<Desc/Clms Page number 1>
PROCEDE DE RECUPERATION DE TRYPSINE A PARTIR DE GLANDES DE PANCREAS.
La présente invention concerne un procédé de récupération de trypsine cristalline à partir de mélanges de tissus contenant des enzymes et de sol- vants organiques, puis elle a plus particulièrement trait à la préparation de trypsine sous une forme cristalline appropriée à l'usage médical.
On sait que les glandes de pancréas de mammifères contiennent à la fois de l'insuline et des enzymes protéolytiques comprenant la trypsine.
Les préparations d'enzymes, telles que la pancréatine, qui est constituée par un mélange d'enzymes amorphes et qui est largement utilisée dans l'indus- trie des textiles et dans l'industrie du tannage, ont été obtenues à partir de glandes fraîches de pancréas depuis de nombreuses années. Les enzymes cristallines pures ont également été préparées à l'échelle du laboratoire à partir de glandesfraîches de pancréas
L'extraction des pro-enzymes à partir des glandes de pancréas peut être éxécutée d'un certain nombre de manières différentes. Suivant, dans une certaine mesure, la nature des tissus particuliers de pancréas, la mesure de l'agitation et d'autres facteurs, il n'a été possible, jusqu'à présent, que d'extraire de 60 à 80% des enzymes en une période de 48 heures.
Dans l'extraction à l'échelle industrielle, des périodes de 48 heures sont indésirables, parce que l'utilisation de l'appareillage d'extrac- tion est sérieusement limitée. En conséquence, on désire créer un procédé d'exécution de l'extraction des enzymes d'une manière sensiblement complète dans un laps de temps très réduit.
En pratique, les glandes de pancréas, qui sont soumises selon l'invention au procédé d'extraction d'enzymes, contiennent des particules grasses. Spécialement, lorsqu'on utilise des glandes de pancréas de porc , qui contiennent environ 30 à 40% dë graisse, on a trouvé que l'extraction est très difficile. Mais, même avec de moindres quantités de graisse, on a constaté qu'elles n'influencent pas seulement 1(.opération d'extraction, mais
<Desc/Clms Page number 2>
également la cristallisation subséquente.
En conséquence, selon l'un de ses aspects, la,présente invention est basée sur la constatation qu'afin d'exécuter un procédé donnant dans sa dernière opération une trypsine cristalline appropriée à l'usage médical, il est important d'éliminer les particules de graisse de la matière glandu- laire. Un problème particulier relatif à la séparation des particules gras- ses des glandes est dû au fait que les graisses se trouvant fréquemment ré- parties dans tout le tissu et qu'elles empêchent; en conséquence, un contact efficace entre le liquide aqueux utilisé pour l'extraction et le tissu por- tant les enzymes dans une mesure telle qu'il est difficile d'exécuter le pro- cédé avec un rendement satisfaisant dans un temps raisonnable.
Le facteur temps présente aussi un problème en ce que les enzymes sont des substances très sensibles qui sont sujettes à perte d'activité si le traitement est exagérément prolongé.
Confornément à cette constatation, le procédé'de la présente invention pour récupérer de la trypsine cristalline à partis de mélanges de glandes de pancréas réduites contenant des enzymes et de solvants organiques est caractérisé en ce que les glandes sont soumises, en présence d'un agert extracteur, à un traitement mécanique, tel qu'une distorsion, après quoi la trypsine extraite est soumise à cristallisation.
Ainsi, une importante caractéristique de l'invention réside dans la distorsion des glandes au cours de l'extraction, cette distorsion soumet- tant ces glandes à une flexion produisant un pressurage analogue au pressa- ge d'une éponge, ce qui a pour résultat partiellement que les solvants peu- vent pénétrer dans les tissus d'une manière complète pour effectuer la récu- pération des enzymes, afin d'accélérer leur extraction et partiellement pour produire un relâchement ou un dégagement des substances grasses de l'intérieur des glandes, en permettant aux particules grasses dégagées d'être retirées du tissu.
Comme on peut facilement le comprendre, on obtient de ce fait à la fois une augmentation du rendement et une réduction de la durée de l'ex- traction.
Un autre avantage important de l'exécution du procédé de la ma- nière décrite consiste en ce que les forces de distorsion ont pour effet de retirer les particules grasses de l'intérieur du tissu glandulaire et égale - ment de favoriser la formation de masses agglutinées de particules grasses qui tendent à s'élever à la surface de la solution d'extraction et qui peu- vent ensuite être retirées par écumage ou centrifugeage. La production d'une solution d'enzymes sensiblement exempte de graisse par le procédé de la pré- sente invention a rendu possible d'obtenir des enzymes cristallines à partir de glandes contenant des quantités importantes de particules grasses. En reconnaissant cette nécessité d'une solution d'enzymes essentiellement exemp- te de graisse, on empêche la formation de trypsine cristalline à partir de glandes contenant des graisses.
On pense que cet effet résulte des influen- ces défavorables des particules grasses suf la formation d'enzymes cristal- lines au cours de l'opération de cristallisation subséquente.
Dans la mise en oeuvre du procédé, ceci peut être effectué rapi- dement selon l'invention en faisant passer les glandes sous la forme d'une bouillie à travers une zone de @istorsion, par exemple, dans une pompe à turbine sans soumettre la matière glandulaire à une autre subdivision notable quelconque. Ceci est nettement différent du' procédé antérieur@@@t connu d'extraction d'insuline dans lequel on a proposé d'améliorer l'extraction d'enzymes protéolytiques en élevant le degré de subdivision des glandes, par exemple en les faisant passer à travers un broyeur à grande vitesse. Mais ceci n'a pas été démontré satisfaisant en raison des difficultés accrues qui en résultent dans la séparation des extraits à partir du tissu finement di- visé.
