BE1022345B1

BE1022345B1 - Constructions de la proteine uspa2 et leurs utilisations

Info

Publication number: BE1022345B1
Application number: BE2015/5094A
Authority: BE
Inventors: Cindy Castado; Normand Blais; Patrick Chomez; Marianne Dewerchin
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2015-02-20
Publication date: 2016-03-25
Also published as: PT3498292T; JP2017507181A; SMT202100728T1; EP3110438B1; LT3498292T; TW201620927A; IL246994A0; EA201691611A1; ME03335B; SI3498292T1; CA2939862A1; MX2016010954A; US10745449B2; CY1124979T1; HUE042054T2; EP3498292A1; CY1121535T1; DK3498292T3; KR20160124774A; US10947280B2

Abstract

La présente invention concerne des compositions comprenant la protéine de surface ubiquitaire A2 (UspA2) de Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis). Plus particulièrement, la présente demande concerne des constructions de protéines UspA2 et des compositions immunogènes comprenant les constructions, des vaccins comprenant de telles compositions immunogènes et leurs utilisations thérapeutiques. L'invention concerne en outre des compositions comprenant UspA2 en combinaison avec au moins un antigène de Haemophilus influenzae, des compositions immunogènes comprenant les antigènes, des vaccins comprenant de telles compositions immunogènes et leurs utilisations thérapeutiques.

Description

CONSTRUCTIONS DE LA PROTEINE USPA2 ET LEURS UTILISATIONS Domaine de l'invention

La présente invention concerne des compositions comprenant la protéine de surface ubiquitaire A2 (UspA2) de Moraxella catarrhalis (M. catarrhalls, M. cat.) . Plus particulièrement, la présente invention concerne des constructions de la protéine UspA2 et des compositions immunogènes comprenant les constructions, des vaccins comprenant de telles compositions immunogènes et leurs utilisations thérapeutiques.

Contexte de l'invention

La protéine de surface ubiquitaire A2 (UspA2) est un autotransporteur trimérique qui apparaît sous la forme d'une ressamblant à une sucette sur les micrographies électroniques (Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000)). Elle est composée d'une tête N-terminale, suivie d'une tige qui se termine par une hélice amphipathique et d'un domaine membranaire C-terminal. (Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000)). UspA2 contient un domaine très bien conservé (Aebi et al., Infection & Immunity 65(11) 4367-4377 (1997)), qui est reconnu par un anticorps monoclonal dont l'effet protecteur a été démontré après transfert passif dans un modèle d'épreuve avec Moraxella catarrhalis chez la souris (Helminnen et al. J Infect Dis. 170 (4) : 867-72 (1994)) .

Il a été montré que UspA2 interagit avec les structures de l'hôte et des protéines de la matrice extracellulaire comme la fibronectine (Tan et al., J Infect Dis. 192(6): 1029-38 (2005)) et la laminine (Tan et al., J Infect Dis. 194(4): 493-7 (2006)), suggérant qu'elle peut jouer un rôle à un stade précoce de l'infection par Moraxella catarrhalis.

UspA2 semble également être impliquée dans la capacité de Moraxella catarrhalis à résister à l'activité bactéricide du sérum humain normal. (Attia AS et al. Infect Immun 73(4): 2400-2410 (2005)). Elle (i) lie l'inhibiteur du complément C4bp, permettant à Moraxella catarrhalis d'inhiber le système du complément classique, (ii) empêche l'activation de la voie alterne du complément en absorbant C3 à partir du sérum et (iii) interfère avec les stades terminaux du système du complément, le complexe d'attaque membranaire (MAC), en liant la protéine vitronectine régulatrice du complément, (de Vries et al., Microbiol Mol Biol Rev. 73(3): 389-406 (2009)).

Moraxella catarrhalis est un agent pathogène respiratoire important et courant qui a été associé à un risque accru d'exacerbations dans les bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO) chez les adultes. (Sateesh et ai., Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3: 109-115 (2006)).

Il existe un besoin de vaccins contre Moraxella catarrhalis.

Bref résumé de l'invention

Comme premier aspect, la présente invention propose les protéines de formule (I). A - (Ri)m - (B) n (formule I) dans laquelle : A représente UspA2 de Moraxella catarrhalis ou un fragment immunogène de celle-ci ;

Ri représente un acide aminé ; m vaut 0, 1 ou 2 ; B représente une histidine ; et n vaut 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

Comme deuxième aspect, la présente invention propose des compositions immunogènes comprenant des protéines de formule (I) et des protéines de l'invention. La composition peut comprendre en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. La composition peut comprendre un excipient.

Dans un troisième aspect, la présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par Moraxella catarrhalis. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

Dans un quatrième aspect, la présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention de l'otite moyenne. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

Dans un cinquième aspect, la présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention des exacerbations dans les bronchopneumopathies chroniques obstructives. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

Dans un sixième aspect, la présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention de la pneumonie. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

Dans un septième aspect, la présente invention propose une composition pharmaceutique comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par Moraxella catarrhalis. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.

Dans un huitième aspect, la présente invention propose des acides nucléiques codant pour les protéines de l'invention.

Dans un neuvième aspect, la présente invention propose un procédé de production d'acides nucléiques de l'invention.

Dans un dixième aspect, la présente invention propose une composition comprenant au moins un antigène provenant de Moraxella catarrhalis et au moins un antigène provenant de Haemophilus influenzae. La composition peut comprendre en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. La composition peut comprendre un excipient.

Dans un aspect supplémentaire, la présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par Moraxella catarrhalis et/ou Haemophilus influenzae. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

Dans un autre aspect, la présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention des exacerbations dans les bronchopneumopathies chroniques obstructives. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention et d'une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un antigène provenant de Haemophilus influenzae.

La présente invention propose également une composition pharmaceutique comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par Moraxella catarrhalis en combinaison avec au moins un antigène provenant de Haemophilus influenzae. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. D'autres aspects de la présente invention sont décrits dans la description détaillée de modes de réalisation particuliers, les exemples et les revendications qui suivent.

Brève description des dessins

Figure 1 - Profil de fermentation type avec les procédés d'induction à haute densité cellulaire (HCDI) et les paramètres suivis en fermenteur de 20 1 avec une alimentation semi-continue (« fed-batch »).

Figure 2 - Profil de fermentation type avec les procédés d'induction à basse densité cellulaire (LCDI) et les paramètres suivis en fermenteur de 20 1 avec une alimentation semi-continue (« fed-batch »).

Figure 3 - Rendement de UspA2 à partir des constructions de protéines MC-001, MC-002, MC-004, MC-005, MC-006, MC-007, MC-008 et MC-010 évaluées dans un fermenteur ; données issues du tableau 4.

Figure 4 - Distribution des poids moléculaires de MC-005 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine se trouve sous forme de trimère, avec une petite proportion d'oligomère d'un poids moléculaire supérieur pouvant correspondre à un dimère de trimères. PM = poids moléculaire. kDa = kilodalton.

Figure 5 - Distribution des poids moléculaires de MC-001 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine se trouve sous forme de trimère.

Figure 6 - Distribution des poids moléculaires de MC-001 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. L'échantillon présente des espèces multiples et est hautement polydispersé. Le coefficient de sédimentation des espèces principales détectées ne correspond pas a l'un des trimères normalement détectés dans les autres lots.

Figure 7 - Distribution des poids moléculaires de MC-001 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine se trouve sous forme de trimère.

Figure 8 - Distribution des poids moléculaires de MC-007 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine se trouve sous forme de trimère.

Figure 9 - Spectres de dichroïsme circulaire (CD) dans l'UV lointain des constructions de UspA2 donnant une indication des structures secondaires des protéines.

Figure 10 - Suivi des structures secondaires par dichroïsme circulaire (CD) durant le dépliement thermique de MC-005 (UspA2Ahélice + 6His). L'analyse visuelle des spectres montre clairement que la protéine perd la majeure partie de ses structures secondaires à 33 °C.

Figure 11 - Suivi des structures secondaires par dichroïsme circulaire (CD) durant le dépliement thermique de MC-007 (UspA2 pleine hélice + 6His). L'analyse visuelle des spectres montre que la perte de structure secondaire est plus lente comparativement à la construction sans hélice. Les changements structuraux sont détectables après chauffage à 33 °C, mais un dépliement complet semble survenir entre 35 °C et 37 °C.

Figure 12 - Spectre MALDI de MC-001 lot opt-01. La masse observée à 57427 Da peut être cohérente avec la protéine déméthionylée, alors que le pic à 57620 Da pourrait correspondre à la protéine complète.

Figure 13 - Spectre MALDI de MC-011 lot BMP37. La masse observée peut être cohérente avec la protéine déméthionylée. Les deux autres pics à +186 Da et +366 Da ne sont pas identifiés.

Figure 14 - Efficacité protectrice de MC-001 et MC-007 dans un modèle de souris de colonisation du poumon.

Figure 15 - Réponse en anticorps dirigée contre UspA2 induite après administration intramusculaire chez des souris, où PII et PIII indiquent, respectivement, les taux d'anti-IgG dans les sérums prélevés au jour 28 (après II) et au jour 42 (après III).

Figure 16 - Titres bactéricides induits par UspA2 contre une souche homologue formulée avec différents adjuvants (AS01E, AS04C et AIPO4) .

Figure 17 - Réponse en anticorps dirigée contre UspA2 induite après administration intramusculaire chez des souris, en utilisant différentes formulations d'antigènes et d'adjuvants.

Figure 18 - Titres bactéricides induits par UspA2 contre une souche homologue, en utilisant différentes formulations d'antigènes et d'adjuvants.

Figure 19 - Réponse en IgG induite contre la PD chez des souris par le vaccin PD-PEPilA-UspA2 (un vaccin trivalent NTHi-M. cat.), formulé avec des adjuvants différents.

Figure 20 - Réponse en IgG induite contre la PE chez des souris par le vaccin PD-PEPilA-UspA2 (un vaccin trivalent NTHi-M. cat.), formulé avec des adjuvants différents.

Figure 21 - Réponse en IgG induite contre la PilA chez des souris par le vaccin PD-PEPilA-UspA2 (un vaccin trivalent NTHi-M. cat.), formulé avec des adjuvants différents.

Figure 22 - Immunogénicité de la PE dans les formulations bivalente PD-PEPilA et trivalente PD-PEPilA-UspA2 avec AS01E.

Figure 23 - Immunogénicité de la PilA dans les formulations bivalente PD-PEPilA et trivalente PE-PilA-UspA2 avec AS01E.

Figure 24 - Immunogénicité de la PD dans les formulations bivalente PD-PEPilA et trivalente PE-PilA-UspA2 avec AS01E.

Figure 25 - Effet de la formulation vaccinale tétravalente PD/PEPilA/UspA2/As01E sur des poumons de souris présensibilisés avec M. cat. inactivée à la chaleur - Périvascularite et péribronchiolite chez des souris immunisées par du PBS.

Figure 26 - Effet de la formulation vaccinale tétravalente PD/PEPilA/UspA2/As01E sur des poumons de souris présensibilisés avec M. cat. inactivée à la chaleur - Jour 2 après immunisation.

Figure 27 - Effet de la formulation vaccinale tétravalente PD/PEPilA/UspA2/As01E sur des poumons de souris présensibilisés avec M. cat. inactivée à la chaleur - Jour 7 après immunisation.

Figure 28 - Effet de la formulation vaccinale tétravalente PD/PEPilA/UspA2/As01E sur des poumons de souris présensibilisés avec M. cat. inactivée à la chaleur - Jour 14 après immunisation.

Figure 29 - Effet de la formulation vaccinale tétravalente PD/PEPilA/UspA2/As01E sur des poumons de souris présensibilisés avec M. cat. inactivée à la chaleur - Résultats détaillés.

Figure 30 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après vaccination lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant de l'IL17. Restimulés avec M. cat. à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 31 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après vaccination lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant du TNFa. Restimulés avec M. cat. à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 32 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après vaccination lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant de l'IFNy. Restimulés avec M. cat à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 33 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après vaccination lors d'une restimulation avec M. cat. WC.

Lymphocytes CD4 des poumons exprimant de l'IL13. Restimulés avec M. cat à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 34 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après épreuve lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant de l'IL17. Restimulés avec M. cat à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 35 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après épreuve lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant du TNFa. Restimulés avec M. cat à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 36 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après épreuve lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant de l'IFNy. Restimulés avec M. cat à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Figure 37 - Réponses en lymphocytes T CD4 des poumons après épreuve lors d'une restimulation avec M. cat. WC. Lymphocytes CD4 des poumons exprimant de l'IL13. Restimulés avec M. cat à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur ou du milieu.

Description détaillée de l'invention

Sauf explication ou définition contraire ici, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par l'homme du métier du domaine auquel cette divulgation appartient. Par exemple, les définitions des termes courants en biologie moléculaire peuvent se trouver dans Benjamin Lewin, Genes V, publié par Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9) ; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publié par Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) ; et Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publié par VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Les termes au singulier « un », « une », « le » et « la » comprennent les articles au pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire. De façon similaire, le terme « ou » est censé comprendre « et » sauf si le contexte indique clairement le contraire. Il faut en outre comprendre que toutes les tailles de bases ou tailles d'acides aminés, et toutes les valeurs de poids moléculaire ou de masse moléculaire, données pour les acides nucléiques ou les polypeptides sont approximatives, et sont fournies pour la description. En outre, les limitations numériques données en ce qui concerne les concentrations ou les taux d'une substance, comme un antigène, peuvent être approximatives. Ainsi, lorsqu'une concentration est indiquée comme étant (par exemple) approximativement de 200 pg, il est prévu que la concentration comprenne des valeurs légèrement supérieures ou légèrement inférieures à (« environ » ou « ~ ») 200 pg.

Bien que des procédés et des matériaux similaires ou équivalents à ceux décrits ici puissent être utilisés dans la pratique ou l'analyse de cette divulgation, des procédés et des matériaux appropriés sont décrits ci-dessous.

Le terme « comprend » signifie « inclut ». Ainsi, sauf si le contexte requiert le contraire, le terme « comprend », et des variations comme « comprennent » et « comprenant » seront compris comme impliquant l'inclusion d'un composé ou d'une composition indiqué(e) (par exemple, acide nucléique, polypeptide, antigène) ou d'une étape, ou d'un groupe de composés ou d'étapes, mais pas l'exclusion d'autres composés, compositions, étapes, ou groupes de ceux-ci. L'abréviation « e.g. » est dérivée du latin exempli gratia, et est utilisée ici pour indiquer un exemple non limitatif. Ainsi, l'abréviation « e.g. » est synonyme du terme « par exemple ».

Afin de faciliter la description des divers modes de réalisation de cette divulgation, les explications suivantes des termes sont fournies. Des termes et des explications supplémentaires sont fournis dans le contexte de cette divulgation.

Un « sujet » tel qu'utilisé ici est un mammifère, y compris des êtres humains, des primates non humains, et des mammifères non primates comme des membres du genre des rongeurs (y compris, mais non limités à, les souris et les rats) et des membres de l'ordre des lagomorphes (y compris, mais non limités à, les lapins).

Telle qu'utilisée ici, « UspA2 » signifie protéine de surface ubiquitaire A2 de Moraxella catarrhalis. UspA2 peut être constituée de ou comprendre la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 de ATCC 25238. MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRV NPNLAFKAGAAINT S GNKKGS YNIGVNYE F (SEQ ID NO : 1) ainsi que des séquences présentant au moins ou exactement 63 %, 66 %, 70 %, 72 %, 74 %, 75 %, 77 %, 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité, sur la longueur entière, avec SEQ ID NO : 1. La comparaison de 38 séquences de UspA2 provenant de Moraxella catarrhalis (tableau 1, SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38) a démontré approximativement 63 % à approximativement 100 % d'identité avec UspA2 telle que représentée par SEQ ID NO : 1.

UspA2 telle que décrite par SEQ ID NO : 1 contient un peptide siqnal (par exemple les acides aminés 1 à 29 de SEQ ID NO : 1 ) , un domaine de liaison à la laminine (par exemple, les acides aminés 30 à 177 de SEQ ID NO : 1), un domaine de liaison à la fibronectine (par exemple, les acides aminés 165 à 318 de SEQ ID NO : 1) (Tan et al. JID 192: 1029-38 (2005)), un domaine de liaison à C3 (par exemple, les acides aminés 30 à 539 de SEQ ID NO : 1 (WO 2007/018463) , ou un fraqment des acides aminés 30 à 539 de SEQ ID NO : 1, par exemple, les acides aminés 165 à 318 de SEQ ID NO : 1 (Hallström T et al. J. Immunol. 186: 3120-3129 (2011)), une hélice amphipathique (par exemple, les acides aminés 519 à 564 de SEQ ID NO : 1 ou les acides aminés 520 à 559 de SEQ ID NO : 1, identifiés en utilisant différents procédés de prédiction) et un domaine d'ancraqe C-terminal (par exemple, les acides aminés 576 à 630 de SEQ ID NO : 1 (Brooks et al. , Infection & Immunity, 76(11), 5330-5340 (2008) ) .

Des différences d'acides aminés de UspA2 ont été décrites pour diverses espèces de Moraxella catarrhalis. Voir par exemple, J Bacteriology 181(13): 4026-34 (1999), Infection and

Immunity 76(11):5330-40 (2008) et PLoS One 7(9): e45452 (2012).

UspA2 peut être constituée de ou comprendre une séquence d'acides aminés qui diffère de SEQ ID NO : 1 au niveau d'un ou de plusieurs acides aminés quelconques choisis dans le groupe constitué de : AA (acide aminé) 30 à 298, AA 299 à 302, AA 303 à 333, AA 334 à 339, AA 349, AA 352 à 354, AA 368 à 403, AA 441, AA 451 à 471, AA 472, AA 474 à 483, AA 487, AA 490, AA 493, AA 529, AA 532 ou AA 543. UspA2 peut être constituée de ou comprendre une séquence d'acides aminés qui diffère de SEQ ID NO : 1 en ce qu'elle contient au moins une insertion d'acide aminé comparativement à SEQ ID NO : 1. UspA2 peut être constituée de ou comprendre une séquence d’acides aminés qui diffère de SEQ ID NO : 1 au niveau de l’une quelconque des différences d’acides aminés dans SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38. Par exemple, SEQ ID NO : 1 peut contenir K à la place de Q au niveau de l’acide aminé 70, Q à la place de G au niveau de l’acide aminé 135 et/ou D à la place de N au niveau de l’acide aminé 216.

Tableau 1 Séquences d'acides aminés de UspA2 à partir de 38 souches de Moraxella catarrhalls (SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38)

UspA2 peut être UspA2 de la souche de M. catarrhalis ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™, American 2933, American 2912, American 2908, Finnish 307, Finnish 353, Finnish 358, Finnish 216, Dutch H2, Dutch F10, Norwegian 1, Norwegian 13, Norwegian 20, Norwegian 25, Norwegian 27, Norwegian 36, BC5SV, Norwegian 14, Norwegian 3, Finish 414, Japanese Z7476, Belgium Z7530, German Z8063, American 012E, Greek MC317, American V1122, American P44, American V1171, American TTA24, American 035E, American SP12-6, American SP12-5, Swedish BC5, American 7169, Finnish FIN2344, American V1118, American V1145 ou American V1156. UspA2 peut être UspA2 telle que représentée par l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38. UspA2 peut être UspA2 d'une autre source qui correspond à la séquence de UspA2 de l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38. Des séquences correspondantes de UspA2 peuvent être déterminées par l'homme du métier en utilisant divers algorithmes. Par exemple, le programme Gap ou le programme Needle peut être utilisé pour déterminer les séquences de UspA2 correspondant à l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38.

