BE1024785B1 - Vaccin - Google Patents

Abstract

Protéines VP2 de HRV utiles en tant que composants de compositions immunogèines pour l'induction d'une immunité à méldiation cellulaire présentant une réactivité croisée contre une infection par un rhinovirus humain ; constructions d'acides nucléiques codant pour de telles protéines VP2 de HRV.

Description

(30) Données de priorité :

05/10/2016 GB 1616904.7 (73) Titulaire(s) :

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA

1330, RIXENSART

Belgique (72) Inventeur(s) :

GERARD Catherine Marie Ghislaine

1330 RIXENSART

Belgique

GIANNINI Sandra 1330 RIXENSART Belgique

MASSAUX Julien Thierry 1330 RIXENSART Belgique (54) VACCIN (57) Protéines VP2 de HRV utiles en tant que composants de compositions immunogèines pour l'induction d'une immunité à méldiation cellulaire présentant une réactivité croisée contre une infection par un rhinovirus humain ; constructions d'acides nucléiques codant pour de telles protéines VP2 de HRV.

Figure 1

BREVET D'INVENTION BELGE

SPF Economie, PME, Classes Moyennes & Energie

Numéro de publication : 1024785 Numéro de dépôt : BE2017/5714

Office de la Propriété intellectuelle Classification Internationale : C07K 14/005 A61K 39/12 Date de délivrance : 02/07/2018

Le Ministre de l'Economie,

Vu la Convention de Paris du 20 mars 1883 pour la Protection de la propriété industrielle ;

Vu la loi du 28 mars 1984 sur les brevets d'invention, l'article 22, pour les demandes de brevet introduites avant le 22 septembre 2014 ;

Vu le Titre 1er “Brevets d’invention” du Livre XI du Code de droit économique, l'article XI.24, pour les demandes de brevet introduites à partir du 22 septembre 2014 ;

Vu l'arrêté royal du 2 décembre 1986 relatif à la demande, à la délivrance et au maintien en vigueur des brevets d'invention, l'article 28 ;

Vu la demande de brevet d'invention reçue par l'Office de la Propriété intellectuelle en date du 05/10/2017.

Considérant que pour les demandes de brevet tombant dans le champ d'application du Titre 1er, du Livre XI du Code de Droit économique (ci-après CDE), conformément à l'article XI. 19, §4, alinéa 2, du CDE, si la demande de brevet a fait l'objet d'un rapport de recherche mentionnant un défaut d'unité d'invention au sens du §ler de l'article XI.19 précité et dans le cas où le demandeur n'effectue ni une limitation de sa demande ni un dépôt d'une demande divisionnaire conformément aux résultats du rapport de recherche, le brevet délivré sera limité aux revendications pour lesquelles le rapport de recherche a été établi.

Arrête :

Article premier. - Il est délivré à

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA, Rue de l'Institut 89, 1330 RIXENSART Belgique;

représenté par

PRONOVEM - Office Van Malderen, Avenue Josse Goffin 158, 1082, BRUXELLES;

un brevet d'invention belge d'une durée de 20 ans, sous réserve du paiement des taxes annuelles visées à l’article XI.48, §1 du Code de droit économique, pour : VACCIN.

INVENTEUR(S) :

GERARD Catherine Marie Ghislaine, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA Rue de l'Institut 89, 1330, RIXENSART;

GIANNINI Sandra, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'Institut 89, 1330, RIXENSART;

MASSAUX Julien Thierry, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'Institut 89, 1330, RIXENSART;

PRIORITE(S) :

05/10/2016 GB 1616904.7;

DIVISION :

divisé de la demande de base : date de dépôt de la demande de base :

Article 2. - Ce brevet est délivré sans examen préalable de la brevetabilité de l'invention, sans garantie du mérite de l'invention ou de l'exactitude de la description de celle-ci et aux risques et périls du (des) demandeur(s).

Bruxelles, le 02/07/2018, Par délégation spéciale :

BE2017/5714

VACCIN

Contexte

La présente invention concerne des compositions immunogènes pour une utilisation dans la prévention ou l'amélioration d'une maladie provoquée par un rhinovirus humain.

Les rhinovirus humains (HRV) sont les agents viraux infectieux les plus courants chez les êtres humains et ils sont la cause prédominante du rhume. Les HRV sont également liés à des exacerbations de la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), au développement de l'asthme, et, plus récemment, à une bronchiolite sévère chez les nourrissons et les enfants ainsi qu'à une pneumonie fatale chez les personnes âgées et les adultes immunodéprimés. Par conséquent, le développement d'un vaccin pour le HRV est hautement recommandé mais les efforts sont gênés par l'existence de plus de 100 sérotypes de HRV, avec une variabilité de séquence à haut niveau dans les sites antigéniques. Les réponses immunitaires humorales sont importantes pour la prévention d'une infection par le HRV. L'infection par le HRV chez les sujets naïfs en anticorps est suivie du développement dans le sérum d'anticorps neutralisants spécifiques du sérotype (IgG) ainsi que d'anticorps sécrétoires (IgA) dans les voies respiratoires. Des études d'épreuve virale chez les êtres humains ont démontré que des anticorps préexistants spécifiques du type de HRV peuvent protéger contre une infection par le HRV (Alper et al., 1998). Des réponses cellulaires spécifiques du CD4 se développent comme conséquence

BE2017/5714 d'une infection par le HRV. Les cellules CD4 sont grandement de type Thl' et leur production d'IFN-γ contribue à la réponse immunitaire antivirale, mais ces cellules CD4 pourront également faciliter le développement de la réponse immunitaire humorale.

La littérature indique qu'une sensibilisation avec la protéine VPO du HRV16 adjuvée avec de l'IFA a impacté directement l'ampleur des anticorps neutralisants hétérotypiques induits contre une infection par le rhinovirus (Glanville et al., 2013) . Dans le document WO 2014/122220, basé sur les résultats de Glanville, la protéine VP4 a été identifiée comme présentant une homologie élevée parmi les HRV, et par conséquent est tenue responsable des lymphocytes T CD4 auxiliaires présentant une réactivité croisée induits par la VPO qui pourront accélérer la production d'anticorps neutralisants lors d'infections naturelles par le HRV. Dans le document WO 2016/134288, les épitopes peptidiques des lymphocytes T CD4+ ont été identifiés.

Résumé

Il est fourni ici des protéines VP2 de HRV utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une immunité à médiation cellulaire présentant une réactivité croisée large contre une infection par le rhinovirus.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une composition immunogène comprenant une protéine VP2 de HRV, en particulier en combinaison avec un adjuvant, par exemple, un adjuvant Thl, tel qu'un adjuvant contenant une saponine.

BE2017/5714

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant une protéine VP2 de HRV. Dans certains modes de réalisation, il est fourni un vecteur comprenant une telle séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant une protéine VP2 de HRV, tel qu'un vecteur adénoviral. Dans certains modes de réalisation, il est fourni une molécule d'ARN s'autoamplifiant comprenant la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant une protéine VP2 de HRV, tel qu'un vecteur SAM. Dans d'autres modes de réalisation, il est fourni des compositions immunogènes comprenant de tels vecteurs ou de telles séquences d'acide nucléique.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni de telles compositions immunogènes comprenant la protéine VP2 de HRV en combinaison avec un adjuvant, et/ou, des constructions à base d'acide nucléique codant pour des protéines VP2 de HRV, pour une utilisation en médecine, par exemple, pour une utilisation dans la prévention ou l'amélioration d'une maladie ou des symptômes d'une maladie provoquée par ou associée à une infection par le HRV chez un sujet, ou, pour une utilisation chez un sujet afin de réduire le temps de récupération à partir d'une infection par le HRV d'un sujet et/ou afin d’amoindrir la gravité d'une maladie provoquée par une infection par le HRV d'un sujet, ou, pour une utilisation chez un sujet afin de réduire ou de prévenir les symptômes cliniques lors d'une infection par le HRV du sujet, ou, pour une utilisation chez un sujet afin d'induire une réponse immunitaire présentant

BE2017/5714 une réactivité croisée contre au moins trois sérotypes de HRV, comme lorsqu'au moins l'un des au moins trois sérotypes de HRV appartient au type A de HRV et au moins un autre des au moins trois sérotypes de HRV appartient au type B de HRV ou au type C de HRV.

Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène est destinée à une utilisation chez des sujets atteints de BPCO (tels que des personnes âgées) ou d'asthme (tels que des nourrissons ou des enfants) .

Dans certains modes de réalisation, les procédés de réduction du temps de récupération à partir d'une infection par le HRV chez un sujet et/ou d'amoindrissement de la gravité de la maladie provoquée par une infection par le HRV chez un sujet en ayant besoin, comprennent l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène telle que divulguée ici.

Dans certains modes de réalisation, les procédés de réduction ou de prévention des symptômes cliniques lors d'une infection par le HRV chez un sujet en ayant besoin, comprennent l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène telle que divulguée ici.

Dans certains modes de réalisation, des procédés d'induction d'une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée contre au moins trois sérotypes de HRV chez un sujet en ayant besoin, comprennent l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène telle que divulguée ici.

BE2017/5714

Brève description des figures

Figure 1 - Quantification du génome d'ARN simple brin positif dans des liquides de LBA à J2 après l'épreuve intranasale par le HRVlb - chaque point représente des valeurs individuelles d'une souris (n = 5/groupe) et les résultats sont présentés avec la médiane (lignes horizontales).

Figure 2 - Numération différentielle des leucocytes (lymphocytes, neutrophiles, macrophages, éosinophiles) dans les liquides de LBA. recueillis 2 jours après l'épreuve par le HRVlb. Chaque point représente des valeurs individuelles d'une souris (n = 5/groupe) et les résultats sont présentés avec la médiane (lignes horizontales).

Figure 3 - Les taux des cytokines inflammatoires (TNF-a, IFN-γ, IL-6, IL-10 et IL-12p70) et des chimiokines (MCP-1) sécrétées dans les liquides de LBA ont été étudiés 2 jours après l'épreuve par le HRVlb. Chaque point représente des valeurs individuelles d'une souris (n = 5/groupe) et les résultats sont présentés avec la médiane (lignes horizontales).

Figure 4 - Réponse en lymphocytes T CD4 + spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des peptides VP2 du HRV39. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 5 - Réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des peptides VP4 du HRV2. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

BE2017/5714

Figure 6 - Réponse en lymphocytes T CD4 + spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des peptides VP4 du HRV39. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 7 - Réponse en lymphocytes T CD4 + spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des peptides VP2 du HRV2. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 8 - Réponse en lymphocytes T CD4 + spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des peptides VP2 du HRV14. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 9 - Réponse en lymphocytes T CD4 + spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des particules UC du HRV25. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 10 - Réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des peptides UC du HRV3. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 11 - Réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des particules UC du HRV28. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

BE2017/5714

Figure 12 - Réponse en lymphocytes T CD8+ spécifiques à la suite d'une stimulation in vitro avec des particules UC du HRV25. Les données sont représentées pour des souris individuelles (points ; n = 5/groupe) avec la médiane / groupe (ligne horizontale).

Figure 13 - Réponses en anticorps neutralisants spécifiques de HRVlb détectées avant/après l'épreuve par le HRVlb. Les données sont représentées pour des sérums de souris groupés (5 ou 7 groupes de 3 souris/groupe) avec la médiane/groupe (ligne horizontale).

Figure 14 - Production d'IFN-γ par les lymphocytes T CD4+ CD44+ chez des souris immunisées avec VP2, VP4 ou VPO du HRV39 ; l'IFN-γ a été déclenché chez les souris immunisées par VP2 et VPO du HRV39 en réponse aux groupes de peptides.produits à partir de VP2 de virus HRV homologues (14Ά) ou hétérologues (14B, 14C, 14D, ou 14E). Les données présentées sont des souris individuelles (n = 6 par groupe) avec la médiane indiquée par une ligne horizontale. En se déplaçant de gauche à droite sur chaque figure, les colonnes présentent les données des souris immunisées avec VP2 du HRV39, VP4 du HRV39, VPO du HRV39, le virus vivant HRV39, et du sérum physiologique, respectivement. Veuillez noter les différences de limite supérieure sur l'ordonnée.

Figure 15 - Production d'IFN-γ par les lymphocytes T CD4+ CD44+ chez des souris immunisées avec VP2, VP4 ou VPO du HRV39 : peu à pas d'IFN a été produit en réponse aux groupes de peptides produits à partir de VP4 de types de HRV homologues (15A) ou hétérologues (15B, 15C, 15D, 15E) . Les données présentées sont des souris individuelles (n = 6 par groupe) avec la médiane

BE2017/5714 indiquée par une ligne horizontale. En se déplaçant de gauche à droite sur chaque figure, les colonnes présentent les données des souris immunisées avec VP2 du HRV39, VP4 du HRV39, VPO du HRV39, le virus vivant HRV39, et du sérum physiologique, respectivement.

Figure 16A - Alignements de la séquence d'acides aminés de la protéine VP2 des types de HRV utilisés dans l'exemple 4. Une vue globale de l'étendue dans laquelle chaque acide aminé est conservé au sein des types est incluse. La hauteur de la barre sur la ligne « identité » est en relation directe avec le degré auquel l'acide aminé est conservé.

Figure 16B - Tableau des types de HRV utilisés dans l'exemple 4, affichant le pourcentage d'identité au niveau des acides aminés en utilisant des comparaisons par paires.

Figure 16C - Alignement des acides aminés en texte pour les types de HRV utilisés dans l'exemple 4 ; HRV_39VP2 (SEQ ID NO : 1), HRV_89-VP2 (SEQ ID NO : 15), HRV_1B-VP2 (SEQ ID NO : 16), HRV_02-VP2 (SEQ ID NO : 17), et HRV_14-VP2 (SEQ ID NO : 18).

Description détaillée

Constructions de protéines VP2 de HRV

Il est fourni des constructions de protéines VP2 de HRV utiles en tant que composant antigénique de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée chez un sujet contre le rhinovirus humain (HRV). Tel qu'utilisé ici, le terme « antigène » se rapporte à une molécule contenant un ou plusieurs épitopes (par exemple,

BE2017/5714 linéaires, conformationnels ou les deux) qui stimuleront le système immunitaire d'un hôte pour fabriquer une réponse immunologique humorale et/ou cellulaire spécifique de l'antigène (c'est-à-dire, une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide existant à l'état naturel) . Un « épitope » est cette partie d'un antigène qui détermine sa spécificité immunologique. Les épitopes des lymphocytes T et B peuvent être identifiés empiriquement (par exemple, en utilisant un PEPSCAN ou des procédés similaires). Dans le contexte de la présente invention, l'induction d'une « réponse immunitaire présentant une réactivité croisée » signifie qu'une réponse immunitaire est induite à la fois contre le type de HRV à partir duquel l'antigène de HRV dans la composition immunogène, par exemple, la protéine VP2 de HRV de l'invention, est dérivé (c'est-à-dire, une réponse immunitaire homologue), et, contre un ou plusieurs types de HRV différents du type de HRV à partir duquel l'antigène de HRV dans la composition immunogène est dérivé (c'est-à-dire, une réponse immunitaire hétérologue). Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention induit une réponse immunitaire contre à la fois des sérotypes homologues et hétérologues de rhinovirus humain.

Pour l'objectif de la présente invention, les termes « construction de protéine VP2 de HRV », « protéine VP2 de rhinovirus humain » ou « protéine VP2 de HRV », ou « protéine VP2 » sont utilisés de façon interchangeable et se rapportent à toute séquence d'acides aminés correspondant à la séquence d'acides

BE2017/5714 aminés de la protéine de la capside VP2 de tout sérotype de HRV. Les variants immunogènes d'une construction de protéine VP2 de HRV sont des séquences d'acides aminés présentant au moins ou exactement 75 %, 77 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, ou 99 % d'identité, sur la longueur entière, avec la séquence native de VP2 de HRV. La protéine VP2 a une longueur d'environ 270 acides aminés. Le tableau 1 énumère les numéros d'accession Uniprot des séquences des polyprotéines complètes du génome pour des sérotypes de HRV choisis parmi les trois clades. Généralement, la protéine VP2 est située entre les acides aminés 70 et 339 du précurseur de la polyprotéine. Ainsi, en se basant sur ces séquences, l'homme du métier peut en dériver les séquences de type sauvage des protéines VP2 et/ou VP4 de HRV pour les sérotypes de HRV, pour une utilisation dans les présents exemples et dans la présente invention.