La matière de départ servant à effectuer l'opération d'extraction selon le procédé de l'invention peut être constituée par les résidus prove-
<Desc/Clms Page number 3>
vebant de l'extraction d'insuline à partir de glandes de pancréas réduites en faisant venir ces glandes en contact avec un solvant organique miscible à l'eau pour l'insuline. En partant de ces résidus, la première opération du procédé de l'invention consiste à former une bouillie contenant les pro- duits solides des résidus et un solvant d'extraction liquide contenant au moins 80% d'eau en volume.
Etant donné que la partie liquide des résidus peut comporter immédiatement après l'extraction de l'insuline une concentra- tion supérieure à 50% de solvant organique, il sera généralement nécessaire de réduire la concentration du soldant organique contenu dans les résidus, de préférence pour qu'elle contienne au moins 3 parties en poids d'un solvant d'extraction aqueux (contenant au moins 80% d'eau) pour chaque partie de produit solide et on peut utiliser jusqu'à environ 30 parties de solvant par partie de solides. On utilise de préférence entre environ 6 et 12 parties de solvant d'extraction pour chaque partie de solides et il semble que les résultats optima sont obtenus lorsqu'on emploie environ 9 parties de solvant d'extraction pour chaque partie de solides.
Si on le désire, on peut utili- ser pour former la bouillie le procédé ordinairement appliqué qui consiste à diluer les résidus en y ajoutant de l'eau jusqu'à ce que la concentration" de solvant organique soit réduite à la valeur désirée. Après la formation de la bouillie, on effectue l'extraction de trypsine. On préfère'amener le tissu et le solvant d'extraction en contact à un pH inférieur à 6,5, de pré- férence au-dessous de 4, et utiliser une température comprise entre 0 et 5 C lorsqu'on traite des glandes de porc, puis une température allant jusqu'à 15 C lorsqu'on traite des matières premières ayant une teneur quelque peu inférieure en matière lipoidale.
Afin que l'extraction des enzymes soit effectuée aussi complète- ment que possible, on préfère faire passer la bouillie plusieurs fois à tra- vers la zone dans laquelle les morceaux glandulaires sont distordus et, afin de faciliter la séparation entre la matière lipoidale et l'extrait, la bouil- lie est soumise à une douce agitation entre les passes, de manière que les particules de graisses tendent à se coaguler pour former de plus gros agglo- mérés ayant tendance à s'élever à la surface de la bouillie en raison de leur poids spécifique quelque peu inférieur. Les plus gros agrégats des particu- les de graisse peuvent ensuite être retirés par écumage.
L'invention est expliquée ci-après à l'aide du dessin schémati- que annexé.
La figure 1 est un schéma de courant simplifié du procédé d'ex- traction de trypsine à partir de glandes de pancréas.
La figure 2 est une vue en perspective des éléments explosés de la pompe utilisée dans le circuit de la figure 1.
Un réservoir 10 est représenté dans l'angle gauche supérieur de la figure 1, ce réservoir contient les glandes de pancréas et la quantité nécessaire d'eau acidifiée. Ce mélahge est pompé du réservoir 10 dans l'ap- pareil de distillation à vapeur d'eau 11, dans lequel le(-solvant organique est retiré par distillation sous pression réduite. L'appareil de distilla- tion est alimenté en vapeur d'eau par une canalisation 11b. Le solvant or- ganique, qui sera généralement de l'alcool éthylique, quitte à son sommet lla l'appareil de distillation à vapeur d'eau 11 et passe à travers un con- denseur 12, dans lequel il est condensé en un liquide qui est amené à un réservoir 13. d'alcool récupéré.
La bouillie restant dans l'appareil de distillation à vapeur d'eau 11 peut être amenée à passer à un extracteur 14. Suivant l'exemple représen- té, cet extracteur est,muni d'une chemise 14a à travers laquelle on fait cir- culer de la saumure réfrigérante entrant par le tuyau 14c et sortant par-le tuyau 14d, pour refroidir la bouillie. L'extracteur 14 est également muni d'un agitateur 15. On préfère maintenir la bouillie dans l'extracteur 14 pendant un temps assez long pour permettre son refroidissement au moins à 15 C pendant ce temps, on peut faire fonctionner l'agitateur 15 pour mainte- nir les morceaux solides de la bouillie en suspension.
Après le refroidisse-
<Desc/Clms Page number 4>
ment de la bouillie à la température désirée, on.la fait passer au moyen de la canalisation de sortie 16 prévue au fond de l'extracteur par la pompe 17' et elle est ramenée à la partie supérieure de l'extracteur au moyen de la canalisation 18.
A l'intérieur de la pompe 17, la bouillie est maintenue à un état de violente agitation, les morceaux de matière glandulaire se trouvant en même temps distordus en leur faisant prendre une succession de formes irré- gulièresa On a trouvé qu'une pompe à turbine est l'appareillage convenant le mieux pour obtenir ce résultat. La figure 2.montre une vue en perspecti- ve de la pompe 17, dont les pièces sont séparées.' Dans l'exemple représenté, la pompe 17 est constituée par une enveloppe cylindrique 17a destinée à ren- fermer une turbine 17b à fortes aubes, qui est montée sur l'arbre d'un moteur et maintenue dans l'enveloppe 17a par une plaque de fermeture 17c. Lorsque on fait fonctionner la pompe, la bouillie entre par l'admission 17d et sort par la sortie 17e.
