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La présente invention est relative à des perfection- nements à la préparation d'extraits hépatiques contenant le principe anti-anémique (c'est-à-dire agissant contre l'anémie pernicieuse) normalement présent dans le foie.
Le principe anti-anémique obtenu à partir du foie est supposé contenir deux ou peut-être plus de deux composés actifs distincts, dont l'un a reçu récemment le nom de "vitamine B12" Telle qu'elle est employée dans le présent mémoire, l'expression "principe actif" désigne un ou un mélange de plus d'un des composés dis- tincts susmentionnés et s'applique à n'importe quel ex- trait hépatique, présentant une activité antagoniste vis- à-vis de l'anémie pernicieuse, quel que soit le nombre de composés actifs distincts que cet extrait hépatique puisse contenir.
Divers procédés ont été décrits pour la préparation du principe actif à partir d'extraits hépatiques .Ainsi, le brevet anglais n 469.430 décrit un procédé, dans lequel un extrait hépatique est soumis à une extraction, par l'em- ploi de certains solvants à caractère phénolique, tels que définis dans le dit brevet. Selon un autre procédé dé- crit, l'activité anti-anémique de l'extrait hépatique est augmentée en protéolysant un extrait aqueux contenant les constituants hydrosolubles du foie . On connaît égale- ment d'autres procédés d'extraction impliquant, par exem- ple, l'emploi de divers solvants d'extraction ou l'adsorp- tion sur du charbon de bois. Il a , toutefois, été signalé dans la littérature que le principe actif ne peut être pu- rifié par adsorption sur du gel de silice. (Cohn et con- sorts, J. Biol.
Chem., 1928, 77. 325).
Dans la demande de brevet belge n @ on a
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décrit, un proeédé pour la préparation d'extraits hépatiques riches en principe actif, dans lequel procédé une technique d'extraction à contre-courant est mise en oeuvre. 11 est si- qurlé dans la demande de brevet belge précitée que l'extraction à contre-courant peut être exécutée par chromatographie basée sur des partages inégaux (voir Pioche);
). J. 1941, 35, 1358), impliquant le passade d'un extrait hépatique dissous dans un solvant aopropreé, tel que défini dans ladite demande de brevet, à travers une colonne contenant une matière solide on poudre, poreuse, inerte et humide . Ce procède permet l'obtention d'ex- traits hépatiques à activité anti-anémique élevée.
La présente invention a pour objet un procède pour la préparation d'extraits hépatiques riches en principe actif.
Il a été constate à présent que le principe actif peut être purifié par adsoration sur du gel de silice, à partir d'une solution aqueuse, par application d'une technique chroma- tographique.
La présente invention concerne , dès lors, un procède pour la préparation d'extraits hépatiques riches en principe actif, dans lequel procède on fait passer un extrait hépati- que aqueux à travers une colonne de sel de silice.
Après application de l'extrait aqueux, la. colonne peut être développée; par le passade d'eau ou d'une solution aqueuse d'un agent de relargage.
Le gel de silice employé dans le procédé suivant l'in- vention est, de préférence, une forme fortement adserbante de silice précipitée . Le gel de silice peut être préparé par diverses méthodes impliquant la précipitation de sili- ce, le produis obtenu présentant un pouvoir s'adsorption va- riable, selon les conditions do la précipitation- En géné ral,il est souhaitable d'exécuter, sur chaque lot de gel de silice, une série d'essais en vue de déterminer le pou-
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voir d'absorption de ces lots- L'emploi de gel de silice à faible pouvoir d'adsorption,
dans le procédé suivant l'in- vention, nécessiterait l'utilisation de quantités très gran- des d'agent adsorbant pour arriver à une séparation.
L'expression "gel de silice", telle qu'elle est utili- sée dans le présent mémoire, dési'-ne n'importe quelle forme de silice précipitée utilisée ou utilisable comme agent adsorbant, que cette silice réponde ou non cenforme à une définition particulière quelconque du mot "gel". La colonne chromatographique peut, par exemple, être préparée par agi- tation de silice précipitée (gel de silice) avec de l'eau, de manière à produire une pâte, qui est versée dans un tube en verre convenable quelconque, à la base duquel se trouve une plaque perforée fixe, qui peut avantageusement être recouverte de papier-filtre .
Pour faciliter la percola- tion ou filtration de liquide à travers la colonne, le gel de silice peut être mélangé à une matière inerte relative- ment non adsorbante quelconque, normalement utilisée comme adjuvant de filtration . Un exemple d'un tel adjuvant de filtration est le kieselguhr.
La quantité d'agent adsorbant employée dans le procédé suivant l'invention dépend entre autres de deux facteurs principaux, à savoir le pouvoir d'adsorption du gel de silice, tel que spécifié ci-dessus, et la concentration relative du principe actif dans l'extrait aqueux appliqué à la colonne . On notera à présent qu'il est préférable d'appliquer à la colonne un extrait hépatique partiellement purifié .On décrira ci-après des procédés permettant d'obtenir un tel extrait hépatique partiellement purifié.