Comme il est également connu de l'homme du métier, la longueur de la séquence d'acides aminés de la protéine VP2 peut légèrement varier selon le sérotype de HRV. Par exemple, la protéine VP2 de type sauvage du HRV39 correspond aux acides aminés 70 à 334 de la séquence de

type sauvage de	VP0 du	HRV39 (SEQ	ID	NO : 4).
Trois espèces de	HRV ont	été	identifiées	dans
lesquelles les à-dire, HRV-A,	plus de HRV-B et	cent types HRV-C.	sont classés, c'	' est-
L'espèce	HRV-A	comprend	en	particulier	les

sérotypes suivants :	: HRVla, HRVlb, HRV2, HRV7, HRV8,
HRV9, HRV10, HRV11,	HRV12,	HRV13,	HRV15,	HRV16, HRV18,
HRV19, HRV20, HRV21,	HRV22,	HRV23,	HRV2 4,	HRV25, HRV28,
HRV29, HRV30, HRV31,	HRV32,	HRV33,	HRV34,	HRV36, HRV38,

BE2017/5714

HRV39,	HRV40,	HRV41,	HRV43, HRV44	, HRV45, HRV46,	HRV47,
HRV49,	HRV50,	HRV51,	HRV53, HRV54	, HRV55, HRV56,	HRV57,
HRV58,	HRV59,	HRV60,	HRV61, HRV62	, HRV63, HRV64,	HRV65,
HRV66,	HRV67,	HRV68,	HRV71, HRV73	, HRV74, HRV75,	HRV76,
HRV77,	HRV78,	HRV80,	HRV81, HRV82	, HRV85, HRV88,	HRV8 9,
HRV90,	HRV94,	HRV95	, HRV96, HRV98, HRV100,	HRV101,
HRV102	et HRV103.
L	'espèce	HRV-B	comprend	en particulier les
sérotypes suivants :	HRV3, HRV4	, HRV5, HRV6,	HRV14,
HRV17,	HRV26,	HRV27,	HRV35, HRV37	r HRV42, HRV48,	HRV52,
HRV69,	HRV70,	HRV72,	HRV79, HRV83	, HRV84, HRV86,	HRV91,
HRV92,	HRV93,	HRV97 et HRV99.
L'	espèce	HRV-C	comprend	en particulier les

sérotypes suivants : HRV-C1, HRV-C2, HRV-C3, HRV-C4,

HRV-C5, HRV-C6, HRV-C7, HRV-C8,	HRV-C9,	HRV-C10,	HRV-
Cil,	HRV-C12,	HRV-C13,	HRV-C14,	HRV-C15,	HRV-C16,	HRV-
07,	HRV-C18,	HRV-C19,	HRV-C20,	HRV-C21,	HRV-C22,	HRV-
C23,	HRV-C24,	HRV-C25,	HRV-C26,	HRV-C27,	HRV-C28,	HRV-
C29,	HRV-C30,	HRV-C31,	HRV-C32,	HRV-C33,	HRV-C34,	HRV-
C35,	HRV-C36,	HRV-C37,	HRV-C38,	HRV-C39,	HRV-C40,	HRV-
C41,	HRV-C42,	HRV-C43,	HRV-C44,	HRV-C45,	HRV-C46,	HRV-

C47, HRV-C48 et HRV-C49.

Tableau 1

Clade	HRV	Accession Uniprot	Clade	HRV	Accession Oniprot
A	HRV1	B9V432	A	HRV7 5	A5GZF9
A	HRV10	A5GZE7	A	HRV7 6	B9V4A3
A	HRV100	B9V496	A	HRV7 7	B9V475
A	HRV101	D2IW01	A	HRV7 8	B9V4A4
A	HRV11	A7KC06	A	HRV8	B9V434
A	HRV12	A7KC07	A	HRV 8 0	B9V477

BE2017/5714

Clade	HRV	Accession Uniprot	Clade	HRV	Accession Uniprot
A	HRV13	B9V437	A	HRV81	B9V478
A	HRV15	A5GZE2	A	HRV8 2	B9V481
A	HRV16	Q82122	A	HRV85	B9V484
A	HRV18	B9V439	A	HRV88	A5GZF3
A	HRV19	B9V440	A	HRV8 9	P07210
A	HRV1B	P12916	A .	HRV 9	B9V436
A	HRV2	P04936	A	HRV 90	B9V488
A	HRV20	B9V441	A	HRV 9 4	B9V4A6
A	HRV21	B9V442	A	HRV 9 5	B9V491
A	HRV 2 2	B9V443	A	HRV 9 6	B9V492
A	HRV2 3	A5GZE6	A	HRV 9 8	B9V494
A	HRV2 4	B9V4B1	B	HRV 14	P03303
A	HRV25	B9V444	B	HRV17	A7KC12
A	HRV2 8	A5GZF7	B	HRV2 6	B9V445
A	HRV2 9	B9V446	B	HRV2 7	A7KC13
A	HRV30	B9V4A0	B	HRV3	A7RC14
A	HRV31	B9V447	B	HRV35	B9V4A8
A	HRV32	B9V448	B	HRV37	A7KC15
A	HRV33	B9V449	B	HRV4	A5GZD9
A	HRV 3 4	B9V4B0	B	HRV4 2	B9V451
A	HRV3 6	A5GZF4	B	HRV 4 8	A5GZD7
A	HRV3 8	A5GZE4	B	HRV5	B9V433
A	HRV3 9	Q5XLP5	B	HRV52	B9V458
A	HRV 4 0	B9V450	B	HRV 6	A5GZD5
A	HRV41	A5GZE0	B	HRV 6 9	B9V472
A	HRV4 3	B9V452	B	HRV7 0	A5GZD8
A	HRV4 4	A5GZE8	B	HRV7 2	D6PT65
A	HRV4 5	B9V453	B	HRV7 9	B9V476
A	HRV 4 6	A5GZF5	B	HRV 8 3	B9V482
A	HRV4 7	B9V454	B	HRV8 4	B9V483
A	HRV4 9	B9V455	B	HRV8 6	B9V485
A	HRV5 0	B9V456	B	HRV 91	B9V489
A	HRV51	B9V457	B	HRV 9 2	B9V490
A	HRV5 3	A5GZF6	B	HRV93	A7KC17
A	HRV54	B9V459	B	HRV97	B9V493

BE2017/5714

Clade	HRV	Accession Uniprot	Clade	HRV	Accession Uniprot
A	HRV5 5	A5GZG0	B	HRV 9 9	B9V495
A	HRV5 6	B9V461	C	HRVC-11	C5HDF8
A	HRV5 7	B9V462	C	HRVC - SOUCHE CU072	E9LS20
A	HRV58	B9V463	C	HRVC - CU184	E9LS23
A	HRV5 9	A5GZE9	C	HRVC-15	E5D8F2
A	HRV60	B9V464	C	HRVC-24	A8S322
A	HRV 61	B9V465	C	HRVC-25	A8S330
A	HRV 6 2	B9V466	c	HRVC-26	A8S334
A	HRV63	B9V467	c	HRVC - SOUCHE NATO45	A7TUB2
A	HRV 6 4	B9V4A2	c	HRVC - SOUCHE NAT001	A7TUB1
A	HRV 6 5	B9V468	c	HRVC - SOUCHE NY-074	A0MHB7
A	HRV66	B9V469	c	HRVC-04	C7DUC6
A	HRV 6 7	B9V470	c	HRVC-10	C7DÜC7
A	HRV68	B9V471	c	HRVC-03	A4UHT9
A	HRV7	B9V497	c	HRVC - SOUCHE QCE	C9DDK2
A	HRV71	B9V473	c	HRVC-54	A0A0B5HPB2
A A	HRV7 3 HRV7 4	A5GZE1 A5GZE3	c	HRVC-35	H8Y6P9

Les types de HRV peuvent être également groupés selon l'usage du récepteur, en virus du groupe mineur et virus du groupe majeur. Les virus du groupe mineur, tels que le HRV2, utilisent en tant que récepteur la famille des récepteurs des lipoprotéines de basse densité. Ils sont labiles à l'acide et présentent une dépendance absolue à un pH bas pour la décapsidation. Les virus du groupe majeur, tels que les HRV14 et HRV16, utilisent la molécule d'adhérence intercellulaire 1 (ICAM-1) en tant que récepteur. Ils sont généralement labiles à l'acide

BE2017/5714 mais, à la différence des virus du groupe mineur, ils ne présentent pas une dépendance absolue à un pH bas pour la décapsidation. Comme il est bien connu de l'homme du métier, les HRV du groupe mineur comprennent 11 sérotypes, y compris HRV1A, HRV1B, HRV2, HRV23, HRV25, HRV29, HRV30, HRV31, HRV44, HRV47, HRV49 et HRV62.

Pour l'objectif de l'invention, la protéine VP2 de l'un quelconque des types de HRV énumérés ici peut être utilisée. Dans un mode de réalisation, la protéine VP2 de HRV est la protéine VP2 de HRV des HRV39, HRVlb, HRV2, HRV3, HRV14, HRV25 ou HRV28, ou, l'un de leurs variants immunogènes. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine VP2 de HRV est la protéine VP2 du HRV39 (SEQ ID NO : 1) ou l'un de ses variants immunogènes présentant au moins 90 %, 95 %, 97 %, ou 99 % d'identité, sur la longueur entière, avec SEQ ID NO : 1.

L'identité ou l'homologie en ce qui concerne une séquence est définie ici comme le pourcentage de résidus d'acides aminés dans la séquence candidate qui sont identiques à la séquence d'acides aminés de référence après l'alignement des séquences et l'introduction de brèches, si nécessaire, pour obtenir le pourcentage maximal d'identité de séquence, et en ne considérant aucune substitution conservative comme faisant partie de l'identité de séquence.

L'identité de séquence peut être déterminée par des procédés classiques qui sont couramment utilisés pour comparer la similarité en position des acides aminés de deux polypeptides. En utilisant un programme informatique tel que BLAST ou FASTA, deux polypeptides sont alignés pour une correspondance optimale de leurs

BE2017/5714 acides aminés respectifs (soit tout le long de la pleine longueur de l'une ou des deux séquences soit tout le long d'une partie prédéterminée de l'une ou des deux séquences) . Les programmes fournissent une pénalité d'ouverture par défaut et une pénalité de brèche par défaut, et une matrice de score telle que PAM 250 [une matrice de score classique ; voir Dayhoff et al., dans Atlas of Protein Sequence et Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] peut être utilisée conjointement avec le programme informatique. Par exemple, le pourcentage d'identité peut être ensuite calculé comme : le nombre total de correspondances identiques multiplié par 100 et ensuite divisé par la somme de la longueur de la séquence la plus longue au sein de la fenêtre correspondante et du nombre de brèches introduites dans les séquences plus courtes afin d'aligner les deux séquences.

Lorsqu'il est fait référence ici à une séquence par un code d'accession UniProt ou Genbank, la séquence à laquelle il est fait référence est la version à la date de dépôt de la présente demande.

Dans un mode de réalisation, les protéines VP2 de HRV décrites ici sont isolées de façon appropriée. Une protéine VP2 de HRV « isolée » est l'une qui est retirée de son environnement original. De façon similaire, les polynucléotides décrits ici sont isolés de façon appropriée. Par exemple, une protéine existant à l'état naturel est isolée si elle est séparée de certains ou de la totalité des matériaux coexistant dans le système naturel. Un polynucléotide est considéré comme isolé si, par exemple, il est cloné dans un vecteur qui ne fait

BE2017/5714 pas partie de son environnement naturel ou s'il est compris au sein d'un ADNc.

Dans un mode de réalisation, un variant immunogène d'une protéine VP2 de HRV correspond à une protéine VP2 de HRV dans laquelle une séquence d'acides aminés de jusqu'à 25, ou, jusqu'à 20 acides aminés peut être insérée, substituée ou délétée, par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acide (s) aminé (s) . Dans un mode de réalisation plus spécifique, une telle insertion, substitution ou délétion est localisée dans ces parties des séquences d'acides aminés de la protéine VP2 qui correspondent à des régions hautement variables de la protéine VP2 de HRV. Les régions dans la protéine VP2 de HRV appropriées pour une telle insertion, substitution ou délétion comprennent les aal55 à 170 (c'est-à-dire, la boucle NIm-II), les aal34 à 146, les aa232 à 238 et les aa72 à 75, dont la numérotation de chacune est basée sur la séquence pleine longueur de VP2 du HRV39 (SEQ ID NO : 1) Dans un mode de réalisation particulier, une insertion, délétion et/ou une substitution est localisée au niveau des aal55 à 170 (c'est-à-dire, la boucle NIm-II). Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine VP2 de HRV est la protéine VP2 du HRV39 comportant une mutation dans sa boucle NIm-II (SEQ ID NO : 2) ou l'un de ses variants immunogènes présentant au moins 90 %, 95 %, 97 %, ou 99 % d'identité avec SEQ ID NO : 2, sur la longueur entière. En variante, une insertion, une délétion et/ou une substitution est localisée à l'extrémité carboxy de VP2.

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Dans un autre mode de réalisation, un peptide de HRV est inséré ou substitué dans l'une desdites régions hautement variables de la protéine VP2 de HRV ; le peptide est dérivé de l'une des protéines VP1, VP2, VP3 ou VP4 de la capside de HRV, et est capable d'induire une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée et/ou une neutralisation croisée contre deux sérotypes de HRV ou plus. De tels peptides sont choisis ou dérivés de régions conservées des protéines structurales des rhinovirus humains. Une réponse présentant une réactivité croisée et/ou neutralisante peut être obtenue lorsque la séquence d'acides aminés du HRV est de longueur limitée. Ainsi, le peptide de HRV peut être constitué d'un fragment de 5 à 40 acides aminés contigus, ou de 8 à 30 acides aminés contigus, provenant d'une protéine de la capside pleine longueur de type sauvage de HRV (VP1, VP2, VP3 ou VP4). De façon favorable, le peptide de HRV est constitué de pas plus de 20 acides aminés, comme de 8 à 20 acides aminés, par exemple, 16 acides aminés. Dans un mode de réalisation quelconque, un peptide de HRV ou l'un de ses variants aura une longueur minimale de 8 acides aminés.

La protéine VP2 de 1'invention peut inclure ou comprendre des fragments d'acides aminés ou des peptides de HRV qui ont été décrits dans la littérature. Par exemple, il a été démontré que des anticorps induits avec des fragments d'acides aminés recombinants de VP1 du HRV-14 ou -89 couvrant les acides aminés 147 à 162 de VP1 du HRV14 présentent une activité spécifique et de neutralisation croisée (McCray & Werner, 1998 Nature Oct 22-28; 329(6141): 736-8 ; Edlmayr et al., 2011, Eur.

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Respir. J. 37: 44-52). Il a été observé que la structure de la capside des rhinovirus est dynamique et semble osciller entre deux états structuraux différents : un dans lequel la VP4 est profondément enfouie, et l'autre où l'extrémité N-terminale des VP4 et VP1 est accessible aux protéases (Lewis et al. 1998 Proc Natl Acad Sei U S A. 95(12) : 6774-8) . Il a été trouvé que les anticorps produits contre les 30 acides aminés N-terminaux de VP4 mais pas de VP1 neutralisent avec succès l'infectivité virale in vitro (Katpally et al. 2009, J Virol. 83(14) : 7040-8.). Il a été trouvé que les anticorps produits contre les 30 acides aminés N-terminaux de VP4 neutralisent les HRV14, HRV16 et HRV29. En outre, les anticorps produits contre une séquence consensus des 24 premiers résidus issus de VP4 de rhinovirus ont également présenté une certaine activité de neutralisation croisée (Katpally et al., 2009, J Virol. 83 (14) : 7040-8 . ) .

D'autres descriptions de peptides et/ou d'épitopes de HRV de la littérature peuvent se trouver dans : Niespodziana et al. 2012 (The FASEB Journal. Vol 26, 1001-1008) dans lequel une réponse contre un peptide 20mer N-terminal provenant de VP1 n'était pas une réponse de neutralisation, c'est-à-dire, un épitope non protecteur ; Miao et al. 2009 (J. Clin. Microbiol. Vol 47, No 10, 3108-3113) - les Acm produits contre la partie N-terminale de VP1 d'entérovirus qui est hautement conservée sont utiles dans la reconnaissance d'un large éventail d'entérovirus ; WO 2006/078648 concernant des vaccins à base de peptides contre le HRV dérivés des régions exposées de façon transitoire de VP4, en

BE2017/5714 particulier les acides aminés 1 à 31 ou 1 à 24 de VP4 ; WO 2011/050384 concernant des peptides provenant de l'extrémité N-terminale de VP1 comprenant les acides aminés 1 à 8 ; WO 2008/057158 concernant Nim IV de rhinovirus, en particulier un peptide comprenant les acides aminés 277 à 283 ou 275 à 285 provenant de la région carboxy-terminale de VP1, en particulier du HRV14 .

Il a été identifié d'autres peptides de HRV dérivés des séquences N-terminales des VP1 et VP4, c'est-à-dire, des fragments d'acides aminés de HRV comprenant les acides aminés 32 à 45 de VP1 et des fragments d'acides aminés de HRV comprenant les acides aminés 1 à 16 de VP4, ou leurs variants comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique. Lorsqu'un variant d'une séquence peptidique comporte 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique, ceci signifie que le variant présente au moins une différence d'acide aminé comparativement à la séquence peptidique de référence, qui peut comprendre entre 0 et 4 additions ou délétions d'acides aminés à une extrémité et entre 0 et 4 additions ou délétions à l'autre extrémité et entre 0 et substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence.

