JP2017507181A - Ｕｓｐａ２タンパク質構築物およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、モラクセラ・カタラーリス（Ｍ．カタラーリス）偏在表面タンパク質Ａ２（ＵｓｐＡ２）を含んでなる組成物に関する。より詳しくは、本出願は、ＵｓｐＡ２タンパク質構築物および前記構築物を含んでなる免疫原性組成物、そのような免疫原性組成物を含んでなるワクチン、およびそれらの治療的使用に関する。本発明はさらに、ＵｓｐＡ２をインフルエンザ菌由来の少なくとも１つの抗原と組み合わせて含んでなる組成物、前記抗原を含んでなる免疫原性組成物、そのような免疫原性組成物を含んでなるワクチンおよびそれらの治療的使用に関する。

Description

本発明は、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis, M. cat.)偏在表面タンパク質Ａ２（ＵｓｐＡ２）を含んでなる組成物に関する。より詳しくは、本出願は、ＵｓｐＡ２タンパク質構築物および前記構築物を含んでなる免疫原性組成物、そのような免疫原性組成物を含んでなるワクチンおよびそれらの治療的使用に関する。

偏在表面タンパク質Ａ２（ＵｓｐＡ２）は、電子顕微鏡写真でロリポップ型構造として見られる三量体オートトランスポーターである(Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000))。ＵｓｐＡ２は、Ｎ末端頭部と、それに続く両親媒性ヘリックスで終わる軸、およびＣ末端膜ドメインから構成される(Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000))。ＵｓｐＡ２は、極めてよく保存されたドメインを含み(Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000))、これがマウスモラクセラ・カタラーリス抗原投与モデルにおいて受動伝達時に保護が示されたモノクローナル抗体により認識される(Helminnen et al. J Infect Dis. 170(4): 867-72 (1994))。

ＵｓｐＡ２は、宿主構造ならびにフィブロネクチン(Tan et al., J Infect Dis. 192(6): 1029-38 (2005))およびラミニン(Tan et al., J Infect Dis. 194(4): 493-7 (2006))のような細胞外基質タンパク質と相互作用することが示されており、それがモラクセラ・カタラーリス感染の初期段階で役割を果たす可能性のあることが示唆される。

ＵｓｐＡ２はまた、正常なヒト血清の殺菌活性を妨害するモラクセラ・カタラーリスの能力にも関与していると思われる(Attia AS et al. Infect Immun 73(4): 2400-2410 (2005))。ＵｓｐＡ２は、（ｉ）補体阻害因子Ｃ４ｂｐと結合して、モラクセラ・カタラーリスが古典的補体系を阻害することを可能とし、（ｉｉ）血清からＣ３を吸収することにより第二補体経路の活性化を妨げ、（ｉｉｉ）補体調節タンパク質ビトロネクチンと結合することにより、補体系の最終段階である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）と相互作用する(de Vries et al., Microbiol Mol Biol Rev. 73(3): 389-406 (2009))。

モラクセラ・カタラーリスは、重要かつ一般的な呼吸器系病原体であり、成人の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）において増悪の高いリスクと関連付けられている(Sateesh et al., Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006))。

モラクセラ・カタラーリスに対するワクチンの必要がある。

第１の態様として、本発明は、式（Ｉ）
Ａ−（Ｒ_１）_ｍ−（Ｂ）_ｎ（式Ｉ）
［式中、
Ａは、モラクセラ・カタラーリス由来のＵｓｐＡ２またはその免疫原性フラグメントであり；
Ｒ_１は、アミノ酸であり；
ｍは、０、１または２であり；
Ｂは、ヒスチジンであり；かつ
ｎは、０、１、２、３、４、５または６である］
のタンパク質を提供する。

第２の態様として、本発明は、式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物を提供する。前記組成物は、薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなる。前記組成物は賦形剤を含んでなり得る。

第３の態様では、本発明は、完全にまたは部分的にモラクセラ・カタラーリスにより引き起こされる病態または疾患の治療または予防方法を提供する。前記方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

第４の態様では、本発明は、中耳炎の治療または予防方法を提供する。前記方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

第５の態様では、本発明は、慢性閉塞性肺疾患の増悪の治療または予防方法を提供する。前記方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

第６の態様では、本発明は、肺炎の治療または予防方法を提供する。前記方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

第７の態様では、本発明は、完全にまたは部分的にモラクセラ・カタラーリスにより引き起こされる病態または疾患の治療または予防における使用のための、式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなり得る。

第８の態様では、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。

第９の態様では、本発明は、本発明の核酸を生産する方法を提供する。

第１０の態様では、本発明は、モラクセラ・カタラーリス由来の少なくとも１つの抗原とインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来の少なくとも１つの抗原とを含んでなる組成物を提供する。前記組成物は、薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなり得る。前記組成物は賦形剤を含んでなり得る。

さらなる態様では、本発明は、完全にまたは部分的にモラクセラ・カタラーリスおよび／またはインフルエンザ菌により引き起こされる病態または疾患の治療または予防方法を提供する。前記方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

さらなる態様において、本発明は、慢性閉塞性肺疾患の増悪の治療または予防方法を提供する。前記方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質と治療上有効な量のインフルエンザ菌由来の少なくとも１つの抗原を投与することを含んでなる。

本発明はまた、完全にまたは部分的にモラクセラ・カタラーリスにより引き起こされる病態または疾患の治療または予防における使用のための式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を、インフルエンザ菌由来の少なくとも１つの抗原と組み合わせて含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなり得る。

本発明のさらなる態様を、以下の特定の実施形態の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲に記載する。

高細胞密度誘導(High Cell Density Induction)（ＨＣＤＩ）法を用いた場合の典型的な発酵特性および２０Ｌ規模の流加発酵中にモニタリングしたパラメーター。 低細胞密度誘導(Low Cell Density Induction)（ＬＣＤＩ）法を用いた場合の典型的な発酵特性および２０Ｌ規模の流加発酵中にモニタリングしたパラメーター。 発酵槽で評価したタンパク質構築物ＭＣ−００１、ＭＣ−００２、ＭＣ−００４、ＭＣ−００５、ＭＣ−００６、ＭＣ−００７、ＭＣ−００８およびＭＣ−０１０からのＵｓｐＡ２収量；表４からのデータ。 沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００５の分子量分布。大部分のタンパク質は三量体として見られ、三量体の二量体に相当し得る高分子量オリゴマーを小さな割合で含む。ＭＷ＝分子量。ｋＤａ＝キロダルトン。 沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００１の分子量分布。大部分のタンパク質は三量体として見られる。 沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００１の分子量分布。サンプルは多種類を示し、極めて多分散である。検出された主要種の沈降係数は、他のロットで通常検出される三量体の沈降係数に相当しない。 沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００１の分子量分布。大部分のタンパク質は三量体として見られる。 沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００７の分子量分布。大部分のタンパク質は三量体として見られる。 タンパク質二次構造の指標を与えるＵｓｐＡ２構築物のＦａｒ−ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル。 熱によるＭＣ−００５（ＵｓｐＡ２デルタヘリックス＋６Ｈｉｓ）のアンフォールディングの際の円偏光二色性（ＣＤ）による二次構造のモニタリング。スペクトルの視覚分析は、タンパク質は３３℃でその二次構造の大部分を失うことを明らかに示す。 熱によるＭＣ−００７（ＵｓｐＡ２完全ヘリックス＋６Ｈｉｓ）のアンフォールディングの際の円偏光二色性（ＣＤ）による二次構造のモニタリング。スペクトルの視覚分析は、二次構造の消失はヘリックスを持たない構築物に比べて緩慢であることを示す。構造変化は３３℃まで加熱すると検出可能となるが、完全なアンフォールディングは３５℃〜３７℃の間で起こると思われる。 ＭＣ−００１ロットｏｐｔ−０１のＭＡＬＤＩスペクトル。５７４２７Ｄａに見られた質量は脱メチオニル化タンパク質に一致していると言え、５７６２０Ｄａのピークは完全なタンパク質に相当していると言える。 ＭＣ−０１１ロットＢＭＰ３７のＭＡＬＤＩスペクトル。見られた質量は脱メチオニル化タンパク質に一致していると言える。＋１８６Ｄａおよび＋３６６Ｄａの他の２つのピークは同定されていない。 肺定着のマウスモデルにおけるＭＣ−００１およびＭＣ−００７の保護有効性。 マウスにおける筋肉内投与後に誘導されるＵｓｐＡ２に対する抗体応答、ここで、ＰＩＩおよびＰＩＩＩはそれぞれ２８日目（ＩＩ後）および４２日目（ＩＩＩ後）に採集された血清中の抗ＩｇＧレベルを示す。 同系統に対して異なるアジュバント（ＡＳ０１_Ｅ、ＡＳ０４_ＣおよびＡｌＰＯ_４）を用いて処方されたＵｓｐＡ２の殺菌力価。 マウスにおいて抗原およびアジュバントの種々の処方物を用いた筋肉内投与後に誘導されるＵｓｐＡ２に対する抗体応答。 同系統に対して抗原およびアジュバントの種々の処方物を用いてＵｓｐＡ２により誘導された殺菌力価。 マウスにおいて異なるアジュバントを用いて処方されたＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２ワクチン（三価ＮＴＨｉ−Ｍ．ｃａｔ．ワクチン）により誘導されたＰＤに対するＩｇＧ応答。 マウスにおいて異なるアジュバントを用いて処方されたＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２ワクチン（三価ＮＴＨｉ−Ｍ．ｃａｔ．ワクチン）により誘導されたＰＥに対するＩｇＧ応答。 マウスにおいて異なるアジュバントを用いて処方されたＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２ワクチン（三価ＮＴＨｉ−Ｍ．ｃａｔ．ワクチン）により誘導されたＰｉｌＡに対するＩｇＧ応答。 ＡＳ０１Ｅを含む二価ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡおよび三価ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２処方物におけるＰＥの免疫原性。 ＡＳ０１Ｅを含む二価ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡおよび三価ＰＥ−ＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２処方物におけるＰｉｌＡの免疫原性。 ＡＳ０１Ｅを含む二価ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡおよび三価ＰＥ−ＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２処方物におけるＰＤの免疫原性。 熱失活Ｍ． ｃａｔ．に予め感作させたマウス肺に及ぼす四価ＰＤ／ＰＥＰｉｌＡ／ＵｓｐＡ２／ＡＳ０１_Ｅワクチン処方物の影響−ＰＢＳ免疫マウスにおける血管周囲炎および細気管支周囲炎。 熱失活Ｍ． ｃａｔ．に予め感作させたマウス肺に及ぼす四価ＰＤ／ＰＥＰｉｌＡ／ＵｓｐＡ２／ＡＳ０１_Ｅクチン処方物の影響−免疫誘導後２日目。 熱失活Ｍ． ｃａｔ．に予め感作させたマウス肺に及ぼす四価ＰＤ／ＰＥＰｉｌＡ／ＵｓｐＡ２／ＡＳ０１_Ｅクチン処方物の影響−免疫誘導後７日目。 熱失活Ｍ． ｃａｔ．に予め感作させたマウス肺に及ぼす四価ＰＤ／ＰＥＰｉｌＡ／ＵｓｐＡ２／ＡＳ０１_Ｅクチン処方物の影響−免疫誘導後１４日目。 熱失活Ｍ． ｃａｔ．に予め感作させたマウス肺に及ぼす四価ＰＤ／ＰＥＰｉｌＡ／ＵｓｐＡ２／ＡＳ０１_Ｅクチン処方物の影響−詳細な結果。 ワクチン接種後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＬ１７発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 ワクチン接種後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＴＮＦα発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 ワクチン接種後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＦＮγ発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 ワクチン接種後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＬ１３発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 抗原投与後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＬ１７発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 抗原投与後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＴＮＦα発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 抗原投与後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＦＮγ発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。 抗原投与後の、Ｍ． ｃａｔ． ＷＣ再刺激実施例の肺ＣＤ４ Ｔ細胞応答。ＩＬ１３発現肺ＣＤ４細胞。熱失活Ｍ． ｃａｔ全細胞（ＷＣ）または培地で再刺激。

本明細書でそうではないことが説明および定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。例えば、分子生物学の一般用語の定義はBenjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。

単数の用語「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、文脈がそうではないことを明示しない限り、「および」を含むものとする。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示される総ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および総ての分子量または分子質量値は概数であり、記述のために提供されるものであることが理解されるべきである。加えて、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して示される数値限界も概数であり得る。よって、濃度が（例えば）およそ２００ｐｇであることが示される場合、その濃度は（「約」または「〜」）２００ｐｇより若干大きいまたは若干小さい値を含むことが意図される。

本明細書に記載されるものと類似または等価な方法および材料も本開示の実践または試験に使用可能であるが、好適な方法および材料を以下に記載する。

「含んでなる(comprises)」という用語は、「含む(includes)」を意味する。従って、文脈がそうではないことを必要としない限り、「含んでなる(comprises)」という語および変形形態(compriseおよびcomprisingなど）は、記載された化合物もしくは組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）もしくは工程、または化合物もしくは工程の群を包含するが、他のいずれの化合物、組成物、工程、またはそれらの群も排除しないことを意味するものと理解される。略語「e.g.」はラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では限定されない例を示すために使用される。よって、略語「e.g.」は、用語「for example」と同義である。

本開示の種々の実施形態の検討を容易にするために、以下の用語の説明を提供する。その他の用語および説明は本開示の中で示される。

「対象」は、本明細書で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ならびに齧歯属のメンバー（限定されるものではないが、マウスおよびラットを含む）およびウサギ目のメンバー（限定されるものではないが、ウサギを含む）などの非霊長類哺乳動物を含む哺乳動物である。

本明細書で使用する場合、「ＵｓｐＡ２」は、モラクセラ・カタラーリス由来の偏在表面タンパク質Ａ２を意味する。ＵｓｐＡ２は、ＡＴＣＣ ２５２３８の配列番号１のアミノ酸配列
ならびにその全長にわたって配列番号１と少なくともまたは正確に６３％、６６％、７０％、７２％、７４％、７５％、７７％、８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなり得る、または含んでなり得る。モラクセラ・カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の３８の配列（表１、配列番号１〜配列番号３８）の比較によれば、配列番号１に示されるＵｓｐＡ２とおよそ６３％〜およそ１００％の同一性が示された。

配列番号１に記載されるＵｓｐＡ２は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜２９）、ラミニン結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸３０〜１７７）、フィブロネクチン結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５〜３１８）(Tan et al. JID 192: 1029-38 (2005))、Ｃ３結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸３０〜５３９（ＷＯ２００７／０１８４６３）、または配列番号１のアミノ酸３０〜５３９、例えば、配列番号１のアミノ酸１６５〜３１８のフラグメント(Hallstrom T et al. J. Immunol. 186: 3120-3129 (2011))、両親媒性ヘリックス（種々の推定方法を用いて特定される、例えば、配列番号１のアミノ酸５１９〜５６４または配列番号１のアミノ酸５２０〜５５９）およびＣ末端アンカードメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸５７６〜６３０(Brooks et al., Infection & Immunity, 76(11), 5330-5340 (2008))を含む。

ＵｓｐＡ２アミノ酸の差異は種々のモラクセラ・カタラーリス種で記載されている。例えば、J Bacteriology 181(13):4026-34 (1999), Infection and Immunity 76(11):5330-40 (2008) and PLoS One 7(9):e45452 (2012)参照。

