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La présente invention est relative à des perfectionne- ments à la préparation d'extraits hépatiques, contenant le principe anti-anémique (c'est-à-dire agissant contre l'anémie pernicieuse) présent dans le foie .
Le principe anti-anémique , qui peut être obtenu à partir d'extraits hépatiques, est supposé contenir au moins deux et peut-être plus de deux composés distincts, dont la plupart semblent présenter une activité antago- niste vis-à-vis de l'anémie pernicieuse . Un de ces compo- sés est connu à présent sous le nom de "vitamine B12".
Par application du procédé décrit dans le présent mémoire, on obtient une matière très active, qui contient un ou plusieurs des composés susdits. Telle qu'elle est em- ployée dans le présent mémoire, l'expression "principe actif" désigne à la fois un ou un mélange de plus d'un des composés actifs distincts spécifiés ci-dessus- Quelle que soit la nature du principe actif, il est entendu que le procédé suivant la présente invention permet l'élimina- tion des impuretés inactives et l'obtention de prépara- tions présentant une activité supérieure à celle des ex- traits hépatiques originels, utilisés comme matière de départ.
On a décrit diverses méthodes pour l'extraction et la purification du principe actif, au départ d'extraits hépatiques aqueux . Ainsi, le brevet anglais n 469.430 décrit un procédé , dans laquel le principe actif est ex- trait d'extraits hépatiques aqueux , par l'emploi de substances à caractère phénolique, telles que spécifiées dans le dit brevet. De même, on a décrit un procédé, dans lequel l'activité anti-anémique d'un extrait hépati- que aqueux est augmentée , par traitement de cet extrait
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au moyen de papaïne .
On a également décrit encore d'autres procédés, qui peuvent être appliqués séparément ou en combinaison et qui permettent la préparation d'extraits à pleine activité clinique , à des doses comprises, par exemple, entre 15 et 20 mgr de matière .
La présente invention a pour objet la préparation d'ex- traits hépatiques aqueux, contenant des proportions relati- vernent élevéesdu principe actif.
On a constaté à présent que la séparation du principe actif des impuretés qui l'accompagnent normalement peut être améliorée, par application d'une technique d'extraction à contre-courant.
La présente invention concerne, dès lors, un procédé d'obtention d'une préparation, dérivée du foie et riche en principe actif, dans lequel procédé un extrait hépatique dissous soit dans de l'eau, soit dans un solvant approprié, tel que défini dans le présent mémoire, est traité par un processus d'extraction à contre-courant,cette extraction à contre-courant étant exécutée entre l'eau et le solvant approprié, en sorte que, lorsque l'extrait hépatique est un extrait aqueux, le principe actif est extrait dans le sol- vant approprié et vice-versa.
L'extrait hépatique peut être un extrait aqueux, auquel cas il est soumis à une extraction à contre-courant, à l'aide d'un solvant tel que défini dans le présent mémoi- re . Ainsi, on peut, par exemple, faire circuler l'extrait aqueux à contre-courant du solvant approprié dans une tour élevée, qui peut, au besoin, être munie de garnissa- ges.
Suivant une particularité de l'invention, un extrait hépatique aqueux est, dès lors, soumis à une extraction à contre-courant, à l'aide d'un solvant approprié, tel que
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défini dans le présent:. mémoire.
Selon une variante, un extrait hépatique dissous dans un solvant approprié, tel que défini dans le présent mémoire, peut être soumis a une extraction a contre-courant, à l'aide d'eau, par exemple dans une tour d'extraction.
Suivant une autre particularité de l'invention, un extrait hépatique dissous dans un solvant approprié, del que défini dans le présent mémoire, est, dès lors, soumis à une extraction à contre-courant a l'aide d'eau.
Telle qu'elle est employée dans le présent mémoire, l'ex- pression "solvant approprié" dési/ne un alcool soluble dans l'eau, à température ambiante, raison de 3 à 25 % en volume, ou un mélange de tels alcools,des mélanges de phénol et/ou d'un ou plusieurs des crésols avec l'un ou l'autrede ces alcools des mélanges de phénol et/ou d'un ou plusieurs ues crésols avec une quantité n'excédant pas trois fois leur poids d'une cétone ou d'un ester soluble dans l'eau, à température ambiante, à rai- son de 3 à 25 % en volume, des mélanges de phénol et/ou d'un ou plusieurs des crésols avec une quantité suffisante d'eau pour les liquéfier,
et des mélanges d'alcool propylique ou isopropylique et d'eau, contenant de 5 à 25 % en volume d' eau.