Dans un mode de réalisation, un peptide est constitué d'au moins 8 et de pas plus de 20 acides aminés

BE2017/5714 provenant de l'extrémité N-terminale de VP4, lequel peptide de HRV comprend les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou un variant des acides aminés 1 à 16 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés a l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide VP4 de HRV est constitué des acides aminés 1 à 16 de VP4 ou d'un variant comportant une, deux, trois, ou quatre additions ou délétions ou substitutions d'acides aminés. D'autres fragments d'acides aminés spécifiques de VP4 de HRV comprennent, par exemple, les acides aminés 1 à [16 à 20], les acides aminés 2 à [17 à 21], 3 à [18 à 22], 4 à [19 à 23], 5 à [20 à 24] où il faudra comprendre que les nombres entre crochets comprennent tous les nombres dans la plage spécifiée individuellement. De façon favorable, le peptide VP4 de HRV est constitué de pas plus de 16 acides aminés contigus provenant de VP4. Il faudra comprendre que la numérotation du peptide VP4 de HRV ou d'un peptide ou d'une protéine quelconque (exprimé(e) de façon recombinante) comme il est utilisé ici est indépendante de la méthionine due au codon de départ.

Dans un autre mode de réalisation, un peptide de HRV est constitué d'au moins 8 et de pas plus de 40 acides aminés provenant de la région N-terminale de VP1, lequel peptide de HRV comprend les acides aminés 32 à 45 de VP1 ou un variant des acides aminés 32 à 45 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la

BE2017/5714 séquence peptidique. Dans un mode de réalisation particulier, le fragment d'acides aminés de VP1 de HRV est constitué des acides aminés 32 à 45 de VP4 ou d'un variant comportant une, deux, trois, ou quatre additions ou délétions ou substitutions d'acides aminés. Les peptides VP1 comprennent, par exemple, les acides aminés [5 à 35] à 45, [6 à 35] à 46, [7 à 35] à 47, [8 à 35] à 48, [9 à 35] à 49 et de façon similaire 32 à [45 à 72], 33 à [45 à 73], 34 à [45 à 74], 35 à [45 à 75] et 36 à [45 à 76] où les nombres entre crochets comprennent tous les nombres dans la plage spécifiée individuellement.

Les peptides de HRV pour l'objectif de l'invention comprennent ainsi :

- les acides aminés 147 à 162 de VP1 du HRV14 ou un variant des acides aminés 147 à 162 de VP1 du HRV14 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

- les acides aminés 1 à 30 de VP4 du HRV14 ou un variant des acides aminés 1 à 30 de VP4 du HRV14 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

- les acides aminés 1 à 24 de VP4 du HRV14 ou un variant des acides aminés 1 à 24 de VP4 du HRV14 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

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- les acides aminés 1 à 8 de VP1 du HRV14 ou un variant des acides aminés 1 à 8 de VP1 du HRV14 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

- les acides aminés 277 à 283 de VP1 du HRV14 ou un variant des acides aminés 277 à 283 de VP1 du HRV14 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

- les acides aminés 275 à 285 de VP1 du HRV14 ou un variant des acides aminés 275 à 285 de VP1 du HRV14 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

- les acides aminés 32 à 45 de VP1 ou un variant des acides aminés 32 à 45 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique ;

- les acides aminés 1 à 16 de VP4 ou un variant des acides aminés 1 à 16 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique.

Dans un mode de réalisation particulier, le peptide de HRV est dérivé de VP1 et a ou comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi :

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HRV14 (B) : 32-PILTANETGATMPV-45 (SEQ ID NO : 5)

HRV8 (A-M) : 32-PALDAAETGHTSSV-45 (SEQ ID NO : 6)

HRV25 (A-m) : 32-PILDAAETGHTSNV-45 (SEQ ID NO : 7)

HRV_C_026 : 32-QALGAVEIGATADV-45 (SEQ ID NO : 8) ou l'un de leurs variants comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence d'acides aminés.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le peptide de HRV est dérivé de VP4 et a ou comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi :

HRV14 (B) : 1-GAQVSTQKSGSHENQN-16 (SEQ ID NO : 9)

HRV100 (A-M) : 1-GAQVSRQNVGTHSTQN-16 (SEQ ID NO : 10)

HRV_C_026 : 1-GAQVSRQSVGSHETMI-16 (SEQ ID NO : 11) ou l'un de leurs variants comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés à l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence d'acides aminés. Pour l'objectif de la présente invention, les variants immunogènes sont constitués de ou comprennent une séquence d'acides aminés présentant au moins ou exactement 75 %, 77 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, ou 99 d'identité, sur la longueur entière, avec la séquence native.

Dans un autre mode de réalisation particulier, des peptides dérivés de VP2 du HRV2 peuvent être introduits dans la protéine VP2, où ledit peptide dérivé de VP2 du HRV2 est choisi parmi :

SSKGWWWKLPDALKDMGIFGENMFYHYLGRS (aa 143 à 173 de VP2 du HRV2) (SEQ ID NO : 12), IPEHQIASALHGNVNVGYNYTHPG

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ETGREVK (aa 196 à 226 de VP2 du HRV2) (SEQ ID NO : 13), et INTIPITISISPMCAEFSGARAKRQGLPVFI (aa 306 à 336 de VP2

du HRV2)	(SEQ	ID NO : 14).
Dans	un	mode de réalisation,	la	composition ne
comprend	pas	de protéine VP4 (ou	de	polynucléotide

comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine VP4 de HRV). Pour l'objectif de la présente invention, le terme « protéine VP4 de rhinovirus humain » ou « protéine VP4 de HRV » ou « protéine VP4 » se rapporte à toute séquence d'acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés de la protéine de la capside VP4 de tout sérotype de HRV ainsi que l'un de ses variants, où le variant est au moins identique à 90 % à la séquence d'acides aminés de VP4 d'un HRV.

La protéine VP2 de HRV peut être synthétisée chimiquement en utilisant des techniques classiques ou produite par recombinaison.

Protéine VP2 de HRV adjuvée

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin comprend la protéine VP2 de HRV telle que définie ici et en combinaison avec un adjuvant, tel qu'un adjuvant Thl.

Pour l'objectif de la présente invention, le terme « adjuvant » se rapporte à un composé ou une composition qui amplifie la réponse immunitaire contre un antigène, telle que la réponse immunitaire contre une protéine VP2 de HRV chez un sujet humain. Les exemples de tels adjuvants comprennent, mais n'y sont pas limités, des adjuvants inorganiques (par exemple, des sels de métaux inorganiques tels que le phosphate d'aluminium ou

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1'hydroxyde d'aluminium), des adjuvants organiques (par exemple, des saponines, telles que le QS21, ou le squalène), des adjuvants à base d'huile (par exemple, l'adjuvant complet de Freund et l'adjuvant incomplet de Freund), des cytokines (par exemple, IL-lß, IL-2, IL-7,

IL-12, IL-18, particulaires immunostimulants

GM-CSF, et IFN-γ) , des adjuvants (par exemple, des complexes (ISCOM), des liposomes, ou des microsphères biodégradables), des virosomes, des adjuvants bactériens (par exemple, le monophosphoryllipide A, tel que le monophosphoryl-lipide A 3-dés-Oacylé (3D-MPL), ou des muramyl-peptides), des adjuvants synthétiques (par exemple, des copolymères séquencés non ioniques, des analogues de muramyl-peptides, ou un lipide A synthétique), des adjuvants de polynucléotides synthétiques (par exemple, polyarginine ou polylysine), et des oligonucléotides immunostimulants contenant des dinucléotides CpG non méthylés (« CpG »).

Dans un mode de réalisation, l'adjuvant est un adjuvant contenant une saponine. Une saponine appropriée pour une utilisation dans la présente invention est le Quil A et ses dérivés. Le Quit A est une préparation de saponine isolée de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja saponaria Molina et il a été décrit pour la première fois comme possédant une activité adjuvante par Dalsgaard et al. en 1974 (Saponin adjuvants, Archiv, für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254). Des fragments purifiés de Quil A ont été isolés par HPLC, lesquels conservent une activité adjuvante sans la toxicité associée au Quil A (EP 0 362 278), par exemple QS7 et QS21 (également

BE2017/5714 connus en tant que QA7 et QA21) . Le QS-21 est une saponine naturelle dérivée de l'écorce de Quillaja saponaria Molina, qui induit des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL), des cellules Thl et une réponse prédominante en anticorps IgG2a et il s'agit d'une saponine préférée dans le contexte de la présente invention. Sous une forme appropriée de la présente invention, l'adjuvant de saponine au sein de la composition immunogène est un dérivé du Quil A de Quillaja saponaria Molina, de préférence une fraction immunologiquement active du Quil A, telle que QS-7, QS17, QS-18 ou QS-21, de façon appropriée QS-21.

Dans un mode de réalisation, la saponine comprend une combinaison de fractions de saponines telles que divulguées dans le document WO 1996/011711. En variante, des saponines (semi-)synthétiques sont considérées comme utiles telles que celles décrites par Govind Ragupathi et al. (Expert Rev Vaccines 2011 ; 10(4): 463-470).

La saponine est généralement fournie dans sa composition la moins réactogène ou elle est neutralisée par un stérol exogène, tel que le cholestérol. Les stérols appropriés comprennent le β-sitostérol, le stigmastérol, 1'ergostérol, 1'ergocalciférol et le cholestérol. Ces stérols sont bien connus dans l'art, par exemple, le cholestérol est divulgué dans l'Index Merck, llème Edn., page 341, en tant que stérol existant à l'état naturel trouvé dans la graisse animale. Il existe plusieurs formes particulières de compositions moins réactogènes dans lesquelles le QS21 est neutralisé avec un stérol exogène tel que le cholestérol. Dans un mode de réalisation, la saponine/stérol est présentée

BE2017/5714 dans une structure de formulation liposomique. Des procédés d'obtention de la saponine/stérol dans une formulation liposomique sont décrits dans le document WO 96/33739, en particulier, l'exemple 1.

Une saponine, telle que le QS21, peut être utilisée dans des quantités entre 1 et 100 pg par dose humaine de la composition d'adjuvant. Le QS21 peut être utilisé à un taux d'environ 50 pg, comme au moins 40 pg, au moins 45 pg ou au moins 49 pg, ou, inférieur à 100 pg, inférieur à 80 pg, inférieur à 60 pg, inférieur à 55 pg ou inférieur à 51 pg. Des exemples de plages appropriées se situent entre 40 et 60 pg, de façon appropriée entre 45 et 55 pg ou entre 49 et 51 pg ou 50 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition d'adjuvant comprend du QS21 à un taux d'environ 25 pg, comme au moins 20 pg, au moins 21 pg, au moins 22 pg ou au moins 24 pg, ou, inférieur à 30 pg, inférieur à 29 pg, inférieur à 28 pg, inférieur à 27 pg ou inférieur à 26 pg Des exemples de plages inférieures comprennent entre 20 et 30 pg, de façon appropriée entre 21 et 29 pg ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg, ou 25 pg.

Lorsque la fraction de saponine active est le QS21 et qu'un stérol est inclus, le rapport QS21/stérol sera généralement de l'ordre de 1/100 à 1/1 (p/p) , de façon appropriée entre 1/10 et 1/1 (p/p), et de préférence 1/5 à 1/1 (p/p). De façon appropriée, un excès de stérol est présent, le rapport QS21/stérol étant d'au moins 1/2 (p/p) . Dans un mode de réalisation, le rapport QS21/stérol est de 1/5 (p/p). Dans un mode de réalisation spécifique, le stérol est le cholestérol.

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Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend un agoniste du TLR-4 (également appelé ligand du TLR-4). Un exemple approprié d'agoniste du TLR-4 est un lipopolysaccharide, de façon appropriée un dérivé non toxique du lipide A, particulièrement le monophosphoryllipide A ou plus particulièrement le 3-désacylé monophosphoryl-lipide A (3D—MPL).

Le 3D-MPL est vendu sous le nom de MPL par GlaxoSmithKline Biologicals N.A. et il est appelé dans tout le document MPL ou 3D-MPL. Voir, par exemple, les brevets US No. 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094. Le 3D-MPL favorise principalement les réponses en lymphocytes T CD4+ avec un phénotype IFN-g (Thl) . Le 3D-MPL peut être produit selon les procédés décrits dans le document GB 2 220 211 A. Du point de vue chimique, il s'agit d'un mélange de 3-désacylé monophosphoryl-lipide A avec 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Dans les compositions de la présente invention, le 3DMPL à petites particules peut être utilisé pour préparer l'adjuvant. Le 3D-MPL à petites particules présente une taille de particule telle qu'il peut être stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 pm. De telles préparations sont décrites dans le document WO 94/21292.

D'autres ligands du TLR-4 qui peuvent être utilisés sont les aminoalkyl-glucosaminide phosphates (AGP) tels que ceux décrits dans le document WO 98/50399 ou le brevet US No. 6 303 347 (des procédés de préparation d'AGP sont également décrits), de façon appropriée RC527 ou RC529 ou des sels pharmaceutiquement acceptables d'AGP tels que décrits dans le brevet US No. 6 764 840. D'autres AGP appropriés sont décrits dans le document

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WO 2004/062599. Certains AGP sont des agonistes du TLR4, et certains sont des antagonistes du TLR-4. On pense que les deux sont utiles en tant qu'adjuvant.

D'autres ligands appropriés du TLR-4 sont tels que décrits dans le document WO 2003/011223 et dans le document WO 2003/099195, tels que le composé I, le composé II et le composé III décrits aux pages 4 et 5 du document WO 2003/011223 ou aux pages 3 et 4 du document WO 2003/099195 et en particulier ces composés décrits dans le document WO 2003/011223 tels que ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057m ER804058,

ER804059, ER804442, ER804680 et ER804764. Par exemple, un ligand approprié du TLR-4 est ER804057.

D'autres ligands du TLR-4 qui peuvent être utilisés dans la présente invention comprennent l'adjuvant de glucopyranosyl-lipide (GLA) tel que décrit dans les documents WO 2008/153541 ou WO 2009/143457 ou les la littérature de Coler RN et al.

articles de (Development

Synthetic a Vaccine e!6333.

et Characterization of Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as Adjuvant, PLoS ONE 6(1):

doi: 10.1371/journal.pone.0016333, 2011) et Arias MA et al. (Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic et Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgpl40, PLoS ONE 7(7): e41144. doi: 10.1371/journal. pone .0041144,

2012). Les documents WO 2008/153541 ou WO 2009/143457 sont incorporés ici en référence dans l'objectif de définir des ligands du TLR-4 qui peuvent être utilisés dans la présente invention.

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Un ligand du TLR-4 tel qu'un lipopolysaccharide, tel que le 3D-MPL, peut être utilisé dans des quantités entre 1 et 100 pg par dose humaine de la composition d'adjuvant. Le 3D-MPL peut être utilisé à un taux d'environ 50 pg, comme au moins 40 pg, au moins 45 pg ou au moins 49 pg, ou, inférieur à 100 pg, inférieur à 80 pg, inférieur à 60 pg, inférieur à 55 pg ou inférieur à 51 pg. Des exemples de plages appropriées se situent entre 40 et 60 pg, de façon appropriée entre 45 et 55 pg ou entre et 51 pg ou 50 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition d'adjuvant comprend du 3D-MPL à un taux d'environ 25 pg, comme au moins 20 pg, au moins 21 pg, au moins 22 pg ou au moins 24 pg, ou, inférieur à 30 pg, inférieur à 29 pg, inférieur à 28 pg, inférieur à 27 pg ou inférieur à 26 pg. Des exemples de plages inférieures comprennent entre 20 et 30 pg, de façon appropriée entre 21 et 29 pg ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg, ou 25 pg.

Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend un agoniste du TLR4, tel que le 3D-MPL, formulé avec un sel d'aluminium, tel que 1'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium.

Dans un mode de réalisation spécifique, l'adjuvant comprend à la fois une saponine et un agoniste du TLR4. Dans un exemple spécifique, l'adjuvant comprend du QS21 et du 3D-MPL. Dans une variante de mode de réalisation, l'adjuvant comprend du QS21 et du GLA.

Lorsque, à la fois, un agoniste du TLR4 et une saponine sont présents dans l'adjuvant, alors le rapport pondéral de l'agoniste du TLR4 sur la saponine se situe de façon appropriée entre 1/5 et 5/1, de façon appropriée

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1/1. Par exemple, lorsque du 3D-MPL est présent dans une quantité de 50 pg ou 25 pg, alors de façon appropriée, le QS21 peut être également présent dans une quantité de 50 pg ou 25 pg par dose humaine de l'adjuvant.

