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PROCEDEAMELIOREPOURLAPREPARATIONDETRIPEPTIOE ALDEHYDES
La présente invention est relative à un procédé amélioré pour la préparation de tripeptide aldéhydes de formule 1 :
P-D-Phe-Pro-Arg-H. H2S04 1 dans laquelle :
R est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle.
Phe est un groupe phénylalanines
Pro est un groupe L-proline et
Arg est un groupe L-arglnine, ayant une pureté convenable pour une utilisation pharmaceutique.
[Les abréviations de la L-proline et de la L-arginine sont Pro et Arg selon l'art antérieur, voir par exemple Biochem. 7, 126, 773 (1972),Biochemistry14,449(1975)].
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On sait que les sels de D-phényialanul-L-prolyl-Larginine aldéhyde (H-D-Phe-Pro-Arg-Hj présentent une activité antithrombine. Cependant, l'acétate décrit dans le brevet hongrois Ho 169. 870 ne convient pas pour une utilisation thérapeutique parce qu'il perd très rapidement son activité, soit sous forme solide soit sous forme d'une solution aqueuse. Le même phénomène peut être observé dans le cas du chlorhydrate, du citrate, du tartrate, du tosylate et du dérivé NG-carboxy du tripeptide aldéhyde. Cependant, le sulfate de H-D-Phe-Pro-Arg-H et le dérivé N-méthyle de celui-ci sont extrêmement stables, même sous forme de solution aqueuse (brevet britannique No 2. 091. 270 et demande publiée de brevet européen No 185. 390) et peuvent donc être utilisés dans le domaine thérapeutique.
Les sulfates ci-dessus peuvent être préparés de la façon suivante :
1. Le sulfate de H-D-Phe-Pro-Arg-H peut être préparé selon le brevet britannique No 2. 091. 270 à partir de l'hémisulfate de
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t-butoxycarbonyl-D-phènylalanul-L-prolyi-L-arginine aldèhyde ou . partir du t-butoxycarbonyl-D-phényialanyi-L-prolyl-NOcarboxu-L-argtntne afdehude en présence de 1 à 12 équivalents d'acide sulfurique aqueux 1 à 12 N à une température de 40 à 50. C.
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La préparation de la première matière de départ est décrite dans l'exemple 1 du brevet cité plus haut, tandis que la préparation du
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dérivé N'--carboxu-protégé est décrite dans ! e brevet belge No. e 880. 844.
2. Le sulfate de H-O-Phe-Pro-Arg-H peut être également préparé selon la description indiquée plus haut, par hydrogénolyse du benzutoxucarbonut-D-phénuiatanut-L-protut-NS-benzutoxucarboxy-L-arginine aldéhyde (Z-D-Phe-Pro-ArgtZJ-Hj en présence d'une quantité molaire équivalente d'acide sulfurique. La préparation du tripeptide aldéhyde doublement protégé utilisé comme matière de départ, est décrite dans le brevet hongrois No.
169. 870.
3. Selon la demande publiée de brevet européen No 1 85. 390,
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le sulfate de N-méthut-D-phénutatanut-L-protut-L-argtntne atdéhude H-t-D-MePhe-Pro-Arg-H. HgSCJ est préparé selon une méthode analogue a celle du sulfate de tripeptide aldéhyde libre par élimination des groupes protecteurs du N-benzyloxycarbonyl-N- ¯41oxycarbonyi-Nméthut-Q-phénutatanut-L-protut-NO-benzutoxucarboxu-L-arginine aldéhyde au cours d'une hydrogénolyse en présence d'acide sulfurique. La préparation du tripeptide aldéhyde utilisé comme matière de départ est décrite dans la même demande.
Le principal inconvénient des procédés ci-dessus réside en ce que, si la production est conduite à grande échelle, ils ne fournissent pas un produit ayant une pureté appropriée.
Ainsi par exemple, le produit obtenu par le procédé No 1 comprend environ 4 à 6% de sulfate de calcium. Une analyse chromatographique en couche mince indique que le produit ainsi obtenu peut comprendre plus d'environ 10% d'autres impuretés (par exemple, tripeptide alcool, -acide, -acétal) en plus du sel de calcium,, ceci signifie que la quantité totale de substances contannnantes peut dépasser 20%. Il y a un autre inconvénient en ce que la neutralisation de l'excès d'acide sulfurique et la filtration du 3ulfate de calcium précipité soulèvent d'autres difficultés.
Le sulfate de tripeptide aldéhyde préparé par le procédé No 2 (hudrogénotuse) comprend en plus des 5 à 10% de
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contaminant détectables par analyse chromatographique en couche mince, une teneur de 10 à 155% de sulfate de tripeptide atdéhude de configuration D-L-D déterminée pan analyse HPLC ; aidehyde de confi minee par ainsi, il peut y avoir un total de 15 a zu de contaminants.
Les 5 à 0% de contaminants indiqués pius haut sont composés des substances suivantes : tripeptide acide formé pendant la synthèse du tripeptide aldéhyde, tripeptide alcool, un produit de décomposition cyclique dont la structure est décrite dans la demande de brevet européen publiée No 185. 390 et une substance de structure inconnue formés en différentes quantités, dont la tache est située en-dessous de celle du composé cible sur le chromatogramme.
On a observé que la"surhydratation"joue un rôle important dans la production du dernier produit secondaire. A savoir, si l'hydrogénolyse est effectuée de façon connue en ellemême, c'est-à-dire en présence d'un équivalent molaire d'acide sulfurique à température ambiante et que le procédé est poursuivi après achèvement de l'hudrogénolyse, une tache supplémentaire (Rf = 0, 39 à 0, 44) correspondant à une contamination apparaît toujours en-dessous de la tache du produit (dans le cas de H-D- Phe-Pro-Arg-H.
