JPS63196283A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

〈従来技術及び発明が解決しようとする問題点〉近年、
生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により有用な
生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、インター
フェロン等を生産する研究が活発に行われている。

このよ゛うな方法において、従来、接着性動物細胞の培
養は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培
養ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養用基材上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖にを効な形態になっていることが必要
である。

しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。

この点を改善するため、生体高分子であるコラーゲンや
その変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布したも
の（特開昭５８”−７１８８４号公報参照）や、高分子
材料上に可溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞
培養床（特開昭６１−５２２８０号公報参照）が提案さ
れている。

しかしながら、上記の従来技術は、高分子基材への糖や
蛋白質などの固定化が十分でなく容易に脱離してしまい
、細胞の接着性並びに接着した細胞の伸展性、増殖性お
よび活性維持が未だ十分でなく、高密度、長期間の細胞
培養ができないという問題点がある。

く目　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記目的を
達成するため、この発明の細胞培養用基材としては、高
分子材料からなる基材が、単分子膜の累積膜で被覆され
ていると共に、上記累積膜に、糖、蛋白質、脂質および
これらの複合化合物（以下、糖蛋白質等と称する）の少
なくとも一種が担持されていることを特徴とするもので
ある。

なお、高分子材料は、多孔性材料であるのが好ましく、
基材は中空糸であるのが好ましい。また、累積膜は、紫
外線、電子線またはイオン照射により部分的に処理され
ているものが好ましい。

また、上記単分子膜の累積膜に、糖蛋白質等の少なくと
も１種類が部分的に、特に、格子模様、縞模様、水玉模
様等担持されているものが好ましい。

上記の構成の細胞培養用基材によれば、高分子材料から
なる基材が、単分子膜の累積膜で被覆されているので、
基材表面には、上記累積膜を構成する材料および単分子
膜の累積状態に応じて、正または負の電荷を有する官能
基が存在し、この官能基は、糖蛋、白質等との接着に関
与し、糖蛋白質等を固定して担持する。より詳細には、
水に不溶性の有機化合物を水面上に展開することにより
、有機化合物の親水基、疎水基が所定方向に配向した単
分子膜を作製することができ、この単分子膜を適当な圧
力を加えて基材上に移し取ることにより、官能基が所定
方向に配向した状態の単分子膜で基材を被覆することが
できる。上記操作を繰返すことにより、官能基の配向が
制御された累積膜で前記基材を被覆することができ、官
能基の配向が制御された構造を有する累積膜により、前
記糖蛋白質等が担持される。そして、上記累積膜に担持
された糖蛋白質等は、細胞との接着に関与する。

また、細胞表面の細胞膜の構造は、脂質二重層の中に、
膜内粒子と呼ばれる各種の糖蛋白質、糖脂質が分布をも
って埋めこまれており、これらは自由に脂質二重層の中
を移動でき、上記糖蛋白質等の表面の官能基と接着する
。従って、前記単分子膜の累積膜は、前記高分子と糖蛋
白質等との接着を強固なものとし、糖蛋白質等を強固に
固定化し担持する。そして、糖蛋白質等の表面の官能基
を有する部位により細胞の接着性を高めることができ、
細胞の伸展、増殖が有効に行なわれる。

また、上記基材を被覆する累積膜が、紫外線等の照射に
より部分的に処理されて微細加工されると、親水性の程
度の異なる部分が微細模様状に配置された累積膜表面が
得られるので、糖蛋白質等の配向と分布を制御して糖蛋
白質等を固定化し担持できる。そして、上記のような構
造を有する細胞膜は、イオン結合、疎水結合等により細
胞が安定した形態、配列で基材の糖蛋白質等の上に接着
でき、ひいては細胞の伸展、増殖を促進することができ
る。特に、格子模様、縞模様、水玉模様等のように一定
のパターンをもって紫外線等で処理されているものは、
上記の効果を一層高めることができる。

さらに、上記高分子材料が、多孔性材料であるときは、
多孔性材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に亘
り細胞培養することができる。特に、前記高分子材料か
らなる基材が中空糸であるものは、中空部内や中空糸の
外側に培養液等を潅流することにより、中空糸上に細胞
を高密度に育成、増殖させることができる。

