BE498062A - - Google Patents

Description

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  PROCEDE POUR LA   PREPARATION   DE SUBSTANCES   EMPECHANT!LA   COAGULATION
DU SANG. 



   Le fait que   l'on   peut obtenir l'héparine, qui est un ester   sul-   furique d'un polysaccharide, à partir de poumons et de foies, est bien con- nu Pour la préparation de cette   substance,   l'industrie utilise divers pro- 
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 cédés. La plupart de ces procédés.ont ceci de commun que, dans une première phase, on obtient un produit brut, appelé héparine brute, et que, ce   der=   nier est ensuite   transformée   selon diverses méthodes, en héparine pure. 
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  Pour la préparation de l'héparine brute, M.H. Kuizenga et oo Spaul= ding (J.BioloShem,o vol 118 (1943), page 641) ont indiqué z, titre d'exemple   le mode opératoire suivant s: Des poumons de boeufs sont autolysés en présence   de sulfate d'ammonium, puis ils sont extraits par de l'hydroxyde de sodium. 



  Dans l'extrait obtenu, on précipite- un composé   héparino-protéiné   par   acidifi-   cation au moyen d'acide sulfurique. Ce composé est traité par de l'hydroxyde de sodium et l'héparine brute est précipitée dans la solution obtenue avec de   1-acétone,   On obtient ainsi   à   partir de 50 kg de   poumons-frais   102 g d'hé- 
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 parine brute d'une activité de 8s3 U 1/mg (unités internà,tioùales), ce qui correspond a un rendement de 16900 U.I par kilogramme de poumon,
La purification de cette héparine brute peut être effectuée par 
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 exemple par reprécipitation en passant par le sel de benzidine (FFoCharles et Aère Todd, Bioch.J.., vol 34 (140, page 112) ou en passant par le sel de baryum dans l'acide acétique dilué (M.H.Kuizenga et LoB Spaulding, leGo)

   Quand on réalise la purification en passant par le sel baryté on obtient, a titre d'exemple, à partir de 102 g d'héparine brute titrant bzz ü o I a/ag, &,83 g de composé baryté d'une activité de 85 duo Io/mg, ce qui correspond à un rendement de 88%, c'est-à-dire 15000 ü o 3 par kilogramme de poumon. Ainsi, pendant la procédure-de purification partant de l'héparine brute, on perd donc   12%   de   Inactivités   En poussant :la purification de cette prépara- tion plus loin, par précipitation fractionnée avec de l'acétone, ces mêmes 
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 auteurs obtinrent une héparine pure- titrant 125 U.I./mg., en un rendement de 65%, c'est-à-dire 9750 UoIo par kilogramme de poumon. Pendant le processus de purification on perd donc en tout 40% de l'activité présente au début. 

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   D'après les explications de J.E.Jorpes et S.  Gardell   (J.Biol.Chem., vol 176, (1948), page 267), l'héparine contenue dans les poumons et dans le foie consiste en un groupe de polysaccharides plus ou moins sulfurés, connus sousle nom d'acides   héparino-mono-,,   -di-, -tri- et -tétrasulfoniques. Plus il y a de groupes sulfoniques dans la molécule, plus forte est   Inaction   anti- coagulante. L'acide héparino-monosulfonique par exemple possède seulement une activité de 10 - 20 U.I./mg.   Ce:qui     contribue- à   la perte d'activité   men-   tionnée plus haut est le fait que les composés peu actifs se perdent pendant la purification. 



   Un autre sous-produit dans la fabrication de l'héparine, peu actif et relativement pauvre en souffre, est obtenu par traitement d'héparine bru- te, dans de l'alcool dilué, avec du chlorure de zinc ou du chlorure de cadmium. 



   Quant on ajoute 4 parties-   en.volume   d'acétone à l'eau-mère, obte- nue lors de la purification de l'héparine brute en passant par le sel de ben- zidine, on obtient un précipité livrant après   éliminàtion   de la benzidine une préparation titrant   0,5 à   1 U.I./mg. 



   Ces. composés se distinguent de l'héparine fortement active princi- paiement par leur teneur inférieure en soufre. 



   Il a été établi suivant l'invention que l'on peut produire des com- posés anticoagulants d'activité correspondant à celle de l'héparine pure, c'est-à-dire des acides héparino-tri- et -tétrasulfoniques, par sulfuration des sous-produits de la fabrication d'héparine mentionnés- plus haut. 



   Le nouveau procédé de préparation d'agents anti-coagulants for- tement actifs est caractérisé par le fait que l'on transforme par sulfura- tion des sous-produits de la fabrication d'héparine peu actifs en des pro- duits fortement actifs. 



     On   peut donc envisager comme matières de départ pour la sulfura- tion : 
A) Le sous-produit qui se sépare de préparations d'héparine impu- res au moyen de sel de zinc ou de cadmium dans de l'alcool dilué (sous-produit A). 