UspA2 peut être une séquence présentant au moins 95 % d’identité, sur la longueur entière, avec l'une quelconque de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38.

Les fragments immunogènes de UspA2 comprennent des fragments immunogènes d'au moins 450 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1, 490 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1 (par exemple, le fragment de UspA2 de MC-004 ou MC-005), 511 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1 (par exemple, le fragment de UspA2 de la construction MC-001, MC-002, MC-003 ou MC-004), 534 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1 (par exemple, le fragment de UspA2 de MC-009 ou MC-011) ou 535 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1 (par exemple, le fragment de UspA2 de MC-007, MC-008 ou MC-010) . Les fragments immunogènes peuvent déclencher des anticorps qui peuvent lier SEQ ID NO : 1.

Les fragments immunogènes de UspA2 peuvent comprendre des fragments immunogènes d'au moins 450, 490, 511, 534 ou 535 acides aminés consécutifs de l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38. Les fragments immunogènes de UspA2 peuvent comprendre des fragments immunogènes de UspA2 de l'une quelconque de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38 qui correspondent au fragment de UspA2 de SEQ ID NO : 1 dans l'une quelconque des constructions de UspA2 MC-001, MC-002, MC-003, MC-004, MC-005, MC-006, MC-007, MC-008, MC-009, MC-010 ou MC-011. Les fragments immunogènes peuvent déclencher des anticorps qui peuvent lier la séquence pleine longueur à partir de laquelle le fragment est dérivé.

Des alignements entre des paires de polypeptides peuvent être calculés par divers programmes. Par exemple, le programme Needle du progiciel EMBOSS (logiciel gratuit ; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6) : 276—277) et le programme Gap du progiciel GCG (une marque déposée aux Etats-Unis) (Accelrys Inc.) peuvent être utilisés.

Les programmes Gap et Needle sont une mise en œuvre de l'algorithme de Needleman-Wunsch décrit dans : Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Ces programmes utilisent fréquemment la matrice de score BLOSUM62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry) : 10915-10919) avec des pénalités d'ouverture et d'extension de brèche, respectivement, de 8 et 2. Parfois, la matrice de score PAM250 (Dayhoft et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", In "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352, National Biomédical Research Foundation, Washington) est également utilisée.

Les matrices de score décrivent par des nombres la tendance de chaque acide aminé à muter en un autre, ou à être conservé. Ces nombres sont généralement calculés à partir de statistiques de mutations observées dans des alignements fidèles par paires ou multiples, ou même dans des fragments d'alignements multiples. Généralement, dans ces tableaux, si un nombre positif élevé est associé à une paire d'acides aminés identiques, cela indique que ce résidu a une faible tendance à la mutation. A l'opposé, un nombre positif élevé associé à une paire d'acides aminés différents indique une tendance élevée à la mutation entre ces deux acides aminés. Et ceci est appelé une « substitution conservative ».

En regardant un alignement par paires, on peut observer les résidus identiques alignés (« identités ») entre les deux séquences. Un pourcentage d'identité peut être calculé en multipliant par 100 (1) le quotient entre le nombre d'identités et la longueur de l'alignement (par exemple, dans le résultat du programme Needle), ou (2) le quotient entre le nombre d'identités et la longueur de la séquence la plus longue, ou (3) le quotient entre le nombre d'identités et la longueur de la séquence la plus courte, ou (4) le quotient entre le nombre d'identités et le nombre de résidus alignés (par exemple, dans le résultat du programme Gap).

Le pourcentage d'identité du tableau 8 a été calculé selon la définition (3) du paragraphe précédent, en utilisant les alignements par paires calculés par le logiciel Gap.

Tel qu'utilisé ici, « adjuvant » signifie un composé ou une substance qui, lorsqu'il/elle est administré (e) à un sujet conjointement avec un vaccin, un agent immunothérapeutique, ou une autre composition contenant un antigène ou un immunogène, augmente ou amplifie la réponse immunitaire du sujet à l'antigène ou à l'immunogène administré (comparativement à la réponse immunitaire qui serait obtenue en l'absence de l'adjuvant). Ceci doit être distingué de la « thérapie adjuvante » définie par le National Cancer Institute of the United States Institutes of Health dans le contexte d'un traitement du cancer comme un traitement supplémentaire donné après le traitement primaire, pour abaisser le risque que le cancer réapparaisse. L'invention propose en outre des protéines de formule (I) contenant des substitutions conservatives d'acides aminés. Par exemple, les protéines de formule (I) peuvent contenir une substitution conservative d'un acide aminé quelconque de UspA2 de Moraxella catarrhalis telle que décrite dans l'une quelconque des séquences présentées ici (par exemple, toute séquence de UspA2 représentée par SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38).

Tel qu'utilisé ici, « peptide signal » se rapporte à un polypeptide court (moins de 60 acides aminés, par exemple, 3 à 60 acides aminés) présent sur des protéines précurseurs (généralement à l'extrémité N-terminale), et qui est généralement absent de la protéine mature. Le peptide signal (sp) est généralement riche en acides aminés hydrophobes. Le peptide signal dirige le transport et/ou la sécrétion de la protéine traduite à travers la membrane. Les peptides signal peuvent être également appelés signaux de ciblage, peptides de transit, signaux de localisation, ou séquences signal. Par exemple, la séquence signal peut être un peptide signal cotraductionnel ou posttraductionnel.

Un peptide signal hétérologue peut être clivé à partir d'une construction de protéine par des peptide signal peptidases durant ou après le transport ou la sécrétion de la protéine. Par exemple, la peptide signal peptidase est une peptide signal peptidase I. Un peptide signal « hétérologue » est un peptide signal qui n'est pas associé à la protéine comme elle existe dans la nature.

Tel qu'utilisé ici, « traitement » signifie la prévention de l'apparition de symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, la prévention de la réapparition de symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, le retard de la réapparition de symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, la diminution de la gravité ou de la fréquence des symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, le ralentissement ou l'élimination de la progression de l'affection et l'élimination partielle ou totale des symptômes de la maladie ou de l'affection chez un sujet.

Tel qu'utilisé ici, « éventuellement » signifie que 1'événement/les événements décrit(s)ci-après peut/ peuvent apparaître ou pas, et comprend à la fois l'événement/ les événements qui apparaît/apparaissent et les événements qui n'apparaissent pas. L'otite moyenne est une cause majeure de morbidité chez 80 % de tous les enfants âgés de moins de 3 ans. (Expert Rev. Vaccines 5: 517-534 (2006)) . Plus de 90 % des enfants développent une otite moyenne avant l'âge de 7 ans (Current Opinion in

Investigational Drugs 4: 953-958 (2003)). En 2000, il y a eu 16 millions de visites effectuées chez des médecins en pratique privée pour une otite moyenne aux Etats-Unis et approximativement 13 millions de prescriptions d'antibactériens ont été délivrées. (Pediatrics 113: 1451-1465 (2004)). Dans les pays européens, les taux rapportés d'otite moyenne aiguë se situent dans la plage de 0,125 à 1,24 par enfant/an. (Expert Review of Vaccines 8: 1479-1500 (2009)) . L'otite moyenne est une infection coûteuse et la raison la plus courante est que les enfants reçoivent des antibiotiques. (Current Infectious Disease Reports 11: 177-182 (2009)). Les bactéries sont responsables d'approximativement 70 % des cas d'otite moyenne aiguë, avec Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae non typable (NTHi), et Moraxella catarrhalis prédominant comme agents responsables (Expert Review of Vaccines 5: 517-534 (2006)). Un sous-ensemble d'enfants expérimente une otite moyenne récurrente et chronique et ces enfants enclins à une otite présentent des épanchements prolongés de l'oreille moyenne qui sont associés à une perte de l'audition et à des retards dans le développement de la parole et du langage. (Current Infectious Disease Reports 11: 177-182 (2009)). La pression antibiotique récente et la vaccination avec le vaccin conjugué antipneumococcique ont entraîné l'apparition de Haemophilus influenzae et Moraxella catarrhalis produisant de la ß-lactamase comme organismes principaux responsables de l'otite moyenne aiguë en Amérique du Nord, suivis de Streptococcus pneumoniae (Pediatr Clin N Am 60 (2013) 391-407).

Puisque l'otite moyenne est une maladie multifactorielle, la faisabilité de la prévention de l'otite moyenne en utilisant une stratégie de vaccination a été remise en cause. (Current Infectious Disease Reports 11: 177-182 (2009)).

Le modèle du chinchilla est un modèle animal robuste et validé par l'otite moyenne et sa prévention (Expert Review of

Vaccines 8: 1063-1082 (2009)). Alors que le modèle du chinchilla peut mimer l'évolution naturelle de l'infection humaine, d'autres ont suggéré que les résultats dans le modèle du chinchilla peuvent varier d'un laboratoire à l'autre. (Current Opinion in Investigational Drugs 4: 953-958 (2003)).

Divers autres rongeurs ont été également utilisés pour l'induction d'une otite moyenne et sont résumés dans Vaccine 26: 1501-1524 (2008). Le modèle animal murin est souvent étudié dans la recherche sur l'otite moyenne.

La présence d'anticorps bactéricides est associée à une protection contre l'otite moyenne due à H. influenzae non typable. (Current Opinion in Infectious Disease 16: 129-134 (2003)). Toutefois, une réponse immunitaire n'a pas besoin d'être bactéricide pour être efficace contre le NTHi. Des anticorps qui réagissent simplement avec les adhésines de surface du NTHi peuvent réduire ou éliminer l'otite moyenne chez le chinchilla. (Current Opinion in Investigational Drugs 4: 953-958 (2003)) .

La bronchopneumopathie chronique obstructive est une maladie inflammatoire chronique des poumons et une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Approximativement une personne décédée sur 20 en 2005 aux Etats-Unis avait une BPCO comme cause sous-jacente. (Drugs and Aging 26: 985-999 (2009)). Il est prévu qu'en 2020, la BPCO s'élève au cinquième rang des principales causes de perte d'années de vie ajustées sur l'incapacité, des maladies invalidantes chroniques, et soit la troisième cause la plus importante de mortalité (Lancet 349: 1498-1504 (1997)). L'évolution de la BPCO est caractérisée par une aggravation progressive de la limitation du flux d'air et un déclin de la fonction pulmonaire. La BPCO peut se compliquer par des exacerbations aiguës (AE) fréquentes et récurrentes, qui sont associées à des dépenses de santé énormes et à une morbidité élevée. (Proceedings of the American Thoracic Society 4: 554-564 (2007)) . Une étude suggère qu' approximativement 50 % des exacerbations aiguës des symptômes dans la BPCO sont provoquées par Haemophilus influenzae non typable, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, et Pseudomonas aeruginosa. (Drugs and Aging 26: 985-999 (2009)). Haemophilus influenzae (H. influenzae) se trouve dans 20 à 30 % des exacerbations de la BPCO ; Streptococcus pneumoniae, dans 10 à 15 % des exacerbations de la BPCO ; et Moraxella catarrhalis, dans 10 à 15 % des exacerbations de la BPCO. (New England Journal of Medicine 359: 2355-2365 (2008)). Il a été montré que Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, et Moraxella catarrhalis sont les agents pathogènes primaires dans les exacerbations aiguës de la bronchite à Hong Kong, en Corée du Sud, et aux Philippines, alors que Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. constituent une grande proportion des agents pathogènes dans d'autres pays/régions asiatiques y compris en Indonésie, Thaïlande, Malaisie et Taïwan (Respirology, (2011) 16, 532-539 ; doi: 10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x) . Au Bangladesh, 20 % des patients souffrant de BPCO ont présenté une culture des expectorations positive pour Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae, alors que 65 % des patients souffrant de EABPCO (exacerbations aiguës de la BPCO) ont présenté des cultures positives pour Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter, Moraxella catarrhalis et leurs combinaisons. (Mymensingh Medical Journal 19: 576-585 (2010)) . Toutefois, il a été suggéré que les deux mesures les plus importantes pour prévenir une exacerbation de la BPCO consistent en des immunisations actives et un maintien chronique de la pharmacothérapie. (Proceedings of the American Thoracic Society 4: 554-564 (2007)).

La pneumonie extra-hospitalière (PEH) a été décrite comme la cause majeure de décès à partir de maladies infectieuses et la cause située au sixième rang des décès globaux aux Etats-Unis. Moraxella catarrhalls est l'un des agents pathogènes associés à la PEH en Amérique du Nord (Clin Chest Med 26 (2005) 37-55) et est l'un des agents pathogènes associés à une pneumonie extra-hospitalière modérée à sévère au Japon (J Infect Chemother. 2014 Nov 20. pii: S1341-321X(14)00396-1. doi: 10.1016/j.jiac.2014.11.006. [Diffusion en ligne avant 1'impression]).

Il existe un besoin de vaccins efficaces contre M. catarrhalis.

La présente invention concerne des protéines de formule (I). A - (Ri)m - (B) n (formule I) dans laquelle : A représente UspA2 de Moraxella catarrhalis ou un fragment immunogène de celle-ci ;

Ri représente un acide aminé ; m vaut 0 ou 2 ; B représente une histidine ; et n vaut 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

Dans un mode de réalisation particulier, Ri et m sont définis où (Ri)m représente AS (alanine sérine). Dans un autre mode de réalisation, Ri représente des acides aminés non natifs.

Dans un mode de réalisation, les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont définies où m vaut 0. Dans un mode de réalisation, lorsque m vaut 0, n vaut 2. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, lorsque m vaut 0, n ne vaut pas 0.

Dans un mode de réalisation, m vaut 2.

Dans un mode de réalisation particulier, n est choisi dans le groupe constitué de 1, 2 et 6. Dans un autre mode de réalisation, n est choisi dans le groupe constitué de 2 et 6. Dans un mode de réalisation particulier, n vaut 2. Dans un autre mode de réalisation, n vaut 6.

Dans un mode de réalisation, n est choisi dans le groupe constitué de 0, 1, 2 et 6, ou tout sous-ensemble de ceux-ci.

Dans un mode de réalisation, n vaut 0. Dans un autre mode de réalisation, lorsque n vaut 0, m vaut 2.

Dans un mode de réalisation, n vaut 1. Dans un mode de réalisation, n vaut 3. Dans un mode de réalisation, n vaut 4. Dans un mode de réalisation, n vaut 5.

Dans un mode de réalisation, les protéines de formule (I) contiennent en outre une méthionine (M) à l'extrémité amino ; une protéine avec la formule suivante : méthionine - A - (Ri)m (B) n. Celles-ci sont comprises au sein des protéines de l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque m vaut 0 et n vaut 0, les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont des protéines non natives.

Dans un mode de réalisation, les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont des protéines non natives.

Dans un mode de réalisation, les protéines de formule (I) sont définies où A représente UspA2 de M. catarrhalis. Dans un autre mode de réalisation, les protéines de formule (I) sont définies où A représente UspA2 telle que représentée par une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 et SEQ ID NO : 38 ou tout sous-ensemble de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38. Dans un autre mode de réalisation, les protéines de formule (I) sont définies où A représente UspA2, où UspA2 est au moins identique à 63 %, 66 %, 70 %, 72 %, 74 %, 75 %, 77 %, 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % sur la longueur entière, avec SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, les protéines de formule (I) sont définies où A représente UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 75 % à 100 % avec la séquence d'acides aminés de UspA2 représentée par SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, A représente UspA2 où UspA2 est approximativement identique à 90 % à 100 % avec la séquence d'acides aminés de UspA2 représentée par SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, A représente UspA2, où UspA2 est au moins identique à 95 % avec la séquence d'acides aminés de UspA2 représentée par SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, les protéines de formule (I) sont définies où A représente UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 75 % à 100 % avec la séquence d'acides aminés de UspA2 représentée par l'une quelconque de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38. Dans un autre mode de réalisation, A représente UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 90 % à 100 % avec la séquence d'acides aminés de UspA2 représentée par l'une quelconque de SEQ ID NO : là

SEQ ID NO : 38. Dans un mode de réalisation supplémentaire, A représente UspA2, où UspA2 est au moins identique à 95 % avec la séquence d'acides aminés de UspA2 représentée par l'une quelconque de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38. Dans un mode de réalisation particulier, A représente UspA2 ayant la séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 1.

Dans un autre mode de réalisation, les protéines de formule (I) sont définies où A représente un fragment immunogène de UspA2 de M. catarrhalis. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 où UspA2 a une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 et SEQ ID NO : 38 ou tout sous-ensemble de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 75 % à 100 % avec la séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 90 % à 100 % avec SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, A est un

fragment immunogène de UspA2, où UspA2 est au moins identique à 95 % avec SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 75 % à 100 % avec la séquence d'acides aminés représentée par l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2, où UspA2 est approximativement identique à 90 % à 100 % avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 38. Dans un mode de réalisation supplémentaire, A est un fragment immunogène de UspA2, où UspA2 est au moins identique à 95 % avec l'une quelconque de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38. Dans un mode de réalisation particulier, A est un fragment immunogène de UspA2, où UspA2 a la séquence d'acides aminés représentée par SEQ ID NO : 1.

Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 de M. catarrhalis choisi dans le groupe constitué des acides aminés 30 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 39) , les acides aminés 31 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 40), les acides aminés 30 à 519 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 41), les acides aminés 30 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 42) et les acides aminés 31 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 43). Plus spécifiquement, dans un mode de

réalisation, A représente SEQ ID NO : 43, les acides aminés 31 à 564 de SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation supplémentaire, A représente SEQ ID NO : 42, les acides aminés 30 à 564 de SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 de M. catarrhalis choisi dans le groupe constitué des acides aminés 30 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 39), les acides aminés 31 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 40) et les acides aminés 30 à 519 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 41) . Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 présentant au moins 52 % (American 2908), 55 % (Norwegian 25), 57 % (Japanese Z7476), 62 % (Finnish FIN2344), 64 % (American 2912), 69 % (American P44), 73 % (American 7169), 76 % (Norwegian 27), 81 % (American VI145), 88 % (German Z8063) ou 100 % (Swedish BC5) d'identité avec SEQ ID NO : 39. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 présentant au moins 52 % (American 2908), 57 % (Dutch F10), 62 % (American 2933), 65 % (Greek MC317), 67 % (American V1122), 70 % (American P44), 73 % (American 7169), 76 % (Norwegian 3), 81 % (German Z8063), 100 % (Swedish BC5) d'identité avec SEQ ID NO : 43.

Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 de M. catarrhalis de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38 où le fragment comprend les acides aminés qui s'alignent avec les acides aminés 30 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 39), les acides aminés 31 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 40), les acides aminés 30 à 519 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 41), les acides aminés 30 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 42) ou les acides aminés 31 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 43). Dans un mode de réalisation, le programme Gap (du progiciel GCG), ou le programme Needle (du progiciel EMBOSS), mettant en œuvre l'algorithme de Needleman-Wunsch, peuvent être utilisés pour aligner les séquences.

