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PROCEDE DE RECUPERATION DE TRYPSINE CRISTALLINE A PARTIR DE MELANGES DE
TISSUS CONTENANT DES ENZYMES ET DES SOLVANTS ORGANIQUES.
La présente invention concerne la préparation de trypsine cris- talline à partir de glandes de pancréas et elle a trait, en particulier, à la préparation de trypsine sous forme cristalline approprié à l'usage médical à partir de mélanges de tissus contenant des enzymes et de solvants organiques, tels que les résidus de pancréas restant après l'extraction de l'insuline.-
On sait que les glandes de pancréas de mammifères contiennent à la fois de l'insuline et des enzymes protéolytiques comprenant la trypsine.
Les préparations d'enzymes, telles que la pancréatine qui est constituée par un mélange d'enzymes amorpheset qui est utilisée dans une grande mesure dans les industries des,textiles et du tannage, ont été obtenues à partir de glandes de pancréas fraîches il y a de nombreuses années. On a aussi préparé des en- zymes cristallines pures à l'échelle du laboratoire à partir de glandes de pancréas fraîches.
Lorsqu'on prépare de l'insuline à partir de glandes de pancré- as fraîches, la pratique usuelle consiste à utiliser un solvant organique mis- cible à l'eau acidifié pour l'insuline, tel que les alcools .inférieurs et les cétones. Les solvants préférés sont le méthanol, l'éthanol et l'acétone. L' éthanol ou un solvant organique analogue est dilué à l'eau et acidifié pour préparer le solvant d'extraction. Afin de maintenir les enzymes inactives et insolubilisées de façon à empêcher la destruction de l'insuline ou la conta- mination de l'extrait d'insuline, il est préférable que le solvant d'extraction contienne d'environ 50% à environ 85% de solvant organique et qu'il soit à un pH au-dessous de 4.
Pendant de nombreuses années, on a pensé que les fortes concen- trations de solvant organique et/ou les faibles pH utilisés dans l'extraction
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de l'insuline détruisaient les enzymes protéolytiques et les résidus de glan- des de pancréas restant après l'extraction de l'insuline'étaient mis au rebut.
Cependant, on a récemment utilisé ces résidus comme source de préparation d'en- zymes analogues à la pancréatine. A cette fin, on a pensé qu'il était suffisant de réduire la concentration de solvant organique à moins d'environ 20% en vo- lume, tout en extrayant les enzymes dans un solvant aqueux. Cependant, jusqu'à présent on n'a pas trouvé de moyen pour préparer de la trypsine cristalline à partir de mélanges de tissu contenant des enzymes et de solvant organique, tels que les résidus de glandes de pancréas produits dans l'extraction de l'insuline.
La présente invention crée un procédé de production de trypsine cristalline à partir de mélanges de tissu contenant des enzymes et de solvant organique en réduisant la concentration de solvant organique du mélange à une valeur critiquement faible tout en extrayant les enzymes protéolytiques du tissu dans un solvant d'extraction aqueux de volume total limité et en traitant ensui- te l'extrait séparé tout d'abord pour éliminer les impuretés et ensuite pour récupérer la trypsine sous une forme cristalline appropriée à son utilisation en médecine.
Le présent procédé de récupération de trypsine cristalline à partir de mélange de tissu contenant des enzymes et de solvant organique est caractérisée en ce que la concentration de solvant organique dans ledit mélange est réduite à 4% ou moins en volume, après quoi la trypsine cristalline est récupérée.
Une importante caractéristique de l'invention réside ainsi dans la réduction de la concentration du solvant organique contenu dans le mélange à 4% ou moins en volume. On constate que cette caractéristique a des effets sur- prenants.
Bien qu'il soit connu dans la technique de réduire la concentra- tion de solvant organique à 20% ou moins pour récupérer des mélanges d'enzymes brutes à partir de mélanges de tissus contenant des enzymes et de solvant orga- nique, on a trouvé que cette réduction n'est pas suffisante pour obtenir l'effet selon la présente invention.
Il est surprenant que la réduction de concentration, telle que spécifiée ici, non seulement facilite l'extraction d'enzymes, mais rende aussi possible de régler la cristallisation de la trypsine au cours de l'opération de cristallisation subséquente.
Il est possible que cela soit dû au fait que chaque enzyme pa- rait être un complexe de composés chimiques en étroite relation, de solubilités variables,et que d'une certaine manière la présence de solvant organique dans l'extrait contrariait la récupération des enzymes sous la forme cristalline.
En outre, l'enseignement de la technique antérieure ne donne aucune réponse à la question de savoir comment régler ou contrôler la cris- tallisation des enzymes à partir d'un mélange de tissus contenant des enzymes et des solvants organiques.
