BE1008955A3 - Procede d'obtention de biomateriaux et produits obtenus. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouveau procédé d'obtention de biomatériaux dans lequel on traite par un faisceau d'ions la surface d'un support polymérique, on recouvre ledit support par une protéine et éventuellement un surfactant non ionique. La présente invention concerne également le biomatériau obtenu par ce procédé et son utilisation pour la culture et/ou la régénération tissulaire et/ou cellulaire.
Description
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PROCEDE D'OBTENTION DE BIOMATERIAUX ET PRODUITS OBTENUS.
Ob1et de l'invention.
La présente invention concerne un nouveau procédé d'obtention de biomatériaux et les produits obtenus par ce procédé, destinés à servir de support pour la culture et/ou la régénération tissulaire et/ou cellulaire (en particulier la régénération des cellules nerveuses), pour l'élaboration de réseaux de neurones et/ou pour l'obtention de biosenseurs.
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ArrlAre-plaE technoloaique et Xtat de la technique à la ba8e de l'invention.
Les polymères constituent des biomatériaux de choix, déjà largement utilisés dans le domaine médical.
Cependant, l'amélioration de leurs performances dans ce domaine nécessite souvent la modification de leurs propriétés de surface.
Différents types de traitements de surface ont déjà été proposés, notamment les traitements par plasma.
Cependant, il se manifeste également un intérêt grandissant pour les modifications hétérogènes contrôlées des propriétés de surface des biomatériaux, à l'échelle infra-, supra-ou à celle de la dimension cellulaire.
But de l'invention.
La présent invention vise à fournir un nouveau procédé d'obtention de biomatériaux présentant sur leur
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surface traitée des zones préférentielles d'attachement et de prolifération cellulaire, permettant des applications telles que la régénération nerveuse, l'élaboration de réseaux de neurones ou la conception de nouveaux biosenseurs.
Eléments caractéristiques de la Drésente invention.
La présente invention concerne un procédé d'obtention de biomatériaux dans lequel on traite par un faisceau d'ions, de préférence un faisceau de He, un faisceau de Xe+ et/ou un faisceau de Ga+, la surface d'un support polymérique, de préférence un film de poly (methyl methacrylate), en ce que l'on recouvre ledit support polymérique par une protéine, de préférence du collagène et éventuellement par un surfactant non ionique, de préférence du Pluronic F68 ! D.
Avantageusement, on traite le support polymérique par un faisceau d'ions à une dose comprise entre 1010 et
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20 12 16 dz de préférence entre 1012 et 1016 ions par cm2 de surface de support polymérique.
Un autre aspect de la présente invention concerne le biomatériau obtenu par le procédé selon l'invention, et le biosenseur comprenant ce dit biomatériau.
Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation du biomatériau selon la présente invention pour la culture et/ou la régénération tissulaire et/ou cellulaire.
Brève description des figures.
Les figures 1 et 2 représentent les biomatériaux selon l'invention, sur lequel des cellules adhèrent spécifiquement sur la surface traitée desdits biomatériaux. Description d'une forme d'exécution préférée de la présente invention.
Préparation et modification des supports.
Préparation des supports.
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Du poly (methyl methacrylate) (PMMA) d'origine commerciale (Oroglas V825 (P de Rohm & Haas, MW = 55700, Mn = 44100) est déposé par spin-coating à partir d'une solution de 5 % (poids par volume) dans du dichloromethane (produit
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pour analyse, UCB, Belgique) sur le fond de boites de polystyrène (Falcon standard Petri dishes < S), 35 X 10 mm style, Falcon 1008 < S, Becton Dickinson Benelux, Belgium).
Le film de PMMA obtenu par cette méthode présente une épaisseur uniforme de quelques microns. La composition chimique de surface du film de PMMA est contrôlée par analyse Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectometry et X-ray Photoelectron Spectrometry.
Bombardement ionique des supports.
Les supports sont ensuite bombardés par un faisceau d'ions, soit un faisceau d'He produit à 1 MeV par un accélérateur Van de Graaf (courant maximum : 12.0 nA ; surface de zone bombardée : 3.4 mm2 ; pression dans l'enceinte : 10-6 Torr), soit un faisceau de Xe+ produit à 4 keV par une source d'ions de type Kratos WG174 (P (courant maximum : 13.5 nA ; surface de zone bombardée : 16 mm2 ; pression dans l'enceinte 10-8 Torr).
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Sur les supports bombardés par He (support A), la dose d'ions déposée est de 4. 1014 ions par cm2. Sur les supports bombardés par Xe+ (support B), la dose déposée est de 5. 1015 ions par cm2. Les doses ioniques sont déterminées par intégration de la densité de courant mesurée à l'aide de cages de Faraday.
Le bombardement des matériaux polymères par faisceaux d'ions permet d'induire à la surface des modifications hétérogènes de leurs propriétés. L'intérêt de créer des hétérogénéités de surface par bombardement ionique provient du contrôle que l'on peut avoir de la taille de ces hétérogénéités et de leur localisation en jouant sur la taille et le balayage du faisceau d'ions incident. Dans le cas des faisceaux He+ et Xe+ utilisés, la taille minimum est de l'ordre de la centaine de microns.