UspA2 - SEQ ID NO : 1

MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE TLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEEL FNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRV NPNLAFKAGAAINT S GNKKGSYNIGVNYEF

Acides aminés 30 à 540 de UspA2 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 39

QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNET SIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEEL FNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK

Acides aminés 31 à 540 de UspA2 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 40

AKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEE L FNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK

Acides aminés 30 à 519 de UspA2 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 41

QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE TLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEEL FNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL I TANKTAI DANKASADTKFAATADAI TKNGNAI TKNAKS

Acides aminés 30 à 564 de UspA2 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 42

QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEI HAHNEAQNE TLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEEL FNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL I TANKTAI DANKASADTKFAATADAI TKNGNAI TKNAKS I TDLGTKVDGFDSRVTALDTK

VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAA

Acides aminés 31 à 564 de UspA2 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 43

AKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEE L FNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAA

Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 de M. catarrhalis qui diffère de SEQ ID NO : 1 dans un ou plusieurs des acides aminés suivants : AA (acide aminé) 30 à 298, AA 299 à 302, AA 303 à 333, AA 334 à 339, AA 349, AA 352 à 354, AA 368 à 403, AA 441, AA 451 à 471, AA 472, AA 474 à 483, AA 487, AA 490, AA 493, AA 529, AA 532 ou AA 543. Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 de M. catarrhalis qui diffère de SEQ ID NO : 1 en ce qu'il contient au moins une insertion d'acide aminé comparativement à SEQ ID NO : 1.

Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 qui contient un domaine de liaison à la laminine et un domaine de liaison à la fibronectine.

Dans un mode de réalisation supplémentaire, A est un fragment immunogène de UspA2 qui contient un domaine de liaison à la laminine, un domaine de liaison à la fibronectine et un domaine de liaison à C3.

Dans un autre mode de réalisation, A est un fragment immunogène de UspA2 qui contient un domaine de liaison à la laminine, un domaine de liaison à la fibronectine, un domaine de liaison à C3 et une hélice amphipathique.

Le domaine de liaison à la laminine, le domaine de liaison à la fibronectine, le domaine de liaison à C3 ou l'hélice amphipathique peut être tel que défini pour SEQ ID NO : 1 ou peut être la séquence correspondante à l'une quelconque de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38.

Les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont utiles en tant qu'immunogènes chez des sujets comme des mammifères, particulièrement des êtres humains. En particulier, les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont utiles dans l'induction d'une réponse immunitaire contre M. catarrhalis chez des sujets, particulièrement des êtres humains. Les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont utiles dans le traitement ou la prévention d'une infection ou d'une maladie due à M. catarrhalis. Plus spécifiquement, les protéines de formule (I) et les protéines de l'invention sont utiles dans le traitement ou la prévention de l'otite moyenne et/ou de la BPCO et/ou de l'EABPCO et/ou de la pneumonie.

La présente invention concerne des compositions immunogènes comprenant UspA2 de M. catarrhalis ou un fragment immunogène de celle-ci. La présente invention concerne également des vaccins comprenant de telles compositions immunogènes et leurs utilisations thérapeutiques. Les compositions immunogènes et les vaccins de la présente invention sont utiles dans le traitement ou la prévention d'une infection ou d'une maladie due à M. catarrhalis. Plus spécifiquement, les compositions immunogènes et les vaccins décrits ici sont utiles dans le traitement ou la prévention de l'otite moyenne et/ou de la BPCO et/ou de l'EABPCO et/ou de la pneumonie.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend UspA2 de M. catarrhalis. UspA2 peut être l'une quelconque de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38 ou une séquence de UspA2 au moins identique à 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec l'une quelconque de SEQ ID NO : là SEQ ID NO : 38. UspA2 peut être également une séquence de UspA2 au moins identique à 63 % (American 2908), 66 % (Japanese Z7476), 70 % (Dutch F10), 72 % (Finnish 358), 74 % (American P44), 77 % (Finnish 307), 80 % (Norwegian 3), 84 % (American V1145), 90 % (German Z8063) ou 100 % (Swedish BC5) avec celle de SEQ ID NO : 1.

Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend un fragment immunogène de UspA2. Le fragment immunogène de UspA2 peut être SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 42 ou SEQ ID NO : 43, ou une séquence présentant au moins 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d'identité de séquence avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 42 ou SEQ ID NO : 43. Le fragment immunogène de UspA2 peut être une séquence de UspA2 au moins identique à 52 % (American 2908), 55 % (Norwegian 25), 57 % (Japanese Z7476), 62 % (Finnish FIN2344), 64 % (American 2912), 69 % (American P44), 73 % (American 7169), 76 % (Norwegian 27), 81 % (American V1145), 88 % (German Z8063) ou 100 % (Swedish BC5) avec SEQ ID NO : 39. Le fragment immunogène de UspA2 peut être également une séquence de UspA2 au moins identique à 52 % (American 2908), 57 % (Dutch F10), 62 % (American 2933), 65 % (Greek MC317), 67 % (American V1122), 70 % (American P44), 73 % (American 7169), 76 % (Norwegian 3), 81 % (German Z8063), 100 % (Swedish BC5) avec SEQ ID NO : 43. Des différences d'acides aminés ont été décrites dans UspA2 provenant de diverses espèces de Moraxella catarrhalis.

UspA2 contient un domaine de liaison à la laminine (par exemple, les acides aminés 30 à 177 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 44) . Dans un mode de réalisation, le fragment de UspA2 comprend la région de liaison à la laminine de SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le fragment de UspA2 comprend la région de liaison à la laminine de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38.

Acides aminés 30 à 177 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 44 : QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQR NLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIED

UspA2 contient un domaine de liaison àe la fibronectine (par exemple, les acides aminés 165 à 318 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 45) . Dans un mode de réalisation, le fragment de

UspA2 comprend la région de liaison à la fibronectine de SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le fragment de UspA2 comprend la région de liaison à la fibronectine de l'une quelconque de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38. Le domaine de liaison à la fibronectine de SEQ ID NO : 45 possède également des propriétés de liaison de C3.

Acides aminés 165 à 318 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 45 :

KDAIAKNNESIEDLYD

FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQK

UspA2 contient un domaine de liaison au composant 3 du complément (C3) (par exemple, les acides aminés 30 à 539 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 46, ou les acides aminés 165 à 318 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 45). Dans un mode de réalisation, le fragment de UspA2 comprend la région de liaison à C3 de SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le fragment de UspA2 comprend un domaine de liaison à C3 de l'une quelconque de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38.

Acides aminés 30 à 539 de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 46 :

QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLS G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDT

UspA2 contient une hélice amphipathique (par exemple, les acides aminés 519 à 564 de SEQ ID NO : 1 ou les acides aminés 520 à 559 de SEQ ID NO : 1) . Dans un mode de réalisation, le fragment de UspA2 comprend les acides aminés 519 à 564 de SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, le fragment de UspA2 comprend les acides aminés 520 à 559 de SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le fragment de UspA2 comprend une hélice amphipathique de l'une quelconque de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 38 .

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend une protéine de formule (I) où A est un fragment immunogène de UspA2 qui comprend un domaine de liaison à la laminine et un domaine de liaison à la fibronectine.

Dans un mode de réalisation supplémentaire, la composition immunogène comprend une protéine de formule (I) où A est un fragment immunogène de UspA2 qui comprend un domaine de liaison à la laminine, un domaine de liaison à la fibronectine et un domaine de liaison à C3.

Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend une protéine de formule (I) où A est un fragment immunogène de UspA2 qui comprend un domaine de liaison à la laminine, un domaine de liaison à la fibronectine, un domaine de liaison à C3 et une hélice amphipathique.

Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend une protéine telle que définie par la formule (I) . La composition immunogène peut contenir, par exemple, une protéine de formule (I) avec une méthionine supplémentaire à l'extrémité amino.

Dans un mode de réalisation, les présentes compositions immunogènes peuvent être administrées avec d'autres antigènes. Par exemple, la présente composition immunogène peut être administrée avec des antigènes de H. influenzae. Par exemple, la protéine de formule (I) peut être administrée avec la protéine D (PD) de H. influenzae. La protéine D peut être telle que décrite dans le document WO 91/18926. La présente composition immunogène peut être administrée avec la protéine E (PE) et la piline A (PilA) de H. influenzae. La protéine E et la piline A peuvent être telles que décrites dans le document WO 2012/139225 ; dont le contenu est incorporé ici en référence. La protéine E et la piline A peuvent se présenter sous la forme d'une protéine de fusion.

Dans un autre mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention peuvent être administrées avec des antigènes supplémentaires provenant d'autres espèces bactériennes également connues pour provoquer une otite moyenne, une BPCO, une EABPCO ou une pneumonie.

La quantité de la composition immunogène qui est nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique ou biologique souhaité dépendra d'un certain nombre de facteurs comme l'utilisation pour laquelle elle est prévue, le moyen de l'administration, le receveur et le type et la gravité de l'affection traitée, et elle sera finalement à la discrétion du médecin ou du vétérinaire traitant. En général, on peut s'attendre à ce qu'une dose type pour le traitement d'une affection provoquée en totalité ou en partie par M. catarrhalis chez un être humain, par exemple, se situe dans la plage d'environ 0,001 mg à 0,120 mg. Plus spécifiquement, une dose type pour le traitement d'une affection provoquée en totalité ou en partie par M. catarrhalis chez un être humain peut se situer dans la plage d'environ 0,003 mg à environ 0,03 mg de protéine. La présente invention propose une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par M. catarrhalis. La composition immunogène peut contenir des antigènes supplémentaires ; une dose type pour le traitement d'une affection provoquée en totalité ou en partie par H. influenzae chez un être humain peut se situer dans la plage d'environ 0,005 mg à environ 0,05 mg pour chaque antigène supplémentaire. Cette dose peut être administrée sous la forme d'une seule dose unitaire. Plusieurs doses unitaires peuvent être également administrées séparément. Par exemple, des doses unitaires peuvent être administrées séparément en tant que doses de sensibilisation distinctes au cours de la première année de vie ou en tant que doses de rappel distinctes données à des intervalles réguliers (par exemple, tous les 1, 5 ou 10 ans) . La présente invention propose également une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par Moraxella catarrhalis en combinaison avec au moins un antigène provenant de Haemophilus influenzae.

Les formulations comprenant les compositions immunogènes de l'invention peuvent être adaptées pour une administration par une voie appropriée, par exemple, par la voie intramusculaire, sublinguale, transcutanée, intradermique ou intranasale. De telles formulations peuvent être préparées par tout procédé connu de l'Etat de l'Art.

Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent comprendre en outre un adjuvant. Lorsque le terme « adjuvant » est utilisé dans ce mémoire, il se rapporte à une substance qui est administrée conjointement avec la composition immunogène pour stimuler la réponse immunitaire du patient envers le composant immunogène de la composition.

Les adjuvants appropriés comprennent un sel d'aluminium comme le gel d'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium ou l'alun, mais il peut être également un sel de calcium, de magnésium, de fer ou de zinc, ou il peut être une suspension insoluble de tyrosine acylée, ou de sucres acylés, de saccharides dérivés de façon cationique ou anionique, ou de polyphosphazènes. Dans un mode de réalisation, la protéine peut être adsorbée sur du phosphate d'aluminium. Dans un autre mode de réalisation, la protéine peut être adsorbée sur de 1'hydroxyde d'aluminium. Dans un troisième mode de réalisation, de l'alun peut être utilisé comme adjuvant.

Les systèmes d'adjuvants appropriés qui favorisent une réponse principalement Thl comprennent : des dérivés non toxiques du lipide A, le monophosphoryl-lipide A (MPL) ou l'un de ses dérivés, particulièrement le monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé (3D-MPL) (pour sa préparation, voir le document GB 2220211 A) ; et une combinaison de monophosphoryl-lipide A, de préférence de monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé, conjointement avec soit un sel d'aluminium (par exemple, du phosphate d'aluminium ou de 1'hydroxyde d'aluminium) soit une émulsion huile dans l'eau. Dans de telles combinaisons, l'antigène et le 3D-MPL sont contenus dans les mêmes structures particulaires, permettant une administration plus efficace des signaux antigéniques et immunostimulants. Des études ont montré que le 3D-MPL est capable d'amplifier en outre l'immunogénicité d'un antigène adsorbé sur de l'alun (Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14 ; EP 689454-Bl). AS01 est un système d'adjuvants contenant du MPL (3-0-désacyl-4'-monophosphoryl-lipide A), du QS21 ((Quillaja saponarla Molina, fraction 21) Antigenics, New York, NY, USA) et des liposomes. AS01B est un système d'adjuvants contenant du MPL, du QS21 et des liposomes (50 μg de MPL et 50 pg de QS21). AS01E est un système d'adjuvants contenant du MPL, du QS21 et des liposomes (25 pg de MPL et 25 pg de QS21). Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin comprend du AS01. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin comprend du AS01B ou du ASOIE. Dans un mode de réalisation particulier, la composition immunogène ou le vaccin comprend du AS01E. AS02 est un système d'adjuvants contenant du MPL et du QS21 dans une émulsion huile/eau. AS02V est un système d'adjuvants contenant du MPL et du QS21 dans une émulsion huile/eau (50 pg de MPL et 50 pg de QS21). AS03 est un système d'adjuvants contenant de 1'a-tocophérol et du squalène dans une émulsion huile/eau (h/e). AS03A est un système d'adjuvants contenant de 1'a-tocophérol et du squalène dans une émulsion h/e (11,86 mg de tocophérol) . AS03B est un système d'adjuvants contenant de 1'a-tocophérol et du squalène dans une émulsion h/e (5,93 mg de tocophérol) . AS03C est un système d'adjuvants contenant de 1'a-tocophérol et du squalène dans une émulsion h/e (2,97 mg de tocophérol). Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin comprend du AS 03 . AS04 est un système d'adjuvant contenant du MPL (50 pg de MPL) adsorbé sur un sel d'aluminium (500 pg de Al3+) . Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin comprend du AS04.

Un système impliquant l'utilisation de QS21 et de 3D-MPL est décrit dans le document WO 94/00153. Une composition dans laquelle le QS21 est neutralisé avec du cholestérol est décrite dans le document WO 96/33739. Une formulation d'adjuvant supplémentaire impliquant du QS21, du 3D-MPL et du tocophérol dans une émulsion huile dans l'eau est décrite dans le document WO 95/17210. Dans un mode de réalisation, la composition immunoqène comprend en outre une saponine, qui peut être le QS21. La formulation peut également comprendre une émulsion huile dans l'eau et du tocophérol (WO 95/17210) . Des oligonucléotides contenant des CpG non méthylés (WO 96/02555) et d'autres oligonucléotides immunomodulateurs (WO 0226757 et WO 03507822) sont également des inducteurs préférentiels d'une réponse TH1 et sont appropriés pour une utilisation dans la présente invention.

Des adjuvants supplémentaires sont ceux choisis dans le groupe des sels métalliques, des émulsions huile dans l'eau, des agonistes des récepteurs de type Toll, (en particulier l'agoniste du récepteur de type Toll 2, l'agoniste du récepteur de type Toll 3, l'agoniste de récepteur de type Toll 4, l'agoniste de récepteur de type Toll 7, l'agoniste de récepteur de type Toll 8 et l'agoniste de récepteur de type Toll 9), des saponines ou des combinaisons de ceux-ci.

La présente invention propose un procédé de préparation d'une composition immunogène comprenant la combinaison d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention avec un adjuvant.

La présente invention propose en outre un vaccin contenant une composition immunogène de l'invention et un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.

Les excipients possibles comprennent l'arginine, l'acide pluronique et/ou le polysorbate. Dans un mode de réalisation préféré, le polysorbate 80 (par exemple, TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 80) est utilisé. Dans un autre mode de réalisation, une concentration finale d'environ 0,03 % à environ 0,06 % est utilisée. De façon spécifique, une concentration finale d'environ 0,03 %, 0,04 %, 0,05 % ou 0,06 % de polysorbate 80 (p/v) peut être utilisée.

La présente invention propose un procédé de préparation d'une composition immunogène ou d'un vaccin comprenant la combinaison d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention propose également des acides nucléiques codant pour les protéines de l'invention. Le terme « acide nucléique » se rapporte à une forme polymère de nucléotides. Les nucléotides peuvent être des ribonucléotides, des désoxyribonucléotides, ou des formes modifiées soit de ribonucléotides soit de désoxyribonucléotides. Le terme comprend des formes simples et doubles d'ADN. Les acides nucléiques sont de préférence substantiellement dépourvus d'autres acides nucléiques.

La présente invention propose un procédé de production des acides nucléiques de l'invention. Les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés par des procédés connus de l'homme du métier. Par exemple, les acides nucléiques de l'invention peuvent être synthétisés en partie ou en totalité. Les acides nucléiques peuvent être préparés par digestion d'acides aminés plus longs ou jonction d'acides aminés plus courts.

La présente invention propose un procédé pour le traitement ou la prévention de l'otite moyenne. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

La présente invention propose un procédé pour le traitement ou la prévention des exacerbations dans la bronchopneumopathie chronique obstructive. L'exacerbation de la BPCO peut être une exacerbation aiguë. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace de la protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

La présente invention propose un procédé pour le traitement ou la prévention de la pneumonie. Le procédé comprend l'administration à un sujet qui en a besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace de la protéine de formule (I) ou d'une protéine de l'invention.

La présente invention propose une composition pharmaceutique comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par Moraxella catarrhalis. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention propose l'utilisation (a) de protéines de formule (I) et de protéines de l'invention, (b) d'une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c) d'un vaccin comprenant (cl) une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c2) une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une infection ou d'une maladie due à M. catarrhalis.

La présente invention propose l'utilisation (a) de protéines de formule (I) et de protéines de l'invention, (b) d'une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c) d'un vaccin comprenant (cl) une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c2) une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou la prévention de l'otite moyenne.

La présente invention propose l'utilisation (a) de protéines de formule (I) et de protéines de l'invention, (b) d'une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c) d'un vaccin comprenant (cl) une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c2) une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou la prévention des exacerbations aiguës de la bronchopneumopathie chronique obstructive (EABPCO).

La présente invention propose l'utilisation (a) de protéines de formule (I) et de protéines de l'invention, (b) d'une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c) d'un vaccin comprenant (cl) une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention ou (c2) une composition immunogène comprenant une protéine de formule (I) ou une protéine de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou la prévention de la pneumonie.

Les exemples qui suivent sont uniquement prévus en tant qu' illustration et ils ne sont pas censés limiter l'étendue de l'invention d'une manière quelconque.

Dans les exemples, les termes suivants ont la signification désignée : 6xhis = six histidines ; xg = force centrifuge (nombre de gravités) ; AS = alanine sérine ; BSA = sérumalbumine bovine ; °C = degrés Celsius ;

CaCl2 = chlorure de calcium ; CD = dichroïsme circulaire ; CHCl3 = chloroforme ; CH3CN = acétonitrile ; CO2 = dioxyde de carbone ;

Da = dalton ; ADN = acide désoxyribonucléique ; OD = oxygène dissous ; DSC = calorimétrie différentielle à balayage ; EDTA = acide éthylène-diamine-tétra-acétique ; h = heure ; H2O = eau ; H2O2 = peroxyde d’hydrogène ; HCDI = induction à densité cellulaire élevée ; HCl = chlorure d’hydrogène ;

His = his = histidine ; IMAC = chromatographie d’affinité avec métaux immobilisés ; IPTG = isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranoside ; kVolts = kilovolts ; L = litre ; LB = Luria-Bertani ; LCDI = induction à densité cellulaire basse ; MeOH = méthanol ; ml = millilitre ;

NaCl = chlorure de sodium ; tr/min = tours par minute ; min = minute ; mM = millimolaire ; μg = microgramme ; μl = microlitre ; PM = poids moléculaire ; m/z = masse/charge ;

NaCl = chlorure de sodium ;

NaPO4 = phosphate de sodium ; ng = nanogramme ; NH4OH = hydroxyde d'ammonium ; nm = nanomètre ; D.O. = densité optique ; PBS = solution tampon phosphate ; PCR = réaction en chaîne de la polymérase ; psi = livres par pouce carré ; PVDF = difluorure de polyvinylidène ; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium ; TFA = acide trifluoroacétique ;

Tm = point de fusion ;

Tmi = premier point de fusion ;

Tnp = second point de fusion ; p/v = poids/volume.

