu'un polypeptide ou une glycoprotéine ayant l'activite de FSC-G humain
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qui s'obtient en transformant un hôte à l'aide d'un vecteur recombinant auquel se trouve incorporé un gene codant pour un polypeptide ayant l'activiste de FSC-G humain.
Deux exemples particulièrement préférables de FSC-G humains sont les suivants : (l) le FSC-G humain ayant les propriétés physicochimi-
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ques ci-après : i) poids moleculaire : environ 19. 000+1000 tel que mesure par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium ; ii) point isoélectrique : ayant au moins l'un des trois points isoélectriques pl = 5, 5 + 0, 1, pI = 5, 8 + 0, 1 et pI . 6,1 + 0,1; iii) absorption dans l'ultraviolet :
ayant un maximum d'absorption à 280 nm et un minimum d'absorption à
250 nm : iv) séquence des aminoacides des 21 résidus à partir de l'extremiste N-terminale :
H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser- - Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-Val-
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. (2) le FSC-G humain contenant soit un polypeptide ayant l'activiste de facteur de stimulation des granulo- cytes humains, qui est représenté par tout ou partie de la séquence des aminoacides ci-après, soit une glycoprotéine comportant ce polypeptide et une chaine de sucres :
(Met) Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro
Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val
Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
Glu Lys Leu (Val Ser Glu) mcys Ala Thr Tyr Lys
Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly
His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser
Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly
Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu
Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu
Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile
Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala
Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly
Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu
Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala
Gin Pro (étant entendu que m représente 0 ou l et n représente 0 ou 1).
Pour des détails du procédé de préparation de ces deux types de FSC-G, on peut se référer aux memoires des demandes de brevets japonais n* 153273/1984, 269455/1985, 269456/1985, 270838/198'5 et 270839/1985, toutes de la Demanderesse.
Un autre procédé qui peut etre applique consiste ä fusionner une cellule produisant du FSC-G avec une cellule tumorale maligne autoproliférante et ä cultiver l'hybridome résultant en presence ou en l'absence d'unagentmutogène.
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La solution contenant le FSC-G humain obtenue peut être conservée à l'état congelé après avoir été davantage purifiée et concentrée, si nécessaire, suivant toute technique connue. En variante, la solution peut être conservée après avoir été déshydratée, par exemple par lyophilisation.
Tous les FSC-G humains ainsi préparés peuvent être traités conformément ä la présente invention pour donner des préparations pharmaceutiques stables contenant du FSC-G.
Des exemples typiques pour le surfactif qui est utilisé pour former la preparation pharmaceutique stable contenant du FSC-G de la presente invention sont les suivants : les surfactifsnonioniquesayant un bilan hydrophile-lipophile de 6 - 18, comme les esters d'acides aliphatiques du sorbitan {par exemple monocaprylate de sorbitan, monolaurate de sorbitan et monopalmitate de sorbitan), les esters d'acides aliphatiques du glycérol (par exemple monocaprylate de glycérol, monomyristate de glycérol et monstéarate de glycerol), les esters d'acides aliphatiques du polyglycerol (par exemple monostéarate de decaglyceryle, distéarate de décaglycéryle et monolinoléate de décaglycéryle),
les esters d'acides aliphatiques du polyoxyethylene sorbitan (par exemple monolaurate de polyoxyéthylène sorbitan, monooléate de polyoxyethylene sorbitan, monostéarate de polyoxy- éthylène sorbitan, monopalmitate de polyoxyethylene sorbitan, trioleate de polyoxyethylene sorbitan et tristéarate de polyoxyethylene sorbitan), les esters d'acides aliphatiques du polyoxyéthylène sorbitol (par exemple tétrastéarate de polyoxyethylene sorbitol et tétra-oleate de polyoxyethylene sorbitol), ies esters d'acides aliphatiques du polyoxyethylene glycerol (par exemple monostéarate de polyoxyethylene glyceryl),
les esters d'acides aliphatiques de polyethylèneglycol