以下、この発明の詳細な説明する。

この発明の細胞培養用基材は、高分子材料からなる基材
と、この基材の表面を被覆する単分子膜の累積膜と、こ
の累積膜上に担持される糖蛋白質等とからなる。

上記高分子材料としては、賦形性、機械的強度を有する
ものであればいかなるものでも使用でき、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン、アイ
オノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラフルオロ
エチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹脂、ポ
リスチレン等のスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレ
ート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコール、ポリ
酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、ポリアクリロニト
リル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリカー
ボネート、ボリアリレート２、ポリフェニレンオキサイ
ド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフ
タレート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、ポリア
ミド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系樹脂、
シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合体もし
くは共重合体またはそれらのブレンド物が例示できる。

上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、粒子等の形態が例示でき
る。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行なう
には、物質代謝を容易にする孔を有する多孔性高分子材
料が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュー
ブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容易
で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔性高分子材料
からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき、
培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流させ、必要
に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に送
ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖すること
ができる。なお、前記中空糸としては、種々の大きさの
ものが使用でき、例えば、内径５０〜１０００μｍ程度
のものが用いられる。

また、この発明にかかる細胞培養用基材をマイクロキャ
リアー法のビーズ担体として使用する場合には、前記高
分子材料は１００〜３００μ畠程度の粒径のものが用い
られる。

この発明の細胞培養用基材は、上記高分子基材と糖蛋白
質等との接着を強固なものにするため、上記高分子材料
からなる基材の表面が単分子膜の累積膜で被覆されてい
る。

上記単分子膜は、水に不溶性の有機化合物を水面上に展
開することにより作製することができ、展開状態では親
水基が水相側に、疎水基が気相側に配向する。また、上
記単分子膜は、適当な圧力を加えて前記基材上に移し取
ることにより、単分子膜の官能基が所定方向に配向した
状態で前記基材を被覆することができる。従って、上記
操作を繰返すことにより、親水基、疎水基の配向および
構造が制御された累積膜を作製することができる。

特に、上記累積膜は表面圧を調整することにより前記官
能基の配向状態を制御できるので、このようにして作製
された累積膜は、糖蛋白質等との接着を強固なものとし
、ひいては細胞との接着性、細胞の伸展、増殖に有用で
ある。

上記単分子□膜を形成する有機化合物としては、低分子
化合物、高分子化合物等の多くの有機化合物が使用でき
る。低分子化合物としては、例えば、カプリル酸、カプ
リン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ス
テアリン酸、ジオキシステアリン酸、ベヘン酸、リグノ
セリン酸、モンタン酸等の飽和脂肪酸、オレイン酸、エ
ライジン酸、エルカ酸、リノール酸、リルン酸、エレオ
ステアリン酸、アラキドン酸、リシルイン酸等の不飽和
脂肪酸等の脂肪酸；上記脂肪酸からの誘導体、例えば、
メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプ
ロピルアルコール、エチレングリコール、ジエチレング
リコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコ
ール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、トリメ
チロールプロパン、ペンタエリトリトール、ソルビタン
等の一価または多価アルコールとのエステル；カプリル
酸アミド、カプリン酸アミド、ラウリン酸アミド、ミリ
スチン酸アミド、パルミチン酸アミド、オレイン酸アミ
ド、ステアリン酸アミド等の前記脂肪酸のアミド；ラウ
リルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコー
ル、ステアリルアルコール等の高級アルコール；あるい
は上記脂肪酸のビニル化合物等が例示できる。また、上
記高分子化合物としては、種々の高分子が使用できるが
、天然ペプチド、合成ポリペプチド等が好ましく、所望
する官能基に応じて適宜選択することができる。

なお、上記ポリペプチドは、直鎖状、環状ポリペプチド
であってもよい。上記ポリペプチドのうち、特に、正電
荷を有するポリリジンやポリオルニチンのポリアミノ酸
が好ましい。これらは、表面に負の電荷を有する前記糖
蛋白質等の接着を促進する。

また、上記基材を被覆する累積膜は、糖蛋白質等の配向
と分布を制御して前記糖蛋白質等を担持するため、紫外
線、電子線またはイオン照射処理、特に、部分的に照射
処理されているのが好ましい。