   B) Les acides héparino-mono- et -disulfoniques (sous-produit B). 



   C) La fraction totale,plus ou moins active, de l'héparine brute qui est précipitée par l'alcool ou l'acétone (produit C). 



   D) La fraction obtenue des eaux-mère de la purification de l'hé- parine (produit   D).   



   La préparation des agents anticoagulants fortement actifs peut ê- tre effectuée suivant l'invention de telle sorte que les sous-produits de la fabrication d'héparine sont sulfurés individuellement ou en commun; cette sulfuration des sous-produits, soit individuellement ou en commun, peut avoir lieu aussi en présence d'héparine. 



   En règle générale, la sulfuration des sous-produits de 1'héparine est accomplie dans la pyridine,   l'[alpha]-picoline,     etc...,   en utilisant l'acide c hlo- rosulfonique comme agent de sulfuration. 



   Pendant l'isolement des composés sulfurés du mélange de réaction, l'élimination de l'agent de sulfuration en excès présente certaines difficul- tés. Suivant les données de   P.   Karrer (Helv.Chim.Acta, vol. 26,   (1943),   page 1296) l'acide sulfurique est éloigné, par exemple, par dialyse. Suivant l'in- vention présente ce procédé compliqué est simplifié en ce que les sous-produits sulfurés de la fabrication de l'héparine sont précipités- dans le mélange de sulfuration au moyen d'alcaloïdes, telles que la brucine, la narcotine et au- tres. 



   Il est pourtant connu que des composés anticoagulants peuvent être préparés par sulfuration d'autres hauts polymères naturels ou synthétiques, L'effet anticoagulant d'esters sulfuriques de polysaccharides synthétiques a été découvert par Bergström   (Ztscho   physiol;Chem., vol 238, (1936), page 

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 163)a Par sulfuration de cellulose, d'amidon, de chitine, de pectine, etc.., au moyen d'acide chlorosulfonique, cet auteur obtint des préparations d'une activité de 5 à 20 fois plus faible que celle de l'héparine.

   Chargaff   (de   
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 B iol,Chemo, vol.115 (1936), page 155) a établi que l'activité d'esters sul- furiques de cellulose et d'esters sulfuriques d'alcool polyvinylique n'at- teint que un quart de celle   de-   l'héparine, En partant de cellulose, Po   Kar-   
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 rer (HelvoChimoActa9 vol 26 (1943), page 1296) pu obtenir des produits d'une teneur en souffre de 18 ¯ 20%, titrant 25 U.I./mg, et , partir d'esters sul- furiquea de chondroitine des produits titrant 17 ITmIo/mga Leur activité -était donc bien inférieure à celle de l'héparine qui titre environ 130   U.I./mg.   



  Astrup (Acta   Physiol,   Scande,   vole 8     (1944),   page 215) lui aussi conclut que l'ester trisulfurique de la cellulose et   1''acide   chitino-disulfonique sont beaucoup moins actifs   que,l'héparine.   Tous- ces agents anticoagulants, con- 
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 traitement à ceux obtenus'suivant l'invention présente, sont très peu actifs ou inutilisables à cause de leurs actions secondaires toxiques, 
Suivant le nouveau procédé, on obtient dès substances anticoagulantes, applicables à des fins thérapeutiques, avec un rendement qui n'a pas été 
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 atteint juoqu'k-ce jour (50000 UÓI" à partir' d'un kilogramme de poumon). 



  Exemple   1.   
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 1 partia en poids de sous-produit A, titrant 50 Uolo/mg et pouvant être obtenu d'après les données susmentionnées, est secouée avec une solution, 
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 chauffée à 800, de 1 partie en volume d'acide chlorosulfonique dans 10 par- ties en volume de pyridine. On laisse reposer pendant environ-10 minutes, puis on décante. Le résidu est dissout dans 10T parties d'eau et la solution est ajustée au moyen d'acide chlorhydrique-a pH 3o En agitant, on ajoute 50 parties en volume d'une solution aqueuse d'hydrochlorure de narcotine à 10%, ensuite de quoi le sel de narcotine de l'ester sulfurique précipite en 
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 gros flocons. On centrifuge et ori 1aw le résidu trois- fois avec 10 parties en volume d'une solution aqueuse   d'hydrochlorure   de narcotine à 1 %.

   Le sel narcotinique est mélangé avec 10 parties d'eau et additionné de 10 parties en volume d'une solution de soude à 10%. La base de narcotine précipitée 
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 est éloignée par filtration, le filtrat est ajusté là. pE, 6 .au : moyen d'acide acétique et l'ester sulfurique est précipité avec le double volume de métha- nol. Après séchage avec de l'alcool et de l'éther, on obtient 1, 1 parties en poids d'une préparation contenant   14,5%   de souffre et titrant 130 U.I./mg ce qui correspond au standard international de l'héparine. 