Exemples

Exemple 1 - Constructions de protéines

Des constructions de protéines ont été produites avec différents fragments de UspA2 avec et sans acides aminés supplémentaires. Le tableau suivant décrit les constructions de protéines réalisées.

Tableau 2

Constructions de protéines contenant la protéine UspA2

A.A. = acide aminé

Les séquences d'ADN et d'acides aminés pour chaque construction de protéine énumérée dans le tableau 2 sont présentées ci-dessous : SEQUENCES DES CONSTRUCTIONS DE PROTEINES MC-001 (ADN) - SEQ ID NO : 52

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCC AGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATGAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT G CAC T G G CAGAACAG G G T GAAGCAAT TAAAGAAGAT C T GCAGGG T C T GGCAGAT T

TTGTTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG C AC AT AAC GAAG C AC AGAAT GAAAC C C T GAAAG G T C T GAT T AC C AAC AG C AT C GAAAAT AC C AATAACAT TACCAAAAACAAAGCAGATAT T CAGGCGC T GGAAAATAAT GT T GT GGAAGAAC T G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT C AGAAAG C C GATAT C GAT AAT AAC AT T AAC AAC A T T TAT G AAC T GGCACAGCAGCAGGAT C AG C AT AG C AG C GAT AT CAAAACCCT GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAATCAGGCAAATATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGA AAC AG AC C GAAG C AAT T GAT G C C C T GAAT AAAG C GAG C AG C GAAAAC AC C C AGAAT AT C GAA GATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGA C GCAC T GAACAAGGCAAGCT C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T GAAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT C AG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT G AAC T GGC CCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC TGGCAAAAGCAA GCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACA C T GAC GAAAAAC CAGAACAC C C T GAT T GAAAAAGAT AAAGAACAT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC ACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGCAAGCCATCATCA T C AC C AC C AC T AA MC-001 (protéine) - (M) (acides aminés 30 à 540 de UspA2) (ASHHHHHH) SEQ ID NO : 53

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDSRVTALDTKASHHHHHH MC-002 (ADN) - SEQ ID NO : 54

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAAC GAAC T G GAAG C C GATAT T G G T GATAT TAC C G CAC T G GAAAAATAT C T G G CAC T GAGC C AGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA TCAGAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATT T T GT T GAAG G T CAG GAAG G CAAAATT C T GCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CACATAAC GAAG CACAGAAT GAAAC CCT GAAAGG T C T GAT TAC CAACAGCAT C GAAAATAC C AATAACATTACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGT TGTGGAAGAACT G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT CAGAAAGC C GATAT C GAT AAT AACAT T AACAACA TTTATGAACTGGCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAATCAGGCAAATATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGA AAC AG AC C GAAG C AAT T GAT G C C C T GAAT AAAG C GAG C AG C GAAAAC AC C C AGAAT AT C GAA GATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGA CGCAC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T G AAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT C AG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT GAAC T GGC CCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC T GGCAAAAGCAA GCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACA C T GAC GAAAAAC CAGAACAC CCT GAT T GAAAAAGAT AAAGAACAT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC AC CAAAG T T GAT G G T T T T GATAG C C G T G T GAC C G CAC T G GATAC CAAATAA MC-002 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 540 de UspA2) SEQ ID NO : 55

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNE SIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNE TLKGLITNSIENT

NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN

VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE

DLAAYNELQD

AYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKN QADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIE KDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRV TALDTK SEQ ID NO : 56

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAAC GAAC T G GAAG C C GATAT T G G T GATAT TAC C G CAC T GGAAAAATAT C T GGCAC T GAGC C AGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA TCAGAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATT T T G T T GAAG G T C AG GAAG G C AAAAT T C T G C AGAAC GAAAC C AG CAT C AAAAAAAAC AC C C AG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CAC AT AAC GAAG CAC AGAAT GAAAC CCT GAAAG G T C T GAT TAC C AAC AG CAT C GAAAAT AC C AAT AACAT TACCAAAAACAAAGCAGATAT T CAGGCGC T GGAAAATAAT GT T GT GGAAGAAC T G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT C AGAAAG C C GATAT C GAT AAT AAC AT T AAC AAC A T T TAT GAAC T GGCACAGCAGCAGGAT CAGCATAGCAGCGATAT CAAAACCC T GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAGGCAAATAT T CAGGAT C T GGC CAC CT AT AAT GAAC T GCAGGAT CAGTAT GCACAGA AACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAA GAT C T GGCAGCATACAACGAAC T GCAGGAT GCC TAT GCAAAACAGCAGAC T GAAGCCAT CGA CGCAC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T GAAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT C AG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT GAAC T GGCCCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC T GGCAAAAGCAA GCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACA C T GAC GAAAAAC C AGAAC AC CCT GAT T GAAAAAGAT AAAGAAC AT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC

ACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGA TGGTCGTAT TAC C G C T C T G GATAG TAAAG T T GAAAAT G GAAT G G CAG CACAAG CAG CACAC T AA SEQ ID NO : 57

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAI DANKASADTKFAATADAI TKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAH MC-003 (ADN) - SEQ ID NO : 87

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCC AG TAT GGAAATATT C T GGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT GCAC T GGCAGAACAGGGT GAAGCAAT TAAAGAAGAT C TGCAGGGTC TGGCAGAT T TTGTTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG C AC AT AAC GAAG C AC AGAAT GAAAC C C T GAAAG G T C T GAT T AC C AAC AG C AT C GAAAAT AC C AATAACAT TACCAAAAACAAAGCAGATAT T CAGGCGC T GGAAAATAAT GT T GT GGAAGAAC T G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT C AGAAAG C C GATAT C GAT AAT AAC AT T AAC AAC A T T TAT GAAC T GGCACAGCAGCAGGAT C AG C AT AG C AG C GAT AT CAAAACCCT GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAGGCAAATAT T CAGGAT C T GGCCACC TAT AAT GAAC TGCAGGAT CAGTAT GCACAGA AACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAA GAT C TGGCAGCATACAACGAAC T GCAGGAT GCC TAT GCAAAACAGCAGAC T GAAGCCAT CGA CGCAC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G

AAT TACAG GAT GCGTATGC CAAACAG CAGAC C GAAG C GAT T GAT G C G C T GAACAAAG C C T C T T C T GAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATAT CAATAATAT CTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAA G C G CAG CAAATAC C GAT CGTATTGC GAAAAACAAAG C C GAT G CAGAT G CAAG C T T T GAAACA C T GAC GAAAAAC C AGAAC AC C C T GAT T GAAAAAGATAAAGAACAT GAT AAAC T GAT C AC CGC CAATAAAAC C G CAAT T GAT G CAAATAAAG C CAG C G CAGATAC CAAAT T T G CAG CAAC C G CAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC AC CAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCAC T GGATACCAAACACTAA MC-003 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 540 de UspA2) (H) - SEQ ID NO : 88

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDSRVTALDTKH MC-004 (ADN) - SEQ ID NO : 58

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCC AG T AT GGAAAT AT T C T GGCCC T GGAAGAAC T GAATAAAGC T C T GGAAGAGC T GGAT GAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT GCAC T GGCAGAACAGGGT GAAGCAAT TAAAGAAGAT C T GCAGGGT C T GGCAGAT T TTGTTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CAC AT AAC GAAG CAC AGAAT GAAAC CCT GAAAG G T C T GAT TAC C AAC AG CAT C GAAAAT AC C AAT AACAT TAC C AAAAAC AAAG C AGAT AT T CAGGCGC T GGAAAATAAT GT T GT GGAAGAAC T G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT CAGAAAGC C GATAT C GAT AAT AACAT T AACAACA

TTTATGAACTGGCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAG G CAAATAT T CAG GAT C T G G C CAC C TATAAT GAAC T G CAG GAT CAG TAT G CACAGA AACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAA GATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGA C G CAC T GAACAAG G CAAG C T C T GAAAACAC G CAGAACAT T GAAGAT CTGGCTGCC TATAAT G AAT TACAG GAT GCGTATGC CAAACAG CAGAC C GAAG C GAT T GAT G C G C T GAACAAAG C C T C T T C T GAAAATACACAGAATAT CGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATAT CAATAATAT CTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAA G C G CAG CAAATAC C GAT CGTATTGC GAAAAACAAAG C C GAT G CAGAT G CAAG C T T T GAAACA C T GAC GAAAAAC CAGAACAC C C T GAT T GAAAAAGATAAAGAACATGATAAACT GAT CACCGC CAATAAAAC C G CAAT T GAT G CAAATAAAG C CAG C G CAGATAC CAAAT T T G CAG CAAC C G CAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC AC CAAAG TTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCAC T GGATACCAAACATCAT TAA MC-004 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 540 de UspA2) (HH) SEQ ID NO : 59

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDSRVTALDTKHH MC-005 (ADN) - SEQ ID NO : 60

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCC AG TAT GGAAATAT T C T GGCCC T GGAAGAAC T GAATAAAGC T C T GGAAGAGC T GGAT GAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT GCAC T GGCAGAACAGGGT GAAGCAAT TAAAGAAGAT C T GCAGGGT C T GGCAGAT T

TTGTTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CACATAAC GAAGCACAGAAT GAAAC CCT GAAAGG T C T GAT TAC CAACAGCAT C GAAAATACC AATAACAT TAC CAAAAACAAAG CAGATAT T CAG G C G C T G GAAAATAAT G T T G T GGAAGAAC T GTTTAATCTGAGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATAT CGATAATAACAT TAACAACA T T TAT GAAC T G G CACAG CAG CAG GAT CAG CATAG CAG C GATAT CAAAAC CCT GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAG G CAAATAT T CAG GAT C T G G C CAC C TATAAT GAAC T G CAG GAT CAG TAT GCACAGA AACAGAC C GAAG CAAT T GAT G C C C T GAATAAAG C GAG CAG C GAAAACAC C CAGAATAT C GAA GAT C T G G CAG CATACAAC GAAC T G CAG GAT G C C TAT G CAAAACAG CAGAC T GAAGC CAT C GA C G CAC T GAACAAG G CAAG C T C T GAAAACAC G CAGAACAT T GAAGAT CTGGCTGCC TATAAT G AAT TACAG GAT GCGTATGC CAAACAG CAGAC C GAAG C GAT T GAT GC GC T GAACAAAGC C T C T T C T GAAAATACACAGAATAT CGC CAAAAATCAGGCCGATAT TGCCAACAATATCAATAATAT C TAT GAAC TGGCCCAGCAGCAG GAT CAGCACTCTTCT GATAT CAAAACAC T G G CAAAAG CAA G C G CAG CAAATAC C GAT CGTATTGC GAAAAACAAAGC C GAT GCAGAT GCAAGC T T T GAAACA C T GAC GAAAAAC C AGAAC AC C C T GAT T GAAAAAGAT AAAGAACAT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAAT AAAAC C G CAAT T GAT GCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAAT T TGCAGCAACCGCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCGCAAGCCATCATCAT CACCACCACTAA MC-005 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 519 de UspA2) (ASHHHHHH) SEQ ID NO : 61

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSASHHH HHH MC-006 (ADN) - SEQ ID NO : 62

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAAC GAAC T G GAAG C C GATAT T G G T GATAT TAC C G CAC T G GAAAAATAT C T G G CAC T GAG C C AGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT G CAC T G G CAGAACAG G G T GAAG CAAT TAAAGAAGAT C T G CAG G G T C T G G CAGAT T T T G T T GAAG G T CAG GAAG G CAAAAT T C T G CAGAAC GAAAC CAG CAT CAAAAAAAACAC C CAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CACATAAC GAAG CACAGAAT GAAAC CCT GAAAGG T C T GAT TAC CAACAGCATCGAAAATACC AATAACAT TAC CAAAAACAAAG CAGATAT T CAG G C G C T G GAAAATAAT G T T G T GGAAGAAC T G T T TAAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT CAGAAAG C C GATAT C GATAATAACAT TAACAACA T T TAT GAAC T G G CACAG CAG CAG GAT CAG CATAGCAGC GATAT CAAAAC CCT GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAATCAGGCAAATATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGA AAC AG AC C GAAG C AAT T GAT G C C C T GAAT AAAG C GAG C AG C GAAAAC AC C C AGAAT AT C GAA GATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGA CG CAC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T GAAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT C AG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT GAAC T GGCCCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC T GGCAAAAGCAA GCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACA C T GAC GAAAAAC C AGAAC AC CCT GAT T GAAAAAGAT AAAGAAC AT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAG AT GCAAT TACCAAAAAT GGCAAT GCCAT CACCAAAAAT GCCAAAAGC TAA MC-006 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 519 de UspA2) SEQ ID NO : 63

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE

DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKS MC-007 (ADN) - SEQ ID NO : 64

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAAC GAAC T G GAAG C C GATAT T G G T GATAT TAC C G CAC T G GAAAAATAT C T G G CAC T GAG C C AGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT G CAC T G G CAGAACAG G G T GAAG CAAT TAAAGAAGAT CTGCAGGGTCTGG CAGAT T T T G T T GAAG G T CAG GAAG G CAAAAT T C T G CAGAAC GAAAC CAG CAT CAAAAAAAACAC C CAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CACATAAC GAAG CACAGAAT GAAAC CCT GAAAGG T C T GAT TAC CAACAGCAT C GAAAATAC C AATAACAT TAC CAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGT TGTGGAAGAACT G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT CAGAAAGC C GATAT C GAT AAT AACAT T AACAACA T T TAT GAAC T GGCACAGCAGCAGGAT CAGCATAGCAGCGATAT CAAAACCC T GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAGGCAAATAT T CAGGAT C T GGCCACC TAT AAT GAAC T GCAGGAT CAG TAT GCACAGA AACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAA GAT C T GGCAGCATACAACGAAC T GCAGGAT GCC TAT GCAAAACAGCAGAC T GAAGCCAT CGA CGCAC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T GAAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT CAG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT GAAC T GGCCCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC T GGCAAAAGCAA GCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACA C T GAC GAAAAAC C AGAAC AC CCT GAT T GAAAAAGAT AAAGAAC AT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC ACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGA TGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCAGCAA G C CAT CAT CAT CAC CAC CAC T AA MC-007 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 564 de UspA2) (ASHHHHHH) SEQ ID NO : 65

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAASHHHHHH MC-008 (ADN) - SEQ ID NO : 66

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAAC GAAC T G GAAG C C GATAT T G G T GATAT TAC C G CAC T G GAAAAATAT C T GGCAC T GAGC C AGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGAT GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA TCAGAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATT TTGTTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG C AC AT AAC GAAG CAC AGAAT GAAAC CCT GAAAG G T C T GAT TAC C AAC AG CAT C GAAAAT AC C AATAACAT TACCAAAAACAAAGCAGATAT T CAGGCGC T GGAAAATAAT GT T GT GGAAGAAC T G T T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT C AGAAAG C C GATAT C GAT AAT AAC AT T AAC AAC A T T TAT GAAC T GGCACAGCAGCAGGAT C AG C AT AG C AG C GAT AT CAAAACCC T GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAGGCAAATAT T CAGGAT C T GGC CAC CT AT AAT GAAC T GCAGGAT CAGTAT GCACAGA AACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAA GAT C T GGCAGCATACAACGAAC T GCAGGAT GCC TAT GCAAAACAGCAGAC T GAAGCCAT CGA CGCAC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TAT AAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T GAAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT C AG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT GAAC T GGCCCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC T GGCAAAAGCAA

G C G CAG CAAATAC C GAT CGTATTGC GAAAAACAAAG C C GAT G CAGAT G CAAG C T T T GAAACA C T GAC GAAAAAC CAGAACACCC T GAT T GAAAAAGATAAAGAACATGATAAACT GATCACCGC CAATAAAAC C G CAAT T GAT G CAAATAAAG C CAG C G CAGATAC CAAAT T T G CAG CAAC C GCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC ACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGA TGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCACACC AC T AA MC-008 (Protéine) - (M) (30 à 564 de UspA2) (HH) SEQ ID NO : 67

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH MC-009 (ADN) - SEQ ID NO : 68

AT G G C GAAAAAT GATAT TAC C C T G GAAGAT CTGCCGTATCT GAT C AAAAAAAT C GAT C AGAA CGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAGT AT GGAAATAT T C T GGCCC T GGAAGAAC T GAATAAAGC T C T GGAAGAGC T GGAT GAAGAT GT G G G T T G GAAT C AGAAT GATAT CGC C AAT C T G GAAGAT GAT G T T GAAAC CCT GAC C AAAAAT CA GAAT GCAC T GGCAGAACAGGGT GAAGCAAT TAAAGAAGAT C T GCAGGGT C T GGCAGAT T T T G TTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGT AAT C T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCAT T GCCAAAAACAACGAAAG CATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCAC AT AAC GAAG CAC AGAAT GAAAC CCT GAAAG G T C T GAT TAC CAAC AG CAT C GAAAAT AC C AAT AACATTACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTT T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT C AGAAAG C C GATAT C GAT AAT AAC AT T AAC AAC AT T T

ATGAACTGGCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTT GAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAA T CAGGCAAATAT T CAGGAT C T GGCCACC TATAAT GAAC TGCAGGAT CAGTAT GCACAGAAAC AGACCGAAGCAATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGAT CTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGC AC T GAACAAGGCAAGC T C T GAAAACACGCAGAACAT T GAAGAT C T GGC T GCC TATAAT GAAT TACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCT G AAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT C AG GCC GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C T A T GAAC T GGC C CAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC TGGCAAAAGCAAGCG CAGCAAAT AC C GAT C G TAT T GCGAAAAACAAAGCCGAT GCAGAT GCAAGC T T T GAAACAC T G AC GAAAAACCAGAACACCC T GAT TGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAA TAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATG CAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACC AAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGATGG T C G TAT TAC C GC T C T GGATAGTAAAGT T GAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCACACCACT AA MC-009 (Protéine) - (M) (31 à 564 de UspA2) (HH) SEQ ID NO : 69

MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQR NLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNV EEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIED LAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS S ENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETL TKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDG FD S RVTAL D T KVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH MC-010 (ADN) - SEQ ID NO : 70

ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCC AG TAT GGAAATAT T C T GGCCC T GGAAGAAC T GAATAAAGC T C T GGAAGAGC T GGAT GAAGAT

GTGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAA T CAGAAT G CAC T G G CAGAACAG G G T GAAG CAAT TAAAGAAGAT C T G CAG G G T C T G GCAGAT T T T G T T GAAG G T CAG GAAG G CAAAAT T C T G CAGAAC GAAAC CAG CAT CAAAAAAAACAC C CAG CGTAATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGA AAGCATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATG CACATAAC GAAG CACAGAAT GAAAC CCT GAAAGG T C T GAT TAC CAACAGCATCGAAAATACC AATAACAT TAC CAAAAACAAAG CAGATAT T CAG G C G C T G GAAAATAAT G T T G T GGAAGAAC T GTTTAATCTGAGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACAT TAACAACA T T TAT GAAC T G G CACAG CAG CAG GAT CAG CATAG CAGC GATAT CAAAAC CCT GAAAAAAAAC GTTGAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCA GAAT CAG G C AAAT AT T CAG GAT C T G G C CAC C T AT AAT GAAC T GCAGGAT CAG T AT GCACAGA AAC AG AC C GAAG C AAT T G AT G C C C T G AAT AAAG C GAG CAG C GAAAAC AC C C AGAAT AT C GAA GATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGA C G CAC T GAACAAG G CAAG C T C T GAAAACAC G CAGAACAT T GAAGAT CTGGCTGCC TATAAT G AATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCT T C T G AAAAT AC AC AGAAT AT CGC C AAAAAT CAG G C C GATAT T G C C AAC AAT AT C AAT AAT AT C TAT GAAC T GGCCCAGCAGCAGGAT CAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACAC T GGCAAAAGCAA GCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACA C T GAC GAAAAAC C AGAAC AC CCT GAT T GAAAAAGAT AAAGAAC AT GAT AAAC T GAT CAC CGC CAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAG ATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGC ACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGA TGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCATAA MC-010 (Protéine) - (M) (acides aminés 30 à 564 de UspA2) SEQ ID NO : 71

MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDED VGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENT NNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKN VEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFET

LTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG T KVDG FD S RVTAL D T KVNAFDGRITALDS KVENGMAAQAA MC-011 (ADN) - SEQ ID NO : 72

ATGGCGAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAGAA C GAAC T G GAAG C C GATAT T G G T GATAT TAC C G CAC T G GAAAAATAT C T GGCAC T GAGC CAG T ATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTG TTGAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGT AATCTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGAAAG CATTGAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCAC AT AAC GAAG CAC AGAAT GAAAC CCT GAAAG G T C T GAT TAC C AAC AG CAT C GAAAAT AC C AAT AACAT TAC CAAAAACAAAGCAGATAT T CAGGCGC T GGAAAATAAT GT T GT GGAAGAAC T GT T T AAT C T GAG CGGTCGTCT GAT T GAT CAGAAAGC C GATAT C GAT AAT AACAT T AACAACAT T T ATGAACTGGCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTT GAAGAAGGTCTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAA TCAGGCAAATATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAAC AG AC C GAAG C AAT T GAT G C C C T GAAT AAAG C GAG CAG C GAAAAC AC C C AGAAT AT C GAAGAT CTGGCAGCATACAACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGC AC T G AAC AAG G C AAG C T C T GAAAAC AC G C AGAAC AT T GAAGAT CTGGCTGCC T AT AAT GAAT TACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCT GAAAATACACAGAATAT CGC CAAAAATCAGGCCGATAT TGCCAACAATATCAATAATATCTA T GAAC T G G C C CAG CAG CAG GATCAGCAC T C T T C T GATAT CAAAACACTGGCAAAAGCAAGCG CAG CAAATAC C GAT CGTATTGC GAAAAACAAAG C C GAT G CAGAT G CAAG C T T T GAAACAC T G AC GAAAAAC CAGAACAC C C T GAT T GAAAAAGATAAAGAACAT GATAAACT GAT CACCGCCAA TAAAAC C G CAAT T GAT G CAAATAAAG C CAG C G CAGATAC CAAAT T T G CAG CAAC C G CAGAT G CAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACC AAAG T T GAT G G T T T T GATAG C C G T G T GAC C G CAC T G GATAC CAAAG CAAG C CAT CAT CAT CA CCACCACTAA MC-011 (Protéine) - (M) (acides aminés 31 à 540 de UspA2) (ASHHHHHH) SEQ ID NO : 73

MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQR NLVNGFEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNV EEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIED LAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASS ENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETL TKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDGFDSRVTALDTKASHHHHHH

Construction et transformation de vecteurs Séquence d'ADN pour UspA2 issue de la souche ATCC 25238 - SEQ ID NO : 74

ATGAAAACCATGAAACTTCTCCCTCTAAAAATCGCTGTAACCAGTGCCATGATTATTGGCTT GGGTGCGGCATCTACTGCGAATGCGCAGGCTAAAAATGATATAACTTTAGAGGATTTACCAT AT T T AAT AAAAAAGAT T GAC CAAAAT GAAT T GGAAGCAGATAT CGGAGATAT TAC T GC T C T T GAAAAGTAT C TAGCAC T TAGCCAGTAT GGCAATAT T T TAGCTCTAGAAGAGCTCAACAAGGC T C TAGAAGAG C T C GAC GAG GATGTTGGATGGAAT CAGAAT GATAT TGCAAACT TGGAAGATG ATGTTGAAACGCTCACCAAAAATCAAAATGCTTTGGCTGAACAAGGTGAGGCAATTAAAGAA GAT C T T CAAG G G C T T G CAGAT T T T G TAGAAG G G CAAGAG G G TAAAAT T C TACAAAAT GAAAC T T CAAT TAAAAAAAATACT CAGAGAAACC T T GT CAAT GGGT T T GAGAT T GAGAAAAATAAAG ATGCTATTGCTAAAAACAATGAGTCTATCGAAGATCTTTATGATTTTGGTCATGAGGTTGCA GAAAG TATAG G C GAGATACAT G C T CATAAT GAAG C G CAAAAT GAAAC T C T TAAAG G C T T GAT AACAAACAGTAT T GAGAATAC TAATAATAT TACCAAAAACAAAGC T GACAT CCAAGCAC T T G AAAACAAT G T C G TAGAAGAAC TAT T CAAT C TAAG CGGTCGCCTAATTGATC AAAAAGCAGAT AT T GATAATAACATCAACAATATC TAT GAGC T GGCACAACAGCAAGATCAGCATAGC T C T GA TATCAAAACACTTAAAAAAAATGTCGAAGAAGGTTTGTTGGAGCTAAGCGGTCACCTAATTG AT CAAAAAACAGATAT T GC T CAAAACCAAGC TAACATCCAAGATC T GGCCAC T TACAACGAG C T AC AAGAC C AG T AT G C T C AAAAG C AAAC C GAAG C GAT T GAC G C T C T AAAT AAAG C AAG C T C T GAGAATACACAAAACAT C GAAGAT CTGGCCGCT TACAAC GAG C TACAAGAT GCCTATGC CA AAC AG C AAAC C GAAG C AAT T GACGCT C T AAAT AAAG C AAG C T C T GAGAAT ACACAAAACAT C GAAGAT CTGGCCGCT TACAAC GAG C TACAAGAT GCCTATGC CAAACAG CAAAC C GAAG C CAT

T GACGCTC TAAATAAAGCAAGC TC T GAGAATACACAAAACATT GC TAAAAACCAAGCGGATA T T GC TAATAACATCAACAATATC TAT GAGC T GGCACAACAGCAAGATCAGCATAGC T C T GAT ATCAAAACCTTGGCAAAAGCAAGTGCTGCCAATACTGATCGTATTGCTAAAAACAAAGCCGA T GC T GAT GCAAG T T T T GAAAC GC T CAC CAAAAATCAAAATAC T T T GAT T GAAAAAGATAAAG AG CAT GACAAAT TAAT TAC T G CAAACAAAAC T G C GAT T GAT G C CAATAAAG CAT C T G C G GAT AC CAAG T T T G CAG C GACAG CAGAC G C CAT TAC CAAAAAT G GAAAT G C TAT CAC TAAAAAC G C AAAATCTATCACTGATTTGGGCACTAAAGTGGATGGTTTTGACAGTCGTGTAACTGCATTAG ACAC CAAAG T CAAT G C C T T T GAT GGTCGTAT CACAG C T T TAGACAG TAAAG T T GAAAAC GG T ATGGCTGCCCAAGCTGCCCTAAGTGGTCTATTCCAGCCTTATAGCGTTGGTAAGTTTAATGC GACCGCTGCACTTGGTGGCTATGGCTCAAAATCTGCGGTTGCTATCGGTGCTGGCTATCGTG TGAATCCAAATCTGGCGTTTAAAGCTGGTGCGGCGATTAATACCAGTGGTAATAAAAAAGGC TCTTATAACATCGGTGTGAATTACGAGTTCTAA Séquence de protéine pour UspA2 issue de la souche ATCC 25238 -SEQ ID NO : 1 telle que décrite ci-dessus.

Construction de vecteurs

Pour générer la construction MC-001, le fragment d'ADN codant pour un fragment du gène de UspA2 (acides aminés 30 à 540 de la souche ATCC 25238) comprenant les sites de restriction Ndel / XhoI pour faciliter le clonage (la méthionine de départ est codée par le site Ndel) et la séquence d'ADN correspondant au lieur d'acides aminés AS (alanine sérine) et aux acides aminés 6xhis ont été optimisés pour les codons (non native) et synthétisés par GENEART (une marque déposée aux Etats-Unis). Optimisée pour les codons signifie que la séquence nucléotidique a été modifiée à partir de la séquence native sans changer la séquence d'acides aminés afin de mieux s'adapter à l'usage des codons dans Escherichia coli pour une expression optimale. Le fragment de UspA2 a été cloné selon des procédés classiques dans le vecteur d'expression pET-26b en utilisant les sites de restriction Ndel / XhoI.

Pour générer les constructions MC-002, MC-003, et MC-004, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène UspA2 (acides aminés 30 à 540 de la souche ATCC 25238) en utilisant la construction MC-001 comme matrice, l'amorce UspA2Nde opt (qui contient le codon de départ, la méthionine), et l'amorce UspA2opt delta His, A2opt lHis delta AS, et A2opt 2His delta AS, respectivement. Le fragment de UspA2 a été cloné selon des procédés classiques dans le vecteur d'expression pET-26b en utilisant les sites de restriction NdeI / Xhol.

Pour générer la construction MC-005, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène UspA2 (acides aminés 30 à 519 de la souche ATCC 25238) en utilisant le vecteur MC-001 comme matrice avec les amorces UspA2Nde opt (qui contient le codon de départ, la méthionine) et R delta hairpin A2opt His. La séquence d'ADN correspondant au site de restriction Ndel a été incorporée dans l'amorce 5' et au site de restriction XhoJ a été incorporée dans l'amorce 3'. En outre, la séquence d'ADN correspondant au lieur d'acides aminés AS et aux acides aminés 6xhis a été incorporée dans l'amorce 3'. Le produit de PCR généré a été ensuite inséré dans le vecteur de clonage pET-26b(+) (NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis)).

Pour générer la construction MC-006, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène UspA2 (acides aminés 30 à 519 de la souche ATCC 25238) en utilisant la construction MC-005 comme matrice avec les amorces UspA2Nde opt (qui contient le codon de départ, la méthionine) et delta His delta hélice. La séquence d'ADN correspondant au site de restriction Ndel a été incorporée dans l'amorce 5' et au site de restriction XhoJ a été incorporée dans l'amorce 3'. Le produit de PCR généré a été ensuite inséré dans le vecteur de clonage pET-26b(+) (NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis) ) .

Pour générer la construction MC-007, le fragment d'ADN codant pour un fragment du gène de UspA2 (acides aminés 30 à 564 de la souche ATCC 25238) comprenant les sites de restriction NdeI / Xhol pour faciliter le clonage (la méthionine de départ est codée par le site NdeI) et la séquence d'ADN correspondant au lieur d'acides aminés AS et aux acides aminés 6xhis ont été optimisés pour les codons et synthétisés par GENEART (une marque déposée aux Etats-Unis) (plasmide : 1026399) . Le fragment de UspA2 a été cloné selon des procédés classiques dans le vecteur d'expression pET-26b en utilisant les sites de restriction NdeI / Xhol.

Pour générer la construction MC-008, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène de UspA2 (acides aminés 30 à 564 de la souche ATCC 25238) en utilisant la construction MC-007 comme matrice avec les amorces UspA2Nde opt (qui contient le codon de départ, la méthionine) et 2His hélice deltaAS. La séquence d'ADN correspondant au site de restriction Ndel a été incorporée dans l'amorce 5' et au site de restriction Xhol a été incorporée dans l'amorce 3' . Le produit de PCR généré a été ensuite inséré dans le vecteur de clonage pET-26b(+) (NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis)).

Pour générer la construction MC-009, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène de UspA2 (acides aminés 31 à 564 de la souche ATCC 25238) en utilisant le plasmide 1026399 comme matrice et les amorces N-term cyto Abis (qui contient le codon de départ, la méthionine) et 2His hélice deltaAS. La séquence d'ADN correspondant au site de restriction NdeI a été incorporée dans l'amorce 5' comprenant la délétion de glutamine et au site de restriction Xhol a été incorporée dans l'amorce 3' comprenant deux résidus histidine.

Le produit de PCR généré a été ensuite inséré dans le vecteur de clonage pET-26b(+) (NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis)). Le séquençage de 1'ADN de la construction finale a été réalisé pour confirmer la séquence correcte.

Pour générer la construction MC-010, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène de UspA2 (acides aminés 30 à 564 de la souche ATCC 25238) en utilisant la construction MC-007 comme matrice avec les amorces UspA2 Nde opt (qui contient le codon, départ de la méthionine) et cyto hélice dHis dAS. La séquence d'ADN correspondant au site de restriction Ndel a été incorporée dans l'amorce 5' et au site de restriction Xhol a été incorporée dans l'amorce 3'. Le produit de PCR généré a été ensuite inséré dans le vecteur de clonage pET-26b(+) (NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis)).

Pour générer la construction MC-011, une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée pour amplifier le fragment du gène de UspA2 (acides aminés 31 à 540 de la souche ATCC 25238) en utilisant la construction MC-001 comme matrice avec les amorces N-term cyto Abis (qui contient le codon de départ, la méthionine) et N-term reverse. La séquence d'ADN correspondant au site de restriction Ndel a été incorporée dans l'amorce 5' et au site de restriction Xhol a été incorporée dans l'amorce 3'. Le produit de PCR généré a été ensuite inséré dans le vecteur de clonage pET-26b(+) (NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis) ) .

Une liste détaillée des séquences des amorces de PCR utilisées pour les amplifications est illustrée dans le tableau 3. La réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée en utilisant le kit Expand High Fidelity PCR System (Roche) selon les recommandations du fabricant. La ligature a été réalisée en utilisant le kit Rapid DNA Ligation (Roche) selon les recommandations du fabricant.

Tableau 3 Séquences des amorces de PCR utilisées pour les amplifications de UspA2

Transformation

Des cellules d'Escherichia coli (E. coli) BLR (DE3), BLR modifiées (DE3) ou B834 (DE3) ont été transformées avec de l'ADN plasmidique selon des procédés classiques avec des cellules traitées au CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » Dans Glover, D. M. (Ed) , DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.). En bref, des cellules BLR (DE3) compétentes ont été décongelées doucement sur de la glace. Approximativement 4 μΐ of plasmide (10 à 100 ng) ont été mélangés en utilisant 50 à 100 μΐ de cellules compétentes. Ensuite, cette formulation a été incubée sur de la glace pendant 5 min. Pour effectuer la réaction de transformation, la formulation a été pulsée à la chaleur à 42 °C pendant 30 secondes puis incubée sur de la glace pendant 2 minutes. Approximativement 0,5 ml de milieu SOC (bouillon Super Optimal avec répression des Catabolites) a été ajouté aux cellules transformées et la culture cellulaire a été incubée à 37 °C pendant une heure avant le plaquage sur de la gélose Luria-Bertani (LB) avec 50 μg/ml de kanamycine. Environ 150 μΐ de la culture des cellules transformées ont été plaqués et incubés pendant une nuit à 37 °C. BLR (DE3) : BLR est un dérivé recA~ de BL21 (F- ompT hsdSB{rB- mB-) gal dem (DE3). Cette souche d'E. coli utilisée pour l'expression de protéines recombinantes améliore les rendements en monomères des plasmides et peut aider à stabiliser les plasmides cibles contenant des séquences répétitives ou dont les produits peuvent provoquer la perte du prophage DE3 (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). Le génotype détaillé d'E. coli BLR (DE3) a été publié par NOVAGEN (une marque déposée aux États-Unis) : (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dem A(srl-recA) 306::TnlO (TetR) (DE3) . B834 (DE3) est la souche parentale pour BL21. Ces hôtes sont auxotrophes pour la méthionine et permettent une activité hautement spécifique de marquage des protéines cibles avec la 35S-méthionine et la sélénométhionine pour la cristallographie. Le génotype détaillé d'E. coli B834 (DE3) a été publié par NOVAGEN (une marque déposée aux Etats-Unis) : F- ompT hsdSß{rB-mB-) gal dem met (DE3). BLR modifiée (DE3) : afin d'empêcher une (phospho)gluconoylation, le gène Pgl a été inséré dans le locus de la biotine localisé dans le génome de BLR (DE3) . En outre, pour empêcher les substitutions Ile-Val, la mutation C219Y dans le gène de la thréonine désaminase a été corrigée. Génotype : (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dem A(srl-recA)306::Tnl0 (TetR); Δ(bioA-bioD) ::Pgl; TD+ (C219Y) (DE3) .

Exemple 2 - Expression des protéines en utilisant un flacon sous agitation

Des souches d'Escherichia coli transformées avec un plasmide recombinant ont été utilisées pour inoculer 100 ml de bouillon LB (Becton, Dickinson and Company) ± 1 % (poids/volume, p/v) de glucose (Laboratoire MAT, numéro de catalogue : GR-0101) et 50 pg/ml de kanamycine (Sigma). Cette préculture a été généralement laissée se développer pendant une nuit à 37 °C.

Douze ml de préculture ont été utilisés pour inoculer 500 ml de bouillon LB + 50 pg/ml de kanamycine. Les cultures ont été incubées à 37 °C sous une agitation de 150 tr/min pour atteindre une D.O. 600nm de ~0,6. A une D.0.6oonm de ~0, 6, les cultures de BLR (DE3) ont été induites pour l'expression de la protéine recombinante par addition de 1 mM d'isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ; EMD Chemicals Inc., numéro de catalogue : 5815) et incubées pendant une nuit à 23 °C sous une agitation de 150 tr/min. Après la période d'induction, les cultures ont été centrifugées à 6370 g pendant 20 minutes et les culots issus de 350 ml de culture ont été congelés à -20 °C séparément.

Exemple 3 - Purification des protéines en utilisant du tampon phosphate (construction MC-001 et construction MC-011)

Chaque culot bactérien obtenu après induction dans un flacon sous agitation a été remis en suspension dans 30 ml de tampon phosphate de potassium 20 mM (pH 8,0) contenant 10 mM de NaCl et du cocktail d'inhibiteurs de protéases COMPLETE de Roche (une marque déposée aux Etats-Unis) (1 comprimé/50 ml de tampon). La lyse cellulaire est réalisée par des extractions à la presse de French 3X (20 000 psi) et une clarification est réalisée par centrifugation pendant 30 minutes à 23700 g. Le surnageant est récolté et filtré sur 0,22 pm.

Des protéines marquées par 6xHis ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur des métaux immobilisés (IMAC) en utilisant une colonne XK16 et 20 ml de résine NiNTA (Qiagen) équilibrée auparavant avec 20 mM de tampon phosphate de potassium (pH 8,0) contenant 10 mM de NaCl ou du tampon PBS pH 8,0 contenant 500 mM d'arginine. Les composants solubles ont été chargés à une vitesse allant jusqu'à 4 ml/min (produisant une « fraction non retenue ») . Après le chargement sur la colonne, la colonne a été lavée avec 60 ml de tampon phosphate de potassium 20 mM (pH 8,0) contenant 10 mM de NaCl à une vitesse de 4 ml/min produisant une « fraction de lavage no. 1 ». Un second lavage en utilisant le même tampon + 10 mM d'imidazole a été réalisé, produisant une « fraction de lavage no. 2 ». L'élution a été réalisée en utilisant le même tampon contenant 200 ou/et 500 mM d'imidazole.

Les échantillons issus des fractions d'élution ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Les échantillons contenant la protéine ont été dialysés avec 5 litres de tampon phosphate de potassium 20 mM (pH 8,0) contenant 10 mM de NaCl. La concentration de la protéine a été déterminée en utilisant la méthode de Lowry.