前記累積膜を上記紫外線、電子線またはイオン照射処理
する方法は、いずれも慣用の手段が用いられる。これら
の表面処理により、前記累積膜の官能基の分布を制御す
ることができ、前記累積膜の表面に、カルボキシ基、カ
ルボニル基、ヒドロパーオキシド基等の官能基が導入さ
れ、親水性の程度の異なる部分を微細模様状に形成でき
るので、糖蛋白質等を官能基の配向、分布状態が制御さ
れた状態で累積膜上に強固に接着させ、ひいては上記糖
蛋白質等の表面での細胞の伸展、増殖を促進することが
できる。

上記紫外線としては、前記基材を被覆する累積膜表面で
化学反応を生じさせる波長のものが使用され、紫外線の
うち、２００ｎｉ未満の遠紫外線は、光エネルギーが大
きいため、より効率的に処理することができる。

なお、上記紫外線を放射する光源としては、クセノンア
ーク、メタルハライドランプなども使用できるが、大面
積の処理が可能な水銀灯やコヒーレントで微細加工が可
能なレーザが好適に用いられる。上記水銀灯としては、
３８８ｎｍの波長が主である高圧水銀灯、２５Ｂ、７ｎ
ａ＋および１８４．９ｎｏ＋の波長の光を同時に放射す
る低圧水銀灯が例示できる。

また、レーザとしては、Ａｒ、Ｈｅ−Ｃｄ、Ｎ２等のレ
ーザの他に、短波長と高出力の光を放射するエキシマレ
ーザが利用できる。エキシマレーザは、短時間に高いエ
ネルギーを累積膜に与え、前記累積膜を化学的および物
理的に大きく改質できるため、好適に用いられる。

上記紫外線による処理は、紫外線を種々の雰囲気中で累
積膜の表面に照射することにより行なわれる。例えば、
空気中で紫外線を照射すると、前記累積膜の表面にカル
ボニル基が生成する他、ヒドロペルオキシド基や過酸基
も生じる。

また、前記電子線処理における電子線源としては、各種
の電子線加速器、コックロフトワルトン型、バンプグラ
フ型、共振変圧型等が使用でき、また、電子線としては
、累積膜の種類および所望する処理の程度に応じて種々
の照射線量、例えば、１〜５０Ｍ　ｒａｄのものが使用
できる。

イオン処理としては、慣用のイオンビーム照射′装置が
用いられ、イオンシャワーにより試料全体に照射される
他、マスクや集束イオンビームの採用により、部分的、
微細模様に照射される。イオンとしては、各種のイオン
を用いることができ、特に限定されないが、Ｈｅ　＋、
Ａ　ｒ　十、Ｃ＋、Ｎ＋等のイオンを例示することがで
きる。また、好適なイオンエネルギーの値としては０．
０５ｋｅｖ〜５００Ｋｅｖが挙げられ、この値未満では
効果が小さく、またこの値を越えると基材の炭化が顕著
に進み好ましくない。

上記紫外線等の照射は、前記累積膜表面の全面に行なっ
てもよいが、紫外線等の照射を部分的に行ない、微細加
工することにより、糖蛋白質等の配向と分布を制御して
糖蛋白質等を固定、担持させ、糖蛋白質等の表面での細
胞の伸展と増殖を増大させることができる。紫外線等を
部分的に照射する場合、格子状、縞模様、水玉模様等の
微細模様に照射することにより、糖蛋白質等の配向、分
布を精度よく制御できるので、上記効果をさらに増進で
きる有用な表面を形成することができる。

また、エキシマレーザおよび電子線は、短時間に高いエ
ネルギーを前記累積膜に与え、累積膜を化学的に大きく
改質できる他、累積膜表面を微細な凹凸状に微細加工す
る物理的改質もできるので、糖蛋白質等の固定、担持だ
けでなく、配向および分布もより一層制御することがで
き、細胞の物質代謝をも促進できるという利点がある。

なお、上記微細模様は、適宜の手段により形成すること
ができ、例えば、フォトマスクを使用して前記紫外線等
を照射したり、レーザ、電子線を操作することにより、
上記微細模様状にミクロンオーダーの精度で所望の間隔
を有する模様状に描くことができる。