ＵｓｐＡ２は、ＡＡ（アミノ酸）３０〜２９８、ＡＡ２９９〜３０２、ＡＡ３０３〜３３３、ＡＡ３３４〜３３９、ＡＡ３４９、ＡＡ３５２〜３５４、ＡＡ３６８〜４０３、ＡＡ４４１、ＡＡ４５１〜４７１、ＡＡ４７２、ＡＡ４７４〜４８３、ＡＡ４８７、ＡＡ４９０、ＡＡ４９３、ＡＡ５２９、ＡＡ５３２またはＡＡ５４３からなる群から選択されるいずれか１以上のアミノ酸が配列番号１と異なるアミノ酸配列からなり得る、または含んでなり得る。ＵｓｐＡ２は、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸挿入を含むという点で配列番号１と異なるアミノ酸配列からなり得る、または含んでなり得る。ＵｓｐＡ２は、配列番号２〜配列番号３８におけるアミノ酸差異のいずれか１つで配列番号１と異なるアミノ酸配列からなり得る、または含んでなり得る。例えば、配列番号１は、アミノ酸７０においてＱの代わりにＫ、アミノ酸１３５においてＧの代わりにＱおよび／またはアミノ酸２１６においてＮの代わりにＤを含み得る。

ＵｓｐＡ２は、Ｍ．カタラーリス系統ＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）２５２３８（商標）、アメリカ２９３３、アメリカ２９１２、アメリカ２９０８、フィンランド３０７、フィンランド３５３、フィンランド３５８、フィンランド２１６、オランダＨ２、オランダＦ１０、ノルウェー１、ノルウェー１３、ノルウェー２０、ノルウェー２５、ノルウェー２７、ノルウェー３６、ＢＣ５ＳＶ、ノルウェー１４、ノルウェー３、フィンランド(Finish)４１４、日本Ｚ７４７６、ベルギーＺ７５３０、ドイツＺ８０６３、アメリカＯ１２Ｅ、ギリシャＭＣ３１７、アメリカＶ１１２２、アメリカＰ４４、アメリカＶ１１７１、アメリカＴＴＡ２４、アメリカＯ３５Ｅ、アメリカＳＰ１２−６、アメリカＳＰ１２−５、スウェーデンＢＣ５、アメリカ７１６９、フィンランドＦＩＮ２３４４、アメリカＶ１１１８、アメリカＶ１１４５またはアメリカＶ１１５６由来のＵｓｐＡ２であり得る。ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれかで示されるＵｓｐＡ２であり得る。ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つのＵｓｐＡ２配列に相当する別の配列由来のＵｓｐＡ２であり得る。相当するＵｓｐＡ２配列は、種々のアルゴリズムを用いて当業者により決定され得る。例えば、ＧａｐプログラムまたはＮｅｅｄｌｅプログラムが、配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つに相当するＵｓｐＡ２配列を決定するために使用可能である。

ＵｓｐＡ２は、その全長にわたって配列番号１〜配列番号３８のいずれかと少なくとも９５％の同一性を有する配列であり得る。

ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントは、配列番号１の少なくとも４５０の連続するアミノ酸、列番号１の４９０の連続するアミノ酸配（例えば、ＭＣ−００４またはＭＣ−００５のＵｓｐＡ２フラグメント）、配列番号１の５１１の連続するアミノ酸（例えば、構築物ＭＣ−００１、ＭＣ−００２、ＭＣ−００３またはＭＣ−００４のＵｓｐＡ２フラグメント）、配列番号１の５３４の連続するアミノ酸（例えば、ＭＣ−００９またはＭＣ−０１１のＵｓｐＡ２フラグメント）または配列番号１の５３５の連続するアミノ酸（例えば、ＭＣ−００７、ＭＣ−００８またはＭＣ−０１０のＵｓｐＡ２フラグメント）の免疫原性フラグメントを含んでなる。免疫原性フラグメントは、配列番号１と結合し得る抗体を誘導し得る。

ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントは、配列番号１〜配列番号３８のいずれかの少なくとも４５０、４９０、５１１、５３４または５３５の連続するアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなり得る。ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントは、ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１、ＭＣ−００２、ＭＣ−００３、ＭＣ−００４、ＭＣ−００５、ＭＣ−００６、ＭＣ−００７、ＭＣ−００８、ＭＣ−００９、ＭＣ−０１０またはＭＣ−０１１のいずれかにおいて配列番号１のＵｓｐＡ２フラグメントに相当する配列番号２〜配列番号３８のいずれかに由来するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントを含んでなり得る。免疫原性フラグメントは、フラグメントが由来する全長配列と結合し得る抗体を誘導し得る。

ポリペプチドペア間のアラインメントは、種々のプログラムにより計算され得る。例えば、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（フリーソフトウエア；ＥＭＢＯＳＳ：The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277）からのＮｅｅｄｌｅプログラムおよびＧＣＧ（ＵＳ登録商標）パッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．）からのＧａｐプログラムが使用可能である。

ＧａｐおよびＮｅｅｄｌｅプログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453に記載のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの実装形態である。これらのプログラムは、多くの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス(Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919)を、それぞれ８および２のギャップオープンペナルティーおよびエクステンションペナルティーとともに使用している。ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス(Dayhoft et al., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, In “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352, National Biomedical Research Foundation, Washington)が使用される場合もある。

スコアリングマトリックスは、各アミノ酸が別のアミノ酸に変異する、または保存される傾向を数値で記載している。これらの数値は一般に忠実なペアワイズアラインメントもしくは多重アラインメントで、または多重アラインメントのフラグメントにさえ見られる突然変異の統計値から計算される。一般に、これらの表では、高い正の数値が同一アミノ酸のペアに関連付けられる場合、この残基の突然変異傾向は低いことが示される。逆に、高い正の数値が異なるアミノ酸のペアに関連付けられる場合には、これら２つの間の突然変異傾向が高いことを示す。そして、これは「保存的置換」と呼ばれる。

ペアワイズアラインメントで見る場合、２配列間でアラインされた同一の残基（「一致」）を観察することができる。同一性のパーセンテージは、（１）一致の数とアラインメントの長さとの間の商（例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラムの出力）、または（２）一致の数と最長配列の長さとの間の商、または（３）一致の数と最短配列との間の商、または（４）一致の数とアラインされた残基の数との間の商（例えば、Ｇａｐプログラムの出力）に１００を掛けることによって計算できる。

表８の同一性のパーセンテージは、前段落の定義（３）に従い、Ｇａｐソフトウエアにより計算されるペアワイズアラインメントを用いて計算されたものである。

本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、ワクチン、免疫治療薬、または他の抗原もしくは免疫原含有組成物とともに対象に投与された際に、その投与された抗原または免疫原に対する対象の免疫応答を増大または増強する（アジュバントの不在下で得られる免疫応答に比べて）化合物または物質を意味する。これは米国国立衛生研究所の癌研究所により、癌処置に関して、癌が再発するリスクを低くするために一次処置の後に施される追加処置として定義されている「補助療法(adjuvant therapy)」とは区別されるべきである。

本発明はさらに、保存的アミノ酸置換を含む式（Ｉ）のタンパク質を提供する。例えば、式（Ｉ）のタンパク質は、本明細書に示される配列のいずれか（例えば、配列番号１〜配列番号３８に示されるいずれかのＵｓｐＡ２配列）に記載されるモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrahlis)のＵｓｐＡ２由来の任意のアミノ酸の保存的置換を含み得る。

本明細書で使用する場合、「シグナルペプチド」は、前駆体タンパク質（一般にＮ末端にある）上に存在し、成熟タンパク質には一般に存在しない、短い（６０未満のアミノ酸、例えば、３〜６０のアミノ酸）ポリペプチドを意味する。シグナルペプチド（ｓｐ）は一般に疎水性アミノ酸に富む。シグナルペプチドは、翻訳されたタンパク質の輸送および／または膜を経た分泌を指示する。シグナルペプチドはまた、標的化シグナル、輸送ペプチド、局在シグナル、またはシグナル配列とも呼ばれることがある。例えば、シグナル配列は、共翻訳または翻訳後シグナルペプチドであり得る。

異種シグナルペプチドは、タンパク質輸送または分泌の際またはその後にシグナルペプチドペプチダーゼによりタンパク質構築物から切断され得る。例えば、シグナルペプチドペプチダーゼは、シグナルペプチドペプチダーゼＩである。「異種」シグナルペプチドは、それが天然に存在するタンパク質と会合してないものである。

本明細書で使用する場合、「処置」は、対象における病態または疾患の症状の発生の予防、対象における病態または疾患の症状の再発の予防、対象における病態または疾患の症状の再発遅延、対象における病態または疾患の症状の重篤度または頻度の低減、病態の進行の緩徐化または排除、および対象における病態または疾患の症状の部分的または全面的排除を意味する。

本明細書で使用する場合、「場合により」は、その後に記載される事象が起こっても起こらなくてもよく、起こる事象と起こらない事象の両方を含むことを意味する。

中耳炎は、３歳未満の全小児の８０％の罹患の主因である(Expert Rev. Vaccines 5:517-534 (2006))。９０％を超える小児が７歳までに中耳炎を発症する(Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003))。２０００年には、米国で中耳炎のために開業医を受診したのは１６００万人で、調剤された抗菌処方薬はおよそ１３００件であった(Pediatrics 113:1451-1465 (2004))。欧州諸国では、報告されている急性中耳炎は、商に１人当たり年間０．１２５〜１．２４の範囲にのぼる(Expert Review of Vaccines 8:1479-1500 (2009))。中耳炎は、コストのかかる感染症であり、小児が抗生物質を受容する最も多い理由である(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。細菌が急性中耳炎の原因のおよそ７０％を担い、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、無莢膜型インフルエンザ菌(non-typeable Haemophilus influenzae)（ＮＴＨｉ）、およびモラクセラ・カタラーリスが病原体として優勢である(Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006))。一部の小児は再発性および慢性中耳炎を受け、これらの中耳炎傾向にある小児は難聴および言語発達遅滞を伴った長期滲出性中耳炎を持つ(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。最近の抗生物質選択圧および肺炎球菌ワクチンの接種は、北米で、急性中耳炎を引き起こす主要生物としてβ−ラクタマーゼ産生インフルエンザ菌およびモラクセラ・カタラーリス、次いで、肺炎連鎖球菌の出現をもたらしている(Pediatr Clin N Am 60 (2013) 391-407)。

中耳炎は多因子性疾患であるので、ワクチン接種戦略を用いて中耳炎を予防することの実現可能性は疑問視されてきた(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。

チンチラモデルは中耳炎およびその予防のロバストでバリデーション済みの動物モデルである(Expert Review of Vaccines 8:1063-1082 (2009))。このチンチラモデルはヒト感染の自然経過を模擬し得るが、チンチラモデルは研究室ごとにばらつきがあり得ることを示唆している人もいる(Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003))。

様々な他の齧歯類も中耳炎の誘導に使用されており、Vaccine 26:1501-1524 (2008)にまとめられている。耳炎研究ではネズミ動物モデルがよく供試される。

細菌抗体の存在は、無莢膜型Ｈ．インフルエンザによる中耳炎からの保護に関連がある(Current Opinion in Infectious Disease 16:129-134 (2003))。しかしながら、免疫応答は、ＮＴＨｉに対して有効であるためには殺菌力がなくてもよい。単にＮＴＨｉ表面アドヘシンと反応する抗体でもチンチラの中耳炎を低減または排除できる(Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003))。

慢性閉塞性肺疾患は、肺の慢性炎症性疾患であり、世界の罹患率および死亡率の主因である。米国で２００５年には、死者２０人におよそ１人が基礎原因にＣＯＰＤを持っていた(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。２０２０年には、ＣＯＰＤは、障害調整生命年の原因の第５位、慢性廃疾(chronic invalidating diseases)、および死因の第３位にまで上昇すると予測される(Lancet 349:1498-1504 (1997))。

ＣＯＰＤの経過は空気流の制限の段階的悪化および肺機能の低下を特徴とする。ＣＯＰＤには頻発性および再発性の急性増悪（ＡＥ）が合併することがあり、莫大な医療費および高い罹患率が伴う(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554−564 (2007))。ある研究では、ＣＯＰＤの症状の急性増悪のおよそ５０％が無莢膜型インフルエンザ菌、モラクセラ・カタラーリス、肺炎連鎖球菌、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)により引き起こされることが示唆されている(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。インフルエンザ菌（Ｈ．インフルエンザ）はＣＯＰＤ増悪の２０〜３０％；肺炎連鎖球菌はＣＯＰＤ増悪の１０〜１５％；およびモラクセラ・カタラーリスはＣＯＰＤ増悪の１０〜１５％に見られる(New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008))。香港、韓国、およびフィリピンでは、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、およびモラクセラ・カタラーリスが気管支炎の急性増悪における主要病原体であることが示されているが、インドネシア、タイ、マレーシアおよび台湾を含む他のアジア諸国／地域では、クレブシェラ(Klebsiella)種、緑膿菌およびアシネトバクター(Acinetobacter)種が病原体の大きな割合を占める(Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。バングラディシュでは、ＣＯＰＤ患者の２０％がシュードモナス、クレブシェラ、肺炎連鎖球菌およびインフルエンザ菌に関して陽性痰培養を示し、一方、ＡＥＣＯＰＤ（ＣＯＰＤの急性増悪）患者の６５％がシュードモナス、クレブシェラ、アシネトバクター、エンテロバクター、モラクセラ・カタラーリスおよびそれらの組合せに関して陽性培養を示した(Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010))。しかしながら、ＣＯＰＤ増悪を予防するための２つの最も重要な手段が能動免疫と薬物療法の長期的維持であることが示唆されている(Proceedings of the American Thoraci
c Society 4:554−564 (2007))。

市中肺炎(Community-acquired pneumonia)（ＣＡＰ）は、米国では、感染性疾患からの死因の第１位および全死因の第６位と記載されている。モラクセラ・カタラーリスは北米のＣＡＰに関連する病原体の１つであり(Clin Chest Med 26 (2005) 37-55)、日本の中等度〜重度の市中肺炎に関連する病原体の１つである(J Infect Chemother. 2014 Nov 20. pii: S1341-321X(14)00396-1. doi: 10.1016/j.jiac.2014.11.006. [Epub ahead of print])。

Ｍ．カタラーリスに対する有効なワクチンの必要がある。

本発明は、式（Ｉ）
Ａ−（Ｒ_１）_ｍ−（Ｂ）_ｎ（式Ｉ）
［式中、
Ａは、モラクセラ・カタラーリス由来のＵｓｐＡ２またはその免疫原性フラグメントであり；
Ｒ_１は、アミノ酸であり；
ｍは、０または２であり；
Ｂは、ヒスチジンであり；かつ
ｎは、０、１、２、３、４、５または６である］
のタンパク質に関する。

１つの特定の実施形態では、（Ｒ_１）_ｍがＡＳ（アラニンセリン）であるＲ_１およびｍが定義される。別の実施形態では、Ｒ_１は、非天然アミノ酸である。

一実施形態では、ｍが０である式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質が定義される。一実施形態では、ｍが０である場合、ｎは２である。本発明の別の実施形態では、ｍが０である場合、ｎは０でない。

一実施形態では、ｍは２である。

１つの特定の実施形態では、ｎは、１、２および６からなる群から選択される。別の実施形態では、ｎは、２および６からなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、ｎは２である。別の実施形態では、ｎは６である。