Dans un mode de réalisation, la saponine, éventuellement avec un agoniste du TLR4, est administrée dans une formulation liposomique. Par « formulation liposomique », il est signifié que la saponine (et éventuellement l'agoniste du TLR-4) est formulée avec des liposomes, ou, en d'autres termes, présentée dans une composition à base de liposomes. Les liposomes prévus pour la présente invention contiennent un lipide neutre ou sont constitués essentiellement d'un lipide neutre. Par « lipide neutre », il faut comprendre que la charge nette globale du lipide est (approximativement) de zéro. Par conséquent, le lipide peut être globalement non ionique ou il peut être zwittérionique. Dans un mode de réalisation, les liposomes comprennent un lipide zwittérionique. Des exemples de lipides appropriés sont des phospholipides tels que des espèces de phosphatidylcholine. Dans un mode de réalisation, les liposomes contiennent de la phosphatidylcholine en tant que lipide formant des liposomes qui est de façon appropriée non cristalline à température ambiante. Des exemples de tels lipides non cristallins de phosphatidylcholine comprennent la phosphatidylcholine du jaune d'œuf, la dioléoyl-phosphatidylcholine (DOPC) ou la dilauryl-phosphatidylcholine (DLPC). Dans un mode de réalisation particulier, les liposomes de la présente invention contiennent de la DOPC, ou, sont constitués essentiellement de DOPC. Les liposomes peuvent également

BE2017/5714 contenir une quantité limitée d'un lipide chargé qui augmente la stabilité de la structure liposome-saponine pour les liposomes composés de lipides saturés. Dans ces cas, la quantité de lipide chargé est de façon appropriée de 1 à 20 % p/p, de préférence 5 à 10 % p/p de la composition liposomique. Des exemples appropriés de tels lipides chargés comprennent le phosphatidylglycérol et la phosphatidylsérine. De façon appropriée, les liposomes neutres contiendront moins de 5 % p/p de lipide chargé, comme moins de 3 % p/p ou moins de 1 % p/p. Dans un mode de réalisation particulier, la formulation liposomique comprend du cholestérol en tant que stérol.

Constructions d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant une protéine VP2 de HRV

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin comprend le polynucléotide comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine VP2 de HRV telle que définie ici. Dans un autre mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine VP2 de HRV est placée sous le contrôle d'éléments permettant son expression dans une cellule, comme dans une cellule de mammifère.

Dans un mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique est incorporée dans un vecteur viral, tel qu'un vecteur adénoviral. Ainsi, dans un mode de réalisation spécifique, la composition comprend un vecteur adénoviral comprenant un transgène codant pour la protéine VP2 de HRV telle que définie ici.

L'adénovirus a été largement utilisé pour des applications de transfert de gènes en raison de sa capacité à obtenir un transfert de gènes hautement

BE2017/5714 efficace dans divers tissus cibles et une grande capacité transgénique. Les vecteurs adénoviraux d'utilisation de la présente invention peuvent être dérivés de tout un éventail d'hôtes mammifères. Il a été isolé plus de de 100 sérotypes distincts d'adénovirus qui infectent diverses espèces de mammifères. Ces sérotypes adénoviraux ont été classés en six sous-genres (A à F ; B est sous-divisé en B1 et B2) selon l'homologie de séquence et la capacité d'agglutiner les érythrocytes (Tatsis et Ertl, Molecular Therapy (2004) 10: 616-629).

Dans un mode de réalisation, le vecteur adénoviral de la présente invention est dérivé d'un adénovirus humain. Des exemples de tels adénovirus d'origine humaine sont Adl, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Adll, Ad 24, Ad34, Ad35, particulièrement Ad5, Adll et Ad35. Bien que les vecteurs à base d'Ad5 aient été largement utilisés dans un certain nombre d'essais de thérapie génique, il existe des limitations sur l'utilisation de 1'Ad5 et d'autres vecteurs adénoviraux du groupe C humains à cause d'une immunité préexistante dans la population générale à cause d'une infection naturelle. L'Ad5 et d'autres membres du groupe C humains tendent à faire partie des sérotypes les plus séroprévalents. En outre, une immunité contre des vecteurs existants peut se développer comme résultat d'une exposition au vecteur durant le traitement. Ces types d'immunité préexistante ou développée contre des vecteurs séroprévalents peuvent limiter l'efficacité de la thérapie génique ou des efforts de vaccination.

Par conséquent, dans un autre mode de réalisation, le vecteur adénoviral est dérivé d'un adénovirus simien

BE2017/5714 non humain, également appelé simplement adénovirus simien. De nombreux adénovirus ont été isolés à partir de simiens non humains tels que des chimpanzés, des bonobos, des macaques rhésus et des gorilles, et des vecteurs dérivés de ces adénovirus induisent de fortes réponses immunitaires contre des transgènes codés par ces vecteurs (Colloca et al. (2012) Sei. Transi. Med. 4: 1-9 ; Roy et al. (2004) Virol.324: 361-372 ; Roy et al. (2010) J. of Gene Med. 13: 17-25). Certains avantages des vecteurs basés sur des adénovirus simiens non humains comprennent le manque relatif d'anticorps présentant une neutralisation croisée contre ces adénovirus dans la population humaine cible. Par exemple, la réaction croisée de certains adénovirus de chimpanzé avec des réponses en anticorps neutralisants préexistants est seulement présente chez 2 % de la population humaine cible comparativement à 35 % dans le cas de certains vecteurs adénoviraux humains candidats.

Dans des modes de réalisation spécifiques, le vecteur adénoviral est dérivé d'un adénovirus non humain, tel qu'un adénovirus simien et en particulier, un adénovirus de chimpanzé tel que ChAd3, ChAd63, ChAd83, ChAdl55, Pan 5, Pan 6, Pan 7 (également appelé C7) ou Pan 9. Des exemples de telles souches sont décrits dans les documents WO 03/000283, WO 2010/086189 et

GB 1510357.5 et sont également disponibles auprès de 1'American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginie 20110-2209, et d'autres sources. En variante, les vecteurs adénoviraux peuvent être dérivés d'adénovirus simiens non humains isolés de bonobos, tel que PanAdl, PanAd2 ou PanAd3. Des exemples

BE2017/5714 de tels vecteurs décrits ici peuvent être trouvés, par exemple, dans les documents WO 2005/071093 et WO 2010/086189. Des vecteurs adénoviraux peuvent être également dérivés d'adénovirus isolés de gorilles tels que décrits dans les documents WO 2013/52799, WO 2013/52811 et WO 2013/52832.

Des vecteurs adénoviraux peuvent être utilisés pour administrer des séquences souhaitées d'acide nucléique ou de protéine, par exemple, des séquences (de gènes) hétérologues, pour une expression in vivo. Un vecteur peut comprendre tout élément génétique y compris de 1'ADN nu, un phage, un transposon, un cosmide, un épisome, un plasmide, ou un virus pour l'administration. Par « cassette d'expression », il est signifié la combinaison d'un gène hétérologue (transgène) souhaité et d'autres éléments régulateurs nécessaires pour diriger la traduction, la transcription et/ou l'expression du produit génique dans une cellule hôte.

Généralement, un vecteur adénoviral est conçu de telle façon que la cassette d'expression est localisée dans une molécule d'acide nucléique qui contient d'autres séquences adénovirales dans la région native à un gène adénoviral choisi. La cassette d'expression peut être insérée dans une région existante de gène pour perturber la fonction de cette région, si c'est souhaité. En variante, la cassette d'expression peut être insérée dans le site d'un gène adénoviral partiellement ou totalement délété. Par exemple, la cassette d'expression peut être localisée dans le site d'une mutation, d'une insertion ou d'une délétion qui rend non fonctionnel au moins un gène d'une région génomique choisie dans le

BE2017/5714 groupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et E4. Le terme « rend non fonctionnel » signifie qu'une quantité suffisante de la région du gène est éliminée ou sinon perturbée, de telle façon que la région du gène n'est plus capable de produire des produits fonctionnels d'expression du gène. Si c'est souhaité, la région entière du gène peut être éliminée (et remplacée de façon appropriée par la cassette d'expression) . De façon appropriée, les gènes El de l'adénovirus sont délétés et remplacés par une cassette d'expression constituée du promoteur de choix, d'une séquence d'ADNc du gène d'intérêt et d'un signal poly A, ayant pour résultat un virus recombinant défectueux pour la réplication.

Dans un autre mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique est incorporée dans un vecteur d'ARNm s'auto-amplifiant (ci-après appelé SAM). Les molécules d'ARN SAM sont bien connues dans l'art et peuvent être produites en utilisant des éléments de réplication dérivés, par exemple, d'alphavirus, et en substituant les protéines virales structurales par une séquence nucléotidique codant pour une protéine d'intérêt. Une molécule d'ARN SAM est généralement une ± molécule brin qui peut être traduite directement après l'administration à une cellule, et cette traduction fournit une ARN polymérase ARN-dépendante qui ensuite produit des transcrits à la fois antisens et sens à partir de 1'ARN administré. Ainsi 1'ARN administré mène à la production de multiples molécules filles d'ARN. Ces molécules filles d'ARN, ainsi que des transcrits subgénomiques colinéaires, peuvent être traduites ellesmêmes pour fournir une expression in situ d'un antigène

BE2017/5714 codé (c'est-à-dire, une construction de protéine VP2 de HRV) , ou elles peuvent être transcrites pour fournir d'autres transcrits avec le même sens que l'ARN administré qui sont traduits pour fournir une expression in situ de l'antigène. Le résultat global de cette séquence de transcriptions est une énorme amplification du nombre de réplicons d'ARN introduits et ainsi l'antigène codé devient un produit polypeptidique majeur des cellules.

Un système approprié pour obtenir une autoréplication de cette façon est d'utiliser un réplicon à base d'alphavirus. Ces réplicons sont des ARN brin ± qui mènent à la traduction d'une réplicase (ou d'une réplicase-transcriptase) après l'administration à une cellule. La réplicase est traduite sous la forme d'une polyprotéine qui s'auto-clive pour fournir un complexe de réplication qui crée des copies du brin génomique de l'ARN brin ± administré. Ces transcrits brin ± peuvent être eux-mêmes transcrits pour donner d'autres copies de l'ARN parent brin ± et également pour donner un transcrit subgénomique qui code pour l'antigène. La traduction du transcrit subgénomique mène ainsi à une expression in situ de l'antigène par la cellule infectée. Les réplicons d'alphavirus appropriés peuvent utiliser une réplicase provenant d'un virus Sindbis, d'un virus de la forêt Semliki, d'un virus de l'encéphalite équine de l'Est, d'un virus de l'encéphalite équine du Venezuela, etc. Des séquences virales mutantes ou de type sauvage peuvent être utilisées, par exemple, le mutant atténué TC83 du VEEV a été utilisé dans des réplicons, voir la référence suivante : WO 2005/113782.

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Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN SAM décrite ici code pour (i) une ARN polymérase ARN-dépendante qui peut transcrire l'ARN à partir de la molécule d'ARN SAM et (ii) un antigène de protéine VP2 de HRV tel que décrit ici. La polymérase peut être une réplicase d'alphavirus, par exemple, comprenant une ou plusieurs protéines nsPl, nsP2, nsP3 et nsP4 d'alphavirus.

Tandis que les génomes alphaviraux naturels codent pour les protéines structurales des virions en plus de la polyprotéine non structurale de la réplicase, dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN SAM ne codent pas pour les protéines structurales alphavirales. Ainsi, l'ARN SAM peut mener à la production de copies d'ARN génomique de lui-même dans une cellule, mais pas à la production de virions contenant de l'ARN. L'incapacité de produire ces virions signifie que, à la différence d'un alphavirus de type sauvage, la molécule d'ARN SAM ne peut pas se perpétuer sous forme infectieuse Les protéines structurales alphavirales qui sont nécessaires à la perpétuation dans les virus de type sauvage sont absentes des ARN SAM de la présente divulgation et leur place est prise par un ou plusieurs gènes codant pour l'immunogène d'intérêt, de telle façon que le transcrit subgénomique code pour 1'immunogène plutôt que pour les protéines structurales des virions d'alphavirus.

Ainsi, une molécule d'ARN SAM utile avec 1'invention peut comporter deux cadres de lecture ouverts. Le premier cadre de lecture ouvert (en 5') code pour une réplicase ; le second cadre de lecture ouvert

BE2017/5714 (en 3') code pour un antigène. Dans certains modes de réalisation, 1'ARN peut comporter des cadres de lectures ouverts supplémentaires (par exemple, en aval), par exemple, pour coder pour d'autres antigènes ou pour coder pour des polypeptides accessoires.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN SAM divulguée ici comporte une coiffe en 5' (par exemple, une 7-méthylguanosine). Cette coiffe peut amplifier la traduction in vivo de l'ARN. Dans certains modes de réalisation, la séquence en 5 ' de la molécule d'ARN SAM doit être choisie pour assurer la compatibilité avec la réplicase codée.

Une molécule d'ARN SAM peut comporter une queue poly-A en 3 ' . Elle peut également comprendre une séquence de reconnaissance de poly-A polymérase (par exemple, AAUAAA) près de son extrémité 3'.

Les molécules d'ARN SAM peuvent avoir diverses longueurs mais elles sont généralement longues de 5000 à 25 000 nucléotides. Les molécules d'ARN SAM sont généralement simple brin. Les ARN simple brin peuvent généralement initier un effet adjuvant par liaison au TLR7, au TLR8, aux ARN hélicases et/ou au PKR. L'ARN administré sous forme double brin (ARNdb) peut se lier au TLR3, et ce récepteur peut être également déclenché par 1'ARNdb qui est formé soit durant la réplication d'un ARN simple brin soit au sein de la structure secondaire d'un ARN simple brin.

L'ARN SAM peut être préparé de façon pratique par une transcription in vitro (TIV) . La TIV peut utiliser une matrice (ADNc) créée et propagée sous forme de plasmide dans des bactéries, ou créée par synthèse (par

BE2017/5714 exemple, par des procédés d'ingénierie de synthèse de gène et/ou de réaction en chaîne de la polymérase (PCR)). Par exemple, une ARN polymérase ADN-dépendante (telle que les ARN polymérases des bactériophages T7, T3 ou SP6) peut être utilisée pour transcrire l'ARN SAM à partir d'une matrice d'ADN. Des réactions appropriées de coiffage et d'addition de poly-A peuvent être utilisées selon les besoins (bien que la séquence poly-A du réplicon soit habituellement codée au sein de la matrice d'ADN). Ces ARN polymérases peuvent avoir des exigences stringentes pour les nucléotides transcrits en 5 ' et dans certains modes de réalisation, ces exigences doivent correspondre aux exigences de la réplicase codée,

pour assurer que l'ARN	transcrit par IVT	puisse
fonctionner efficacement	comme	substrat	pour sa
réplicase auto-codée.
Un ARN SAM peut comprendre	(en plus	de	toute

structure de coiffe en 5 ' ) un ou plusieurs nucléotides comportant une nucléobase modifiée. Un ARN utilisé avec l'invention comprend idéalement uniquement des liaisons phosphodiester entre les nucléosides, mais dans certains modes de réalisation, il peut contenir des liaisons phosphoramidate, phosphorothioate, et/ou méthylphosphonate.

La molécule d'ARN SAM peut coder pour un seul antigène polypeptidique hétérologue (c'est-à-dire un antigène de protéine VP2 de HRV tel que décrit ici) ou, éventuellement, deux antigènes hétérologues ou plus liés ensemble de telle façon que chacune des séquences conserve son identité (par exemple, liées en série) lorsqu'elles sont exprimées sous la forme d'une séquence

BE2017/5714 d'acides aminés. Les polypeptides hétérologues produits à partir de 1'ARN SAM peuvent être ensuite produits sous la forme d'un polypeptide de fusion ou modifiés de façon à produire des séquences polypeptidiques ou peptidiques séparées.

Les molécules d'ARN SAM décrites ici peuvent être modifiées pour exprimer de multiples séquences nucléotidiques, à partir de deux cadres de lecture ouverts ou plus, permettant ainsi une coexpression des protéines, comme un ou deux antigènes ou plus de HRV (par exemple, un ou deux antigènes ou plus de HRV) conjointement avec des cytokines ou d'autres immunomodulateurs, qui peuvent amplifier la production d'une réponse immunitaire. Une telle molécule d'ARN SAM pourra être particulièrement utile, par exemple, dans la production de divers produits géniques (par exemple, des protéines) en même temps, par exemple, sous la forme d'un vaccin bivalent ou multivalent.

Si c'est souhaité, les molécules d'ARN SAM peuvent être criblées ou analysées pour confirmer leurs propriétés thérapeutiques et prophylactiques en utilisant divers procédés d'analyse in vitro ou in vivo qui sont connus de l'homme du métier. Par exemple, des vaccins comprenant une molécule d'ARN SAM peuvent être testés pour leur effet sur l'induction de la prolifération ou de la fonction effectrices du type de lymphocyte particulier d'intérêt, par exemple, les lymphocytes B, les lymphocytes T, les lignées de lymphocytes T, et les clones de lymphocytes T. Par exemple, des cellules spléniques provenant de souris immunisées peuvent être isolées et la capacité des

BE2017/5714 lymphocytes T cytotoxiques à lyser les cellules cibles autologues qui contiennent une molécule d'ARN SAM qui code pour une protéine VP2 de HRV telle que décrite ici. En outre, la différenciation des lymphocytes T auxiliaires peut être analysée en mesurant la prolifération ou l'induction de cytokines TH1 (IL-2 et IFN-γ) et/ou TH2 (IL-4 et IL-5) par une technique ELISA ou directement dans les lymphocytes T CD4+ par coloration cytoplasmique des cytokines et cytométrie en flux.

