BE1000636A5 - Procede perfectionne de production d'interleukine-1 humaine recombinante. - Google Patents

Procede perfectionne de production d'interleukine-1 humaine recombinante. Download PDF

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BE1000636A5 BE8700134A BE8700134A BE1000636A5 BE 1000636 A5 BE1000636 A5 BE 1000636A5 BE 8700134 A BE8700134 A BE 8700134A BE 8700134 A BE8700134 A BE 8700134A BE 1000636 A5 BE1000636 A5 BE 1000636A5
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Abstract

Il est décrit une interleukine-1 humaine produite par voie microbienne essentiellement dépourvue d'endotoxine, sous la forme d'une protéine essentiellement homogène et ayant une activité spécifique d'au moins environ 5 X 10(7) unités par mg, ainsi qu'un procédé pour sa préparation et l'application de l'interleukine-1 humaine comme agent pharmaceutique.

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 



  Procédé perfectionne de production d'interleukine-1 humaine recombinante 
Deux gènes codant pour les formes a et ss de l'inter-   leukine-l   humaine ont été décrits par les spécialistes cf. par exemple blarch et coll., Nature 315,641-647   (1985).   La demande de brevet européen publiée sous le numéro 200. 966 du 12 novembre   1986,   inventeurs   Cubler   et coll. décrit le clonage et l'expression de l'interleukine-l. humaine recombinante, c'est-à-dire l'interleukine-l humaine qui est produite par voie microbienne. 



  Le procédé de purification qui y est décrit reconnalt qu'il existait un problème de par l'insolubilité de cette protéine dans les cellules hôtes bactériennes. 



  On pense que ce problème d'insolubilité est du à la production de niveaux élevés de protéines dans un environnement qui apparemment n'est pas favorable à un repliement convenable des protéines. Les problèmes de repliement des   proteinesse   manifestent dans 1a formation d'inclusions dans les bactéries. Ces corps d'inclusion ne peuvent etre dissous que dans des agents fortement dénaturants comme l'urée et le chlorhydrate de guanidine. 

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   Les procédés de purification utilisant ces agents dénaturants forts fournissent de l'interleukine-1 humaine recombinante purifiée. Cependant, pour des raisons que l'on ne comprend pas entièrement mais dont on pense qu'elles ont un lien avec le repliement de la protéine dans cet environnement non biologique, les niveaux d'activité spécifique observés pour les molecules purifiées n'excèdent pas environ 6 x 106 unités/ mg. Ainsi, un objectif de l'invention était de mettre au point un procédé de purification pour l'interleukine-1 humaine recombinante, en particulier   l'interleukine4a   recombinante permettant la purification et la solubilisation de la protéine désirée dans un système tampon biologiquement compatible, donnant ainsi un produit ayant une activité spécifique accrue. 



   La présente invention fournit un procédé perfectionné pour produire de   l'interleukine-1   humaine   recom-   binant, en particulier   l'interleukine-lot   humaine, plus particulièrement   l'interleukine-1a   humaine ayant la fréquence d'acides amines présentée dans la figure 1, sous la forme d'une protéine essentiellement homogène, essentiellement dépourvue d'endotoxine et ayant une activité spécifique accrue, en particulier une activité spécifique d'au moins 5 x 107 unités/ mg.

   En outre, l'invention concerne   l'interleukine-1   humaine recombinante produite par le présent procédé,   c'est-à-dire     l'interleukine-l   humaine produite par voie microbienne, essentiellement dépourvue d'endotoxine, sous la forme d'une protéine essentiellement homogène et ayant une activité spécifique d'au moins environ 5 x 107 unités/ mg. Ladite interleukine-l humaine peut être utilisée comme agent pharmaceutique pour le traitement et la prévention des maladies. En outre, l'invention concerne 

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 les compositions pharmaceutiques contenant ladite interleukine-l humaine. Pour des raisons évidentes pour les spécialistes,   l'interleukine-1   humaine de l'invention peut contenir un résidu méthionine additionnel à son extrémité N. 