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(par exemple distéarate de polyéthyleneglycol), les éthers polyoxyéthylène-alcoyliques (par exemple ether polyoxyéthylène-laurylique), les éthers polyoxyéthylène-
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polyoxypropylene-alcoyliques tpar exemple éther polyoxyéthylene-polyoxypropylène-glycolique, éther polyo oxyethylene-polyoxypropylene-propylique et éther poxye lyoxyéthylène-polyoxypropylène-cétylique), les éthers polyoxyéthylène-alcoylphényliques (par exemple éther polyoxyéthylène-nonylphénylique), l'huile de ricin po- lyoxyéthoxylée, l'huile de ricin hydrogénée polyoxyétho- xylée (huile de ricin hydrogénée polyoxyéthylée),
les dérivés polyoxyéthylés de cire d'abeilles (par exemple sorbitol polyoxyéthylé-cire d'abeilles), les dérivés polyoxyéthyléniques de lanoline (par exemple polyoxy- éthylène-lanoline), et les amides d'acides aliphatiques polyoxyéthylés (par exemple amide stéarique polyoxy- éthyle) ;
les surfactifs anioniques, comme les sels d'acidesalcoylsulfuriques comprenant un radical. alcoyle en C, -C.- (par exemple céty1sulfata de sodium, lau- rylsulfate de sodium et oléylsulfate de sodium), les sels d'acides polyoxyéthylène-alcoyléther sulfuriques dont le nombre molaire moyen d'addition d'oxyde d'éthy- 1ène est de 2 à 4 et dont le radical alcoyle compte
10 ä 18 atomes de carbone (par exemple polyoxyethylene laurylsulfate de sodium), les sels d'esters alcoyl- sulfosucciniques dont le radical alcoyle compte 8 à
18 atomes de carbone (par exemple 1aurylsulfosuccinate de sodium) ;
et les surfactifs natures, comme la léci- thine, les glycérophospholipides, les sphingophospholi- pidestpar exemple sphingomyéline), et les esters d'acides aliphatiques du saccharose dont l'acide ali- phatique compte 12 à 18 atomes de carbone. Ces surfac- tifs peuvent être évidemment utilisés indépendamment ou en melange.
Les surfactifs énumérés ci-dessus sont de
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preference utilises en quantités de 1 à 10.000 parties en poids par partie en poids du FSC-G.-
Le saccharide à utiliser pour produire la préparation pharmaceutique stable contenant du FSC-G de la présente invention peut être choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides, de même que parmi leurs esters phosphoriques et les nucléotides qui en dérivent à la condition qu'ils sojent pharmaceutiquement acceptables.
Des exemples typiques en sont donnés ci-après : les sucres-alcools trivalents et superieurs comme le glycérol, l'erythri- tol, l'arabitol, le xylitol, le sorbitol et le mannitol ; les sucres acides comme l'acide glucuronique, l'acide iduronique, l'acide neuraminique, l'acide galacturonique, l'acide gluconique, l'acide mannuro-
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nique, l'acide cétoglycolique, l'acide cetogalactonique et l'acide cetogulonique : l'acide hyaluronique et ses sels, le chondroitinesulfate et ses sels, l'hepa- rine, l'inuline, la chitine et ses dérivés, le chitosane et ses dérivés, la dextrine, le dextrane d'un poids moléculaire moyen de 5000 à 150. 000, outre l'acide alginique et ses sels. Tous ces saccharides peuvent être utilises avec avantage indépendamment ou bien en melange.
Les saccharides énumérés ci-dessus sont de préférence utilisés en quantités de 1 ä 10. 000 parties en poids par partie en poids de FSC-G.
Des exemples typiques pour la protéine ä utiliser dans la production de la préparation pharmaceutique stable contenant du FSC-G de la. présente invention sont notamment l'albumine de sérum humain, la globuline de sérum humain, la gélatine, la gélatine traitée par un acide (poids moléculaire moyen de 7000 à 100. 000), la gélatine traitée par un alcali (poids mo- loculaire moyen de 7000 à 100. 000} et le collagène. 11
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va de soi que ces protéines peuvent etre utilisées in- dépendamment ou bien en mélange.
Les protéines utilisées ci-dessus sont de pré- férence utilisées en quantités de 1 à 20. 000 parties en poids par partie en poids de FSC-G.
Des exemples typiques pour le composé de baut poids moléculaire ä utiliser pour produire la prépara- tion pharmaceutique stable contenant du FSC-G de la présente invention sont notamment des polymères naturels comme l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique et l'hydroxyéthylcel- lulose et des polymeres synthetiques comme le polyethy- leneglycol (poids moleculaire de 300 ä 6000), l'alcool polyvinylique (poids moleculaire de 20. 000 a 100. 000} et la polyvinylpyrrolidone (poids moléculaire de 20.000 ä 100.000).
Il va de soi que ces composes de haut poids moléculaire peuvent être utilisés isolement ou en com- binaison.
