BE823874A - Nouveau polypeptide a activite calcitonique - Google Patents

Description

  :Nouveau polypeptide à activité calcitonique. 

  
La présente invention concerne un nouveau polypeptide de la formule

  

 <EMI ID=1.1> 


  
à activité hypocalcémiante analogue à celle de la

  
calcitonine.

  
Une substance à activité hormonale et en particulier

  
à activité hypocalcémiante peut être extraite des tissus  comprenant la veine cave, attachés à l'oesophage d'un  anguillidé, à proximité du coeur, et la membrane péricardique

  
de ces anguillidés (cf. brevet britannique 1.342 812). Le procédé d'extraction et de purification développé est

  
cependant très compliqué et ne donne qu'un rendement in-  signifiant ; aussi cette substance à l'état pur est-elle pratiquement introuvable. 

  
Il a été trouvé à présent que le polypeptide à

  
activité hypocalcémiante, lorsqu'il est administré à des mammifères, peut être obtenu à l'état pur avec un bon rendement par les opérations ci-après :

  
1) extraction des tissus précisés ci-dessus à l'aide d'un

  
solvant organique en solution à 40-70 &#65533;- (volume/volume)

  
dans un acide dilué par de l'eau ;

  
2) isolement de la substance brute par précipitation à

  
l'aide d'un solvant organique miscible à l'eau, et

  
3) purification de la substance brute extraite par une série

  
d'opérations, comprenant une chromatographie sur tamis moléculaire et une double chromatographie sur résine échangeuse d'ions acide avec élimination des sels.

  
La structure chimique de la substance pure ainsi obtenue, que nous appelons "calcitonine d'anguillidé", a été vérifiée et correspond au schéma ci-après :

  

 <EMI ID=2.1> 


  
L'invention a par conséquent pour objet l'obtention d'un nouveau polypeptide à activité hypocalcémiante.

  
Conformément à l'invention, ce nouveau polypeptide peut être obtenu par extraction à partir des tissus d'anguillidés, comprenant la veine cave, attachés à l'oesophage à proximité du coeur, et la membrane péricardique.

  
L'invention a en outre pour objet un procédé de synthèse chimique de cette nouvelle calcitonine.

  
Les propriétés physico-chimiques du nouveau polypeptide à activité hypocalcémiante, lorsqu'il est administré à des mammifères,qui fait l'objet de l'invention, ont été analysées et sont indiquées ci-après :

  
1) aspect de la substance : poudre blanche

  
2) solubilité : soluble dans l'eau ;

  
insoluble dans les solvants non polaires tels que l'acétone, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le benzène, l'hexane

  
et le tétrachlorure de carbone;

  
3) poids.moléculaire : 3414,73

  
4) point de fusion : 220[deg.]C (avec décomposition) ;

  
5) structure primaire : 

  

 <EMI ID=3.1> 


  
6) vitesse de migration dans la chromatographie en

  
 <EMI ID=4.1> 

  
(support : cellulose ; éluant : mélange 15:10:12:3

  
de n-butanol, de pyridine, d'eau et d'acide acétique ; coloration au réactif de Raydon-Smith, à la ninhydrine)

  
7) activité hypocalcémiante dans le sérum : 3700-6000

  
MRC u/mg.

  
 <EMI ID=5.1> 

  
dilués à la concentration voulue à l'aide d'une solution à

  
 <EMI ID=6.1> 

  
rats mâles, on injecte 0,2 ml d'une dilution par voie intramusculaire, et une heure après l'injection, les animaux sont tués et leur sang est prélevé. Le taux du calcium sérique est déterminé par spectrophotométrie. A titre de comparaison, d'autres rats mâles reçoivent une injection intramusculaire de 0,2 ml d'une dilution du produit "Research Standard B", un extrait de la glande thyroïde du porc, ces dilutions étant respectivement de 2,5;5;10 ou 20

  
 <EMI ID=7.1> 

  
établi de manière identique, et l'activité du nouveau polypeptide suivant l'invention est comparée avec celle de

  
la substance -témoin, connue sous le nom de thyro-calcitonine.

  
Il est connu que l'on peut extraire de la glande thyroïde de Mammifères,de même que de certains tissus d'oiseaux et de poissons, une hormone polypeptidique à activité hypocalcémiante, appelée thyro-calcitonine. Actuellement, la structure primaire des calcitonines du

  
Porc, des Bovidés, du Saumon et de la calcitonine humaine

  
a pu être établie. 