Selon les chercheurs antérieurs, la cristallisation est commencée en elle-même à partir de glandes fraîches de pancréas et ces chercheurs antérieurs se sont trouvés, en conséquence, en face des problèmes que pose un mélange contenant des solvants organiques tel qu'il est traité selon la présente invention.
L'enseignement de réduire la concentration à 20% au-dessous en vue de n'obtenir que des mélanges bruts d'enzymes n'aide aucunement à établir un procédé qui règle la cristallisation de trypsine à partir de mélanges de solvants organiques et de tissus contenant des enzymes.
On croit qu'un résultat de l'utilisation de volumes limités dans l'opération d'extraction est de réduire au minimum l'extraction de non- taminés inertes ou, il est possible, d'enzymes partiellement dénaturées; qui
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contrariaient la cristallisation de trypsine. De préférence, on n'utilise pas plus de 14 parties en poids de solvant d'extraction pour chaque partie de produits de tissus solides contenus dans le mélange. Pour la commodité de la manipulation et pour permettre le pompage du mélange d'extraction, qui affec- te la forme d'une bouillie, le mélange d'extraction contient de préférence au moins environ 6 parties en poids de liquide pour chaque partie, de produit so- lide.
Des résultats optima sont obtenus lorsque le mélange d'extraction contient en- tre environ 9 et 11 parties en poids du solvant d'extraction pour chaque partie . des produits solides.
La bouillie préparée pour l'opération d'extraction d'enzymes ayant le rapport préféré de produit liquide à produits solides et ayant la concentra- tion désirée de solvant organique dans la partie liquide peut être formée d'un certain nombre de manières. Cependant, la simple dilution du mélange avec suf- fisamment d'eau pour réduire la concentration de solvant organique au moins à 4% nécessiterait l'utilisation de volumes excessivement grands d'eau et on préfère en conséquence former le mélange d'extraction d'enzymes d'une ma- nière qui comprend l'élimination d'une partie du solvant organique du mélange.
Des rendements très améliorés en enzymes et en particulier en trypsine peuvent être obtenus en réduisant la concentration du solvant orga- nique à moins de 4% et des résultats optima sont obtenus aux environs de 1% ou moins.
L'enseignement de la présente invention peut être appliqué en pratique de diverses manières.
Suivant une forme de réalisation, la réduction de la concentra- tion du solvant organique peut être obtenue par distillation sous pression ré- duite.
Dans une autre réalisation, la réduction de la concentration peut être obtenue par dilution par paliers,dans laquelle la dilution finale produit une concentration-de solvant organique inférieure à 4% et, selon une troisième réalisation, la réduction et la concentration du solvant organique peut être obtenue en lavant les tissus portant les enzymes avec suffisamment d'eau pour produire une concentration de solvant de 15 à 25% en volume, en évacuant l'eau de lavage et en ajoutant ensuite suffisamment d'eau pour rédui- re la concentration de solvant organique à moins de 4% en volume.
Au cours de l'opération de réduction de la concentration de solvant organique, une partie importante des enzymes est extraite dans la par- tie liquide du mélange. L'extraction d'enzymes peut être complétée après la formation de la bouillie contenant de 6 à 14 parties de liquide pour chaque partie de solide du tissu avec la partie liquide ne contenant pas plus de 4% en volume de solvant organique en agitant la bouillie se trouvant dans 1' appareillage d'extraction, qui est maintenue à un pH inférieur à 6,5 ou de préférence inférieur à 4, puis à une température suffisamment basse pour empécher l'activation et la destruction des enzymes.
Le tissu soumis à l'extraction peut ensuite être séparé du liquide contenant les enzymes par centrifugeage ou filtrage et le liquide peut être de nouveau traité pour préparer la trypsine cristalline.
Pour illustrer l'invention en détail, on donne les exemples suivants.
Exemple 1.
Les enzymes furent récupérées à partir de résidus de pancréas de boeuf exempts d'insuline par le mode opératoire suivant: Les résidus contenaient environ 70% de liquide et 30% de solides en poids, la
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partie liquide était 65% d'éthanol en volume acidifié au pH 2,85 avec de l'aci- de phosphorique. 450 kg. de ces résidus furent mis en suspension dans 1500 li- tres d'eau de conduite qui contenait 2200 cm3 de H2S04 concentré. On peut faire varier l'addition d'eau, sans sortir du cadre de l'invention, en ajoutant entre 6 et 20 parties et de préférence environ 10 parties d'eau par partie de solides de tissus contenus dans le mélange.
Après que la suspension eut été préparée, en utilisant un agitateur du type à turbine, la bouillie fut pompée dans l'appareil de distillation. La distillation fut faite dans un appareil du type à pot sous vide à une température moyenne de 15 à 20 C et au maximum 30 C. 650 litres de liquide et environ 30% d'éthanol fu- rent retirés au cours de cette opération. La concentration en alcool du concen- tré se trouvant dans l'appareil de distillation était d'environ 1 %. Le concentré fut ensuite dilué avec 250 litres d'eau de conduite afin d'atteindre une consis- tance permettant de le faire circuler.