H2S04, Rf = 0,52 à 0, 571 sur le chromatogramme en couche mince (adsorbant : Kiesetget S, étuant : mélange 26/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau ; révélateur : chlorotolidinej, cette contamination représentant dans certains cas la principale impureté.
Pour éliminer cette contamination, le point final de la réaction doit être détecté très exactement et la réaction doit être arrêtée lorsque le point final est atteint.
Cependant, comme le point final de la réaction est déterminé par analyse chromatographique en couche mince et que l'analyse demande 20 à 30 minutes, si le mélange éluant ci-dessus est mis en oeuvre, la réaction ne peut pas être stoppée au point final en particulier dans des conditions industrielles. Ainsi, le
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produit secondaire ayant la valeur Rf définie plus haut est généralement produit en une quantité d'environ 3 à 4% en raison
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d'une"surhudratation". Ce produit secondaire est plus toxique que le produit final et il dot donc être éliminé également pour cette raison.
Le produit risque fortement de subir une racémisation, si bien que les substances contaminantes formées pendant les procédés décrits ci-dessus ne peuvent pratiquement pas être enlevées. Comme le produit final ne peut pas être purifié, la production d'intermédiaires ayant une pureté convenable et la suppression de la formation du produit secondaire doivent être résolues pour fournir un produit final dont la pureté convient pour une utilisation pharmaceutique. Ceci signifie l'inhibition de la racémisation pendant te procédé.
Le but de la présente invention est de fournir un procédé qu ! permet de supprimer la formation des produits secondaires mentionnés ci-dessus et de préparer des sels de tripeptide aldéhydes de formule 1 ayant une pureté d'au moins 95%.
L'invention repose sur la constatation selon laquelle la formation du produit D-L-D, c'est-à-dire la racémisation, est
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fortement influencée par le pH. Dans un milieu ayant un pH alcalin et même dans un milieu ayant un pH neutre, le produit final et les intermédiaires subissent une racémisation. Dans un milieu ayant un pH acide (pH = 2), le produit final est stable pendant des mots. Il faut donc élaborer une technologie qui assure que le pH du mélange réactionnel ne devient pas neutre ou même basique en peu de temps.
Pour cela, l'arginine lactame est libéré à partir de son sel in situ pendant la condensation, par l'intermédiaire d'un anhydride mixte, du chlorhydrate de NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame de formule tV :
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où Arg est tel que décrit plus haut et Z est un groupe benzyioxucapbonyle, et du dipeptide de formule V
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ou P. Phe. Pro et Z sont tels que définis plus haut, de telle sorte o u que la base est par la suite ajoutée au mélange réactionnel. Dans
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cas conditions.. i'ar'ginine iactame libéré in situ réagit tout de suite, in statu nascendi, avec l'anhl In statu nascendi, avec i'anhudride mixte en donnant le tripeptide lactame protégé correspondant de formule fi)
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où Z, P.
Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, si bien que la formation d'un milieu basique aboutissant à une racémisation peut être éliminée.
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De plus, la présente invention repose sur la constatation selon laquelle, si le complexe formé avec l'hydrure boroaluminique pendant la réduction du tripeptide lactame protégé de formule t ! ! obtenu de la façon décrite plus haut, est décomposé de telle manière que le milieu réactionnel est ajouté à la solution d'acide sulfurique froide (0-SOC) diluée, de préférence 1 N utilisée en excès, contrairement au procédé de la demande de brevet européen No 185. 390, dans lequel l'acide sulfurique est ajouté au mëlange réactionnel, le pH acide du mélange réactionnel peut être assuré. Ainsi, la racémisation du tripeptide aldéhyde protégé peut être évitée ou notablement réduite.
De plus, la présente invention repose sur la constatation selon laquelle l'hydrogenolyse du tripeptide aldéhyde de formule ! préparé de la façon décrite plus haut, doit être effectuée en présence d'un excès d'acide sulfurique à une faible température inférieure à 10. C, de préférence comprise entre 6 à 8 C.
Les données expérimentales de la Demanderesse ont montré que si l'hydrogénolyse de Z-D-Phe Pro-Arg (Z)-H était effectuée à différentes températures en présence d'un équivalent molaire d'acide sulfurique, les impuretés détectables par analyse chromatographique en couche mince du produit ainsi obtenu étaient les suivantes : 17% à 40 C, 10% à tenmpérature ambiante (20- 26 C), 4% à 6-10 C. Les teneurs en isomère D-L-D du produit détectables par HPLC étaient le suivantes : 12%, 5% et 2 à 3%, respectivement, c'est-à-dire que la teneur totale en impuretés du produit était de 29, 15 et 6-7, respectivement.
Ceci signifie que si l'hydrogénolyse est réalisée à des températures inférieures. la
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quantité de sous-produits est notablement réduite tandis que le temps nécessaire à l'hydrogenolyse n'augmente pas remarquablement avec la réduction de température.
Si l'hydrogénolyse est réalisée à des températures inférieures en présence d'un excès d'acide sulfurique, on observe un grand avantage supplémentaire en ce que la formation du sousproduit ayant un Rf de 0. 39 à 0,44 peut être notablement réduite et que la détection exacte du point final de la réaction n'est ainsi pas nécessaire. Selon les expériences de la Demanderesse, si 'hydrogénolyse de Z-O-Phe-Pro-Arg (Z)-H est réalisée en présence de 1.5 à 1,7 équivalent molaire d'acide sulfurique dans du tétrahudrofuranne a une température de 6 à 8'C, le produit secondaire ayant la valeur Rf ci-dessus est formé qu'en traces même après une heure de "surhydratation".