Pendant qu'elle se trouve dans l'enveloppe 17a la bouillie est maintenue à un état de violente agitation, en raison de la rotation rapi- de de la turbine 17b et les morceaux de matière glandulaire sont ainsi dis- tordus en leur faisant prendre une succession de formes irrégulières par l'ac- tion combinée des aubes de-la turbine 17b et des parois de l'enveloppe 17a.
Le mouvement rotatif de brassage imprimé à la bouillie favorise la séparation et l'agglomération des particules de graisse. Il est évident qu'il est dési- rable de faire tourner la turbine 17b à grande vitesse. Par exemple, on peut faire tourner la turbine entre 450 et 1750 tours à la minute.
Au cours des expériences, une pompe du type décrit ayant une ca- pacité d'environ 10 litres à la minute a été utilisée pour faire circuler la bouillie de la base d'une cuve d'extracteur d'une capacité de 20 litres environ en la renvoyant dans la partie supérieure de cette cuve d'extracteur.
Bien que l'on puisse faire varier considérablement la durée du cycle de pom- page suivant la grandeur ou la capacité particulière de la pompe, il est dé- sirable de faire passer la bouillie à travers la pompe à turbine plusieurs fois au cours du cycle de pompage. Par exemple, lorsqu'on utilise la pompe ayant'aune capacité de 10 litres mentionnée ci-dessus, on a trouvé désirable de faire passer la bouillie à travers la pompe quinze fois pendant un cycle de pompage de 30 minutes. Ensuite, la bouillie est maintenue dans l'extrac- teur pendant un certain laps de temps et, de préférence avec une légère agi- tation, pour produire une nouvelle agglutination des particules de graisse.
Par exemple , la bouillie peut être maintenue dans l'extracteur 14 et agitée douvement par l'agitateur 15 pendant 15 minutes. Au cours de ce laps de temps, les particules de graisse tendent à s'élever à la surface et à s'agglutiner en agglomérés dont au moins les plus gros peuvent être retirés par écumage et évacués par le tuyau 14b. Après la période de repos, on a trouvé désira- ble de soumettre la bouillie à un autre cycle de pompage, qui peut avoir environ la même durée que le premier cycle de pompage. Par exemple, on peut faire passer la bouillie de nouveau par la pompe 17 pendant un laps de temps de 30 minutes.
On a constaté que par cette succession d'opérations, l'extrac- tion des enzymes peut être effectuée à peu près complètement en une à deux heures, alors qu'il fallait antérieurement 48 heures pour obtenir les mêmes résultats,bien que 60à 80% des enzymes aient été extraites dans l'appareil de distillation à vapeur d'eau 11.
On fait ensuite passer la bouillie de l'extracteur 14 à une cen- trifugeuse 19, dans laquelle le résidu usé est séparé de la partie liquide, La partie liquide contient les particules de graisse qui s'agglutinent enco- re sous l'action centrifuge. Le produit centrifugé ou partie liquide est amené à passer dans un écumeur de graisse 20 pouvant affecter la forme d'une petite cuve présentant une lèvre 20a à sa partie supérieure. L'extrait est maintenu dans l'écumeur 20 suffisamment longtemps pour permettre aux parti- cules de graisse de s'élever à la surface et d'être retirées par écumage de la surface en passant sur la lèvre 20a et par le tuyau 20b. L'extrait exempt de graisse est ensuite amené à passer dans une cuve 21, dans;laquelle on peut ajouter du sulfate d'ammonium ou un autre réactif pour assurer la sépa- ration et l'activation de trypsine.
Le résidu usé est évacué par le tuyau 19a.
<Desc/Clms Page number 5>
Comme on l'a précédemment indiqué, la matière de départ pour exé- cuter le nouveau procédé d'extraction de cette invention est de préférence constituée par les résidus provenant de l'extraction d'insuline à partir de glandes de pancréas réduites en faisant venir ces glandes en contact avec un solvant organique miscible à l'eau pour l'insuline. Cependant, il est évident que le procédé de l'invention est également applicable à l'extraction de trypsine à partir de glandes fraîches de pancréas.
Pour illustrer plus complètement les détails de cette invention, on donne ci-après des exemples.
EXEMPLE 1.
----------
De la trypsine fut récupérée à partir de résidus de pancréas de boeuf exempts d'insuline par:le mode opératoire suivant : les résidus conte- naient environ 70% de liquide et 30% de solides en poids, puis la partie li- quide était constituée par 65% d'éthanol en volume acidifié au pH 2,85. 450kg de ces résidus furent mis en suspension dans 1500 litres d'eau de conduite qui contenait 2200 cm3 de H2SO$ concentré. Après que la suspension eut été préparée, en utilisant un agitateur du type à turbine, la bouillie fut pompée dans l'appareil de distillation.
La distillation fut effectuée dans un ap- pareil du type à pot sous vide à une température moyenne de 16 à 21 C et 30 C au maximum. 650 litres de liquide, soit environ 30% d'éthanol; furent reti- rés au cours de cette opération. La concentration d'alcool du concentré se trouvant dans l'appareil de distillation était d'environ 1 %. Le concentré fut ensuite dilue'avec 250 litres d'eau de conduite afin d'obtenir une con- sistance permettant de la faire circuler.
Le liquide dilué fut ensuite ramené à son réservoir de départ et refroidi à 4 C. L'extraction fut effectuée avec deux circulations de 30 minutes à travers une pompe à turbine à trois aubes. La suspension fut agi- tée lentement avec un agitateur à turbine pendant 15 minutes entre et après les cycles de circulation. Cette action permit aux particules de graisse de s'agglutiner avant nouvelle extraction et nouveau traitement. Les parti- cules de graisses agglutinées furent retirées pendant ces opérations par écu- mage.