Les composes de haut poids moléculaire énumé- rés ci-dessus sont avantageusement utilisés en quantités de 1 ä 20. 000 parties en poids par partie en poids de
FSC-G.
En plus du surfactif, du saccharide, de la proteine ou du composé de haut poids moleculaire men- tionné ci-dessus, au moins un composé choisi entre un aminoacide, un agent réducteur sulfuré et un antioxydant peut être incorpore pour produire la prépara- tion pharmaceutique stable contenant du FSC-G de la présente invention. Des exemples pour les aminoacides sont notamment la glycine, la thréonine, le tryptophane, la lysine, l'hydroxylysine, l'histidine, l'arginine, la cystéine, la cystine et la méthionine.
Des exemples pour l'agent réducteur sulfure sont notamment la Nacétylcystéine, la N-acetylhomocysteine, l'acide thioctique, le thiodiglycol, la thioéthanolamine,. le thio-
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glycérol, le thiosorbitol, l'acide thioglycolique et ses sels, le thiosulfate de sodium, l'hydrogénosulfite de sodium, le pyrosulfite de sodium, le sulfite de sodium, l'acide thiolactique, le dithiothreitol, le glutathion et un agent réducteur sulfuré modéré compre- nant un radical sulfhydryle, comme un acide thioalcanoi- que en C.-C-.
Les exemples pour les antioxydants sont notamment l'acide érythorbique, le dibutylhydroxytoluène, le butylhydroxyanisole, le dl-K'tocopherol, l'acetate de tocophérol, l'acide L-ascorbique et ses sels, le palmitate d'acide L-ascorbique, le stéarate d'acide L-ascorbique, le gallate de triamyle, le gallate de propyle et des agents chelatants tels que l'ethylenediaminetetra-acetate disodique (EDTA), le pyrophosphate de sodium et le métaphosphate de sodium.
Les aminoacides, agents réducteurs sulfures et antioxydants ou leurs mélanges ci-dessus sont utilises de préférence en quantités de 1 ä 10. 000 parties en poids par partie en poids de FSC-G.
Aux fins de formuler la préparation stable contenant du FSC-G de la présente invention sous une forme dosée appropriée, un ou plusieurs des agents suivants peuvent être incorpores : un diluant, un auxiliaire de solubilisation, un agent d'isotonie, un excipient, un modificateur du pH, un édulcorant et un tampon.
La préparation pharmaceutique stabilisée de FSC-G de la présente invention peut être formulee en vue de l'administration par voie orale ou de l'administration par voie parenterale, par exemple par injection de différentes façons, et diverses formes dosées peuvent etre utilisées suivant le mode spécifique d'administration.
Des formes dosées typiques sont celles destinées ä l'administration par voie orale comme les comprimes, pilules, capsules,-granules et suspensions ;
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lessolutions, suspensions et préparations lyophilisées destinées principalement à l'injection intraveineuse, à l'injection intramusculaire, ä l'injection sous-cutanée et à l'injection intracutanée, outre celles destinées à l'administration transmucosale comme les suppositoires rectaux, les formes à usage nasal et les suppositoires vaginaux.
Conformément à la présente invention, au moins une substance choisie dans la classe formee par un surfactif, un saccharide, une protéine et un composé de haut poids moléculaire est ajoutee à une préparation pharmaceutique contenant du FSC-G de façon à l'empêcher de s'adsorber sur la paroi de son récipient ou d'une seringue et simultanément lui conférer de la stabilité à long terme.
Le mécanisme détaillé suivant lequel les substances mentionnées ci-dessus stabilisent le FSC-G ou l'empechentd'etreadsorben'est pas encore parfaitement élucidé. En présence d'un surfactif,. la surface du FSC-G, qui est une protéine hydrophobe, serait revêtue par le surfactif jusqu'à etre solubilisée de sorte que le FSC-G présent à l'état de traces est effectivement empêché d'etre adsorbé par la paroi de son récipient ou sa seringue. Un saccharide ou un compose hydrophile de haut poids moleculaire formerait une couche hydratée entre le FSC-G et la surface adsorbante de la paroi du récipient de la seringue, empêchant ainsi efficacement l'adsorption du FSC-G.
Une protéine entrerait
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en compétition avec le FSC-G pour l'adsorption sur la en compe a paroi du récipient ou de laseringue, empêchant ainsi efficacement l'adsorption du FSC-G.