一実施形態では、ｎは、０、１、２、および６、またはそれらの任意のサブセットからなる群から選択される。

一実施形態では、ｎは０である。別の実施形態では、ｎが０である場合、ｍは２である。

一実施形態では、ｎは１である。一実施形態では、ｎは３である。一実施形態では、ｎは４である。一実施形態では、ｎは５である。

一実施形態では、式（Ｉ）のタンパク質はアミノ末端にメチオニン（Ｍ）をさらに含む；下式：メチオニン−Ａ−（Ｒ_１）_ｍ−（Ｂ）_ｎのタンパク質。これらは本発明のタンパク質内に含まれる。１つの特定の実施形態では、ｍは０であり、ｎは０であり、式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質は、非天然タンパク質である。

一実施形態では、式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質は、非天然タンパク質である。

一実施形態では、ＡがＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２である式（Ｉ）のタンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８または配列番号１〜配列番号３８の任意のサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列に示されるＵｓｐＡ２である式（Ｉ）のタンパク質が定義される。別の実施形態では、ＡがＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２がその全長にわたって配列番号１と少なくとも６３％、６６％、７０％、７２％、７４％、７５％、７７％、８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である式（Ｉ）のが定義される。別の実施形態では、ＡがＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２が、配列番号１に示されるＵｓｐＡ２アミノ酸配列とおよそ７５％〜１００％同一である式（Ｉ）のタンパク質が定義される。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１に示されるＵｓｐＡ２アミノ酸配列とおよそ９０％〜１００％同一である。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１に示されるＵｓｐＡ２アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一である。別の実施形態では、ＡがＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２が配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つに示されるＵｓｐＡ２アミノ酸配列とおよそ７５％〜１００％同一である式（Ｉ）のタンパク質が定義される。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つに示されるＵｓｐＡ２アミノ酸配列とおよそ９０％〜１００％同一である。さらなる実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれかに示されるＵｓｐＡ２と少なくとも９５％同一である。特定の実施形態では、Ａは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＵｓｐＡ２である。

別の実施形態では、ＡがＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである式（Ｉ）のタンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａは、ＵｓｐＡ２が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８または配列番号１〜配列番号３８の任意のサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列とおよそ７５％〜１００％同一である。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１とおよそ９０％〜１００％同一である。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は配列番号１と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とおよそ７５％〜１００％同一である。別の実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つとおよそ９０％〜１００％同一である。さらなる実施形態では、ＡはＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれかと少なくとも９５％同一である。特定の実施形態では、Ａは、ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、ＵｓｐＡ２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

別の実施形態では、Ａは、配列番号１のアミノ酸３０〜５４０（配列番号３９）、配列番号１のアミノ酸３１〜５４０（配列番号４０）、配列番号１のアミノ酸３０〜５１９（配列番号４１）、配列番号１のアミノ酸３０〜５６４（配列番号４２）および配列番号１のアミノ酸３１〜５６４（配列番号４３）からなる群から選択されるＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。より具体的には、一実施形態では、Ａは、配列番号４３、すなわち、配列番号１のアミノ酸３１〜５６４である。さらなる実施形態では、Ａは、配列番号４２、すなわち、配列番号１のアミノ酸３０〜５６４である。別の実施形態では、Ａは、配列番号１のアミノ酸３０〜５４０（配列番号３９）、配列番号１のアミノ酸３１〜５４０（配列番号４０）および配列番号１のアミノ酸３０〜５１９（配列番号４１）からなる群から選択されるＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。別の実施形態では、Ａは、配列番号３９と少なくとも５２％（アメリカ２９０８）、５５％（ノルウェー２５）、５７％（日本Ｚ７４７６）、６２％（フィンランドＦＩＮ２３４４）、６４％（アメリカ２９１２）、６９％（アメリカＰ４４）、７３％（アメリカ７１６９）、７６％（ノルウェー２７）、８１％（アメリカＶ１１４５）、８８％（ドイツＺ８０６３）または１００％（スウェーデンＢＣ５）の同一性を有するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。別の実施形態では、Ａは、配列番号４３と少なくとも５２％（アメリカ２９０８）、５７％（オランダＦ１０）、６２％（アメリカ２９３３）、６５％（ギリシャＭＣ３１７）、６７％（アメリカＶ１１２２）、７０％（アメリカＰ４４）、７３％（アメリカ７１６９）、７６％（ノルウェー３）、８１％（ドイツＺ８０６３）、１００％（スウェーデンＢＣ５）の同一性を有するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。

別の実施形態では、Ａは、配列番号２〜配列番号３８に由来するＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントであり、前記フラグメントは、配列番号１のアミノ酸３０〜５４０（配列番号３９）、配列番号１のアミノ酸３１〜５４０（配列番号４０）、配列番号１のアミノ酸３０〜５１９（配列番号４１）、配列番号１のアミノ酸３０〜５６４（配列番号４２）または配列番号１のアミノ酸３１〜５６４（配列番号４３）とアラインするアミノ酸を含んでなる。一実施形態では、配列をアラインするために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを実行するＧａｐプログラム（ＧＣＧパッケージから）、またはＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳパッケージから）が使用され得る。

ＵｓｐＡ２−配列番号１

配列番号１由来のＵｓｐＡ２のアミノ酸３０〜５４０、配列番号３９

配列番号１由来のＵｓｐＡ２のアミノ酸３１〜５４０、配列番号４０

配列番号１由来のＵｓｐＡ２のアミノ酸３０〜５１９、配列番号４１

配列番号１由来のＵｓｐＡ２のアミノ酸３０〜５６４、配列番号４２

配列番号１由来のＵｓｐＡ２のアミノ酸３１〜５６４、配列番号４３

別の実施形態では、Ａは、下記アミノ酸：ＡＡ（アミノ酸）３０〜２９８、ＡＡ２９９〜３０２、ＡＡ３０３〜３３３、ＡＡ３３４〜３３９、ＡＡ３４９、ＡＡ３５２〜３５４、ＡＡ３６８〜４０３、ＡＡ４４１、ＡＡ４５１〜４７１、ＡＡ４７２、ＡＡ４７４〜４８３、ＡＡ４８７、ＡＡ４９０、ＡＡ４９３、ＡＡ５２９、ＡＡ５３２またはＡＡ５４３の１以上で配列番号１と異なるＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。別の実施形態では、Ａは、配列番号１と比較して少なくとも１個のアミノ酸挿入を含むことで配列番号１と異なるＭ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。

別の実施形態では、Ａは、ラミニン結合ドメインおよびフィブロネクチン結合ドメインを含むＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。

さらなる実施形態では、Ａは、ラミニン結合ドメイン、フィブロネクチン結合ドメインおよびＣ３結合ドメインを含むＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。

さらなる実施形態では、Ａは、ラミニン結合ドメイン、フィブロネクチン結合ドメイン、Ｃ３結合ドメインおよび両親媒性ヘリックスを含むＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである。

ラミニン結合ドメイン、フィブロネクチン結合ドメイン、Ｃ３結合ドメインまたは両親媒性ヘリックスは配列番号１に関して定義された通りであり得るか、または配列番号２〜配列番号３８のいずれか１つにおける対応する配列であり得る。

式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質は、哺乳動物、特に、ヒトなどの対象において免疫原として有用である。特に、式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質は、対象、特に、ヒトにおいてＭ．カタラーリスに対する免疫応答を誘導するのに有用である。式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質は、Ｍ．カタラーリス感染または疾患の治療または予防において有用である。より具体的には、式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質は、中耳炎および／またはＣＯＰＤおよび／またはＡＥＣＯＰＤおよび／または肺炎の治療または予防において有用である。

本発明は、Ｍ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２またはその免疫原性フラグメントを含んでなる免疫原性組成物に関する。本発明はまた、このような免疫原性組成物を含んでなるワクチンおよびそれらの治療的使用に関する。本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、Ｍ．カタラーリス感染または疾患の治療または予防に有用である。より具体的には、本発明に記載の免疫原性組成物およびワクチンは、中耳炎および／またはＣＯＰＤおよび／またはＡＥＣＯＰＤおよび／または肺炎の治療または予防に有用である。

一実施形態では、免疫原性組成物は、Ｍ．カタラーリス由来のＵｓｐＡ２を含んでなる。ＵｓｐＡ２は、配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つまたは配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のＵｓｐＡ２配列であり得る。ＵｓｐＡ２はまた、配列番号１のものと少なくとも６３％（アメリカ２９０８）、６６％（日本Ｚ７４７６）、７０％（オランダＦ１０）、７２％（フィンランド３５８）、７４％（アメリカＰ４４）、７７％（フィンランド３０７）、８０％（ノルウェー３）、８４％（アメリカＶ１１４５）、９０％（ドイツＺ８０６３）または１００％（スウェーデンＢＣ５）同一のＵｓｐＡ２配列であり得る。

別の実施形態では、免疫原性組成物は、ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントを含んでなる。ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３、または配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３のいずれか１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する配列であり得る。ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントは、配列番号３９と少なくとも５２％（アメリカ２９０８）、５５％（ノルウェー２５）、５７％（日本Ｚ７４７６）、６２％（フィンランドＦＩＮ２３４４）、６４％（アメリカ２９１２）、６９％（アメリカＰ４４）、７３％（アメリカ７１６９）、７６％（ノルウェー２７）、８１％（アメリカＶ１１４５）、８８％（ドイツＺ８０６３）または１００％（スウェーデンＢＣ５）同一のＵｓｐＡ２配列であり得る。ＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントはまた、配列番号４３と少なくとも５２％（アメリカ２９０８）、５７％（オランダＦ１０）、６２％（アメリカ２９３３）、６５％（ギリシャＭＣ３１７）、６７％（アメリカＶ１１２２）、７０％（アメリカＰ４４）、７３％（アメリカ７１６９）、７６％（ノルウェー３）、８１％（ドイツＺ８０６３）、１００％（スウェーデンＢＣ５）同一のＵｓｐＡ２配列であり得る。アミノ酸の差異は、種々のモラクセラ・カタラーリス種由来のＵｓｐＡ２で記載されている。

ＵｓｐＡ２は、ラミニン結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸３０〜１７７、配列番号４４）を含む。一実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号１のラミニン結合領域を含んでなる。さらなる実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号２〜配列番号３８のいずれか１つのラミニン結合領域を含んでなる。

配列番号１のアミノ酸３０〜１７７、配列番号４４：

ＵｓｐＡ２は、フィブロネクチン結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５〜３１８、配列番号４５）を含む。一実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号１のフィブロネクチン結合領域を含んでなる。さらなる実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号２〜配列番号３８のいずれか１つのフィブロネクチン結合領域を含んでなる。配列番号４５のフィブロネクチン結合ドメインはまた、Ｃ３結合特性も有する。

配列番号１のアミノ酸１６５〜３１８、配列番号４５：

ＵｓｐＡ２は、補体成分３（Ｃ３）結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸３０〜５３９、配列番号４６、または配列番号１のアミノ酸１６５〜３１８、配列番号４５）を含む。一実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号１のＣ３結合領域を含んでなる。さらなる実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号２〜配列番号３８のいずれか１つのＣ３結合ドメインを含んでなる。

配列番号１のアミノ酸３０〜５３９、配列番号４６：

ＵｓｐＡ２は、両親媒性ヘリックス（例えば、配列番号１アミノ酸の５１９〜５６４または配列番号１のアミノ酸５２０〜５５９）を含む。一実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号１のアミノ酸５１９〜５６４を含んでなる。別の実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号１のアミノ酸５２０〜５５９を含んでなる。さらなる実施形態では、ＵｓｐＡ２のフラグメントは、配列番号２〜配列番号３８のいずれか１つの両親媒性ヘリックスを含んでなる。

一実施形態では、免疫原性組成物は、Ａが、ラミニン結合ドメインおよびフィブロネクチン結合ドメインを含んでなるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、式（Ｉ）のタンパク質を含んでなる。

さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、Ａが、ラミニン結合ドメイン、フィブロネクチン結合ドメインおよびＣ３結合ドメインを含んでなるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、式（Ｉ）のタンパク質を含んでなる。

さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、Ａが、ラミニン結合ドメイン、フィブロネクチン結合ドメイン、Ｃ３結合ドメインおよび両親媒性ヘリックスを含んでなるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、式（Ｉ）のタンパク質を含んでなる。

別の実施形態では、免疫原性組成物は、式（Ｉ）によって定義されるタンパク質を含んでなる。免疫原性組成物は、例えば、アミノ末端に付加的メチオニンを有する式（Ｉ）のタンパク質を含み得る。

一実施形態では、本免疫原性組成物は、他の抗原とともに投与されてよい。例えば、本免疫原性組成物は、Ｈ．インフルエンザ由来の抗原とともに投与されてよい。例えば、式（Ｉ）のタンパク質は、Ｈ．インフルエンザ由来のタンパク質Ｄ（ＰＤ）とともに投与されてよい。タンパク質ＤはＷＯ９１／１８９２６に記載の通りであり得る。本免疫原性組成物は、Ｈ．インフルエンザ由来のタンパク質Ｅ（ＰＥ）およびピリンＡ（ＰｉｌＡ）とともに投与されてよい。タンパク質ＥおよびピリンＡはＷＯ２０１２／１３９２２５に記載の通りであり得、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。タンパク質 ＥおよびピリンＡは、融合タンパク質として提供されてもよい。

別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、それもまた中耳炎、ＣＯＰＤ、ＡＥＣＯＰＤまたは肺炎を引き起こすことが知られている他の細菌の由来する付加的抗原とともに投与されてよい。

所望の治療効果または生物学的効果を達成するために必要とされる免疫原性組成物の量は、それが意図される使用、投与の手段、レシピエントならびに処置される病態のタイプおよび重篤度などのいくつかの因子によって決まり、最終的には担当の医師または獣医の裁量下にある。一般に、ヒトにおいて完全にまたは部分的にＭ．カタラーリスにより引き起こされる病態の処置に典型的な用量は、例えば、約０．００１ｍｇ〜０．１２０ｍｇの範囲にあると予想され得る。より具体的には、ヒトにおいて完全にまたは部分的にＭ．カタラーリスにより引き起こされる病態の処置に典型的な用量は、約０．００３ｍｇ〜約０．０３ｍｇのタンパク質の範囲にあり得る。本発明は、完全にまたは部分的にＭ．カタラーリスにより引き起こされる病態または疾患の治療または予防における使用のための、式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は付加的抗原を含んでよく、ヒトにおいて完全にまたは部分的にＨ．インフルエンザにより引き起こされる病態の処置に典型的な用量は、各付加的抗原について約０．００５ｍｇ〜約０．０５ｍｇの範囲にあり得る。この用量は単一の単位用量として投与されてよい。また、数回の分離した単位用量が投与されてもよい。例えば、分離した単位用量を、生後１年以内に分離したプライミング用量として、一定間隔で（例えば、１年、５年または１０年ごとに）与えられる分離したブースター用量として投与してもよい。本発明はまた、完全にまたは部分的にモラクセラ・カタラーリスにより引き起こされる病態または疾患の治療または予防における使用のための式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を、インフルエンザ菌に由来する少なくとも１つの抗原と組み合わせて含んでなる免疫原性組成物を提供する。

本発明の免疫原性組成物を含んでなる処方物は、適当な経路、例えば、筋肉内、舌下、経皮、皮内または鼻腔内経路による投与に適合させることができる。このような処方物は、当技術分野で公知の任意の方法により調製され得る。

本発明の免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含んでなり得る。用語「アジュバント」が本明細書で使用される場合、それは組成物の免疫原性成分に対する患者の免疫応答を増強するために免疫原性組成物とともに投与される物質を意味する。