   Exemple 2. 
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  1 partie en poids du sous-produit B titrant 25 Umg.jet pouvant être obtenu d'après les données susmentionnées, est introduite portion par portion dans une solution, chauffée à 70 C de 2 parties en volume d'acide chlorosul- 
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 fonique danslO parties en volume d'4(=picoline" On agite pendant 4 heures à 70 C, puis on, ajoute 100 parties   d'eau,   La solution limpide est ajus- tée à pH 3 au moyen de   4   parties en   volume,-   d'acide chlorhydrique concentré,,. puis elle est additionnée-, en agitant, de 80 parties en volume d'une solution 
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 aqueuse dshydolor de brucine à 10%e Le sel brucinique du nouvel ester sulfurique est centrifugé et lavé trois fois avec 10 parties en volume.

   d'une solution aqueuse d'hydohlorna e de brucine à 1 %# On décompose le sel bru- cinique avec 20 parties en volume d'hydroxyde de sodium à 5 % et on sépare la base de brucine précipitée-. Le filtrat est. ajusté à pH 5 au moyen   d'aci-   de acétique et l'ester sulfurique est précipité avec le double volume d'al- cool éthylique, Après séchage avec- de   l'alcool   et de l'éther, on obtient 
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 192 parties en.

   poids d'une préparation titrant 120 U ,,1 .y'mg"   Exemple   
1 partie en poids du produit C, titrant 10   U.I./mg   et pouvant être obtenu par exemple sous forme de l'héparine brute suivant les données susmen- 
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 tionnées est introduite portion par portion dans unw solution, chauffée à 100 C, de 2 parties en volume d'acide   chlorosulfonique   dans 10 parties en volume de pyridine. On laisse reposer pendant 15 minutes et on ajoute 100 parties   d'eau.   La solution est ajustée à pH 3 au moyén d'acide chlorhydrique 

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 concentré, puis elle est additionnée de 80 parties en volume d'une solution aqueuse d'hydrochlorure de narcotine à 10 %.

   On centrifuge et on lave le sel narcotinique troisfois avec 10 parties en volume d'une solution aqueuse d'hydrochlorure de -narcotine à 1%. Le résidu est décomposé par 20 parties en volume d'une solution de soude à 5%. On sépare de la base de narcotine pré- cipitée, on ajuste le filtrat avec de   l'acide   acétique à pH 5 et on   précipi-   te l'ester sulfurique avec le volume double de méthanol. Après- séchage avec de l'alcool et de l'éther on obtient 1 partie en poids d'une préparation ti- trant 110   U.I./mg   et contenant 14,2 % de souffre. 



   Exemple 4. 



   1 partie en poids du produit D, titrant 0,5 - 1 U.I./mg, qui peut être obtenu suivant les données susmentionnées, est secouée pendant 5 heures à 60 C avec 2 parties en volume d'acide chlorosulfonïque dans 10 parties en volume de pyridine. On ajoute 200 parties d'eau et on ajuste à pH 3,5 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. Le produit de sulfuration est précipité par l'adjonction de 80 parties en volume, d'une solution aqueuse d'hydrochlorure de narcotine à 10%. Le précipité est séparé par filtration, puis il est lavé trois fois avec 10 parties en volume d'une solution d-hydrochlorure de narco- tine à 1 %. Le   se-1   narcotinique est mélangé avec 20 parties en volume d'une . solution de soude à 5% et la base de narcotine est séparée.

   Le produit de sulfuration est précipité dans le filtrat, après avoir ajusté ce dernier à pH 5, au moyen de 2 parties en   volume   d'alcool. Après séchage avec de l'al- cool et   de-l'éther on   obtient 1, 1 partie en poids d'une préparation titrant 130 U.I./mg et contenant 13, 1% de souffre. 



    REVENDICATIONS.   le - Procédé pour la préparation de substances anticoagulantes fortement actives, caractérisé par le fait que l'on confère par sulfuration une forte activité à des sous-produits de la fabrication d'héparine peu ac- tifs.

Claims (1)

1. 2. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on soumet à la sulfuration la fraction de préparations hépariniques impures séparable- au moyen de- sels de-zinc ou de cadmium.

   3. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on soumet à la sulfuration les- acides héparino-mono- et -disulfoniques.

   4. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé .par le fait que l'on soumet à la sulfuration la fraction totale de l'héparine brute,, pou- vant -être précipitée avec de l'alcool et de 1'acétone.

   5.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on soumet à la sulfuration la fraction pouvant être précipitée des eaux- mère de la fabrication d'héparine au moyen de solvants organiques. tel que l'alcool ou l'acétone.

   6. - Procédé suivant les revendications 1, 2, 3, 4 et 5, caracté- risé par le fait que la précipitation ,de substances actives dans le mélange de sulfuration est effectuée au moyen d'alcaloïdes.