Exemple 4 - Purification des protéines en utilisant du tampon contenant de l'arginine (MC-001, MC-005 et MC-007)

Chaque culot bactérien obtenu après induction dans un flacon sous agitation (exemple 3) ou un fermenteur (exemple 5) a été remis en suspension dans 30 ml de tampon PBS + 500 mM d'arginine pH 8,0 et du cocktail d'inhibiteurs de protéases COMPLETE de Roche (une marque déposée aux Etats-Unis) (1 comprimé/50 ml de tampon). En variante, la pâte cellulaire de fermentation («7 g) a été remise en suspension dans 90 ml de tampon PBS contenant 500 mM d'arginine pH 8,0 et du cocktail d'inhibiteurs de protéases COMPLETE de Roche (une marque déposée aux Etats-Unis) (1 comprimé/50 ml de tampon).

La lyse cellulaire a été réalisée par des extractions par presse de French 2 ou 3 X (20 000 psi) et une clarification a été réalisée par centrifugation pendant 30 minutes à 23 700 g à 4 °C. Le surnageant a été récolté et filtré sur 0,22 pm. Les protéines marquées par 6xHis ont été purifiées par chromatographie d'affinité avec des métaux immobilisés (IMAC) en utilisant une colonne XK16 et 80 ml de résine NiNTA (Qiagen) équilibrée auparavant avec du tampon PBS + 500 mM d'arginine pH 8,0. Les composants solubles ont été chargés à une vitesse allant jusqu'à 4 ml/min (produisant une « fraction non retenue »). Après le chargement sur la colonne, la colonne a été lavée avec le même tampon, puis avec 20 mM de tampon phosphate de potassium (pH 8,0) contenant 10 mM de NaCl à une vitesse de 4 à 6 ml/min produisant une « fraction de lavage no. 1 ». Un second lavage en utilisant le même tampon + 10 mM d'imidazole a été réalisé, produisant une « fraction de lavage no. 2 ». L'élution a été réalisée en utilisant le même tampon + 200 mM d'imidazole ou 500 mM d'imidazole. Dans d'autres flacons d'élution, une concentration finale de 5 mM d'EDTA a été ajoutée.

Les échantillons issus des fractions d'élution ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Les échantillons contenant les protéines ont été dialysés avec 5 litres de tampon phosphate de potassium 20 mM (pH 8,0) contenant 10 mM de NaCl et 5 mM d'EDTA. La concentration de la protéine a été déterminée en utilisant la méthode de Lowry.

Ce protocole peut être utilisé avec d'autres protéines marquées par 6xHis.

Exemple 5 - Fermentation

La procédure de fermentation suivante peut être utilisée :

Les semences de travail sont des aliquotes congelées de souches dérivées d'Escherichia coli BLR(DE3) ou BLR(DE3) cultivées en flacon, transformées avec un dérivé de pET26b contenant une séquence codant pour une construction de protéine recombinante candidate pour un antigène spécifique.

Une semence de travail (WS) est prélevée du stockage congelé, décongelée et utilisée pour inoculer une fiole

Erlenmeyer contenant du milieu de pré-culture. La manipulation de la semence et la culture en fiole sont réalisées de façon aseptique sous une hôte à flux d'air laminaire (FAL) ou dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) . La fiole de la pré culture est incubée généralement à une température entre 30 °C et 37 °C sous une vitesse d'agitation de 200 tr/min pendant le temps nécessaire pour atteindre une densité optique à 650 nm (DO650nm) entre 1,0 et 3,0, généralement entre 4 et 6 h.

Un fermenteur de 20 1 est préparé par nettoyage en place suivi d'une séquence automatisée de stérilisation à la vapeur. Le milieu de départ est transféré de façon aseptique dans le fermenteur. Une bouteille remplie de NH4OH à 25 % est reliée de façon aseptique au fermenteur pour un contrôle automatique du pH. Le pH initial du milieu de départ est ajusté au pH cible par addition d'une solution de NH4OH. De l'antimousse irradié est ajouté en utilisant une seringue à travers un septum dans la plaque fixe. Une bouteille remplie de milieu d'alimentation est reliée de façon aseptique au fermenteur. L'alimentation est contrôlée par soit une cascade de pCh (contrôle de l'oxygène dissous) soit une courbe d'alimentation pré-programmée. L'agitation est contrôlée par soit une cascade de pCy soit une courbe d'agitation pré-programmée.

Les paramètres initiaux du fermenteur sont généralement les suivants :

• Température : 28 °C à 32 °C • Pression : 0,5 barg (7 psi) • Débit de l'air : 2 WM (volumes de remplissage par minute) • pH : régulé à 6,8 par addition de NH4OH à 25 %.

Une aliquote de cette pré-culture (généralement entre 5 ml et 50 ml) est utilisée pour inoculer le milieu de départ du fermenteur par addition à la seringue à travers un septum sur la plaque fixe du fermenteur. Les phases de la culture par fermentation sont : • Phase fermée : la biomasse s'accumule en utilisant la source de carbone dans le milieu de départ. • Phase alimentée : le milieu d'alimentation est introduit soit selon un contrôle en cascade de p02 soit une courbe d'alimentation pré-programmée. L'accumulation de la biomasse se poursuit sur la source de carbone dans le milieu d'alimentation. • Phase d'induction : l'expression de l'antigène protéine recombinante est induite par l'addition d'une solution d'IPTG à la culture dans le fermenteur. A la récolte, la culture est recueillie généralement dans des bouteilles de centrifugation de 1 1 et centrifugée pour séparer la fraction du culot solide (pâte cellulaire) de la fraction du surnageant liquide. Le surnageant est jeté, et le poids cellulaire humide (culot solide) est enregistré et les poches de pâte cellulaire sont stockées à -20 °C.

La procédure suivante peut être également utilisée : Pré-culture classique d'Escherichia coli

Chaque pré-culture classique a été préparée en utilisant une culture de semences congelée de souches d'Escherichia coli. Ces souches sont des souches BLR(DE3) transformées avec un dérivé de pET26b contenant une séquence codant pour la construction spécifique à évaluer.

La culture des semences a été décongelée à température ambiante et 400 μΐ ont été utilisés pour inoculer une fiole Erlenmeyer de 2 litres contenant 400 ml de milieu de préculture (adapté d'après Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2: 87-95 (1987)).

La fiole inoculée a été ensuite incubé à 37 °C (± 1 °C) et 200 tr/min. La pré-culture a été stoppée après 6 h d'incubation. A cette étape, la densité optique à 650 nm (DCpsonm) est environ de 2. La pré-culture a été utilisée pour inoculer le milieu dans un fermenteur dès que la culture a été stoppée.

Fermentation alimentée à l'échelle de 20 1

Procédé

Un fermenteur de 20 litres (Biolafitte) a été utilisé. Neuf litres de milieu de fermentation en mode batch ont été transférés de façon aseptique dans le fermenteur. Le pH du milieu a été réajusté à 6,8 avec l'addition de base. 1 ml d'antimousse irradié non dilué (SAG 471) a été également ajouté au fermenteur. La température (28 °C) , la pression de tête (0,5 bar), la vitesse d'aération (20 litres d'air dispersé par minute) et la vitesse d'agitation initiale (300 tr/min) ont été ensuite réglés avant l'inoculation. Le taux d'oxygène dissous dans ces conditions a été de 100 %. La pression de tête et la vitesse d'aération ont été maintenues à un taux constant durant la fermentation. L'inoculation a été obtenue par l'addition d'un équivalent de 10 ml DO650nm = 2 de pré-culture (préparée comme il a été décrit ci-dessus, dans l'exemple 2) en suivant la formule suivante : 20

Volume de préculture (ml) = —;—--------

Preculture finale D0650nm

Durant la fermentation en mode batch (0 à 15 h), la température a été maintenue à 28 °C. Le taux d'oxygène dissous a été fixé à 20 %. Le taux d'oxygène dissous (OD) a été régulé en augmentant l'agitation lorsque que 1 ' OD a chuté au-dessous de 20 %. L'épuisement en glucose a entraîné une augmentation de 1'OD et une diminution simultanée de l'agitation.

Lorsque le glucose est épuisé, la vitesse d'alimentation est démarrée en se basant sur un signal de pH qui augmente au-dessus de 7,0. A partir de ce point et par la suite, la vitesse d'alimentation a été contrôlée par la demande en oxygène, en augmentant le débit lorsque l'oxygène dissous a eu tendance à chuter en-dessous du point fixé à 20 %. A cette étape, la vitesse d'alimentation est maintenue à 900 tr/min.

Durant la phase alimentée (avant l'induction), le pH a été maintenu à 6, 8 par addition de base, la température a été régulée à 30 °C.

Deux stratégies ont été appliquées pour produire la protéine : « L'induction à densité cellulaire élevée » (HCDI) est appliquée lorsque la culture est induite avec 1 mM d'IPTG (isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside) à une densité optique de 80 ± 5, généralement atteinte après 40 h de culture. La température a été maintenue à 28 °C et la vitesse d'alimentation est encore contrôlée par la demande en oxygène avec une vitesse d'agitation constante à 900 tr/min.

Le procédé « d'induction à densité cellulaire basse » (LCDI) signifie une induction à une densité optique de 40 ± 5 généralement atteinte après 24 h de culture. La température a été diminuée à 30 °C et la vitesse d'alimentation constante de 0,5 ml/min est appliquée. Ensuite 1 mM d'IPTG est ajouté à la culture. A cette étape, le taux d'OD a été maintenu à 20 % en contrôlant la vitesse d'agitation. A la fin de la phase d'induction (72 h), la pâte cellulaire a été recueillie par centrifugation (6500 x g, 4 °C pendant 1 h), et stockée à -20 °C.

Les figures 1 et 2 illustrent un profil de fermentation type avec les procédés de HCDI et de LCDI et les paramètres contrôlés en fermenteur de 20 1 avec une alimentation semi-continue (« fed-batch »).

Le tableau 4 présente les constructions évaluées dans le fermenteur et le rendement en UspA2 obtenu pour chacune.

Tableau 4

His = histidine

La figure 3 illustre sous forme graphique le rendement en UspA2 du tableau 4 à partir des constructions évaluées dans le fermenteur.

Sur cette figure, le rendement en UspA2 est affecté par les résidus d'histidine présents dans la construction, (p < 0,05, unilatérale, trois taux, ANOVA type II) . Il a été observé une corrélation positive entre le nombre de résidus d'histidine et le rendement en UspA2 de la fermentation, avec une augmentation de rendement supérieure à 400 % entre 0 et 6 résidus dans les fermentations avec une alimentation semi-continue (« fed-batch »).

Il a été également observé qu'un résidu d'histidine ajouté au motif à demi-hélice (construction MC-003) a produit un rendement en UspA2 d'environ 1 g/1 de protéine.

Exemple 6 - Caractérisation des protéines

Ultracentrifugation analytique L'ultracentrifugation analytique est utilisée pour déterminer l'homogénéité et la distribution des tailles en solution des différentes espèces au sein d'un échantillon de protéines en mesurant la vitesse à laquelle les molécules se déplacent en réponse à une force centrifuge. Ceci est basé sur le calcul des coefficients de sédimentation des différentes espèces qui sont obtenus par l'expérience de vitesse de sédimentation, qui dépendent de leur forme et masse moléculaire.

Les échantillons de protéines suivants ont été centrifugés dans une ultracentrifugeuse analytique Beckman-Coulter

ProteomeLab XL-1 à 28 000 tr/min après que le rotor AN-60TÎ ait été équilibré à 15 °C. a. MC-005 lot BMP53, 675 pg/ml dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 b. MC-001 lot BMP13, 545 pg/ml dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 c. MC-001 lot BMP14, 545 pg/ml dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 d. MC-001 lot BMP54, 445 pg/ml dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 e. MC-007 lot BMP70, 510 pg/ml dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0

Pour le recueil des données, de 133 à 325 lectures ont été enregistrées à 280 nm toutes les 5 minutes. L'analyse des données a été réalisée en utilisant le programme SEDFIT (disponible par l'intermédiaire des National Institutes for Health) pour la détermination de la distribution des C(S) . La distribution des C(S) est une représentation de l'intensité relative des différents composants dans un mélange de macromolécules séparées par leur coefficient de sédimentation, qui est fonction de la taille et de la conformation des molécules. La détermination du volume spécifique partiel des protéines à 15 °C a été réalisée avec le logiciel SEDNTERP à partir de leur séquence d'acides aminés. SEDNTERP (SEDNTERP est distribué et supporté par le Biomolecular Interaction Technologies Center à l'Université du New Hampshire) a été également utilisé pour déterminer la viscosité et la densité du tampon à 15 °C.

La détermination de l'abondance relative de toutes les espèces a été réalisée en considérant l'aire sous la courbe totale de la distribution globale comme représentant 100 % de l'échantillon et en calculant le pourcentage de cette aire totale représenté par la contribution de chaque espèce. Le tracé de la distribution des C(S) (concentration en fonction du coefficient de sédimentation) a été utilisé pour ce calcul, en considérant qu'il s'agit d'une meilleure représentation des données brutes que la distribution des C (M) (concentration en fonction du poids moléculaire). L'ultracentrifugation analytique des différentes constructions purifiées a permis l'observation que UspA2 Ahélice, UspA2 hélice et UspA2 pleine hélice avec un marqueur his C-terminal sont présentes principalement sous la forme de trimères en solution lorsque 500 mM de L-arginine sont ajoutées durant la lyse cellulaire avant la purification (figures 4, 5, 7 et 8).

Il a été observé une distribution des tailles hétérogène pour UspA2 is hélice lorsqu'aucune L-arginine n'a été ajoutée durant la lyse cellulaire. Deux populations majeures sont observées. Il n'a pas été possible de confirmer le poids moléculaire de l'espèce détectée par AUC (ultracentrifugation analytique) avec cette préparation de protéine, parce que le rapport de frottement qui est essentiel à l'estimation du poids moléculaire doit être calculé à partir d'un échantillon homogène. Toutefois, en se basant sur les coefficients de sédimentation, aucune des espèces observées ne semble correspondre au trimère observé dans d'autres échantillons.

La figure 4 illustre la distribution des poids moléculaires de MC-005 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine est trouvée sous forme de trimère, avec une petite proportion d'un oligomère d'un poids moléculaire supérieur qui peut correspondre à un dimère de trimères.

La figure 5 illustre la distribution des poids moléculaires de MC-001 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine est trouvée sous forme de trimère.

La figure 6 illustre la distribution des poids moléculaires de MC-001 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. L'échantillon présente des espèces multiples et est hautement polydispersé. Le coefficient de sédimentation de l'espèce principale détectée ne correspond pas à l'un des trimères normalement détectés dans les autres lots.

La figure 7 illustre la distribution des poids moléculaires de MC-001 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine est trouvée sous forme de trimère.

La figure 8 illustre la distribution des poids moléculaires de MC-007 purifiée déterminée par la vitesse de sédimentation par ultracentrifugation analytique. La majorité de la protéine est trouvée sous forme de trimère.

Dichrolsme circulaire/structure secondaire

Le dichroisme circulaire (CD) est utilisé pour déterminer la composition des structures secondaires d'une protéine en mesurant la différence de l'absorption de la lumière polarisée à gauche par rapport à la lumière polarisée à droite qui est due à une asymétrie structurale. La forme et l'amplitude des spectres de CD dans la région UV lointain (190 à 250 nm) sont différentes si une protéine exhibe un feuillet bêta, une hélice alpha ou une structure enroulée aléatoire. L'abondance relative de chaque type de structure secondaire dans un échantillon de protéine donné peut être calculée par comparaison aux spectres de référence.

Les spectres UV lointains sont mesurés en utilisant un chemin optique de 0,01 cm de 178 à 250 nm, avec une résolution de 1 nm et une largeur de bande sur un spectropolarimètre Jasco J-720. La température de la cellule est maintenue à des températures différentes par un bloc cellulaire RTE-111 thermostaté Peltier. Un courant d'azote de 10 1/min est maintenu durant les mesures.

La concentration des constructions de protéines suivantes a été ajustée à 400 pg/ml dans un tampon de 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0. a. MC-005 lot BMP53, dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 b. MC-001 lot BMP13, dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 c. MC-001 lot BMP14, dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 d. MC-001 lot BMP54, dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8,0 e. MC-007 lot BMP70, dans 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, pH 8, 0

Les calculs des structures secondaires ont été réalisés en utilisant les algorithmes suivants :

Selcon 3 (Sreerama and Woody, Anal. Biochem. (1993), 209, 32 ; Sreerama and Woody, Biochemistry, 33, 10022-25 (1994) ;

Sreerama et al. Protein Science, 8, 370-380 (1999) ; Johnson W.C. Jr., Proteins: Str. Func. Genet. 35, 307-312 (1999)) CDSSTR (Johnson W.C. Proteins: Struc. Func. Genet. 35, 307-312 (1999) modifié par Sreerama. N. (Anal. Biochem., 287, 252 (2000)).

Les résultats affichés sont une moyenne du pourcentage calculé avec les deux algorithmes et ils sont soumis à une marge d'erreur de 5 %.

Les résultats des calculs de structures secondaires pour les protéines exprimées dans le fermenteur sont présentés dans le tableau 5, en prenant en considération une marge d'erreur de 5 %.

Tableau 5

Calculs des structures secondaires à 22 °C

Les calculs sont compatibles avec la forme et l'analyse visuelle des spectres, où la teneur en hélice augmente avec l'intensité des minima à 208 et 220 nm. Les protéines sont composées d'une proportion élevée de structures en hélice, avec la présence de structures bêta.

La superposition des spectres sur la figure 9 ne montre aucune différence significative de forme entre les constructions. Le spectre de MC-005 hélice montre une intensité inférieure qui pourrait être responsable d'une structure alpha inférieure qui est cohérente avec l'absence d'hélice C-terminale.

La figure 9 illustre le spectre de dichroïsme circulaire en UV lointain des constructions de UspA2 MC-001, MC-005 et MC007 donnant une indication des structures secondaires des protéines. La superposition des spectres montre clairement que les constructions contenant une demi-hélice ou une hélice entière C-terminale ne montrent aucune différence détectable dans leurs structures secondaires, alors que la construction sans hélice génère un spectre avec une différence d'intensité qui pourrait être responsable d'une teneur différente de structure secondaire. Dépliement thermique

La mesure des spectres de CD en UV lointain à des températures différentes durant le dépliement thermique a suggéré que MC-005 est moins thermostable que MC-007. Le spectre observé à 33 °C pour MC-005 est similaire au spectre type d'une protéine dépliée. Pour la construction MC-007, même si une perte partielle des structures secondaires est observée à 33 °C, le dépliement complet semble survenir entre 35 °C et 37 °C. Ceci peut être une indication d'une stabilité thermique supérieure de la construction MC-007 contenant une hélice entière.

La figure 10 illustre le suivi des structures secondaires par dichroïsme circulaire durant le dépliement thermique de MC-005 (UspA2Ahélice+6His). L'analyse visuelle du spectre montre clairement que la protéine perd la majeure partie de ses structures secondaires à 33 °C.

La figure 11 illustre le suivi des structures secondaires par dichroïsme circulaire durant le dépliement thermique de MC-007 (UspA2 + hélice + 6His). L'analyse visuelle du spectre montre que la perte de structure secondaire est plus lente comparativement à la construction sans hélice. Les changements structuraux sont détectables lors du chauffage à 33 °C, mais le dépliement complet semble survenir entre 35 °C et 37 °C. Dépliement thermique par calorimétrie différentielle à balayage (DSC)

Les transitions thermiques de différentes constructions de UspA2 ont été comparées afin d'évaluer l'effet des modifications de l'hélice C-terminale sur la stabilité thermique des protéines. L'analyse a été réalisée sur VP-DSC de MicroCal (partie de GE Healthcare) . Le tampon de 20 mM de NaP04, 10 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA, pH 8 a été utilisé comme référence et soustrait des lectures. Les protéines ont été équilibrées à la température initiale pendant 15 minutes avant l'augmentation de la température. Les lectures de DSC ont été ensuite conduites de 10 °C à 60 °C à une vitesse de chauffage de 90 °C/h.