好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルまたはリン酸アルミニウムまたはミョウバンなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、マグネシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシンもしくはアシル化糖、陽イオン的にまたは陰イオン的に誘導体化された糖類、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。一実施形態では、タンパク質は、リン酸アルミニウムに吸着させてもよい。別の実施形態では、タンパク質は、水酸化アルミニウムに吸着させてもよい。第３の実施形態では、ミョウバンをアジュバントとして使用してもよい。

優勢なＴｈ１応答を促進する好適なアジュバント系としては、脂質Ａの非毒性誘導体、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）またはその誘導体、特に、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その製法についてはＧＢ２２２０２１１Ａを参照）；およびモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）または水中油型エマルションのいずれかとの組合せが含まれる。このような組合せでは、抗原および３Ｄ−ＭＰＬは同じ粒子構造に含まれ、抗原性シグナルと免疫刺激性シグナルのより効果的な送達を可能とする。研究によれば、３Ｄ−ＭＰＬがミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらにことが示されている(Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1)。

ＡＳ０１は、ＭＰＬ（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ）、ＱＳ２１（シャボンノキ(Quillaja saponaria Molina)、画分２１）Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）およびリポソームを含有するアジュバント系である。ＡＳ０１Ｂは、ＭＰＬ、ＱＳ２１およびリポソーム（５０μｇ ＭＰＬおよび５０μｇ ＱＳ２１）を含有するアジュバント系である。ＡＳ０１Ｅは、ＭＰＬ、ＱＳ２１およびリポソーム（２５μｇ ＭＰＬおよび２５μｇ ＱＳ２１）を含有するアジュバント系である。一実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、ＡＳ０１を含んでなる。別の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、ＡＳ０１ＢまたはＡＳ０１Ｅを含んでなる。特定の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、ＡＳ０１Ｅを含んでなる。

ＡＳ０２は、油／水エマルション中にＭＰＬおよびＱＳ２１を含有するアジュバント系である。ＡＳ０２Ｖは、油／水エマルション中にＭＰＬおよびＱＳ２１（５０μｇ ＭＰＬおよび５０μｇ ＱＳ２１）を含有するアジュバント系である。

ＡＳ０３は、油／水（ｏ／ｗ）エマルション中にα−トコフェロールおよびスクアレンを含有するアジュバント系である。ＡＳ０３_Ａは、ｏ／ｗエマルション中にα−トコフェロールおよびスクアレン（１１．８６ｍｇトコフェロール）を含有するアジュバント系である。ＡＳ０３_Ｂは、ｏ／ｗエマルション中にα−トコフェロールおよびスクアレン（５．９３ｍｇトコフェロール）を含有するアジュバント系である。ＡＳ０３_Ｃは、ｏ／ｗエマルション中にα−トコフェロールおよびスクアレン（２．９７ｍｇトコフェロール）を含有するアジュバント系である。一実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、ＡＳ０３を含んでなる。

ＡＳ０４は、アルミニウム塩（５００μｇ Ａｌ^３＋）に吸着されたＭＰＬ（５０μｇ ＭＰＬ）を含有するアジュバント系である。一実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、ＡＳ０４を含んでなる。

ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの使用を含む系がＷＯ９４／００１５３に開示されている。ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされる組成物がＷＯ９６／３３７３９に開示されている。水中油エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含むさらなるアジュバント処方物がＷＯ９５／１７２１０に記載されている。一実施形態では、免疫原性組成物はサポニンをさらに含んでなり、これはＱＳ２１であり得る。処方物はまた、水中油エマルションおよびトコフェロール（ＷＯ９５／１７２１０）を含んでなってもよい。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５）および他の免疫調節オリゴヌクレオチド（ＷＯ０２２６７５７およびＷＯ０３５０７８２２）もＴＨ１応答の好ましい誘導物質であり、本発明における使用に好適である。

さらなるアジュバントとしては、金属塩、水中油エマルション、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（特に、Ｔｏｌｌ様受容体２アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体３アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体４アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体７アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体８アゴニストおよびＴｏｌｌ様受容体９アゴニスト）、サポニンまたはそれらの組合せの群から選択されるものがある。

本発明は、式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質とアジュバントを合わせることを含んでなる免疫原性組成物の調製方法を提供する。

本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物と薬学上許容可能なアジュバントとを含有するワクチンを提供する。

可能性のある賦形剤としては、アルギニン、プルロニック酸および／またはポリソルベートが含まれる。好ましい実施形態では、ポリソルベート８０（例えば、ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）８０）が使用される。さらなる実施形態では、終濃度約０．０３％〜約０．０６％が使用される。具体的には、終濃度約０．０３％、０．０４％、０．０５％または０．０６％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）が使用され得る。

本発明は、式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質と薬学上許容可能な賦形剤を合わせることを含んでなる免疫原性組成物またはワクチンの調製方法を提供する。

本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。用語「核酸」は、ポリマー形態のヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの修飾形態であり得る。この用語は、一本鎖型および二本鎖型のＤＮＡを含む。これらの核酸は好ましくは他の核酸を実質的に含まない。

本発明は、本発明の核酸を生産する方法を提供する。本発明の核酸は当業者に公知の方法により生産され得る。例えば、本発明の核酸は部分的または完全に合成可能である。核酸は、アミノ酸の消化またはより短いアミノ酸の連結によって作製されてもよい。

本発明は、中耳炎の治療または予防方法を提供する。この方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

本発明は、慢性閉塞性肺疾患の増悪の治療または予防方法を提供する。ＣＯＰＤの増悪は急性増悪であり得る。この方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

本発明は、肺炎の治療または予防方法を提供する。この方法は、必要とする対象に治療上有効な量の式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を投与することを含んでなる。

本発明は、完全にまたは部分的にモラクセラ・カタラーリスにより引き起こされる病態または疾患の治療または予防において使用するための式（Ｉ）のタンパク質または本発明のタンパク質を含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学上許容可能なアジュバントをさらに含んでなってもよい。

本発明は、Ｍ．カタラーリス感染または疾患の治療または予防用薬剤の製造のための、（ａ）式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質、（ｂ）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物、または（ｃ）（ｃ１）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質、または（ｃ２）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物を含んでなるワクチンの使用を提供する。

本発明は、中耳炎の治療または予防用薬剤の製造のための、（ａ）式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質、（ｂ）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物、または（ｃ）（ｃ１）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質、または（ｃ２）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物を含んでなるワクチンの使用を提供する。

本発明は、慢性閉塞性肺疾患（ＡＥＣＯＰＤ）の急性増悪の治療または予防用薬剤の製造のための、（ａ）式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質、（ｂ）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物、または（ｃ）（ｃ１）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質、または（ｃ２）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物を含んでなるワクチンの使用を提供する。

本発明は、肺炎の治療または予防用薬剤の製造のための、（ａ）式（Ｉ）のタンパク質および本発明のタンパク質、（ｂ）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物、または（ｃ）（ｃ１）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質、または（ｃ２）式（Ｉ）のタンパク質もしくは本発明のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物を含んでなるワクチンの使用を提供する。

以下の実施例は単に例示を意図し、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

実施例では、以下の用語は示された意味を有する。
６ｘｈｉｓ ＝ ６ヒスチジン；
ｘｇ ＝ 遠心力（数値重）；
ＡＳ ＝ アラニンセリン；
ＢＳＡ ＝ ウシ血清アルブミン；
℃ ＝ 摂氏度；
ＣａＣｌ_２ ＝ 塩化カルシウム；
ＣＤ ＝ 円偏光二色性；
ＣＨＣｌ_３ ＝ クロロホルム；
ＣＨ_３ＣＮ ＝ アセトニトリル；
ＣＯ_２ ＝ 二酸化炭素；
Ｄａ ＝ ダルトン；
ＤＮＡ ＝ デオキシリボ核酸；
ＤＯ ＝ 溶存酸素；
ＤＳＣ ＝ 示差走査熱量測定；
ＥＤＴＡ ＝ エチレンジアミン四酢酸；
ｈ ＝ 時間；
Ｈ_２Ｏ ＝ 水；
Ｈ_２Ｏ_２ ＝過酸化水素；
ＨＣＤＩ ＝ 高細胞密度誘導；
ＨＣｌ ＝ 塩化水素；
Ｈｉｓ ＝ ｈｉｓ ＝ヒスチジン；
ＩＭＡＣ ＝ 固定化金属アフィニティークロマトグラフィー；
ＩＰＴＧ ＝ イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド；
ｋＶｏｌｔｓ ＝ キロボルト；
Ｌ ＝ リットル；
ＬＢ ＝ Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ；
ＬＣＤＩ ＝ 低細胞密度誘導；
ＭｅＯＨ ＝ メタノール；
ｍｌ ＝ ミリリットル；
ＮａＣｌ ＝ 塩化ナトリウム；
ＲＰＭ ＝ ｒｐｍ ＝ 回転／分；
ｍｉｎ ＝ 分；
ｍＭ ＝ ミリモル；
μｇ ＝ マイクログラム；
μＬ ＝ マイクロリットル；
ＭＷ ＝ 分子量；
ｍ／ｚ ＝ 質量／電荷；
ＮａＣｌ ＝ 塩化ナトリウム；
ＮａＰＯ_４ ＝ リン酸ナトリウム；
ｎｇ ＝ ナノグラム；
ＮＨ_４ＯＨ ＝ 水酸化アンモニウム；
ｎｍ ＝ ナノメーター；
Ｏ．Ｄ． ＝ 光学密度；
ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝生理食塩水；
ＰＣＲ ＝ ポリメラーゼ連鎖反応；
ｐｓｉ ＝ ポンド／平方インチ；
ＰＶＤＦ ＝ ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidence diluoride)；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＝ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；
ＴＦＡ ＝ トリフルオロ酢酸；
Ｔｍ ＝ 融点；
Ｔｍ_１ ＝ 第１融点；
Ｔｍ_２ ＝ 第２融点；
ｗ／ｖ ＝ 重量／容量

実施例１：タンパク質構築物
タンパク質構築物は、ＵｓｐＡ２の種々のフラグメントを用い、付加的アミノ酸を伴って、また、伴わずに作製した。下表に作製したタンパク質構築物を記載する。

表２に列挙した各タンパク質構築物のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す。

タンパク質構築物配列：
ＭＣ−００１（ＤＮＡ）−配列番号５２

ＭＣ−００１（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５４０）（ＡＳＨＨＨＨＨＨ）配列番号５３

ＭＣ−００２（ＤＮＡ）−配列番号５４

ＭＣ−００２（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５４０）配列番号５５

配列番号５６

配列番号５７

ＭＣ−００３（ＤＮＡ）−配列番号８７

ＭＣ−００３（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５４０）（Ｈ）−配列番号８８

ＭＣ−００４（ＤＮＡ）−配列番号５８

ＭＣ−００４（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５４０）（ＨＨ）配列番号５９

ＭＣ−００５（ＤＮＡ）−配列番号６０

ＭＣ−００５（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５１９）（ＡＳＨＨＨＨＨＨ）配列番号６１

ＭＣ−００６（ＤＮＡ）−配列番号６２

ＭＣ−００６（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５１９）配列番号６３

ＭＣ−００７（ＤＮＡ）−配列番号６４

ＭＣ−００７（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５６４）（ＡＳＨＨＨＨＨＨ）配列番号６５

ＭＣ−００８（ＤＮＡ）−配列番号６６

ＭＣ−００８（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２ ３０−５６４）（ＨＨ）配列番号６７

ＭＣ−００９（ＤＮＡ）−配列番号６８

ＭＣ−００９（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２ ３１〜５６４）（ＨＨ）配列番号６９

ＭＣ−０１０（ＤＮＡ）−配列番号７０

ＭＣ−０１０（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３０〜５６４）配列番号７１

ＭＣ−０１１（ＤＮＡ）−配列番号７２

ＭＣ−０１１（タンパク質）−（Ｍ）（ＵｓｐＡ２アミノ酸３１〜５４０）（ＡＳＨＨＨＨＨＨ）配列番号７３

ベクター構築および形質転換

ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のＵｓｐＡ２のＤＮＡ配列−配列番号７４

ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のＵｓｐＡ２のタンパク質配列−上記の配列番号１

ベクター構築
構築物ＭＣ−００１を作製するために、クローニングを助けるためのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位（開始メチオニンはＮｄｅＩ部位によりコードされる）ならびにＡＳ（アラニンセリン）アミノ酸リンカーおよび６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を含む、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５４０）をコードするＤＮＡフラグメントは、ＧＥＮＥＡＲＴ（ＵＳ登録商標）によってコドンが最適化され（非天然）、合成された。コドンが最適化されたとは、最適な発現のために大腸菌(Escherichia coli)でのコドン使用頻度とより良く適合するように、アミノ酸配列を変化させずにヌクレオチド配列が天然配列から変化されたことを意味する。ＵｓｐＡ２フラグメントは、標準的な方法に従い、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＥＴ−２６ｂ発現ベクターにクローニングした。

ＭＣ−００２、ＭＣ−００３、およびＭＣ−００４構築物を作製するために、鋳型としてのＭＣ−００１構築物、それぞれプライマーＵｓｐＡ２Ｎｄｅ ｏｐｔ（メチオニン開始コドンを含む）、およびプライマーＵｓｐＡ２ｏｐｔ ｄｅｌｔａ Ｈｉｓ、Ａ２ｏｐｔ １Ｈｉｓ ｄｅｌｔａ ＡＳ、およびＡ２ｏｐｔ ２Ｈｉｓ ｄｅｌｔａ ＡＳを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５４０）を増幅した。ＵｓｐＡ２フラグメントを、標準的な方法に従い、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＥＴ−２６ｂ発現ベクターにクローニングした。

構築物ＭＣ−００５を作製するために、鋳型としてのＭＣ−００１ベクターを、プライマーＵｓｐＡ２Ｎｄｅ ｏｐｔ（メチオニン開始コドンを含む）およびＲ ｄｅｌｔａ ｈａｉｒｐｉｎ Ａ２ｏｐｔ Ｈｉｓを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５１９）を増幅した。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＸｈｏＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。さらに、ＡＳアミノ酸リンカーおよび６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマーに組み込んだ。次に、作製されたＰＣＲ産物をｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標））に挿入した。

構築物ＭＣ−００６を作製するために、鋳型としてのＭＣ−００５構築物を、プライマーＵｓｐＡ２Ｎｄｅ ｏｐｔ（メチオニン開始コドンを含む）およびデルタＨｉｓ ｄｅｌｔａ ｈｅｌｉｃｅとともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５１９）を増幅した。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＸｈｏＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。次に、作製されたＰＣＲ産物をｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標））に挿入した。

構築物ＭＣ−００７を作製するために、クローニングを助けるためのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位（開始メチオニンはＮｄｅＩ部位によりコードされる）ならびにＡＳアミノ酸リンカーおよび６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を含む、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５６４）をコードするＤＮＡフラグメントは、ＧＥＮＥＡＲＴ（ＵＳ登録商標）によってコドンが最適化され、合成された（プラスミド：１０２６３９９）。このＵｓｐＡ２フラグメントを、標準的な方法に従い、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いて、ｐＥＴ−２６ｂ発現ベクタークローニングした。