Le liquide dilué fut ensuite ramené à son réservoir d'origine et refroidi à 4 C. L'extraction fut effectuée avec deux circulations de trente minites à travers une pompe comportant une turbine à trois aubes. La suspension fut agitée lentement avec un agitateur du type à turbine pendant 15 minutes en- tre et après les cycles de circulation. Cette action permet aux particules grasses de s'agglutiner avant une nouvelle extraction et la progression. Les particules de graisse coagulées furent retirées pendant ces opérations par écumage.
La séparation fut effectuée dans une centrifugeuse Bird du type cylindrique. Le tissu provenant de la première centrifugation fut mis en suspen- sion dans 850 litres d'eau de conduite contenant 340 cm3 de H2SO4. Le lavage fut effectué par une circulation de 30 minutes à travers la pompe du type à turbine. La suspension obtenue fut alors centrifugée et le liquide sortant fut ajouté à celui obtenu de la première séparation.
La trypsine cristalline est séparée de l'extrait combiné prove- nant du tissu par précipitation fractionnée avec addition de sulfate d'ammo- niumo Au cours de la première opération, des substances inertes sont précipitées et séparées de l'extrait par centrifugeage et filtrage. Ensuite, la concentra- tion de sulfate d'ammonium est augmentée pour précipiter le trypsinogène et les autres pro-enzymes. Le trypsinogène est ensuite isolé et épuré par recristalli- sation répétée de la même manière comme lorsque de la trypsine cristalline est produite à partir de glandes de pancréas fraîches.
Exemple 2.
Le mode opératoire de l'exemple 1 fut suivi essentiellement sauf que l'on remplaça les résidus de pancréas de boeuf par des résidus de pancréas de porc. En raison des plus fortes teneurs en graisse et en matière lipoïdale contenues dans les glandes de pancréas de porc (en moyenne 30 à 40% comparati- vement aux 5 à 10% des glandes de pancréas de boeuf), des précautions particuliè- res furent prises pour empêcher la graisse de s'opposer à la récupération de la trypsine cristalline. Après l'opération de distillation, la bouillie fut réfrigé- rée à 0 C environ et maintenue à cette température pendant les opérations d' extraction à la pompe et de centrifugeage pour favoriser la coagulation et la séparation des particules de graisse.
Une autre modification au mode opératoire consistait à faire passer le produit centrifugé dans une petite cuve d'écumage immédiatement après la séparation des résidus usés. Le produit centrifugé fut maintenu dans cette cuve d'écumage assez longtemps pour permettre aux particules de graisse, qui s' étaient de nouveau agglutinées par la centrifugation, de s'élever à la surfa- ce et d'être retirées par-écumage. De cette manière, on obtint un extrait sen- siblement exempt de graisse.
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Exemple 3.
Des résidus de pancréas exempts d'insuline furent mis en suspension dans 4 volumes d'eau à un pH 1,8 acidifiée à l'acide chlorhydrique. Le pH fut ensuite réglé de nouveau à 1 à l'acide chlorhydrique. La concentration d'éthanol fut alors diminuée à 3% par distillation sous pression réduite. L9extrac- tion des enzymes fut ensuite complétée en faisant passer la bouillie dans une cuve dans laquelle elle fut soumise à l'extraction pendant une période de la.8 heures à 3 C et à un pH de 1,8.
Le tissu fut alors séparé par centrifugeage et mis au rebut.
Du sulfate d'ammonium fut ajouté au produit centrifugé jusqu'à ce qu'une con- centration de 0,4 fut atteinte. On laissa la suspension résultante se reposer à 5 C pendant 48 heures.
La suspension fut ensuite filtrée et le précipité contenant la fraction de protéine animale fut évacué.
Du sulfate d'ammonium fut ajouté au produit filtré jusqu'à 0,7 de saturation et on laissa la suspension résultante se déposer pendant 48 heures à 5 C.
On sépara le précipité d'enzymes brut et la matière surnageante fut éliminée.
Le gâteau brut à 0,7 de saturation fut retravaillé en le dissol- vant dans 10 volumes d'eau distillée et le refractionnant par les opérations au sulfate d'ammonium à 0,4 et 0,7 de saturation à 5 C.Le gâteau à 0,7 de saturation obtenu par ces opérations peut être retravaillé de nouveau en le dissolvant dans 3 volumes d'eau distillée et en le refractionnant par des opérations de saturation au sulfate d9ammonium à 0,4 et 0,7 de saturation à 25 C.