La séparation fut effectuée dans une centrifugeuse Bird du type cylindrique. Le tissu provenant de la première centrifugation fut mis en suspension dans 850 litres d'eau de conduite contenant 340 cm3 de H2SO4.
Le lavage fut effectué par une circulation de 30 minutes à travers la pompe à turbine. La suspension obtenue fut ensuite centrifugée et le liquide sor- tant fut ajouté à celui obtenu de la première séparation. La trypsine cris- talline fut ensuite récupérée de la solution par précipitation fractionnée.
EXEMPLE 2.
----------
Le mode opératoire de l'exemple 1 fut suivi essentiellement, sauf que l'on remplaça les résidus de pancréas de boeuf par des résidus de pancréas de porc. En raison de la plus forte teneur en graisse ou matière lipoïdale contenue dans les glandes de pancréas de porc (en moyenne 30 à 40% comparativement à 5 à 10% pour les glandes de pancréas de boeuf), la bouillie fut réfrigérée après l'opération de distillation à environ 0 C ou légèrement au-dessous, puis maintenue à cette température pendant l'extraction à la pom- pe et le centrifugeage, afin de favoriser l'agglutination et la séparation des particules de graisse et d'empêcher la graisse de gêner@la récupération de trypsine cristalline.
Une autre modification du mode opératoire consiste à faire passer le produit centrifugé dans une petite cuve immédiatement après la séparation des résidus usés. Le produit centrifugé fut maintenu dans cette cave d'écu- mage assez longtemps pour permettre aux particules de graisse qui avaient été de nouveau agglutinées par la centrifugation de s'élever à la surface et d'ê- tre retirées par écumage. De cette manière, on obtintt un extrait sensible-
<Desc/Clms Page number 6>
ment exempt de graisse.
EXEMPLE 3.
La trypsine cristalline peut être récupérée à partir de glandes fraîches de pancréas par le mode opératoire suivant : des glandes de pancréas broyées sont mises en suspension dans 2 parties en poids d'eau acidifiée à l'acide sulfurique à 0,25 N. La bouillie obtenue contient généralement en- viron 11 parties en poids de liquide pour chaque partie en poids de solides.
On fait ensuite passer la bouillie à une cuve munie d'une chemise dans laquel- le elle est refroidie à environ 4 C pour les glandes de pancréas de boeuf et à environ - 1 C pour les glandes de pancréas de porc. On fait ensuite circuler la bouillie du réservoir à travers une pompe à turbine et on la ra- mène au réservoir pendant 15 minutes. La pompe est arrêtée et la bouillie est agitée doucement pendant 15 minutes, puis les plus gros agglomérés de graisse sont retirés en même temps par écumage. La pompe est de nouveau mi- se en marche et on fait passer la bouillie pendant un nouveau cycle de cir- culation de 15 minutes.
La matière glandulaire solide est ensuite séparée par centrifu- geage et maintenue pour l'extraction de l'insuline à partir de cette matière.
L'opération de centrifugeage fait de nouveau agglutiner les particules de graisse séparées et elles peuvent être retirées par le mode opératoire décrit à l'exemple 2. L'élimination du reste de la graisse à partir de l'extrait à ce point est particulièrement importante lorsque la matière de départ est constituée par des glandes de pancréas de porc.
Du sulfate d'ammonium est ajouté au produit centrifugé jusqu'à ce qu'on obtienne une concentration de 0,4 de saturation. La suspension ré- sultante est laissée reposer à 5 C pendant 48 heures.
La suspension est ensuite filtrée et le précipité contenant la fraction de protéines animales est évacué. Du sulfate d'ammonium est ajou- té à la couche surnageante jusqu'à 0,7 de saturation et on laisse reposer la suspension obtenue pendant 48 heures à 5 C. Le précipité d'enzymes brut est séparé et la couche surnageante est évacuée.
Le gâteau à 0,7 de saturation est retravaillé en le dissolvant dans 10 volumes d'eau distillée et en le refractionnant par des opérations de traitement au sulfate d'ammonium à 0,4 et 0,7 de saturation à 5 C. Le gateau saturé à 0,7 obtenu par ces opérations peut être retravaillé de nouveau en le dissolvant dans 3 volumes d'eau distillée et en le refraction- nant par des opérations de saturation au sulfate d'ammonium à 0,4 et 0,7 à 25 Co
Le gâteau saturé à 0,7 ainsi obtenu est dissous dans 1,5 volume d'eau distillée à 25 Ca La solution de sulfate d'ammonium saturée est ajou- tée à 0,25 de saturation. Le pH est réglé à 5 avec 5 N NaOH.
On inocule dans la solution une petite quantité de cristaux de chymotrypsinogène et la solution est laissée reposer à 25 C jusqu'à ce que la cristallisation du cbhymotrypsinogène soit complète; il faut usuellement de 48 à 72 heures.
La suspension est ensuite filtrée.
Le pH du produit filtré après la séparation du chymotrypsino gè- ne brut est réglé à 3 avec 5 N H2SO4. Du sulfate d'ammonium est ajouté à cette solution à 0,7 de saturation. La suspension est filtrée et le pro- duit filtré est évacué. Le précipité obtenu est dissous dans 3 volumes d'eau distillée et retravaillé par une saturation au sulfate d'ammonium de 0,4 et 0,7 à 25 C. Le précipité saturé à 0,7 est dissous dans 1,5 volume de tampon au borate d'un pH 9 à 10 C. Le pH de la solution est réglé à 7 avec du 5 N NaOH. Le sulfate de magnésium saturé est ajouté à une saturation de 0,5.