De plus, il est préférable d'utiliser de l'acide sulfurique au cours de toutes les étapes du procédé parce que dans le cas où par exemple de l'acide chlorhydrique est utilisé, le sulfate peut être contaminé par des ions chlorure.
A la suite des réactions menées de la façon indiquée plus haut, la quantité d'isomère O-L-O dans le produit final de formule 1 est d'au plus 2 à 4%, tandis que les autres contaminants (tripeptide acide et-alcool) sont formes en une quantité inférieure à 1%.
A partir de ce qui précède, l'invention se rapporte à un procédé amélioré pour la préparation de tripeptide aldéhydes de formule 1.. dans laquelle R, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, sous une forme pure du point de vue pharmaceutique, par condensation d'un lactame de formule IV, dans laquelle Arg est tel que défini plus haut et Z est un groupe benzyloxycarbonule, avec un dipeptide de formule V, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Z sont tels que définis plus haut, par l'intermédiaire d'un anhydride mixte, réduction du tripeptide lactame de formule ttt dans laquelle R, Z,
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Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, avec de l'hydrure aluminolithlque,
et hydrogénolyse du tripeptide aldéhyde protégé de formule Il ainsi obtenu, dans laquelle P., Z, Phe et Arg sont tels que
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définis plus haut, en présence d'acide sulfurique, qui comprend : al) la libération du L-arginine lactame NG-protégé in situ pendant la condensation du chlorhydrate de L-arginine tactame NG-protégé de formule IV, dans laquelle Z est tel que défini plus haut avec du dipeptide de formule V, dans laquelle R, Z, Phe et Pro sont tels que définis plus haut, par l'intermédiaire d'un anhydride mixte dans le mélange réactionnel, par addition ultérieure d'une base au mélange de ces composants réactionnels, puis la réduction du tripeptide lactame protégé ainsi obtenu de formule ttt,
dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, la décomposition du complexe ainsi formé par addition du mélange réactionnel à un excès d'acide sulfurique 1 N à une température de 0 à SOC, puis la réalisation de l'hydrogénolyse du tripeptide protégé de formule Il, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut à une température inférieure à 1 O'C en présence de 1 à 2 équivalents molaires d'acide sulfurique ou a2) après réduction du tripeptide lactame protégé de formule ttt, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, la décomposition du complexe ainsi formé par addition du mélange réactionnel à un excès d'acide sulfurique 1 N à une température de 0 à 5'C,
puis la réalisation de l'hydrogénolyse du tripeptide protégé de formule Il ainsi obtenu, dans laquelle R, Z, PHe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, à une température inférieure à 1 onc en présence de 1 ou 2 équivalents molaires d'acide sulfurique ou a3) ta réalisation de l'hydrogénolyse du tripeptide protégé de formule Il, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, à une température inférieure à 10 C en présence de 1 ou 2 équivalents molaires d'acide sulfurique.
Selon la présente invention, la réaction est de préférence conduite de la façon suivante :
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Le groupe t-butoxycarbonyle protecteur du tbutoxycarbonyl-NO-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame est éliminé de façon connue per se. Le chlorhydrate de Nom- benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame de formule IV ainsi obtenu
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est maintenu en solution dans du diméthulformamide à une température de-1 5'C a-20'C, puis la solution est ajoutée à l'anhydride mixte forme à partir du dipeptide de formule V
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t. benzutoxucarbonut-D-phénutatanut-L-protine ou N-méthut- benzyloxycarbonyl-O-phénylalanyl-L-proline) et de l'ester isobutylique d'acide chlorocarbonique. La base..
de préférence) la trièthylamane est ensuite ajoutée au mélange réactionnel. Dans ces conditions, le lactame libéré in situ sous faction de la base, réagit aussitôt avec l'anhydride mixte pour former un tripeptide lactame protégé et ainsi la formation du milieu basique provoquant la racémlsation peut être évitée. Si cela est désiré, le produit ainsi obtenu peut être purifié au cours d'une purification rapide à travers un lit de gel de silice. En choisissant la séquence
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d'opérations ci-dessus, qui diffère de celle de fart antérieur, il est inutile de procéder à une purification coûteuse du tripeptide lactame protégé par chromatographie sur cotonne.
Le tripeptide lactame protégé de formule tti ainsi obtenu est réduit par de l'hydrure aluminolithique dans du tétrahydrofuranne anhydre. Le complexe ainsi formé est décomposé, contrairement à ce que préconise la demande de brevet européen No 185.390, par addition du mélange réactionnel à une solution diluée de préférence 1 N d'acide sulfurique utilisée en excès avec refroidissement à une température de 2 à 4'C. Le pH final de 2-3 est ajuste par addition facultative d'acide sulfurique.
Le mélange réactionnel est ensuite traité de façon connue per se.
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Le tripeptide aldèht Le trtpeptide atdéhude protégé de formule Il ainsi obtenu est purifié par filtration à travers un lit de gel de silice.