Le gâteau à 0,7 de saturation ainsi obtenu fut dissous dans 1,5 volumes d'eau distillée à 25 C. La solution de sulfate d'ammonium saturée fut ajoutée à une saturation 0,25. Le pH fut réglé à 5 avec 5 N NaOH. La solution fut inoculée avec une petite quantité de cristaux chymotrypsinogènes et lais- sée reposée à 25 C jusque ce que la cristallisation de chymotrypsinogène fut complète, 48 à 72 heures étant usuellement nécessaires. La suspension fut ensuite filtrée.
Le pH du produit filtré fut réglé, après la séparation du chymotryp-- sinogène brut à 3 avec 5 N H2SO4.D u sulfate d'ammonium fut ajouté à cette solu- tion jusqu'à 0,7 de saturation.
La suspension fut filtrée et le filtrat éliminé. Le précipité obtenu fut dis- sous dans 3 volumes d'eau distillée et retravaillé par saturation à 0,4 et 0,7 au sulfate d'ammonium à 25 C.
Le précipité saturé à 0,7 fut dissous dans 1,5 volume de tampon au borate au pH 9 à 10 C. Le pH de la solution fut réglé à 7 avec 5 N NaOH. On ajouta du sul- fate de magnésium saturé jusqu'à 0,5 de saturation. La solution fut maintenue à 5 C jusque ce que la cristallisation de la trypsine fut complète, quelques jours étant usuellement nécessaires. La suspension de cristallisation fut sé- parée par filtrage et le produit filtré fut éliminé. Le gâteau de trypsine cris- talline fut ensuite maintenu à -5 C ou mis en suspension dans 10 volumes d'eau et lyophilisé.
Exemple 4.
Le mode opératoire suivant peut être utilisé pour récupérer de la trypsine cristalline à partir de résidus de glandes de pancréas exempts d' insuline contenant de 30 à 50% en poids de produits solides et ayant une partie liquide acidifiée au-dessous du pH 4 et contenant environ 60 à 70% en volume d'éthanol. On met 450 kg. de ces résidus en suspension dans 675 li- tres d'eau. On mélange complètement la bouillie et on sépare la masse de l'eau des produits solides par centrifugeage. On élimine l'eau de lavage.
On met les résidus lavés en suspension dans 1350 litres d'eau. On extrait les enzymes contenues dans les produits solides dans la partie liquide de la bouillie en faisant circuler cette dernière à travers une pompe à turbine pendant 30 à 60
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minutes, soit en continua soit avec une période intermédiaire de 5 à 15 mi- nutes de repos dans une cuve avec agitation générale. A titre de variante, l'extraction est effectuée en faisant passer la bouillie à une cuve d'extrac- tion comportant une chemise dans laquelle circule de la saumure et qui est équipée d9un agitateur, puis on maintient la bouillie dans cette cuve pen- dant 12 à 48 heures, tout en maintenant sa température entre -1 C et +2 C.
On sépare les résidus usés de la partie liquide de la bouillie par eentrifu- geage. On maintient l'extrait séparé à une température comprise entre-1 à +2 C pour continuer le traitement. On traite l'extrait ainsi obtenu avec du sulfate d'ammonium de la manière décrite à l'exemple 1 pour obtenir un gâ- teau d'enzymes brut sensiblement exempt de contaminants inertes et le gâteau est de nouveau travaillé pour obtenir la trypsine cristalline.
Exemple 5
2700 go de pancréas de boeuf furent soumis à l'extraction pour obtenir l'insuline et le tissu retiré par centrifugeage après l'extraction contenait environ 50% en poids de la solution d'extradant à l'alcool. Le poids du tissu était d'environ 1800 g.
Les solides de tissu pancréatique retirés furent ajoutés à 6000 cm3 d'eau froide et la température fut maintenue en agitant à 5 C pendant 10 heures. Le pH du mélange d'extraction était 2,4 sans l'addition de nou- vel acide. Les solides du tissu furent retirés par centrifugeage et resou- mis à l'extraction dans 3000 cm3 d'eau froide pendant une période de 2 heu- res, puis les éléments insolubles pancréatiques furent retirés comme pré- cédemment. Le premier et le second extractants furent alors combinés. Les extractants aqueux combinés contenant les proenzymes pancréatiques furent filtrés jusqu'à ce qu'ils soient clairs et les pro-enzymes furent précipités par l'ad- dition d'une quantité suffisante de sulfate d'ammonium pour produire une con- centration à 0,8 de saturation dans la solution.
Les proenzymes protéolytiques précipitées furent retirées par filtrage et remises en solution, puis de nou- veau épurées et activées pour récupérer la trypsine cristalline en bons rende- ments.
Exemple 6
2700 gr. de pancréas de boeuf congelé furent soumis à l'extrac- tion de façon analoguepour récupérer l'insuline, comme à l'exemple 5. Les solides de tissu pancréatique retirés contenant les pro-enzymes furent ajoutés à 4000 cm3 d'eau et la bouillie ainsi formée fut soumise à distillation dans le vide à une température de 30 C pour élim@iner l'alcool. Après avoir éliminé environ 1000 cm3 d'eau par distillation, la matière fut retirée de l'appareil de distillation et refroidie à 5 C, puis agitée vigoureusement pendant 3 heu- res.