  
Ces calcitonines sont composées de 32 acides aminés, possèdent une liaison -S-S- entre le premier et le septième des acides aminés, compté à partir du groupe amine terminal, et le groupe proline-amide sur le radical carboxyle terminal. La disposition réciproque des autres amino-acides est différente dans chaque calcitonine et ]eurs activités biologiques sont par conséquent différentes également, variant par

  
 <EMI ID=8.1> 

  
Porc, d'un Bovidé ou de l'Homme et 25 à 50 fois ces valeurs dans le cas de la calcitonine du Saumon.

  
La calcitonine des Anguillidés suivant l'invention possède une structure semblable à celle du Saumon, les amino-acides 1 à 25 se suivant dans un ordre identique et une différence ne se manifestant que pour les sept derniers constituants, et ce de la manière suivante :

  

 <EMI ID=9.1> 


  
Il en ressort que le polypeptide à activité hypocalcémiante, extrait des Anguillidés, constitue une nouvelle substance.

  
La calcitonine des Anguillidés suivant l'invention possède une activité hypocalcémiante et hypophosphorémiante analogue à celle des calcitonines déjà connues et est par conséquent susceptible de jouer un rôle important dans la régulation du métabolisme calcique.

  
Les calcitonines inhibent la résorption osseuse et sont donc des substances de haute valeur pour le traitement des ostéopathies dues à des troubles métaboliques. Actuellement, les calcitonines sont employées pour le traitement

  
da la maladie de Paget, les ostéoporoses et les hypercalcémies.

  
Le procédé pour l'extraction de la calcitonine  <EMI ID=10.1> 

  
comprenant la veine cave attachée à l'oesophage à proximité

  
du coeur et (ou) la membrane péricardique ; est particulièrement préférée la fraction de tissus comprenant la veine cave, le cas échéant avec le coeur, excepté le myocarde. Cette matière première peut être dégraissée et séchée avant l'extraction.

  
Pour cette extraction, on utilise un solvant organique à 40-70 % (volume-volume) dans une solution

  
aqueuse d'un acide organique ; parmi les mélanges d'extraction préférés, on peut citer les mélanges 15:3:6 à 10 de butanol, d'acide acétique et d'eau et le mélange 15:10:3:12 de butanol, de pyridine, d'acide acétique et d'eau.

  
L'extraction se déroule de manière usuelle, de

  
 <EMI ID=11.1> 

  
on ajoute une proportion de solvant organique miscible à l'eau suffisante pour provoquer la précipitation de la substance active, c'est-à-dire le polypeptide d'un poids moléculaire

  
 <EMI ID=12.1> 

  
on peut citer entre autres les alcools inférieurs, l'acétone, etc.

  
Le précipité séparé est redissous dans un acide dilué, par exemple de l'acide chlorhydrique 0,2N et de l'acide

  
 <EMI ID=13.1> 

  
chromatographie sur tamis moléculaire pour séparer la substance active et certaines protéines à poids moléculaire élevé, qui l'accompagnent comme sous-produits.

  
Pour cette chromatographie, conviennent comme supports les gels de dextranne tels que les Sephadex G-25, G-50 et G-75, et les acrylamides comme le Biogel P-10. Comme éluant, on emploie une solution acide faiblement concentrée, par exemple d'acide formique ou de formiate d'ammonium.

  
Les fractions éluées, qui contiennent la substance  <EMI ID=14.1> 

  
échangeuse d'ions acide de la cellulose ou du dextranne réticulé, parmi lesquels on peut citer l'Amberlite IR-120, IR-50, le Dowex 50, la Duolite C-3, C-25, C-62 ou CS-101,

  
la carboxyméthyl-cellulose, la SE-cellulose, le SP-Sephadex, le Se-Sephadex et le CM-Sephadex. L'élution peut être effectuée à l'aide d'une solution acide tamponnée, par exemple de formiate d'ammonium ou d'acétate d'ammonium, dont le pH et la concentration optimaux sont déterminés par un essai préliminaire. Dans le cas d'un échangeur d'ions fortement acide, le pH se situe entre 2 et 6 et les concentrations d'élution progressives entre 0,1 et 1 mole, ces valeurs étant respectivement de 4 à 6 et de 0,01 à 0,1 mole pour les échangeurs d'ions faiblement acides.

  
Dans les fractions éluées, on vérifie la présence

  
de la substance active et celles qui en contiennent sont soumises à un dessalage. Cette opération peut s'effectuer

  
de manière usuelle par chromatographie sur tamis moléculaire, tel qu'un gel de dextranne comme le Sephadex G-25 ou G50 ou un acrylamide comme le Biogel P- 10, ou par filtration à travers une membrane comme l'Amicon UN-2.