Cependant, en utilisant des faisceaux de Ga+ (15 KeV), la résolution latérale peu descendre jusqu'à 15 nanomètres. Ceci est d'autant plus important que ce qui importe pour créer l'hétérogénéité n'est pas la nature de
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l'ion, mais bien la densité d'énergie déposée en surface par les ions, principalement sous forme de pouvoir d'arrêt électronique. Dans le cas du PMMA, cette densité déposée doit être au minimum comprise entre 0.2 et 0.5 eV. A-3.
Reconditionnement des supports bombardés.
Après bombardement, les supports sont rincés dans u tampon phosphate PBS (137 mM NaCl, 3.0 mM Kcl, 8.0 mM Na2HP04. 2H20, 1.1 mM KHPO, pH 7.4) à température ambiante.
Ils sont ensuite reconditionnés par immersion à température ambiante dans une solution PBS contenant à la fois 33.0 mg/ml de collagène de type I (collagen S, Boehringer Mannheim, Belgium) et 0.01 % (p/v) de Pluronic F68 (P (Serva, Allemagne), un surfactant non ionique. Après une heure de reconditionnement, les supports sont finalement rincés par simple immersion dans du PBS avant d'être testés du point de vue de l'adhésion de cellules mammaliennes.
Le reconditionnement de surface par une solution contenant à la fois du collagène, une protéine de la matrice extra-cellulaire et un surfactant non ionique, le Pluronic F68 ID, permet de promouvoir l'adhésion de cellules mammaliennes sur support hydrophile et de l'inhiber sur support hydrophobe. Dewez et al. (Journal of Biomedical Material Research (1994) ) ont montré cet effet sur des supports présentant des propriétés de surface hydrophile ou hydrophobe. cet effet est lié à l'adsorption préférentielle de la protéine sur le support hydrophile et l'adsorption exclusive du surfactant sur les supports hydrophobes. En l'absence du surfactant lors du reconditionnement de surface, la protéine s'adsorbe aussi bien sur support hydrophile qu'hydrophobe.
L'intérêt du reconditionnement mixte protéine surfactant appliqué aux surfaces présentant des hétérogénéités hydrophiles-hydrophobes produites par bombardement ionique est de créer des zones préférentielles d'attachement et de prolifération cellulaire au sein de zones anti-adhésives, permettant des applications telles que la régénération nerveuse, l'élaboration de réseaux de neurones
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ou la conception de nouveaux biosenseurs.
Test d'adhésion cellulaire.
Les supports sont mis en contact avec un inoculum de cellules épithéliales Hep G 2 (lignée cellulaire issue d'un hépatoblastome humain, ATCC HTB 8065). Le milieu d'inoculation est un milieu de culture chimiquement défini ne contenant pas de sérum, dérivé du milieu BDM décrit par Schneider (Journal of Immunological Methods, 116, p. 65-77 (1989) ) ; il s'agit d'un mélange en proportion de 5 : 5 : 1 (v/v/v) des milieux Iscove's Dulbecco's modified Eagle, Ham's F12 et NCTC 135 additionné des composés suivants aux concentrations indiquées : glucose 25 mM ; glutamine 6 mM ; 2mercaptoethanol 50 uM ; Hepes 25 mM ; NaHC03 3 g/l. La densité cellulaire obtenue à la surface des supports est de l'ordre
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2 de 70000 cellules par cm2.
Après 24 heures d'incubation à 370C dans une atmosphère saturée en eau et contenant 5 % de C02'le surnageant est éliminé de la surface des supports. Ces derniers sont ensuite rincés précautionneusement avec du PBS de manière à éliminer les cellules non adhérentes, immergés dans une solution aqueuse contenant 1 % (v/v) de formol pour fixer le matériel cellulaire, et finalement soumis à une coloration hématoxiline/hémalin.
La figure 1 (grossissement X 125) montre le comportement adhésif de cellules Hep G 2 inoculées sur le support A après 24 heures d'incubation. La figure montre clairement que les cellules adhèrent exclusivement dans la zone bombardée de l'échantillon (partie gauche de la photo, les cellules y apparaissent comme des points plus sombres). L'attachement cellulaire délimité clairement la frontière entre zone traitée et zone non traitée (partie droite de la photo).
La figure 2 (grossissement X 125) montre le comportement adhésif de cellules Hep G 2 inoculées sur le support B après 24 heures d'incubation. Les cellules ont également adhéré et proliféré sur la zone traitée (bande foncée au centre de la photo).
Claims (9)
1. Procédé d'obtention de biomatériaux, caractérisé en ce que l'on traite par un faisceau d'ions la surface d'un support polymérique, en ce que l'on recouvre ledit support par une protéine et éventuellement un surfactant non ionique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le faisceau d'ions est un faisceau de He+, un faisceau de Xe+ et/ou un faisceau de Ga+.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on traite le support polymérique par
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10 20 un faisceau d'ions à une dose comprise entre 1010 et 1020, de 12 16 2 préférence entre 1012 et 1016, ions par cm2 de surface du support polymérique.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support polymérique est un film de poly (methyl methacrylate).
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine est du collagène.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le surfactant non ionique est du Pluronic F68 < E).
7. Biomatériau obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
8. Biosenseur comprenant le biomatériau selon la revendication 7.
9. Utilisation du biomatériau selon la revendication 7 pour la culture et/ou la régénération tissulaire et/ou cellulaire.
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