A présent, il s'est avéré préférable d'employer un ou un mélange de plus d'un des solvants suivants: alcool a-butylique, alcool butylique secondaire, alcool propylique, alcool isopropylique ou alcool n-butyllque,mélangé , du phénol et/ou à du tricrésol.
Lorsque l'extraction à contre-courant doit être exécutée entre l'eau et l'alcool propylique ou isopropylique aqueux, dans l'un ou l'autre sens, la phase aqueuse doit contenir une quantité suffisante d'un agent de relargage, pour empêcher une missibillité complète. Ceci ne s'applique pas aux cas où l'ex- traction doit être exécutée par cromatographic basée sur des partages inégaux (voir Biochem.J.1941,35,1358),comme décrit ci- dessous.
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Il est, toutefois, préférable de réaliser les condi- tions de l'extraction à contre-courant en appliquant la tech- nique de la chromatographie basée sur des oartages inégaux.
Dans ce mode d'exécution du procédé suivant l'invention,on fait passer un/extrait hépatique dissous dans un solvant appro- prié, à travers une colonne, contenant une matière en pou- dre, solide, poreuse, inerte et humide, la colonne étant sub- séquement développée et le principe actif en étant séparé de manière appropriée quelconque .
Suivant une particularité complet.dentaire de l'inven- tion, on fait, dès lors, passer un extrait hépatique dis- sous dans un solvant approprié, tel que défini dans le pré- sent mémoire, à travers une colonne contenant une salière en poudre solide, poreuse, inerte et humide.
Diverses matières peuvent être utilisées comme matières en poudre solides et poreuses. C'est ainsi qu'on peut faire usage d'amidon, de kieselguhr ou de pâte à panier, mais on a constaté qu'il est préférable d'employer du gel de silice. Le gel de silice doit, de préférence, être d'un type faiblement adsorbant et un tel gel approprié peut être préparé par les procédés donnés par Martin et Synge (Biochem. J. 1941, 35 (12), 1358-1368) et par Gordon, Martin et Synge (Biochem.J. 1944, 38 (1).65-68).
Le gel de silice doit, de préférence, contenir de
50 à 100 % d'eau par rapport à son propre poids. Si on ; utilise de l'amidon, dit kieselguhr ou de la pâte à pa- pier, ces diverses matières doivent également être mélan- gées à une quantité suffisante d'eau pour que la masse obtenue soit, dans une mesure appréciable, humide, mais ne soit pas cohérente .Lorsqu'on utilise du gel de silice, l'extrait hépatique dissous dans le solvant approprié ne doit pas être saturé à plus de trois quarts au moyen
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d'eau, sinon la colonne peut se boucher et ne plus permet- tre le passage de liquide .
On a constaté que, lorsqu'on utilise du gel de silice, il est souhaitable de soumettre chaque lot de ce gel, avant son emploi, à un essai de détermination de son pouvoir adsorbant, seuls les lots présentant un pouvoir adsorbant relativement faible étant retenus pour le procédé suivant l'invention.
Après application de l'extrait hépatique, la colonne peut, si nécessaire, être développée par l'emploi de sol- vant propre, lequel solvant peut ou non être le même que celui contenant l'extrait hépatique, à condition qu'il ré- ponde à la définition donnée ci-dessus de l'expression "solvant approprié " .Le principe actif peut être élue de la section appropriée ou des sections appropriées de la colon- ne, en employant des volumes élevés d'eau ou, de préféren- ce, des volumes plus faibles d'alcool méthylique, éthyli- que ou propyligue aqueux et notamment d'alcool éthylique à 50 . La section de la colonne qui contient le principe actif , peut être déterminée visuellement, par exemple par la formation de zones colorées en rose .
On a constaté qu'en général on peut obtenir une ou deux zones colorées en rose , qui contiennent chacune le principe actif, bien que, dans certains cas, les deux zones puissent être fu- sionnées, de manière à n'en former qu'une seule à la vue .