Les molécules d'ARN SAM qui codent pour un antigène de HRV, par exemple, un antigène peptidique de HRV tel que décrit ici, peuvent être également testées pour leur capacité d'induire des réponses immunitaires humorales, comme il est mis en évidence, par exemple, par 1'induction de la production par les lymphocytes B d'anticorps spécifiques d'un antigène de HRV d'intérêt. Ces analyses peuvent être conduites en utilisant, par exemple, des lymphocytes B périphériques provenant d'individus immunisés. De tels procédés d'analyse sont connus de l'homme du métier. D'autres analyses qui peuvent être utilisées pour caractériser les molécules d'ARN SAM peuvent impliquer la détection de l'expression de l'antigène de HRV codé par les cellules cibles. Par exemple, la technique FACS peut être utilisée pour détecter l'expression de l'antigène sur la surface cellulaire ou au niveau intracellulaire. Un autre avantage de la sélection par FACS est que l'on peut trier différents niveaux d'expression ; parfois une expression inférieure peut être souhaitée. Un autre procédé approprié pour l'identification de cellules qui expriment un antigène particulier implique la technique

BE2017/5714 d'adhérence utilisant des anticorps monoclonaux sur une plaque ou de capture en utilisant des billes magnétiques revêtues d'anticorps monoclonaux.

Le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre un système d'administration viral ou non viral. Le système d'administration (également appelé ici véhicule d'administration) peut avoir des effets adjuvants qui amplifient l'immunogénicité de l'antigène du HRV codé. Par exemple, la molécule d'acide nucléique peut être encapsulée dans des liposomes, des microparticules polymères biodégradables non toxiques ou des particules de réplicon viral (VRP), ou complexée avec des particules d'une émulsion cationique huile dans l'eau . Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration de nanoémulsion cationique (NEC) ou un système d'administration de nanoparticules lipidiques (NPL). Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration non viral, c'est-à-dire que le vaccin à base d'acide nucléique est sensiblement dépourvu de capside virale. En variante, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre des particules de réplicon viral. Dans d'autres modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre un acide nucléique nu, tel qu'un ARN nu (par exemple, ARNm), mais l'administration par l'intermédiaire de NEC ou de NPL est préférée.

Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration de nanoémulsion cationique (NEC). Les systèmes d'administration de NEC et des procédés pour leur

BE2017/5714 préparation sont décrits dans la référence suivante : WO 2012/006380. Dans un système d'administration de NEC, la molécule d'acide nucléique (par exemple, ARN) qui code pour l'antigène est complexée avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Les émulsions cationiques huile dans l'eau peuvent être utilisées pour administrer des molécules chargées négativement, telles qu'une molécule d'ARN à des cellules. Les particules de l'émulsion comprennent un noyau huileux et un lipide cationique. Le lipide cationique peut interagir avec la molécule chargée négativement, ancrant de cette façon la molécule aux particules de l'émulsion. D'autres détails sur des CNE utiles peuvent être trouvés dans les références suivantes : WO 2012/006380 ; WO 2013/006834 ; et WO 2013/006837 (dont le contenu de chacune est incorporé ici dans son intégralité).

Ainsi, dans un vaccin à base d'acide nucléique de l'invention, une molécule d'ARN codant pour un antigène de protéine VP2 de HRV peut être complexée avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Les particules comprennent généralement un noyau huileux (par exemple, une huile végétale ou du squalène) qui est en phase liquide à 25 °C, un lipide cationique (par exemple, un phospholipide) et, éventuellement, un tensioactif (par exemple, le trioléate de sorbitane, le polysorbate 80) ; du polyéthylène glycol peut être également incorporé. Dans certains modes de réalisation, la NEC comprend du squalène et un lipide cationique, tel que le 1,2-dioléoyloxy-3-(triméthylammonio)propane (DOTAP). Dans certains modes de réalisation préférés, le

BE2017/5714 système d'administration est un système d'administration non viral, comme une NEC, et le vaccin à base d'acide nucléique comprend un ARN SAM (ARNm) . Ceci peut être particulièrement efficace dans le déclenchement de réponses immunitaires humorales et cellulaires. Les avantages comprennent également l'absence d'une réponse immunitaire anti-vecteur limitante et un manque de risque d'intégration génomique.

Les systèmes d'administration de NPL et les microparticules polymères biodégradables non toxiques, et des procédés pour leur préparation sont décrits dans les références suivantes : WO 2012/006376 (systèmes d'administration de NPL et de microparticules) ; Geall étal. (2012) PNAS USA. Sep 4 ; 109(36): 14604-9 (système d'administration de NPL) ; et WO 2012/006359 (systèmes d'administration de microparticules). Les NPL sont des particules liposomiques non virioniques dans lesquelles une molécule d'acide nucléique (par exemple, ARN) peut être encapsulée. Les particules peuvent comprendre un peu d'ARN externe (par exemple, sur la surface des particules), mais au moins la moitié de 1'ARN (et idéalement sa totalité) est encapsulé. Les particules liposomiques peuvent être formées, par exemple, d'un mélange de lipides zwittérioniques, cationiques et anioniques qui peuvent être saturés ou insaturés, par exemple ; DSPC (zwittérionique, saturé), DlinDMA (cationique, insaturé), et/ou DMG (anionique, saturé). Les NPL préférées pour une utilisation avec l'invention comprennent un lipide amphiphile qui peut former des liposomes, éventuellement en combinaison avec au moins un lipide cationique (tel que DOTAP, DSDMA, DODMA,

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DLinDMA, DLenDMA, etc.). Un mélange de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG et cholestérol est particulièrement efficace. D'autres NPL utiles sont décrites dans les références suivantes :

WO 2012/031046 WO 2011/076807 WO 2014/136086

WO 2012/030901 WO 2012/006378 WO 2013/006825 WO 2015/095346

WO 2012/006376 ;

WO 2012/031043 ;

WO 2013/033563 ;

WO 2015/095340 ;

WO 2016/037053. Dans certains modes de réalisation, les NPL sont des liposomes RV01, voir les références suivantes : WO 2012/006376 et Geall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4 ; 109(36): 14604-9.

Compositions immunogènes

Il est également fourni des compositions comprenant la protéine VP2 de HRV ou des constructions d'acide nucléique codant pour une telle protéine VP2 de HRV. Les compositions peuvent être une composition pharmaceutique, par exemple, une composition immunogène ou une composition vaccinale. Par conséquent, la composition peut également comprendre un support pharmaceutiquement acceptable.

Un « support pharmaceutiquement acceptable » comprend tout support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement des grosses macromolécules métabolisées lentement telles que des protéines, des polysaccharides, des acides polylactiques, des acides polyglycoliques, des polymères d'acides aminés, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose, et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes). Ces supports sont bien connus d'une

BE2017/5714 personne de compétence moyenne dans le domaine. Les compositions peuvent également contenir un diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances tampons du pH, et analogues, peuvent être présentes. Le sérum physiologique tamponné par du phosphate stérile apyrogène est un support classique.

Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre les constructions, des séquences d'acide nucléique, et/ou des séquences polypeptidiques décrites ailleurs dans ce document dans de l'eau stérile simple (par exemple, de l'eau pour préparations injectables « p.p.i. ») ou dans un tampon, par exemple, un tampon phosphate, un tampon Tris, un tampon borate, un tampon succinate, un tampon histidine, ou un tampon citrate. Les sels tampons seront généralement inclus dans la plage de 5 à 20 mM. Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir un pH situé entre 5,0 et 9,5, par exemple, entre 6,0 et 8,0. Les compositions peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, du chlorure de sodium) pour donner la tonicité. Une concentration de 10 ± 2 mg/ml de NaCl est classique, par exemple, environ 9 mg/ml. Les compositions peuvent comprendre des chélateurs d'ions métalliques. Ceux-ci peuvent prolonger la stabilité de 1'ARN en éliminant les ions qui peuvent accélérer l'hydrolyse phosphodiester. Ainsi, une composition peut comprendre un ou plusieurs de 1'EDTA, 1'EGTA, le BAPTA, l'acide pentétique, etc. De tels chélateurs sont généralement présents à une concentration située entre

BE2017/5714 et 500 μΜ, par exemple, 0,1 mM. Un sel citrate, tel que le citrate de sodium, peut également agir comme un chélateur, tout en fournissant également de façon avantageuse une activité tampon. Les compositions pharmaceutiques peuvent présenter une osmolalité située entre 200 mOsm/kg et 400 mOsm/kg, par exemple, entre 240 et 360 mOsm/kg, ou entre 290 et 310 mOsm/kg. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre un ou plusieurs conservateurs, tels que le thiomersal ou le 2phénoxyéthanol. Les compositions dépourvues de mercure sont préférées, et des vaccins dépourvus de conservateur peuvent être préparés. Les compositions pharmaceutiques peuvent être aseptiques ou stériles. Les compositions pharmaceutiques peuvent être non pyrogènes, par exemple, contenant < 1 UE (unité d'endotoxine, une mesure standard) par dose, et de préférence < 0,1 UE par dose. Les compositions pharmaceutiques peuvent être dépourvues de gluten. Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous forme de dose unitaire. Dans certains modes de réalisation, une dose unitaire peut avoir un volume situé entre 0,1 et 1,0 ml, par exemple, environ 0,5 ml.

Les compositions divulguées ici seront généralement administrées directement à un sujet. L'administration directe peut être accomplie par injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu). Des variantes de voies d'administration comprennent une administration rectale, orale (par exemple, comprimé, pulvérisation), buccale, sublinguale, vaginale, topique, transdermique

BE2017/5714 ou transcutanée, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre mucosale. L'administration intradermique et l'administration intramusculaire sont deux voies préférées. L'injection peut être effectuée par l'intermédiaire d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Une dose intramusculaire classique est de 0,5 ml.

Une dose humaine ou une quantité immunologiquement efficace de l'antigène protéinique peut être d'environ ou inférieure à 50 pg de protéine VP2 de HRV telle que décrite ici ; par exemple, de 1 à 50 pg, comme environ 1 pg, environ 2,5 pg, environ 5 pg, environ 7,5 pg, environ 10 pg, environ 15 pg, environ 20 pg, environ 25 pg, environ 30 pg, environ 35 pg, environ 40 pg, environ 45 pg ou environ 50 pg. Dans d'autres modes de réalisation, une dose humaine de l'antigène protéinique peut être de 10 à 50 pg ou de 20 à 50 pg. Une dose d'un acide nucléique (par exemple, un vaccin à base d'acide nucléique) peut varier selon le vecteur d'acide nucléique utilisé. Une dose humaine ou une quantité immunologiquement efficace d'un acide nucléique peut être située de façon appropriée entre 1 ng et 100 mg. Par exemple, une quantité appropriée peut être de 1 pg à 100 mg. Une quantité appropriée de l'acide nucléique particulier (par exemple, un vecteur) peut être facilement déterminée par l'homme du métier. Les exemples de quantité efficace d'un composant d'acide nucléique peuvent se situer entre 1 ng et 100 pg, comme entre 1 ng et 1 pg (par exemple, 100 ng à 1 pg), ou entre 1 pg et 100 pg, comme 10 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng,

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200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, ou 1 gg. Les quantités efficaces d'un acide nucléique peuvent également comprendre de 1 gg à 500 gg, comme entre 1 gg et 200 gg, comme entre 10 et 100 gg, par exemple 1 gg, 2 gg, 5 gg, 10 gg, 20 gg, 50 gg, 75 gg, 100 gg, 150 gg, ou 200 gg. En variante, un exemple de quantité efficace d'un acide nucléique peut se situer entre 100 gg et 1 mg, comme de 100 gg à 500 gg, par exemple, 100 gg, 150 gg, 200 gg, 250 gg, 300 gg, 400 gg, 500 gg, 600 gg, 700 gg, 800 gg, 900 gg ou 1 mg.

Généralement, une dose humaine sera dans un volume situé entre 0,1 ml et 2 ml, généralement entre 0,2 et 1 ml, comme 0,5 ou 0, 625 ml. Ainsi, la composition décrite ici peut être formulée dans un volume, par exemple, d'environ 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 ou 2,0 ml de dose humaine par composant immunogène individuel ou combiné. Dans un mode de réalisation particulier, une dose humaine est contenue dans 0,5 ml de la composition.

Pour tout composant des compositions immunogènes divulguées ici, le dosage peut varier avec la condition, le sexe, l'âge et la taille du sujet ou de la population ciblé(e) et la voie d'administration de la composition immunogène ou du vaccin.

Les rhinovirus humains sont la cause principale des affections aiguës des voies respiratoires supérieures chez les êtres humains, connues sous le nom de rhume. Ils constituent également la cause virale la plus courante d'une exacerbation sévère de maladies respiratoires chroniques telles que l'asthme et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO). Les

BE2017/5714 inventeurs ont découvert qu'en utilisant des compositions de l'invention (c'est-à-dire, comprenant un antigène de protéine VP2), éventuellement adjuvées, une réponse immunitaire peut être produite, laquelle protège partiellement ou totalement le sujet contre des infections subséquentes et/ou une maladie par le même type ou d'autres types de HRV, la réponse immunitaire présentant ainsi une réactivité croisée. Les inventeurs ont également découvert que la réponse immunitaire produite est au moins médiée par des cellules. Dans un autre mode de réalisation, des anticorps présentant une réactivité croisée sont également induits, lesquels peuvent être ou pas neutralisants.

Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont destinées à une utilisation chez un sujet pour : prévenir une infection par le HRV (utilisation prophylactique), réduire la charge virale d'une infection par le HRV, réduire le temps de récupération, et/ou amoindrir la gravité de la maladie provoquée par un HRV chez ce sujet. Le terme « temps de récupération » se rapporte à la réduction du temps pour la récupération d'une infection par le HRV. En variante, les compositions sont destinées à une utilisation dans un procédé pour réduire ou prévenir une maladie chez un sujet, c'est-à-dire, réduire ou prévenir les symptômes cliniques lors d'une infection par le HRV, par exemple, en réduisant la gravité des exacerbations chez un sujet diagnostiqué avec un asthme ou une BPCO.

Une personne de compétence moyenne dans le domaine comprendra que la prévention ou l'utilisation prophylactique des compositions divulguées ici n'est pas

BE2017/5714 censée impliquer 100 % d'efficacité dans toute population donnée. Il existe plutôt des degrés variables de prévention ou de prophylaxie qu'une personne de compétence moyenne dans le domaine reconnaît comme ayant un ou plusieurs effets bénéfiques. A cet égard, les procédés de 1'invention peuvent fournir tout niveau de prévention ou de prophylaxie. Les compositions décrites ici et leur utilisation peuvent prévenir ou réduire simultanément une infection par le HRV et les symptômes cliniques associés au HRV tels que les exacerbations de l'asthme ou de la BPCO.

Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont destinées à une utilisation dans un procédé d'induction d'une réponse immunitaire (présentant une réactivité croisée) contre des HRV d'au moins trois sérotypes différents. La réponse immunitaire produite lors de l'administration à un sujet d'une composition comprenant une protéine VP2 dérivée d'un type de HRV appartenant aux HRV-A peut présenter une réactivité croisée contre une épreuve du sujet avec un type de HRV appartenant aux HRV-A, HRV-B et/ou HRVC. De façon similaire, la réponse immunitaire produite lors de l'administration à un sujet d'une composition comprenant une protéine VP2 dérivée d'un sérotype de HRV appartenant aux HRV-B peut présenter une réactivité croisée contre l'épreuve du sujet avec un type de HRV appartenant aux HRV-B, HRV-A et/ou HRV-C, ou, la réponse immunitaire produite lors de l'administration à un sujet d'une composition comprenant une protéine VP2 dérivée d'un type de HRV appartenant aux HRV-C peut présenter

BE2017/5714 une réactivité croisée contre l'épreuve du sujet avec un type de HRV appartenant aux HRV-A et/ou HRV-B.

Dans d'autres modes de réalisation des utilisations et des procédés divulgués ici, la population cible pour les utilisations ou les procédés divulgués ici sont des patients humains diagnostiqués avec une BPCO ou un asthme. La population cible peut être limitée à des patients humains atteints de BPCO.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour prévenir une infection virale par le HRV, réduire la charge virale lors d'une infection par le HRV, et/ou réduire ou prévenir les symptômes cliniques d'une infection par le HRV chez un sujet humain en ayant besoin, qui comprennent l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace de l'une quelconque des compositions immunogènes telles que fournies ici.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour induire une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée contre au moins trois types de HRV chez un patient humain en ayant besoin, qui comprennent l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace de l'une quelconque des compositions immunogènes telles que fournies ici.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation d'une protéine VP2 de HRV telle que divulguée ici dans la fabrication d'une composition immunogène pour la prévention ou la réduction de la durée d'une infection par le HRV chez un sujet humain, et/ou la réduction ou la prévention des symptômes cliniques d'une infection par le HRV chez un sujet humain.

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Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation d'une protéine VP2 de HRV telle que divulguée ici dans la fabrication d'une composition immunogène induisant une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée contre au moins trois sérotypes de HRV chez un sujet humain en ayant besoin.

Dans certains modes de réalisation, le sujet est un sujet humain. Dans des modes de réalisation spécifiques, le sujet humain est un patient atteint d'asthme, ou, le sujet humain est un patient atteint de BPCO.