   Un aspect important de l'invention vient de la découverte inattendue selon laquelle une proportion substantielle de l'interleukine-l humaine recombinante exprimée chez un hôte bactérien, p. ex. E. coli, est présente dans la fraction cytosol soluble meme si l'activité spécifique dans cette fraction est bien inférieure à celle qui est contenue dans les corps d'inclusion extraits à l'urée. De plus, non seulement l'interleukine-l humaine se trouve dans le cytosol, mais de façon extrêmement surprenante, on a en outre découvert qu'on peut la purifier à partir du cytosol dans un procédé simple de séparation chromatographique sur colonne en deux ou le cas échéant en trois étapes. 



   Dans la première étape du procédé de l'invention, on obtient la fraction cellulaire soluble en fracturant les hôtes microbiens transformés qui ont été cultivés dans des conditions choisies de manière à provoquer l'expression du gène introduit codant pour l'interleukine-l humaine et cette fraction est séparée des matières cellulaires insolubles, y compris les corps d'inclusion, dans lesquels les spécialistes de la technique antérieure pensaient que se trouvait la grande majorité de l'interleukine-l   (rHIL-l)   humaine exprimée. 



   La rupture des cellules peut s'effectuer par des techniques bien connues des   specialistes   comme par exemple par utilisation de dégradation enzymatique 

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 p. ex. avec un traitement au lysozyme, par rupture physique en utilisant un broyeur à bouletsou un dispositif analogue ou mieux par traitement aux ultra-sons. 



  La séparation du cytosol soluble d'avec des matières cellulaires insolubles s'effectue le plus commodément par centrifugation, p. ex. à 20 000 g pendant environ 30 min. On soumet alors le surnageant contenant la fraction cytosol contenant le   rHIL-l   soluble à une filtration sur gel utilisant une solution de sel tamponnée pour   l'elution.   Une colonne appropriée à cette étape du procédé est une colonne de   SephacrylTM   S-200 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suede). 



   On dose les fractions de chromatographie sur gel contenue dans ladite solution de sel tamponnée de préférence dans une solution de   NaCl   tamponnée avec tris/HCl, pH 8, 0, qui peut contenir un stabilisateur de protéine comme l'acide   éthylènediaminetétraacétique   (EDTA). On dilue les fractions biologiquement actives combinées avec une quantité supplémentaire de solution de sel tamponnée et on les utilise dans la seconde étape du pro- 
 EMI4.1 
 cédé de l'invention. 



   Le dosage des fractions chromatographiques peut facilement s'effectuer par des procédés bien connus des spécialistes. Un dosage approprié est le dosage de proliferation des thymocytes murins (dosage LAF) décrit par Mizel et coll., J. Immunol. 120,   1497-1508     (1987).   



   La seconde étape du procédé fait intervenir une chromatographie par échange d'ions, de préférence sur une colonne de DEAE-cellulose et en utilisant un gradient croissant de concentration de sel dans une solution   tamponnée. Dans   un mode de réalisation préféré, 

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 EMI5.1 
 ledit gradient est un gradient de NaCl allant de 0 800 mM dans un tampon tris/Hcl, 25 mM, pH 8, Dans la purification à grande échelle, après centrifugation pour enlever les débris cellulaires, on enlève les acides nucléiques dans la fraction cytosol par une précipitation au sulfate de streptomycine. On ajoute 1/10 de volume (du surnageant) de 
 EMI5.2 
 solution de sulfate de streptomycine à 10 % p/v. On maintient le pH à   6, 2 à 6, 4   avec de l'acide acétique 1 N.

   On fait tourner la suspension à 20 000 g pendant 30 min. On concentre les protéines dans la solution de surnageant résultante en ajoutant du sulfate d'ammonium à une saturation de 60 %. On fait tourner la suspension à 20 000 9 pendant 30 min. et on dissout la pastille résultante dans un volume minimum de   NaCl   800   mM,     tris/HCl 25 mH,   pH   8, 0.   