  
En répétant le cas échéant le passage sur échangeur d'ions acide et le dessalage, on obtient pour finir le nouveau polypeptide à l'état pur.

  
La nouvelle calcitonine suivant l'invention peut également être préparée par synthèse chimique. Cette synthèse s'appuie sur les procédés usuels dans le domaine

  
de la chimie des peptides, à savoir la condensation dans l'ordre voulu d'un acide aminé et d'un peptide comprenant au départ deux à quatre amino-acides, le pont disulfure étant introduit par oxydation du groupe mercapto à l'endroit des deux unités L-cystéine.

  
La substance ainsi synthétisée peut le cas échéant  <EMI ID=15.1> 

  
Le radical carboxyle peut être protégé par formation d'un groupe amide ou d'un groupe hydrazide ou par.estérification, tandis que le radical oxhydryle de la serine, de la thréonine ou de la tyrosine peut le cas échéant être protégé par estérification ou éthérification. Le groupe mercapto de la cystéine , le groupe amine de la fraction guanidine de l'arginine, et le groupe imine de l'histidine peuvent être protégés respectivement par acylation ou alkylation, par

  
un groupe nitro ou toayle et par un groupe trityle ou benzyle.

  
Un amino-acide ou un peptide, dont le groupe

  
a-amino est protégé et le radical carboxyle terminal

  
activé, peut ainsi réagir avec un composé analogue à groupe c-amino libre et radical carboxyle terminal bloqué, et vice-versa.

  
L'activation du radical carboxyle,dont questinn ci-dessus, se fait de manière habituelle, par exemple sous forme d'azide d'acide, d'anhydride, d'ester réactif ou de carbodiimide. Dans la réaction de condensation, toute formation de mélanges racémiques doit être évitée soigneusement.

  
Le pont disulfure risquant d'être coupé à certains moments de la synthèse du nouveau peptide suivant l'invention,  <EMI ID=16.1> 

  
L'établissement du pont disulfure est le plus propice au moment de la condensation du peptide sans unité cystéine, tel qu'un docosa-peptide-amide (unités 11 à 32) protégé, avec un peptide à unité cystéine, tel qu'un déca-peptide

  
 <EMI ID=17.1> 

  
est obtenue par oxydation du groupe mercapto libre du

  
peptide protégé à l'aide d'iode dans l'acide acétique glacial, à l'aide de di-iodo-éthane dans un solvant organique, à l'aide d'eau oxygénée ou d'oxygène dans l'eau au pH de 6,5. Les groupes mercapto, protégés par exemple par un groupe trityle ou acétamido, peuvent être traités par l'iode dans le méthanol pour séparer simultanément le

  
 <EMI ID=18.1> 

  
de la formule (1) peut être obtenu sous forme de base libre ou d'un sel de celle-ci, la transformation de l'une dans l'autre se faisant de façon connue. Les sels physiologiquement acceptables de la base s'obtiennent.par réaction avec un acide minéral ou organique, entre autres l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique, l'acide citrique , etc. Il est également possible de préparer un complexe du nouveau polypeptide par addition d'un oomposé minéral ou organique approprié, ce complexe étant destiné à fournir une substance à activité de longue durée au moment de son

  
 <EMI ID=19.1> 

  
Parmi les composés et produits convenant pour

  
la formation de complexes, on peut citer en tant que composés minéraux, les dérivés d'un métal tel que le calcium, le magnésium ou le zinc, en particulier leurs phosphates, pyrophosphates et polyphosphates, et en tant que produits

  
 <EMI ID=20.1> 

  
cellulose, l'acide polyglutamique, etc.

  
Dans le présent mémoire descriptif, les abréviations employées possèdent la signification ci-après  
 <EMI ID=21.1> 
 L'invention est décrite ci-après plus en détail à l'aide de quelques exemples non limitatifs.

  
EXEMPLE 1 A) Préparation de la matière brute à extraire 3 kg de tissus comprenant la veine cave, attachés à l'oesophage à proximité du coeur, et de membrane péricardique d'anguilles sont déshydratés à trois reprises par immersion pendant 5 heures dans 30 1 d'acétone, contenant 0,6 g d'acide éthylène. diamine tétracétique et se trouvant à 5[deg.]C.