Outre la prévention de l'adsorption du FSC-G, les substances mentionnées ci-dessus contriburaient aussi à empêcher l'association ou la polymerisation des molecules-de FSC-G. En présence d'un surfactif,
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d'un saccharide, d'une protéine ou d'un compose de haut poids moléculaire, les différentes molécules de FSC-G sont dispersées au sein de ces substances et l'interaction entre les molécules de FSC-G est suffisamment affaiblie pour induire une baisse sensible de leur probabilité d'association ou de polymérisation. En outre, ces substances ralentiraient l'autoxydation du FSC-G qui est accélérée aux températures et humidités élevées ou empêcheraient le FSC-G de s'associer ou de se polymériser en conséquence de son autoxydation.
Ces effets de ralentissement de l'autoxydation du FSC-G
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ou de l'obstacle mis ä son association ou à sa poly- merisation seraient davantage accentués par addition d'un aminoacide, d'un agent réducteur sulfuré ou d'un antioxydant.
Les difficultés décrites ci-dessus sont par- ticulièrement notables dans les solutions pour l'injec- tion et dans les suspensions, mais elles se manifestent aussi pendant la formulation du FSC-G sous d'autres formes dosées telles que des comprimés. L'addition de surfactifs, de saccharides, de protéines ou de com- posés de haut poids moléculaire est efficace aussi dans ce dernier cas.
Grâce à l'addition d'au moins une substance choisie entre un surfactif, un saccharide, une protéine et un composé de haut poids moléculaire, le FSC-G est hautement stabilisé et conserve son activité pendant une longue durée, ainsi que le démontrent les exemples ci-après. Pour arriver à ce résultat, la quantité de chacune de ces substances, et en particulier ä la limite inférieure, est critique et les intervalles ci-après sont souhaitables : 1 à 10. 000 parties en poids de sur- factif, 1 ä 10. 000 parties en poids de saccharide,
1 ä 20. 000 parties en poids de protéine et 1 à 20. 000 parties en poids de compose de haut poids moléculaire,
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par partie en poids de FSC-G.
Conformément à la présente invention, un surfactif, un saccharide, une protéine et/ou un composé de haut poids moléculaire sont utilises en une concen- tration spécifiée et ceci est efficace non seulement pour empêcher le FSC-G d'être adsorbé sur la paroi de son récipient ou d'une seringue, mais aussi pour augmenter la stabilité d'une préparation pharmaceutique contenant du FSC-G. Par conséquent, il devient possible de réaliser l'administration d'une dose faible, mais hautement précise de FSC-G à des patients et du fait que le FSC-G est onéreux, son utilisation efficace fait baisser les coûts de production des préparations pharmaceutiques contenant du FSC-G.
Les exemples ci-apres sont donnés pour l'illustration plus détaillée de l'invention, mais ne sont pas à considérer comme limitatifs. Dans ces exemples, l'activité résiduelle du FSC-G est déterminée suivant l'un des procédés suivants.
(a) procédé sur agar mou avec des cellules de moelle osseuse de souris
On mélange du sérum de cheval (0, 4 ml), 0, 1 ml de l'échantillon, 0, 1 ml d'une suspension de cellules de moelle osseuse de souris C3H/He (femelle) (0. 5 à 1 x 105 cellules nucléaires) et 0, 4 ml d'un bouillon de culture de McCoy 5A modifié contenant 0, 75% d'agar, on coule dans une boite en matière plastique pour culture de tissus t) = 35 mm), on laisse figer et on pro-
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cède ä la culture pendant 5 jours ä 370C dans 5% C02/95% air ä une humidité de 100%.
on détermine le nombre des colonies (une colonie consistant en au moins 50 cellules) et on détermine l'activiste en prenant comme unité l'ac- tivité pour former une colonie.
Le bouillon de culture de McCoy 5A modifié - utilise dans le procédé la) est prepare de la facon
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suivante.