'toutefois, lorsque l'extrait hépatique de départ n'est pas très pur , il se peut qu'on n'obtiennepas de zones colo- rées en rose distinctes et qu'il soit, dès lors, impossi- ble de déterminer visuellement la section de la colonne contenant le principe actif . Dans ces cas, la colonne peut être divisée en sections, qui peuvent chacune être éluées séparément . Les éluats obtenus peuvent être soumis à des essais cliniques ou, de préférence, à un essai micro- biologique au moyen de Lactobacillus lactis l'orner, en vue
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de déterminer leur activité.
Il est, toutefois, préférable d'appliquer un extrait hépatique partiellement purifié à la colonne et notamment un extrait cliniquement actif à des doses ne dépassant pas 20 mgr. Ces extraits partiellement purifiés peuvent être obtenus par un procédé approprié quelconque ,mais il a été constaté qu'en appliquant une technique d'ex- traction au moyen d'un solvant, dans laquelle technique il est fait usage de certains "solvants d'extraction appropriés", tels qué définis ci-dessous, la purification partielle peut être grandement simplifiée.
Telle qu'elle est employée dans le présent mémoire, l'expression "solvant d'extraction approprié " désigne un alcool soluble dans l'eau à raison de 3 à 25 % en volume ou des mélanges de tels alcools, des mélanges de ces al- cools avec du phénol et/ou un ou plusieurs des crésols, des mélanges de phénol et/ou d'un ou plusieurs des crésols avec una quantité n'excédant pas trois fois leur poids d'une cétone ou d'un ester soluble dans l'eau à raison de 3 à 25 % , et des mélanges d'alcool propylique ou d'al- cool isopropylique et d'eau contenant de 5 à 25 % en volu- me d'eau . A présent, il s'est avéré préférable d'utiliser un ou un mélange de plus d'un des alcools butyliqups.
Lorsqu'on emploie de l'alcool propylique ou isopropyli- que aqueux, comme solvant d'extraction approprié, l'ex- trait hépatique aqueux doit contenir un agent de relarga- ge en quantité suffisante pour empêcher une miscibilité complète .
Suivant encore une autre particularité de l'inven- tion, l'extrait hépatique, sous forma d'une solution aqueu- se, est, dès lors, d'abord partiellement purifié par une ou plusieurs extractions, à l'aide d'un solvant d'extrac- tion approprié, tel que défini dans le présent mémoire.
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L'extrait hépatique dissous dans le solvant d'extrac- tion approprié, peut, si on le désire, être utilisé direc- tement dans le procédé d'extraction à contre-courant.Sui- vant une variante l'extrait ainsi obtenu peut, si on le désire, être encore soumis à d'autres traitements de puri- fication, avant l'exécution du procédé d'extraction à con- tre-courant.
Lors de la purification partielle, on a constaté qu'il est généralement souhaitable de traiter d'abord l'ex- trait hépatique à l'aide d'une quantité relativement fai- ble du solvant d'extraction approprié, de manière à ,:lirai- ner les impuretés les plus solubles dans le dit solvant.
De faibles quantités du principe actif peuvent être élimi- nées, lorsqu'on opère de cette manière, fiais peuvent être récupérées par extraction des fractions de solvant,au moyen d'un peu d'eau .
Lorsque les impuretés les plus solubles dans le sol- vant ont été éliminées, le prinuipe actif peut être ex- trait en employant des volumes plus importants du solvant d'extraction approprié.
Ce mode d'extraction peut nécessiter des extractions
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répétées et/ou l' emploi de volumes désavé1.nta:';0.useftlent im- ' portants du solvant d'extraction approprié. On peut rené- dier à cet inconvénient de l'une et/ou l'autre des manières suivantes :
1 par l'addition d'un a:;ent de relarage, tel que, par exemple, le chlorure de sodiun, le nitrate de sodium
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le sulfate ,1'R:IIoniul', etc.;
2 par l'acidification de l'extrait hépatique aqueux originel jusqu'un pH compris entre2et 7 , et
3 par l'emploi, comme solvants d'extraction appro- priés, tels que définis dans le présent ménoire , de sol- vants d'extraction contenant du phénol et/ou un ou plu- sieurs (les crcsols.
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La purification partielle peut être suivie de l'un ou l'autre des traitements connus et notamment d'une adsorp- tion du principe actif sur du charbon de bois ou une matière analogue.