L'hydrogenolyse est de préférence réalisée dans un solvant organique polaire, de préférence te tétrahudrofuranne ou un alcanol inférieur, par exemple le méthanol, l'éthanol, l'i-propanol, de préférence l'éthanol. Il est préféré de ne pas effectuer l'hydrogénolyse dans un système fermé, mais plutôt de faire barbotter de l'hydrogène dans le mélange réactionnel. En pratique,
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on fait barbotter de l'hydrogène gazeux à travers le système sous jstème : sous une forme finement divisée qui, par exemple, peut être assurée par
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passage du gaz à travers un filtre G2.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé, te tripeptide aldéhyde protégé de formule Il de pureté convenable ainsi préparé, est dissous dans du tétrahtjdrofuranne et la solution ainsi obtenue est ajoutée à une suspension aqueuse refroidie de catalyseur comprenant 1, 5 à 1, 7 équivalent molaire d'acide sulfurique 1 N. Le raport du solvant organique Åa la fraction aqueuse est de 70-50/30-50, de préférence de 60/40. En tant que catalyseur, on utilise de préférence de 10 à 30% en poids d'un catalyseur comprenant 1 0% de palladium sur du charbon ou du platine. L'hudrogénation est conduite sous refroidissement à une température de 6-8 C, par barbottage d'hydrogène gazeux finement divisé à travers le système.
Le déroulement de la réaction est suivi par analyse chromatographique en couche mince.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé, le tripeptide aldéhyde protégé utilisé comme matière de départ, est dissous dans du tétrahudrofuranne et un catalyseur comprenant ! ; en poids de palladium précipité sur un support de sulfate de baryum ou d'oxyde d'aluminium, de préférence de sulfate de baryum, est utilisé en tant que catalyseur.
L'hydrogénation est effectuée à une température de 6 à 8'C en présence de 1,5 équivalent molaire d'acide sulfurique 1N par barbottage d'hydrogène gazeux finement divisé dans le système. Le déroulement de la réaction est suivi par analyse chromatographique en couche mince.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé. le tripeptide protégé de départ est dissous dans de l'éthanol, puis la solution est ajoutée à une suspension refroidie aqueuse de catalyseur comprenant 10% de palladium sur du charbon. L'hydrogénation est conduite à une température de 6 à
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8'G par barbotage d'hydrogène gazeux finement divisé dans le système. Le procédé est suivi par chromatographie en couche mince.
Le produit peut être simplement récupéré à partir du mélange réactionnel par filtration du catalyseur et évaporation du
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solvant organique du mélange solvant organo-aqueux à une température inférieure à 40. C. de préférence entre 25 et 30. C. puis lyophilisation de la solution aqueuse soit directement, sot après ajustement du pH à environ 4. Le pH est de préférence ajusté au moyen d'une résine échangeuse d'ions de phase hydroxy ou avec de l'acide sulfurique OJN.
Lorsque le procédé suivant l'invention est effectué dans une unité pilote, ta contamination maximum du produit ainsi obtenu (sulfate de O-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine-aldéhyde et sulfate de N-méthyl-O-phénylalanyl-L-p[rolul-L-argininealdéhyde), détectable par analyse chromatographique en couche mince, est d'au plus 1", *, tandis que sa teneur en isomère D-L-D est d'au plus 2 à 4%. Ainsi, la quantité totale d'impuretés peut être
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réduite à environ zu ce qui est en accord avec les conditions fixées pour les substances pharmaceutiques, alors que les procédés connus fournissent des teneurs en impuretés de 15 à 25%.
La présente invention est davantage ilustrée par les exemples non limitants suivants.
Les valeurs Rf ont été déterminées par chromatographie en couche mince sur gel de silice (Kieselgel G, Renal, Budapest) avec les mélanges étuants donnés dans tes exemples. Développement : les plaques chromatographiques chlorées ont été traitées avec une solution d'o-tolidine (2, 5 g d'otolidine et 10 ml d'acide acétique dissous dans 500 ml d'eau) après séchage.
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Exemple 1 Préparation du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde 201 g (0, 3 mole) de benzyloxucarbonyl-O-phénylalanyiL-prolyl-N6-benzi e L-protut-NS-benzutoxucarbonut-L-arginine atdéhude sont dissous dans 2 litres de tétrahydrofuranne à température ambiante. Simultanément, 60 g d'un catalyseur comprenant 10% de palladium sur du charbon en suspension dans 0,6 litre d'eau désionisée, puis
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900 mi d'acide sulfurique 1 N (0, 45 mole) sont ajoutés. La suspension comprenant le catalyseur est refroidie à une température de 2 à 5. C. puis additionnée de la solution tètrahudrofuranique du tripeptide aldéhyde protégé avec 0, 2 litre supptémentaire d'eau désionisée, sous agitation.
On fait ensuite barbotter de l'hydrogène gazeux à travers le mélange, en maintenant la température de celui-cl à 6-8 C et en l'agitant.
Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince avec un mélange 60/20/6/11d'acétated'éthyle/pyridine/acideacétique/eaucomme éluant. Les valeurs Rf de la matière de départ, de l'intermédiaire et du produit final sont de 0, 92-0, 96, 0,38-0,44 et 0,00-0,10, respectivement-
La réaction est achevée en 3-4 heures. A la fin de la
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réaction, le catalyseur est séparé par filtration et lavé avec 3xl00 ml d'eau désionisée. Le filtrat et la liqueur de lavage sont combinés, puis le tétrahudrofuranne est chassé par distillation dans un évaporateur rotatif sous vide à une. température de 25-30. C.
La solution aqueuse résiduelle est extraite avec 2x300 ml de dichlorométhane, puis le pH de la phase aqueuse est contrôlé.
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Si le pH est différent de 4, le pH est alors ajusté à 4 par de l'acide sulfurique OJN ou avec une résine d'échange d'ions à cycle OH- (par exemple AG 1x2).