La solution est maintenue à 5 C jusqu'à ce que la cristallisation de la tryp- sine soit complète; il faut ordinairement de 7 à 9 jours. La suspension de cristallisation est séparée par filtrage et le produit filtré est évacué, Le gâteau de trypsine cristalline peut ensuite être maintenu à - 5 C ou mis en suspension dans 10 volumes d'eau et lyophilisé.
<Desc/Clms Page number 7>
EXEMPLE 4.
De la trypsine cristalline peut être préparée par le mode opéra- toire suivant 7 parties d'eau sont ajoutées à chaque partie de résidus de glandes de pancréas après l'extraction de l'insuline pour former une bouillie contenant au moins 21 parties de liquide pour chaque partie de solides. La bouillie est ensuite conduite dans une cuve dans laquelle elle est refroidie à au moins 4 C. Après 'avoir atteint la température désirée, on fait circu- ler la bouillie à travers une pompe à turbine à trois aubes pendant 15 mi- nutes, on la laisse reposer avec une légère agitation dans la cuve pendant 15 minutes et on la fait circuler de nouveau à travers la pompe pendant 15 minutes.
Une partie de la graisse séparée peut être retirée par écumage pen- dant que la bouillie est au repos dans la cuve entre les cylles de circula- tiona
L'extrait est séparé des résidus usés par centrifugeage, clarifié, puis on obtient un précipité de trypsinogène brut à 0,8 de saturation avec du sulfate d'ammoniumo Ce précipité est séparé par filtrage et le gâteau de filtrage est dissous dans 6 volumes d'eau, puis l'épuration est effectuée en ajoutant un sulfate d'ammonium saturé à une concentration entre 0,35 et 0,55. La trypsine est ensuite cristallisée au pH 7,1 à 7,5 dans une solution de tampon au borate à 0,3 de saturation avec du sulfate de magnésium. Le sel de borate est retiré de la trypsine cristalline par dialyse et, après clarification, la matière dialysée est placée dans des flacons.
EXEMPLE 5.
Pour traiter rapidement les résidus afin d'obtenir la trypsine cristalline, on peut procéder de la faon suivante : on met 450 kg de rési- dus en suspension dans 1500 litres d'eau contenant 2200 cm3 d'acide sulfuri- que. On retire 650 litres de liquide par distillation sous pression réduite.
On refroidit le concentré à 0 C. On fait circuler à travers une pompe à tur- bine pendant 15 minutes. On centrifuge et on écume la graisse du liquide sortant dans une cuve d'écumage. On met le résidu en suspension dans 750 litres d'eau contenant 300 cm3 d'acide sulfurique. On fait circuler à tra- vers une pompe à turbine pendant 15 minutes. On centrifuge et on écume le liquide sortant, comme précédemment. On combine l'extrait et on précipite le trypsinogène avec saturation entre 0,4 et 0,7 de sulfate d'ammonium, après avoir précipité tout d'abord et séparé les contaminants inertes à une satura- tion de 0,4 de sulfate d'ammonium. Le gâteau d'enzymes brut ainsi obtenu peut être retravaillé pour obtenir le chymotrypsinogène et la trypsine sous la forme cristalline par le mode opératoire de l'exemple 3.
Bien que dans ce qui précède l'intention ait été décrite avec beaucoup de détails pour illustrer certains modes de réalisation, il est évi- dent que l'on peut faire varier ces détails dans une large mesure sans sor- tir de son cadre.
<Desc / Clms Page number 1>
METHOD FOR RECOVERING TRYPSIN FROM PANCREAS GLANDS.
The present invention relates to a process for recovering crystalline trypsin from tissue mixtures containing enzymes and organic solvents, and more particularly to the preparation of trypsin in a crystalline form suitable for medical use.
It is known that the pancreatic glands of mammals contain both insulin and proteolytic enzymes including trypsin.
Preparations of enzymes, such as pancreatin, which is a mixture of amorphous enzymes and which is widely used in the textile industry and in the tanning industry, have been obtained from fresh glands. pancreas for many years. Pure crystalline enzymes have also been prepared on a laboratory scale from fresh pancreatic glands
Extraction of pro-enzymes from the pancreatic glands can be performed in a number of different ways. Depending, to some extent, on the nature of the particular pancreatic tissues, the extent of agitation and other factors, it has so far only been possible to extract 60-80% of the enzymes. within 48 hours.
In industrial scale extraction, 48 hour periods are undesirable, because the use of the extraction equipment is severely limited. Accordingly, it is desired to provide a method of performing the extraction of enzymes in a substantially complete manner in a very short time.
In practice, the pancreatic glands, which are subjected according to the invention to the process for extracting enzymes, contain fatty particles. Especially when using pig pancreatic glands, which contain about 30-40% fat, it has been found that the extraction is very difficult. But, even with lesser amounts of fat, it has been found that they not only influence 1 (extraction operation, but
<Desc / Clms Page number 2>
also the subsequent crystallization.
Accordingly, according to one of its aspects, the present invention is based on the finding that in order to carry out a process giving in its last operation a crystalline trypsin suitable for medical use, it is important to remove the fat particles of glandular material. A particular problem relating to the separation of fatty particles from the glands is due to the fact that the fats are frequently found throughout the tissue and which they prevent; therefore, effective contact between the aqueous liquid used for the extraction and the tissue carrying the enzymes to such an extent that it is difficult to carry out the process with a satisfactory yield in a reasonable time.