構築物ＭＣ−００８を作製するために、鋳型としてのＭＣ−００７構築物を、プライマーＵｓｐＡ２Ｎｄｅ ｏｐｔ（メチオニン開始コドンを含む）および２Ｈｉｓ ｈｅｌｉｃｅ ｄｅｌｔａ ＡＳとともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５６４）を増幅した。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＸｈｏＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。次に、作製されたＰＣＲ産物をｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標））に挿入した。

構築物ＭＣ−００９を作製するために、鋳型としての１０２６３９９プラスミドおよびプライマーＮ−ｔｅｒｍ ｃｙｔｏ Ａｂｉｓ（メチオニン開始コドンを含む）および２Ｈｉｓ ｈｅｌｉｃｅ ｄｅｌｔａ ＡＳを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来アミノ酸３１〜５６４）を増幅した。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を、グルタミン欠失を含む５’プライマーに組み込み、ＸｈｏＩ制限部位を、２個のヒスチジン残基３’プライマーに組み込んだ。次に、作製されたＰＣＲ産物をｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標））に挿入した。最終構築物のＤＮＡシーケンシングを行って適正な配列を確認した。

構築物ＭＣ−０１０を作製するために、鋳型としてのＭＣ−００７構築物を、プライマーＵｓｐＡ２ Ｎｄｅ ｏｐｔ（メチオニン開始コドンを含む）およびｃｙｔｏ ｈｅｌｉｃｅ ｄＨｉｓ ｄＡＳとともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３０〜５６４）を増幅した。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＸｈｏＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。次に、作製されたＰＣＲ産物をｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標））に挿入した。

構築物ＭＣ−０１１を作製するために、鋳型としてのＭＣ−００１構築物を、プライマーＮ−ｔｅｒｍ ｃｙｔｏ Ａｂｉｓ（メチオニン開始コドンを含む）およびＮ末端リバースとともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＵｓｐＡ２遺伝子フラグメント（ＡＴＣＣ ２５２３８系統由来のアミノ酸３１〜５４０）を増幅した。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＸｈｏＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。次に、作製されたＰＣＲ産物をｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標））に挿入した。

増幅に用いたＰＣＲプライマー配列の詳細なリストを表３に示す。ポリメラーゼ連鎖反応はExpand High Fidelity PCR System kit (Roche)を製造者の推奨に従って用いて行った。ライゲーションは、Rapid DNA Ligation Kit (Roche)を製造者の推奨に従って用いて行った。

形質転換
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）、改変ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＢ８３４（ＤＥ３）細胞を、標準的な方法に従い、ＣａＣｌ_２処理細胞を用いてプラスミドＤＮＡで形質転換させた(Hanahan D. ≪ Plasmid transformation by Simanis. ≫ In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。簡単に述べれば、ＢＬＲ（ＤＥ３）コンピテント細胞を氷上で穏やかに解凍した。およそ４μｌのプラスミド（１０〜１００ｎｇ）を、５０〜１００μｌのコンピテント細胞を用いて混合した。その後、この配合物を氷上で５分間インキュベートした。形質転換反応を行うために、この配合物に４２℃で３０秒間、熱パルスをかけ、その後、氷上で２分間インキュベートした。およそ０．５ｍｌのＳＯＣ培地（カタボライト抑制を伴うＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌブロス）を形質転換細胞に加え、細胞培養物を３７℃で１時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天に播種した。１５０μｌ前後の形質転換細胞培養物を播種し、一晩３７℃でインキュベートした。

ＢＬＲ（ＤＥ３）： ＢＬＲは、ＢＬ２１のｒｅｃＡ⁻誘導体（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−） ｇａｌ ｄｃｍ （ＤＥ３）である。組換えタンパク質の発現に用いたこの大腸菌株は、プラスミドモノマー収量を向上させ、繰り返し配列を含む標的プラスミドの安定化を助けることができるか、またはその産物がＤＥ３プロファージの消失を生じ得る(Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37−44)。大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）の詳細な遺伝子型は、ＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標）により公開されている。（Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）（ＤＥ３）。

Ｂ８３４（ＤＥ３）は、ＢＬ２１の親株である。これらの宿主は、メチオニン栄養要求株であり、結晶学のための、３５Ｓ−メチオニンおよびセレノメチオニンによる標的タンパク質の特異性の高い活性標識を可能とする。大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）の詳細な遺伝子型はＮＯＶＡＧＥＮ（ＵＳ登録商標）により公開されている：Ｆ⁻ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ_Ｂ（ｒ_Ｂ−ｍ_Ｂ−） ｇａｌ ｄｃｍ ｍｅｔ（ＤＥ３）。

改変ＢＬＲ（ＤＥ３）： （ホスホ）グルコノイル化を防ぐために、ＢＬＲ（ＤＥ３）ゲノムに位置するビオチン遺伝子座にＰｇｌ遺伝子を挿入した。加えて、Ｉｌｅ−Ｖａｌ置換を防ぐために、トレオニンデアミナーゼ遺伝子のＣ２１９Ｙ突然変異を修正した。
遺伝子型：（Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）；デルタ（ｂｉｏＡ−ｂｉｏＤ）：：Ｐｇｌ；ＴＤ＋（Ｃ２１９Ｙ）（ＤＥ３）。

実施例２：振盪フラスコを用いたタンパク質発現
組換えプラスミドで形質転換させた大腸菌株を用い、１００ｍｌのＬＢブロス（Ｂｅｃｔｏｎ、ＤｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＣｏｍｐａｎｙ）±１％（重量／容量、ｗ／ｖ）グルコース（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ＭＡＴ、カタログ番号：ＧＲ−０１０１）および５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）に播種した。この前培養物を一般に一晩３７℃で増殖させた。１２ｍｌの前培養物を用いて５００ｍｌ ＬＢブロス＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンに播種した。培養物を３７℃にて１５０ＲＰＭで振盪しながらＯ．Ｄ．_{６００ｎｍ}が約０．６に達するまでインキュベートした。

Ｏ．Ｄ．_{６００ｎｍ}が約０．６の時点で、ＢＬＲ（ＤＥ３）培養物に、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ； ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号：５８１５）を添加することにより組換えタンパク質の発現を誘導し、１５０ＲＰＭで振盪しながら２３℃で一晩インキュベートした。この誘導期間の後、培養物を６３７０ｇで２０分間遠心分離し、３５０ｍｌ培養物からのペレットを別個に−２０℃で冷凍した。

実施例３：リン酸バッファーを用いたタンパク質の精製（ＭＣ−００１構築物およびＭＣ−０１１構築物）
振盪フラスコ内での誘導後に得られた各細菌ペレットを１０ｍＭ ＮａＣｌおよびＲｏｃｈｅ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（ＵＳ登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍｌｍｌバッファー）を含有する３０ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。３回のフレンチプレス抽出（２００００ｐｓｉ）により細胞溶解を行い、２３７００ｇで３０分の遠心分離により清澄化を行う。上清を採取し、０．２２μｍで濾過した。

６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質を、１０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）または５００ｍＭアルギニンを含有するＰＢＳバッファーｐＨ８．０で予め平衡化したＸＫ１６カラムおよび２０ｍｌ ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にて精製した。可溶性成分を最大４ｍｌ／分（「フロースルー画分」を形成する）でロードした。カラムにロードした後、カラムを、１０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）６０ｍｌで４ｍｌ／分の速度にて洗浄し、「洗浄画分＃１を得た。同じバッファー＋１０ｍＭイミダゾールを用いた２回目の洗浄を行い、「洗浄画分＃２を得た。溶出は２００または／および５００ｍＭイミダゾールを含有する同じバッファーを用いて行った。

溶出画分からのサンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。タンパク質を含有するサンプルを１０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）５リットルに対して透析した。タンパク質濃度はローリー法を用いて決定した。

実施例４：アルギニン含有バッファーを用いたタンパク質精製（ＭＣ−００１、ＭＣ−００５およびＭＣ−００７）
振盪フラスコ（実施例３）または発酵槽（実施例５）での誘導後に得られた各細菌ペレットを３０ｍｌ ＰＢＳバッファー＋５００ｍＭアルギニンｐＨ８．０およびＲｏｃｈｅ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（ＵＳ登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍｌバッファー）に再懸濁させた。あるいは、発酵細胞ペースト（約７ｇ）を、５００ｍＭアルギニンおよびＲｏｃｈｅ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（ＵＳ登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍｌバッファー）を含有するＰＢＳバッファーｐＨ８．０ ９０ｍｌに再懸濁させた。

細胞溶解は２回または３回のフレンチプレス抽出（２００００ｐｓｉ）により行い、清澄化は４℃、２３７００ｇで３０分の遠心分離により行った。上清を採取し、０．２２μｍで濾過した。６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質を、ＰＢＳバッファー＋５００ｍＭアルギニンｐＨ８．０で予め平衡化したＸＫ１６カラムおよび８０ｍｌ ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にて精製した。可溶性成分を最大４ｍｌ／分（「フロースルー画分」を形成する）でロードした。カラムにロードした後、カラムを、同じバッファー、次いで、１０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で４〜６ｍｌ／分の速度にて洗浄し、「洗浄画分＃１」を得た。同じバッファー＋１０ｍＭイミダゾールを用いた２回目の洗浄を行い、「洗浄画分＃２」を得た。溶出は同じバッファー＋２００ｍＭイミダゾールまたは５００ｍＭイミダゾールを用いて行った。さらなる溶出バイアルで、５ｍＭ ＥＤＴＡ終濃度を添加した。

溶出画分からのサンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。タンパク質を含有するサンプルを１０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）５リットルに対して透析した。タンパク質濃度はローリー法を用いて決定した。

このプロトコールは他の６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質でも使用可能である。

実施例５：発酵
以下の発酵手順を使用できる：
ワーキングシードは、フラスコで増殖させた大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）または特定の抗原候補組換えタンパク質構築物をコードする配列を含有するｐＥＴ２６ｂ誘導体で形質転換されたＢＬＲ（ＤＥ３）由来株の冷凍アリコートである。

ワーキングシード（ＷＳ）を冷凍保存から取り出し、解凍し、前培養培地を含有するエルレンマイヤーフラスコへの播種に使用する。シードの取り扱いおよびフラスコ培養は、ラミナエアフロー（ＬＡＦ）フードまたはバイオロジカルセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）下で無菌的に行う。前培養フラスコを一般に、３０℃〜３７℃の間で２００ＲＰＭ振盪速度下、６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_{６５０ｎｍ}）が１．０〜３．０の間に達するのに必要な時間、一般には４〜６時間インキュベートする。

２０Ｌ発酵槽を定置洗浄(Clean-In-Place)とその後の自動蒸気滅菌シーケンスにより準備する。開始培地をこの発酵槽に無菌的に移す。自動ｐＨ制御のためにＮＨ_４ＯＨ ２５％を充填したボトルをこの発酵槽に無菌的に接続する。開始培地の初期ｐＨはＮＨ_４ＯＨ溶液を添加することにより目的ｐＨに調整する。照射済み消泡剤を天板の隔膜からシリンジを用いて加える。流加培地を充填したボトルを発酵槽に無菌的に接続する。流加はｐＯ２−カスケード（溶存酸素制御）またはプレプログラムフィード曲線のいずれかにより制御する。振盪はｐＯ２−カスケードまたはプレプログラム振盪曲線のいずれかにより制御する。

初期発酵槽パラメーターは一般に次の通りである。
・温度：２８℃〜３２℃
・圧力：０．５ｂａｒｇ（７ｐｓｉ）
・空気流量：２ＶＶＭ(Vessel Volumes per Minute)
・ｐＨ：ＮＨ_４ＯＨ２５％の添加により６．８に調節

この前培養物（一般に５ｍｌ〜５０ｍｌの間）のアリコートを用い、発酵槽の天板の隔膜を経たシリンジ添加により開始培地に播種する。発酵培養の相は、
・バッチ相：バイオマスが開始培地中の炭素源を用いて蓄積される。
・流加相：流加培地がｐＯ２−カスケード制御またはプレプログラム流加曲線のいずれかに従って導入される。バイオマスの蓄積は流加培地中の炭素源に基づいて継続する。
・誘導相：発酵槽中の培養物にＩＰＴＧ溶液を添加することにより組換えタンパク質抗原の発現が誘導される。

採取時、培養物は一般に１Ｌの遠心分離ボトル中に回収され、液体上清画分から固体ペレット（細胞ペースト）画分を分離するために遠心分離される。上清を排出し、湿重（固体ペレット）を記録し、細胞ペーストバッグを−２０℃で保存する。
以下の手順も使用可能である：

大腸菌の標準前培養
各標準前培養物は、大腸菌株の冷凍シード培養物を用いて調製した。これらの株は、評価する特定の構築物をコードする配列を含有するｐＥＴ２６ｂ誘導体で形質転換されたＢＬＲ（ＤＥ３）株である。

シード培養物を室温まで解凍し、４００μｌを用いて、４００ｍｌの前培養培地（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)から適合させたもの）を含有する２リットルのエルレンマイヤーフラスコに播種した。

播種したフラスコを、次に、３７℃（±１℃）および２００ｒｐｍでインキュベートした。前培養はインキュベーション６時間後に停止した。この段階で６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_{６５０ｎｍ}）は約２である。培養を停止した後すぐにこの前培養物を用い、発酵槽の培地に播種した。

２０Ｌ規模の硫加発酵
方法
２０リットルの発酵槽（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ）を用いた。９リットルのバッチ相培地を発酵槽に無菌的に移した。培地のｐＨは塩基の添加により６．８に調整した。１ｍｌの無希釈の照射済み消泡剤（ＳＡＧ ４７１）も発酵槽に加えた。次に、接種前に、温度（２８℃）、上部圧力（０．５バール）、曝気速度（散布空気２０リットル／分）および初期振盪速度（３００ｒｐｍ）に設定した。これらの条件での溶存酸素のレベルは１００％であった。発酵中、上部圧力および曝気速度は一定のレベルに維持した。

播種は、次式：
に従い、ＯＤ６５０ｎｍ＝２の前培養（実施例２で上記したように調製）１０ｍｌ相当の添加により達成した。

バッチ相の間（０〜１５時間）、温度は２８℃に維持した。溶存酸素のレベルは２０％に設定した。この溶存酸素（ＤＯ）のレベルは、ＤＯが２０％を下回った際に撹拌を強化することによって調節した。グルコース消耗は、ＤＯの上昇とともに撹拌の低下をもたらした。

グルコースが消耗すると、７．０を上回るｐＨシグナルに基づいて流加速度が始動される。この時点から後は、硫加速度は酸素要求により制御され、溶存酸素が設定された２０％を下回る傾向にあれば流速が高まる。この段階で、振盪速度は９００ｒｐｍに維持される。

流加相の間（誘導前）、ｐＨは、塩基の添加により６．８に維持し、温度は３０℃に調節した。

タンパク質を生産するために２つの戦略を適用した：
一般に培養４０時間で達成される光学密度８０±５の時点で培養を１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導する場合には、「高細胞密度誘導」（ＨＣＤＩ）が適用される。温度は２８℃に維持し、硫加速度はなお、９００ｒｐｍの一定振盪速度での酸素要求により制御した。

「低細胞密度誘導」（ＬＣＤＩ）法は、通常培養２４後に達成される光学密度４０±５での誘導を意味する。温度は３０℃に引き下げ、一定流加速度０．５ｍｌ／分が適用される。次に、１ｍＭ ＩＰＴＧを培養物に添加する。この段階で、ＤＯレベルは、撹拌速度を制御することにより２０％に維持された。