Bouillon de culture de McCoy 5A modifié (concentraton double)
On dissout deux fois-dans 500 ml d'eau distillée 12 9 de bouillon de culture de McCoy 5A (Gibco), 2, 55 g de milieu MEM aux aminoacides-vitamines (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2, 18 g de bicarbonate de sodium et 50. 000 unités de penicilline G potassique et on filtre la solution aseptiquement ä travers un filtre
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Millipore (0, zo (b) Chromatographie liquide à haute performance avec inversion de phase
Au moyen d'une colon ne C8 à inversion de
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phase (4, 6 mm x 300 mm, 5 phase (4, 6 mm x 300 mm.
m) et d'un melange n-propa- nol/acide trfluoroacétique comme phase mobile, on détermine l'activiste résiduelle du FSC-G (injecte en
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une quantité équivalente ä 1/g) dans les conditions ", t & g) dans les conditions de gradient suivantes :
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<tb>
<tb> Temps <SEP> (secondes) <SEP> Solvant <SEP> (A) <SEP> Solvant <SEP> (8) <SEP> Gradient
<tb> 0 <SEP> 100% <SEP> 0% <SEP> lineaire
<tb> 15 <SEP> 0% <SEP> 100%
<tb> 25 <SEP> 100% <SEP> 0% <SEP> } <SEP> linéaire
<tb>
Solvant (A) : 30% de n-propanol et 0, 1% d'acide tri- fluoroacetique Solvant (B) :
60% de n-propanol et 0, 1% d'acide tri- fluoroacétique
On opère la détection à une longueur d'onde de 210 nm et on calcule le pourcentage d'activité rési-
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duelle du FSC-G à l'aide de la formule suivante : quantité résiduelle de FSC-G après écoulement d'une durée Activité résiduelle = déterminée x 100 de FSC-G (%) = quantité initiale de FSC-G x 10
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La quantité résiduelle de FSC-G déterminée de La quantit cette façon est en -très bonne corrélation avec le résultat
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que donne la mesure suivant le procédé sur agar mou (a) au moyen de cellules de moelle osseuse de souris.
EXEMPLE 1
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On ajoute à 5g de FSC-G l'un des agents stabilisants indiqués au tableau 1 et on dissout le mélange aseptiquement dans une solution tampon 20 mM (contenant du chlorure de sodium 100 mM, de pH 7, 4) pour obtenir une préparation pharmaceutique contenant 5 ; tg de FSC-G par ml, qu'on lyophilise ensuite. On détermine l'evolution de l'activite du FSC-G en fonction du temps suivant le procédé (a), les résultats étant indiqués au tableau 1.
Le terme "activité (%)" dans le tableau est représentatif de l'activité résiduelle du FSC-G par
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comparaison avec l'activiste unitaire initiale et est défini par la relation suivante :
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unités d'activité après écoulement Activité (%) d. une durée déterminée " 100 Activte (%) = unites d'activite initiale------
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On opère la lyophilisation de la façon suivante : On introduit la solution de FSC-G contenant un agent stabilisant dans une fiole en verre sterile traitée au sulfamide, on la congèle ä une température due -40. C ou plus basse pendant 4 heures, on la soumet au séchage
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primaire par chauffage de -400C jusqu'à O.
C en 48 heures avec augmentation de la pression de 0, 03 jusqu'à 0, 1 torr, puis au séchage secondaire par chauffage de 0"C jusqu'ä 200C en 12 heures avec augmentation de la pression de 0, 03 jusqu'à 0, 8 torr, après quoi on remplit la fiole au moyen d'azote sec stérile jusqu'à établir la pression atmosphérique, puis on obture la fiole avec un bouchon en caoutchouc lyophilisé qu'on scelle finalement avec une coiffe en aluminium.
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TABLEAU 1
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<tb>
<tb> Quantité <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Agent <SEP> stabilisant <SEP> (parties
<tb> en <SEP> Après <SEP> stockage <SEP> de
<tb> poids) <SEP> 6 <SEP> mois <SEP> 1 <SEP> mois
<tb> ä <SEP> 40C <SEP> à <SEP> 370C
<tb> xylitol <SEP> 10.