  
Les tissus et membranes partiellement déshydratés sont ensuite immergés encore deux fois dans 15 1 de chloroforme

  
 <EMI ID=22.1> 

  
d'acétone. Par séchage à l'air, on obtient 820 g d'un

  
 <EMI ID=23.1> 

  
B) Extraction

  
On met en suspension dans un mélange de solvants formé de 7,5 1 de BuOH, de 1,5 1 de-AcOHet de 5 1 d'eau, 1,4 kg du  <EMI ID=24.1>  ............

  
pendant 24 heures à 50[deg.]C. Après addition de 5 1 de

  
BuOH et de 1 1 de AcOH supplémentaires, on poursuit l'agitation à 50[deg.]C pendant 60 minutes additionnelles.

  
Par centrifugation à 3000 tours/mn, on sépare le surnageant, et au précipité sédimenté, on ajoute à nouveau 7,51 de BuOH, 1,51 de AcOH et 31 d'eau, on agite pendant
60 mn à 50[deg.]C et centrifuge à 3000 tours/mn. Les deux surnageants réunis sont concentrés sous vide à 1/5e de leur volume, puis le précipité formé est séparé par centrifugation.

  
Au surnageant limpide obtenu, on ajoute 5 fois son volume d'acétone, laisse au repos jusqu'au lendemain et sépare le précipité formé par centrifugation. Par lavage à l'acétone, on obtient 65 g de poudre de substance

  
 <EMI ID=25.1> 

  
Ces 65 g de poudre sont agités avec 1,41 d'acide chlorhydrique 0,2N, centrifugés à 1 600 tours/mn, et le précipité séparé du surnageant est à nouveau lavé avec
11 d'acide chlorhydrique 0,2N ; la réunion des surnageants fournit 2,21 de solution chlorhydrique de la substance active (à 8,8 MRC u/ml).

  
C) Purification la

  
A 200 ml de/solution chlorhydrique obtenue ci-dessus, on ajoute 96 g d'urée et on fait passer ce mélange à travers

  
 <EMI ID=26.1> 

  
 <EMI ID=27.1> 

  
l'aide d'acide formique 0,1 N avec un débit de 180 ml par heure. L'éluat de cette chromatographie sur tamis moléculaire est récolté en fractions de 20 ml, dans lesquelles on vérifie la présence de la substance active.

  
Celle-ci se retrouve dans les fractions 270 à 330, qui sont réunies et qui produisent par lyophilisation 45 mg de poudre active (à 25 MRC u/mg). ............ 

  
Dans 100 ml d'une solution 0,1 molaire de formiate d'ammonium (pH=3,4), on dissout 4 g de poudre active, et on fait passer cette solution à travers une colonne

  
(50 x 7,5 cm) remplie de SP-Sephadex C-25, tamponné avec la solution de formiate d'ammonium 0,1 M, et on élue successivement, à raison de 40 1 pour chaque concentration et avec un débit de 500 ml par heure, avec des solutions de formiate d'ammonium aux concentrations graduellement croissantes de 0,1 à 0,7 molaire. L'éluat est récolté

  
en fractions de 400 ml. Les fractions contenant la substance active (150 à 200) sont réunies, concentrées par passage à travers une membrane filtrante Amicon UM-2 et lyophilisées pour fournir 250 mg de poudre active (à 200 MRC u/mg).

  
De cette poudre, on dissout 60 mg dans 1 ml de solution de formiate d'ammonium 0,1 M, contenant 480 mg d'urée, et cette solution est passée à travers une colonne
(1,2 x 250 cm), remplie de Sephadex G-50 tamponné au .formiate d'ammonium, dans laquelle on élue à l'acide formique aqueux 0,1 normal avec un débit de 5 ml par heure, l'éluat étant récolté sous forme de fractionsde 4 ml.

  
Les fractions contenant la substance active (70 à 83)

  
sont réunies et donnent par lyophilisation 23 mg de poudre active (à 400 MRC u/mg).

  
De cette poudre, on dissout 90 mg dans 10 ml d'eau, dont le pH est amené à 4,37 à l'aide d'acide chlorhydrique et que l'on fait passer sur une colonne (1,2 x 35 cm) de carboxyméthyl-cellulose, équilibrée à pH 4,37 par de l'acétate d'ammonium 0,01 molaire, qui est successivement traitée avec 1 1 d'acétate d'ammonium 0,01 M et 2 1 de formiate d'ammonium 0,01 M (ces deux solutions ayant un pH de 4,37), et pour finir à raison de 35 ml par heure avec des volumes de 2,5 1 de solutions de formiate d'ammonium à  <EMI ID=28.1> 

  
à 0,07 molaire (pH 6,0). L'éluat est récolté en fractions de 20 ml, dont les fractions contenant la substance active
(108 à 125) sont réunies et donnent par lyophilisation

  
9 mg de poudre (à 2000 MRC u/mg).