The time factor also presents a problem in that enzymes are very sensitive substances which are subject to loss of activity if the treatment is excessively prolonged.
In accordance with this finding, the method of the present invention for recovering crystalline trypsin from mixtures of reduced pancreatic glands containing enzymes and organic solvents is characterized in that the glands are subjected, in the presence of an agert. extractor, to mechanical processing, such as distortion, after which the extracted trypsin is subjected to crystallization.
Thus, an important feature of the invention resides in the distortion of the glands during extraction, this distortion subjecting these glands to flexion producing a pressing similar to the pressing of a sponge, which results in partially that the solvents can penetrate the tissues completely to effect the recovery of enzymes, in order to speed up their extraction and partially to produce a relaxation or release of fatty substances from inside the glands, by allowing the released fatty particles to be removed from the tissue.
As can easily be understood, this results in both an increase in yield and a reduction in the time of extraction.
Another important advantage of performing the method as described is that the distorting forces have the effect of removing fatty particles from within the glandular tissue and also promoting the formation of clumped masses. fatty particles which tend to rise to the surface of the extraction solution and which can then be removed by skimming or centrifuging. The production of a substantially fat-free enzyme solution by the process of the present invention has made it possible to obtain crystalline enzymes from glands containing large amounts of fat particles. Recognizing this need for a substantially fat-free enzyme solution prevents the formation of crystalline trypsin from fat-containing glands.
This effect is believed to result from the unfavorable influences of the fatty particles on the formation of crystalline enzymes during the subsequent crystallization process.
In carrying out the method, this can be done quickly according to the invention by passing the glands in the form of a slurry through a zone of distortion, for example, in a turbine pump without subjecting the fluid. glandular material to some other notable subdivision. This is markedly different from the known prior method of insulin extraction in which it has been proposed to improve the extraction of proteolytic enzymes by increasing the degree of subdivision of the glands, for example by switching them to. through a high speed crusher. However, this has not been shown to be satisfactory because of the increased difficulties which result in separating the extracts from the finely divided tissue.
The starting material used to carry out the extraction operation according to the process of the invention may consist of the residues obtained from
<Desc / Clms Page number 3>
by extracting insulin from small pancreatic glands by contacting these glands with a water-miscible organic solvent for insulin. Starting from these residues, the first step of the process of the invention consists in forming a slurry containing the solid products of the residues and a liquid extraction solvent containing at least 80% water by volume.
Since the liquid part of the residue may have a concentration of greater than 50% organic solvent immediately after extraction of the insulin, it will generally be necessary to reduce the concentration of the organic residue contained in the residue, preferably to it contains at least 3 parts by weight of an aqueous extracting solvent (containing at least 80% water) for each part of solid product and up to about 30 parts of solvent per part of solids can be used . Preferably between about 6 and 12 parts of extraction solvent are used for each part of solids and it appears that optimum results are obtained when about 9 parts of extraction solvent are used for each part of solids.
If desired, the ordinarily applied method of diluting the residue by adding water to the slurry can be used to form the slurry until the concentration of organic solvent is reduced to the desired value. When forming the slurry, the trypsin extraction is carried out. It is preferred to bring the tissue and the extraction solvent into contact at a pH below 6.5, preferably below 4, and use a pH value of less than 6.5. temperature between 0 and 5 C when processing pig glands, then a temperature up to 15 C when processing raw materials with a somewhat lower lipoid content.
In order that the extraction of the enzymes be carried out as completely as possible, it is preferred to pass the slurry several times through the area in which the glandular pieces are distorted and, in order to facilitate the separation between the lipoidal material and the 'extract, the slurry is subjected to gentle agitation between passes so that the fat particles tend to coagulate to form larger agglomerates which tend to rise to the surface of the slurry due to of their somewhat lower specific gravity. The larger aggregates of the fat particles can then be removed by skimming.
The invention is explained below with the aid of the accompanying schematic drawing.
Figure 1 is a simplified flow diagram of the method of extracting trypsin from pancreatic glands.
Figure 2 is a perspective view of the exploded elements of the pump used in the circuit of Figure 1.
A reservoir 10 is shown in the upper left corner of FIG. 1, this reservoir contains the pancreatic glands and the necessary quantity of acidified water. This mixture is pumped from the tank 10 into the steam distillation apparatus 11, where the organic solvent is distilled off under reduced pressure. The still is supplied with steam. water through a line 11b The organic solvent, which will generally be ethyl alcohol, leaves at its top 11 the steam distillation apparatus 11 and passes through a condenser 12, in which it is condensed into a liquid which is supplied to a reservoir 13. of recovered alcohol.
The slurry remaining in the steam distillation apparatus 11 can be passed to an extractor 14. According to the example shown, this extractor is provided with a jacket 14a through which is circulated. circulating refrigerant brine entering through pipe 14c and exiting through pipe 14d, to cool the slurry. The extractor 14 is also provided with a stirrer 15. It is preferred to keep the slurry in the extractor 14 for a long enough time to allow it to cool to at least 15 ° C. during this time, the stirrer 15 can be operated to keep the solid pieces of the slurry in suspension.
After cooling
<Desc / Clms Page number 4>
slurry at the desired temperature, it is passed through the outlet pipe 16 provided at the bottom of the extractor by the pump 17 'and it is returned to the upper part of the extractor by means of the pipeline 18.