Dans certains modes de réalisation, le sujet humain est un sujet jeune en âge tel qu'un nourrisson, un jeune enfant ou un enfant. Dans d'autres modes de réalisation, le sujet humain est un nourrisson, un jeune enfant ou un enfant qui est un patient atteint d'asthme. Dans certains modes de réalisation, le sujet humain est un sujet âgé, par exemple, âgé de 50 ans ou plus, âgé de 60 ans ou plus, ou, âgé de 70 ans ou plus. Dans d'autres modes de réalisation, le sujet humain est un sujet âgé qui est un patient atteint de BPCO. Dans ces modes de réalisation, la population cible est définie en conséquence.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Exemples

Exemple 1

L'objectif de l'expérience a été de comparer la qualité, la diversité et l'ampleur des anticorps neutralisants induits avant/après une épreuve intranasale avec le HRVlb chez des souris sensibilisées avec une combinaison adjuvée avec de l'ASOlb de protéines

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VP2 et VP4 comparativement à des souris sensibilisées avec des protéines VP4 adjuvées avec de l'ASOlb ou de 1'ASOlb seul.

1.1 Modèle animal

Des souches de souris CB6/F1 ont été choisies pour étudier 1'immunogénicité des vaccins candidats pour le HRV puisque ces animaux sont capables de mimer des réponses immunitaires à la fois humorales et cellulaires induites lors d'infections naturelles par le HRV. En outre, les souris CB6/F1 sont capables de récapituler les signes virologiques et histologiques observés chez les êtres humains (recrutement des neutrophiles et production de cytokines dans les poumons) lors d'une épreuve avec des HRV appartenant au groupe mineur (se répliquant chez les souris).

1.2 Conception expérimentale

Dans cette étude, 3 groupes de souris CB6/F1 (n = 30/groupe) ont été immunisés par voie intramusculaire deux fois (dans le muscle gastrocnémien) aux jours 0 et 14 (JO et J14) avec 5 pg de :

GROUPE 1 - Combinaison de VP2 du HRV39 (SEQ ID NO : 1) + concatémère de protéines VP4 du clade A pleine longueur (SEQ ID NO : 3 ; protéines VP4 spécifiques des types HRV2, 8, 10, 21, 39, 60, 71, 77, CU107 et CU150) formulée dans de l'ASOlb.

GROUPE 2 - Concatémère de protéines VP4 du clade A pleine longueur (SEQ ID NO : 3 ; protéines VP4 spécifiques des types HRV2, 8, 10, 21, 39, 61, 77, CU107 et CU150) formulé dans de l'ASOlb

GROUPE 3 - ASOlb seul en tant que témoin négatif.

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L'ASOlb comprend du 3D-MPL et du QS21 dans des liposomes contenant du cholestérol. Une dose humaine (DH) d'ASOlb contient 50 pg de MPL, 50 pg de QS21, dans des liposomes contenant du cholestérol.

Quatre semaines plus tard (J42), les souris ont été soumises à une épreuve par voie nasale avec 10⁶ unités TCID50 de virus HRVlb purifié et les taux de réponse en lymphocytes T CD4+/CD8+ présentant une réactivité croisée et la qualité, la diversité et l'ampleur des anticorps neutralisants ont été étudiés dans des échantillons de sérum et des cellules spléniques prélevés à 14 jours après la seconde immunisation (avant l'épreuve) et 14 jours après l'épreuve par le HRVlb.

Les taux de génomes d'ARN simple brin positif, de production de cytokines (MCP-1, IL-6, IL-10, IL-12p70,

TNF-a, IFN-γ) et la numération globulaire différentielle ont été étudiés dans les liquides de lavage bronchoalvéolaire (LBA) 2 jours après l'épreuve avec le HRVlb (J44) afin de s'assurer que l'épreuve avec le HRVlb a été obtenue avec succès. La description complète pour chaque groupe et le calendrier d'immunisation sont rapportés dans le tableau 2.

Tableau 2

Groupe	N	Sensibilisation	Calendrier d'immunisation	Calendrier de 1'épreuve intranasale (106 unités TCID50)
Immunogène (5 pg/immunogène/ dose)	Dose d'adj uvant (ASOlb)
1	30	Protéine VP2 du HRV39	1/10 DH	Jours 0, 14	Jour 42

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		(SEQ ID NO : 1) + concatémère de protéines VP4 du clade A (SEQ ID NO : 3)
2	30	Concatémère de protéines VP4 (SEQ ID NO : 3)	1/10 DH	Jours 0, 14
3	30	Aucun	1/10 DH	Jours 0, 14

N : nombre de souris par groupe ; DH = dose humaine ; NA = non applicable.

1.3 Matériau - Antigènes et adjuvants 5 Les antigènes utilisés dans cette expérience ont été produits comme suit :

La protéine VP2 du HRV39 (SEQ ID NO : 1 avec une séquence C-terminale marqueur His GGHHHHHH en Cterminale) a été exprimée dans le système Pichia (levure) et purifiée par centrifugation sur gradient de densité de CsCl suivie d'une chromatographie d'exclusion sur Sephacryl S-500 HR/concentration sur Amicon et dialyse. Le concatémère de protéines VP4 du clade A (SEQ ID NO : 3) a été exprimé dans E. coli (BL21). La purification a été effectuée en utilisant une colonne Ni-NTA GE His trap suivie d'une chromatographie d'exclusion sur Superdex75 en utilisant du tampon de 25 mM de Bicine-4 M d'urée (4 M d'urée - 25 mM de Bicine - 500 mM de NaCl, 1 % de saccharose - 0,1 % de pluronic

F68, pH 8,0). Le matériau a été finalement dialysé dans du tampon PBS complémenté avec 1 % d'Empigen.

Tous les antigènes ont été formulés avec l'adjuvant

ASOlb (1/10 DH).

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Le matériau viral de HRVlb hautement purifié utilisé pour l'épreuve IN a été acheté chez Virapur Laboratories (VIRAPUR, San Diego, CA, Etats-Unis).

Exemple 2 - Procédés

2.1 Test de neutralisation du rhinovirus

La quantification des anticorps neutralisants a été effectuée en utilisant le test de neutralisation suivant Une suspension de 5000 cellules Hl-HeLa/puits a été ensemencée dans des plaques de 96 puits à fond plat (Nunclon Delta Surface, Nunc, Danemark) et incubée pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.

Les sérums ont été dilués par des dilutions en série au 1/2 (en démarrant à 1/10) dans du milieu d'infection pour le HRV (MEM complémenté avec 2 % de FCS, 3 0 mM de MgCl2, 2 mM de L-glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels et 1 % de pénicilline/ streptomycine) dans des plaques de 96 puits (Nunc, Danemark) et incubés avec une construction de 100 TCID50 de virus pendant 2 h à 37 °C (5 % de CO2) . Les bords des plaques n'ont pas été utilisés et une colonne de chaque plaque a été laissée sans sérum et a été utilisée comme témoin négatif (aucune neutralisation). Le milieu des plaques de 96 puits ensemencées avec les cellules Hl-HeLa a été décanté et les mélanges virus-anticorps ont été ensuite déposés sur des cellules Hl-HeLa sous-confluentes et incubés à 34 °C avec 5 % de CO2 pendant 72 heures ou 120 heures (selon les souches de HRV utilisées - voir le tableau 3).

Tableau 3

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Trois jours d'infection	Cinq jours d'infection
(72 h)	(120 h)
HRVlb, 2, 3, 8, 14, 16,	HRV2 5, 2 9
28, 39

Trois ou cinq jours après l'infection, les cellules Hl-HeLa ont été lavées et incubées à 37 °C pendant 8 h (5 % de CO2) avec une solution de WST-1 (réactif pour mesurer la fiabilité cellulaire) dilué 15x (Roche, 1164807001, numéro de lot 12797000) dans du milieu de révélation de HRV (DMEM complémenté avec 2 % de FCS,

0 mM de MgCl2, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μΜ de β-mercaptoéthanol, 1 % d'acides aminés non essentiels et 1 % de pénicilline/ streptomycine). Les plaques sont ensuite lues à une longueur d'onde de 450 nm en utilisant le logiciel Softmaxpro.

Pour calculer les titres en anticorps neutralisants, les ensembles de données ont été normalisés en se basant sur la moyenne de la D.O. du WST-1 dans les puits des « cellules sans virus » et les puits des « cellules sans sérum » par rapport à 0 et 100 % d'effet cytopathique (ECP) respectivement. Le pourcentage d'inhibition de l'ECP à une dilution i a été ensuite donné par :

% d'inhibition = (D.O.i - Moyenne de la D.O. des cellules sans sérum) / (Moyenne de la D.O. des cellules sans virus - Moyenne de la D.O. des cellules sans sérum)

L'inverse de la dilution donnant une réduction de 50 % de l'ECP a été ensuite extrapolé en utilisant une régression non linéaire.

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2.2 Mesure des lymphocytes T CD4+/CD8+ spécifiques du rhinovirus par coloration intracellulaire des cytokines

Les fréquences des lymphocytes T CD4+ et CD8 + spécifiques de l'antigène produisant de l'IL-2, de l'IFN-γ et/ou du TNF-α ont été évaluées par coloration intracellulaire des cytokines (CIC) dans les rates prélevées (a) 14 jours après la 2^nde immunisation (J28 avant l'épreuve), et (b) 14 jours après l'épreuve par le HRVlb (J56 après la 2^nde immunisation) .

Isolement des splénocytes

Les rates ont été recueillies dans du milieu RPMI 1640 sans L-glutamine complémenté avec des additifs de RPMI (= milieu RPMI) et dissociées dans une suspension de cellules simples qui a été ensuite transférée sur un tamis cellulaire de 100 pm et rincée avec 5 ml du milieu RPMI. Les cellules spléniques ont été ensuite centrifugées à 335 g pendant 10 min (4 °C) et le culot a été remis en suspension dans 5 ml de milieu RPMI. Cette étape de lavage précédente a été répétée une fois de plus et le culot final a été remis en suspension dans 5 ml de milieu RPMI complémenté avec 5 % de FCS.

La suspension cellulaire a été ensuite diluée 20x (10 pl) dans du tampon PBS (190 pl) pour le comptage des cellules (en utilisant un analyseur MACSQuant) . Après le comptage, les cellules ont été à nouveau centrifugées (335 g, 10 min, TA) et le culot cellulaire a été remis en suspension à 10⁷ cellules/ml dans du milieu RPMI.

Préparation des cellules

Les splénocytes ont été ensemencés dans des plaques de 96 puits à fond arrondi à approximativement 1 million

BE2017/5714 de cellules par puits. Les splénocytes ont été stimulés in vitro avec 100 μΐ de :

- un groupe de peptides 15-mer se chevauchant par 11 aa couvrant la séquence d'acides aminés entière des protéines VP2, VP4 des souches de HRV2, 14 et 39 à une concentration de travail de 1 pg/ml par peptide

- particules ultracentrifugées (UC) des HRV3 et 28 à 1,4 x 10⁷ TCID50/ml (-MOI 1)

- particules UC du HRV25 à 1,4 x 10⁶ TCID50/ml (-MOI

0,1)

- lysat cellulaire non infecté UC ou milieu (en tant que témoins négatifs du test)

- solution de PMA - ionomycine à des concentrations de travail de 0,25 pg/ml et 2,5 pg/ml respectivement (en tant que témoin positif du test).

Des anticorps anti-lymphocytes T CD4 49d et CD28 (1 pg/ml) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant :

- 2 h à 37 °C suivies de 4 h en présence de bréfeldine (1 pg/ml) pour inhiber la sécrétion des cytokines pour la stimulation in vitro en utilisant les groupes de peptides provenant des protéines VP2, VP4 des souches de HRV2, 14 et 39

- 16 h à 37 °C suivies de 4 h en présence de bréfeldine (1 pg/ml) pour inhiber la sécrétion des cytokines pour la stimulation in vitro en utilisant des préparations virales UC (HRV3-25-28) .

Coloration intracellulaire des cytokines (CIC)

La coloration cellulaire a été effectuée comme suit : les suspensions cellulaires ont été placées dans des plaques de 96 puits à fond en V, centrifugées (150 g,

BE2017/5714 min à 4 °C), et lavées dans 250 μΐ de PBS, 1 % de FCS. Les cellules ont été à nouveau centrifugées et remises en suspension dans 50 μΐ de PBS, 1 % de FCS contenant 2 % de réactif bloqueur de Fc (1/50 ; CD16/32) . Après 10 min d'incubation à 4 °C, 50 μΐ d'un mélange d'anticorps anti-lymphocytes T CD4—V450 (1/200), antilymphocytes T CD8 perCp-cy 5.5 (1/100) et de Live & Dead PO (1/1000) ont été ajoutés et incubés pendant 30 min dans l'obscurité à 4 °C. Après un lavage dans du PBS, 1 % de FCS, les cellules ont été perméabilisées dans 200 μΐ de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) et incubées pendant 20 min à 4 °C.

Les cellules ont été ensuite lavées avec du Perm Wash (Kit BD) et remises en suspension avec 50 μΐ d'anticorps anti-IFNg APC (1/200) + anti-IL-2 FITC (1/400) + anti-TNFa PE (1/700) dilués dans du PermWash. Après 1 h d'incubation à 4 °C, les cellules ont été lavées avec du Perm Wash et remises en suspension dans 220 μΐ de PBS.

Acquisition et analyse des cellules

Les cellules colorées ont été analysées par cytométrie en flux en utilisant un LSRII et le logiciel FlowJo. Les cellules vivantes ont été identifiées avec la coloration Live/Dead et ensuite classées par FSC/SSC et l'acquisition a été effectuée sur ~ 20 000 événements (lymphocytes T CD4+). Les pourcentages de cellules produisant de l'IFN-γ +/ IL-2+ +/- TNFa ont été calculés sur les populations classées de lymphocytes T CD4 + et CD8 +.

Liste des réactifs utilisés (numéros de référence tels que disponibles au moment du dépôt)

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Réactifs	No. de catalogue	Numéros de lot	Fournisseurs
Milieu RPMI 1640	31870-025	1683050/ 1734648	Gibco
Additifs RPMI	SR120	D16R001083	Interne
PBS dépourvu de Ca+- et MG++	BE17512Q	5MB165	Lonza
Sérum de veau fœtal inactivé	FBS-HI-12A	CP15-1084	Capricorn
anti-CD16/32 de souris	553142	5154726	BD
anti-CD4 V450 de souris	560468	5065793	BD
anti-CD8 PerCp Cy 5.5 de souris	551162	5156801	BD
Live & Dead PO	L34959	1733112	Molecular Probes
Cytofix/Cytoperm	51-2090K2	5075560	BD
Permwash lOx cc	554723	4198590	BD
anti-IL-2 FITC de souris	554427	4344599	BD
anti-IFN-g APC de souris	554413	4226904	BD
anti-TNF-a PE de souris	554419	3018857	BD
anti-CD28 de souris	553294	83839	BD
anti-CD49d de souris	553313	4105875	BD
Acétate-myristate de phorbol	P8139-1MG	MKBS5634V	Sigma
(PMA)
Ionomycine	I0634-1MG	RNBD5728	Sigma
GolgiPlug (Bréfeldine)	555029	4309737	BD
EPI	LOG081D	D16R001486	Interne
Billes d'étalonnage CS&T		94851	BD

2.3 Numérations différentielles des cellules dans les liquides de BLA

Les fréquences des leucocytes récupérés dans les LBA 2 jours après l'épreuve avec le HRVlb ont été évaluées par phénotypage des cellules immunitaires en

BE2017/5714 utilisant la cytométrie en flux. Un panel d'anticorps conjugués à des fluorochromes spécifiques de Ly6C-FITC, SiglecF-PE, Ly6G-PerCP, CDU-PB, CD3-APC-Cy7, CD11C PECy7 a été utilisé afin de distinguer facilement les macrophages (CDllc+/CDllb-/SiglecF+) , (CDllc-/CDllb+/Ly6c+/Ly6g-) , les (CDllb+/CDllc-/SiglecF+), les neutrophiles (CDllc/CDllb+/Ly6c+/Ly6g+) et les lymphocytes (CDllc-/CDllb/CD3+).

les monocytes éosinophiles

Les souris ont été sacrifiées et les poumons ont été lavés et massés doucement 3 fois avec 500 μΐ de PBS 5 mM d'EDTA. Le liquide récupéré a été ensuite centrifugé (1000 g-10 min-25 °C), et utilisé pour des tests CBAflex et de qRT-PCR spécifique du HRVlb alors que le culot des leucocytes a été remis en suspension dans du PBS - 2 mM d'EDTA (complémenté avec 2 % de FCS) et les cellules ont été ensemencées dans des plaques de polypropylène de 96 puits (selon le nombre de cellules récupérées - de 7,2 x 10³ à 1,2 x 10⁵ cellules/puits) .