<SEP> 000 <SEP> 92 <SEP> 86
<tb> nannitol <SEP> 10.000 <SEP> 91 <SEP> 85
<tb> acide <SEP> glucuronique <SEP> 10. <SEP> 000 <SEP> 86 <SEP> 82
<tb> acide <SEP> hyaluronique <SEP> 2000 <SEP> 92 <SEP> 89
<tb> dextrane <SEP> (P. <SEP> M. <SEP> 40. <SEP> 000) <SEP> 2000 <SEP> 95 <SEP> 90
<tb> réparine <SEP> 5000 <SEP> 85 <SEP> 80
<tb> chitosane <SEP> 2000 <SEP> 93 <SEP> 91
<tb> acide <SEP> alginique <SEP> 2000 <SEP> 90 <SEP> 90
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 1000 <SEP> 98 <SEP> 99
<tb> globuline <SEP> de <SEP> serum <SEP> humain <SEP> 1000 <SEP> 98 <SEP> 95
<tb> gelatine <SEP> traitée <SEP> par <SEP> un <SEP> 2000 <SEP> 97 <SEP> 95
<tb> acide
<tb> gélatine <SEP> traitée <SEP> par <SEP> un
<tb> alcali <SEP> 1000 <SEP> 99 <SEP> 96
<tb> :
<SEP> ollagène <SEP> 2000 <SEP> 95 <SEP> 90
<tb> polyéthylèneglycol <SEP> 10. <SEP> 000 <SEP> 94 <SEP> 90
<tb> (PM <SEP> 4000)
<tb> hydroxypropylcellulose <SEP> 1000 <SEP> 98 <SEP> 94
<tb> arboxyméthylce11ulose <SEP> 1000 <SEP> 8a <SEP> 80
<tb> sodique
<tb> hydroxyméthylcellulose <SEP> 5000 <SEP> 92 <SEP> 90
<tb> alcool <SEP> polyvinylique <SEP> 2000 <SEP> 96 <SEP> 95
<tb> (PM <SEP> 50. <SEP> 000)
<tb> polyvinylpyrrolidone <SEP> 2000 <SEP> 95 <SEP> 94
<tb> (PM <SEP> 50.
<SEP> 000)
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> mannitol <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 97
<tb> cyst$ine <SEP> 100
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
TABLEAU 1 (suite)
EMI17.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Agent <SEP> stabilisant <SEP> (parties
<tb> en <SEP> Après <SEP> stockage <SEP> de
<tb> poids) <SEP> 6 <SEP> mois <SEP> 1 <SEP> mois
<tb> ä <SEP> 4C <SEP> à <SEP> 37 C
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 100 <SEP> 9
<tb> éthylènesoritan <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 96
<tb> mannitol <SEP> 2000
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> hydroxypropylcellulose <SEP> 500 <SEP> 98 <SEP> 92
<tb> dextrane <SEP> (PM. <SEP> 40.
<SEP> 000) <SEP> 2000
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 100
<tb> éthylènesorbitan
<tb> 98 <SEP> 96
<tb> sorbitol <SEP> 200
<tb> nuile <SEP> de <SEP> ricin <SEP> durcie
<tb> polyoxyéthylée
<tb> 94 <SEP> 92
<tb> dextrane <SEP> (PM <SEP> 40. <SEP> 000) <SEP> 2000
<tb> héant <SEP> - <SEP> 74 <SEP> 58
<tb>
EXEMPLE 2
On ajoute l'un des agents stabilisants indiqués au tableau 2 à 10 g de FSC-G et on dissout le melange aseptiquement dans une solution tampon au phosphate 20 mM (contenant du chlorure de sodium 100 mM, de pH 7, 4) pour obtenir une préparation pharmaceutique contenant log de FSC-G par ml. On introduit la préparation aseptiquement dans des fioles en verre traitées au sulfamide qu'on scelle pour obtenir une solution de FSC-G.
On mesure l'évolution de l'activiste du FSC-G dans la solution en fonction du temps suivant le procédé appliqué dans l'exemple 1, et les réasultats sont présentés au tableau2.
<Desc/Clms Page number 18>
TABLEAU 2
EMI18.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Agent <SEP> stabilisant <SEP> (parties
<tb> en <SEP> Après <SEP> stockage <SEP> de
<tb> poids) <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 2 <SEP> mois <SEP> 1 <SEP> mois
<tb> à <SEP> 4 C <SEP> à <SEP> 4 C <SEP> à <SEP> TA.