Inside the pump 17, the slurry is maintained in a state of violent agitation, the pieces of glandular material being at the same time distorted, causing them to assume a succession of irregular shapesa It has been found that a turbine is the most suitable apparatus to achieve this result. Figure 2 shows a perspective view of the pump 17, the parts of which are separated. In the example shown, the pump 17 consists of a cylindrical casing 17a intended to enclose a turbine 17b with strong blades, which is mounted on the shaft of a motor and held in the casing 17a by a plate. closing 17c. When the pump is operated, the slurry enters through inlet 17d and leaves through outlet 17e.
While in the casing 17a the slurry is maintained in a state of violent agitation, due to the rapid rotation of the impeller 17b and the pieces of glandular material are thus distorted causing them to set a succession of irregular shapes by the combined action of the blades of the turbine 17b and the walls of the casing 17a.
The rotary stirring movement imparted to the slurry promotes the separation and agglomeration of fat particles. It is evident that it is desirable to rotate the turbine 17b at high speed. For example, you can turn the turbine between 450 and 1750 revolutions per minute.
In the course of the experiments, a pump of the type described having a capacity of about 10 liters per minute was used to circulate the slurry from the base of an extractor vessel with a capacity of about 20 liters. returning it to the upper part of this extractor tank.
Although the duration of the pumping cycle can be varied considerably depending on the particular size or capacity of the pump, it is desirable to pass the slurry through the impeller pump several times during the cycle. pumping. For example, when using the 10 liter capacity pump mentioned above, it has been found desirable to pass the slurry through the pump fifteen times during a 30 minute pump cycle. Thereafter, the slurry is held in the extractor for a period of time and, preferably with gentle agitation, to produce further agglutination of the fat particles.
For example, the slurry can be held in extractor 14 and stirred gently by agitator 15 for 15 minutes. During this time the fat particles tend to rise to the surface and clump together into agglomerates, at least the larger ones of which can be skimmed off and discharged through pipe 14b. After the standing period, it has been found desirable to subject the slurry to another pumping cycle, which may be about the same duration as the first pumping cycle. For example, the slurry can be passed again through the pump 17 for a period of 30 minutes.
It has been found that by this succession of operations the extraction of the enzymes can be effected almost completely in one to two hours, whereas previously it took 48 hours to obtain the same results, although 60 to 80% enzymes have been extracted in the steam distillation apparatus 11.
The slurry is then passed from the extractor 14 to a centrifuge 19, in which the spent residue is separated from the liquid part. The liquid part contains the fat particles which still clump together under the centrifugal action. . The centrifuged product or liquid part is made to pass through a fat skimmer 20 which can take the form of a small tank having a lip 20a at its upper part. The extract is held in the skimmer 20 long enough to allow the fat particles to rise to the surface and be skimmed off the surface through lip 20a and through pipe 20b. The fat-free extract is then passed to a vessel 21, in which ammonium sulfate or other reagent can be added to ensure the separation and activation of trypsin.
The used residue is discharged through pipe 19a.
<Desc / Clms Page number 5>
As previously indicated, the starting material for carrying out the novel extraction process of this invention is preferably the residues resulting from the extraction of insulin from the reduced pancreatic glands by bringing in. these glands in contact with a water-miscible organic solvent for insulin. However, it is evident that the method of the invention is also applicable to the extraction of trypsin from fresh pancreatic glands.
To more fully illustrate the details of this invention, examples are given below.
EXAMPLE 1.
----------
Trypsin was recovered from insulin-free beef pancreas residues by: the following procedure: the residues contained about 70% liquid and 30% solids by weight, then the liquid part was made up. with 65% ethanol by volume acidified to pH 2.85. 450kg of these residues were suspended in 1500 liters of pipe water which contained 2200 cm3 of concentrated H2SO $. After the slurry was prepared, using a turbine type stirrer, the slurry was pumped into the still.
The distillation was carried out in a vacuum pot type apparatus at an average temperature of 16-21 C and at most 30 C. 650 liters of liquid, or about 30% ethanol; were removed during this operation. The alcohol concentration of the concentrate in the still was about 1%. The concentrate was then diluted with 250 liters of tap water to obtain a consistency to circulate it.
The diluted liquid was then returned to its starting tank and cooled to 4 C. The extraction was carried out with two circulations of 30 minutes through a three-bladed turbine pump. The suspension was stirred slowly with a turbine stirrer for 15 minutes between and after the circulation cycles. This action allowed the fat particles to agglutinate before further extraction and further processing. Agglutinated fat particles were removed during these operations by skimming.
The separation was carried out in a Bird centrifuge of the cylindrical type. The tissue from the first centrifugation was suspended in 850 liters of tap water containing 340 cc of H2SO4.
Washing was carried out by circulating for 30 minutes through the turbine pump. The resulting suspension was then centrifuged and the resulting liquid was added to that obtained from the first separation. The crystalline trypsin was then recovered from the solution by fractional precipitation.
EXAMPLE 2.
----------
The procedure of Example 1 was followed essentially, except that the residues of beef pancreas were replaced by residues of pork pancreas. Due to the higher fat or lipoid content in the pig pancreatic glands (average 30-40% compared to 5-10% for beef pancreatic glands), the porridge was refrigerated after the operation. distillation to about 0 C or slightly below, then maintained at this temperature during pumping and centrifuging, to promote clumping and separation of fat particles and to prevent fat from forming. interfere with the recovery of crystalline trypsin.
Another modification of the procedure is to pass the centrifuged product in a small tank immediately after the separation of the spent residues. The centrifuged product was kept in this skimming cellar long enough to allow the fat particles which had been again clumped by the centrifugation to rise to the surface and be removed by skimming. In this way, we obtain a sensitive extract-
<Desc / Clms Page number 6>
completely free of grease.
EXAMPLE 3.