   Dans certains cas, en particulier dans les essais par gradation, on peut porter les niveaux d'endotoxine en ce point au-dessus des niveaux permissibles. Ainsi, on peut introduire une troisième étape optionnelle pour enlever l'endotoxine. On peut employer à cet effet des procédés connus des spécialistes bien qu'un procédé préféré selon l'invention fasse intervenir le passage de lasolution de produit (dilué 1 : 1 v/v avec 
 EMI5.3 
 du tris/HCl 25 mM, pH 8, provenant de l'étape de 
1)chromatographie à la DEAE à travers une colonne remplie de DetoxiGelTM (Pierce Chemical Company, Rockford, Ill) en utilisant les instructions fournies par le fabricant. 



   On peut employer l'interleukine-1 humaine purifiée de l'invention comme agent pharmaceutique de façon 

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 connue pour stimuler le système immun d'un malade comme, par exemple, en améliorant la réponse de défense de l'hôte aux agents pathogènes, en agissant comme adjuvant de vaccin et en accroissant la défense de l'hôte contre les maladies néoplasiques. D'autres applications cliniques comprennent la favorisation de la cicatrisation des blessures par stimulation de la prolifération des fibroblastes et amélioration de la guérison des malades souffrant de façon critique d'une malnutrition protéique. 



   L'interleukine-l humaine de l'invention peut être administrée à des mammifères homéothermes pour les applications cliniques indiquées ci-dessus. L'administration peut se faire par n'importe quel procédé classique comme par application parenterale par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire. 11 est clair que la dose requise varie avec l'état particulier traité, la gravité de l'état, la durée du traitement et le procédé d'administration. On peut obtenir une forme posologique appropriée à l'application pharmaceutique à partir   d'inter1eukine-l   humaine lyophilisée filtrée de façon stérile et reconstituée avant l'emploi de facon classique.

   Les spécialistes savent également introduire des tampons, des stabilisateurs, des bactériostats et d'autres additifs classiquement employés dans les formes posologiques parentérales pharmaceu- 
 EMI6.1 
 tiques. Exemple 1 
On cultive des cellules d'E. coli transformées avec un vecteur d'expression codant pour l'interleukine- 

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 humaine recombinante (rHIL-la) dans des conditions permettant l'expression de la   rHIL-la. On recueille   les cellules puis on les congèle.   Po 1a purifica-     tion de rHIL-la,   on dégèle les cellules   d'E.   coli congelées dans du tris-/HC1 30   mM,   pH 8, 0, EDTA 5 mM (dans un rapport de 1 : 5 p/v). On brise les cellules en suspension avec un appareil Branson Cell Disruptor 350 (traitement aux ultrasons).

   On enlève par centrifugation à 20 000 9 les cellules brisées et toute   rHIL-1&alpha; "insoluble" éventuelle sous forme   de corps d'in-   clusion. On applique le surnageant contenant la rHIL-1&alpha; 7   soluble dans une colonne de filtration sur gel (SephacrylTM S-200) (figure 2). On équilibre la colonne dans du tris/HC1 30 mM, pH   8, 0, NaCl   800 mM, EDTA 5 mM. 



  On rassemble les fractions biologiquement actives, on 
 EMI7.1 
 dilue à 1 avec du tris/HC1 30 mM, pH 8, et on chromatographie sur DEAE-cellulose (échangeuse d'anions DE 53, Whatman Ltd) en utilisant un gradient linéaire de NaC1 0-800 mM dans mM, pH 8, 1 (figure 3). On recueille plus de SO % de l'activité biologique avec une activité spécifique de   0, 4 à   1, 0 x 107 unitésl mg de protéine. La pureté de la proteine est confirmée par analyse par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) comme il est dit par Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970) (figure 4) et chromatographie en phase liquide à haute pression (CLHP - HPCL) à phases inversées.