<tb> nannitol <SEP> 5000 <SEP> 91 <SEP> 87 <SEP> 82
<tb> acide <SEP> hyaluronique <SEP> 2000 <SEP> 93 <SEP> 87 <SEP> 70
<tb> dextrane <SEP> (PM <SEP> 40. <SEP> 000) <SEP> 2000 <SEP> 96 <SEP> 95 <SEP> 85
<tb> glycerol <SEP> 10.000 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 88
<tb> acide <SEP> neuraminique <SEP> 5000 <SEP> 93 <SEP> 91 <SEP> 84
<tb> :
<SEP> chitine <SEP> 2000 <SEP> 95 <SEP> 92 <SEP> 86
<tb> dextrine <SEP> 2000 <SEP> 90 <SEP> 92 <SEP> 87
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 1000 <SEP> 99 <SEP> 95 <SEP> 92
<tb> globuline <SEP> de <SEP> serum <SEP> humain <SEP> 1000 <SEP> 98 <SEP> 94 <SEP> 90
<tb> Gelatine <SEP> traitée <SEP> par <SEP> un <SEP> 2000 <SEP> 97 <SEP> 96 <SEP> 87
<tb> acide
<tb> gélatine <SEP> traitée <SEP> par <SEP> un <SEP> 500 <SEP> 99 <SEP> 95 <SEP> 92
<tb> alcali
<tb> collagène <SEP> 2000 <SEP> 99 <SEP> 94 <SEP> 88
<tb> polyéthylèneglycol <SEP> 10.000 <SEP> 94 <SEP> 89 <SEP> 90
<tb> (PM <SEP> 4000)
<tb> ydroxypropylcel1ulose <SEP> 2000 <SEP> 98 <SEP> 95 <SEP> 92
<tb> carboxyméthylcellulose <SEP> 2000 <SEP> 92 <SEP> 91 <SEP> 80
<tb> sodique
<tb> hydroxyéthylcellulose <SEP> 4000 <SEP> 92 <SEP> 94 <SEP> 90
<tb> alcool <SEP> polyvinylique <SEP> 4000 <SEP> 97 <SEP> 93 <SEP> 90
<tb> (PM <SEP> 50.
<SEP> 000)
<tb> polyvinylpyrrolidone <SEP> 4000 <SEP> 95 <SEP> 95 <SEP> 92
<tb> (PM <SEP> 50.000)
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> sorbitan <SEP> 400 <SEP> 97 <SEP> 96 <SEP> 95
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
TABLEAU 2 (suite)
EMI19.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Agent <SEP> stabilisant <SEP> (parties
<tb> en <SEP> Après <SEP> stockage <SEP> de
<tb> poids)
<SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 2 <SEP> mois <SEP> 1 <SEP> mois
<tb> à <SEP> 4 C <SEP> à <SEP> 4 <SEP> à <SEP> TA.
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 400 <SEP> 100 <SEP> 96 <SEP> 94
<tb> éthylènesorbitan <SEP> 400 <SEP> 100 <SEP> 96 <SEP> 94
<tb> monostearate <SEP> de <SEP> polyoxy-
<tb> éthylènesorbitan <SEP> 400 <SEP> 98 <SEP> 97 <SEP> 94
<tb> éther <SEP> polyoxyethylenepolyoxypropylène-glyco <SEP> 400 <SEP> 100 <SEP> 94 <SEP> 93
<tb> lique
<tb> huile <SEP> de <SEP> ricin <SEP> durcie <SEP> 400 <SEP> 99 <SEP> 98 <SEP> 90
<tb> polyoxyéthylée <SEP> 400 <SEP> 99 <SEP> 98 <SEP> 90
<tb> laurylsulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 2000 <SEP> 97 <SEP> 93 <SEP> 87
<tb> lécithine <SEP> 2000 <SEP> 97 <SEP> 94 <SEP> 90
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> mannitol <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 97
<tb> cystéine <SEP> 100
<tb> albumine
<SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 97 <SEP> 95
<tb> éthylènesorbitan
<tb> mannitol <SEP> 2000
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 1000
<tb> hydroxypropylcellulose <SEP> 500 <SEP> 99 <SEP> 97 <SEP> 95
<tb> dextrane <SEP> (PM <SEP> 40.
<SEP> 000) <SEP> 2000
<tb> monopalmitate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 100
<tb> éthylènesorbitan
<tb> 96 <SEP> 96 <SEP> 93
<tb> sorbitol <SEP> 2000
<tb> huile <SEP> de <SEP> ricin <SEP> durcie <SEP> 100
<tb> polyoxyéthylée
<tb> 95 <SEP> 92 <SEP> 92
<tb> dextrane <SEP> (PM <SEP> 40.000) <SEP> 2000
<tb> néant <SEP> - <SEP> 72 <SEP> 61 <SEP> 47
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
EXEMPLE 3
On a joute à 10 g de FSC-G l'un des agents stabilisants indiqués au tableau 3 et on dissout le mélange aseptiquement dans une solution tampon au phos- phate 20 mM (contenant du chlorure de sodium 100 mM de pH 7, 4) pour obtenir une préparation pharmaceutique contenant 10 g de FSC-G par ml. On introduit 1 ml de la préparation dans une fiole en verre revêtue de si- licone et traitée au sulfamide et on la conserve à 4*C.