Les plaques ont été ensuite lavées avec du PBS + 2 mM d'EDTA + 2 % de FCS et centrifugées (1000 g-5 min4 °C) . Le surnageant a été prélevé et le culot a été remis en suspension dans 25 μΐ de réactif bloqueur de RFc (anticorps de rat anti-CD16/CD32 de souris (2.4 G2), (référence : 553142, numéro de lot 4198965) prédilué à 1/50 dans du PBS + 2 mM d'EDTA + 2 % de FCS et incubé pendant 10 min à 4 °C.

μΐ d'un mélange d'anticorps conjugués à des fluorochromes dilués comme suit : Ly6C-FITC (1/200) (référence : 553104, numéro de lot : 4330779) SiglëcFPE (1/150) (référence : 552126, numéro de lot : 3277625),

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Ly6G-PerCP (1/100) (référence : 560602, numéro de lot : 5188651), CDllb-PB (1/300) (référence : RM2828, numéro de lot : 1642766), CD3-APC-Cy7 (1/100) (référence : 100222, numéro de lot : B199708), CD11C-PE-Cy7 (1/400) (référence : 558079, numéro de lot : 4286714) ont été ensuite ajoutés pendant 30 min à 4 °C. Les plaques ont été ensuite centrifugées (1000 g-5 min-4 °C), et le culot a été remis en suspension dans du PBS, et l'analyse des échantillons a été effectuée par cytométrie en flux. Les cellules vivantes ont été classées (FSC/SSC) et l'acquisition a été effectuée sur ~ 100 000 événements.

2.4 Quantification des cytokines sécrétées dans les liquides de LBA (test CBA Flex)

La quantification des cytokines sécrétées (IL-6, TNF-a, IFN-γ, IL-12p-70, IL-10, MCP-1) dans les liquides de LBA recueillis 2 jours après l'épreuve avec le HRVlb a été également effectuée en utilisant le kit BD™ Cytometric Bead Array (CBA, BD, Etats-Unis -référence 552364 ; numéro de lot 5261593) en suivant les instructions du fabricant sur des échantillons non dilués.

Les procédures de réglage de 1'instrument FACS ont été effectuées en utilisant le protocole de vérification des performances (en utilisant des billes CS&T) et de nettoyage quotidien. Les étalons ont été reconstitués dans le diluant du test (concentration du stock à 50 000 pg/ml), laissés s'équilibrer à température ambiante pendant au moins 15 min, mélangés et des dilutions en série au 1/2 ont été effectuées en démarrant la dilution à partir de 5000 pg/ml jusqu'à 5 pg/ml.

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Dans la plaque de 96 puits, 50 μΐ des échantillons mélangés de la courbe d'étalonnage ou non dilués ont été ajoutés aux plaques de test appropriées et 50 μΐ/puits de billes de capture mélangées (IL-6, TNF-a, IFN-γ, IL5 12p-70, IL-10, MCP-1) ont été ajoutés dans chaque puits à tester. Les plaques ont été mélangées pendant 5 minutes en utilisant un agitateur digital. Les plaques ont été ensuite incubées pendant 1 heure à température ambiante, protégées de la lumière.

50 μΐ/puits du réactif de détection PE mélangé ont été ajoutés dans chaque puits et mélangés pendant 5 minutes en utilisant l'agitateur digital. Les plaques ont été à nouveau incubées pendant 1 heure à température ambiante, protégées de la lumière.

Les plaques ont été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 min (avec freinage), le surnageant a été prélevé avec précaution en utilisant une pipette multicanaux et les billes ont été remises en suspension dans 200 μΐ de tampon de lavage. Les échantillons ont été ensuite acquis par FACS (Fortessa) et analysés en utilisant le logiciel FlowJo (FCAP Array).

2.5 Détection des génomes d'ARN simple brin positif dans les liquides de LBA

Afin de s'assurer que les souris ont été soumises avec succès à l'épreuve avec la souche de HRVlb, les taux d'ARN génomique simple brin positif de HRVlb ont été étudiés dans les liquides de LBA recueillis 2 jours après l'épreuve avec le HRVlb. Les échantillons de LBA ont été centrifugés (1000 g-10 min-25 °C) et le surnageant a été utilisé pour détecter/quantifier l'ARN génomique (brin positif) par un test de qRT-PCR. L'ARN

BE2017/5714 a été purifié à partir de 100 μΐ d'échantillon de LBA (50 μΐ de LBA/50 μΐ d'ARN plus tard) en utilisant le kit QIAamp Viral RNA mini (Qiagen) 2, 6 ou 14 jours après 1'inoculation.

L'ARN génomique (brin positif) a été détecté comme suit : transcription inverse : l'ARN, l'amorce aléatoire et les dNTP ont été chauffés pendant 10 min à 65 °C et ensuite placés sur de la glace. L'ADNc a été synthétisé avec la transcriptase inverse Superscript III pendant 50 min à 55 °C et ensuite inactivé à la chaleur à 70 °C pendant 15 min.

La PCR en temps réel a été réalisée sur 2 μΐ d'ADNc avec 900 nM d'amorce directe (RV-F1), 300 nM d'amorce inverse (RV-R1) et 200 nM de sondes (RV-Probe) en utilisant le mélange TAQMAN Gene Expression Master Mix. Les conditions des cycles de la qPCR ont été : 2 min à 50 °C, 10 min à 95 °C, ceci suivi de 45 cycles de 15 s à 95 °C et de 1 min à 60 °C.

Exemple 3 - Résultats

3.1 Quantification du génome d'ARN simple brin positif

Les résultats suivants ont été obtenus :

- des taux élevés de génomes d'ARN positifs (nombre de copies d'ARN de ~10⁷/10⁸/ml de LBA) ont été détectés dans les liquides de LBA des souris soumises à l'épreuve, attestant que l'épreuve avec le HRVlb par IN a été obtenue avec succès (figure 1)

- la capacité des particules virales à se répliquer n'a pas été étudiée à cause du taux faible de brin négatif exprimé dans les liquides de LBA.

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3.2 Numération différentielle du sang total La réponse immunitaire inflammatoire a été étudiée en comptant le nombre des cellules du sang total (lymphocytes, neutrophiles, macrophages, éosinophiles) récupérées dans les liquides de LBA à 2 jours après l'épreuve avec le HRVlb. Les résultats suivants ont été obtenus :

- des taux de deux à cinq fois supérieurs de neutrophiles (2000 à 9000 cellules/ml de LBA) ont été détectés chez certaines souris soumises à une épreuve avec la souche de HRVlb comparativement à des souris soumises à une épreuve avec du NaCl à 150 mM (exp 20140293 - < 2000 cellules/ml de LBA) (figure 2), suggérant que l'épreuve avec le HRVlb induit

15' l'infiltration des neutrophiles. Toutefois, il est important de souligner que les taux de neutrophiles détectés dans les liquides de LBA après l'épreuve sont variables d'une souris à une autre.

3.3 Quantification des cytokines/chimiokines sécrétées dans les liquides de LBA en utilisant le test s

CBA Flex

La mesure des taux de protéines de 6 cytokines inflammatoires (TNF-cc, IFN-γ, IL-6, IL-10 & IL-12p70) et de chimiokines (MCP-1) a été effectuée par le test

CBAflex dans les liquides de LBA recueillis 2 jours après l'épreuve avec le HRVlb. Les résultats suivants ont été obtenus :

- des taux élevés de chimiokines proinflammatoires MCP-1 (> 20 pg/ml) ont été détectés dans certains des liquides de LBA de certaines souris soumises à l'épreuve (figure 3). Il est également important de souligner que

BE2017/5714 l'induction des chimiokines MCP-1 a été variable d'une souris à une autre et au sein du même groupe

- aucun ou des taux limités des cytokines de type IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p-70 ont été détectés dans les liquides de LBA (figure 3).

3.4 Réponses en lymphocytes T CD4/CD8+ spécifiques du rhinovirus détectées dans les cellules spléniques recueillies avant et après l'épreuve avec le HRVlb

Les taux de réponse en lymphocytes T CD4+/CD8+ spécifiques du HRV ont été étudiés dans les cellules spléniques recueillies à 14 jours après la seconde immunisation (avant l'épreuve) et 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb.

Les réponses en lymphocytes T CD4+/CD8+ spécifiques du type ont été étudiées en utilisant un groupe _; de peptides couvrant la séquence entière des protéines VP2 (du HRV39) ou VP4 (des sérotypes HRV2 et 39) alors que les réponses en lymphocytes T CD4+/CD8+ présentant une réactivité croisée ont été étudiées en utilisant soit un groupe de peptides dérivés du HRV2 ou du HRV14 couvrant la séquence entière des protéines VP2 ou VP4, soit des particules ultracentrifugées (UC) du HRV3, 25 ou 28 (multiplicité d'infection (MOI) de 0,1 à 1 selon les souches de HRV utilisées). Les résultats suivants ont été obtenus.

Réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques du type

Une fréquence élevée (0,8 à 1,7 %) de réponses en lymphocytes T CD4+ spécifiques de VP2 du HRV39 a été détectée avant l'épreuve avec le HRVlb dans le groupe 1 (VP2/VP4) mais pas dans les autres groupes. De façon intéressante, cette réponse a été stimulée (~2 fois

BE2017/5714 supérieure) 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb (1,7 à 3,2 %) dans le groupe 1 (figure 4).

Aucune ou une fréquence basse (0,1 à 0,5 %) de réponses en lymphocytes T CD4+ spécifiques de VP4 des HRV2/39 a été détectée dans tous les groupes. Aucun effet de stimulation n'a été détecté 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb (figures 5 et 6) .

Réponse en lymphocytes T CD4+ présentant une réactivité croisée

Aucune réponse en lymphocytes T CD4 + présentant une réactivité croisée contre la protéine VP4 du HRV14 (clade B) n'a été détectée avant/après l'épreuve avec le HRVlb (données non présentées).

Des réponses en lymphocytes T CD4+ présentant une réactivité croisée contre VP2 du HRV2 (clade A/m) ou du HRV14 (clade B) ont été déjà détectées avant l'épreuve avec le HRVlb dans le groupe 1 (plage de fréquences de 0,2 — 0,8 %) mais pas dans les autres groupes. Comme pour la réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques, les réponses présentant une réactivité croisée contre VP2 ont été également stimulées (~4 fois supérieures) 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb (1,0 à 2,9 %) (figures 7 et 8).

Les lymphocytes T CD4+ présentant une réactivité croisée contre les particules du HRV25 (clade A/m) ont été déjà détectés avant l'épreuve avec le HRVlb dans le groupe 1 (plage de fréquences de 0,5 à 1,5 %) mais pas dans les autres groupes. Un effet de stimulation de la réponse a été détecté 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb (figure 9).

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Aucun ou des taux faibles de lymphocytes T CD4 + présentant une réactivité croisée (< 0,2 %) contre les particules des HRV3 (clade B) et 28 (clade A/M) ont été détectés avant l'épreuve avec le HRVlb. Les réponses en lymphocytes T CD4+ contre la souche du HRV3 (0,25 à 0,5 %) ou du HRV28 (0,35 à 1 %) ont été stimulées 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb dans le groupe 1 mais pas dans les autres groupes (figures 10 et 11) .

Réponses en lymphocytes T CD8+

Aucune réponse des lymphocytes T CD8+ n'a été détectée avant/après l'épreuve avec le HRVlb à la suite des stimulations in vitro avec les peptides dérivés de VP2/VP4 des HRV2/14/39 ou les particules UC des HRV3 et 28 (données non présentées).

Des réponses en lymphocytes T CD8+ spécifiques du HRV25 ont été détectées avant l'épreuve avec le HRVlb dans le groupe 1 et le groupe 2. La fréquence de cette réponse en lymphocytes T CD8+ a été stimulée 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb (0,4 - 1 %) mais seulement dans le groupe 1 (figure 12).

3.5 Mesures des réponses en anticorps neutralisants spécifiques du HRV dans des échantillons de sérum prélevés avant/après l'épreuve avec le HRVlb

Les taux d'anticorps neutralisants spécifiques du HRV ont été étudiés dans des sérums de souris groupés (5 ou 7 groupes de 3 souris/groupe) prélevés 14 jours après la seconde immunisation (avant l'épreuve) ou 14 jours après l'épreuve avec le HRVlb. L'activité neutralisante a été testée contre les souches suivantes :

Clade A/m : HRVlb, 2, 25, 29

Clade A/M : HRV8, 16, 28, 39

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Clade B : HRV3 et 14

Les résultats suivants ont été obtenus :

- aucun anticorps neutralisant (Acn) contre les souches de HRV2, 3, 8, 14, 16, 25, 28, 29, 39 n'a été détecté avant et après l'épreuve avec le HRVlb (données non présentées)

- des taux supérieurs d'Acn spécifiques du sérotype du virus de l'épreuve (HRVlb) ont été détectés 14 jours après l'épreuve dans les sérums des souris du groupe 1 comparativement aux autres groupes (RMG de 13,00 entre les groupes 1 et 2, RMG de 6,99 entre les groupes 1 et 3) (figure 13). Ceci indique que la sensibilisation avec la protéine VP2 du HRV39 amplifie la production d'Acn contre l'infection avec la souche hétéro-sous-typique j (HRVlb) .

Exemple 4 - Etude de l'immunogénicité chez la souris i

Une étude de l'immunogénicité chez la souris a été j initiée avec la protéine recombinante VPO, VP2, ou VP4 j j

du HRV39, adjuvée avec de l'ASOlB. L'objectif principal ) de cette étude a été de démontrer des réponses en j lymphocytes T spécifiques de l'antigène homologues et ) hétérologues chez les,souris vaccinées avec la protéine ( recombinante VPO, VP2 ou VP4 du HRV39 en utilisant un ( test de coloration intracellulaire des cytokines. *

4.1 Matériaux et procédés

Cinq groupes de souris CB6F1 femelle (âgées de 6 à 8 semaines) ont été immunisés aux jours 0 et 28 par injection intramusculaire avec soit du sérum physiologique (témoin), soit la protéine recombinante

VPO du HRV39 adjuvée avec de l'ASOlB, soit la protéine !

I

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VP2 du HRV39 adjuvée avec de l'ASOlB, soit la protéine VP4 du HRV39 adjuvée avec de l'ASOlB, soit le virus HRV39 vivant (Virapur).

Au jour 42, du sérum a été produit à partir de toutes les souris pour l'analyse sérologique et les rates ont été récoltées à partir de 6 souris par groupe pour 1'analyse de 1'immunogénicité par coloration intracellulaire des cytokines. Les splénocytes ont été incubés pendant une nuit avec des groupes de peptides (15-mer avec des chevauchements de 11 acides aminés) de VP2 ou VP4 de cinq types de HRV (HRV39, HRVlb, HRV2, HRV14, et HRV89) ceci suivi d'une incubation pendant 4 heures avec de la bréfeldine A. Les cellules ont été colorées pour la viabilité, fixés, perméabilisées, et ensuite colorées avec des anticorps marqués par fluorescence dirigés contre les CD3, CD4, CD8, CD44, IFN-γ, TNF-cc, IL-2, CD107a, IL-13, IL-4, IL-17A, et IL17F. Les données ont été acquises en utilisant un cytomètre en flux BD Fortessa et analysées en utilisant FLOWJO X avant d'être représentées graphiquement dans GraphPad Prism.

Les souris restantes ont été immunisées par voie intranasale avec le virus HRVlb vivant, à l'exception du groupe témoin traité avec du sérum physiologique, au jour 56. Les rates et le sérum seront recueillis au jour 70 de l'étude pour une autre analyse immunologique.

4.2 Résultats

Dans les splénocytes recueillis au jour 42, les réponses en lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'antigène ont été détectées chez les souris immunisées avec VP2 ou VPO du HRV39 comme il a été décrit en 4.1, ci-dessus, en

BE2017/5714 réponse à une stimulation avec un groupe de peptides VP2 homologues du HRV39 (figure 14A) et avec des groupes de peptides VP2 hétérologues des HRV1B (figure 14B) , HRV2 (figure 14C) , HRV89 (figure 14D) et HRV14 (figure 14E). Sur les figures 14A à 14E, les données affichées représentent des souris individuelles (n = 6 par groupe) avec la médiane indiquée par une ligne horizontale. En se déplaçant de gauche à droite sur chacune des figures 14A à 14E, les colonnes montrent les données provenant des souris immunisées avec VP2 du HRV39 (cercle), VP4 du HRV39 (carré), VPO du HRV39 (triangle), le virus HRV39 vivant (losange), et le sérum physiologique (hexagone), respectivement. Veuillez noter les différences de limite supérieure sur l'ordonnée.

Les splénocytes provenant des souris immunisées avec VP4 du HRV39 ont produit peu à aucun IFN-γ en réponse à la stimulation avec les groupes de peptides VP2 homologues (HRV39) ou hétérologues (HRVlB, HRV2, HRV89, ou HRV14) (figure 15) . Peu à aucune réponse en lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène n'a été détectée à la suite des stimulations avec les groupes de peptides homologues ou hétérologues (données non présentées).