   Après chromatographie    au0 Sephacryl HI 5-200,   on contamine la rHIL-la avec de 1000 à 2 000 unités d'endotoxine par ml mais la chromatographie à la DEAE aboutit à une réduction de   99 %   de l'endotoxine. On montre que l'activité biologique 
 EMI7.2 
 est stable pendant au moins 3 moins lorsqu'on conserve la protéine à 4 C. 

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  Exemple 2 
On realise le procédé ci-dessus par gradation pour produire 32 mg de   rHIL-1&alpha; essentiellement pure.   



  On traite 100 g de pâte cellulaire par le procédé de   maneton-gaulin     (aneth.   Enzymology 22,   482-484 -1971-)   et on traite le produit soluble résultant avec du sulfate de streptomycine et du sulfate d'ammonium pour enlever les acides nucléiques et concentrer la protéine. On chromatographie la protéine resolubilisée résultante sur une colonne de   Sephacryl   de 10 litres dans une solution de sel   tamponnée,   On chromatographie alors la matière purifiée dans une colonne de DEAEcellulose.

   La protéine est pure à plus de 95 % comme on le détermine par SDS-PAGE L'activité totale obtenue est de 1, 6 x 109 unités avec une activité spécifique moyenne de 5 x 107 unités mg Cependant, par opposition à l'essai pilote initial, cette matière est quelque peu contaminée par de l'endotoxine   (jusqu'à   500 unités d'endotoxine par   ml).   On peut facilement enlever cette impureté d'endotoxine en faisant passer la solution de protéine sur une colonne remplie de    DetoxigelTM   en suivant les instructionsdu fabricant. 



  Description des dessins 
La figure 1 montre la sequence d'acides aminés de HIL-la. 



   La figure 2 fournit un chromatogramme de la 
 EMI8.1 
 filtration sur gel cytosol à E. coli contenant la rHIL-la soluble sur SephacrylTM S-200. L'éluant est le tris/HCl) pH 8, 800 mM. On quantifie 

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5 10 15 20 25 l'activité d'IL-l de fractions aliquotes par le dosage LAF. 



   La figure 3 présente un chromatogramme de la 
 EMI9.1 
 chromatographie à la DEAE-cellulose de la masse SephacrylTM S-200 de fractions actives IL-1. On élue la rHIL-la un gradient de sel courant de 0 à SOO mM de NaCl dans tri de 25 mM, pH 8, On avecévalue l'activité biologique d'échantillons de chaque fraction par le dosage LAF. 



   La figure 4 met en évidence la purification de rHIL-la. On analyse par SDS-PAGE des échantillons provenant de différents stades de la purification de   rHIL-la.   



   (A) M : marque d'échelle ; P : pastille résultant de la centrifugation d'une suspension cellulaire traitée aux ultra-sons ; S : fraction cytosol ; fractions 64 - 69 et fractions 70 - 77 : fractions individuelles 64   à 77 (marquées par #) résultant   de la chromatographie sur colonne à   5ephacrylTM   S-200. 



   (B) M : marque d'échelle ; 0 : fractions rassemblées provenant de la chromatographie sur colonne à Sephacryl   S-200 ; 0*   : fractions rassemblées provenant de la chromatographie sur colonne à    5ephacrylTM   
 EMI9.2 
 5-200 dilu6e à 1 avec tris/HC1 30 mbl, pH 8, fractions 60-65 et fractions 66 - 73 : fractions individuelles 60 à 73 (marquées par   j)   résultant de la chromatographie à la DEAE-cellulose. 