On évalue l'efficacite avec laquelle chaque agent stabili-
EMI20.1
san. t empêche l'adsorption du PSC-G en mesurant l'activite residuelle du FSC-G dans la solution après 0, 5.
2 et 24 heures. On effectue les mesures suivant le procédé (b) par chromatographie liquide à haute performance avec inversion de phase. Les résultats sont donnés au tableau 3.
<Desc/Clms Page number 21>
TABLEAU 3
EMI21.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> Activité <SEP> résiduelle <SEP> (%)
<tb> Agent <SEP> stabilisant <SEP> (parties
<tb> en <SEP> ini- <SEP> 0,5 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h
<tb> poids) <SEP> tiale
<tb> nannitol <SEP> 5000 <SEP> 100 <SEP> 93 <SEP> 90 <SEP> 91
<tb> acid <SEP> hyaluronique <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 97 <SEP> 92 <SEP> 92
<tb> dextrane <SEP> (PM <SEP> 40.
<SEP> 000) <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 95 <SEP> 96
<tb> glyc$rol <SEP> 10.000 <SEP> 100 <SEP> 94 <SEP> 91 <SEP> 90
<tb> @éparine <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 92 <SEP> 90 <SEP> 90
<tb> acide <SEP> glucuronique <SEP> 5000 <SEP> 100 <SEP> 96 <SEP> 90 <SEP> 91
<tb> acide <SEP> cétoglycolique <SEP> 5000 <SEP> 100 <SEP> 92 <SEP> 88 <SEP> 90
<tb> albumine <SEP> de <SEP> serumhumain <SEP> 1000 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 101 <SEP> 99
<tb> globuline <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 1000 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 100 <SEP> 98
<tb> gélatine <SEP> traitée <SEP> par <SEP> un <SEP> 500 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 98 <SEP> 99
<tb> alcali
<tb> gélatine <SEP> traitée <SEP> par <SEP> un <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 97 <SEP> 97
<tb> acide
<tb> collagène <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 99
<tb> polyéthylèneglycol <SEP> 10.000 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP>
99
<tb> (PM <SEP> 4000)
<tb> hydroxypropylcellulose <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 99
<tb> carboxyméthylcellulose <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 96 <SEP> 95
<tb> sodique
<tb> hydroxyethylcellulose <SEP> 4000 <SEP> 100 <SEP> 96 <SEP> 93 <SEP> 92
<tb> alcool <SEP> polyvinylique <SEP> 4000 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 100 <SEP> 98
<tb> (PM <SEP> 50.000)
<tb> polyvinylpyrrolidone <SEP> 4000 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 98 <SEP> 96
<tb> monocaprylate <SEP> de <SEP> sorbitan <SEP> 400 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 98
<tb>
<Desc/Clms Page number 22>
TABLEAU 3 (suite)
EMI22.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> Activite <SEP> residuelle <SEP> (%)
<tb> Agent <SEP> stabilisant <SEP> (parties <SEP> ini- <SEP> 0.5 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 24 <SEP> h
<tb> en
<tb> poids)
<SEP> tiale
<tb> monostéarate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 400 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 100
<tb> éthylènesorbitan
<tb> huile <SEP> de <SEP> ricin <SEP> durcie <SEP> 400 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 101 <SEP> 99
<tb> polyoxyéthylée
<tb> laurylsulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 97
<tb> lecithine <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 100 <SEP> 98
<tb> albumine <SEP> de <SEP> serum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> mannitol <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 101
<tb> cystéine <SEP> 100
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 2000
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 99
<tb> éthylènesorbitan
<tb> mannitol <SEP> 2000
<tb> albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> 1000
<tb> hydroxypropylcellulose <SEP> 500 <SEP> 100 <SEP> 101 <SEP> 99 <SEP> 100
<tb>
dextrane <SEP> (PM <SEP> 40. <SEP> 000) <SEP> 2000
<tb> monolaurate <SEP> de <SEP> polyoxy- <SEP> .
<tb> éthylènesorbitan
<tb> 100 <SEP> 100 <SEP> 99 <SEP> 99
<tb> sorbitol <SEP> 2000
<tb> huile <SEP> de <SEP> ricin <SEP> polyoxy- <SEP> 100
<tb> éthylée <SEP> 100
<tb> 100 <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 97
<tb> dextrane <SEP> (PM <SEP> 40. <SEP> 000) <SEP> 2000
<tb> néant <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 91 <SEP> 72 <SEP> 73
<tb>