Peu à aucun IFN-γ a été produit par les lymphocytes T CD4+ CD44+ à partir des splénocytes de souris immunisées avec VP2, VP4 ou VPO du HRV39 en réponse à une stimulation avec des peptides VP4 de types de HRV homologues (15A) ou hétérologues (15B, 15C, 15D, 15E) . Les données affichées représentent des souris individuelles (n = 6 par groupe) avec la médiane indiquée par une ligne horizontale. En se déplaçant de gauche à

BE2017/5714 droite sur chacune des figures 15A à 15E, les colonnes montrent les données provenant des souris immunisées avec VP2 du HRV39 (cercle), VP4 du HRV39 (carré), VPO de HRV (triangle), le virus HRV39 vivant (losange), et le sérum physiologique (hexagone), respectivement.

L'alignement de la séquence d'acides aminés de VP2 des cinq types de HRV utilisés dans cette étude a été effectué pour identifier les régions,présentant un degré élevé d'identité d'acides aminés comme des régions potentielles de réactivité croisée. La figure 16A fournit une vue globale de l'étendue dans laquelle chaque acide aminé est conservé au sein des cinq types de HRV inclus. La hauteur de la barre sur la ligne « identité » est en relation directe avec le degré auquel cet acide aminé est conservé. De multiples régions d'homologie élevée qui seront potentiellement responsables du phénotype des lymphocytes T CD4+ présentant une réactivité croisée sont détectées. La figure 16C fournit un alignement en texte des séquences complètes de VP2 de ces cinq types de HRV (HRV_39-VP2 (SEQ ID NO : 1), HRV_89-VP2 (SEQ ID NO : 15), HRV_1B-VP2 (SEQ ID NO : 16), HRV_02-VP2 (SEQ ID NO : 17), et HRV_14-VP2 (SEQ ID NO : 18)).

Comme il est représenté sur la figure 16B, il existe un degré élevé d'identité d'acides aminés lors de la comparaison des séquences parmi les HRV de type A (HRV39, HRV89, HRV1B, et HRV2) par opposition au degré d'identité d'acides aminés lors de la comparaison de chacun de ces types A au HRV14 de type B (figure 16B).

Au jour 70 de l'étude, les réponses en lymphocytes T spécifiques de l'antigène attendues contre les HRV

BE2017/5714 homologues (HRV39 et/ou HRVlb) et hétérologues (HRV2, HRV89 et/ou HRV14) seront quantifiées.

i }

i i

BE2017/5714

SEQ ID NO : 1 - VP2 du HRV39 de type sauvage

2ZFFEÏZ2E3EV 2’LFZALFZMF IFFEZtiEiTEF 1Ζ?,3'?Ε*ΖΈΗ7 ny^gyyHQF fezlliffihif z27lfs2;msat zz'zpeatiaezf xzgmlfefkb sllizpusfl eazgsaiazv

FITVSI3PMF SEFSGARARP ÄAAT -2 €4

SEQ ID NO : 2 - VP2 du HRV3 9 mutée ?FT7EA3FE3 ΓΡΙΙΟΖΙΡΖΖ· STZZ? ; JZTAB AWGEG7ÄPH EZTAZZASÄZ ZKPT^FZTSÎ

TLLZAvyFEE BLASANT*FB7 TAFE27ETHFF EAGSWGAGA TFAZ-F.FPZTZ 22BZ.BFZ GTLL gï7llzfph;f zzîlrsbbsat zzgffgtzavp »smew =z.z.ii?7zzi eagisatazu

SEQ ID NO : 3 - Concatémère de protéines VP4 pleine longueur du clade A

G* ZSP^l·! Z ~	TESS'12237327	FS3L27ExGIB	FFITPAF F FA	SELEFSILPS	EFTZF7E-Z7X
Ei'GZETLQeZ	AyZSFQFrZFT	2E3T02ÎA7S272-	:SL277F27Z277	F73ZAA33FA3	elefs;z?sk
FTZ F 7EZVLE	:tfzftl;gfa	Q7S? VFZGLH	ST 0222473273-3	:L2fEF2:ZBEF	KZ AAS 3 F A3
LEE.: IZPSF'F	FZ ΞΆ’Ζ ”ZL£rT	fzftlqgfa;	7SF22FZGIH?	iyrrzsssss	LEÏFÎÎIE7F7.
ZAA3: GASEL	EES2ZZ.5EFT	ZP’Ü'Z'ZLEEZ	IFTL;GGA;V	SF ^rZGTäST	02737:242331
S2FEIHEFKZ	AAFX-A. Ξ ?—Ξ	FF^Z Z ZFXZZ	E7EL7LEEGZ	FTLIGGAyZF	' * ~ · *·· ~
K373NF3SLB	EEEZXEFEZA.	PF F AAFFX~ F	s;zfskftzf	VKZ’ZXSS f Z c	TLQGGA: 73?.
sA Z’zjX.—	SySEGSSLirt	F2JZ277FF7AA	SS PASRLZES	; ZPSEFELP7	FZVZ.TF -IFF
L^GGAO'ZZF I	XVG-ZHSTINI	7A27G3SL2ÎEF	NIBEFFTAA:	UFAS F LE FSQ	ZPSFFTZFTZH
ZELIFE/tEL	QGGAQVSP;n	7G72H 3TÇ2ÎA7	3FFSSLEEF2Î	INEFKTAA33	GASFLZES'E
F SKFÎZE7KZ	« -U.Ä	sga;7Zr;k7	FÏ7H3T0B37S	FG3 S LEE FE I	EEFKZAA3 SG
A3KLEFS1ZG	3FF7ZF7HZ7	lekgzftlq
SEQ ID NO	: 4 - Polyprotéine VPO du	HRV39 -	Séquence

Uniprot Q5XLP5

XGA.Q7S? 12. Z	^r?· - »vJ	F 3331221FKT	NEFKLAASSG	AFXLXr F2? F	SKFTIPTZTCV
LEEGZFTLI3	FT7EAZ3-ESZ	PZZ;ZTPGZ3	TIT3 0E7A.EA	77FEF7XPHE	LEAPTASATI
p-pr·- -, ( -r ??v-	FFETLE3E7Ä	•TFT S EG7ÏSWE	LEEA1KTXGI	F FEH24E EHFL	GRS FETZ2E7;
__.\X 2?^ 3.	LLZA2GZFEE1	Xr-x λΜ λ f-*A Z i	AFïBTTrîFGE	A zzir—^ZL^’^FF	EMEF'iFSLLZï
BL27FZ FILL?	2ÎLLZFFHÇFI	27I.ES2vX3A.TZ	rZ?E72ÎA7FX	ZSXLFETEXvS	LLIIF73FIE
AZ T3 ATA.I7?	-. γ g ~ vp f	τι g F ALF AF r A	A77TQFLF7EX	TF Z-3G1FLTT	ZZL03F3ALF
WE2H?TZ-'EIFZ	FGQ'ZPNLIEX	ZOVDZXÏFZÎÏ	BT27SFZG22727	ΧΤΤ731Ι3IT	BTAEQIFATF
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P;?ETZILP7	ZE7VZEZ2IIL	LS zp;earxl		Z S3EL32’3G£	TLZIHVZZP’Z-
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ZEEZ Ï-L77Z	E32EALE 323x33	Ζ-2ΓΖΖ SZXXZ E	1.3 3 A3 3 H Z AA	QZITLZ ZZTP
ZERLEA“~L2Z	ESAREREITX	ZZESZRZLZPP	ETEEZSFLEQ	AIZEZZR7ZL?	3x3 3* *.,x__ίχΕ32
EEEE I?E SEE	FVZEA.S37PZ	ZLLEFTTESZi	“ u r ïe—Zl’r ^70 Γ-Ϊ	I7TZSAYZZZ	?EZEES?.Z?A
XLZ Z 32 2I2ZA3	ΓΕΖΖΕΖΖ ZS IE		LSÜLSECFZL	IZRL ZESEEZ	3?ZIT ί xE’/Str
Z SZ3 333	ΖΕΡΕΧΧΝΙΪΙΙ	ZETL7LZASEK	PZZLCEXEZZ	AZTZZ Z’ZZESE	Τχ A 3 G*? A Z A.
ME'ZXZZl setz	ERAZESZIER	3*L£ 3’ 32373EE	ER ?E? (TEES	NFLIHZEERE	3 E Σ EE 3 Z 32233
32X3 3 223ÂEHV	LSI ΖΕΙΧΕΕΠ	Z-QS ASSES EVE	r. i r.3 V 3 A 3 RA	LZ'IRFEZLLL	ΕΕλΖΈΕΕ
SEQ ID NO	: 5 - Peptide de	HRV dérivé de VPl	du HRV14

PIATANETGÄ TMW

SEQ ID NO : 6 - Peptide de HRV dérivé de VP1 du HRV8 (AM)

PAL Σ ΆΑΞ-Τ RH T S S7

SEQ ID NO : 7 - Peptide de HRV dérivé de VP1 du HRV25 (A-M)

PILDAÄETGH Ï3W

SEQ ID NO : 8 - Peptide de HRV dérivé de VP1 du HRVC026 CAXGÄVEIGÄ

SEQ ID NO : 9 - Peptide de HRV dérivé de VP4 du HRV14 (B)

GAQVSTQPSG SHEXQN

BE2017/5714

SEQ ID NO : 10 - Peptide de HRV dérivé de VP4 du HRVIOO (Ά-Μ)

GÄQVSSyWG THSTQM1 5

SEQ ID NO : 11 - Peptide de HRV dérivé de VP4 du ^HRV_^C_⁰²⁶ gaqvsrqst:- shetmi ¹⁰ SEQ ID NO : 12 - Peptide de HRV dérivé de VP2 du HRV2 DÄlKDMGIFG ENMFÏ.HYLGR S

SEQ ID NO : 13 - Peptide de HRV dérivé de VP2 du HRV2

ZREEQIASÄL HGiü/NVZVNY EHRGEIGREV E 15

SEQ ID NO : 14 - Peptide de HRV dérivé de VP2 du HRV2

INTIRÎTISZ EZ’MCAEFSGÄ EAHRQGLP7F I

SEQ ID NO : 15 - VP2 du HRV 89

	Zr.ZZ2ZT5.ZZ1	5ZZT5QZTÄN	A'WTTC-'ZVÎ ?	ïztrzeagaz	ZÎZ5T25ZV33
NRRxZZIV?,:	A - 2 ^2 d A Λ Λ	:-:l5cälkvxz	ΙΕΖΈΖΙΝΕΤΕΕ	ZZ-53FÏTIHV	;-znô3îûh;g
LLZVÄAIREZT	ηγζ	37GZZZETE5 :-	ΞΖ FREW53F	T33ZZEZF.F3Z	Z 3NZÎ7EI GTL
LGMLflTEEQ	ÏIN1RZWA	tiiLïTïy&v	ΡΧΖ3ΡΠΖ5ΕΝΝ	373 ZV ZI? Z Z5	LQVQE Ζ-Ζ-ΤςΤ
55 ZT’T5Z3rM		•7-7— rη·*’ - _
		« J - w i i -
SEQ ID NO	: 16 - VP2 du HRV	_1B
szr/EÄZvrz	C5ZZ2ZTRGZ	3TZTSÇZVRZÏ	R’Z7GÏGV7FE	ΤΖΤΞ 2EÄTRT	ZÎZ?T;FZV33
NF ET ΤΖ.ΞΖΤΗ	WGZ ZEZEÜSÄ	EL5ZALEEM5	ΙΕΖΈΖ3ΤΤΤΕΕ	ZFP.3GTTVHV	Q ZMÄ.3ZZFEQG
TLLVhyjVSH	;ZA3REZÏG3V	TRGTNZTE55	eâgf77z~;;r	Z'ANZRZTzSZZ	3’äZNFZ1 FILL
gnliiefe;?	ZZZIRSNNSAI	LIVRTVSAVF	MZ3XZGHNNW	3ZVIZPZ3FI	F3ETT33Z7ZR
piragisFMC	AEESGÄPÄEil	VRQ - 263

SEQ ID NO : 17 - VP2 du HRV 02

BE2017/5714

5 T 7EA ? .-ÏS _ F.II TF.-1' 3___Ά. - ,ΆΠ AI 'AOrUH I_iSr.£A3AI _?.Ε3<^3— c;

SEQ ID NO

- VP2 du HRV 14

PFFIPIAFLIV

;ViATFÜH3F lODCrvrLLFd

I:

BE2017/5714

Claims (26)

1. REVENDICATIONS

   1. Composition immunogène comprenant une protéine VP2 de rhinovirus humain (HRV) et un adjuvant, ou, un polynucléotide comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour ladite protéine VP2 de HRV.
2. 2. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle la protéine VP2 de HRV est la protéine VP2 de HRV de HRV39, HRVlb, HRV2, HRV3, HRV14, HRV25 ou HRV28
3. 3. Composition immunogène selon la revendication 1 ou 2, où la composition ne comprend pas de protéine VP4 de HRV, ou, de polynucléotide comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine VP4 de HRV.
4. 4. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la protéine VP2 de HRV comporte une insertion, une substitution ou une délétion de jusqu'à et y compris 20 acides aminés.
5. 5. Composition immunogène selon la revendication 4, dans laquelle l'insertion, la substitution ou la délétion est localisée au niveau de la position d'acide aminé correspondant aux aal55 à 170 (boucle NIm-II), aal34 à 146, aa232 à 238, ou aa72 à 75 de VP2 du HRV 39 (SEQ ID NO : 1).
6. 6. Composition immunogène selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle la protéine VP2 de HRV comporte une insertion ou une substitution dans sa séquence d'acides aminés d'un peptide de HRV capable d'induire une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée et/ou une neutralisation croisée.
7. 7. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la protéine VP2

   BE2017/5714 de HRV comporte une insertion ou une substitution dans sa séquence d'acides aminés d'un peptide choisi parmi (a) des peptides correspondant aux acides aminés 32 à 45 de VP1, (b) un variant des acides aminés 32 à 45 de VP1 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés a l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique, (c) un peptide comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 5, 6, 7, et 8, (d) des peptides correspondant aux acides aminés 1 à 16 de VP4, (e) un variant des acides aminés 1 à 16 de VP4 comportant 1 à 4 additions ou délétions d'acides aminés a l'une ou l'autre extrémité et/ou 1 ou 2 substitutions ou additions ou délétions d'acides aminés au sein de la séquence peptidique, ou (f) un peptide comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 9, 10 et 11.
8. 8. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle au moins 5 acides aminés sont délétés à partir de la région NIm-II de la protéine VP2.
9. 9. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant une protéine VP2 de rhinovirus humain (HRV) et un adjuvant comprenant une saponine.
10. 10. Composition immunogène selon la revendication 10, dans laquelle l'adjuvant comprend en outre un lipopolysaccharide A.
11. 11. Composition immunogène selon la revendication 11, dans laquelle la saponine est le QS21 et/ou le lipopolysaccharide A est le 3D-MPL.

    BE2017/5714
12. 12. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle l'adjuvant comprend en outre un stérol, tel que le cholestérol et/ou un dérivé du cholestérol.
13. 13. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle l'adjuvant comprend en outre des liposomes.
14. 14. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, où la composition comprend le polynucléotide.
15. 15. Composition immunogène selon la revendication 9, dans laquelle la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine VP2 de HRV est placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.
16. 16. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la séquence d'acide nucléique est administrée dans un vecteur viral, tel qu'un vecteur adénoviral.
17. 17. Composition immunogène selon la revendication 16, dans laquelle le polynucléotide est un vecteur d'ARNm s'auto-amplifiant (vecteur SAM).

    18. Composition immunogène selon 1 ' une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation dans la prévention ou l'amélioration d ' une maladie ou des symptômes d'une maladie provoquée par ou associée à une infection par le HRV chez un sujet • 19. Composition immunogène selon 1 ' une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation

    chez un sujet pour réduire le temps de récupération à partir d'une infection par le HRV d'un sujet et/ou pour

    BE2017/5714 amoindrir la gravité de la maladie provoquée par une infection par le HRV d'un sujet.
18. 20. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation chez un sujet pour réduire ou prévenir des symptômes cliniques lors d'une infection par le HRV du sujet.
19. 21. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation chez un sujet pour induire une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée contre au moins trois sérotypes de HRV, comme lorsqu'au moins l'un des au moins trois sérotypes de HRV appartient aux HRV de type A et au moins un autre des au moins trois sérotypes de HRV appartient aux HRV de type B ou aux HRV de type C.
20. 22. Composition immunogène pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, où le sujet est atteint de BPCO ou d'asthme.
21. 23. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22, où la réponse immunitaire présentant une réactivité croisée est une réponse immunitaire à médiation cellulaire.
22. 24. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, où la réponse immunitaire présentant une réactivité croisée est en outre caractérisée par la production d'anticorps présentant une réactivité croisée.
23. 25. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, où la réponse immunitaire est stimulée après une exposition subséquente à un HRV.

    BE2017/5714
24. 26. Procédé de réduction du temps de récupération à partir d'une infection par le HRV chez un sujet en ayant besoin et/ou d'amoindrissement de la gravité d'une maladie provoquée par une infection par le HRV chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
25. 27. Procédé de réduction ou de prévention des symptômes cliniques lors d'une infection par le HRV chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
26. 28. Procédé d'induction d'une réponse immunitaire présentant une réactivité croisée contre au moins trois sérotypes de HRV chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.

    BE2017/5714