Le volume de la solution est complétée à 1, 5 litre avec de l'eau désionisée, puis la solution est lyophilisée. Ainsi, on obtient 125 g (83,2%) du produit recherché.
Pf = 0.52 à 0,57 lacétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau =
25/20/6/11]
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[c < ,] 20r) =-t] 7'tc= Leau)
La teneur totale en impuretés déterminée par analyse chromatographique en couche mince est de 3 à 5%, tandis que la
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teneur en isomère D-L-D est d'environ 2 à 3% par HPLC.
Le benzutoxucarbonut-D-phénutatanui-L-protut-NSbenzyloxycarbonyi-L-arglntne aldéhyde utilisé comme matière de départ, peut être préparé de la façon suivante.
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Etape ! Benzuioxucarbonuf-D-phénuiatanui-L-proiui-NBji ji benzu) oxucarbonut-L-arg) nine iactame 429, 5 g U, 1 mole) de t-butoxycarbonyl-N6benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame (demande de brevet européen publiée No. 185. 390) sont mis en suspension dans 1300 ml de chloroforme anhydre. Ensuite, on ajoute goutte-à-goutte 1300 ml d'acétate d'éthyle chlorhydrique (189 g/100 ml, environ 5N) sous agitation et refroidissement avec de l'eau glacée, de façon à éviter une augmentation de la température au-delà de 15 C. La dissolution et la précipitation d'une substance cristalline commence peu après. La suspension est agitée à la température ambiante pendant 3 heures, puis est diluée avec 3000 ml d'un mélange séché 1/1 d'éther et d'acétate d'éthyle.
La substance cristalline précipitée est séparée par filtration, lavée avec 2x 1000 ml d'acétone et 500 ml d'éther, puis séchée sur de l'hydroxyde de potassium solide et du pentoxyde de phosphore dans un dessiccateur à vide.
Après environ une heure de séchage, le chlorhydrate de NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame est dissous dans 1000 ml de diméthylformamide anhydre, refroidi à une température de -15 C à -20 C et ajouté à un anhydride mixte préparé de la façon suivante :
396 g (1 mole) de N-benzuloxycarbonyi-D- phénylalanyl-L-proline (E. Nicolaides et coll. : J. Med. Chem. 11, 74 (1968) et la demande de brevet européen publiée No. 185. 396), sont dissous dans 1000 ml de diméthylformamide anhydre et additionnés de 111 ml (1 mole) de N-méthyl-morpholine. Le mélange est ensuite refroidi à une température de -15.
C et 132 ml ! M mote) d'ester isobutylique d'acide chforocarbontque sont ajoutés goutte-à- goutte à la même température sous agitation en 5 à 10 minutes.
L'anhydride mixte est refroidi à une température de -20 C à -25 C après 10 minutes d'agitation et combiné avec la solution dans le diméthylformamide du chlorhydrate de NO-benzyloxycarbonyi-L- arginin lactame obtenue plus haut. Ensuite, 308 mi (2, 2 moles) de
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triethylamine sont ajoutés goutte-à-goutte au mélange réactionnel à la même température en environ 30 minutes, puis la suspension est agitée pendant une heure supplémentaire à une température de-20'C à-15'C. Le pH de l'espace vapeur est contrôlé avec un papier pH humide : si te pH tombe en-dessous de 8, de la triéthylamine suppiémentaire est ajoutée.
Le mélange est ensuite dilué avec 2 litres de benzène, les sels précipités sont séparés par filtration et lavés avec 2x500 ml de benzène.
Le filtrat de benzène-diméthylformamide est additionné de 1, 5 litre d'eau et les phases sont séparées. La couche aqueuse inférieure de diméthylformamide est extraite avec 2x500 ml de benzène. Les solutions benzéniques combinées sont lavées avec 2xO, 5 litre d'eau, ! xO, 5 litre d'acide sulfurique 0, 1N et 3xO, 5 litre d'eau, séchées sur sulfate de sodium anhydre et évaporées à 2 litres sous vide à une température d'au maximum 40. C.
360 g de Kiegelgelz adsorbant sont mis en suspension dans du benzène et un lit filtrant est prepare avec un rapport du diamètre à la hauteur de 8/1 Åa 4/1. La solution benzénique est aspirée à travers le lit filtrant sous un léger vide, puis le lit filtrant est lavé avec 4, 8 litres de benzène de la même façon. Les solutions benzéniques combinées sont concentrées à
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environ 600 ml sous vide à une température d'au plus 40. C, puis 3 litres d'éther diisopropylique sont ajoutés sous vigoureuse agitation.
Le filtrat est séparé par filtration, lave avec 2x600 ml
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d'éther diisopropylique et séché dans un dessicateur à vide sur du pentoxyde de phosphore et des copeaux de paraffine. On obtient ainsi 510 g (76 : ) du produit recherché. La teneur totale en contaminant du produit, telle que déterminée par chromatographie en couche mince, est de 1 à 2%.
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Rf = 0, 55 à 0, 65 {acétate d'éthyle}.
La valeur Rf du D-L-CI lactame est de 0, 45 à 0, 50 dans l'acétate d'éthule.
M20Q =-55,8 (c = 1, tétrahydrofuranne).