誘導相（７２時間）の終了時に、細胞ペーストを遠心分離（６，５００ｘｇ、４℃、１時間）により回収し、−２０℃で保存した。

図１および２は、ＨＣＤＩ法およびＬＣＤＩ法での典型的な発酵特性ならびに２０Ｌ規模の流加発酵の際にモニタリングされるパラメーターを示す。

表４は、発酵槽で評価された構築物およびそれぞれについて得られたＵｓｐＡ２収率を示す。

図３は、発酵槽で評価された構築物からの表４のＵｓｐＡ２収率をグラフの形で示す。

この図では、ＵｓｐＡ２収率は構築物に存在するヒスチジン残基により影響を受ける（ｐ＜０．０５、一元配置、３水準、ＩＩ型ＡＮＯＶＡ）。ヒスチジン残基の数とＵｓｐＡ２発酵収率の間には正の相関が見られ、流加発酵において０〜６残基の間で４００％より大きい収率増が見られる。

１／２ヘリックスパターン（ＭＣ−００３構築物）にヒスチジン残基１個を付加すると、約タンパク質１ｇ／ｌのＵｓｐＡ２収率が得られることも認められた。

実施例６：タンパク質の特性決定
分析的超遠心分離
遠心力に応じて分子が移動する速度を測定することによりタンパク質サンプル内の種々の種の溶液中での均質性およびサイズ分布を決定するために分析的超遠心分離を使用する。これは、沈降速度実験により得られる種々の種の沈降係数の計算に基づき、分子の形状および質量に依存する。

以下のタンパク質サンプルをＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ−１分析超遠心機にて、ＡＮ−６０Ｔｉローターを１５℃に平衡化した後に２８０００ＲＰＭで回転させた。
ａ．ＭＣ−００５ロットＢＭＰ５３、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中６７５μｇ／ｍｌ
ｂ．ＭＣ−００１ロットＢＭＰ１３、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中５４５μｇ／ｍｌ
ｃ．ＭＣ−００１ロットＢＭＰ１４、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中５４５μｇ／ｍｌ
ｄ．ＭＣ−００１ロットＢＭＰ５４、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中４４５μｇ／ｍｌ
ｅ．ＭＣ−００７ロットＢＭＰ７０、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中５１０μｇ／ｍｌ

データ収集のため、１３３〜３２５回のスキャンを５分ごとに２８０ｎｍで記録した。

データ解析は、Ｃ（Ｓ）分布の決定のためのプログラムＳＥＤＦＩＴ（米国効率衛生研究所から入手可能）を用いて行った。Ｃ（Ｓ）分布は、それらの沈降係数により分離された高分子の混合物中の種々の成分の相対的強度を表すものであり、分子サイズおよびコンフォメーションの関数である。１５℃におけるタンパク質の部分比容積の決定は、ＳＥＤＮＴＥＲＰソフトウエアを用いてそれらのアミノ酸配列から決定した。また、ＳＥＤＮＴＥＲＰ（ＳＥＤＮＴＥＲＰは、ニューハンプシャー大学の生体分子相互作用技術センター(Biomolecular Interaction Technologies Center)により配布およびサポートされている）も、１５℃でのバッファーの粘度および密度を決定するために使用した。

総ての種の相対的存在量の決定は、サンプルの全分布の全曲線下面積を１００％とし、全種の分布により表されるこの総面積のパーセンテージを計算することにより行われたものである。Ｃ（Ｓ）分布プロット（沈降係数に対する濃度）は、Ｃ（Ｍ）分布（分子量に対する濃度）より生のデータをより良く表すものであることを考えられるので、その計算に使用された。

精製された種々の構築物の分析的超遠心分離により、精製前の細胞溶解中に５００ｍＭ Ｌ−アルギニンを加える場合にＣ末端ｈｉｓタグを有するＵｓｐＡ２ Δヘリックス、ＵｓｐＡ２ １／２ヘリックスおよびＵｓｐＡ２完全ヘリックスが溶液中に主として三量体として存在することが観察できた（図４、５、７および８）。

細胞溶解中にＬ−アルギニンを加えなかった場合には、ＵｓｐＡ２ １／２ヘリックスでは不均一なサイズ分布が見られた。２つの主要な集団が見られる。分子量の評価に不可欠な摩擦比は均質なサンプルから計算する必要があるので、このタンパク質調製法を用いた場合にＡＵＣ（分析的超遠心分離）により検出される種の分子量を確認することはできなかった。しかしながら、沈降係数に基づけば、観測された種に、他のサンプルで見られた三量体に相当すると思われるものは無かった。

図４は、沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００５の分子量分布を示す。大部分のタンパク質は三量体として見られ、三量体の二量体に相当し得るより高い分子量のオリゴマーを小さな割合で伴っている。

図５は、沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００１の分子量分布を示す。大部分のタンパク質は三量体として見られる。

図６は、沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００１の分子量分布を示す。このサンプルは複数種を表し、多分散性が高い。検出された主要種の沈降係数は、他のロットで通常検出される三量体の沈降係数に相当しない。

図７は、沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００１の分子量分布を示す。大部分のタンパク質は三量体として見られる。

図８は、沈降速度分析型超遠心分離により決定された精製ＭＣ−００７の分子量分布を示す。大部分のタンパク質は三量体として見られる。

円偏光二色性／二次構造
円偏光二色性（ＣＤ）は、構造の非対称性による左円偏光と右円偏光の吸収の違いを測定することによりタンパク質の二次構造組成を決定するために用いる。遠紫外領域（１９０〜２５０ｎｍ）におけるＣＤスペクトルの形状および大きさは、タンパク質がβ−シート構造で存在するかα−ヘリックス構造で存在するかランダムコイル構造で存在するかによって異なる。所与のタンパク質サンプル中の各二次構造タイプの相対的存在量が参照スペクトルとの比較により計算できる。

遠紫外スペクトルは、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７２０分光旋光計にて分解能帯域幅１ｎｍで、０．０１ｃｍ光路を用いて１７８から２５０ｎｍまで測定する。セル温度はＰｅｌｔｉｅｒサーモスタットＲＴＥ−１１１セルブロックにより種々の温度に維持される。測定中、１０Ｌ／分の窒素流を維持する。

以下のタンパク質構築物の濃度を２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０バッファー中、４００μｇ／ｍｌに調整した。
ａ．ＭＣ−００５ロットＢＭＰ５３、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中
ｂ．ＭＣ−００１ロットＢＭＰ１３、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中
ｃ．ＭＣ−００１ロットＢＭＰ１４、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中
ｄ．ＭＣ−００１ロットＢＭＰ５４、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中
ｅ．ＭＣ−００７ロットＢＭＰ７０、２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８，０中

二次構造の計算は以下のアルゴリズムを用いて行った。
Ｓｅｌｃｏｎ ３(Sreerama and Woody, Anal. Biochem. (1993), 209, 32; Sreerama and Woody, Biochemistry, 33, 10022-25 (1994); Sreerama et al. Protein Science, 8, 370-380 (1999); Johnson W.C.Jr., Proteins: Str. Func. Genet. 35, 307-312 (1999))
ＣＤＳＳＴＲ(Johnson W.C. Proteins: Struc. Func. Genet. 35, 307-312 (1999) modified by Sreerama. N. (Anal. Biochem., 287, 252 (2000))

示された結果は両アルゴリズムで計算したパーセンテージの平均であり、許容誤差は５％である。

発酵槽で発現されたタンパク質に関する二次構造計算の結果を、許容誤差を５％として表５に示す。

計算結果はスペクトルの形状および視覚的解析と一致し、２０８ｎｍおよび２２０ｎｍにおける最小強度で、ヘリックス含量は増える。β構造が存在する場合、タンパク質は高い割合のヘリックス構造から構成される。

図９でスペクトルを重ね合わせると、構築物間の形状に有意な違いはない。ＭＣ−００５ヘリックスのスペクトルは低強度を示し、これはＣ末端ヘリックスの不在と一致するα構造の少なさを説明し得る。

図９は、ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１、ＭＣ−００５およびＭＣ００７の遠紫外円偏光二色性スペクトルを示し、タンパク質二次構造の指標を与える。スペクトルを重ね合わせると、１／２および完全Ｃ末端ヘリックスを含有する構築物がそれらの二次構造に検出可能な差異を持たないが、ヘリックスを持たない構築物は、二次構造内容の差異を説明し得る強度に差異を持つスペクトルを生じることが明らかに示される。

熱によるアンフォールディング
熱によるアンフォールディング中の種々の温度における遠紫外ＣＤスペクトルの測定は、ＭＣ−００５がＭＣ−００７よりも熱安定性が低いことを示唆した。ＭＣ−００５に関して３３℃で観察されたスペクトルは、アンフォールディングタンパク質の典型的なスペクトルと同様である。ＭＣ−００７構築物については、３３で二次構造の部分的な消失が見られるとしても、完全なアンフォールディングは３５℃〜３７℃の間で起こると思われる。これは完全なヘリックスを含有する構築物ＭＣ−００７のより高い熱安定性の指標となり得る。

図１０は、ＭＣ−００５（ＵｓｐＡ２Δヘリックス＋６Ｈｉｓ）の熱によるアンフォールディング中の円偏光二色性による二次構造のモニタリングを示す。スペクトルの視覚的分析は、タンパク質は３３℃でのその二次構造の大部分を失うことを明らかに示す。

図１１は、ＭＣ−００７（ＵｓｐＡ２＋ヘリックス＋６Ｈｉｓ）の熱によるアンフォールディング中の円偏光二色性による二次構造のモニタリングを示す。スペクトルの視覚的分析は、二次構造の消失がヘリックスを持たない構築物に比べて遅いことを示す。構造の変化は３３℃で加熱した際に検出可能であるが、完全なアンフォールディングは３５℃〜３７℃の間に起こると思われる。

熱によるアンフォールディングの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
タンパク質の熱安定性に及ぼすＣ末端ヘリックス修飾の影響を評価するために、種々のＵｓｐＡ２構築物の熱遷移を比較した。

分析は、ＭｉｃｒｏＣａｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部門）製のＶＰ−ＤＳＣで行った。バッファー２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８を参照として用い、スキャンから差し引いた。タンパク質は昇温ＤＳＣスキャン前に１５分間、初期温度で平衡化し、その後、９０℃／時の加熱速度で１０℃から６０℃までスキャンを行った。

ＭＣ−００１およびＭＣ−００７構築物では２つの遷移が検出され、ＭＣ−００５では１つだけであった。種々の構築物の遷移の値（またはＴｍ）は表６に見出すことができる。

３種類のタンパク質の総てで低い方のＴｍは３２℃前後であり、主要な違いは２つ目のＴｍの値である。完全ヘリックスを含有する構築物（ＭＣ−００７）は、１／２ヘリックス（ＭＣ−００１）の３４．５℃に比べ、３７．５℃により高いＴｍを有する。

ＭＣ−００１およびＭＣ−００７では、３２℃前後の最初のＴｍは可逆的であり、高い方のＴｍは不可逆的であることが示された。ＭＣ−００５では、検出された唯一のＴｍは不可逆的である。

これは、完全なヘリックスを含有する構築物ＭＣ−００７のより高い熱安定性の指標となり得る。

質量分析
ＵｓｐＡ２タンパク質サンプルは、ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ系を用いたタンパク質沈降により調製した。タンパク質ペレットをエッペンドルフ管の底に遠心分離した後、窒素下で穏やかに乾燥させた。次に、乾燥させたペレットを２μｌの純粋ギ酸に溶かし、その後、３μｌの超純水および５μｌのシナピン酸で希釈する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化とその後のタイム・オブ・フライト型分光分析装置）分析用のマトリックスとして使用したシナピン酸は、終濃度０．１％のＴＦＡを添加した５０％ＣＨ_３ＣＮ／５０％Ｈ_２Ｏ中で調製する。

１μｌのサンプル＋マトリックス混合物をＢｒｕｋｅｒ ３８４研磨ステンレス鋼ＭＡＬＤＩターゲットにスポットし、室温および大気圧で乾燥させて結晶化させた（ドライドドロップレット(dried droplet)法）。

ＵｓｐＡ２質量分析は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ２ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ブレーメン、ドイツ）で陽イオン化および線形モードにて行った。シナピン酸マトリックス中に共結晶されたタンパク質サンプルにスマートビームレーザーを照射した。無傷のＵｓｐＡ２タンパク質の質量測定は、加速電圧２５ｋボルトで、１０．０００〜１００．０００Ｄａの質量範囲で行った。レーザー減衰は、できる限り最良のタンパク質シグナルを得るため、また、断片化ならびにバックグラウンドの過イオン化現象を避けるために微調整した。質量分析計の較正は、近接外部法(close external method)にて、相同マトリックスで、市販のＢｒｕｋｅｒタンパク質較正混合物２を用い、以下の較正物質：ｍ／ｚ ２２３０７Ｄａでのタンパク質Ａの［Ｍ＋２Ｈ］^２＋（ＭＳ検出器により、またはイオン化中にタンパク質に２個のＨ＋イオンを添加した後に測定される質量）種、ｍ／ｚ ２３９８２Ｄａでのトリプシノーゲンの［Ｍ＋Ｈ］^＋種、ｍ／ｚ ４４６１３Ｄａでのタンパク質Ａの［Ｍ＋Ｈ］^＋種およびｍ／ｚ ６６４３１Ｄａ°でのウシアルブミン［Ｍ＋Ｈ］^＋種での正確な測定により行った。示された各スペクトルは、個々のショット合計５００からの結果である。

以下のサンプルを分析した。
振盪フラスコで生産したＮ末端にＭＱＡＫアミノ酸を有するＭＣ−００１構築物（配列番号８５）、ロットｏｐｔ−０１、振盪フラスコで生産したＮ末端にＭＡＫアミノ酸を有するＭＣ−０１１構築物、ロットＢＭＰ３７。

表７および図１２では、Ｎ最末端にＭＱＡＫアミノ酸を有するＭＣ−００１タンパク質（配列番号８５）は、５７５６５Ｄａの予想質量に比べて、５７４２７Ｄａの測定分子質量によって示されるように、少なくとも部分的に脱メチオニル化されることが示されている。他のピーク５７６２０Ｄａは、完全な非脱メチオニル化タンパク質、Ｎ−アセチル化タンパク質、または別の修飾タンパク質集団を表し得る。

図１２は、ＭＣ−００１ロットｏｐｔ−０１のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。５７４２７Ｄａに見られる質量は脱メチオニル化タンパク質と一致し得るが、５７６２０Ｄａのピークは完全なタンパク質に相当し得る。

表７および図１３に示されるように、Ｎ最末端にＭＡＫアミノ酸を有するＭＣ−０１１タンパク質は、完全なアミノ酸配列に基づいて予想される質量としての５７４３７Ｄａに比べて、５７２６５Ｄａの分子質量を有する脱メチオニル化タンパク質に相当し得るＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける主要集団であった。＋１８６Ｄａおよび＋３６６Ｄａの他の２つの
ピークは予想される翻訳後修飾に近いとは言えないので、それらはこの実験によっては同定できなかった。

エドマン分解によるＮ末端シーケンシング
Ｎ末端領域の最適化（Ｎ末端メチオニンの次のアミノ酸配列の最適化）がタンパク質の脱メチオニル化をもたらすかどうかを評価するために、ｈｉｓ Ｎ最末端にＭＡＫアミノ酸を有するＭＣ−０１１構築物についてＮ末端シーケンシングを行った。