Il a, en outre, été constaté qu'il est souhaitable que l'extrait hépatique aqueux contienne un agent de relar- gage, tel que, par exemple, du chlorure de sodium, du nitra- te de sodium, du sulfate d'ammonium, etc.. De plus, des ,
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solutions aqueuses de ces agents de relargage peuvent avan- tageusement être utilisées, à la place d'eau, pour dévelop- per la colonne .
Dans des conditions favorables, par exemple lorsqu'on emploie du gel de silice fortement adsorbant, un agent de relargage et des extraits hépatiques aqueux à degré d'acti- vité relativement élevé, on peut obtenir, lors du développe- ment de la colonne, une séparation en zones colorées dis- tinctes, la zone ou les zones contenant le principe actif étant caractérisées par une coloration rose Ainsi, dans certains cas, on a constaté qu'il se forme deux zones distinctes , qui contiennent toutes deux une portion du principe actif, tandis que dans d'autres cas les deux zones peuvent être fusionnées en une seule, de façon à pré- senter l'apparence d'une seule zone.
Si on utilise du gel de silice insuffisamment ou fai- blement adsorbant ou si on utilise des extraits hépatiques insuffisamment purifiés, la zone ou les zones contenant le principe actif peuvent ne pas être déterminées visuelle- ment. Dans ce cas, la colonne peut être divisée en sections et chaque section peut être éluée , l'éluat étant analysé au point de vue de sa teneur en principe actif, en étant,par exemple soumis à des essais cliniques ou, de préférence, à un essai microbiologique à l'aide de Lactobacillus lactis
Dorner.
Le principe actif peut être récupéré de la colonne par élution de la section appropriée au moyen d'eau ou d'alcool méthylique, éthylique, propylique ou isopropylique aqueux.
La séparation chromatographiqua peut êcre répétée un nombre quelconque de fois, jusqu'à ce que le principe actif pré- sente le degré voulu de pureté.
Il a été constaté que, lorsque le principe actif a été préparé sous forme sensiblement pure, il est possible de
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comparer la pureté de préparations subséquentes par des mé- thodes colorimétriques.
Comme indiqué ci-dessus, il est préférable d'appliquer à la colonne des extraits hépatiques partiellement purifiés. qui peuvent être préparés (le n'importe quelle manière convens- ble. Il a été constaté que des résultats excellents sont ob- tenus,si l'exraithépatique est préalablement purifié par le procédé d'extraction à contre-courant décrit dans la de- ' mande de brevet belge n 380. Toutefois, la présente in- vention n'est pas limitée à l'utilisation de tels extraits.
Des extraits hépatiques, purifiés dans une mesure suffi- sante pour permettre l'obtention de bons résultats par le procédé suivant l'invention, peuvent être obtenus, par exem- ple, par la série suivante de procédés.
Du foie haché peut être mélangé à de l'eau et le mélange obtenu peut être acidifié jusqu'à pH 4,5 et, si on le désire, protéolysé à l'aide de papaïne. Après addition de volumes égaux d'acétone ou d'éthanol, le mélange est filtré et la ma- tière filtrée est soumise à une nouvelle extraction. Les fil- trats combinés sont alors concentrés sous vide et la matière lipoïdique est séparée par filtration. Quant à la matière pro- téinique, elle est alors précipitée par acidification et application de chaleur , le mélange obtenu étant neutralisé et ensuite filtré.
Le principe actif contenu dans le filtrat est alors adsorbé sur du charbon de bois- Celui-ci est lavé à l'aide de phénol aqueux dilué et le principe actif est séparé par extraction au moyen de phénol à 85-90 9. Le mé- lange obtenu estdilué au moyen d'éther et enfin extrait à l'aide d'eau.
Pour purifier davantage l'extrait obtenu ci-avant, on peut soit appliquer le procédé de chromatographiebasée sur des partages inégaux décrit dans la demande de brevet belge adsorption n 380. soit soumettre le principe actif à une nouvelle /
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sur charbon de bois, le principe actif étant récupéré par élution du charbon de bois, par. exemple, au moyen d'é- thanol chaud à 65 %.
Une purification supplémentaire peut, si on le désire, être obtenue, en faisant passer l'extrait partiellement purifié à travers une colonne d'alumine,comme décrit dans le brevet anglais n 590.956, les impuretés étant alors adsorbées sur\1'alumine. Il est évident que les procédés de purification partielle peuvent être modifiés à volonté et qu'une combinaison quelconque des procédés spécifiés ci- dessus peut être mise en oeuvre- Ainsi, le procédé de sépara- par chromatographie tion/basée sur des partages inégaux peut être répété un nom- bre quelconque de fois ou bien ce procédé peutjêtre entière- ment omis.
Il y a, toutefois, lieu de signaler à nouveau que, pour permettre une séparation précise par le procédé suivant l'invention, l'extrait aqueux appliqué à la colonne chroma- tographique doit être aussi..fortement purifié que possible.