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Etage 2 Benzuioxucarbonut-D-phénutatanut-L-protut-NOBenzL benzyloxycarbonyl-L-arglnine aldéhyde
300 g (0, 45 mole) du tripeptide lactame protégé de l'exemple t, étape 1, sont dissous dans 2. 5 litres de tétrahjjdrofuranne anhydre refroidi à une température de -5. C. La solution est refroidie à une température de -20. C à -25. C dans un bain de neige carbonique/acétone et une solution d'hydrure aluminolithique et de tétrahydrofuranne ayant une concentration
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d'environ 0, 7 mole/litre.. correspondant à 0, 376 mole d'hydrure aluminolithique, est ajoutée sous vigoureuse agitation en 20 à 25 minutes.
Le déroulement de la réduction est suivi par chromatographie en couche mince avec un mélange 240/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme gluant En cas de besoin, une quantité supplémentaire d'hydrure aluminolithique est ajoutée jusqu'à disparition de la tache ayant une valeur Rf de 0,75 à 0,80, qui correspond au lactame.
Lorsque la réaction est achevée, le mélange réactionnel est versé peu-à-peu dans 3 litres de solution d'acide sulfurique 1 N à une température de 2-3 C sous agitation. Le pH final est ajusté par l'addition éventuelle d'une quantité supplémentaire d'acide sulfurique. De l'eau est ajoutée à la solution jusqu'à formation d'un trouble, puis celle-ci est extraite avec 3x0, 9 litre de n-hexane. Entre deux extractions, la matière se sépare sous forme de phase huileuse, elle est alors homogénéisée avec du tétrahydrofuranne, ensuite opalisée par addition d'un peu d'eau. La phase aqueuse est extraite avec 2x2 litres de dichlorométhane.
Les solutions dichlorométhaniques combinées sont lavées avec 2x0,2 litre d'une solution à 5% de carbonate acide de sodium à une température de 4 à 8'C, puis avec 2x0,5 litre d'eau distillée à une température de 4 à SOC. séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées sous vide à une température d'au plus 40 C. On obtient environ 300 g de substance huileuse.
Le résidu huileux est dissous dans un mélange 7/3 de dichlorométhane et d'acétone, envoyé à travers un lit filtrant
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(diamètre/hauteur = 5/1) préparé à partir de 900 g de Kieselgel-60 adsorbant avec un mélange 7/3 de dichiorométhane et d'acétone comme éluant sans aspiration, puis le lit filtrant est lavé avec 6 litres du même mélange éluant. Le procédé peut ne pas durer plus de 20 minutes. Les filtrats combinés sont évaporés à environ 600 ml à une température d'au plus 40'C, puis un litre de benzène est ajouté et la solution est à nouveau évaporée. le produit est ensuite précipité par addition de 1, 6 litre de cyclohexane sous agitation.
Le précipité est séparé par filtration, lavé avec 2x0,3 litre de
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cyclohexane et séché dans un dessicateur à vide à température ambiante sur des copeaux de paraffine. On obtient ainsi 240 g (79,7%) du produit recherché.
Rf = 0,52 à 0,62 (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau =
240/20/6/11).
La teneur en impuretés du. produit déterminée par
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chromatographie en couche mince est de 0, 5 à 2%. su =-0, 8" fic = !, tétrahydrofuranne).
Exemple 2 Préparation du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde 20, 1 g (0, 03 mole) de benzyloxycarbonyl-Dphényialanyl-L-prolyl-NS-benzyloxycarbonyl-L-arginine aidéhyde sont dissous dans 214 mi de tètrahydrofuranne et la solution est refroidie a une température de O. C. 4,3 g d'un catatuseur comprenant du palladium sur du charbon sont mis en suspension dans 70 ml d'eau désionisée, puis 102 ml d'acide sulfurique 1N (0, 051 mole) sont ajoutés. La suspension comprenant le catalyseur est refroidie à une température de 2 à 5 C et t'air est éliminé par un courant d'azote.
Ensuite, la solution tétrahydrofuranique du tripeptide aldéhyde protégé est ajoutée à la suspension sous
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agitation et de l'hydrogène gazeux finement divisé est envoyé à 4drogp travers le système, dont la température est maintenue à 6-8 C avec de la glace. Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince avec le même
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mélange éluant que celui qui est décrit dans l'exemple. A la fin de la réaction (3-4 heures le mélange réactionnel est traité selon la procédure de l'exemple 1. Rendement: 12,5 g (83,2%).
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Rf = 0, 52 à 0, 57 (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau = 25/20/6/1 1) [ =-n7' (c= Leau) La teneur en impuretés déterminée par analyse chromatographique en couche mince est de 3, 5%, tandis que la teneur en isomère 0-L-O est d'environ 1, 5% (HPLC).
Exemple 3 Préparation du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolul-L-arginine aldéhyde 20 1 g (0.. 3 mole) de benzuioxucarbonui-D-phénutatanutL-prolyt-NB-benzyloxycarbonyl-L-arginine aldéhyde sont dissous dans 2 litres d'éthanol à température ambiante. 60 g d'un catalyseur comprenant 10% de palladium sur du sulfate de baryum comme support, sont mis en suspension dans 0, 6 litre d'eau désionisée, puis additionnés de 600 ml d'acide sulfurique IN (0, 3 mole). La suspension est refroidie à une température de 2 à 5 C et la solution éthanolique du tripeptide aldéhyde protégé est ajoutée.
De l'eau désionisée est ensuite ajoutée en une quantité qui correspond à un rapport 6/4 du solvant à la phase aqueuse.