   Les mobilités électrophorétiques des protéines marqueuses à la verticale de M (phosphorylase b 

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 EMI10.1 
 = 94 000), s6rum albumine de boeuf = ovalbumine = 43 000), anhydrase carbonique = 30 000), inhibiteur de la trypsine soja ' et a-lactalbumine (M = 14 000))

   sont r indiquées par leur valeur de (x suivies par des   flèches.  
FIGURE 1 
 EMI10.2 
 
<tb> 
<tb> Phe <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Val <SEP> Lys <SEP> Tyr <SEP> Asn <SEP> Phe <SEP> Met <SEP> Arg <SEP> Ile
<tb> Ile <SEP> Lys <SEP> Tyr <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Asn <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Asn
<tb> Gln <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Ile <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Asp <SEP> Gln <SEP> Tyr <SEP> Leu <SEP> Thr
<tb> Ala <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Lys
<tb> Phe <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Asp
<tb> Ala <SEP> Lys <SEP> Ile <SEP> Thr <SEP> Val <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Thr
<tb> Gln <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Val <SEP> Thr <SEP> Ala 

  <SEP> Gln <SEP> Asp <SEP> Glu <SEP> Asp <SEP> Gln <SEP> Pro
<tb> Val <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Met <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Lys <SEP> Thr
<tb> Ile <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Phe <SEP> Trp
<tb> Glu <SEP> Thr <SEP> His <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Phe <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Val
<tb> Ala <SEP> His <SEP> Pro <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Ile <SEP> Ala <SEP> Thr <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Asp
<tb> Tyr <SEP> Trp <SEP> Val <SEP> Cys <SEP> Leu <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Ile
<tb> Thr <SEP> Asp <SEP> Phe <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asn <SEP> Gln <SEP> Ala
<tb>

Claims (12)

  1. EMI11.1 i c a t i R e v e n d1. Interleukine-1 humaine produite- par voie microbienne essentiellement dépourvue d'endotoxine, sous la forme d'une protéine essentiellement homogene et ayant une activité spécifique d'au moins environ 5 x 107 unités/mg.
  2. 2. Interleukine-1 humaine selon la revendication 1 qui est l'interleukine-la humaine.
  3. 3. Interleukine-1 humaine selon la revendication 1 ayant la séquence d'acides amines présentés dans la figure l.
  4. 4. Interleukine-1 humaine selon l'une quelconque des revendications 1 ä 3 comme agent pharmaceutique.
  5. 5. Procédé pour produire une interleukine-1 humaine, procédé dans lequel on brise les cellules microbiennes qui ont été transformées avec un vecteur d'expression contenant le gène pour l'interleukine- 1 recombinante humaine, et oü l'expression dudit gene était induite, on sépare les matières cellulaires insolubles d'une fraction cytosol et on purifie 1'interleukine-l de la fraction cytosol essentiellement jusqu'à homogénéité.
  6. 6. Procédé de la revendication 5 oü lesdites cellules microbiennes sont brisees par traitement aux ultrasons.
  7. 7. Procédé des revendications 5 ou 6 où l'interleukine-1 est purifiée de la fraction cytosol en soumettant ladite fraction cytosol ä une filtration sur gel en utilisant une solution de sel tamponnée, en combinant les fractions biologiquement actives provenant de ladite filtration sur gel et en les soumettant à une chromatographie d'echange d'ions en utilisant un gradient de concentration croissante de sel dans une solution tamponnee. <Desc/Clms Page number 12> EMI12.1
  8. 8. Procédé de la revendication 7, où ladite filtration sur gel est effectuee sur une colonne de TM Sephacryl S-200 et ladite solution de sel tamponnée est une solution de NaCl tamponnée avec tris/HC1.
  9. 9. Procédé des revendications 7 ou 8 oü ladite chromatographie d'échange d'ions est faite en utilisant une colonne de DEAE-cellulose et ledit gradient de concentration croissante de sel dans une solution tamponnée est un gradient de NaCl 0-800 mM dans un tampon tris/HCl.
  10. 10. Interleukine-1 humaine lorsqu'elle est préparée selon un procédé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 5 ä 9.
  11. 11. Utilisation d'une interleukine-l humaine selon l'une quelconque des revendications 1 ä 4 ou 10 pour le traitement et la prévention de maladies.
  12. 12. Compositions pharmaceutiques contenant une interleukine-1 humaine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 10.
BE8700134A 1986-02-18 1987-02-18 Procede perfectionne de production d'interleukine-1 humaine recombinante. BE1000636A5 (fr)

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