上記のような累積膜上には、糖蛋白質等が担持されてい
る。ここで用いる糖蛋白質等は、細胞と親和性があり、
細胞の接着を促進するものであればいずれも用いること
ができ、例えば、ラクトース、ガラクトース等のオリゴ
糖、アルブミン等の蛋白質、リン脂質等の脂質、グロボ
シド、ガングリオシド等の糖と脂質との複合体である糖
脂質、細胞質や血清中に含まれる脂質と蛋白質との複合
体であるリボ蛋白質、糖と蛋白質との複合体である糖蛋
白質等が挙げられ、特にオリゴ糖、コラーゲン、ゼラチ
ン、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロネクチン、
ビトロネクチン、フィブリン等の糖蛋白質が好適に用い
られ、これらは２種またはそれ以上組み合せて使用する
ことも有用である。基材上に糖蛋白質等を担持する方法
は、従来の技術がいずれも応用できる。一般には、上記
高分子基材を累積膜で被覆した後、上記の糖蛋白質等の
１種類または２種類以上を含有する溶液に浸漬したり、
上記単分子膜で基材を被覆するのと同様な方法で被覆し
たり、または該溶液を累積膜表面に塗布した後、乾燥す
ることにより行われる。

この際、糖蛋白質等が変性しにくい条件で乾燥するのが
好ましい。

上記糖蛋白質等の担持は、累積膜表面の全面に積層して
もよいが、累積膜表面に部分的に、特にパターン化して
担持したものが好ましく、このようにパターン化して担
持することにより、糖蛋白質等の上に接着する細胞の配
置を制御でき、ひいては細胞の接着性が安定化し、細胞
の伸展、増殖および機能発現を有利にすることができる
。さらに、糖蛋白質等を上記のように部分的に担持する
場合、特に、格子状、縞模様、水玉模様等の微細模様に
担持することにより、上記効果をさらに増進できる有用
な表面を形成することができる。累積膜上に糖蛋白質等
をパターン化して担持するには、例えば、スクリーン印
刷等の技術を応用して行なうことができる。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞Ｈｅ　Ｌ　ａ　ｓ　ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５
、ヒト肝由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｌｖｅｒ　、ヒト肺由
来正二倍体線維芽細胞工ＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来
ナマルバ細胞等が例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の条
件で培養が行なわれる。

本発明の細胞培養用基材は、従来公知の種々のモジュー
ルにて、動物細胞の増殖に適用できる。

本発明の細胞培養基材としてフィルム状基材を用いたモ
ジュールの一例を、添付図面に基づいて説明すると以下
の通りである。

温情図面に示す細胞培養器は、サポートスクリーン（２
）上に載置されたフィルム状細胞培養用基材（１）の両
端が、ポリカーボネート等からなるハウジング（３）内
の両側に設けられたスペーサ（６）により保持されてい
る。また、上記ハウジングＧ）には、増殖させる細胞懸
濁液をハウジング（３）内に満すための孔（４）が設け
られていると共に、培養液を潅流させるための管（５）
が取付られている。なお、上記孔（４）は、細菌等が侵
入するのを防止するため、フィルター付きのＭ（ア）で
被冠されている。

上記の細胞培養器を用いて細胞を増殖させるには、上記
孔（４）から細胞懸濁液を注入して細胞を前記基材（１
）上に接着させると共に、前記孔（４）をフィルタ付き
の上記蓋（７）で被冠し、所定の培養条件の下、上記培
養液を前記管（５）を通じて所定時間潅流させることに
より行なわれる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１および比較例 清浄な水面にポリリジン（分子量４．０００−１５．０
００）の酢酸アンモニウム溶液（濃度０　、　ＯＬｖｔ
％）を滴下し、表面圧を０．２ｄｙｎｃ／ｃｍに保って
単分子膜を展開した。この単分子膜をポリエチレンテレ
フタレート（膜厚１００μｍ、径４５關φの円形フィル
ム）上に水平付着法によって移し取る操作を２０回繰り
返すことで、その累積膜を積層した複合膜を得た。この
複合膜を、石英板上に描かれたクロムマスクの画像を通
して２５０〜３００　ｎｍ波長の紫外線をＤｅｅｐＵＶ
露光装置により３０分間照射し、１μｍの格子状模様（
処理部幅１μＭ）に処理されたフィルムを得た。この処
理フィルムを径４５ｍ＋ｓφのガラスシャーシにセット
し、高圧蒸気滅菌後、無菌のフィブロネクチン（シグマ
社製、牛血清より採取）のトリス緩衝溶液（濃度０．１
　ａ＋ｇ／　ｍｌ　）を塗布し、室温で乾燥させた。こ
れらの操作は全て無菌的に行なった。このシャーレでチ
ャイニーズハムスター肺由来細胞（Ｖ−７９）を培養し
た。培養液として１０重量％牛脂児血清を含むイーグル
ＭＥＭ培地を用いた。