Les produits solides pancréatiques furent ensuite retirés par centrifu- geage et de nouveau soumis à l'extraction dans 3000 cm3 d'eau froide en ajou- tant suffisanment d'acide pour maintenir le il à 2,4, puis en agitant pendant 2 heures à une température de 5 C.
Les extraits combinés furent traités après retrait des extraits de tissu en suspension de nouveau, comme à l'exemple 5, pour récupérer la trypsine cris- talline .
Exemple 7
Dans 1 exemple précédent, la trypsine est obtenue sous la forme cristalline. Parfois, il est désirable de procéder à des opérations d'épura- tion supplémentaire en plus de celles décrites pour préparer un produit cris- tallin pur ayant une grande stabilité et une force standardisée. En se ré- férant particulièrement au mode opératoire décrit à l'exemple 3, il arrive, après que le gâteau de trypsinogène a été dissous dans la solution de tam- pon de borate et que la solution de sulfate de magnésium a été ajoutée, qu'une gélatinisation notable apparaît dans la solution au repos ou que la
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solution peut être d'une couleur forcée ou d'un aspect trouble.
Si l'une quel- conque de ces conditions se présente. il est-désirable de soumettre la solu- tion au filtrage avant de la traiter pour la cristallisation de la trypsine.
De même,, après la cristallisation.. le produit cristallin peut paraître gommeux ou gélatineuxLorsque ceci se produit, la solution"cristalline séparée doit être centrifugée en utilisant une cuve à masse. Le précipité provenant de la centrifugation doit ensuite être mis en suspension dans une quantité minimum de solution de tampon au borate de pH 9. Cette suspension doit ensuite être filtrée et le gâteau filtré doit être séché autant que possible. Le gâteau de filtre sec ainsi obtenu peut être emmagasiné indéfiniment à -5 C.
Le procédé de la présente invention a été illustré dans ce qui précède par des exemples dans lesquels la matière première était des glandes de pancréas à partir desquellesl'insuline avait été extraite.C'est là éga- lement la matière la plus économique que l'on puisse utiliser actuellement, mais on voit que le procédé sera applicable en lui-même dans tous autres trai- tements dans lesquels on obtient un mélange de tissus contenant de la trypsi- ne, tels par exemple que des résidus provenant d'autres traitements dans les- quels on obtient un mélange de tissus contenant de la trypsine, et de solvants organiques., puis il peut aussi être appliqué en combinaison avec du tissu frais qui a reçu une addition de solvant organique à une fin ou à une autre,par exemple pour la conservation.
Bien que dans ce qui précède l'invention ait été décrite avec beaucoup de détails pour illustrer certains modes de réalisation, il est bien évident que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
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PROCESS FOR RECOVERING CRYSTALLINE TRYPSIN FROM MIXTURES OF
FABRICS CONTAINING ENZYMES AND ORGANIC SOLVENTS.
The present invention relates to the preparation of crystalline trypsin from pancreatic glands and in particular relates to the preparation of trypsin in crystalline form suitable for medical use from tissue mixtures containing enzymes and enzymes. organic solvents, such as pancreatic residue left over after insulin extraction.
It is known that the pancreatic glands of mammals contain both insulin and proteolytic enzymes including trypsin.
The enzyme preparations, such as pancreatin which is a mixture of amorphous enzymes and which is used to a great extent in the textile, tanning and tanning industries, have been obtained from fresh pancreatic glands ago many years. Laboratory-scale pure crystalline enzymes have also been prepared from fresh pancreatic glands.
When preparing insulin from fresh pancreatic glands, it is usual practice to use an acidified, water-mixed organic solvent for the insulin, such as lower alcohols and ketones. The preferred solvents are methanol, ethanol and acetone. Ethanol or a similar organic solvent is diluted with water and acidified to prepare the extraction solvent. In order to keep the enzymes inactive and insolubilized so as to prevent destruction of insulin or contamination of the insulin extract, it is preferred that the extraction solvent contains from about 50% to about 85%. organic solvent and that it is at a pH below 4.
For many years it was believed that the high concentrations of organic solvent and / or the low pH values used in the extraction
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insulin destroyed the proteolytic enzymes and the pancreatic gland residues remaining after the insulin extraction were discarded.
However, these residues have recently been used as a source for preparing pancreatin-like enzymes. For this purpose, it has been thought sufficient to reduce the concentration of organic solvent to less than about 20% by volume, while extracting the enzymes into an aqueous solvent. However, so far no way has been found to prepare crystalline trypsin from mixtures of tissue containing enzymes and organic solvent, such as the pancreatic gland residues produced in the extraction of the. insulin.