On fait ensuite barbotter de t'hudrogenc gazeux à
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travers le mélange ag travers te mélange agité, en maintenant la température de celui-ci à 6-S. C. Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince selon la procédure de l'exemple 1. A la fin de la réaction (environ 3 à 4 heures), le catalyseur est séparé par filtration et lavé plusieurs fois avec de l'eau désionisée. Les filtrats sont combinés et l'alcool est chassé dans un évaporateur rotatif à une température de 25-30 C. La solution aqueuse ayant un pH d'environ 3-4, est directement lyophilisée.
Ainsi, on obtient 1 0 1 g (65%) du produit recherché sous forme de monohydrate, ayant la même qualité que le produit obtenu dans l'exemple 1.
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Exemple 4 L 4 Préparation du sulfate de D-phényialanut-L-prolui-L-argtnine aldéhyde
La procédure de l'exemple 3 est suivie, sauf que 43 g de catalyseur comprenant 1 0% de palladium sur du-charbon, prélablement lavè jusqu'à neutralité, sont utilisés en tant que
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catait cataiuseur. Ainsi, on obtient 125J g {83. 2%) du produit recherché ayant la même qualité que le produit obtenu dans l'exemple 1.
Exemple 5
Préparation du sulfate de N-méthyl-O-phénylalanyi-L-protyl-L- arginine atdéhude
20, 5 g t0, 03 mole] de N-benzyloxycarbonyl-N-méthyl-
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D-phénuiaianut-L-protut-NO-benzuioxucarbonut-L-argtnine aldéhyde sont dissous dans 2 M m) d'éthanot, puis additionnés de 110 mil d'eau désionisée, de 60 ml d'acide sulfurique 1N (0,03 mole) et de 3 g d'un catalyseur comprenant 10% de palladium sur du charbon. On fait ensuite barbotter de l'hydrogène gazeux finement divisé à travers le mélange, en maintenant la température de celui-
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ci à 6-88C. Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince avec un mélange 25/20/6/1 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme éluant.
Les valeurs Pf de la matière de départ, de l'intermédiaire et du produit final sont d'environ 0,9, 0,7 et 0,4 respectivement sur le chromatogramme. A la fin de la réaction (environ 2 heures), le
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catalyseur est séparé par filtration et lavé avec 3x30 mi d'eau désionisée. Le filtrat et la liqueur de lavage sont combinés et évapores dans un évaporateur rotatif jusqu'à environ 100 ml à une température d'au plus 25'C, puis le résidu est extrait avec 2x50 mi de dichlorométhane.
Les traces de solvant organique sont éliminées de la solution aqueuse par distillation et le résidu est dilué avec de l'eau désionisée à un volume d'environ 200 ml. On vérifie que le pH est à une valeur d'environ 4. En cas de besoin, le pH est ajusté par addition d'acide sulfurique OJN ou avec une résine échangeuse
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d'ions de phase OH- (par exemple AG 1 x8L puis la solution est gelée et lyophilisée. Ainsi, on obtient 12, 5 g (75} ;) du produit recherché.
Rf = 0,35 à 0, 45 (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau = 25/20/6/1) [α]20D=-126,0 ¯ 5 (c = L eau)
La teneur totale en impuretés déterminée par analyse chromatographlque en couche mince est de 2 à 5%, tandis que la teneur en impuretés par HPLC est d'environ 3-5%.
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Le N-benzylaxyoarbonyl-hl-methyl-O-phenylelanyl-LLe N-benzyloxi prolyi-NO-benzyloxycarbonyl-L-arginine aldéhyde utilisé comme matière de départ. peut être préparé de la façon suivante.
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Et-ap N-benzyloxycarbonyl-N-méthyl-O-phénylalanyl-L-prolyl-NGbenzyloxycarbonyi-L-arginine lactame 42. 95 g (0, 11 mole) de t-butoxucarbonut-NSbenzyloxycarbonyi-L-arginine lactame sont mis en suspension dans HO m) de chloroforme anhydre et additionnés de 275 mi d'acétate d'éthyle chlorhydrique (11-15 g/100 ml) sous agitation constante. Le mélange rédactionnel est agité à la température ambiante pendant 3 heures, le point final de la réaction est déterminé par chromatographie en couche mince avec un mélange 60/20/6/11d'acétated'éthyle/pyridine/acideacétique/eaucomme éluant. Les valeurs Rf de la matière de départ et du produit final
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sont d'environ 0, 9 et 0, 3 respectivement. A la fin de la réaction, le mélange est dilué avec 400 ml d'éther diéthylique.
La substance cristalline précipitée est séparée par filtration, lavée avec 2x] 00 ml d'éther diéthylique et 2x50 mi d'acétone, puis séchée sur du pentoxyde de phosphore et de l'hydroxyde de potassium dans un dessicateur a vide. Après environ 1-2 heures de séchage, le sel de lactame ainsi obtenu (environ 0, 1 mole), est dissous dans 100 mi de diméthylformamide anhydre et stocké à une température de - 15.
C jusqu'au moment de son utilisation par addition à un anhydride mixte préparé de la façon suivante :
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Libération de la N-benzyloxycarbonyl-N-méthyl-D-phénuialanyi-
L-prolin
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50. 9 g (0, 1 motel du sel de cyclohexyl ammonium de Nbenzuioxucarbonui-N-mèthui-D-phènuiaianui-L-proiine sont dissous dans 200 ml d'éther diéthylique et 120 ml (1 mole) d'acide sulfurique IN. La phase éthérée est lavée avec 2x50 mi d'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite à une température d'au plus 35'C jusqu'à obtention d'une huile épaisse.