培養液１ｍｌ当たりＩ　Ｘ　１０４個の培養細胞を播種
し、５％炭酸ガス、９５％空気雰囲気の温度３７℃の環
境下、７日間の培養を行なったところ、培養液１　ｘＩ
当り平均６．４×１０６個の細胞数となり、良好な増殖
が観察された。

一方、ポリエチレンテレフタレートフィルムをそのまま
用いたほかは、実施例１谷同様に試験を行なった比較例
では、培養液１　ｘＩ当り平均９．０×１０５の細胞数
となった。

実施例２ 実施例１と同じ手順に従ってポリ（γ−ベンジンーＬ−
グルタメート）（分子量１５，０００−３０．０００）
の累積膜（２０回繰作）を四弗化エチレン樹脂多孔質フ
ィルム（住人電気工業■製、フロロポアＦＰ−０１０）
に積層して、その複合膜を得た。このフィルムを添付図
面に示す細胞培養器（内径４７■φ）に装着し、全体を
高圧蒸気滅菌後、無菌のコラーゲン溶液（タイプｌ、濃
度０．３％）を孔（４）から注入し、１分間静置後、溶
液を排出して、室温で乾燥させた。ついで孔（４）から
ヒト胎児包皮由来細胞（Ｐｌｏｖ　７０００）のイーグ
ルＭＥＭ（ｔｏ％牛脂児血清添加）懸濁液（細胞数２Ｘ
１０４個／　ｘＩ　）を満した。孔（４）には、細菌を
カットするフィルターの蓋（７）をし、管（５）を通し
て、新鮮なイーグルＭＥＭ培地を潅流し、３７℃で１週
間培養を行なった。

培養終了後、フィルムに付着している細胞数を測定した
ところ、５．５×１０４個／′１１に繁殖していること
がわかった。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、高
分子材料からなる基材が、単分子膜の累積膜で被覆され
ていると共に、累積膜上に糖蛋白質等が担持されている
ので、前記基材から糖蛋白質等が脱落することなく、前
記基材へ糖蛋白質等を強固に固定化し担持することがで
きる。また、上記糖蛋白質等は、細胞との接着性並びに
細胞の伸展性および増殖性に優れるので、高密度かつ長
期間の細胞培養が可能となるという特有の効果を奏する
。従って、この発明の細胞培養用基材は、動物細胞の培
養によるホルモン等の有用物の生産システムに利用でき
る他、例えばインスリン産生細胞を基材表面に接着、培
養することにより人工膵臓が形成できるように人工臓器
の構築に利用できる。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明の細胞培養用基材を用いた細胞培養器
の一例を示す断面図である。 （１）・・・細胞培養用基材、（２）・・・サポートス
クリーン、（３）・・・ハウジング、（４）・・・孔、
（５）・・・管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高分子材料からなる基材が、単分子膜 の累積膜で被覆されていると共に、上記 累積膜に、糖、蛋白質、脂質およびこれ らの複合化合物の少なくとも一種が担持 されていることを特徴とする細胞培養用 基材。 ２、高分子材料が、多孔性材料である上記 特許請求の範囲第１項記載の細胞培養用 基材。 ３、基材が、中空糸である上記特許請求の 範囲第１項記載の細胞培養用基材。 ４、累積膜が、紫外線、電子線またはイオ ン照射により部分的に処理されている上 記特許請求の範囲第１項記載の細胞培養 用基材。 ５、累積膜に、糖、蛋白質、脂質およびそ れらの複合化合物の少なくとも１種類が 部分的に担持されている上記特許請求の 範囲第１項記載の細胞培養用基材。 ６、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物の少なくとも１種類が、格子模様 に担持されている上記特許請求の範囲第 ５項記載の細胞培養用基材。 ７、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物の少なくとも１種類が、縞模様に 担持されている上記特許請求の範囲第５ 項記載の細胞培養用基材。 ８、糖、蛋白質、脂質およびそれらの複合 化合物の少なくとも１種類が、水玉模様 に担持されている上記特許請求の範囲第 ５項記載の細胞培養用基材。