The present invention creates a process for producing crystalline trypsin from tissue mixtures containing enzymes and organic solvent by reducing the organic solvent concentration of the mixture to a critically low value while extracting the proteolytic enzymes from the tissue in a solvent. aqueous extraction of limited total volume and subsequent processing of the separated extract first to remove impurities and then to recover trypsin in a crystalline form suitable for use in medicine.
The present method of recovering crystalline trypsin from a mixture of tissue containing enzymes and organic solvent is characterized in that the concentration of organic solvent in said mixture is reduced to 4% or less by volume, after which the crystalline trypsin is recovered.
An important characteristic of the invention thus resides in the reduction of the concentration of the organic solvent contained in the mixture to 4% or less by volume. We can see that this characteristic has surprising effects.
Although it is known in the art to reduce the organic solvent concentration to 20% or less to recover crude enzyme mixtures from tissue mixtures containing enzymes and organic solvent, it has been found that this reduction is not sufficient to obtain the effect according to the present invention.
It is surprising that the reduction in concentration, as specified herein, not only facilitates the extraction of enzymes, but also makes it possible to control the crystallization of trypsin during the subsequent crystallization process.
It is possible that this is due to the fact that each enzyme would appear to be a complex of closely related chemical compounds, of varying solubilities, and that in some way the presence of organic solvent in the extract interfered with the recovery of the enzymes. in the crystalline form.
Further, the teaching of the prior art gives no answer to the question of how to control or control the crystallization of enzymes from a mixture of tissues containing enzymes and organic solvents.
According to the earlier researchers, crystallization was initiated in itself from fresh pancreatic glands and these earlier researchers, therefore, faced the problems of a mixture containing organic solvents as processed according to the present invention.
Teaching to reduce the concentration to 20% below in order to obtain only crude mixtures of enzymes does not help in establishing a process which controls the crystallization of trypsin from mixtures of organic solvents and tissues. containing enzymes.
It is believed that one result of the use of limited volumes in the extraction operation is to minimize the extraction of inert non-taminates or, possibly, partially denatured enzymes; who
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thwarted the crystallization of trypsin. Preferably, no more than 14 parts by weight of extraction solvent are used for each part of solid tissue products contained in the mixture. For convenience in handling and to allow pumping of the extraction mixture, which takes the form of a slurry, the extraction mixture preferably contains at least about 6 parts by weight of liquid for each part, of solid product.
Optimum results are obtained when the extraction mixture contains between about 9 and 11 parts by weight of the extraction solvent for each part. solid products.
The slurry prepared for the enzyme extraction operation having the preferred ratio of liquid product to solids and having the desired concentration of organic solvent in the liquid part can be formed in a number of ways. However, simple dilution of the mixture with sufficient water to reduce the organic solvent concentration to at least 4% would require the use of excessively large volumes of water and it is therefore preferred to form the extract mixture. enzymes in a manner which comprises removing part of the organic solvent from the mixture.
Much improved yields of enzymes and in particular trypsin can be obtained by reducing the concentration of the organic solvent to less than 4% and optimum results are obtained in the region of 1% or less.
The teaching of the present invention can be applied in practice in various ways.
In one embodiment, the reduction in the concentration of the organic solvent can be achieved by distillation under reduced pressure.
In another embodiment, the reduction in concentration can be achieved by stepwise dilution, wherein the final dilution produces an organic solvent concentration of less than 4% and, in a third embodiment, the reduction and concentration of the organic solvent can be achieved. be achieved by washing the fabrics carrying the enzymes with sufficient water to produce a solvent concentration of 15 to 25% by volume, draining off the wash water and then adding sufficient water to reduce the concentration of organic solvent less than 4% by volume.
During the operation of reducing the concentration of organic solvent, a substantial part of the enzymes is extracted into the liquid part of the mixture. The enzyme extraction can be completed after forming the slurry containing 6-14 parts liquid for each solid part of the tissue with the liquid part containing no more than 4% by volume organic solvent by stirring the slurry in the extraction apparatus, which is maintained at a pH below 6.5 or preferably below 4, and then at a temperature sufficiently low to prevent activation and destruction of the enzymes.
The extracted tissue can then be separated from the liquid containing the enzymes by centrifuging or filtering and the liquid can be further processed to prepare the crystalline trypsin.
To illustrate the invention in detail, the following examples are given.
Example 1.
Enzymes were recovered from insulin-free beef pancreas residues by the following procedure: The residues contained about 70% liquid and 30% solids by weight,
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liquid part was 65% ethanol by volume acidified to pH 2.85 with phosphoric acid. 450 kg. of these residues were suspended in 1500 liters of line water which contained 2200 cc of concentrated H2SO4. The addition of water can be varied, without departing from the scope of the invention, by adding between 6 and 20 parts and preferably about 10 parts of water per part of tissue solids contained in the mixture.