Deux transitions ont été détectées dans les constructions MC-001 et MC-007 et seulement une dans MC-005. Les valeurs des transitions (ou Tm) des différentes constructions peuvent être trouvées dans le tableau 6.

Alors que la Tm inférieure des trois protéines se situe autour de 32 °C, la différence principale est la valeur de la seconde Tm. La construction contenant une hélice entière (MC-007) a une Tm supérieure à 37,5 °C comparativement à 34,5 °C pour la demi-hélice (MC-001).

Il a été démontré que pour MC-001 et MC-007, la première Tm autour de 32 °C est réversible, alors que la Tm supérieure est irréversible. Pour MC-005, la seule Tm détectée est irréversible.

Ceci peut être une indication d'une stabilité thermique supérieure de la construction MC-007 contenant une hélice entière.

Tableau 6

Points de fusion des constructions de UspA2 mesurés par DSC

Spectrométrie de masse

Les échantillons des protéines UspA2 ont été préparés par précipitation des protéines avec le système CHCI3 / MeOH /HO. Le culot des protéines a été centrifugé au fond du tube Eppendorf avant d'être doucement séché sous azote. Le culot séché a été ensuite dissous dans 2 μΐ d'acide formique pur avant d'être dilué avec 3 μΐ d'eau ultrapure et 5 μΐ d'acide sinapinique. L'acide sinapinique utilisé comme matrice pour l'analyse MALDI-TOF (analyseur par spectrométrie à temps de vol avec désorption et ionisation par laser assistées par matrice) est préparé dans 50 % de CH3CN / 50 % de H20 complémenté par du TFA à une concentration finale de 0,1 %. 1 μΐ du mélange échantillon + matrice a été déposé sur une cible MALDI Bruker 384 en acier inoxydable rectifié et laissé sécher pour la cristallisation à température ambiante et pression atmosphérique (procédé de la gouttelette séchée). L'analyse de spectrométrie de masse de UspA2 a été réalisée sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Ultraflex 2 (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne) en mode ionisation positive et linéaire. Les échantillons des protéines, cocristallisés dans la matrice d'acide sinapinique, ont été irradiés par un laser SmartBeam. La mesure de masse de la protéine UspA2 intacte a été réalisée sur une plage de masses de 10 000 à 100 000 Da avec une tension d'accélération de 25 kVolts. L'atténuation du laser a été affinée afin d'obtenir le meilleur signal de protéine possible et d'éviter toute fragmentation ainsi que le phénomène de sur-ionisation du bruit de fond. L'étalonnage du spectromètre de masse a été effectué dans un procédé externe proche avec une matrice homologue et en utilisant le mélange commercial pour protéines Bruker Protein Calibration mixture 2, par des mesures exactes des étalons suivants : [M+2H]2+ (masse mesurée par un détecteur MS après l'addition de deux ions H+ à la protéine durant l'ionisation) espèce de la protéine A à m/z 22307 Da, [M+H]+ espèce de trypsinogène à m/z 23982 Da, [M+H]+ espèce de la protéine A à m/z 44613 Da et [M+H]+ espèce d'albumine bovine à m/z 66431 Da. Chaque spectre présenté provient de la somme de 500 injections individuelles.

Les échantillons suivants ont été analysés :

Construction MC-001 avec les acides aminés MQAK (SEQ ID NO : 85) en N-terminal produite en flacon sous agitation, lot opt-01, construction MC-011 avec les acides aminés MAK en N-terminal produite en flacon sous agitation, lot BMP37.

Dans le tableau 7 et sur la figure 12, il a été montré que la protéine MC-001 avec les acides aminés MQAK (SEQ ID NO : 85) à l'extrémité N-terminale est au moins partiellement déméthionylée, comme il est montré par la masse moléculaire mesurée de 57427 Da, comparativement à la masse attendue de 57565 Da. L'autre pic de 57620 Da peut représenter la protéine non déméthionylée complète, la protéine N-acétylée, ou une autre population de la protéine modifiée.

La figure 12 illustre le spectre MALDI de MC-001 lot opt- 01. La masse observée à 57427 Da peut être cohérente avec la protéine déméthionylée, alors que le pic à 57620 Da pourrait correspondre à la protéine complète.

Comme il est montré dans le tableau 7 et sur la figure 13, la protéine MC-011 avec les acides aminés MAK à l'extrémité N-terminale a donné une population majeure en MALDI-MS qui peut correspondre à la protéine déméthionylée, avec une masse de 57265 Da, comparativement à 57437 Da pour la masse attendue basée sur la séquence d'acides aminés complète. Les deux autres pics à +186 Da et +366 Da ne sont proches d'aucune modification posttraductionnelle attendue, si bien qu'ils n'ont pas pu être identifiés par cette expérience.

Tableau 7

Masse moléculaire de deux constructions de UspA2 mesurée par MALDI-TOF. Les deux constructions ont une masse mesurée principale inférieure à celle attendue à partir de la séquence d'acides aminés. La masse de la population majeure obtenue avec les deux constructions peut être cohérente avec une protéine déméthionylée

Séquençage N-terminal par la dégradation d'Edman

Afin d'évaluer si l'optimisation de la région N-terminale (optimisation de la séquence d'acides aminés à côté de la méthionine N-terminale) mène à une déméthionylation de la protéine, le séquençage N-terminal a été réalisé sur la construction MC-011 portant les acides aminés MAK sur son extrémité N-terminale.

Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel de polyacrylamide Novex de 4 % à 20 % de Invitrogen, avant le transfert sur une membrane de PVDF Problot (difluorure de polyvinylidène) (Bio-Rad). La membrane a été colorée par Amidoblack. La bande d'intérêt a été ensuite découpée et l'analyse a été réalisée selon le protocole du fabricant en utilisant un système séquenceur Applied Biosystems Procise. Douze cycles de dégradation d'Edman ont été effectués.

La séquence d'acides aminés N-terminale obtenue est AKNDITLEDLP (SEQ ID NO : 86), ce qui correspond à l'extrémité N-terminale de la protéine démarrant au numéro d'acide aminé deux après la méthionine initiale. Ceci indique que la protéine mature est principalement déméthionylée.

Exemple 7 - Construction de UspA2 MC-001 : activité bactéricide Test bactéricide

Moraxella catarrhalis a été cultivée pendant une nuit sur une boîte de Petri à 37 °C + 5 % de C02. Les bactéries ont été transférées dans 12 ml du tampon à 0,1 % de HBSS-BSA (solution saline tamponnée de Hank avec sérumalbumine bovine) afin d'obtenir une OD62o de 0,650. Les échantillons de sérum ont été chauffés pendant 45 min à 56 °C pour inactiver le complément endogène. Des dilutions en série au demi des sérums dans du tampon SBA (HBSS-BSA à 0,1 %) ont été ajoutés sur une plaque de microtitrage de 96 puits à fond arrondi (25 μΐ/puits). Ensuite, 50 μΐ de tampon SBA ont été ajoutés dans chaque puits. Puis 25 μΐ de souches de Moraxella catarrhalis à 4 10"4 cfu/ml ont été ajoutés aux puits contenant les sérums et incubés pendant 15 min à température ambiante. Finalement, 25 μΐ de complément de lapin bébé fraîchement décongelé dilué au 1/8 dans du HBSS-BSA à 0,1 % ont été ajoutés pour atteindre un volume final de 125 μΐ. Les plaques ont été incubées pendant 1 h à 37 °C sous une agitation orbitale (210 tr/min). La réaction a été stoppée en déposant la microplaque sur de la glace pendant au moins 5 min.

Après l'homogénéisation, diverses dilutions de la suspension (un mélange de bactéries, de sérum, de complément et de tampon, à un volume de 125 μΐ tel que décrit dans le paragraphe précédent) ont été ajoutées sur des plaques de gélose chocolat et incubées pendant 24 heures à 37 °C avec 5 % de C02 et les colonies de Moraxella catarrhalis ont été dénombrées.

Huit puits sans échantillon de sérum ont été utilisés comme témoins bactériens pour déterminer le nombre de colonies de Moraxella catarrhalis par puits. Le nombre moyen de CFU (unité formant une colonie) des puits témoins a été déterminé et utilisé pour le calcul de l'activité destructrice pour chaque échantillon de sérum. Les titres bactéricides ont été exprimés à la dilution réciproque de sérum induisant 50 % de destruction.

Des antisérums anti-UspA2 générés chez des souris, des cobayes et des lapins contre MC-001 ont été testés dans le test bactéricide décrit ici ci-dessus contre 20 souches différentes de Moraxella catarrhalis isolées de divers tissus (sang, crachats, nez, liquides de l'oreille moyenne) dans divers pays (Etats-Unis, Finlande, Pays-Bas, Norvège, Suède).

Comme il est montré ci-dessous, les anticorps anti-UspA2 ont été capables d'induire une destruction bactéricide croisée de Moraxella catarrhalis, quel que soit le pourcentage d'homologie de l'UspA2 exprimée par la souche testée. En outre, une activité bactéricide a été également montrée contre des souches qui expriment uniquement UspAl ou la protéine chimérique UspA2H. Comme on s'y attendait, aucun titre d'anticorps bactéricides ou des titres d'anticorps bactéricides seulement faibles ont été mesurés contre des mutants doubles knock-out pour UspAl et UspA2.

Tableau 8

Activité bactéricide croisée des anticorps anti-UspA2 MC-001 générés chez des souris, des cobayes et des lapins. 1+2 KO signifie double knock-out, pour UspAl et UspA2. 1KO représente knock-out seulement pour UspAl. MEF (AOM) = liquide de l'oreille moyenne (otite moyenne aiguë). « / » dans la colonne de la source de l'isolat = source de l'isolat inconnue

^déterminé en utilisant le logiciel GapL/ClustaIX contre le fragment de UspA2 ATCC25238 AA 30 à 540. +++ > 50000 ; ++ > 20000 ; + > 500 ; - < 200

Tableau 9

Expression de UspA dans les souches de M. catarrhalis dans le tableau 8

Exemple 8 - Protection dans un modèle de souris de colonisation du poumon (MC-001)

Des souris Balb/c femelles âgées de cinq semaines (n = 8/5 groupes) ont été immunisées par la voie intramusculaire aux jours 0, 14 et 28 avec 50 μΐ de vaccin contenant 10 pg de construction de UspA2 MC-001 formulé au sein de AS02V. Les souris ont été soumises à l'épreuve par voie intranasale au jour 42 avec 5.105 CFU de diverses souches de Moraxella catarrhalis. Les bactéries ont été dénombrées dans les poumons prélevés 0, 3 et 6 heures après l'épreuve. Les différences entre les groupes ont été analysées en utilisant le test de Dunnet.

Comme il est résumé dans le tableau 10, la construction de UspA2 MC-001 a induit une protection significative contre les souches à la fois homologues et hétérologues, y compris la souche 43617 qui exprime UspAl mais pas UspA2 et la souche BBH18 qui exprime la protéine chimérique UspA2H (constituée de la séquence N-terminale de UspAl et de la séquence C-terminale de UspA2).

Tableau 10

Efficacité protectrice de la construction de UspA2 MC-001

*déterminé en utilisant le logiciel GapL/ClustaIX contre le fragment de UspA2 ATCC25238 AA 30 à 540. les valeurs p en gras sont significatives (p < 0,05)

Exemple 9 - Construction de UspA2 MC-007 : activité bactéricide des anticorps

Test bactéricide

Moraxella catarrhalis 25238 a été cultivée pendant une nuit sur une boîte de Petri à 37 °C + 5 % de CO2. Les bactéries ont été transférées dans 12 ml du tampon à 0,1 % de HBSS-BSA afin d'obtenir une OD62o de 0, 650. Les échantillons de sérum ont été chauffés pendant 45 min à 56 °C pour inactiver le complément endogène. Des dilutions en série au demi des sérums dans du tampon SBA (HBSS-BSA à 0,1 %) ont été ajoutés sur une plaque de microtitrage de 96 puits à fond arrondi (25 μΐ/puits). Ensuite, 50 μΐ de tampon SBA ont été ajoutés dans chaque puits. Puis 25 μΐ de souche de Moraxella catarrhalis 25238 à 4 10"4 cfu/ml ont été ajoutés aux puits contenant les sérums et incubés pendant 15 min à température ambiante. Finalement, 25 μΐ de complément de lapin bébé fraîchement décongelé dilué au 1/8 dans du HBSS-BSA à 0,1 % ont été ajoutés pour atteindre un volume final de 125 μΐ. Les plaques ont été incubées pendant 1 h à 37 °C sous une agitation orbitale (210 tr/min). La réaction a été stoppée en déposant la microplaque sur de la glace pendant au moins 5 min. Après l'homogénéisation, diverses dilutions de la suspension ont été ajoutées sur des plaques de gélose chocolat et incubées pendant 24 heures à 37 °C avec 5 % de C02 et les colonies de Moraxella ont été dénombrées. Huit puits sans échantillon de sérum ont été utilisés comme témoins bactériens pour déterminer le nombre de colonies de Moraxella catarrhalis par puits. Le nombre moyen de CFU des puits témoins a été déterminé et utilisé pour le calcul de l'activité destructrice pour chaque échantillon de sérum. Les titres bactéricides ont été exprimés à la dilution réciproque de sérum induisant 50 % de destruction.

Des antisérums anti-UspA2 générés chez des souris avec la construction de UspA2 MC-001 ou MC-007 ont été testés dans le test bactéricide décrit ci-dessus contre la souche homologue de Moraxella catarrhalis 25238.

Comme il est montré dans le tableau 11, la construction de UspA2 MC-007 a déclenché une réponse bactéricide élevée, similaire à celle induite par MC-001.

Tableau 11

Activité bactéricide des anticorps anti-UspA2 MC-001 et MC-007. Sérums de souris normaux = sérums de souris immunisées avec AS02V seulement, pas avec UspA2

Exemple 10 - Construction de UspA2 MC-007 : efficacité protectrice dans un modèle d'épreuve du poumon

Protection dans un modèle de souris de colonisation du poumon Des souris Balb/c femelles âgées de cinq semaines (8 souris par groupe, 5 groupes maximum par point de temps) ont été immunisées par la voie intramusculaire aux jours 0, 14 et 28 avec 50 μΐ de vaccin contenant 10 pg de construction de UspA2 MC-001 formulée avec du AS02V ou MC-007 formulée au sein de AS02V. Les souris ont été soumises à l'épreuve par voie intranasale au jour 42 avec 5.105 CFU de la souche de Moraxella catarrhalis ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™. Les souris ont été immunisées avec 10 pg de cellules entières tuées de la souche de Moraxella catarrhalis ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™ (comme témoin positif) (M. cat. WC 25238 sur la figure 14) ou avec AS02V seul (comme témoin négatif) . Les bactéries ont été dénombrées dans les poumons prélevés 0, 3 et 6 heures après l'épreuve. Les différences entre les groupes ont été analysées en utilisant le test de Dunnet.

Comme il est montré sur la figure 14, les deux constructions de UspA2 ont été protectrices de façon similaire contre la souche ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™.

Exemple 11 - Immunogénicité des formulations de protéine UspA2 MC-009 chez des souris

Des groupes de 25 souris Balb/c femelles ont été immunisées par la voie intramusculaire (IM) aux jours 0, 14 et 28 avec 50 μΐ des formulations suivantes : -MC-009 (1 pg) A1P04 (1000 pg/ml) -MC-009 (1 pg) AS04C (A1P04/MPL 100/100 par ml) -MC-009 (1 pg) AS01E (QS21/MPL 50/50 par ml)

Les taux d'anti-IgG ont été déterminés dans les sérums individuels prélevés aux jours 28 (PII) et 42 (PIII) en utilisant le protocole suivant :

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-UspA2

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 pl par puits de construction de UspA2 MC-009 à 4 pg/ml dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 pl par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0,1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 4 90 nm (62 0 nm pour le filtre de référence).

Les titres ont été calculés par le procédé à 4 paramètres en utilisant le logiciel SOFTMAX (une marque déposée aux Etats-Unis) Pro.

Comme il est montré sur la figure 15, UspA2 a induit des taux d'anticorps élevés avec chaque formulation d'adjuvant.

Test bactéricide

Le test bactéricide a été réalisé contre la souche de M. catarrhalis ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™ exprimant une UspA2 pleine longueur homologue en utilisant le protocole suivant : la souche de Moraxella catarrhalis ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™ a été cultivée pendant une nuit sur une boîte de Petri à 37 °C + 5 % de C02. Les bactéries ont été transférées dans 10 ml de BHi (bouillon infusion cœur) afin d'obtenir une DO620 de 0,650. Les échantillons de sérum ont été chauffés pendant 45 min à 56 °C pour inactiver le complément endogène. Des dilutions en série au demi des sérums dans du tampon SBA (HBSS-BSA à 0,1 %) ont été ajoutées sur une plaque de microtitrage de 96 puits à fond arrondi (25 μΐ/puits). Ensuite, 50 μΐ de tampon SBA ont été ajoutés dans chaque puits. Puis 25 μΐ de souches de Moraxella catarrhalis 25238™ à 4 10"3 cfu/ml ont été ajoutés aux puits contenant les sérums et incubés pendant 15 min à température ambiante. Finalement, 25 μΐ de complément de lapin bébé fraîchement décongelé dilué au 1/8 dans du HBSS-BSA à 0,1 % ont été ajoutés pour atteindre un volume final de 125 μΐ. Les plaques ont été incubées pendant 1 h à 37 °C sous une agitation orbitale (210 tr/min) . La réaction a été stoppée en déposant la plaque sur de la glace pendant au moins 5 min. Une aliquote de 20 μΐ de chaque puits de la plaque a été ensuite transférée dans le puits correspondant d'une microplaque de 96 puits à fond arrondi et 50 μΐ de gélose à 0,9 % de bouillon Mueller Hinton ont été ajoutés dans chaque puits. 50 μΐ de gélose à 0,9 % de PBS ont été ajoutés comme seconde couche. Après 3 heures à 37 °C avec 5 % de C02, les plaques ont été incubées pendant une nuit à 25 °C, les colonies de Moraxella ont été dénombrées en utilisant un système automatisé d'analyse d'images (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Allemagne). Huit puits sans échantillon de sérum ont été utilisés comme témoins bactériens pour déterminer le nombre de Moraxella par puits. Le nombre moyen de CFU des puits témoins a été déterminé et utilisé pour le calcul de l'activité destructrice pour chaque échantillon de sérum. Les titres bactéricides ont été exprimés à la dilution réciproque de sérum induisant 50 % de destruction.

La figure 16 illustre les titres bactéricides induits par UspA2 contre une souche homologue. Dans cette expérience, UspA2 a induit des taux élevés d'anticorps bactéricides pour chaque formulation d'adjuvant. Les sérums ont été testés à PIII ; cinq groupes de cinq échantillons de sérums ont été testés.