  
Pour finir, ces 9 mg de poudre sont dissous dans

  
1 ml d'acide formique aqueux 0,1 N, auquel on fait à nouveau traverser une colonne (1,2 x 250 cm) de Sephadex G-50 et qui est élué avec un débit de 5 ml par heure avec la même solution d'acide formique. Parmi les fractions successives de 4 ml, les fractions 71 à 77 sont réunies et donnent par lyophilisation 3 mg de poudre active ( à 4000 MRC u/mg).

  
Les analyses par chromatographie en couche mince et électrophorèse sur disque confirment que cette poudre est formée d'une seule substance pure, dont un groupe terminal comprend de l'azote.

  
Les proportions molaires respectives des acides aminés constituant cette substance ressortent du tableau ci-après. Cette détermination est effectuée comme suit :

  
20 Y de la poudre sont hydrolysés pendant 24 heures &#65533;. 105[deg.]C par de l'acide chlorhydrique 6 N. Après dessalage, le produit hydrolysé est dissous dans 1,2 ml de tampon citrate 0,2 N (pH = 3,25) et un échantillon de 1 ml est utilisé pour les analyses.

  

 <EMI ID=29.1> 
 

  
 <EMI ID=30.1> 

  
720 mg de

  
BOC-Lys (DIP)-Leu-Ser (Bzl)-Gln-Glu (OBzl)Leu-His-Lys (DIP)-Leu-Gln-Thr (Bzl)-Tyr (Bzl)Pro-Arg (Tos)-Thr (Bzl)-Asp (OBzl)-Val-Gly-

  
 <EMI ID=31.1> 

  
sont dissous à -5[deg.]C dans 5 ml de TFA. Après une agitation de 35 mn à la température ordinaire, la solution est concentrée sous vide, puis l'addition d'éther éthylique provoque la formation d'un précipité, qui est séparé et séché sur hydroxyde de sodium.

  
Le précipité sec est redissous dans 1 ml de DMF,

  
 <EMI ID=32.1> 

  
BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-OH,

  
ces additions s'effectuant à -5[deg.]C et étant suivies d'une

  
 <EMI ID=33.1> 

  
 <EMI ID=34.1> 

  
provoque la formation d'un précipité, qui est séparé par filtration, lavé à fond à l'eau et à l'acétate d'éthyle et séché sous vide ; rendement 740 mg de substance brute.

  
640 mg de ce produit brut sont traités pendant

  
1 heure &#65533; 20[deg.]C par l'acide fluorhydrique en présence de

  
30 g de phénol et de 2,5 ml d'anisole. Après élimination de l'acide fluorhydrique par distillation, le résidu est dissous dans 200 ml de AcOH 0,5 M, et cette solution, après lavage arec
150 ml d'acétate d'éthyle, traverse une colonne (2 x 20 en) de

  
 <EMI ID=35.1> 

  
lyophilisation 590'mg de poudre.-

  
500 mg de cette poudre sont dissous dans 50 ml d'eau, acidifiée par l'acide chlorhydrique au pH de 4,37, la solution passant ensuite à travers une colonne (2,0 x 63 cm) de

  
 <EMI ID=36.1>   <EMI ID=37.1> 

  
de tampon acétate 0,01 molaire (pH=4,57), puis par 8 1 de formiate d'ammonium 0,01 molaire (pH=4,37), et pour finir

  
12 1 de solutions de formiate à concentration progressivement croissante de 0,01 (pH=4,37) à 0,07 molaire (pH=6,0). L'éluat est récolté en fractions de 100 ml, les fractions contenant la substance active sont réunies et donnent par lyophilisation la poudre active, dont 50 mg sont dissous dans 5 ml d'acide formique 0,1 normal, puis traversent une colonne (1,2 x 250 cm) de Séphadex G-50, où ils sont élués avec un débit de 10 ml par heure avec l'acide formique

  
0,1 normal. Par lyophilisation des fractions contenant la substance active, on obtient la substance pure, dont le point de fusion est de 220[deg.]C (avec décomposition), le

  
 <EMI ID=38.1> 

D

  
l'activité de 4000 MRC u/mg. La composition et les proportions relatives des acides aminés sont les suivantes :

  

 <EMI ID=39.1> 


  
 <EMI ID=40.1> 

  
(support : cellulose ; éluant : mélange
15:10:3:12 de n-butanol, de pyridine, de AcOH et d'eau).

Claims (1)

1. <EMI ID=41.1>

   <EMI ID=42.1>

   et ses sels d'addition physiologiquement acceptables, possédant une activité hypocalcémiante.