En général, plus le degré de purification partielle at- teint est élevé, plus le résultat de la chromatographie basée sur des partages inégaux sera meilleur. On a constaté quhen exécutant soigneusement la purification part ielle préliminai- re, on obtient des zones colorées en rose bien définies, con- tenant le principe actif,lors de la chromatographie basée sur des partages inégaux subséquente. On peut,dans ce cas, se pas- ser des essais cliniques en vue de déterminer la position de la zone contenant le principe actif, lorsque la colonne est développée. Si aucune purification partielle n'est exécu- tée, on n'obtient généralement pas de zones colorées bien délimitées dans la colonne .
On a également constaté que l'activité du produit peut être augmentée en soumettant l'extrait à une protéolyse à l'aide d'une ou de plusieurs des enzymes suivantes : trypsi- ne, érepsine ou pancréatine. La protéolyse peut, par exemple, être exécutée à 37 C et à un pH de 8,0, pendant 24 heures.
Ce traitement peut être appliqué à n'importe quel stade ap- proprié du procédé décrit dans le présent mémoire et soit avant, soit après la purification partielle préliminaire , si celle-ci esL exécutée. En général, il est préférable de sou- mettre les extraits à la protéolyse, immédiatement avant l'application de la technique d'extraction à contre-courant.
Les exemples suivants, qui ne doivent être: considérés que couine illustratifs, permettront de bien comprendre l'in- vention.
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E1.El :P1E 1 Un dissout 26 n;r. d'un extrait hépatique l)i1rti.ellAf1fmt
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purifié, se caractérisant par une pleine activité clini- que à une dose unique de le mgr., dans 1425 cm3 d'eau, A la solution obtenue, on ajoute de l'acide phosphorique jusqu'à pH 4,0 et du chlorure de sodium en quantité suffi- sante pour/saturer la soluti on. On soumet la solution saturée à une extraction au moyen de deux fractions de 1425 cmd'alcool butylique normal. Les extraits obtenus sont lavés à l'aide de 375 cm3 de saumure saturée présen- tant un pH de 4,0. Les eaux de lavage sont additionnées à la solution aqueuse originelle .
A cette solution, on ajoute 500 gr. de sulfate ammonique, qui ne se dissout pas complètement , et 5 cm3 d'acide phosphorique à 10 5.
La solution obtenue est extraite à l'aide de trois frac- tions de 1800 cm3 d'alcool butylique normal. Les extraits alcooliques (alcool n-butylique) sont lavés à l'eau, addi- tionnée de faibles volumes d'une solution normale d'hydroxyde sodique , de manière à amener le pH à 7,5.
On continue le lavage jusqu'à ce que les eaux de lavage soient incolores.
Les extraits aqueux sont débarrassés des t races de sulfate ammonique, par extraction au moyen de quatre fractions de phénol à 85 %, la quantité totale de phénol utilisée étant de 285 cm3. Les extraits phénoliques sont lavés, à leur tour, au moyen d'une fraction de 50 cm3 d'eau. 5 volumes d'éther sont ajoutés et la solution est extraite, de manières répétées, à l'aide de faibles volumes d'eau, jusqu'à disparition de toute coloration.
Les extraits aqueux obtenus sont lavés à l'éther pour éliminer le phénol, concentrés sous pression réduite et séchés par congélation suivie de sublimation sous vide .On obtient de la sorte 1,34 gr. de matière clini- quement active à une dose unique de 1,1 mgr, ce qui repré- sente une récupération d'environ 85% de l'activité
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présente dans l'extrait hépatique de départ.
Exemple 2 200 gr. de silice sont agités avec 2 litres de butanol saturé au moyen d'eau, afin d'introduire une proportion appropriée d'eau dans la silice. Le mélange est versé dans une colonne chromatographique d'un diamètre de 3 pou- ces, fermée à sa base au noyen d'une plaque de verre perfo- rée et recouverte de papier-filtre . 5 gr. d'extrait hépa- tique partiellement purifié, cliniquement actif à la dose unique de 9 mgr., sont dissous .dans 100 cm3 d'eau et agités avec $OU cm3 de n-butanol anhydre . L'extrait buta- nolique est séparé d'un petit résidu par décantation et versé dans la colonne, après égouttage de l'excès de sol- vant. Le résidu est repris dans 25 c3 d'eau et agité avec 225 car du butanol anhydre .