Exemple 12 - Immunogénicité de UspA2 en combinaison avec les antigènes PD et PE-PilA de NTHi

Protocoles d'immunisation

Des groupes de 25 souris Balb/c femelles ont été immunisées par la voie intramusculaire (IM) aux jours 0, 14 et 28 avec 50 μΐ des formulations suivantes : - construction de UspA2 MC-009 (1 pg) A1P04

- construction de UspA2 MC-009 (1 pg) AS04C

- construction de UspA2 MC-009 (1 pg) AS01E

UspA2-PD-PEPilA (construction de UspA2 MC-009, construction de PEPilA LVL-735) A1P04 (1 pg de chacun de UspA2, PD et PEPilA ; 1000 mg/ml de A1P04)

UspA2-PD-PEPilA (construction de UspA2 MC-009, construction de PEPilA LVL-735) AS04C A1P04 (1 pg de chacun de UspA2, PD et PEPilA ; 100/100 par ml de A1P04/MPL)

UspA2-PD-PEPilA (construction de UspA2 MC-009, construction de PEPilA LVL-735) AS01E (1 μρ de chacun de UspA2, PD et PEPilA ; 50/50 par ml de QS21/MPL)

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-UspA2

Les taux d'IgG Anti-UspA2 ont été déterminés dans les sérums individuels prélevés aux jours 28 et 42 en utilisant le protocole suivant.

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 μΐ par puits de construction de UspA2 MC-009 à 4 pg/ml dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 μΐ par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0,1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence) . Les titres ont été calculés par le procédé à 4 paramètres en utilisant le logiciel SOFTMAX (une marque déposée aux Etats-Unis) Pro.

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-PE

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 μΐ par puits de 2 μς/ιτιΐ de UspA2 dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 μΐ par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0,1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence).

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-PilA

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 μΐ par puits de 4 μρ/ιηΐ de PilA dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 μΐ par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0, 1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence).

Les titres ont été calculés par le procédé à 4 paramètres en utilisant le logiciel SOFTMAX (une marque déposée aux Etats-

Unis) Pro.

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-PD

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 μΐ par puits de 8 μg/ml de PD dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 μΐ par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0,1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence).

Test bactéricide

Les titres bactéricides ont été mesurés dans des sérums groupés (5 groupes de sérum/groupe) prélevés au jour 42 en utilisant le protocole suivant :

Moraxella catarrhalis a été cultivée pendant une nuit sur une boîte de Petri à 37 °C + 5 % de C02. Les bactéries ont été transférées dans 10 ml de BHi (bouillon infusion cœur) afin d'obtenir une D062o de 0, 650. Les échantillons de sérum ont été chauffés pendant 45 min à 56 °C pour inactiver le complément endogène. Des dilutions en série au demi des sérums dans du tampon SBA (HBSS-BSA à 0,1 %) ont été ajoutées sur une plaque de microtitrage de 96 puits à fond arrondi (25 μΐ/puits). Ensuite, 50 μΐ de tampon SBA ont été ajoutés dans chaque puits. Puis 25 μΐ de souches de Moraxella catarrhalis 25238 à 4 10"3 cfu/ml ont été ajoutés aux puits contenant les sérums et incubés pendant 15 min à température ambiante. Finalement, 25 μΐ de complément de lapin bébé fraîchement décongelé dilué au 1/8 dans du HBSS-BSA à 0,1 % ont été ajoutés pour atteindre un volume final de 125 μΐ. Les plaques ont été incubées pendant 1 h à 37 °C sous une agitation orbitale (210 tr/min) . La réaction a été stoppée en déposant la plaque sur de la glace pendant au moins 5 min. Une aliquote de 20 μΐ de chaque puits de la plaque a été ensuite transférée dans le puits correspondant d'une microplaque de 96 puits à fond arrondi et 50 μΐ de gélose à 0,9 % de bouillon Mueller Hinton ont été ajoutés dans chaque puits. 50 μΐ de gélose à 0,9 % de PBS ont été ajoutés comme seconde couche. Après 3 heures à 37 °C avec 5 % de C02, les plaques ont été incubées pendant une nuit à 25 °C. Les colonies de Moraxella ont été dénombrées en utilisant un système automatisé d'analyse d'images (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Allemagne). Huit puits sans échantillon de sérum ont été utilisés comme témoins bactériens pour déterminer le nombre de Moraxella par puits. Le nombre moyen de CFU des puits témoins a été déterminé et utilisé pour le calcul de l'activité destructrice pour chaque échantillon de sérum. Les titres bactéricides ont été exprimés à la dilution réciproque de sérum induisant 50 % de destruction.

Le test bactéricide a été réalisé contre la souche de Moraxella catarrhalis 25238™, exprimant une UspA2 homologue.

Il a été observé un impact négatif de la présence des antigènes PD et PE-PilA sur les taux d'IgG anti-UspA2 dans des formulations de AS04C (post III) et de AS01E (post II) (figure 17) . Toutefois, l'impact est demeuré limité (^ 2 fois de diminution des anticorps) et il n'a pas été confirmé dans le test bactéricide (figure 18) . Les réponses en IgG induites contre les antigènes PD, PE et PilA chez les souris par le vaccin PE-PEPilA-UspA2 sont présentées sur la figure 19, la figure 20 et la figure 21, respectivement.

Par conséquent, UspA2 a été immunogène lorsqu'elle a été combinée avec les antigènes PD et PE-PilA.

Exemple 13 - Construction de UspA2 MC-009 : immunogénicité des antigènes PD et PE-PilA de NTHi en combinaison avec UspA2 chez des souris

Protocole d'immunisation

Des groupes de 25 souris Balb/c femelles ont été immunisées par la voie intramusculaire (IM) aux jours 0, 14 et 28 avec 50 μΐ des formulations suivantes :

- PD-PEPilA (1 μς de PD et 1 μρ de construction de PEPilA LVL-7 35) AS OIE

- UspA2-PD-PEPilA (1 pg de construction de UspA2 MC-009, PD et construction de PEPilA LVL-735) AS01E

Les taux d'IgG par ELISA contre les antigènes PD, PE et PilA ont été déterminés dans des sérums individuels prélevés aux jours 28 (PII) et 42 (PIII) .

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-PE

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 μΐ par puits de 2 pg/ml de UspA2 dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 μΐ par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0,1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence).

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-PilA

Des plaques ont été recouvertes pendant une nuit à 4 °C avec 100 μΐ par puits de 4 μg/ml de PilA dans du tampon carbonate pH 9,6. Les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 (polysorbate 20) à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi des sérums ont été ajoutées aux micropuits dans du PBS, du TWEEN (une marque déposée aux Etats-Unis) 20 à 0,05 %. Les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Après lavage, des anticorps anti-IgG de souris (Jackson 115-035-003) conjugués à de la peroxydase (100 μΐ par puits) ont été ajoutés, et les plaques ont été placées à température ambiante pendant 30 minutes sous agitation. Les plaques ont été lavées comme ci-dessus et la solution de révélation (4 mg d'OPDA Sigma P8787 et 5 μΐ de H202 dans 10 ml de citrate 0,1 M pH 4,5) a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl IN et l'absorbance a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence).

Test ELISA pour mesurer les anticorps anti-PD

Il n'a été observé aucun impact majeur de l'addition de UspA2 sur l'immunogénicité de PD et PEPilA dans du AS01E comme il est montré sur les figures 22, 23 et 24.

Exemple 14 - Sécurité d'une formulation vaccinale tétravalente contenant UspA2 dans un modèle de souris d'inflammation du poumon provoquée par Moraxella catarrhalis

Pour mitiger le risque d'induire des réponses inflammatoires indésirables dans les poumons de patients souffrant de BPCO après immunisation avec un vaccin candidat visant à prévenir les exacerbations dues à Haemophilus influenzae non typable (NTHi) et Moraxella catarrhalis (M. cat.), divers modèles animaux ont été développés et utilisés pour estimer la sécurité de ce vaccin. La formulation testée contenait trois antigènes de NTHi (PD, PE et PilA, avec les deux derniers combinés sous la forme d'une protéine de fusion PEPilA) , un antigène de M. cat. (UspA2) et le système d'adjuvant 01E (ASOIe) .

Deux modèles ont été particulièrement dédiés pour évaluer la sécurité du composant UspA2 du vaccin.

Modèle 1 : • Objectif

Ce modèle a visé à estimer l'induction possible de réponses immunitaires indésirables dans des poumons inflammés après vaccination. • Conception de l'étude

Des souris C57B1/6 ont été sensibilisées par trois administrations intranasales de 25 pg de souche de M. cat. ATCC (une marque déposée aux Etats-Unis) 25238™ à cellules entières inactivées à la chaleur (exprimant une UspA2 qui est homologue à 100 % à l'UspA2 du vaccin) aux jours 0, 7 et 14. Ce traitement a induit dans les poumons une inflammation périvasculaire et péribronchiolaire (avec formation d'agrégats lymphoïdes), une alvéolite, une pneumonie, une fibrose et une forte réponse des lymphocytes T IL-17+ CD4+ spécifiques de M. cat. à cellules entières, qui globalement a mimé le processus inflammatoire observé dans les poumons des patients souffrant de BPCO (à l'exception d'un emphysème).

Les souris ont été ensuite vaccinées au jour 42 par la voie intramusculaire avec l/10ème de la dose humaine des formulations suivantes : - PD 10 pg/ PEPilA (construction LVL735, décrite dans le document WO 2012/139225) 10 pg/ UspA2 (construction MC009) 10 pg/ ASOIe - PD 10 pg/ PEPilA (construction LVL735) 10 pg/ UspA2 (construction MC009) 3,3 pg/ AS01e - AS01e (témoin négatif) - PBS (témoin négatif)

Pour estimer l'impact de ces formulations sur l'inflammation du poumon induite par la sensibilisation : - Les souris ont été suivies quotidiennement du jour 43 au jour 49 pour observer la mortalité et tout signe clinique indiquant l'induction d'événements indésirables (prostration, piloérection, position voûtée). - Une analyse histologique des poumons a été réalisée aux jours 2, 7 et 14 après la vaccination (avec 5 souris par groupe et point de temps) pour observer une aggravation possible de 1'inflammation. - L'induction de réponses des lymphocytes T potentiellement indésirables a été évaluée sur des groupes de poumons prélevés aux jours 7 et 14 après la vaccination (avec 4 groupes de poumons/groupe/point de temps et les poumons de 3 souris par groupe de poumons) . Les lymphocytes T des poumons ont été restimulés pendant une nuit avec soit des peptides UspA2, M. cat. à cellules entières (WC) inactivées à la chaleur soit du milieu (comme témoin négatif) et ensuite analysés par cytométrie en flux pour l'expression de CD5, CD4, CD8, IL-17, IL-13, TNFa et IFNy. • Résultats

Il n'a été rapporté aucune mortalité ni événement indésirable. - Histologie des poumons (figures 25 à 29) : o Les modifications observées dans les poumons ont été similaires en sévérité dans tous les groupes et caractérisées par des infiltrats de cellules mononucléées périvasculaires/bronchiolaires légers à modérés. o II n'a été observé aucune alvéolite et/ou pneumonie associée à la vaccination. - Réponse des lymphocytes T : o De fortes réponses des lymphocytes T CD4 ' (principalement des cellules productrices d'IL-17 et de TNFa) ont été mesurées dans les poumons après restimulation avec les WC, mais sans tenir compte de la formulation administrée (vaccins ou adjuvant seul ou PBS) (figures 30 à 33) . Il a été observé des réponses faibles ou aucune réponse des lymphocytes T CD8+ dans les poumons (données non présentées). o Aucune réponse des lymphocytes T détectable n'a été restimulée par les peptides UspA2, quel que soit le groupe, indiquant qu'aucune réponse spécifique de UspA2 n'a été amorcée ou stimulée après la vaccination (données non présentées).

Modèle 2 : • Objectif

Ce modèle a visé à estimer l'induction possible de réponses immunitaires indésirables dans des poumons inflammés après vaccination et épreuve avec M. cat. • Conception de l'étude

Des souris C57B1/6 ont été successivement : - Sensibilisées par trois administrations intranasales de 25 pg de la souche de M. cat. 25238 à WC inactivées à la chaleur (exprimant une UspA2 qui est homologue à 100 % avec l'UspA2 du vaccin) aux jours 0, 7 et 14 (corrmie dans le modèle 1). - Vaccinées au jour 42 par la voie intramusculaire avec l/10ème de la dose humaine des formulations suivantes (corrmie dans le modèle 1) : PD (10 pg/ PEPilA (construction LVL735) 10 pg/ UspA2

(construction MC009) 10 pg/ AS01E PD 10 pg/ PEPilA (construction LVL7 35) 10 pg/ UspA2

(construction MC009) 3,3 pg/ AS01E ASOIe (témoin négatif) PBS (témoin négatif) - Soumises à l'épreuve par une administration intranasale de 25 pg de la souche de M. cat. Fl0 à WC inactivées à la chaleur (exprimant une UspA2 qui partage 53 % d'homologie avec l'UspA2 du vaccin) ou par une administration intranasale de PBS comme témoin, les deux au jour 56. La souche de l'épreuve était différente de la souche de sensibilisation pour mimer la situation observée chez les patients souffrant de BPCO qui expérimentent de nouvelles exacerbations dues aux souches de M. cat. nouvellement acquises.

Pour estimer l'impact de la vaccination et de l'épreuve sur l'inflammation des poumons induite par la sensibilisation : - Des souris ont été suivies quotidiennement du jour 43 au jour 63 pour observer la mortalité et tout signe clinique indiquant l'induction d'événements indésirables (prostration, piloérection, position voûtée). - L'induction de réponses des lymphocytes T potentiellement indésirables a été évaluée sur des groupes de poumons prélevés aux jours 7 et 14 après l'épreuve (avec 4 groupes de poumons/groupe/point de temps et les poumons de 3 souris par groupe de poumons) . Les lymphocytes T des poumons ont été restimulés pendant une nuit avec soit des peptides UspA2, M. cat. F10 à WC inactivées à la chaleur soit du milieu (comme témoin négatif) et ensuite analysés par cytométrie en flux pour l'expression de CD5, CD4, CD8, IL-17, IL-13, TNFa et IFNy. • Résultats - Il n'a été rapporté aucune mortalité ni événement indésirable. - Réponses des lymphocytes T : o De fortes réponses des lymphocytes T CD4+ après l'épreuve (principalement des cellules produisant de 1'IL-17 et du TNFa) ont été mesurées dans les poumons après restimulation avec F10 à WC, sans tenir compte de la formulation administrée (vaccins ou adjuvant seul ou PBS) (figures 34 à 37) . De façon non surprenante, ces réponses ont été supérieures chez les souris soumises à l'épreuve avec des bactéries inactivées par rapport aux souris soumises à l'épreuve avec du PBS. Quelle que soit l'épreuve, il a été observé de faibles réponses ou pas de réponse des lymphocytes T CD8+ (données non présentées). o Aucune réponse des lymphocytes T détectable n'a été restimulée par les peptides UspA2, quel que soit le groupe, indiquant qu'aucune réponse spécifique de UspA2 n'a été amorcée ou stimulée après l'épreuve (données non présentées).

Conclusion

Il a été montré que les formulations PD/ PEPilA/ UspA2/ AS01e testées et plus spécifiquement le composant UspA2 de ces vaccins étaient sans risque dans un modèle de souris d'inflammation du poumon provoquée par M. cat.

Claims

REVENDICATIONS

1. Protéine de formule I : A - (Ri)m - (B)n (formule I) dans laquelle: A est un fragment immunogène de UspA2 de Moraxella catarrhalis choisi parmi le groupe constitué par les acides aminés 30 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 39) , les acides aminés 31 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 40) , les acides aminés 30 à 519 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 41), les acides aminés 30 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 42) et les acides aminés 31 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 43); Ri représente un acide aminé ; m vaut 2 ; B représente une histidine ; n vaut 1, 2 ou 6 ; et comprenant en outre une méthionine à l'extrémité amino.
2. Protéine de formule I: A-(Rl)m-(B)n (formule I) dans laquelle: A est un fragment immunogène de UspA2 de Moraxella catarrhalis choisi parmi le groupe constitué par les acides aminés 30 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 39), les acides aminés 31 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 40) , les acides aminés 30 à 519 de SEQ ID N0 : 1 (SEQ ID NO : 41), les acides aminés 30 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 42) et les acides aminés 31 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 43) ; RI représente un acide aminé ; m vaut 0 ou 2 B représente une histidine ; n vaut 1, 2 ou 6 ; et comprenant en outre une méthionine à l'extrémité amino.
3. Protéine selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle (Ri)m représente AS (alanine sérine).
4. Protéine selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle n vaut 2.
5. Protéine selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle A est un fragment immunogène de UspA2 présentant au moins 52 %, 55 %, 57 %, 62 %, 64 %, 69 %, 73 %, 76 %, 81 %, 88 % ou 100 % d’identité avec SEQ ID NO : 39.
6. Protéine selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle A est un fragment immunogène de UspA2 présentant au moins 52 %, 57 %, 62 %, 65 %, 67 %, 70 %, 73 %, 76 %, 81 %, 100 %, d’identité avec SEQ ID NO : 43.
7. Protéine choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 61, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO : 65, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO : 69, SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 73 et SEQ ID NO : 88.
8. Protéine présentant la séquence SEQ ID NO: 65.
9. Protéiné présentant la séquence SEQ ID NO: 69.
10. Composition comprenant une protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 9. ladite protéine comprenant un fragment immunogène de UspA2 choisi parmi le groupe constitué par les acides aminés 30 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 39) , les acides aminés 31 à 540 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 40) , les acides aminés 30 à 519 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 41), les acides aminés 30 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 42) et les acides aminés 31 à 564 de SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO : 43).
11. Composition immunogène comprenant une protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 5, ladite protéine comprenant un fragment immunogène de UspA2 présentant au moins 52 %, 55 %, 57 %, 62 %, 64 %, 69 %, 73 %, 76 %, 81 %, 88 % ou 100 % d'identité avec SEQ ID NO : 39.
12. Composition immunogène comprenant une protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 4, la protéine comprenant un fragment immunogène de UspA2 présentant au moins 52 %, 57 %, 62 %, 65 %, 67 %, 70 %, 73 %, 76 %, 81 %, 100 %, d'identité avec SEQ ID NO : 43.
13. Composition immunogène comprenant une protéine choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 61, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO : 65, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO : 69, SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO : 73 et SEQ ID NO : 88.
14. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 comprenant en outre au moins un antigène de Haemophilus influenzae.
15. Composition immunogène selon la revendication 14, dans laquelle le au moins un antigène est la protéine D.
16. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 10 à 15 comprenant en outre la protéine E.
17. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 10 à 16 comprenant en outre la PilA.
18. Composition immunogène selon la revendication 17, dans laquelle la PE et la PilA sont présentes sous la forme d'une protéine de fusion.
19. Vaccin comprenant la protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 9 ou la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes 10 à 18 et l'adjuvant AS01E
20. Vaccin comprenant l'adjuvant AS01E et une composition immunogène dans lequel la composition immunogène contient une protéine de SEQ ID NO : 69, la protéine D et une protéine de fusion PE-PilA.
21. Vaccin selon la revendication 19, dans lequel la protéine de fusion PE-PilA est LVL-735.
22. Vaccin selon la revendication 20, dans lequel la protéine de fusion PE-PilA est LVL-735.
23. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, pour utilisation dans le traitement ou la prévention de l'otite moyenne chez un sujet qui en a besoin.
24. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, pour utilisation dans le traitement ou de prévention des exacerbations aiguës de la bronchopneumopathie chronique obstructive (EABPCO) chez un sujet qui en a besoin
25. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 ou vaccin selon l'uné quelconque des revendications 19 à 22, pour utilisation dans le traitement ou la prévention de la pneumonie chez un sujet qui en a besoin.
26. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 10 à 18 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, pour utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection ou d'une maladie due à M. catarrhalis chez un sujet qui en a besoin.