After the slurry was prepared, using a turbine type stirrer, the slurry was pumped into the still. The distillation was carried out in a vacuum pot type apparatus at an average temperature of 15 to 20 ° C. and a maximum of 30 ° C. 650 liters of liquid and about 30% ethanol were removed during this operation. The alcohol concentration of the concentrate in the still was about 1%. The concentrate was then diluted with 250 liters of tap water to achieve a consistency to allow it to circulate.
The diluted liquid was then brought back to its original reservoir and cooled to 4 C. The extraction was carried out with two circulations of thirty minutes through a pump comprising a three-blade turbine. The suspension was stirred slowly with a turbine type stirrer for 15 minutes between and after the circulation cycles. This action allows the fatty particles to clump together before further extraction and progression. The coagulated fat particles were removed during these operations by skimming.
The separation was carried out in a Bird centrifuge of the cylindrical type. The tissue from the first centrifugation was suspended in 850 liters of tap water containing 340 cc of H2SO4. Washing was carried out by circulating for 30 minutes through the turbine type pump. The suspension obtained was then centrifuged and the exiting liquid was added to that obtained from the first separation.
The crystalline trypsin is separated from the combined extract from the tissue by fractional precipitation with the addition of ammonium sulfate. In the first operation, inert substances are precipitated and separated from the extract by centrifugation and filtering. Then the concentration of ammonium sulfate is increased to precipitate trypsinogen and other pro-enzymes. The trypsinogen is then isolated and purified by repeated recrystallization in the same manner as when crystalline trypsin is produced from fresh pancreatic glands.
Example 2.
The procedure of Example 1 was followed essentially except that the residues of beef pancreas were replaced by residues of pork pancreas. Due to the higher fat and lipoid content contained in the pancreatic glands of pigs (on average 30-40% compared to 5-10% of the glands of beef pancreas), special precautions were taken. to prevent fat from opposing the recovery of crystalline trypsin. After the distillation operation, the slurry was refrigerated to about 0 ° C. and maintained at this temperature during the pump extraction and centrifuging operations to promote coagulation and separation of the fat particles.
Another modification to the procedure was to pass the centrifuged product through a small skimming tank immediately after separation of the spent residues. The centrifuged product was held in this skimming tank long enough to allow the fat particles, which had again clumped together by the centrifugation, to rise to the surface and be removed by skimming. In this way, a substantially fat-free extract was obtained.
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Example 3.
Insulin-free pancreas residues were suspended in 4 volumes of water at pH 1.8 acidified with hydrochloric acid. The pH was then adjusted back to 1 with hydrochloric acid. The ethanol concentration was then reduced to 3% by distillation under reduced pressure. The enzyme extraction was then completed by passing the slurry into a tank in which it was extracted for a period of 8 hours at 3 ° C and pH 1.8.
The tissue was then separated by centrifugation and discarded.
Ammonium sulfate was added to the centrifuged product until a concentration of 0.4 was reached. The resulting suspension was allowed to stand at 5 ° C for 48 hours.
The suspension was then filtered and the precipitate containing the animal protein fraction was discharged.
Ammonium sulfate was added to the filtered product to 0.7 saturation and the resulting suspension allowed to settle for 48 hours at 5 ° C.
The crude enzyme precipitate was separated and the supernatant was removed.
The raw cake at 0.7 saturation was reworked by dissolving it in 10 volumes of distilled water and re-fractionating it by ammonium sulfate operations at 0.4 and 0.7 saturation at 5 C. The cake at 0.7 saturation obtained by these operations can be reworked again by dissolving it in 3 volumes of distilled water and refracting it by saturation operations with ammonium sulfate at 0.4 and 0.7 saturation at 25 C .
The resulting 0.7 saturation cake was dissolved in 1.5 volumes of distilled water at 25 ° C. The saturated ammonium sulfate solution was added to 0.25 saturation. The pH was adjusted to 5 with 5 N NaOH. The solution was inoculated with a small amount of chymotrypsinogen crystals and allowed to stand at 25 ° C. until crystallization of chymotrypsinogen was complete, 48-72 hours usually being required. The suspension was then filtered.
The pH of the filtered product was adjusted, after separation of the crude chymotryp-sinogen to 3 with 5N H2SO4. Ammonium sulfate was added to this solution to 0.7 saturation.
The suspension was filtered and the filtrate removed. The precipitate obtained was dissolved in 3 volumes of distilled water and reworked by saturation at 0.4 and 0.7 with ammonium sulfate at 25 C.