Le résidu de cette extraction est repris dans 10 cm3 d'eau et aité avec 200 cm3 de buta- nol anhydre . Les extraits sont versés dans la colonne,qui est finalement développée au moyen de 250 cm3 du butanol contenant 12 % d'eau
Le filtrat et les deux tiers inférieurs de la colonne sont de couleur jaune-pâle . Cette partie de la colonne est éluée au moyrn d'alcool éthylique à 50 % et combinée au filtrat. Elle contient 2,372 gr. de matière inactive. Au- dessus de cette section de la colonne se trouve une zone de couleur rose brillant d'environ 1 cm d'épaisseur, qui contient la majeure partie du principe actif et permet d'obtenir, par élution, 0,965 gr. de matière .
Au-dessus de la zone colorée en rose se trouve une zone de couleur orange et à la partie supérieure de la colonne, on remarque une pellicule colorée en brun. Cette section est éluée et retraitée de manière similaire, en utilisant 20 gr. de silice, dans une colonne de 23 mm de diamètre . On obtient
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ainsi une faible quantité supplémentaire de matière rosé, qui est ajoutée à la fraction correspondante provenant de la colonne principale .
Pour effectuer une purification supplémentaire, les fractions colorées en rose combinées sont bhromatographiées, de manière similaire, dans une colonne de 2 pouces de diamètre, remplie de 80 gr. de silice. L'éluat et la partie inférieure incolore de la colonne fournissent 373 mgr de matière .La zone colorée en rose foncé se trouvant au- dessus de la dite partie inférieure et dont l'épaisseur, cliniquement est d'environ 1,5 cm, donne 433 agr de principe /actif à la dose unique de 0,8 mgr. Enfin, la zone supérieure de couleur orange-pâle et d'épaisseur égale à environ lem est retraitée sur 20 gr. de silice, dans une colonne de
23 mm de diamètre . Ce dernier traitement permet d'obtenir une quantité supplémentaire de 41 mgr. de matière colorée en rose .
Exemple 3
294 mgr. d'extrait hépatique hautement purifié, clini- quement actif à la dose unique de 0,4 mgr, sont traités au moyen de 15 mgr, de try.osine dans 3 cm3de phosphate-tam- pon, à ph 8,0.Après incubation à 37 C pendant 41 heures,
18 cm3 d'alcool isopropylique sont a joutés et le faible précipité, qui s'est formé, est séparé par filtration, La solution est chromatographiée dans une colonne de 40 mm de diamètre, chargée à l'aide d'un mélange de 50 gr. de silice précipitée, 60 cm3 d'eau et 150 cm3 d'alcool isopro- pylique . Le chromatogramme est développé à l'aide de
200 Cm3 d'alcool isopropylicue contenant 15 % d'eau.
Il se développe alors, au voisinage de la buse de la colonne, une zone colorée en rose brillant, surmontéed'une zone colorée en rose plus diffuse . Par élution, au moyen d 'al-
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cool éthylique à 50 , on obtient, à partir de la zone principale colorée en rose, 45 mgr. d'un solide rouge,dont l'activité correspond à 55 ;; de l'activité présentée par l'extrait hépatique originel.
Exemple 4
10 gr. de silice précipitée sont vigoureusement mélan- gés à 6 6 cm3 d'eau . Le mélange obtenu est mis en suspen- sion dans un solvant, constitué par un Mélange de 40 gr. de p-crésol, 40 cmd'acétate d'éthyle et 4 cmd'eau . La suspension est versée dans un tube en verre d'un diamètre de 18 mm et le solvant en excès est chassé a travers la dite colonne,sous une légère pression d'air- 300 mgr. d'ex- trait hépatique purifié sont extraits à l'aide de 3 CI) de solvant présentant la composition spécifiée ci-dessus. L'ex- trait obtenu est appliqué à la colonne .
Le résidu brunâtre est soumis à une extraction à l'aide d'1 cm3 du solvant spé- cifié ci-dessus. Après infiltration des extraits mentionnés ci-avant dans la silice , le chromatogramme est développé à l'aide du solvant précité , constitué de p-crésol, d'acé- tate d'éthyle et d'eau . Une zone colorée en brun foncé s'étale très lentement à partirdu sommet de la colonne, tandis qu'une zone colorée en rosé et contenant pratiquement la totalité du principe actif originel se meut plus rapi- dement et est séparée rapidement.
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