タンパク質をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮｏｖｅｘ ４％〜２０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離した後、Ｐｒｏｂｌｏｔ ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidence diluoride)）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）メンブレンに転写した。このメンブレンをアミドブラックで染色した。次に、着目するバンド切り取り、製造者のプロトコールに従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅシーケンサーシステムを用いて分析を行った。１２回のエドマン分解を行った。

得られたＮ末端アミノ酸配列はＡＫＮＤＩＴＬＥＤＬＰ（配列番号８６）であり、これは開始メチオニンの後、アミノ酸番号２で始まるタンパク質のＮ最末端に相当する。これは、成熟タンパク質が主として脱メチオニル化されていることを示す。

実施例７：ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１：殺菌活性
殺菌アッセイ
モラクセラ・カタラーリスを、３７℃＋５％ＣＯ_２にてペトリ皿で一晩培養した。０．６５０のＯＤ_６２０を得るために細菌を１２ｍｌ ＨＢＳＳ−ＢＳＡ（ウシ血清Ａｌｂｕｍを含むハンクスの緩衝塩溶液）０．１％バッファーに移した。血清サンプルは５６℃で４５分間加熱して内在する補体を不活化した。ＳＢＡバッファー（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％）中、血清の連続２倍希釈液を９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（２５μｌ／ウェル）に加えた。次に、５０μｌのＳＢＡバッファーを各ウェルに加えた。その後、２５μｌのモラクセラ・カタラーリス系統４ １０^＾４ｃｆｕ／ｍｌを、血清を含有するウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。最後に、２５μｌの新たに解凍し、ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％中に１／８希釈した仔ウサギ補体を、最終容量が１２５μｌとなるように加えた。プレートを軌道振盪しながら（２１０ｒｐｍ）３７℃で１時間インキュベートした。反応はこのマイクロプレートを氷上に少なくとも５分間置くことにより停止させた。

ホモジナイゼーション後、種々の希釈率の懸濁液（細菌、血清、補体およびバッファーの混合物、前段で述べたように容量１２５μｌ）をチョコレート寒天プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートし、モラクセラ・カタラーリスコロニーを計数した。

ウェル当たりのモラクセラ・カタラーリスコロニー数を決定するために、血清サンプルを含まない８ウェルを細菌対照として使用した。対照ウェルのＣＦＵ（コロニー形成単位）の平均数を決定し、各血清サンプルの殺菌活性の算出に用いた。殺菌力価は５０％の殺菌を誘導する血清の希釈率の逆数で表した。

マウス、モルモットおよびウサギでＭＣ−００１に対して作製した抗ＵｓｐＡ２抗血清を、種々の国（米国、フィンランド、オランダ、ノルウェー、スウェーデン）で種々の組織（血液、痰、鼻、中耳液）から単離された２０の異なるモラクセラ・カタラーリス系統に対して、本明細書において上記した殺菌アッセイにて試験した。

以下に示すように、供試系統により発現されるＵｓｐＡ２の相同性パーセンテージによらず、抗ＵｓｐＡ２抗体は、モラクセラ・カタラーリスの交差殺菌を誘導することができた。さらなる殺菌活性が、ＵｓｐＡ１またはキメラタンパク質ＵｓｐＡ２Ｈのみを発現する系統に対しても示された。予想されるように、ＵｓｐＡ１およびＵｓｐＡ２二重ノックアウト突然変異体に対しての殺菌抗体力価は全く測定されなかったか、または弱いものに過ぎなかった。

実施例８：マウス肺定着モデルにおける保護（ＭＣ−００１）
５週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８／５群）を、０、１４および２８日目に筋肉内経路によりＡＳ０２Ｖ内に処方された１０μｇのＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１を含有するワクチン５０μｌで免疫した。４２日目にマウスに５．１０^５ＣＦＵの種々のモラクセラ・カタラーリス系統で鼻腔内刺激を行った。刺激後０、３および６時間目に肺の細菌を計数した。群間の差異をダネットの検定を用いて解析した。

表１０にまとめられるように、ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１は、ＵｓｐＡ１は発現するがＵｓｐＡ２は発現しない４３６１７株およびキメラタンパク質ＵｓｐＡ２Ｈ（ＵｓｐＡ１由来のＮ末端配列とＵｓｐＡ２由来のＣ末端配列で構成される）を発現するＢＢＨ１８株を含む同系統および異系統の両方に対して有意な保護を誘導した。

実施例９：ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００７：抗体殺菌活性
殺菌アッセイ
モラクセラ・カタラーリス２５２３８を３７℃＋５％ＣＯ_２にてペトリ皿で一晩培養した。０．６５０のＯＤ_６２０を得るために細菌を１２ｍｌ ＨＢＳＳ−ＢＳＡ ０．１％バッファーに移した。血清サンプルは５６℃で４５分間加熱して内在する補体を不活化した。ＳＢＡバッファー（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％）中、血清の連続２倍希釈液を９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（２５μｌ／ウェル）に加えた。次に、５０μｌのＳＢＡバッファーを各ウェルに加えた。その後、２５μｌのモラクセラ・カタラーリス２５２３８系統４ １０^＾４ｃｆｕ／ｍｌを、血清を含有するウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。最後に、２５μｌの新たに解凍し、ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％中に１／８希釈した仔ウサギ補体を、最終容量が１２５μｌとなるように加えた。プレートを軌道振盪しながら（２１０ｒｐｍ）３７℃で１時間インキュベートした。反応はこのマイクロプレートを氷上に少なくとも５分間置くことにより停止させた。ホモジナイゼーション後、種々の希釈率の懸濁液をチョコレート寒天プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートし、モラクセラ・カタラーリスコロニーを計数した。ウェル当たりのモラクセラ・カタラーリスコロニー数を決定するために、血清サンプルを含まない８ウェルを細菌対照として使用した。対照ウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺菌活性の算出に用いた。殺菌力価は５０％の殺菌を誘導する血清の希釈率の逆数で表した。

マウスにおいてＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１またはＭＣ−００７を用いて作製された抗ＵｓｐＡ２抗血清を、２５２３８モラクセラ・カタラーリス同系統に対して上記で記載したプロトコールを用い、細菌アッセイにて試験した。

表１１に示されるように、ＭＣ−００７ ＵｓｐＡ２構築物は、ＭＣ−００１により誘導されたものと同等の高い殺菌応答を誘発した。

実施例１０：ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００７：肺抗原投与モデルにおける保護有効性
マウス肺定着モデルにおける保護
５週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たり８個体、各時点につき最大５群）を、０、１４および２８日目に、ＡＳ０２Ｖとともに処方されたＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００１またはＡＳ０２Ｖ内に処方されたＭＣ−００７ １０μｇを含有する５０μｌのワクチンで筋肉内経路により免疫した。４２日目にマウスに５．１０^５ＣＦＵのモラクセラ・カタラーリス系統ＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）２５２３８（商標）で鼻腔内刺激を行った。マウスをモラクセラ・カタラーリス系統ＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）２５２３８（商標）（陽性対照として）（図１４のＭ．ｃａｔ． ＷＣ ２５２３８）またはＡＳ０２Ｖ単独（陰性対照として）由来の１０μｇの死滅全細胞で免疫した。刺激後０、３および６時間目に肺の細菌を計数した。群間の差異をダネットの検定を用いて解析した。

図１４に示されるように、ＵｓｐＡ２構築物はＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）系統２５２３８（商標）に対しても同様に保護を示した。

実施例１１：マウスにおけるＵｓｐＡ２ ＭＣ−００９タンパク質処方物の免疫原性
２５個体の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの群を０、１４および２８日目に以下の処方物５０μｌで筋肉内（ＩＭ）経路により免疫した。
ＭＣ−００９（１μｇ）ＡｌＰＯ４（１０００μｇ／ｍｌ）
ＭＣ−００９（１μｇ）ＡＳ０４Ｃ（ＡｌＰＯ_４／ＭＰＬ １００／１００／ｍｌ）
ＭＣ−００９（１μｇ）ＡＳ０１Ｅ（ＱＳ２１／ＭＰＬ ５０／５０／ｍｌ）

抗ＩｇＧレベルは、２８日目（ＰＩＩ）および４２日目（ＰＩＩＩ）に採取した個々の血清で、以下のプロトコールを用いて測定した。

抗ＵｓｐＡ２抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを一晩４℃にて、炭酸バッファーｐＨ９．６中４μｇ／ｍｌのＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０（ポリソルベート２０）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露(revelation)溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

図１５に示されるように、ＵｓｐＡ２は、各アジュバント処方物で高抗体レベルを誘導した。

殺菌アッセイ
細菌アッセイは、以下のプロトコールを用い、相同全長ＵｓｐＡ２を発現するＭ．カタラーリス系統（ＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）２５２３８（商標））に対して行った：モラクセラ・カタラーリス系統ＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）２５２３８（商標）を３７℃＋５％ＣＯ_２にてペトリ皿で一晩培養した。０．６５０のＯＤ_６２０を得るために細菌を１０ｍｌのＢＨｉ（ブロスハートインフュージョン）に移した。血清サンプルを５６℃で４５分間加熱して内在する補体を不活化した。ＳＢＡバッファー（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％）中、血清の連続２倍希釈液を９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（２５μｌ／ウェル）に加えた。次に、５０μｌのＳＢＡバッファーを各ウェルに加えた。その後、２５μｌのモラクセラ・カタラーリス系統２５２３８（商標）４ １０^＾３ｃｆｕ／ｍｌを、血清を含有するウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。最後に、２５μｌの新たに解凍し、ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％中に１／８希釈した仔ウサギ補体を、最終容量が１２５μｌとなるように加えた。プレートを軌道振盪しながら（２１０ｒｐｍ）３７℃で１時間インキュベートした。反応はこのマイクロプレートを氷上に少なくとも５分間置くことにより停止させた。次に、プレートの各ウェルの２０μｌアリコートを９６ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、各ウェルに５０μｌのＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地−０．９％寒天を加えた。５０μｌのＰＢＳ０．９％寒天を第２層として加えた。５％ＣＯ_２を用いて３７℃で３時間後、プレートを２５℃で一晩インキュベートし、モラクセラコロニーを、自動画像解析システム（ＫＳ ４００、Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて計数した。ウェル当たりのモラクセラの数を決定するために、血清サンプルを含まない８ウェルを細菌対照として使用した。対照ウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺菌活性の算出に使用した。殺菌力価は５０％の殺菌を誘導する血清の希釈率の逆数で表した。

図１６は、同系統に対してＵｓｐＡ２により誘導される殺菌力価を示す。この実験では、ＵｓｐＡ２は、各アジュバント処方物に対して高レベルの殺菌抗体を誘導した。血清はＰＩＩＩで試験し、５つの血清サンプル５プールを試験した。

実施例１２：ＰＤ抗原およびＰＥ−ＰｉｌＡ ＮＴＨｉ抗原と組み合わせた場合のＵｓｐＡ２の免疫原性
免疫誘導プロトコール
２５個体の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの群を０、１４および２８日目に以下の処方物５０μｌで筋肉内（ＩＭ）経路により免疫した。
ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９（１μｇ）ＡｌＰＯ４
ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９（１μｇ）ＡＳ０４Ｃ
ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９（１μｇ）ＡＳ０１Ｅ
ＵｓｐＡ２−ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ（ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９、ＰＥＰｉｌＡ構築物ＬＶＬ−７３５）ＡｌＰＯ４（ＵｓｐＡ２、ＰＤおよびＰＥＰｉｌＡ各１μｇ；１０００ｍｇ／ｍｌ ＡｌＰＯ４）
ＵｓｐＡ２−ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ（ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９、ＰＥＰｉｌＡ構築物ＬＶＬ−７３５） ＡＳ０４Ｃ ＡｌＰＯ４（ＵｓｐＡ２、ＰＤおよびＰＥＰｉｌＡ各１μｇ；１００／１００／ｍｌ ＡｌＰＯ４／ＭＰＬ）
ＵｓｐＡ２−ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ（ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９、ＰＥＰｉｌＡ構築物ＬＶＬ−７３５）ＡＳ０１Ｅ（ＵｓｐＡ２、ＰＤおよびＰＥＰｉｌＡ各１μｇ；５０／５０／ｍｌ ＱＳ２１／ＭＰＬ）

抗ＵｓｐＡ２抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
以下のプロトコールを用い、２８および４２日目に採取した個々の血清で、抗ＵｓｐＡ２ ＩｇＧレベルを決定した。

プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中４μｇ／ｍｌのＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０（ポリソルベート２０）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

抗ＰＥ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌのＵｓｐＡ２ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

抗ＰｉｌＡ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中４μｇ／ｍｌのＰｉｌＡ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

抗ＰＤ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中８μｇ／ｍｌのＰＤ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

殺菌アッセイ
殺菌力価は、以下のプロトコールを用い、４２日目に採取した血清をプールしたもの（５プール／群）で測定した：モラクセラ・カタラーリスを３７℃＋５％ＣＯ_２にてペトリ皿で一晩培養した。０．６５０のＯＤ_６２０を得るために細菌を１０ｍｌのＢＨｉ（ブロスハートインフュージョン）培地に移した。血清サンプルを５６℃で４５分間加熱して内在する補体を不活化した。ＳＢＡバッファー（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％）中、血清の連続２倍希釈液を９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（２５μｌ／ウェル）に加えた。次に、５０μｌのＳＢＡバッファーを各ウェルに加えた。その後、２５μｌのモラクセラ・カタラーリス系統２５２３８４ １０^＾３ｃｆｕ／ｍｌを、血清を含有するウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。最後に、２５μｌの新たに解凍し、ＨＢＳＳ−ＢＳＡ０．１％中に１／８希釈した仔ウサギ補体を、最終容量が１２５μｌとなるように加えた。プレートを軌道振盪しながら（２１０ｒｐｍ）３７℃で１時間インキュベートした。反応はこのマイクロプレートを氷上に少なくとも５分間置くことにより停止させた。次に、プレートの各ウェルの２０μｌアリコートを９６ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、各ウェルに５０μｌのＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地−０．９％寒天を加えた。５０μｌのＰＢＳ０．９％寒天を第２層として加えた。５％ＣＯ_２を用いて３７℃で３時間後、プレートを２５℃で一晩インキュベートし、モラクセラコロニーを、自動画像解析システム（ＫＳ ４００、Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて計数した。ウェル当たりのモラクセラの数を決定するために、血清サンプルを含まない８ウェルを細菌対照として使用した。対照ウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺菌活性の算出に使用した。殺菌力価は５０％の殺菌を誘導する血清の希釈率の逆数で表した。

殺菌アッセイは、相同ＵｓｐＡ２を発現するモラクセラ・カタラーリス系統２５２３８（商標）に対して行った。

ＵｓｐＡ２ ＩｇＧレベルに及ぼすＰＤ抗原およびＰＥ−ＰｉｌＡ抗原の負の影響がＡＳ０４Ｃ（ＩＩＩ後）およびＡＳ０１Ｅ（ＩＩ後）処方物において見られた（図１７）。しかしながら、この影響は限定されたものに留まり（抗体の減少は１／２以下）、殺菌アッセイ（図１８）では確認されなかった。マウスにおいてＰＥ−ＰＥＰｉｌＡ−ＵｓｐＡ２ワクチンによりＰＤ、ＰＥおよびＰｉｌＡに対して誘導されたＩｇＧ応答をそれぞれ図１９、図２０および図２１に示す。