Le résidu (environ 0,1 mole) est dissous dans 170 mi de diméthylformamide anhydre, refroidi à une température de - 15. C et additionné de 11, 2 ml (0, 1 mole) de N-méthyimorpholine sous agitation. Ensuite, 13, 2 ml de chlorure d'i-butoxycarbonyle sont ajoutés goutte-à-goutte à la même température ent 3 à 5 minutes.
Après 5 à 10 minutes d'agitation, la suspension de diméthylformamide ci-dessus du composé amino est ajoutée à l'anhydride mixte ainsi obtenu, puis 35 ml de triéthylamine sont ajoutés au mélange réactionnel sous vigoureuse agitation à une température de -20 à -25. C. Le pH de l'espace vapeur est contrôlé (il doit être supérieur à environ 8) et en cas de besoin, de la triéthuiamine supplémentaire est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité pendant une heure à une température de - 15. C, pendant
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une heure Åa O'C. puis il est dilué avec 200 m) de benzène et 150 mi d'eau.
Les phases sont séparées et la phase aqueuse est extraite avec 3x30 m ! de benzène. Les solutions benzéniques combinées sont lavées avec 2x50 mi d'eau, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées sous pression réduite à une température d'au maximum 40. C jusqu'à obtention d'une huile épaisse. Le résidu huileux est dissous dans 75 mi d'un mélange 2/1 d'éther et de tétrahydrofuranne et filtré à travers un lit filtrant de la façon suivante :
300 g (quantité quintuple) de Kiegelgel-60 adsorbant sont mis en suspension dans de l'éther et un lit filtrant est préparé
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avec un rapport du diamètre à la hauteur de 3 à 1.
La tache
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supérieure contaminante est éluée avec un mélange 95/5 d'éther et de tétrahydrofuranne, tandis que le produit désiré est éfué avec du tétrahudrofuranne pur. La teneur en substance des fractions est contrôlée par chromatographie en couche mince avec un mélange 480/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme éluant. La valeur Rf du produit désiré est de 0, 71 à 0, 75. Les fractions combinées sont évaporées sous vide à une température d'au plus 3S. C jusqu'à obtention d'une huile épaisse et le produit est utilisé tout de suite ou stocké dans de la neige carboniuque. Rendement: 58,8g (85%).
Rf = 0, 71 à 0,75 (acétate d'éthylelpyridinelacide acétique/eau = 480/20/6/11 J.
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[ = +13, 5' fc = 1, tétrahydrofurannel.
Etape 2 N-benzutoxucarbonut-N-méthut-D-phénutatanui-L-proiui-NSbenzyloxycarbonyl-L-arginine aidéhyde . y 1 34, 14 g (0, 05 mole) du N-benzyloxycarbonyl-Nméthui-D-phénuia ! anui-L-pro) ui-NB-bcnzu) oxucarbonui-Larginine lactame de l'exemple 5, étape 1, sont dissous dans 150 ml de tétrahydrofuranne anhydre refroidi à une température de O'C.
La solution est refroidie à une température de -20 C et 0, 0375 mole d'hydrure aluminolithique dissous dans du tétrahydrofuranne
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est ajoutée sous agitation en 5 à 10 minutes. Le déroulement de la est ajoutée sous ae réduction est suivi par chromatographie en couche mince avec un mélange 240/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme éluant. Les valeurs Rf du lactame de départ et de l'aldéhyde sont de 0, 8 et 0, 5 respectivement
En cas de besoin, une quantité supplémentaire d'hydrure aluminolithique est ajoutée et lorsque la réaction est achevée, le mélange réactionnel est versé peu-à-peu dans 320 mi de solution 1 N d'acide sulfurique à une température de 2-4'C sous agitation constante.
Le pH final doit être compris entre 2 et 3, ce pH étant ajusté par l'addition éventuelle d'une quantité supplémentaire d'acide sulfurique. Si un précipité est formé, il est
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séparé par filtration, la solution est diluée avec de l'eau jusqu'à formation d'un trouble, puis celle-ci est extraite avec 3xl0 ml de n-hexane.
La phase tétrahudrofuranique est extraite avec 250 ml de dichiorométhane à deux ou trois reprises et les solutions
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dichiorométhaniques combinées sont lavées avec 2x50 ml d'eau.. 2x50 mi d'une solution froide à 5% de carbonate acide de sodium, puis avec 2x50 ml d'eau, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées sous vide à une température d'au plus 40. C.
Le résidu d'évaporation est dissous dans un mélange
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7/3 de dichlorométhane et d'acétone (120 miL envoyé sans aspiration à travers un ! it filtrant préparé à partir de 108 g de Kieselgel-60 adsorbant avec 200 ml d'un mélange ï/3 de dichlorométhane et d'acétone, puis le lit filtrant est lavé avec 600 ml du même mélange éluant. Le procédé peut ne pas durer plus de 20 minutes.
Les filtrats combinés sont évaporés à environ 50-60 mi sous pression réduite à une température d'au plus 40. C, puis cette operation est répétée après addition de 100 mi de benzène au résidu. Le produit est précipité à partir de la solution d'environ
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50-60 ml par addition de 100 ml de cyclohexane.
Le précipité ainsi obtenu est lavé avec 2x30 ml de cyclohexane et séché dans un dessicateur à vide à température ambiante sur des copeaux de paraffine. On obtient ainsi 18 g zu du produit recherché.
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Pf = 0, 55 à 0, 59 (acétate d'éthl Rf = 0, 55 à 0, 59 [acétate d'éthute/pyridine/acide acétique/eau =
240/20/6/11).
[α]20D = +14,1 (c = 1, tétrahydrofuranne).
La teneur totale en impuretés du produit est de 2-3% au maximum.