The 0.7 saturated precipitate was dissolved in 1.5 volumes of borate buffer pH 9-10 C. The pH of the solution was adjusted to 7 with 5 N NaOH. Saturated magnesium sulfate was added to 0.5 saturation. The solution was kept at 5 ° C until crystallization of the trypsin was complete, a few days being usually necessary. The crystallization slurry was filtered off and the filtered product was removed. The crystalline trypsin cake was then kept at -5 ° C or suspended in 10 volumes of water and lyophilized.
Example 4.
The following procedure can be used to recover crystalline trypsin from insulin-free pancreatic gland residues containing 30-50% by weight of solids and having a liquid portion acidified below pH 4 and containing about 60 to 70% by volume of ethanol. We put 450 kg. of these residues suspended in 675 liters of water. The slurry is completely mixed and the water mass is separated from the solids by centrifuging. The wash water is removed.
The washed residues are suspended in 1350 liters of water. The enzymes contained in the solid products are extracted from the liquid part of the slurry by circulating the latter through a turbine pump for 30 to 60
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minutes, either continuously or with an intermediate period of 5 to 15 minutes of rest in a tank with general agitation. As an alternative, the extraction is carried out by passing the slurry to an extraction tank having a jacket in which brine circulates and which is equipped with a stirrer, and then the slurry is kept in this tank for a while. 12 to 48 hours, while maintaining its temperature between -1 C and +2 C.
The spent residues are separated from the liquid part of the slurry by centrifugation. The separated extract is maintained at a temperature of between -1 to + 2 ° C. to continue the treatment. The extract thus obtained is treated with ammonium sulfate as described in Example 1 to obtain a crude enzyme cake substantially free of inert contaminants and the cake is again worked to obtain crystalline trypsin.
Example 5
2700 gb of beef pancreas were extracted to obtain insulin and the tissue removed by centrifugation after the extraction contained about 50% by weight of the alcohol extradant solution. The weight of the fabric was approximately 1800g.
The pancreatic tissue solids removed were added to 6000 cc of cold water and the temperature was maintained with stirring at 5 ° C for 10 hours. The pH of the extraction mixture was 2.4 without the addition of new acid. Tissue solids were removed by centrifugation and resuspended in 3000 cc of cold water for a period of 2 hours, then the pancreatic insoluble elements were removed as before. The first and second extractants were then combined. The combined aqueous extractants containing the pancreatic proenzymes were filtered until clear and the proenzymes were precipitated by the addition of a sufficient amount of ammonium sulfate to produce a concentration of 0. , 8 saturation in solution.
The precipitated proteolytic proenzymes were removed by filtration and redissolved, then further purified and activated to recover the crystalline trypsin in good yields.
Example 6
2700 gr. of frozen beef pancreas were subjected to extraction in a similar fashion to recover insulin, as in Example 5. The withdrawn pancreatic tissue solids containing the pro-enzymes were added to 4000 cc of water and the slurry. thus formed was subjected to vacuum distillation at a temperature of 30 ° C. to remove the alcohol. After about 1000 cc of water had been distilled off, the material was removed from the still and cooled to 5 ° C, then stirred vigorously for 3 hours.
The pancreatic solids were then removed by centrifugation and again extracted into 3000 cc of cold water adding enough acid to maintain the pH at 2.4, followed by stirring for 2 hours at a temperature of 5 C.
The combined extracts were processed after removing the suspended tissue extracts again, as in Example 5, to recover the crystalline trypsin.
Example 7
In the previous example, trypsin is obtained in the crystalline form. Sometimes it is desirable to perform additional scrubbing operations in addition to those described to prepare a pure crystalline product having high stability and standardized strength. With particular reference to the procedure described in Example 3, it happens, after the trypsinogen cake has been dissolved in the borate buffer solution and the magnesium sulfate solution has been added, that '' noticeable gelatinization appears in the standing solution or the
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solution may be faded in color or cloudy in appearance.
If any of these conditions occur. it is desirable to subject the solution to filtering before processing it for crystallization of trypsin.
Likewise, after crystallization, the crystalline product may appear gummy or gelatinous. When this occurs, the separated crystalline solution should be centrifuged using a mass cell. The precipitate from centrifugation should then be suspended in a mass cell. minimum quantity of borate buffer solution of pH 9. This suspension should then be filtered and the filter cake should be dried as much as possible The resulting dry filter cake can be stored indefinitely at -5 C.
The process of the present invention has been illustrated in the foregoing by examples in which the raw material was pancreatic glands from which insulin had been extracted. This is also the most economical material to be obtained. can be used at present, but it is seen that the process will be applicable in itself in all other treatments in which a mixture of tissues containing trypsin is obtained, such as for example residues from other treatments in which is obtained a mixture of fabrics containing trypsin, and organic solvents., then it can also be applied in combination with fresh tissue which has received an addition of organic solvent at one end or another, for example for conservation.
Although in the foregoing the invention has been described in great detail to illustrate certain embodiments, it is obvious that numerous modifications can be made to it without departing from its scope.