Il a également été constaté que l'activité des extraits hépatiques obtenus par le procédé suivant l'invention peut être améliorée en soumettant ces extraits à une protéolyse, avant ou après leur application au gel de silice. La protéo- lyse peut être exécutée à l'aide de trypsine, d'érepsine ou de pancréatine , par exemple par traitement à 37 C et à pH 8,0, pendant 2 heures. Il est à noter que, lorsque la purification partielle a été exécutée par le procédé dé- crit dans la demande de brevet belge n 380 cette purification partielle peut elle-même inclure le stade de protéolyse, auquel cas ce traitement sera évidemment super- flu dans le procédé suivant la présente invention.
Les exemples suivants , qui ne doivent être considérés que comme illustratifs, permettront de bien comprendre l'invention.
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Exemple 1.
50 gr. de silice précipitée fortement adsorbante sont mélangés à de l'eau jusqu'à .Formation d'une pâte, qui est versée dans une colonne en verre de 23 mm de diamètre- 4,5 gr. d'un extrait hépatique partiellement purifié, dis- sous dans 20 mm3 d'eau, sont versés dans la colonne, le passade de la solution d'extrait hépatique à travers la silice étant accéléré par application d'une pression d'air au sommet de la colonne . La colonne est ensuite développée au moyen d'eau, jusqu'à ce que la tête de la zone colorée en rose ait atteint un niveau correspondant, vers le bas, aux trois quarts de la hauteur de la colonne. La colonne est refoulée et les quarts supérieur et inférieur de couleur crème sont séparés et rejetés.
La fraction médiane de couleur rose est éluée à l'aide d'alcool éthylique à 50 %, jusqu'à fin de coloratio L'éluat obtenu est évaporé jusqu'a siccité sous pression réduite . Il pèse 2,72 gr.
L'extrait hépatique originel s'avérait pleinement actif, au point de vue clinique, dans des cas d'anémie pernicieuse récidivante, à une dose unique de 15 mgr. L'entièreté de l'activité se retrouve dans les 2,72 grammes extraits de la fraction colorée en rose de la colonne.
Exemple 2
250 gr. de silice adsorbante sont transformés en pâte au moyen d'eau et coite pâte est versée dans une colon- ne chromatographique de 3 pouces de diamètre, à la base de laquelle est fixée une plaque en verre perforée, recouver a, te de papier-filtre . Lorsque l'excès d'eau/Qté élimine par égouttage, une solution de 474 mgr. d'un extrait hépatique fortement purifié dans 15 cm3 d'eau, est versée dans la colonne . Lorsque cette solution d'extrait hépatique s'est infiltrée dans la silice, on fait traverser le lit de sili- ce par 200 cm3 d'eau sous une légère pression d'air.
Lors- @
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que la colonne est complètement égouttée, elle est re- foulée et la zone colorée en rose, qui occupe sensible- ment le second quart de la colonne à partir du bas, est séparée et éluée à l'aide d'alcool éthylique à 50 %.
L'éluat est évaporé jusqu'à faible volume sous pression réduite et séché par congélation suivie de sublimation sous vide . Le rendement est de 174 mgr. La matière obte- nue produit effet clinique classique dans les cas d'ané- mie pernicieuse récidivante, à des doses uniques de 0,3mgr.
ExempleIII
5 gr. d'un lot de silice précipitée adsorbante sont mélangés à 2 gr. de kiesel¯uhr et le mélange obtenu est mis en suspension dans une solution à demi saturée de sulfate ammonique . La suspension obtenue est versée dans une colonne chromatographique d'un diamètre inté- rieur de 15 mm. Lorsque l'excès de liquide a filtré à travers la colonne, une solution de 58 mgr. d'extrait hépatique partiellement purifié, protéolyse à l'aide de trypsine, dans 4 cm3 d'une solution à demi saturée de sulfate emmonique est introduite dans la colonne et soumi- se dans celle-ci à une pression positive . Le chromatogram- ure est développé de la même manière à l'aide d'une solu- tion à demi saturée de sulfate ammonique .
Il se dévelop- pe ainsi une zone de couleur rose foncé, qui se meut lentement vers le bas de la colonne . Cette zone est séparée mécaniquement et extraite à l'aide d'alcool aqueux à 50 Le solvant est chassé par distillation sous pression réduite et le principe anti-anémique est séparé du sulfate ammonique, par extraction au moyen de phénol liquéfié. Le phénol est alors éliminé par extraction
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au moyen d'éthcr,après addition d'eau . Le résidu aqueux donne, après séchage par congélation, suivie de sublima-
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tion sous vide, un produit pesant 37,5 mgr. une mesure colorimétrique indique que ce produit révèle pratiquement la même activité que l'extrait hépatique de départ.
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour la préparation d'extraits hépatiques riches en principe actif, dans lequel on fait passer un extrait hépatique aqueux à travers une colonne contenant du gel de silice , le principe actif étant subséquemment élue de la section appropriée de la colonne.