従って、ＵｓｐＡ２は、ＰＤおよびＰＥ−ＰｉｌＡと組み合わせた場合、免疫原性を有した。

実施例１３：ＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９：マウスにおけるＵｓｐＡ２と組み合わせた場合のＰＤ抗原およびＰＥ−ＰｉｌＡ ＮＴＨｉ抗原の免疫原性
免疫誘導プロトコール
２５個体の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの群を、０、１４および２８日目に以下の処方物５０μｌで筋肉内（ＩＭ）経路により免疫した。
ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ（１μｇのＰＤおよび１μｇのＰＥＰｉｌＡ構築物ＬＶＬ−７３５）ＡＳ０１Ｅ
ＵｓｐＡ２−ＰＤ−ＰＥＰｉｌＡ（１μｇのＵｓｐＡ２構築物ＭＣ−００９、ＰＤおよびＰＥＰｉｌＡ構築物ＬＶＬ−７３５）ＡＳ０１Ｅ

ＰＤ、ＰＥおよびＰｉｌＡに対するＥＬＩＳＡ ＩｇＧレベルは、２８日目（ＰＩＩ）および４２（ＰＩＩＩ）日目に採取した個々の血清で測定した。

抗ＰＥ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌのＵｓｐＡ２ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

抗ＰｉｌＡ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中４μｇ／ｍｌのＰｉｌＡ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

抗ＰＤ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡ
プレートを４℃にて一晩、炭酸バッファーｐＨ９．６中８μｇ／ｍｌのＰＤ １００μｌ／ウェルでコーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、血清の連続２倍希釈液をマイクロウェルのＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（ＵＳ登録商標）２０ ０．０５％中に加えた。これらのプレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５−０３５−００３）を加え、プレートを振盪しながら３０分間室温に置いた。プレートを上記のように洗浄し、暗所で１５分間、各ウェルに暴露溶液（１０ｍｌのクエン酸バッファー０．１Ｍ ＰＨ（ｐＨ）４．５中４ｍｇのＯＰＤＡ Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８７および５μｌのＨ_２Ｏ_２）（１００μｌ／ウェル）を加えた。５０μｌのＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止させ、吸光度を４９０ｎｍ（参照フィルターでは６２０ｎｍ）で読み取った。

力価は、ＳＯＦＴＭＡＸ（ＵＳ登録商標）Ｐｒｏソフトウエアを用いて４パラメーター法により計算した。

図２２、２３および２４に示されるように、ＡＳ０１ＥにおけるＰＤおよびＰＥＰｉｌＡ免疫原性に対してＵｓｐＡ２添加の大きな影響は見られなかった。

実施例１４：マウスモラクセラ・カタラーリス肺炎症モデルにおけるＵｓｐＡ２を含有する四価ワクチン処方物の安全性
無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）およびモラクセラ・カタラーリス（Ｍ．ｃａｔ．）による増悪の予防を目的とする候補ワクチンでの免疫誘導の際にＣＯＰＤ患者の肺において望ましくない炎症性応答を誘導するリスクを軽減するために、種々の動物モデルを開発し、このワクチンの安全性を評価するために使用した。供試処方物は、３種類のＮＴＨｉ 抗原（ＰＤ、ＰＥおよびＰｉｌＡ、最後の２つのものはＰＥＰｉｌＡ融合タンパク質として合わせされる）、１つのＭ．ｃａｔ．抗原（ＵｓｐＡ２）およびアジュバント系０１_Ｅ（ＡＳ０１_Ｅ）を含んだ。

２つのモデルをワクチンのＵｓｐＡ２成分の安全性を評価するために特化させた。

モデル１：
・目的
このモデルは、ワクチン接種時に炎症肺におけるあり得る望ましくない免疫応答の誘導を評価することを目的とした。

・試験計画
０、７および１４日目にＣ５７Ｂｌ／６マウスを２５μｇの熱不活化Ｍ．ｃａｔ．系統ＡＴＣＣ（ＵＳ登録商標）２５２３８（商標）全細胞（ワクチンＵｓｐＡ２と１００％相同なＵｓｐＡ２を発現する）の３回の鼻腔内投与により感作させた。この処置は肺において血管周囲および細気管支周囲の炎症（リンパ系集合体の形成を伴う）、肺胞炎、肺炎、線維症および強いＭ．ｃａｔ．全細胞特異的ＩＬ−１７^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答を誘発し、これらは総体としてＣＯＰＤ患者の肺に見られる炎症プロセス（気腫を除く）を模倣した。

次に、４２日目にマウスに以下の処方物のヒト用量の１／１０で筋肉内経路によりワクチン接種を行った。
ＰＤ １０μｇ／ＰＥＰｉｌＡ（ＬＶＬ７３５構築物、ＷＯ２０１２／１３９２２５に記載）１０μｇ／ＵｓｐＡ２（ＭＣ００９構築物）１０μｇ／ＡＳ０１_Ｅ
ＰＤ １０μｇ／ＰＥＰｉｌＡ（ＬＶＬ７３５構築物）１０μｇ／ＵｓｐＡ２（ＭＣ００９構築物）３．３μｇ／ＡＳ０１_Ｅ
ＡＳ０１_Ｅ（陰性対照）
ＰＢＳ（陰性対照）

感作により誘発された肺炎症に及ぼすこれらの処方物の影響を評価するために、
マウスを４３日目から４９日目まで毎日監視し、死亡率および有害事象（虚脱、起毛、円背）の誘導を示す臨床徴候を観察した。
肺の組織学的分析は、ワクチン接種後２、７および１４日目に行い（各群および各時点で５マウス個体）、あり得る炎症の悪化を観察した。
潜在的に望ましくないＴ細胞応答の誘導を、ワクチン接種後７および１４日目に採取した肺のプールで評価した（４プール／群／時点およびマウス３個体の肺／プール）。肺Ｔ細胞をＵｓｐＡ２ペプチド、熱不活化Ｍ． ｃａｔ．全細胞（ＷＣ）または培地（陰性対照として）のいずれかで一晩再刺激した後、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現に関してフローサイトメトリーにより分析した。

・結果
死亡または有害事象は報告されなかった。

肺の組織学（図２５〜２９）：
・肺に見られた変化は総ての群で重篤度が同等であり、若干から軽度の血管周囲／細気管支単核細胞浸潤物を特徴とした。
・ワクチン接種に関連する肺胞炎および／または肺炎は見られなかった。

Ｔ細胞応答：
・ＷＣによる再刺激時に肺で強いＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答（主としてＩＬ−１７およびＴＮＦα産生細胞）が測定されたが、投与した処方物には無関係であった（ワクチンまたはアジュバント単独またはＰＢＳ）（図３０〜３３）。肺ＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答は低いかまたは全く観察されなかった（データは示されていない）。
・いずれの群でもＵｓｐＡ２ペプチドにより再刺激された検出可能なＴ細胞応答は無く、このことは、ワクチン接種後にＵｓｐＡ２特異的応答がプライムミングまたは増強されたことを示す（データは示されていない）。

モデル２：
・目的
このモデルは、ワクチン接種およびＭ． ｃａｔ．刺激時に炎症肺におけるあり得る望ましくない免疫応答の誘導を評価することを目的とした。

・試験計画
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを順次、
０、７および１４日目に２５μｇの熱不活化Ｍ． ｃａｔ．系統２５２３８ＷＣ（ワクチンＵｓｐＡ２と１００％相同なＵｓｐＡ２を発現する）の３回の鼻腔内投与により感作させ（モデル１と同様）
４２日目に以下の処方物のヒト用量の１／１０で筋肉内経路によりワクチン接種を行った（モデル１と同様）。
ＰＤ（１０μｇ／ＰＥＰｉｌＡ（ＬＶＬ７３５構築物）１０μｇ／ＵｓｐＡ２（ＭＣ００９構築物）１０μｇ／ＡＳ０１_Ｅ
ＰＤ１０μｇ／ＰＥＰｉｌＡ（ＬＶＬ７３５構築物）１０μｇ／ＵｓｐＡ２（ＭＣ００９構築物）３．３μｇ／ＡＳ０１_Ｅ
ＡＳ０１_Ｅ（陰性対照）
ＰＢＳ（陰性対照）
２５μｇの熱不活化Ｍ． ｃａｔ．系統Ｆ１０ ＷＣ（ワクチンＵｓｐＡ２と５３％の相同性を有するＵｓｐＡ２を発現する）の１回の鼻腔内投与によりまたは対照としてのＰＢＳの１回の鼻腔内投与（両方とも５６日目）により刺激した。新たに獲得されたＭ． ｃａｔ．系統により新たな増悪を受けるＣＯＰＤ患者に見られる状態を模倣するために、刺激系統は感作系統とは異なった。

感作により誘発される肺炎症に及ぼすワクチン接種および抗原刺激の影響を評価するために、
マウスを４３日目から６３日目まで毎日監視し、死亡率および有害事象（虚脱、起毛、円背）の誘導を示す臨床徴候を観察した。
潜在的に望ましくないＴ細胞応答の誘導を、ワクチン接種後７および１４日目に採取した肺のプールで評価した（４プール／群／時点およびマウス３個体の肺／プール）。肺Ｔ細胞をＵｓｐＡ２ペプチド、熱不活化Ｍ． ｃａｔ．Ｆ１０ ＷＣまたは培地（陰性対照として）のいずれかで一晩再刺激した後、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現に関してフローサイトメトリーにより分析した。

・結果
死亡または有害事象は報告されなかった。

・Ｔ細胞応答：
・ＷＣによる再刺激時に肺で強い抗原投与後ＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答（主としてＩＬ−１７およびＴＮＦα産生細胞）が測定されたが、投与した処方物には無関係であった（ワクチンまたはアジュバント単独またはＰＢＳ）（図３４〜３７）。驚くことではないが、これらの応答はＰＢＳで刺激したマウスよりも不活化細菌で刺激したマウスで高かった。刺激は何であれ、肺ＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答は低いかまたは全く観察されなかった（データは示されていない）。
・いずれの群でもＵｓｐＡ２ペプチドにより再刺激された検出可能なＴ細胞応答は無く、このことは、ワクチン接種後にＵｓｐＡ２特異的応答がプライムミングまたは増強されたことを示す（データは示されていない）。

結論
供試したＰＤ／ＰＥＰｉｌＡ／ＵｓｐＡ２／ＡＳ０１_Ｅ処方物およびより具体的にはこれらのワクチンのＵｓｐＡ２成分は、マウスＭ． ｃａｔ．肺炎症モデルにおいて安全性が示された。

Claims (40)

1. 式Ｉ：
   Ａ−（Ｒ_１）_ｍ−（Ｂ）_ｎ（式Ｉ）
   ［式中、
   Ａは、モラクセラ・カタラーリス由来のＵｓｐＡ２またはその免疫原性フラグメントであり；
   Ｒ_１は、アミノ酸であり；
   ｍは、０または２であり；
   Ｂは、ヒスチジンであり；かつ
   ｎは、０、１、２、３、４、５または６である］
   のタンパク質。
2. ＡがＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、請求項１に記載のタンパク質。
3. Ａが配列番号１〜配列番号３８のいずれか１つに由来するＵｓｐＡ２である、請求項１〜２のいずれか一項に記載のタンパク質。
4. ｍが２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
5. ｍが０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
6. （Ｒ_１）_ｍがＡＳ（アラニンセリン）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
7. ｎが１、２および６からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
8. ｎが２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
9. アミノ末端にメチオニンをさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質。
10. ｎが０である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
11. ＡがＵｓｐＡ２であり、ＵｓｐＡ２は、その全長にわたって配列番号１と少なくとも６３％、６６％、７０％、７２％、７４％、７５％、７７％、８０％、８４％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
12. Ａが、配列番号１のアミノ酸３０〜５４０（配列番号３９）、配列番号１のアミノ酸３１〜５４０（配列番号４０）、配列番号１のアミノ酸３０〜５１９（配列番号４１）、配列番号１のアミノ酸３０〜５６４（配列番号４２）および配列番号１のアミノ酸３１〜５６４（配列番号４３）からなる群から選択されるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
13. Ａが、配列番号３９と少なくとも５２％、５５％、５７％、６２％、６４％、６９％、７３％、７６％、８１％、８８％または１００％の同一性を有するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
14. Ａが、配列番号４３と少なくとも５２％、５７％、６２％、６５％、６７％、７０％、７３％、７６％、８１％、１００％の同一性を有するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
15. 前記タンパク質が配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３および配列番号８８からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
16. Ａがラミニン結合ドメインおよびフィブロネクチン結合ドメインを含んでなるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
17. Ａが、ラミニン結合ドメイン、フィブロネクチン結合ドメインおよびＣ３結合ドメインを含んでなるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項に定義される式（Ｉ）のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物。
19. 配列番号１のアミノ酸３０〜５４０（配列番号３９）、配列番号１のアミノ酸３１〜５４０（配列番号４０）、配列番号１のアミノ酸３０〜５１９（配列番号４１）、配列番号１のアミノ酸３０〜５６４（配列番号４２）および配列番号１のアミノ酸３１〜５６４（配列番号４３）からなる群から選択されるＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
20. 配列番号３９と少なくとも５２％、５５％、５７％、６２％、６４％、６９％、７３％、７６％、８１％、８８％または１００％の同一性を有するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
21. 配列番号４３と少なくとも５２％、５７％、６２％、６５％、６７％、７０％、７３％、７６％、８１％、１００％の同一性を有するＵｓｐＡ２の免疫原性フラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
22. 配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３および配列番号８８からなる群から選択されるタンパク質を含んでなる、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
23. インフルエンザ菌由来の少なくとも１つの抗原をさらに含んでなる、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
24. 少なくとも１つの抗原がタンパク質Ｄである、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
25. タンパク質Ｅをさらに含んでなる、請求項１８〜２４に記載の免疫原性組成物。
26. ＰｉｌＡをさらに含んでなる、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
27. ＰＥおよびＰｉｌＡが融合タンパク質として存在する、請求項２６に記載の免疫原性組成物。
28. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含んでなるワクチン。
29. アジュバントをさらに含んでなる、請求項２８に記載のワクチン。
30. アジュバントがＡＳ０１Ｅである、請求項２９に記載のワクチン。
31. 前記免疫原性組成物が配列番号６９のタンパク質、タンパク質ＤおよびＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質を含有する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のワクチン。
32. 前記ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質がＬＶＬ−７３５である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のワクチン。
33. 必要とする対象における中耳炎の治療または予防方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含んでなる、方法。
34. 必要とする対象における慢性閉塞性肺疾患（ＡＥＣＯＰＤ）の急性増悪の治療または予防方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含んでなる、方法。
35. 必要とする対象における肺炎の治療または予防方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含んでなる、方法。
36. 必要とする対象におけるＭ．カタラーリス感染または疾患の治療または予防方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含んでなる、方法。
37. 中耳炎の治療または予防における使用のための、請求項１〜１７のタンパク質、または請求項１８〜２７の免疫原性組成物、または請求項２８〜３２のワクチン。
38. 慢性閉塞性肺疾患（ＡＥＣＯＰＤ）の急性増悪の治療または予防における使用のための、請求項１〜１７のタンパク質、または請求項１８〜２７の免疫原性組成物、または請求項２８〜３２のワクチン。
39. 肺炎の治療または予防における使用のための、請求項１〜１７のタンパク質、または請求項１８〜２７の免疫原性組成物、または請求項２８〜３２のワクチン。
40. Ｍ．カタラーリス感染または疾患の治療または予防における使用のための、請求項１〜１７のタンパク質、または請求項１８〜２７の免疫原性組成物、または請求項２８〜３２のワクチン。