Crystalline trypsin can be recovered from fresh pancreatic glands by the following procedure: crushed pancreatic glands are suspended in 2 parts by weight of water acidified with 0.25 N sulfuric acid. obtained generally contains about 11 parts by weight of liquid for each part by weight of solids.
The slurry is then passed to a jacketed tank in which it is cooled to about 4 ° C for the beef pancreas glands and to about -1 ° C for the pork pancreas glands. The slurry from the reservoir is then circulated through a turbine pump and returned to the reservoir for 15 minutes. The pump is stopped and the slurry is stirred gently for 15 minutes, then the larger clumps of fat are removed at the same time by skimming. The pump is turned on again and the slurry is passed through a further 15 minute circulation cycle.
The solid glandular material is then separated by centrifugation and held for extraction of insulin from this material.
The centrifuging operation causes the separated fat particles to agglutinate again and they can be removed by the procedure described in Example 2. Removal of the remainder of the fat from the extract at this point is particularly important. when the starting material is pig pancreatic glands.
Ammonium sulfate is added to the centrifuged product until a saturation concentration of 0.4 is obtained. The resulting suspension is left to stand at 5 ° C. for 48 hours.
The suspension is then filtered and the precipitate containing the fraction of animal proteins is discharged. Ammonium sulfate is added to the supernatant layer to 0.7 saturation and the resulting suspension is allowed to stand for 48 hours at 5 ° C. The crude enzyme precipitate is separated and the supernatant layer is discarded.
The cake at 0.7 saturation is reworked by dissolving it in 10 volumes of distilled water and by refracting it by treatment operations with ammonium sulfate at 0.4 and 0.7 saturation at 5 C. The cake saturated at 0.7 obtained by these operations can be reworked again by dissolving it in 3 volumes of distilled water and refraction- ing it by saturation operations with ammonium sulphate at 0.4 and 0.7 at 25 Co
The 0.7 saturated cake thus obtained is dissolved in 1.5 volumes of distilled water at 25 Ca. The saturated ammonium sulfate solution is added to 0.25 saturation. The pH is adjusted to 5 with 5 N NaOH.
A small amount of chymotrypsinogen crystals are inoculated into the solution and the solution is left to stand at 25 ° C. until crystallization of the cbhymotrypsinogen is complete; it usually takes 48 to 72 hours.
The suspension is then filtered.
The pH of the filtered product after separation of the crude chymotrypsino gene is adjusted to 3 with 5 N H2SO4. Ammonium sulfate is added to this solution at 0.7 saturation. The suspension is filtered and the filtered product is discharged. The precipitate obtained is dissolved in 3 volumes of distilled water and reworked by saturation with ammonium sulfate of 0.4 and 0.7 at 25 C. The precipitate saturated at 0.7 is dissolved in 1.5 volumes of buffer. borate with a pH of 9 to 10 C. The pH of the solution is adjusted to 7 with 5 N NaOH. Saturated magnesium sulfate is added at a saturation of 0.5.
The solution is maintained at 5 ° C. until the crystallization of the trypsine is complete; it usually takes 7 to 9 days. The crystallization slurry is filtered off and the filtered product is discharged. The crystalline trypsin cake can then be kept at -5 ° C. or suspended in 10 volumes of water and lyophilized.
<Desc / Clms Page number 7>
EXAMPLE 4.
Crystalline trypsin can be prepared by the following procedure: 7 parts of water are added to each part of pancreatic gland residue after extraction of insulin to form a slurry containing at least 21 parts of liquid for each part of solids. The slurry is then passed into a vessel in which it is cooled to at least 4 C. After reaching the desired temperature, the slurry is circulated through a three-bladed turbine pump for 15 minutes. Allow it to stand with gentle agitation in the tank for 15 minutes and recirculate it through the pump for 15 minutes.
Part of the separated fat can be removed by skimming while the slurry is standing in the tank between the circula- tion cylinders.
The extract is separated from the spent residues by centrifugation, clarified, then a precipitate of crude trypsinogen at 0.8 saturation with ammonium sulfate is obtained. This precipitate is filtered off and the filter cake is dissolved in 6 volumes of water, then the purification is carried out by adding a saturated ammonium sulfate at a concentration between 0.35 and 0.55. The trypsin is then crystallized at pH 7.1 to 7.5 in a solution of borate buffer at 0.3 saturated with magnesium sulfate. The borate salt is removed from the crystalline trypsin by dialysis and, after clarification, the dialyzed material is placed in vials.
EXAMPLE 5.
To quickly treat the residues in order to obtain crystalline trypsin, the following procedure can be carried out: 450 kg of residues are suspended in 1500 liters of water containing 2200 cm3 of sulfuric acid. 650 liters of liquid are removed by distillation under reduced pressure.
The concentrate is cooled to 0 ° C. Circulated through a turbine pump for 15 minutes. The fat is centrifuged and skimmed from the liquid exiting in a skimming tank. The residue is suspended in 750 liters of water containing 300 cm3 of sulfuric acid. It is circulated through a turbine pump for 15 minutes. The outgoing liquid is centrifuged and frothed, as before. The extract is combined and the trypsinogen precipitated with saturation between 0.4 and 0.7 ammonium sulphate, after first precipitating and separating the inert contaminants to a saturation of 0.4 d sulphate. 'ammonium. The crude enzyme cake thus obtained can be reworked to obtain chymotrypsinogen and trypsin in crystalline form by the procedure of Example 3.
Although in the foregoing the intention has been described in great detail to illustrate certain embodiments, it is obvious that these details can be varied to a large extent without going beyond its scope.